ENSAIOS EXPERIMENTAIS PARA A AVALIAÇÃO DE PRODUTOS
NATURAIS COM ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA TÓPICA
Laura Licia Milani de Arruda (PIBIC/CNPq- UEM), Ciomar Aparecida
Bersani-Amado (Orientadora), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual de Maringá/Departamento de Farmacologia e
Terapêutica/Maringá, PR.
Ciências da Saúde/Farmácia
Palavras-chave: edema de orelha, antiinflamatório, produto natural
Resumo: O objetivo deste estudo foi implantar e padronizar novos modelos
experimentais para o estudo da atividade antiinflamatória tópica de produtos
naturais. Os agentes flogísticos usados foram acetato de forbol miristato
(PMA), ácido araquidônico (AA), fenol (F), capsaicina (CP) e óleo de cróton
(OC). Tais substâncias apresentam ação tópica e induzem uma inflamação
local, resultando na produção de mediadores pró-inflamatórios. O edema de
orelha, em camundongos da linhagem Swiss, foi determinado medindo-se a
espessura da orelha com o auxílio de um micrômetro digital (μm) ou
pesando a orelha em balança analítica (mg), antes e após a indução do
processo inflamatório. A atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) foi
determinada no homegenato das orelhas. Os resultados foram submetidos à
análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey (P<0,05).
Introdução
A utilização do edema como parâmetro de avaliação em modelos
validados, como o modelo de edema de orelha induzido por diferentes
agentes flogísticos, permite avaliar o potencial antiinflamatório tanto por via
tópica quanto sistêmica de vários agentes, sejam eles compostos sintéticos
ou extratos de plantas (DE YOUNG et al., 1989). Além disso, quando o
objetivo é o desenvolvimento de medicamentos de uso tópico, esse modelo
oferece a vantagem de identificar compostos que apresentam uma absorção
cutânea apropriada, de forma a atingir concentrações adequadas na pele
para exercer um efeito farmacológico (BOUCLIER et al., 1990). O objetivo
deste estudo foi implantar e padronizar novos modelos experimentais para o
estudo da atividade antiinflamatória tópica de produtos naturais ou sintéticos,
complementares aos já padronizados no laboratório de inflamação da UEM.
Materiais e métodos
1. Animais - Foram utilizados camundongos machos Swiss. Os animais
foram mantidos sob temperatura controlada e ciclo claro/escuro, com água e
ração ad libitum. O protocolo para estes experimentos foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Experimentação Animal da UEM.
2. Avaliação do edema de orelha - O edema de orelha foi avaliado com o
auxílio de um micrômetro digital (GREAT MT – 045B), que mede o aumento
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
da espessura da orelha dos animais (μm), ou através da determinação do
peso (mg) da orelha.
3. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica do PMA - O edema foi
induzido pela aplicação tópica de 2,0 μg de PMA, dissolvido em 20 μL de
acetona e determinado 4 horas após a aplicação do PMA.
4. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica de ácido
araquidônico - O edema foi induzido pela aplicação tópica de 1,0 mg de
ácido araquidônico, dissolvido em 20 μL de acetona e determinado 1 hora
após a aplicação do agente flogístico.
5. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica do fenol- A solução
de fenol a 10% (v/v) foi dissolvida em acetona 70% (20 μL) e aplicada na
orelha esquerda dos camundongos. Neste modelo, o edema foi determinado
1 hora após a aplicação do fenol.
6. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica da capsaicina - O
edema foi induzido pela aplicação tópica de 2,0 μg de capsaisina, dissolvido
em 20 μL de acetona e avaliado 30 minutos após a aplicação do agente
flogístico.
7. Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla do óleo de cróton
O processo inflamatório crônico foi induzido pela aplicação do óleo de cróton
(0,4 mg/orelha em 20 μL de acetona) em dias alternados durante 9 dias. No
último dia de tratamento amostras das orelhas foram coletadas e pesadas
8. Medida da atividade enzimática da MPO - A atividade MPO foi avaliada
no sobrenadante de homogenados das secções de orelhas (controles e
inflamadas).
9. Análise Estatística - Os resultados foram apresentados como média ±
erro padrão da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos ao Teste T de
Student. P < 0,05 foi considerado como nível de significância.
Resultados e Discussão
Efeito da aplicação tópica do PMA - O PMA é um potente agente flogístico
capaz de promover uma resposta inflamatória e hiperproliferativa bastante
intensa, assemelhando-se com algumas doenças cutâneas (GÁBOR, 2003).
Esse modelo permite identificar inibidores da biossíntese das PG e LT,
podendo ser utilizado na triagem de compostos que pertencem à classe dos
inibidores da COX e/ou LOX. A aplicação tópica do PMA na orelha dos
camundongos promoveu um aumento significativo da espessura da orelha
na quarta hora após o desafio. Também promoveu um aumento significativo
da atividade da MPO (tabela 1).
