UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
ESTUDO DA PREVALÊNCIA DO SISTEMA SANGUÍNEO DUFFY EM DUAS
LOCALIDADES ENDÊMICAS PARA MALÁRIA VIVAX NA AMAZÔNIA
OCIDENTAL BRASILEIRA
PAULO ROBERTO RIBEIRO DE LIMA
MANAUS
2010
PAULO ROBERTO RIBEIRO DE LIMA
ESTUDO DA PREVALÊNCIA DO SISTEMA SANGUÍNEO DUFFY EM DUAS
LOCALIDADES ENDÊMICAS PARA MALÁRIA VIVAX NA AMAZÔNIA
OCIDENTAL BRASILEIRA
Dissertação apresentado ao Programa
de Pós-Graduação em Medicina
Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas em Convênio com a
Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor
Vieira Dourado, para obtenção do título
de Mestre em Doenças Tropicais e
Infecciosas.
Orientador (a): Prof. Dr. Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda
Co-orientador (a): Dr. Sérgio Roberto Lopes Albuquerque
MANAUS
2010
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Central - UEA
L732e
Lima, Paulo Roberto Ribeiro de.
Estudo da prevalência do sistema sanguíneo duffy em duas
localidades endêmicas para malária vivax na amazônia ocidental
brasileira. / Paulo Roberto Ribeiro de Lima; orientador Marcus
Vinícius Guimarães de Lacerda. - Manaus: [s. n.], 2011.
63 f. ; il. ; 30 cm + CD.
Dissertação (Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas)
Universidade do Estado do Amazonas, 2011.
Inclui bibliografia.
1. Doenças Tropicais e Infecciosas. 2. Malária - Plasmodium
vivax. 3. Fator Duffy. I. Lacerda, Marcus Vinícius Guimarães de II.
Título.
CDU(1997) 616.936
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
ESTUDO DA PREVALÊNCIA DO SISTEMA SANGUÍNEO DUFFY
EM DUAS LOCALIDADES ENDÊMICAS PARA MALÁRIA VIVAX
NA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA
PAULO ROBERTO RIBEIRO DE LIMA
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de
Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas
em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor de Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
______________________________________
Prof. Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda, Dr.
Presidente
______________________________________
Prof. Sérgio Roberto Lopes Albuquerque, Dra.
Membro
______________________________________
Profª. Maria Paula Gomes Mourão, Dr.
Membro
iii
Dedicatória
À minha família, amigos, colegas de
trabalho e orientadores pelo apoio, força,
incentivo, companheirismo e amizade. Sem
eles nada disso seria possível.
iv
AGRADECIMENTOS
• A Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para
superar as dificuldades, mostrar os caminho nas horas incertas e me
suprir em todas as minhas necessidades.
• Ao meu orientador Profº Dr. Marcus Lacerda, pela confiança, partilha do
saber e por todas as valiosas contribuições para o trabalho. Acima de
tudo, obrigado por me redirecionar nesta jornada. Com certeza teria sido
muito mais difícil sem o seu apoio.
• Ao Dr. Sérgio Albuquerque pelo apoio técnico e incentivo a mim oferecido.
Sua participação foi imprescindível para a execução do trabalho.
• À Sheila Vitor e Roberto Reys pela parceria no município do Careiro e
pelo apoio amigo ao longo da execução do projeto.
• À equipe do Projeto Epidemiologia da Malaria no Careiro: Juscelino
Torres dos Santos, Eliana Costa Lima, Detila Achão de Paula, Rosa
Gomes Cavalcante, Maria Alexandre dos Santos e Arlan Damasceno de
Freitas.
• As minhas parceiras de laboratório Lucianna Tezza e Anne Almeida, meu
muito obrigado.
• Às grandes amigas Margarida Laranjeira, Cynthia Ferreira, Layla Roja,
Waldelice que foram meus alicerces emocionais contribuindo com sua
amizade e carinho ao estarem sempre presentes com gestos e palavras
de incentivo durante os últimos anos.
• Ao meu irmão, minhas irmãs e minha filha, pelo carinho, paciência e
incentivo.
• Agradeço, de forma muito carinhosa, a minha mãe, pois sua paciência
infinita e sua crença absoluta na minha capacidade de realização foram,
indiscutivelmente, fundamentais na construção e execução deste
trabalho.
Obrigatório - A todas as pessoas e instituições que de maneira relevante contribuíram
para a realização do trabalho. Não esquecer de incluir os nome da UEA, FMTAM,
SUFRAMA, CAPES, FMURAKI.
v
RESUMO
A malária, doença infecciosa causada por protozoários do gênero
Plasmodium, é um dos principais problemas de saúde pública em países em
desenvolvimento. O Brasil é responsável por mais de 50% dos casos de
malária registrados no continente americano, estando a doença praticamente
restrita aos estados da Amazônia legal. O Município do Careiro, local de
estudo situado no estado do Amazonas, é considerado uma área
hiperendêmica. Os polimorfismos do grupo sanguíneo Duffy são importantes
em áreas onde Plasmodium vivax é predominante, porque essa molécula atua
como um receptor para o parasita. No entanto, reportes recentes apontam para
individuos Duffy negativos infectados por esse parasito, sugerindo outras
formas de invasão eritrocitária. No presente estudo, estimamos a prevalência
dos genótipos do grupo sanguíneo Duffy em duas localidades com alta
incidência para malária vivax. Os genótipos mais frequentes foram encontrados
FYA/FYB (37,8%), FYA / FYA (22,6%), FYB/FYB (13,4%), FYA/FYB-33
(12,9%) e FYB/FYB-33 (9%). Baixas frequências foram detectadas nos
genótipos FYB-33/FYB-33 (2,4%), FYA/FYX (1,3%) e FYB/FYX (0,9%). Não foi
encontrado o genótipo FYX/FYX. Evidenciamos também um caso de infecção
por P. vivax entre os indivíduos do grupo Duffy-negativos (homozigoto FYB-33).
A identificação do parasito foi determinada por gota espessa e por PCR em
tempo real, e a do grupo Duffy por meio de genotipagem usando PCR/RFLP e
de fenotipagem usando teste de hemaglutinação em cartão de gel. Estes
achados apontam para a necessidade de mais estudos epidemiológicos de
malária por P. vivax na Amazônia Brasileira. É necessário esclarecer a possível
transmissão do P. vivax entre os habitantes Duffy-negativo da região
amazônica brasileira, e a função dos diversos genótipos na incidência e na
apresentação clínica da malária.
Palavras chave: Malária, Fator Duffy, Plasmodium vivax, Grupo Sanguíneo,
Prevalência.
vi
ABSTRACT
Malaria, an infectious disease caused by protozoa of the genus Plasmodium,
is one of the main public health problems in developing countries. Brazil
accounts for more than 50% of malaria cases registered in the American
continent, and the disease is virtually restricted to the states of the legal
Amazon. The Municipality of Careiro, study area located in Amazonas state, is
considered an hyperendemic area. The Duffy blood group polymorphisms are
important in areas where P. vivax is predominant, because this molecule acts
as a receptor for the parasite. However, recent reports point to Duffy negative
patients infected by this parasite, suggesting other forms of erythrocyte
invasion. In this study, we estimated the prevalence of the Duffy blood group
genotypes in two locations with high incidence of malaria vivax. Most frequent
genotypes were FYA/FYB (37.8%), FYA/FYA (22.6%), FYB/FYB (13.4%),
FYA/FYB-33 (12.9%) and FYB/FYB-33 (9%). Low frequencies were detected in
genotypes FYB-33/FYB-33 (2.4%), FYA/FYX (1.3%) and FYB/FYX (0.9%).
FYX/FYX was not found. We also evidenced a case of P. vivax among Duffynegative individuals (homozygous FYB-33). The parasite identification was
determined by thick smear and by real-time PCR, and the Duffy status by
genotyping using PCR / RFLP and by phenotyping using hemaglutination test in
gel card. These findings highlight the necessity for further epidemiological
studies of P. vivax malaria in the Brazilian Amazon. It is necessary to elucidate
the possible transmission of P. vivax among the inhabitants with Duffy-negative
blood group from Brazilian Amazon region, and the role of the different
genotypes on the incidence and the clinical presentation of malaria.
Keywords: Malaria, Factor Duffy, Plasmodium vivax, Blood Group, Prevalence.
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Número de casos de malária registrados no Brasil entre 1960 a 2009.............
11
Figura 2: Incidência parasitária anual (IPA) da malária por município de infecção,
Amazônia Legal, 2006. Ministério da Saúde, 2007.......................................................... 12
Figura 3: Número de casos de malária notificados nos últimos cinco anos no município
do Careiro, Ministério da Saúde, 2007............................................................................. 13
Figura 4: Ilustração do sistema sanguíneo Duffy com seus respectivos genótipos e
fenótipos............................................................................................................................. 15
Figura 5: Ilustração do ciclo do Plasmodium vivax em humanos mostrando a interação
das proteínas ligantes do parasita com os antígenos Duffy durante a invasão dos
eritrócitos............................................................................................................................. 17
Figura 6 - Localização no município do Careiro do Projeto de Assentamento Agrícola
Panelão e da Comunidade Céu Azul na BR 319.......................................
22
Figura 7: Curva de dissociação da PCR em tempo real demonstrando a temperatura
específica dos produtos de PCR feitos para P. vivax (75ºC) em paciente Duffy negativo
Fy( a-b-).............................................................................................................................. 27
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Frequência dos fenótipos Duffy encontrada na população estudada................. 27
Tabela 2. Prevalência dos genótipos do grupo sanguíneo Duffy na população de
estudo.................................................................................................................................. 28
ix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 11
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
A malária no estado do Amazonas .............................................................................
A malária no município do Careiro ..............................................................................
O grupo sanguíneo Duffy ............................................................................................
Grupo sanguíneo Duffy e malária ...............................................................................
Técnica de PCR/RFLP ................................................................................................
PCR e Diagnóstico de Malária.....................................................................................
12
13
13
16
18
19
2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 21
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................................. 21
2.2 Objetivo Específico...................................................................................................... 21
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................
3.1 Tipo de Estudo ............................................................................................................
3.2 Área de Estudo ...........................................................................................................
3.3 Amostra .......................................................................................................................
3.4 Critérios de Inclusão ...................................................................................................
3.5 Seleção dos participantes ...........................................................................................
3.5.1 Censo preliminar .......................................................................................................
3.5.2 Corte transversal .......................................................................................................
3.5.3 Seguimento de Coorte ..............................................................................................
3.6 Diagnóstico por hemoscopia .......................................................................................
3.7 Determinação do fenótipo Duffy...................................................................................
3.8 Genotipagem do sistema sanguíneo Duffy ..................................................................
22
22
22
23
23
23
24
24
24
25
25
25
4. RESULTADOS................................................................................................................ 28
5. DISCUSSÃO .................................................................................................................. 30
6.PERSPECTIVAS FUTURAS........................................................................................... 35
7. CONCLUSÃO................................................................................................................. 36
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................
37
9. ANEXOS ........................................................................................................................
9.1 Anexo 1 - TCLE ...........................................................................................................
9.2 Anexo 2 - Questionário de visita transversal ...............................................................
9.3 Anexo 3 - Questionário de detecção passiva ..............................................................
9.4 Anexo 4 - Questionário Protocolo de PCR/RFLP .......................................................
9.5 Anexo 5 - Questionário de Fenotipagem.....................................................................
42
36
44
45
46
59
x
9.6 Anexo 6 - Questionário de Resultados......................................................................... 63
9.7 Anexo 7 – Aprovação do CEP...................................................................................... 64
1
1. INTRODUÇÃO
A malária é um dos maiores problemas de saúde pública nos países em
desenvolvimento. Estima-se que a incidência mundial seja de 500 milhões de casos
com o número de morte entre um a três milhões de pessoas. A doença é
considerada endêmica em 107 países e territórios, sendo o continente africano a
região mais atingida(1).
