TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
DESPROTEINIZAÇÃO DE AMOSTRAS DE SANGUE PELO SULFATO DE
ZINCO – ESTUDO E DESENVOLVIMENTO DE UMA NOVA
ESTRATÉGIA.
Eliani Spinelli ([email protected])1; Sorele B. Fiaux1; Cassia M. L.
Silva2; Heliane Duarte1
1Toxfree
– Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
Universidade Federal Fluminense – Niterói, RJ, Brasil.
2Instituto
Médico Legal do Rio de Janeiro, Brasil.
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
SOMOGYI, M. (1930)
Sulfato de zinco a 10% e NaOH 0,5 M
O agente desproteinizante seria o gel de
hidróxido de zinco...
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
IYER & PRZYBYCIEN (1996)
Mecanismo da precipitação de proteínas com metais
divalentes::
divalentes
1ª etapa
Histidina
Triptofano
2ª etapa
M++
M++
NH2
N
H+
Cisteína
COO -
SH
M++
M
S
H+
H+
M++
M
N
M++
COO
H+
Reações cruzadas
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
IYER & PRZYBYCIEN (1996)
Características da reação com metais divalentes:
- Reação irreversível
- A concentração de íons H+ afeta a eficiência
- A agitação pode gerar precipitado mais fino
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
Estratégias para o presente estudo:
1)Avaliação da eficiência da desproteinização através da
dosagem de proteínas no sobrenadante obtido após
centrifugação..
centrifugação
2) Investigação do efeito de variáveis através do planejamento
experimental.
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
Dosagem de proteínas
ZAIA et al. (1998)
Revisão sobre as vantagens e desvantagens dos vários métodos
de desproteinização .
Método de Bradford :
Rápido
Sensível
Execução simples
Menos interferentes
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
Reagente de Bradford (1976
1976))
Brilliant Blue G, Sigma Aldrich (product number B07700770-5G)
Ácido fosfórico ACS 86,
86,3% , J.T.Baker
Álcool etílico ACS 96 %, Vetec
Curva de calibração da albumina bovina
0,9
0,8
Absorvância
0,7
0,6
0,5
y = 0,007x + 0,051
R² = 0,985
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
Albumina (µ
µg)
150
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
Esquema analítico
Sobrenadante
Precipitado
Diluição
com água
destilada
Alíquota para análise
10 µL a 100 µL
Etc.
1: 5
1: 10
1: 20
Reação com 5 mL
do reagente de
Bradford
Leitura da
absorvância
Curva de calibração ⇒ µg de proteína
µg
µg//µL = (µg
(µg de proteína / µL de sobrenadante) x fator de diluição
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
Planejamento experimental
Variáveis a serem investigadas
Domínios
Concentração do sulfato de zinco
Temperatura
Tempo
0,5 – 10%
25 – 55 °C
5 – 30 minutos
A validade do modelo experimental foi determinada
através da análise de uma amostra de sangue, em
triplicata, nas melhores condições apontadas pelo modelo
modelo::
comparação entre valor teórico esperado e valor obtido
obtido..
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Gráfico de superfície, mostrando a dependência da concentração de proteína residual com a
temperatura e a concentração de sulfato de zinco.
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Melhores condições selecionadas pelo estudo:
0,5 mL sangue
1 mL sulfato de zinco a 1%
Vortex por 10 s
45°°C / 15 minutos
3000 rpm / 15 minutos
Sobrenadante límpido
Remoção de 99,3% das
proteínas
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Avaliação do efeito da desproteinização na recuperação
da amitriptilina e nortriptilina
Estratégia: comparação com a recuperação da extração
direta, após seleção do solvente:
- Hexano:acetato de etila 75:25
Resultado da 1ª avaliação: 20,2 % para amitriptilina
21,4 % para a nortriptilina
Fármacos retidos no material precipitado ?