Efeito da aplicação tópica do ácido araquidônico – O AA quando
aplicado topicamente é metabolizado em vários mediadores que promovem
a formação do edema, como a PG e LT, como conseqüência do processo
inflamatório instalado (HUMES et al., 1986). Assim, compostos que inibem o
metabolismo do ácido araquidônico em prostaglandinas e leucotrienos são
identificados neste modelo. A aplicação tópica do AA na orelha de
camundongos induziu uma resposta inflamatória intensa na primeira hora. O
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
peso da orelha aumentou três vezes quando comparada à orelha controle
(veículo - acetona) (tabela 1).
Efeito da aplicação tópica do fenol 10% - O modelo de edema de orelha
induzido pela aplicação tópica do fenol consiste num modelo de inflamação
cutânea causada por um agente irritante que se assemelha à dermatite de
contato que ocorre em humanos (LIM et al., 2004). A aplicação tópica do
fenol 10% na orelha de camundongos induziu uma resposta inflamatória
bastante evidente na sexta hora. O peso da orelha aumentou três vezes
quando comparada à orelha direita (veículo – acetona 70%) (tabela 1).
Efeito da aplicação tópica da capsaicina - A capsaicina quando aplicada
topicamente, induz a liberação de vários mediadores pró-inflamatórios que
promovem vasodilatação e eritema como resposta imediata, seguido da
formação de edema cujo pico máximo é atingido até 30 minutos após sua
aplicação. A aplicação tópica da capsaicina (200µg/orelha) na orelha de
camundongos induziu uma resposta inflamatória bastante evidente após 30
minutos. Como observado, o peso da orelha aumentou aproximadamente
duas vezes quando comparada à orelha direita (veículo – acetona, sem
aplicação da capsaicina) (tabela 1).
Efeito da aplicação tópica e múltipla do óleo de cróton – A aplicação
repetida de óleo de cróton em orelhas de camundongos promove uma
resposta inflamatória crônica caracterizada por edema, infiltração celular e
hiperproliferação celular na epiderme (STANLEY et al., 1991). Este modelo é
adequado para avaliar o efeito antiinflamatório de produtos naturais em um
processo inflamatório já estabelecido. A aplicação tópica múltipla do OC na
orelha de camundongos induziu uma resposta inflamatória intensa no 9º dia.
Como observado, até o 5º dia o peso da orelha aumentou três vezes. A
orelha direita foi utilizada como controle (aplicado veículo-acetona) (figura 1).
Conclusões
Os agentes flogísticos utilizados apresentaram ação tópica induzindo uma
resposta inflamatória local como resultado da produção de mediadores próinflamatórios que promovem vasodilatação, infiltração de células e
extravasamento de plasma, conduzindo à instalação dos sinais clássicos da
inflamação.
Tabela 1. Peso da orelha de camundongos (edema) após a aplicação de
diferentes agentes flogísticos. Atividade da mieloperoxidase no modelo
de edema induzido pelo PMA.
Agente
Flogístico
Dose
PMA
ÁA
F
CP
2,0 µg
1,0 mg
10,0%
200,0 µg
Peso do Orelha (mg)
Controle
10,9 ± 0,5
9,8 ± 0,2
10,6 ± 0,2
9,8 ± 0,2
Inflamada
24,4 ± 1,9
26,7 ± 0,9
31,4 ± 0,5
16,7 ± 1,3
Tempo
de
Medida
4h
1h
1h
30 min
Atividade
Mieloperoxidase
(DO=densidade óptica)
Controle
Inflamada
0,027±0,004
0,12±0,02
-
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
700
Edema (µ m)
600
Veículo acetona
OC 0.4mg + Veículo acetona
500
400
*
*
*
*
6
7
8
9
300
200
100
0
0
1
2
3
4
5
10
Dias
Figura 1 - Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton. Os valores
estão expressos como média ± EPM. * p< 0,001 comparado ao grupo inflamado (OC) (Teste
t de Student).
Agradecimentos: Apoio financeiro CNPq.
Referências
BOUCLIER, M., CAVEY, D., KAIL, N., HENSBY, C. Experimental models in
skin pharmacology. Pharmacology. Review, v. 42, p. 127-154, 1990.
DE YOUNG, L.M., KHEIFETS, J.B., BALLARON, S.J., YOUNG, J.M. Edema
and cell infiltration in the phorbol ester-treated mouse ear are temporally separate and can be differentially modulated by pharmacologic agents. Agents
and Actions, v. 26, p.335-341, 1989.
GÀBOR, M. Models of acute inflammation in the ear. In: WINYARD, P.G. and
WILLOUGHBY, D.A. Inflammation protocols, New Jersey: Humana Press,
p.129-131, 2003.
HUMES, J. L.; OPAS, E. E.; BONNEY, R. J. Arachidonic acid metabolities in
mouse ear oedema. In: LEWIS, A.; CAPETOLA, R. Advances in inflammations research I. Otternes, Raven Press, New York, p. 57-65, 1986
LIM, H.; PARK, H.; KIM, H.P. Inhibition of contact dermatitis in animal models
and suppression of proinflammatory gene expression by topically applied
flavonoid, wogonin. Archives of Pharmacol Research. v. 27(4), p. 442-448,
2004.
STANLEY, P.L., STEINER, S., HAVENS, M., TRAMPOSH, K.M. Mouse skin
inflammation induced by multiple topical applications of 12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate. Skin Pharmacology, v. 4, p. 262-271, 1991.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.