É uma doença infecciosa causada por protozoários do gênero Plasmodium,
onde quatro espécies parasitam o homem: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P.
ovale. Das quatro, o Plasmodium vivax é o de maior prevalência e menor
mortalidade sendo atribuídos ao Plasmodium falciparum os casos de malária severa,
com complicações clínicas, possivelmente, fatais. A maior virulência atribuída ao P.
falciparum está, principalmente, relacionada à capacidade do parasita de
citoaderência e roseteamento em capilares profundos de órgãos vitais(2).
Recentemente Plasmodium knowlesi tem sido implicado também em doença
humana, inclusive com gravidade clínica.
Entre os países da América do Sul, o Brasil é responsável por mais de 50% dos
números de casos registrados de malária e as infecções causadas pelo P. vivax
prevalecem no território brasileiro desde o final da década de 80 (Figura 1).
Figura 1: Número de casos de malária registrados no Brasil entre 1960 a 2009.
2
1.1 A malária no Estado do Amazonas
Mesmo sendo de grande incidência, a malária não ocorre de maneira
homogênea no território brasileiro, estando praticamente restrita aos estados da
Amazônia legal, localizados ao norte do país (Figura 2). Devido aos focos
endêmicos da região o Ministério da Saúde tem intensificado as ações de controle
nesses estados que juntos registram altos níveis de incidência parasitária anual
(IPA) sendo responsáveis por 99,5% dos casos de malária no Brasil(3). O estado do
Amazonas contribui com grande parte da porcentagem anual de casos de malária na
Amazônia Legal tendo registrado 198.987 notificações em 2007 correspondendo a
37,77% do total nacional (4).
Figura 2: Incidência parasitária anual (IPA) da malária por município de infecção,
Amazônia Legal, 2006. Ministério da Saúde, 2007.
Na região da Amazônia Legal foram identificados e classificados 71 municípios
como áreas de alto risco para malária. A transmissão nessa área está relacionada a
fatores biológicos (alta densidade de mosquitos vetores); geográficos (altos índices
de pluviosidade, amplitude da malha hídrica e a cobertura vegetal); ecológicos
(desmatamentos, construção de hidroelétricas, estradas, sistemas de irrigação e
açudes); e sociais (numerosos grupos populacionais residindo em habitações
inadequadas)(5, 6).
3
No estado do Amazonas, apesar da elevada incidência da doença, os casos de
malária não se encontram uniformemente distribuído entre seus municípios, Manaus
concentra grande parte do total registrado no estado, em 2007 foram notificados
49.838 casos o que corresponde a 25,05% do total(7).
1.2
A malária no Município do Careiro
O Município do Careiro localiza-se a 102 km de Manaus possuindo uma
população estimada em 31.000 indivíduos, sendo considerado uma área
hiperendêmica para a malária. Em 2007 apresentou 9.230 casos notificados o
correspondente a 4,6% do total no estado do Amazonas(7).
Ao longo dos últimos cinco anos, de 2003 a 2007, houve um crescente aumento
no número de casos de malária no município (Figura 3). O gráfico mostra um
notificados
deofcasos
Número
cases
reported
Number
crescente número de casos de malária no período de junho a setembro (4).
2500
2000
2003
1500
2004
2005
1000
2006
500
2007
0
J
F
M
A
M
J
J
A
S
O
N
D
Months
of the
Meses do
anoyear
Figura 3 – Número de casos de malária notificados nos últimos cinco anos no
município do Careiro, Ministério da Saúde, 2007.
1.3 O Grupo sanguíneo Duffy
O Sistema Duffy (Fy) foi identificado em 1950 por Cutbush et al., sendo o
primeiro grupo sanguíneo a ser determinado a um loco autossômico específico (8) em
eritrócitos através de aloanticorpos encontrados no soro de um hemofílico
politransfundido que reconheceu o antígeno Fya(9). No ano seguinte, Ikin et al.
4
descreveram o antígeno Fyb
(10)
. Sendo os outros antígenos Fy3, Fy4, Fy5 e Fy6
descritos nas décadas seguintes.
Em 1987, o primeiro anticorpo monoclonal murino obtido anti-Fy6 definiu o
determinante antigênico Fy6 tornando-se importante nos estudos estruturais e
funcionais do sistema Duffy, já que o antígeno Fy6 está presente em todas as células
Duffy-positivo, mas ausente em células Duffy-negativo. Outros anticorpos anti-Fy6
monoclonais foram produzidos e usados como instrumento que auxiliaram tanto no
isolamento de proteínas Duffy quanto para a clonagem desse gene(11).
O maior avanço no conhecimento do sistema de grupo sanguíneo Duffy foi
alcançado com a clonagem do gene FY, localizado na região 1q22-23 do
cromossoma 1. A glicoproteína Duffy (gpFy) atravessa a membrana nove vezes,
possuindo um domínio extracelular N-terminal e um domínio intracelular Cterminal(12). A glicoproteína é caracterizada por dois alelos: FYA e FYB. Os dois se
diferem um do outro pela troca de uma base no nucleotídeo 125. No FYA a base é
guanina (G) e no FYB a base é adenina (A). O resultado desta substituição são
aminoácidos diferenciados para cada alelo. FYA produz códon para o aminoácido
glicina enquanto FYB para ácido aspártico(13).
Os alelos A e B do sistema sanguíneo Duffy formam os genótipos FYA/FYA,
FYB/FYB e FYA/FYB, produzindo os fenótipos Fy (a+b-), Fy (a-b+), Fy (a+b+) e Fy
(a-b-) (figura 4). O fenótipo Fy (a-b-) representa a ausência do antígeno Duffy. A
maioria dos africanos ocidentais e cerca de 68% dos negros americanos não
expressam os antígenos Fya ou Fyb em seus eritrócitos(14).
5
Figura 4: Ilustração do sistema sanguíneo Duffy com seus respectivos genótipos
e fenótipos.
O fenótipo Fy (a-b-) em negros mostrou ser devido a uma mutação pontual -33
T→C na região promotora do GATA Box que leva ao silenciamento do gene
FYB(15,16). É ocasionado pelo polimorfismo de um único nucleotídeo na sequência
TTATCT (relacionada com fatores GATA de transcrição) presente nos alelos A e B.
Esta sequência é mutada para TTACCT no fator GATA-1 específico para eritrócito
levando a inibição do gene no tecido hematopoiético, mas não nos outros tecidos(17).
A mutação -33C é normalmente associada ao gene do FYB sendo muito rara
encontrar-se associado ao gene FYA(18).
Além da mutação do GATA Box outra mutação comum ocorre na região
codificadora do gene FYB modificando-o para o gene FYX. Resulta da substituição
265 C→T associada com a 298 G→A responsável pela expressão muito baixa ou
não funcional do antígeno Fyb caracterizando assim o antígeno Fyx(19).
Estudo realizado por Horuk et al.(20) mostrou que os antígenos do grupo
sanguíneo Duffy exercem a função de receptores de quimiocinas o que levou a
denominação, para tais antígenos, de Antígeno Duffy para Receptor de Quimiocinas
(DARC, em inglês). Mostrou-se neste trabalho que a IL-8 liga-se de forma mínima ou
até mesmo nula com eritrócitos Duffy negativo. Também foi visto, no mesmo estudo,
6
que anticorpos monoclonais para antígenos Duffy impediam a ligação de IL-8 em
eritrócitos Duffy positivo.
A IL-8 é um ligante do DARC eritróide que possui baixo peso molecular com
aproximadamente 8kDa, produzida pela maioria das células do organismo,
principalmente macrófagos e células endoteliais, exercendo importante papel no
processo de migração celular. A IL-8 atua como potente indutor de quimiotaxia para
neutrófilos. Quando introduzida na circulação se liga rapidamente ao DARC eritróide
tornando-se desta forma incapaz de ativar neutrófilos. Com isso o DARC acaba
funcionando
como
“escoadouro”
para
a
IL-8
lançada
na
circulação.
Consequentemente o DARC acaba servindo como fator limitante da estimulação de
leucócitos já que promove uma redução da IL-8 sanguínea(21).
A presença do DARC em células endoteliais das vênulas pós-capilares,
associado a sua capacidade de absorção de quimiocinas, sugere que esta proteína
pode estar envolvida na cascata inflamatória participando na formação do gradiente
de quimiocinas responsáveis em lançar os linfócitos na circulação para os sítios de
inflamação(22). Apesar de em tese apresentar um papel de regulador da resposta
imune, poucos estudos tem se ocupado do entendimento do papel do receptor
DARC e suas variantes genéticas na modulação da resposta imune em doenças
infecciosas.
1.4 Grupo sanguíneo Duffy e malária
A glicoproteína Duffy, além de se ligar a várias quimiocinas, também pode atuar
como facilitador no processo de invasão dos eritrócitos para o Plasmodium vivax(19)
(figura 5). Os antígenos do sistema sanguíneo Duffy acabam funcionando como
receptores para os ligantes merozoítas do P. vivax os quais contém os domínios
DBL (Duffy Binding Ligand)(23).
7
Figura 5: Ilustração do ciclo do Plasmodium vivax em humanos mostrando a
interação das proteínas ligantes do parasita com os antígenos Duffy durante a
invasão dos eritrócitos.
Barnwell et al.(23) em 1989, utilizando anticorpos monoclonais Fy 6, demonstraram
que a glicoproteína Duffy eritrocitária é necessária como ligante na invasão de
hemácias humanas por merozoítos de P. vivax.
A especificidade dos parasitos da malária pelas hemácias parece depender do
número de interação entre ligantes e receptores(21). Em P. vivax, o ligante merozoíta
que interage com o DARC foi identificado como Duffy Binding Protein (DBP) (24).
Entretanto, apesar se ser um receptor reconhecido de invasão de P. vivax, tem se
especulado a existência de outros receptores de invasão celular deste parasito.
Além disso, a evidência epidemiológica de que na África, onde a maior parte da
população é Duffy negativa, a circulação de P. vivax é limitada, fez com que se
entendesse o fator Duffy como essencial para a infecção por P. vivax.
Alguns trabalhos têm indicado associação dos grupos sanguíneos Duffy quanto
à susceptibilidade à infecção pelo Plasmodium vivax(25-27). Cavasini et al.(25) relatam
uma alta frequência dos alelos FYA e FYB entre pacientes com a doença. E entre os
genótipos, o FYA/FYB e FYA/FYA aparecem relacionados a uma elevada frequência
8
de infecção pelo Plasmodium vivax, sugerindo que estes indivíduos tenderiam a
maior risco de infecção pelo parasito.
Albuquerque et al.(28) em estudo recente realizado no estado do Amazonas
também encontrou os genótipos FYA/FYB e FA/FYA associados ao aumento da
frequência de infecção pelo P. vivax. Entre os demais genótipos encontrados o
FA/FYB-33 e FYB/FYB-33 aparecem associados à diminuição da taxa de infecção,
já o FYA/FYX e FYB/FYX apesar de não aparecerem associados à taxa de infecção,
mostraram-se associados ao baixo nível de densidades parasitárias detectadas. O
problema de tais estudos é que utilizaram como grupo controle pacientes sem
malária, em uma avaliação transversal, mas que não estavam necessariamente
expostos ao risco da doença.
O fenótipo Duffy negativo, diferente dos demais é conhecido como uma resposta
adaptativa que confere resistência à infecção eritrocitária por Plasmodium vivax,
devido tal grupo não expressar os antígenos Fy na superfície das hemácias. Porém
pouco se conhece sobre a susceptibilidade ao P. vivax entre os indivíduos Duffy
negativo com alelos heterozigotos (+/-)(29).
Cavasini et al.(30) relataram o achado de dois indivíduos com fenótipo Fy (a-b-) e
genótipo com a mutação FYB-33/FYB-33 com evidências de infecção por malária
vivax ambos na região amazônica. Pasvol(31) verificou indivíduos Duffy negativo
acometidos pela infecção causada por P. vivax na Amazônia e na África sugerindo
evidências de adaptações naturais do P. vivax em áreas endêmicas para malária.