Extração após
desproteinização
5
10
11.934
15
16.335
nortriptilina
17.794
10
15.973
13.892
14.167
13.231
13.343
12.449
5
c:\star\data\sangue\sobrenadante2_11-2-2009.run
15
21.871
21.174
21.439
20.356
20.608
19.977
19.349
19.600
18.663
18.938
15.320
15.524
15.625
15.693
15.979
16.083
16.341
16.555
16.697
17.001
17.211
11.940
12.164
12.509
12.784
13.083
13.238
13.469
13.745
13.889
14.232
14.389
14.548
14.825 14.912
10.989
11.300
11.374
11.470
10.666
9.884
150
10.095
10.235
10.312
10.396
9.589
9.269
18.240
C26
11.291
10.647
C26
8.778
9.017
c:\star\data\sangue\exp 1 eter_4-2-2009.run
10.385
100
9.869
9.252
6.779
200
8.194
7.276
6.511
6.630
6.779
5.500
5.991 5.861
6.121
6.261
6.511
6.630
6.951
7.281
7.503
7.7737.867
7.981
8.197
8.333
5.129
5.245
50
5.861
5.992
4.693
4.260
4
WI:
5.528
5.138
mVolts
3.491
3.510
2
WI:
4.304
Sangue fortificado com
amitriptilina e
nortriptilina a 2,5 µg
µg/mL
/mL
3.512
Extração direta
1.972
mVolts
1.982
1.058
1.085
1.107
1.132
1.173
1.202
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
8
WI:
Channel: Front = FID Results
File: c:\star\data\sangue\exp 1 eter_4-2-2009.run
Last recalc: NA
amitriptilina
nortriptilina
100
0
-20
20
File: c:\star\data\sangue\sobrenadante2_11-2-2009.run
Minutes
Last recalc: NA
Channel: Front = FID Results
150
amitriptilina
50
0
-17
20
Minutes
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
Modificações efetuadas para aumentar o rendimento da extração
Volume de água destilada?
Diluição
Antes ou depois do sulfato de zinco?
Antes ou depois do aquecimento?
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Volumes de precipitado obtidos na
desproteinização de 1 mL de sangue.
O sangue foi previamente diluído com
quantidades crescentes de água (da
direita para esquerda), antes da
adição do sulfato de zinco.
Diferença na compactação do precipitado
obtido com a troca na ordem de entrada dos
reagentes. Á direita, o sangue foi diluído antes
da adição do sulfato de zinco. À esquerda, a
diluição ocorreu após a adição do sulfato de
zinco. Ambos os tubos foram centrifugados a
3000 rpm/ 15 min.
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
Melhor condição selecionada
1 mL de sangue
2 mL de sulfato de zinco a 1%
Vortex / 10s
45 ºC / 15 minutos
Diluição com 6 mL de água destilada
Vortex / 20 s
3000 rpm por 15 min
Separar o sobrenadante
1mL cloreto de amônia 3,3 N, pH 12
15 mL hexano: acetato de etila 75: 25
Resultado da 2ª avaliação: 60 % para amitriptilina
85 % para a nortriptilina
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
Extração em fase sólida
Velocidade de eluição:
Bond Elut
Certify®
1. Condicionamento
2 mL de MeOH
2 mL tampão fosfato 0,1 M pH 6
1 a 2 gotas / segundo
2. Aplicação do sobrenadante
1 a 2 gotas / segundo
3. Lavagem: cloreto de amônio 0,1 M pH 9,5
4. Secagem
5. Eluição dos analitos
2 a 3 gotas / segundo
Vácuo : 20 Pol por 10 minutos
1 a 2 gotas / segundo
5 mL de Diclorometano: isopropanol:amônia 87:10:3
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
Resultado da 3ª avaliação: 80 % para amitriptilina
85 % para a nortriptilina
Curvas de calibração da nortriptilina
Curvas de calibração da amitriptilina
0,3
0,14
Razão das áreas dos piscos: analito / PE
Razão das áreas dos picos: analito / PE
0,16
y = 0,072x - 0,008
R² = 0,985
0,12
EFS
0,1
0,08
y = 0,070x - 0,007
R² = 0,985
0,06
0,04
Liq
Liq//Liq
0,02
y = 0,133x + 0,002
R² = 0,987
0,25
0,2
EFS
0,15
y = 0,123x - 0,018
R² = 0,958
0,1
Liq
Liq//Liq
0,05
0
0
0
0,5
1
1,5
µg / mL
2
2,5
0
0,5
1
1,5
µg / mL
2
2,5
TOXfree – Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica
OBRIGADA.
Contato: [email protected]