Tais achados começaram a mudar a concepção de que apenas o sistema Duffy era
utilizado pelo parasito no processo de invasão celular, alavancando uma nova frente
de investigação básica sobre a biologia do parasito.
1.5 Técnica de PCR/RFLP
É um método que possibilita amplificar sequências específicas de um DNA alvo e
quando aplicada ao diagnóstico clínico oferece resultados mais precisos e
confiáveis(32).
9
O polimorfismo no comprimento de fragmentos de DNA digerido (RFLP) é obtido
através do tratamento do DNA com enzimas de restrição, que o corta em
determinados pontos (sítios de restrição), gerando fragmentos(33).
A técnica de PCR-RFLP utilizada na genotipagem molecular de grupos
sanguíneos é realizada quando uma mutação polimórfica está associada com a
alteração (produção ou remoção) de um sítio de enzima(s) de restrição. Este
procedimento possibilita a amplificação concomitante de ambos os alelos, com um
único par de oligo nucleotídeos. Assim, uma reação positiva (produto de PCR
amplificado) é observada com ambos os alelos que servem como um controle
interno. A diferenciação dos alelos é feita depois da digestão do produto de PCR
com uma enzima de restrição (capaz de identificar a mutação de ponto) e análise em
eletroforese, ferramenta que permite a visualização do tamanho dos fragmentos de
DNA produzidos (34).
1.6
PCR e Diagnóstico de Malária
Na busca de novos métodos laboratoriais mais sensíveis para o diagnóstico
de malária, a biologia molecular tem disponibilizado ferramentas úteis nesse
processo. A técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), utilizada
atualmente para o diagnóstico de várias doenças infecciosas, tem se mostrado
eficaz quanto à sensibilidade e a especificidade comparada ao exame microscópico.
A técnica da PCR, desenvolvida por Kary Mullis, reproduz in vitro a habilidade
natural de replicação do DNA. É um método que possibilita amplificar seqüências
específicas de um DNA alvo e quando aplicada ao diagnóstico clínico oferece
resultados mais precisos e confiáveis(32).
Para a detecção dos Plasmodium sp. em amostras sanguíneas humanas, a
PCR amplifica a seqüência conservada do gene da subunidade menor do RNA
ribossomal do Plasmodium spp. (SSUrRNA).(35)
Atualmente, a PCR em tempo real vem ganhando espaço nos laboratórios de
pesquisa. O diferencial é que a mesma oferece resultados em menor tempo e com
10
menor possibilidade de contaminação(35). Esta variação da PCR convencional
oferece a mesma sensibilidade que o nested PCR (36) sendo assim, aplicável na
detecção de infecções de malária mista e com baixo nível de parasitemia (37, 38).
De acordo com os estudos citados, verificamos a importância da glicoproteína
eritrocitária Duffy no processo de invasão de hemácias humanas pelo Plasmodium
vivax, porém pouco se conhece sobre a influência das mutações nesta glicoproteína
na densidade parasitária, como também sobre a associação dos genótipos Duffy
com a proteção ou risco à infecção pelo parasito. Contudo buscamos realizar neste
estudo a prevalência dos genótipos do grupo sanguíneo Duffy em uma área
endêmica
de
malária
na
região
amazônica.
11
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
 Estimar a prevalência dos genótipos do grupo sanguíneo Duffy em moradores
de duas localidades da Amazônia Ocidental Brasileira.
2.2 Objetivo Específico
 Investigar a ocorrência de infecção por Plasmodium vivax em indivíduos
Duffy-negativo na população estudada.
12
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Tipo de Estudo
Para a estimativa de cada genótipo do grupo sanguíneo Duffy entre a população
estudada foram utilizadas amostras sanguíneas obtidas no corte transversal
realizado em novembro de 2009.
Para verificarmos a ocorrência de infecção por Plasmodium vivax em indivíduos
Duffy-negativo na população estuda, utilizamos os resultados obtidos no estudo de
coorte realizado pelo projeto parceiro Epidemiologia da Malária no Município do
Careiro. O estudo contou com detecção passiva e ativa dos casos de malária vivax
por gota espessa e PCR no período de agosto de 2008 a dezembro de 2010.
3.2 Área de Estudo
Município do Careiro
O estudo foi desenvolvido em duas localidades no município do Careiro
localizado no Estado do Amazonas, na 7ª Sub-Região (Região do Rio Negro –
Solimões), às margens do Rio Castanho (figura 6).
O assentamento agrícola Panelão foi criado pelo INCRA em 1998 e localiza-se
na BR-319 (Manaus - Porto Velho), no km 117, no município do Careiro. É um ramal
de 9 km dividido em seis vicinais. Por se tratar de uma área relativamente isolada,
há um baixo fluxo migratório entre os moradores.
A Comunidade Céu Azul localiza-se as margens da BR 319, do km 118 ao km
149. É uma área de 31 km também localizada no município do Careiro.
Ambas comunidades representam bem o perfil das novas áreas de ocupação
na Amazônia Brasileira, motivadas pela agricultura familiar e pela distribuição de
13
terras, o que perpetua o ciclo de doenças como a malária, com ampla variabilidade
genética do hospedeiro, procedente de diversas partes do país.
Figura 6 - Localização no município do Careiro do Projeto de Assentamento Agrícola
Panelão e da Comunidade Céu Azul na BR 319.
3.3 Amostra
Foram incluídas todas as pessoas residentes nas localidades escolhidas que
cumpriram os critérios de inclusão e que aceitaram participar do estudo.
3.4 Critério de Inclusão.
 Aceitar participar do estudo proposto.
3.5 Seleção dos participantes
Este estudo faz parte do projeto “Epidemiologia da Malária no município do
Careiro”, que está sendo desenvolvido pela Fundação de Medicina Tropical Dr.
Heitor Vieira Dourado - FMT/VHD desde o ano de 2008, nas referidas comunidades,
14
sendo a população de estudo comum aos dois projetos. O projeto tem financiamento
do CNPq e da Fundação Cellex, em Barcelona.
O Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) aplicado aos
participantes do estudo foi elaborado pelo projeto parceiro sendo comum para
ambos (anexo1), tendo sido aprovado pelo Comitê de ética de Pesquisa em Seres
Humanos da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (anexo 7).
3.5.1 Censo preliminar
As comunidades participantes do estudo foram submetidas a um censo
preliminar que indicou o total de famílias residentes no assentamento Panelão e
comunidade Céu Azul, possibilitando estimar o número real de moradores (673
moradores).
3.5.2 Corte transversal
Durante a realização do corte transversal feito em novembro de 2009, as
pessoas que cumpriram com os critérios de inclusão foram convidadas a participar
no presente estudo, solicitando-lhes previamente a assinatura no Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Aos voluntários menores de 18 anos foi
solicitada a assinatura dos pais ou responsáveis legais. Dos 673 moradores
cadastrados pelo censo, 465 foram incluídos neste estudo.
Coletamos de cada participante, uma amostra de aproximadamente 300
microlitros (µL) de sangue total em tubos de 0,5 mL contendo 20 µL de EDTA. A
amostra de sangue foi coletada da porção digital do dedo. As informações obtidas
foram registradas em formulário padrão (questionário de visita transversal, anexo 2)
3.5.3 Seguimento de Coorte
No período de agosto de 2008 a dezembro de 2010 foi realizada a detecção
passiva de casos de malária em caráter permanente. O acompanhamento constou
de diagnóstico laboratorial (utilizando o método da gota espessa). As informações
15
obtidas também foram registradas em formulário padrão (Questionário de detecção
passiva, anexo 3).
3.6 Diagnóstico por hemoscopia
A leitura das lâminas foi feita por técnicos treinados e com experiência no
diagnóstico por microscopia. Esta etapa do projeto foi realizada no posto de saúde
das próprias comunidades. Os critérios para o exame das lâminas seguiram o
padrão de rotina já estabelecido pelo Ministério da Saúde.
3.7 Determinação do fenótipo Duffy
Das amostras testadas, 465 foram incluídas neste estudo. Os fenótipos do
sistema
sanguíneo
Duffy
foram
determinados
pelo
método
clássico
de
hemaglutinação em cartões de gel (Diamed ®), utilizando anticorpos anti-Fya e antiFyb padronizados pela mesma empresa. O procedimento técnico de fenotipagem por
gel centrifugação seguiu rigorosamente o protocolo padronizado e validado no
Hemocentro do Amazonas (HEMOAM), garantindo assim um resultado confiável
quanto à especificidade para a expressão antigênica do sistema sanguíneo Duffy
(POP_MAL_LB_004_v02_PT, item 7; anexo 6).
3.8 Genotipagem do sistema sanguíneo Duffy
A extração do DNA das 465 amostras foi realizada a partir de sangue total
utilizando os “kits” de extração Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega ®),
seguindo o protocolo estabelecido pelo fabricante (POP_MAL_LB_005_v02_PT,
anexo 6).
Após o procedimento de extração do DNA as amostras foram submetidas à
técnica de PCR/RFLP. A etapa de amplificação do DNA foi dividida em duas PCRs,
uma para a determinação do grupo sanguíneo Duffy e mutação FYX (PCR Duffy) e
outra para a determinação da mutação do GATA Box (PCR GATA).
16
A reação em cadeia da polimerase para a genotipagem dos grupos do sistema
sanguíneo Duffy (PCR Duffy) foi realizada com os oligo nucleotídeos específicos
FYAB1 (sense 5’ TCC CCC TCA ACT GAG AAC TC 3’) e FYAB2 (anti-sense 5’ AAG
GCT GAG CCA TAC CAG AC 3’) seguindo o protocolo de genotipagem adotado
pelo projeto (POP_MAL_LB_005_v02_PT, item 8; anexo 6).
Os produtos do DNA amplificado na PCR Duffy foram aplicados em gel de
agarose a 1,5%, visualizados com brometo de etídeo apresentando uma banda de
392pb (POP_MAL_LB_005_v02_PT, item 9; anexo 6).
O produto da PCR Duffy foi tratado com a enzima de restrição BanI e incubado
por 4 horas a 37ºC (POP_MAL_LB_005_v02_PT, item 10; anexo 6). O produto da
digestão enzimática foi observado em gel de agarose a 1,5%, visualizados com
brometo de etídeo (POP_MAL_LB_005_v02_PT, item 9; anexo 6). O gene FYA
apresentou a banda de 210pb e o gene FYB a banda de 306pb.
Após a obtenção do perfil genotípico para Duffy (FYA/FYA, FYB/FYB e
FYA/FYB) da população em estudo, foram selecionadas apenas as amostras que
possuíam o alelo FYB para a verificação de possíveis mutações na região promotora
(mutação do GATA Box) ou na região codificadora (mutação FYX) do gene FYB.
Para a verificação do polimorfismo -33 T→C no promotor do GATA Box foram
utilizadas as amostras com genótipo FYA/FYB e FYB/FYB. Para a PCR GATA
utilizou-se os oligo nucleotídeos específicos FYN1 (sense 5’ CAA GGC TGA CCC
CCA TA 3’) e FYN2 (anti-sense 5’ CAT GGC ACC GTT TGG TTC AG 3’) seguindo o
protocolo de genotipagem padrão (POP_MAL_LB_005_v02_PT, item 8; anexo 6).
Os produtos de DNA amplificados na PCR GATA foram observados em gel de
agarose a 1,5%, com brometo de etídeo. O DNA amplificado apresentou uma banda
de 189pb.
O produto da PCR GATA foi tratado com a enzima de restrição StyI e incubado
por 4 horas a 37ºC (POP_MAL_LB_005_v02_PT, item 10; anexo 6). O produto da
digestão enzimática foi observado em gel de poliacrilamida a 8% (protocolo de gel,
17
anexo 9). Os genótipos GATA NORMAL apresentaram as bandas com 108 e 81pb,
enquanto os GATA MUTADO apresentaram uma banda extra de 61 pb.
Para a verificação do SNP (do inglês Single Nucleotide Polymorphism) 265 C→T
e 298 G→A na cadeia codificadora do FYB e que caracteriza a mutação FYX foram
utilizadas as amostras com genótipo FYA/FYB e FYB/FYB que não apresentaram
mutação do GATA Box.
A PCR realizada seguiu o mesmo protocolo da PCR Duffy incluindo os oligo
nucleotídeos iniciadores. (POP_MAL_LB_005_v02_PT, item 8; anexo 6).
O produto da PCR Duffy foi tratado com a enzima de restrição MspAI para
verificar o SNP 265 C→T incubado por 4 horas a 37ºC e com a enzima de restrição
MWO para o SNP 298 G→A incubado por 4 horas a 60ºC (protocolo de RFLP,
anexo 7), visualizado em gel de poliacrilamida a 8%. Os genótipos mutados para o
SNP 265 C→T apresentaram banda extra de 161pb e os mutados para o SNP 298
G→A apresentaram banda extra de 343pb.
Todos os procedimentos de fenotipagem e genotipagem foram realizados no
Laboratório de Biologia Molecular do Setor de Imunohematologia do Hemocentro do
Amazonas, sob responsabilidade do Dr. Sérgio Albuquerque.
18
4.
RESULTADOS
A prevalência fenotípica encontrada para o sistema sanguíneo Duffy na
população demonstrou uma maior ocorrência dos fenótipos Fy (a+b+) (37,6%) e Fy
(a+b-) (36,8%), seguido pelos fenótipos Fy (a-b+) (23,3%) e Fy (a-b-) (2,4%), como
demonstrado abaixo na tabela 1.
Tabela 1. Frequência dos fenótipos Duffy encontrada na população estudada.
Fenótipo Duffy
Fy (a+b+)
Fy (a+b-)
Fy (a-b+)
Fy (a-b-)
Participantes
175
171
108
11
465
%
37,6
36,8
23,2
2,4
Em nenhum dos pacientes avaliados, o teste fenotípico foi discordante do
teste genotípico, com 100% de concordância. Na revisão dos dados de incidência de
malária (dados não apresentados), um paciente com fenótipo Duffy negativo Fy (a-b) apresentou infecção por P. vivax confirmada por microscopia óptica e PCR.
Figura 7: Curva de dissociação da PCR em tempo real demonstrando a
temperatura específica dos produtos de PCR feitos para P. vivax (75ºC) em paciente
Duffy negativo Fy (a-b-).
Em nossa população de estudo (465 participantes) verificou-se uma maior
prevalência do genótipo FYA/FYB (37,6%), seguido pelos genótipos FYA/FYA
(22,6%), FYB/FYB (13,3%), FYA/FYB-33C (12,9%), FYB/FYB-33C (9,0%), FYB-33C/
FYB-33C (2,4%), FYA/FYX (1,3%) e FYB/FYX (0,9%). Não registramos frequência do
19
genótipo FYX/FYX entre as amostras analisadas, como demonstrado abaixo na
tabela 2.
Tabela 2. Prevalência dos genótipos do grupo sanguíneo Duffy na população
estudada.
Fenótipo Duffy
Fy (a+b+)
Fy (a+b-)
Fy (a-b+)
Genótipo Duffy
FYA/FYB
FYA/FYA
FYA/FYX
FYA/FYB-33
FYB/FYB
FYB/FYX
Fy (a-b-)
FYB/FYB-33
FYB-33/FYB-33
FYX/FYX
Total
Participantes
175
105
6
%
37,6
22,6
1,3
60
62
12,9
13,3
4
0,9
42
11
9,0
2,4
0
465
0
20
5.
DISCUSSÃO
A prevalência fenotípica do grupo sanguíneo Duffy encontrada na população
mostrou os fenótipos Fy (a+b+) 37,6% e Fy (a+b-) 36,8% como os mais frequentes
na população estudada, seguido pelos fenótipos Fy (a-b+) 23,2% e Fy (a-b-) 2,4%
(tabela 2). Albuquerque et al.(29) em estudo realizado na Cidade de Manaus também
encontrou os fenótipos Fy (a+b+) e Fy (a+b-) como os mais frequentes entre
pacientes infectados por Plasmodium vivax.
A distribuição diferenciada dos determinantes antigênicos Duffy, nos diversos
grupos étnicos, é característica desse sistema de grupo
sanguíneo. Os
determinantes antigênicos Fya são prevalentes entre chineses, japoneses, e
melanésios, porém apresenta baixa freqüência entre negros africanos(40,41). No
entanto, o antígeno Fyb é mais abundante na população caucasóide do que em
asiáticos e negros africanos e americanos(42,43).
Em um estudo realizado por Novaretti et al.(44) em doadores de sangue na
cidade de São Paulo, a freqüência fenotípica encontrada de Fy (a+b+) foi de 41,4%
para caucasóides e 1,6% para negros; Fy (a+b-) foi de 19,8% para caucasóides e
14% para negros, mostrando diferença significativa na frequência desses fenótipos
entre brancos e negros naquela população.
A Amazônia brasileira possui uma composição étnica altamente heterogênea,
resultado da hibridação das numerosas populações nativas indígenas pré-existentes
principalmente com populações de ascendência branca(45). Tal característica de
ocupação dessa região justificaria então a elevada prevalência dos fenótipos Fy
(a+b+) e Fy (a+b-) encontrada em nosso estudo.
Entre os genótipos do sistema do grupo sanguíneo Duffy foi observado uma alta
prevalência do genótipo heterozigoto FYA/FYB, correspondendo a 37,6% do total de
465 participantes seguido pelo genótipo homozigoto FYA/FYA (22,6%).
21
A elevada frequência dos alelos FYA e FYB na população da Amazônia
brasileira provavelmente ocorra devido à forte influência da colonização Portuguesa
na região norte do Brasil, bem como a presença populações indígenas(46). De fato,
estudo realizado na região norte do Brasil com diferentes tribos indígenas indicou o
alelo FYA como o mais frequente(47).
Cavasini et al.
(26)
em seu estudo de caso controle, utilizando amostras
provenientes dos estados Macapá, Amapá, Pará e Rondônia, mostrou o genótipo
FYA/FYB como o mais freqüente entre os pacientes infectados pelo Plasmodium
vivax, assim como entre os indivíduos utilizado grupo controle, formado por
doadores de sangue sem antecedentes de malária. Outro estudo realizado no
Amazonas por Albuquerque et al.(29), seguindo o mesmo perfil metodológico do
estudo citado anteriormente, apenas com pacientes infectados por P. vivax também
reportou o genótipo FYA/FYB como o mais prevalente quando comparado aos
outros genótipos Duffy.
Embora não tenhamos utilizado alguma medida quantitativa ou qualitativa das
expressões da glicoproteína Duffy neste estudo, vimos durante nossa pesquisa
publicações que apontam para a possibilidade de que indivíduos heterozigotos são
susceptíveis à malária por P. vivax(26,29,48).
Woolley et al.(48) demonstraram in vitro, pela técnica de citometria de fluxo, que
há diferenças no nível de expressão da glicoproteína Duffy na superfície de
reticulócitos. O epítopo Fy6 considerado importante no processo de invasão pelo
Plasmodium vivax, apresentou menor expressão no genótipo FYB/FYB quando
comparado aos genótipos FYA/FYB e FYA/FYA, o que indica que indivíduos
heterozigotos (FYA/FYB) possuem maior variação de receptores eritrocitários para
proteínas ligantes utilizadas pelo parasita, o que justifica a elevada freqüência
desses genótipos em pacientes acometidos por malária vivax.
O genótipo FYB/FYB (13,3%) foi o terceiro mais prevalente na população
corroborando com o achado por Woolley et al.(48) e Albuquerque et al.(29) que
também obtiveram o mesmo padrão para os três genótipos mais freqüentes entre as
populações estudadas por eles.
22
O genótipo mutado FYA/FYB-33C foi o quarto mais comum na população
estudada (12,9%) seguido pelo FYB/FYB-33C (9%).
Alta prevalência deste alelo foi demonstrada em comunidades isoladas nos
estados do Amapá e Pará, região Norte do Brasil (53). Woolley et al.(48) e Albuquerque
et al.(29) também encontraram tais genótipos com frequência similar aos reportados
em nosso estudo sugerindo a existência de determinado padrão de ocorrência dos
genótipos Duffy entre as populações estudadas na região Amazônica.
Apesar de em nosso estudo, nesse momento, não investigarmos a incidência de
malária por P. vivax para cada genótipo Duffy, o que, portanto não nos possibilita
inferir sobre associação à proteção ou risco à infecção por P. vivax, outros trabalhos
sugerem que os genótipos com a mutação FY-33C conferem determinada proteção
à infecção pelo P. vivax em áreas endêmicas para malária (26,29,49). Foi verificado que
a presença do alelo FYB-33 resulta em uma redução de 50% na expressão da
proteína Duffy na superfície das hemácias (28,50), o que justificaria a hipótese de baixa
incidência de casos de malária vivax para os genótipos portadores do alelo FYB-33.
O genótipo FYX/FYX responsável pela inibição ou redução do antígeno Fy b,
caracterizando outra variação do fenótipo Duffy-negativo, não foi encontrado. Outros
estudos realizados também na região amazônica obtiveram resultado similar ao
nosso achado, corroborando com a hipótese de que genótipo FYX/FYX seja raro
entre as populações dessa região(26,29).
A prevalência dos genótipos FYA/FYX (1,3%) e FYB/FYX (0,9%) na população
estudada foi baixa, quando comparado aos outros genótipos. Yazdanbakhsh et al.(50)
em ensaio feito em Nova York mostraram uma baixa prevalência do gene FYX na
população, mostrando o mesmo associado apenas a caucasóides (3,5%) não tendo
sido encontrado em indivíduos em negros.
Albuquerque et al.(29) também encontraram no Estado do Amazonas uma baixa
prevalência do gene FYX muito similar ao verificado em nosso estudo. Cavasini et
al.(26) utilizando diversas amostras de quatro estados da região amazônica identificou
23
uma baixa prevalência de FYX em pacientes com malária vivax assim como em
indivíduos sem antecedentes de malária.
O alelo FYX, não parece estar associado a uma distribuição com diferencial
étnico, a freqüência detectada aqui, entre os “caboclos” amazônicos, é semelhante à
descrita em outras populações do Brasil de ascendência caucasiana (18), como
também da Europa(51).
Foram identificados neste estudo 11 indivíduos com genótipo FYB-33/FYB-33, o
correspondente a 2,3% da população. O fenótipo Fy (a-b-) produzido a partir da
homozigose da mutação -33C no alelo FYB, é extremamente raro fora da população
negra(44). Algumas pesquisas de ocupação da região amazônica afirmam que a
introdução de um componente étnico negróide na região amazônica é recente (45,52) o
que justificaria a baixa frequência reportada desse fenótipo.
Perna et al.(53) trabalhando com populações afro-brasileiras dos estados do
Amapá e Pará, região norte do Brasil encontraram elevada prevalência do genótipo
FYB-33/FY-33 (58,8% em um dos grupos estudados), o que difere do nosso achado
provavelmente pela inclusão de indivíduos exclusivamente de ascendência negra
em seu estudo.
Apesar de ser considerado como fator de proteção à infecção por Plasmodium.
Vivax(54), foi notificada ocorrência de infecção por P. vivax em um dos indivíduos
com fenótipo Fy (a-b-) e genótipo FYB-33/FYB-33 (homozigoto Duffy-negativo). O
diagnóstico para P. vivax foi feito pelo método da gota espessa (submetido a duas
revisões), sendo confirmado pela amplificação por PCR em tempo Real da
sequência conservada do gene da subunidade menor do RNA ribossomal do
Plasmodium vivax (SSUrRNA). Esta pequena subunidade do rRNA do Plasmodium
sp. é diferente da correspondente ao
humano (aproximadamente 70%), o que
inviabiliza erros na amplificação da seqüência a ser identificada(55,56).
Indivíduos Duffy-negativos parecem ser naturalmente resistentes à invasão pelo
parasita da malária por Plasmodium vivax(44), porém alguns trabalhos publicados
24
recentemente tem mostrado infecção por P. vivax associada ao genótipo FYB-33/FY
B-33(31,56,57).
Cavasini et al.(31) identificaram duas amostras provenientes de Porto Velho no
estado de Rondônia, com fenótipos Fy (a-b-) e genotipadas como FYB-33/FY B-33,
com infecção por P. vivax diagnosticadas por gota espessa e PCR. Este foi o
primeiro estudo realizado em área endêmica para malária na região norte do Brasil a
demonstrar evidências de malária vivax em indivíduos Duffy-negativo, entretanto
nenhum outro estudo havia detectado semelhante ocorrência.
Estudo realizado em Madagascar onde indivíduos Duffy-negativos foram muito
freqüentes, correspondendo a 72% da população estudada, mostrou elevado
número de casos de infecção por P. vivax naquele grupo (aproximadamente 10%
dos indivíduos Duffy-negativo foram diagnosticados com infecção por P. vivax ou
mista envolvendo o P. vivax). Aparentemente em Madagáscar, o P. vivax rompeu
sua dependência em relação ao antígeno Duffy para o estabelecimento de infecção
no estágio sanguíneo em humanos(57).
Nosso estudo é o segundo realizado na região amazônica brasileira reportando
infecção por P. vivax em indivíduos Duffy-negativos que vivem em áreas endêmicas
de malária. Nosso achado aponta para a necessidade de mais estudos
epidemiológicos de malária por P. vivax na Amazônia brasileira com o intuito de
esclarecer a evidência de que o P. vivax está sendo transmitido entre os habitantes
do grupo sangüíneo Duffy negativo. Por fim, a necessidade de investigar a existência
de receptores alternativos pelo P. vivax durante o processo de invasão das
hemácias é reforçada por nossos resultados.
25
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
As análises dos resultados obtidos na fenotipagem e genotipagem do sistema do
grupo sanguíneo Duffy, feitas para esta dissertação de mestrado, são a base de
dados necessária para o cruzamento dessa informação da genética do hospedeiro
com os dados de incidência de malária na região, cujos resultados encontram-se em
fase de revisão e digitação, segundo as normas de Boas Práticas Clínicas.
Durante
nossa
revisão
bibliográfica
verificamos
relatos
de
frequência
diferenciada de infecção por P. vivax para cada genótipo Duffy(26,29,48), porém, até
onde
conhecemos,
nenhum estudo
de
coorte
prospectivo,
cujo
desenho
experimental permitisse a estimativa real da incidência de malária, correlacionando a
mesmo aos genótipos de Duffy, foi ainda realizado. A distribuição quase que
uniforme dos genótipos de Duffy positivos, a nosso ver, terá poder estatístico
suficiente para estimar se algum deles está associado aos seguintes desfechos: (1)
infecção por P. vivax à microscopia; (2) infecção submicroscópica por P. vivax à
PCR; (3) hemoglobina durante a infecção malárica confirmada e sua diferença entre
o fim do estudo de coorte e o seu início; (4) parasitemia periférica.
Tal análise se mostra importante devido a outro estudo, também realizado em
área endêmica para malária vivax na Amazônia brasileira, como o de Albuquerque et
al.(29), frequentemente citado ao longo da dissertação, mencionar possível correlação
entre densidade parasitária encontrada nos infectados pelo P. vivax e determinados
genótipos do sistema de grupo sanguíneo Duffy. Se de fato houver impacto do
genótipo de Duffy sobre a parasitemia, essa variável deverá compor uma das
variáveis de confusão a serem controladas em futuros ensaios clínicos com drogas e
vacinas, em que um dos desfechos é a densidade parasitária da infecção aguda, e
cuja validade externa será mais robusta na medida em que as populações forem
melhor caracterizadas do ponto de vista genético.
26
7. Conclusão
Os genótipos FYA/FYB e FYA/FYA foram os mais frequentes na população
estudada.
Os genótipos FYA/FYB-33 e FYB/FYB-33 foram os mais frequentes entre os
genótipos mutados na população estudada.
Os genótipos FYA/FYX e FYB/FYX foram encontrados em menor frequência na
população estudada.
Foi encontrado um caso confirmado de infecção por P. vivax associado ao
genótipo FYB-33/FYB-33 (homozigoto Duffy-negativo).
27
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32
9. ANEXOS
9.1 Anexo 1 - TCLE
Projeto de epidemiologia da malária no
município do Careiro (Amazonas)
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM) está estudando a malária em
algumas pessoas que moram no Município do Careiro-Castanho. Os pesquisadores não
sabem quantas vezes as pessoas pegam malária durante o ano, na sua comunidade, e
também não sabemos os efeitos destas várias infecções sobre sua saúde. Para nos ajudar
a entender o que acontece, pedimos que você participe deste estudo. Precisamos
acompanhar mais ou menos 1.200 pessoas de todas as idades para ver os tipos de malária
que elas têm durante o ano.
Este é um estudo de observação sobre a malária (especialmente a malária vivax) em toda a
população do P. A. Panelão e do Castanho Sítio, que deve durar por volta de 2 (dois) anos.
Você não vai precisar fazer nada de especial para participar do projeto. Você vai receber o
diagnóstico de malária todas as vezes que tiver algum sintoma da doença e receberá o
tratamento de graça, como já acontece. Durante todo o tempo do estudo, você ficará com
um cartão de identificação individual, que deverá apresentar todas as vezes em que fizer um
exame para o diagnóstico de malária.
Um grupo de pessoas treinadas pela equipe de pesquisadores permanecerá na área do
estudo a fim de realizar o diagnóstico de malária de maneira mais rápida. Todas as vezes
em que você estiver com sintomas de malária, será colhida uma amostra de sangue do
dedo para realizar uma lâmina para o diagnóstico de malária e para a realização de testes
mais específicos para malária e avaliação de anemia e o tipo do sangue. A cada 6 (seis)
meses, mesmo que você não tenha nenhum sintoma de malária, será feita uma visita a
todas as pessoas que aceitarem participar do estudo em que será feito um exame clínico e
será colhido sangue do dedo para realizar uma lâmina para o diagnóstico de malária,
avaliação de anemia e outros testes mais específicos para malária. Se a lâmina de malária
for positiva, você receberá novamente o tratamento. No caso de outro exame mais
específico que indique que você pode ter o parasito da malária no sangue sem ter sintomas,
você será acompanhado semanalmente por um pesquisador para avaliar a real necessidade
do tratamento, já que o tratamento desnecessário quando não houver sintomas também
pode trazer complicações.
Portanto, nós queremos sua permissão para testar seu sangue para malária. Depois desses
testes, queremos também sua permissão para guardar o restante de sangue que sobrar
para poder fazer algum outro estudo no futuro, relacionado à malária. O material deverá ficar
guardado sem nenhuma identificação pessoal na Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas (Hospital Tropical), em Manaus, sob a responsabilidade dos pesquisadores.
Para coletar a amostra de sangue do dedo, você poderá sentir um pouco de dor, mas que
deve parar dentro de alguns minutos. Se a limpeza do dedo não for correta, pode haver uma
infecção, mas isto é muito infreqüente e se acontecer será acompanhada por nossa equipe
de trabalho. Não há nenhum outro risco em participar desse estudo.
O principal benefício em participar desse estudo é o recebimento de mais informações sobre
malária e o diagnóstico e tratamento mais rápido da doença, porque nossa equipe ficará
morando na área durante todo o tempo. Com o diagnóstico e tratamento mais rápido, é
33
possível que haja uma diminuição do número de casos de malária na sua comunidade.
Entretanto, você não receberá nenhum incentivo financeiro. Se tiver algum prejuízo em
participar desta pesquisa, converse com um de nossos pesquisadores para que ele possa
lhe ajudar.
Se você concordar em participar, todas as informações coletadas serão confidenciais. Todo
o material será guardado com um número-código, sem colocar seu nome. Seu nome nunca
será usado em público. Se em qualquer momento você quiser se retirar do estudo, você
poderá fazer isso, e mesmo assim terá direito ao diagnóstico e ao tratamento da malária, por
nossa equipe.
Contato dos pesquisadores
Se você tiver alguma pergunta ou dúvida sobre esse estudo, procure um de nossos
pesquisadores no Careiro para que eles possam tirar sua dúvida. Você poderá também
fazer contato com o Dr. Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda, responsável pelo projeto,
na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (Gerência de Malária), em Manaus (Av.
Pedro Teixeira, 25). Nosso telefone para contato é o 3656 0620. Você ficará com este termo
de consentimento assinado e outra cópia será arquivada pelos pesquisadores.
Eu, ……………………………………………………………………………………......,
entendi
tudo sobre o Estudo da Epidemiologia da Malária no Careiro e autorizo a minha participação
no
estudo
ou
a
participação
do
menor por quem sou
responsável
.............................................................................................................................................
Nome do menor (se o consentimento for para um menor)
....................................................................................................................
Assinatura do voluntário (ou responsável)
…………………………………………….................................
Data: ….. / ….. / …..
Polegar direito
Assinatura do pesquisador que conversou com o voluntário
…………………………………………………………………………………………….
Data: ….. / ….. / …...
34
9.2 Anexo 2 - Questionário de visita transversal
Consórcio P. vivax
EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA NO CAREIRO
Questionário de visita transversal
(POP_MAL_TC_002_A01_v01_PT)
IDENTIFICAÇÃO PESSOAL
1.
2.
Dia da visita (DD/MMM/AA)
Número de identificação permanente
3.
4.
5.
Nome
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
Sobrenome
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
Foi realizada a visita?
(1=sim, 2=não)
|__|
7.
6. Se não, motivo
(1=recusa, 2=ausência, 3=outro, 9=não aplicável)
|__|
Se a pessoa estiver ausente, registrar a data de saída da área do estudo na pergunta 26
Se for mulher, está grávida?
(1=sim, 2=não, 3=desconhecido, 9=NA)
|__|
8.
9.
|__|__| / |__|__|__| / |__|__|
|__|-|__||__||__| - |__|__|
Se a resposta for sim, qual trimestre? (1=primeiro, 2=segundo, 3=terceiro, 9=NA)
Paridade (incluindo esta gravidez se for o caso)
(99=não aplicável)
|__|
|__|__|
MEDIDAS DE CONTROLE DA MALÁRIA
10. A pessoa dormiu com mosquiteiro ontem à noite?
(1=sim, 2=não)
|__|
11. Se sim, o mosquiteiro foi impregnado no ano passado?
12. A casa foi borrifada nos últimos 6 meses?
13. Nos últimos 30 dias, a pessoa tomou algum antimalárico?
(1=sim, 2=não, 9=NA)
(1=sim, 2=não)
(1=sim, 2=não)
|__|
|__|
|__|
(1=CQ, 2=CQ+PQ, 3=MQ+AS, 4=LU+AS, 5=outro, 9=NA)
|__|
14. Se sim, especificar qual
DADOS CLÍNICOS
15. História de febre nas últimas 48 horas?
16. Temperatura axilar (ºC)
(1=sim, 2=não)
|__|
|__|__|.|__|
|__|
17. Classificação
(1=normal, 2=borda costal, 3=além da borda costal, 4=umbigo,
esplênica de Hackett
5=além do umbigo)
|__|
18. A pessoa sente-se doente hoje?
(1=sim, 2=não)
EXAMES DE LABORATÓRIO
19. Foram coletadas duas lâminas?
20. Foi coletado um papel filtro?
(1=sim, 2=não)
(1=sim, 2=não)
|__|
|__|
21. Foi coletado um criotubo?
22. Número de identificação da amostra
(1=sim, 2=não)
|__|
Etiqueta
23. Se não, por quê
(1=amostra prévia <24 h, 2=recusa, 3=outro, 9=NA)
|__|
24. Hemoglobina (g/dL)
(99.9=não realizado)
|__|__|.|__|
(0=Negativo, 1=P. falciparum, 2=P. vivax, 3=P. malariae,
25. Resultado preliminar da gota
|__|
espessa
4=infecção mista, 9=não realizado)
Se a lâmina for positiva, preencher um Questionário de Detecção Passiva de Casos
35
9.3 Anexo 3 – Questionário de Detecção passiva
1.5 Anexo 4 – Protocolo de Extração de DNA
9.4 Anexo 4 - Questionário de PCR/RFLP
36
Procedimento Operacional Padrão
Gerência de Malária
Código POP
POP_MAL_LB_005_v02_PT
Título
Procedimento para realização da técnica PCR/RFLP do gene
FY
Idioma da versão
original
PORTUGUÊS
Elaborado por:
Cynthia Ferreira
Oliveira
Paulo Roberto R. de
Lima
Roberto Carlos R.
Lecca
Revisado por:
Sérgio Roberto L.
Albuquerque
Data & assinatura
S
Aprovado por:
Marcus Vinícius G.
Lacerda
Data & assinatura
Data de
aplicação:
24 de abril de
2009
Data da próxima
revisão:
Data &
assinatura
Emenda
Razão da emenda
2. OBJETIVOS
Descrever o procedimento de amplificação por PCR do gene FY (exon 2 / GATA)
e análise deste produto pela técnica de RFLP.
3. DEFINIÇÕES
PCR: a reação em cadeia da polimerase é definida como uma técnica molecular
que permite a amplificação de pequenas quantidades de um DNA específico a
partir de um molde do DNA, usando uma reação enzimática simples, sem um
organismo vivo.
RFLP: O polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA (RFLP) é obtido
através do tratamento do DNA com enzimas de restrição. O ensaio RFLP
37
consiste na obtenção do DNA alvo e o tratamento do mesmo com enzima de
restrição, seguido de eletroforese para separação dos fragmentos de acordo
com o seu comprimento (tamanho)
Iniciador (primer): uma pequena seqüência de DNA ou RNA a partir da qual
pode começar a replicação do DNA.
4. APLICÁVEL A
Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à
pesquisa clínica.
5. RESPONSABILIDADES
Pessoal encarregado da coleta das amostras da pesquisa.
Pessoal envolvido na realização da PCR nas amostras recebidas no laboratório
de biologia molecular.
Chefia do laboratório de biologia molecular.
6. POP'S RELACIONADOS
Seguimento dos participantes no estudo “Epidemiologia da Malária no Município
do Careiro, Amazonas” (versão atual do POP_MAL_TC_002).
Caracterização da Malária Grave por Plasmodium vivax na Fundação de
Medicina Tropical do Amazonas, Brasil (versão atual do POP_MAL_HO_001).
7.
RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Amostra sanguínea.
Sangue total de paciente a ser testado, armazenado em tubo 0,5 mL a 8ºC.
6.2 Materiais:

Ponteiras com filtro para pipetas automáticas (10 µL, 100 µL, 1000 µL)

Tubos de 0,2 mL; 0,5 mL; 1,5 mL e 2mL

Plástico (tipo Magic Pac)
38
6.3 Equipamentos:

Tubos de 1,5ml

Ponteiras com filtro

Pipetas automáticas (10 µL, 100 µL, 1000 µL)

Isopropanol

Etanol 70%

Promega: Wizard® Genomic DNA Purification Kit.

Centrífuga
6.4 Reagentes:
6.4.1 Extração de DNA:
REAGENTES PARA AS ETAPAS DE EXTRAÇÃO
ARMAZENAMENTO
1. Isopropanol
Temp. ambiente
2. Etanol 70%
Temp. ambiente
3. Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega)
Temp. ambiente
6.4.2 PCR e Fracionamento eletroforético:
REAGENTES PARA O MIX DA PCR
ARMAZENAMENTO
1. Água destilada autoclavada
Temp. ambiente
2. Buffer 10X
Temp. ambiente
3. MgCl2 (50Mm)
- 20ºC
4. dNTP (100ng/ µL)
- 20ºC
5. Fy AB1 forward (100ng/µL)
- 20ºC
6. Fy AB2 reverse (100ng/µL)
- 20ºC
7. Fy N1 forward (100ng/µL)
- 20ºC
8. Fy n2 reverse (100ng/µL)
- 20ºC
9. Taq* (5u/ µL)
- 20ºC
REAGENTES PARA O GEL DE AGAROSE E POLIACRILAMIDA
1. Agarose
Temp. ambiente
39
2. TEB 10X
Temp. ambiente
3. Ladder 25 pb, 100 pb
- 20ºC
4. Azul de bromofenol
8ºC
5. Acrilamida 40%
Temp. ambiente
6. Agua destilada autoclavada
Temp. ambiente
7. Persulfato de amônia (APS) 10%
Temp. ambiente
8. TEMED
Temp. ambiente
- Seqüência dos primers:
Exon 2 - Fy AB1: 5’-TCC CCC TCA ACT GAG AAC TC-3’
- Fy AB2: 5’-AAG GCT GAG CCA TAC CAG AC-3’
GATTA
- Fy N1: 5´-CAA GGC CAG TGA CCC CCA TA-3´
- Fy N2: 5´-CAT GGC ACC GTT TGG TTC AG-3´
6.4.3 RFLP (digestão enzimática)
REAGENTES PARA RFLP-DUFFY
Água injetável
ARMAZENAMENTO
Temperatura ambiente
Buffer
- 20ºC
Enzima de restrição
- 20ºC
Enzimas de restrição a serem utilizadas:
BanI ou BshNI (para diferenciar FYA de FYB)
StyI (para identificar a mutação GATTA FYB – 33C)
MspA1I (para identificar o SNP 265 C→T)
MwoI (para identificar o SNP 298 G→A)
7
EXTRAÇÃO DO DNA
7.1 Obtenções de sangue total
40
Obter 300-400µL de sangue da porção digital, com o uso de lanceta comum,
em tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mL identificado contendo 15 µL de
EDTA.
7.2 Procedimentos para extração do DNA a partir de tubo
Protocolo de extração retirado da “bula” do Wizard® Genomic DNA Purification
Kit.
Volume de amostra sanguínea: 300µL
Obs: Antes de dar início ao procedimento homogeneizar o tubo com sangue
até o mesmo ficar completamente homogeneizado.
Procedimentos:
1. Adicione 900µL de solução Cell Lysis. Inverta o tubo 5 a 6 vezes para
misturar o sangue e a solução de lise.
2. Incube por 10 minutos à temperatura ambiente, homogeneizando por
inversão duas a três vezes.
3. Centrifugue entre 13.000 e 16.000 x g por 20 minutos a temperatura
ambiente.
4. Descarte o sobrenadante.
5. Agite o tubo vigorosamente no vortex. Ressuspenda completamente as
células brancas.
6. Adicione 300 µL de solução Nuclei Lysis. Pipete a mistura 5-6 vezes para
lisar as células brancas.
7. OPCIONAL: Adicione 1,5 µL de solução RNAase ao lisado nuclear e misture
as amostras invertendo o tubo 2-5 vezes.Incube a mistura a 37ºC por 15
minutos e esfrie a temperatura ambiente.
8. Adicione 100µL de solução Protein Preciptation ao lisado nuclear e
homogeneíze vigorosamente no vortex de 10-20 segundos.
9. Centrifugue o tubo entre 13.000-16.000 x g por três minutos à temperatura
ambiente.
10. Transfira o sobrenadante para um tubo limpo de 1,5mL contendo 300µL de
isopropanol a temperatura ambiente.
11. Gentilmente misture a solução por inversão até que as brancas cadeias de
DNA formem uma cadeia visível.
41
12. Centrifugue entre 13.000-16.000 x g por um minuto à temperatura
ambiente.
13. Decante o sobrenadante e adicione uma amostra de um volume de etanol a
70% à temperatura ambiente. Gentilmente inverta o tubo algumas vezes
para lavar o precipitado de DNA e os lados do microtubo.
14. Centrifugue como na etapa 11.
15. Cuidadosamente aspire o etanol. Inverta o tubo em um papel absorvente
limpo e seque ao ar o precipitado por 10 a 15 minutos.
16. Adicione 100µL da solução DNA rehydration ao tubo e reidrate o DNA
incubando à 65ºC por uma hora. Periodicamente homogeneíze gentilmente
a solução. Alternativamente reidrate o DNA incubando a solução overnigth à
temperatura amibiente.
17. Armazene o DNA entre 2-8ºC.
8
PCR (REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE) PARA DUFFY E GATA
Para a amplificação dos genes FYA e FYB foi utilizada a reação de PCR
padronizada pelo Laboratório de biologia molecular do Hemocentro do
Amazonas-HEMOAM. A banda específica de DNA resultante para Duffy
deverá apresentar apenas 1 banda de 392 pb. e para GATA deverá
apresentar também apenas 1 banda de 189 pb.
8.1 Reagentes para o mix da PCR (Duffy e GATA)
DNA extraído
5 µL
Água destilada autoclavada
33,7 µL (qsp 50 µL)
Buffer
5 µL (sempre 10% do volume final)
MgCl2
3 µL
dNTP (100mM)
0,8 µL
Primer 1 forward (100ng/µL)
1,0 µL
Primer 2 reverse (100ng/µL)
1,0 µL
Taq polymerase (5u/ µL)
0,5 µL
Primers:
PCR Duffy:
Primer 1 (Fy AB1) e Primer 2 (Fy AB2)
42
PCR GATTA:
Primer 1 (Fy N1) e Primer 2 (Fy N2)
a. Reação de PCR
Procedimentos:
1. Para o preparo do mix, deve-se multiplicar os valores dos volumes de cada
reagente do mix pela quantidade de amostra. Deve-se acrescentar no cálculo
das amostras o branco da reação.
2. Prepare o mix em um tubo com a capacidade para o volume final após o
cálculo realizado. Sempre utilizar ponteiras estéreis.
3. Deve-se adicionar 45µL do mix em cada microtubo (0,2 mL) previamente
identificado para cada amostra.
4. Em seguida adicionar 5 µL de DNA correspondente a cada amostra
identificada em seu respectivo microtubo.
5. Levar as amostras ao termociclador.
8.3 Condições de amplificação – Programação do Termociclador (para
amplificação Duffy e GATA)
TEMPERATURA (ºC)
TEMPO
NÚMERO DE
CICLOS
95
5 – minutos
1
94
20 - segundos
35
62
20 - segundos
35
72
20 - segundos
35
72
10 - minutos
1
4

modo de espera
Obs:. O produto de PCR será analisado posteriormente em gel de agarose a
1,5%. É importante observar a qualidade de DNA. Um bom DNA deve ter as
seguintes características:
1. Não apresentar rastro no gel.
2. Não apresentar mais de uma banda.
8.1 Restrições e limitações da PCR
43
Possibilidade de contaminação da reação no momento da extração do DNA ou
no momento do preparo da mix do PCR, dada a sensibilidade da técnica
9
GEL DE AGAROSE PARA ANÁLISE DO PRODUTO DA PCR
Preparação do gel de Agarose 1,5%
1. Em um Erlemeyer pesar 1,5 g de Agarose
2. Completar com TEB 1x para 100 mL ,
3. Tampar o Erlemeyer com plástico (Tipo Magic pac) fazendo pequenos furos
no mesmo.
4. Levar o material ao forno de microondas por aproximadamente 3 minutos até
ficar com aspecto transparente.
5. Acrescentar o Brometo de Etídio no Erlemeyer (0,7 µL para 100 mL).
6. Prepara o suporte de polimerização colocando o pente com a quantidade
desejada de poços.
7. Esperar esfriar o Erlemeyer e despejar a agarose a 1,5% no suporte de
polimerização.
8. Aguardar a formação do gel (solidificação) e retirar o pente.
9. Colocar o suporte de polimerização com o gel na cuba de eletroforese.
10. Adicionar na cuba tampão TEB 1X até cobrir a superfície do gel.
Aplicação da amostra no gel de Agarose
1. Homogeneizar em um plástico (tipo Mag Pac) 4 µL da amostra de DNA
(produto da PCR) com 2µL de azul de bromofenol. Obs.: Evitar ao
homogeneizar as amostras no plástico que as mesmas tenham contato entre
si. Deixar espaço entre elas.
2. Deve-se iniciar aplicação das amostras nos poços do gel com 4 µL de
Ladder (Não precisa homogeneizar com azul de bromofenol, pois o mesmo
já vem corado)
3. Em seguida a amostra negativa (branco) já homogeneizada com a gota de
azul de bromofenol deve ser dispensada no poço seguinte. Obs: Sempre
aplicar na seguinte ordem: Ladder, branco e DNA's.
4. Aplicar a amostra homogeneizada nos poços formados no gel.
5. Reservar um poço para utilização de um padrão de corrida (Ladder-100pb).
44
6. Ajustar a voltagem para 100 volts por 1,5 horas.
7. Analisar o gel sob radiação ultravioleta.
8. Tirar foto do gel para posterior análise dos resultados obtidos.
Obs: As corridas em gel de agarose são para observar se houve amplificação
durante o PCR, assim como verificar a qualidade do DNA amplificado, ou
seja, se o mesmo está em boa quantidade (Bandas fortes), se não há rastro
(não está degradado).
10
RFLP (POLIMORFISMO DE COMPRIMENTO DE FRAGMENTOS DE DNA)
Para a análise RFLP serão utilizados os produtos de PCR amplificados na PCR
GATTA e PCR Duffy. Será utilizado a enzima de restrição BanI (BshN1), StyI,
MspA1I e MwoI.
10.1 Reagentes para o preparo mix da digestão enzimática
Produto PCR (Duffy)
12 µL
Água destilada autoclavada
5,5 µL (qsp 50 µL)
Buffer 10 X
2 µL
Enzima de restrição
0,5 µL
Procedimentos:
1. Multiplicar as quantidades de reagente do protocolo pelo número de
amostras a serem digeridas e preparar o mix. Sempre utilizar ponteiras
estéreis.
2. Prepare o mix em um tubo com a capacidade para o volume final após o
cálculo realizado.
3. Utilizar tubo de 0,2 mL para no preparo da digestão de cada amostra.
4. Deve-se adicionar 8µL do mix em cada microtubo previamente identificado
para cada amostra.
5. Em seguida adicionar 12 µL de DNA correspondente a cada amostra
identificada em seu respectivo microtubo.
6. Levar as amostras ao termociclador.
45
10.2 Programação do Termociclador para as digestões enzimáticas
(Condições de incubação)
ENZIMA
BanI
StyI
MspA1I
MwoI
TEMPERATURA
37ºC
37ºC
37ºC
60ºC
TEMPO
4 horas
4 horas
4 horas
4 horas
A leitura das bandas da digestão enzimática para a enzima BanI será feita em
gel de agarose a 1,5% (ítem 9).
- O genótipo FYA deverá mostrar apenas a banda de 210 pb.
- O genótipo FYB deverá mostrar apenas a banda de 306 pb.
- O genótipo FYAB deverá mostrar duas bandas 306 e 210 pb.
A leitura das bandas da digestão enzimática para as enzimas StyI, MspA1I e
MwoI será feita em gel de poliacrilamida a 12% (ítem 11).
- StyI: O genótipo com o GATA mutado deverá mostrar a banda extra de 61 pb
e o GATA normal deverá mostrar apenas as bandas com 108 e 81 pb.
- MspAI: Os genótipos mutados para o SNP 265 C→T apresentaram banda
extra de 161pb e os genótipos sem a mutação apresentarão apenas as bandas
124pb e 118 pb.
- MwoI: Os genótipos mutados para o SNP 298 G→A apresentaram banda
extra de 343pb e os genótipos sem a mutação apresentarão apenas as
bandas 270pb e 73 pb.
46
11 GEL DE POLIACRILAMIDA PARA ANÁLISE DO PRODUTO DA
DIGESTÃO ENZIMÁTICA
Reagentes para o preparo do gel de Poliacrilamida a 12%:
1. Acrilamida 40%
6,4 mL
2. TEB 10X
2,0 mL
3. Água Dest
12,4 mL
4. Persulfato de Amônia (APS) 10%
200 µL
5. TEMED
16 µL
Preparo da Base para receber o Gel
1. Em um Erlemeyer adicione a água, seguido pelo TEB 10X, Acrilamida 40%,
Persulfato de Amônia (APS) 10% e por último o TEMED.
2. O preenchimento das placas de vidro deve ser rápido, devido a gelificação.
Preparo da Base para receber o Gel
1. Preparar os suportes com as placas de vidro.
2. Prender os suportes nas bases.
3. Prepara o Gel.
4. Encher a placa de vidro com o gel preparado utilizando uma seringa de 10 mL
com agulha.
5. Verificar a presença de bolhas e eliminá-las com a agulha caso ocorram.
6. Colocar o pente para a formação dos poços.
7. Aguardar a formação do gel. (2 horas)
8. Após a formação do gel, verificar, com agulha e seringa, se os poços estão
obstruídos.
9. Em seguida aplicar as amostras.
Aplicação de amostras no gel de Poliacrilamida
1. Encher a cuba de corrida com TEB 1x conforme as marcas na cuba.
2. Aplicar as amostras:
- Ladder: 2 µL + 2 µL azul de bromofenol (5x).
- DNA: 10 µL + 2 µL azul de bromofenol (5x).
3. Programar a voltagem da cuba de corrida para 100 V. o tempo de corrida é
47
1,5h aproximadamente.
4. Após a corrida retirar a lâmina com gel da cuba e colocar o gel com a lâmina
em uma cuba com água destilada ou tampão TEB 1x já adicionado brometo
de etídio (0,8 µL para cada 100mL de água) e aguardar 5 minutos.
5 Fazer a leitura e fotografar o gel no sistema de documentação.- Retirar a
lâmina com gel da cuba de corrida
- Colocar o gel com a lâmina em uma cuba com Água Destilada ou tampão
TEB 1x
- Adicionar 5uL ou 10 uL de brometo de etídio e aguardar 5 minutos.
- Fazer a leitura e fotografar o gel no sistema de documentação.
12
BIOSSEGURANÇA
Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança.
13
REGISTRO DOS RESULTADOS
O resultado da PCR/RFLP será preenchido pelo responsável do procedimento
no questionário de Fenotipagem e Genotipagem
(POP_MAL_LB_003_A01_v02_PT), indicando resultado, o código e a
assinatura do membro da equipe do projeto e a data do resultado.
14
REFERÊNCIAS
1. Castilho, L.; Rios, M.; Pellegrino, J.; Saad ST.; Costa FF.; Reid ME. A Novel FY
Allele in Brazilians. Vox Sang., 87(3), 190-5, 2004.
2. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de
microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; 2001.
1
48
15
REGISTRO DOS ANEXOS
TÍTULO DO ANEXO
Título do anexo 1: Questionário de
Fenotipagem/Genotipagem
NOME DO ANEXO:
Novo
Revisão
Tradução
Revisão
Justificativa
CÓDIGO DO ANEXO
(Incluindo versão/idioma):
POP_MAL_LB_005_A01_v02_PT
CÓDIGO DO ANEXO
(Incluindo versão/idioma):
Aprovado
Criado por:
por:
Data e
assinatura
Tradução
Data e
assinatura
A versão atual deste POP foi traduzida a
____________________ e a versão traduzida entra em efeito
em ___/___/_____.
dd
mm
aa
Assinatura do responsável: ______________________
2
49
9.5 Anexo 5 - Questionário de Fenotipagem
Procedimento Operacional Padrão
Gerência de Malária
Código POP
POP_MAL_LB_004_v02_PT
Título
Procedimento para realização da
S técnica de Fenotipagem Duffy
Idioma da versão
original
PORTUGUÊS
Traduzido por:
Revisado por:
Aprovado por:
Data de aplicação:
Cynthia Ferreira Oliveira
Paulo Roberto Ribeiro de Lima
Roberto Carlos Reyes Lecca
Sérgio Roberto L. Albuquerque
Marcus Vinícius G. Lacerda
24 de abril de 2009
Data & assinatura
Data da próxima
revisão:
Data & assinatura
Emenda
Data & assinatura
Razão da emenda
1. OBJETIVOS
Verificar a expressão do fenótipo Fy(a-b-) do sistema sanguíneo Duffy.
2. DEFINIÇÕES
Anticorpos monoclonais: ou mAb surgem a partir de um único linfócito B, que
é clonado e imortalizado, produzindo sempre os mesmos anticorpos, em
resposta um agente patogénico. Estes anticorpos apresentam-se iguais entre si
em estrutura, especificidade e afinidade, ligando-se por isso ao mesmo epítopo
no antigénio.
3. APLICÁVEL A
Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à
pesquisa clínica.
4. RESPONSABILIDADES
Pessoal encarregado da coleta das amostras da pesquisa.
Pessoal envolvido na realização da PCR nas amostras recebidas no laboratório
de biologia molecular.
Chefia do laboratório de biologia molecular.
3
50
5. POP'S RELACIONADOS
Procedimento para realização da técnica PCR/RFLP. (versão atual do
POP_MAL_LB_005_v02_PT).
6. PROCEDIMENTOS
6.1 Recursos necessários
Sangue total de paciente a ser testado, armazenado em tubo de 0,5 mL a 8ºC.
6.1.2 Materiais:
 Ponteiras com filtro para pipetas automáticas (10 µL, 100 µL, 1000 µL)
 Tubos de 1,5 mL
6.1.3 Equipamentos:
 Centrífuga de cartão
 Centrífuga
 Pipetas automáticas de 10 µL, 100 µL
6.1.4 Reagentes:
Fenotipagem Duffy:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Reagentes
Hemácias anticoaguladas (EDTA)
Anticorpos Anti-Fya de origem humana
Anticorpos Anti-Fyb de origem humana
LISS
Solução salina 0,9%
Cartões de gelcentrifugação com gel de
sephadex, contendo soro poliespecífico
antiglobulina humana (anti-IgG de coelho e
anti-C3d monoclonal, linhagem celular C
139-9), suspensos em gel.
Armazenamento
8ºC
8ºC
8ºC
Temp. ambiente
Temp. ambiente
Temp. ambiente
6.2 Obtenção de sangue total
Obter 300-400µL de sangue da porção digital, com o uso de lanceta comum,
em tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mL identificado contendo 15 µL de EDTA
6.3 Fenotipagem Duffy:
O procedimento Técnico de fenotipagem pela técnica de gel centrifugação,
consiste:
4
51
Procedimentos
1. Inicialmente lavar as hemácias a serem fenotipadas, três vezes com solução
salina 0,9%
2. Centrifugar por 1 minuto a 3.500 rpm a cada lavagem.
3. Preparar uma suspensão das hemácias a serem fenotipadas a 1% em
solução de baixa força iônica (LISS).
4. Em seguida identificar o cartão de gel centrifugação
5. Pipetar 50 uL dos reagentes anti-Fya e anti-Fyb nos respectivos canalículos
no cartão de gel.
6. Depois dispensar 25 uL da suspensão de hemácias a ser testada em cada 1
dos dois tubos.
7. O cartão deve ser incubabo por 10 minutos à 37°C em banho seco e
centrifugado em seguida por 10 minuto.
8. A leitura deve ser realizada de acordo com os padrões indicados pelo
fabricante.
Exemplo de interpretação dos possíveis resultados obtidos:
- Reação Positiva ++++: Hemácias totalmente concentradas na parte
superior do gel após a centrifugação.
- Reação Positiva +++: Hemácias concentradas na parte superior porém se
estendendo ao 1° terço superior do gel.
- Reação Positiva ++: Hemácias se estendendo da parte superior do gel até
a parte central do canalículo.
- Reação Positiva +: Hemácias se estendendo da parte central do gel até a
parte inferior do canalículo.
- Reação negativa: Hemácias totalmente concentradas na parte inferior do
gel após a centrifugação.
6.4 Biossegurança
Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança.
6.5 Registro dos resultados
O resultado da PCR será preenchido pelo responsável do procedimento no
questionário de Fenotipagem/Genotipagem (POP_MAL_LB_003_A01_v02_PT),
indicando resultado, o motivo em caso de não ter realizado o exame, a ordem de
armazenamento, o código e a assinatura do membro da equipe do projeto e a data
do resultado.
7. REFERÊNCIAS
1. Castilho, L.; Rios, M.; Pellegrino, J.; Saad ST.; Costa FF.; Reid ME. A Novel FY
Allele in Brazilians. Vox Sang., 87(3), 190-5, 2004.
2. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de
microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; 2001.
.
5
52
8. REGISTRO DOS ANEXOS
TÍTULO DO ANEXO
Título do anexo 1: Questionário de
Fenotipagem/Genotipagem
NOME DO ANEXO:
Novo
Revisão
Tradução
Revisão
Tradução
Justificativa
CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo
versão/idioma):
POP_MAL_LB_003_A01_v02_PT
CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo
versão/idioma):
Aprovado por:
Criado por:
Data e assinatura
Data e
assinatura
A versão atual deste POP foi traduzida a
____________________ e a versão traduzida entra em efeito
em ___/___/_____.
dd
mm
aa
Assinatura do responsável: ______________________
6
53
9.6 Anexo 5 - Questionário de Resultados PCR/RFLP
Consórcio P. vivax
EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA NO CAREIRO
Questionário de Fenotipagem/Genotipagem
(POP_MAL_LB_005_A01_v02_PT)
IDENTIFICAÇÃO
1.
|__|-|__|__|__|-|__|__|
Número de identificação permanente
RESULTADO DA FENOTIPAGEM DUFFY
2.
Fy(a+b-)
3.
Fy(a+b+)
4.
Fy(a-b+)
5.
Fy(a-b-)
|__|
|__|
|__|
|__|
(1= positivo; 0= negativo)
RESULTADO DA GENOTIPAGEM DUFFY
6.
FYA/FYA
X
7.
FYA/FY
8.
FYA/FYB-33
9.
FYA/FYB
10.
FYB/FYB
|__|
|__|
|__|
|__|
|__|
FYB/FYX
FYB/FYB-33
FYX/FYXx
FYB-33/FYB-33
|__|
|__|
|__|
|__|
(1= positivo; 0= negativo)
59
7
54
9.7 Anexo 7 – Registro de aprovação do CEP
9. ANEXOS
9.1 Anexo 1 - TCLE
Projeto de epidemiologia da malária no
município do Careiro (Amazonas)
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM) está estudando a malária em
algumas pessoas que moram no Município do Careiro-Castanho. Os pesquisadores não
sabem quantas vezes as pessoas pegam malária durante o ano, na sua comunidade, e
também não sabemos os efeitos destas várias infecções sobre sua saúde. Para nos ajudar
a entender o que acontece, pedimos que você participe deste estudo. Precisamos
acompanhar mais ou menos 1.200 pessoas de todas as idades para ver os tipos de malária
que elas têm durante o ano.
Este é um estudo de observação sobre a malária (especialmente a malária vivax) em toda a
população do P. A. Panelão e do Castanho Sítio, que deve durar por volta de 2 (dois) anos.
Você não vai precisar fazer nada de especial para participar do projeto. Você vai receber o
diagnóstico de malária todas as vezes que tiver algum sintoma da doença e receberá o
tratamento de graça, como já acontece. Durante todo o tempo do estudo, você ficará com
um cartão de identificação individual, que deverá apresentar todas as vezes em que fizer um
exame para o diagnóstico de malária.
Um grupo de pessoas treinadas pela equipe de pesquisadores permanecerá na área do
estudo a fim de realizar o diagnóstico de malária de maneira mais rápida. Todas as vezes
em que você estiver com sintomas de malária, será colhida uma amostra de sangue do
dedo para realizar uma lâmina para o diagnóstico de malária e para a realização de testes
mais específicos para malária e avaliação de anemia e o tipo do sangue. A cada 6 (seis)
meses, mesmo que você não tenha nenhum sintoma de malária, será feita uma visita a
todas as pessoas que aceitarem participar do estudo em que será feito um exame clínico e
será colhido sangue do dedo para realizar uma lâmina para o diagnóstico de malária,
avaliação de anemia e outros testes mais específicos para malária. Se a lâmina de malária
for positiva, você receberá novamente o tratamento. No caso de outro exame mais
específico que indique que você pode ter o parasito da malária no sangue sem ter sintomas,
você será acompanhado semanalmente por um pesquisador para avaliar a real necessidade
do tratamento, já que o tratamento desnecessário quando não houver sintomas também
pode trazer complicações.
Portanto, nós queremos sua permissão para testar seu sangue para malária. Depois desses
testes, queremos também sua permissão para guardar o restante de sangue que sobrar
para poder fazer algum outro estudo no futuro, relacionado à malária. O material deverá ficar
guardado sem nenhuma identificação pessoal na Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas (Hospital Tropical), em Manaus, sob a responsabilidade dos pesquisadores.
Para coletar a amostra de sangue do dedo, você poderá sentir um pouco de dor, mas que
deve parar dentro de alguns minutos. Se a limpeza do dedo não for correta, pode haver uma
infecção, mas isto é muito infreqüente e se acontecer será acompanhada por nossa equipe
de trabalho. Não há nenhum outro risco em participar desse estudo.
O principal benefício em participar desse estudo é o recebimento de mais informações sobre
malária e o diagnóstico e tratamento mais rápido da doença, porque nossa equipe ficará
morando na área durante todo o tempo. Com o diagnóstico e tratamento mais rápido, é
possível que haja uma diminuição do número de casos de malária na sua comunidade.
Entretanto, você não receberá nenhum incentivo financeiro. Se tiver algum prejuízo em
participar desta pesquisa, converse com um de nossos pesquisadores para que ele possa
lhe ajudar.
Se você concordar em participar, todas as informações coletadas serão confidenciais. Todo
o material será guardado com um número-código, sem colocar seu nome. Seu nome nunca
será usado em público. Se em qualquer momento você quiser se retirar do estudo, você
poderá fazer isso, e mesmo assim terá direito ao diagnóstico e ao tratamento da malária, por
nossa equipe.
Contato dos pesquisadores
Se você tiver alguma pergunta ou dúvida sobre esse estudo, procure um de nossos
pesquisadores no Careiro para que eles possam tirar sua dúvida. Você poderá também
fazer contato com o Dr. Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda, responsável pelo projeto,
na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (Gerência de Malária), em Manaus (Av.
Pedro Teixeira, 25). Nosso telefone para contato é o 3656 0620. Você ficará com este termo
de consentimento assinado e outra cópia será arquivada pelos pesquisadores.
Eu, ……………………………………………………………………………………......,
entendi
tudo sobre o Estudo da Epidemiologia da Malária no Careiro e autorizo a minha participação
no
estudo
ou
a participação
do menor
por
quem
sou
responsável
.............................................................................................................................................
Nome do menor (se o consentimento for para um menor)
....................................................................................................................
Assinatura do voluntário (ou responsável)
…………………………………………….................................
Data: ….. / ….. / …..
Polegar direito
Assinatura do pesquisador que conversou com o voluntário
…………………………………………………………………………………………….
Data: ….. / ….. / …...
9.2 Anexo 2 - Questionário de visita transversal
Consórcio P. vivax
EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA NO CAREIRO
Questionário de visita transversal
(POP_MAL_TC_002_A01_v01_PT)
IDENTIFICAÇÃO PESSOAL
1.
2.
Dia da visita (DD/MMM/AA)
Número de identificação permanente
3.
4.
5.
Nome
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
Sobrenome
Foi realizada a visita?
(1=sim, 2=não)
|__|
7.
(1=recusa, 2=ausência, 3=outro, 9=não aplicável)
6. Se não, motivo
|__|
Se a pessoa estiver ausente, registrar a data de saída da área do estudo na pergunta 26
Se for mulher, está grávida?
(1=sim, 2=não, 3=desconhecido, 9=NA)
|__|
8.
9.
|__|__| / |__|__|__| / |__|__|
|__|-|__||__||__| - |__|__|
Se a resposta for sim, qual trimestre? (1=primeiro, 2=segundo, 3=terceiro, 9=NA)
Paridade (incluindo esta gravidez se for o caso)
(99=não aplicável)
|__|
|__|__|
MEDIDAS DE CONTROLE DA MALÁRIA
10. A pessoa dormiu com mosquiteiro ontem à noite?
(1=sim, 2=não)
|__|
11. Se sim, o mosquiteiro foi impregnado no ano passado?
12. A casa foi borrifada nos últimos 6 meses?
13. Nos últimos 30 dias, a pessoa tomou algum antimalárico?
(1=sim, 2=não, 9=NA)
(1=sim, 2=não)
(1=sim, 2=não)
|__|
|__|
|__|
(1=CQ, 2=CQ+PQ, 3=MQ+AS, 4=LU+AS, 5=outro, 9=NA)
|__|
14. Se sim, especificar qual
DADOS CLÍNICOS
15. História de febre nas últimas 48 horas?
16. Temperatura axilar (ºC)
(1=sim, 2=não)
|__|
|__|__|.|__|
|__|
17. Classificação
(1=normal, 2=borda costal, 3=além da borda costal, 4=umbigo,
esplênica de Hackett
5=além do umbigo)
|__|
18. A pessoa sente-se doente hoje?
(1=sim, 2=não)
EXAMES DE LABORATÓRIO
19. Foram coletadas duas lâminas?
20. Foi coletado um papel filtro?
(1=sim, 2=não)
(1=sim, 2=não)
|__|
|__|
21. Foi coletado um criotubo?
22. Número de identificação da amostra
(1=sim, 2=não)
|__|
Etiqueta
23. Se não, por quê
(1=amostra prévia <24 h, 2=recusa, 3=outro, 9=NA)
|__|
24. Hemoglobina (g/dL)
(99.9=não realizado)
|__|__|.|__|
(0=Negativo, 1=P. falciparum, 2=P. vivax, 3=P. malariae,
25. Resultado preliminar da gota
|__|
espessa
4=infecção mista, 9=não realizado)
Se a lâmina for positiva, preencher um Questionário de Detecção Passiva de Casos
9.3 Anexo 3 – Questionário de Detecção passiva
1.1 Anexo 4 – Protocolo de Extração de DNA
9.4 Anexo 4 - Questionário de PCR/RFLP
Procedimento Operacional Padrão
Gerência de Malária
Código POP
POP_MAL_LB_005_v02_PT
Título
Procedimento para realização da técnica PCR/RFLP do gene
FY
Idioma da versão
original
PORTUGUÊS
Elaborado por:
Cynthia Ferreira
Oliveira
Paulo Roberto R. de
Lima
Roberto Carlos R.
Lecca
Revisado por:
Sérgio Roberto L.
Albuquerque
Aprovado por:
Marcus Vinícius G.
Lacerda
Data & assinatura
Data & assinatura
Data de
aplicação:
24 de abril de
2009
Data da próxima
revisão:
Data &
assinatura
Emenda
Razão da emenda
2. OBJETIVOS
Descrever o procedimento de amplificação por PCR do gene FY (exon 2 / GATA)
e análise deste produto pela técnica de RFLP.
3. DEFINIÇÕES
PCR: a reação em cadeia da polimerase é definida como uma técnica molecular
que permite a amplificação de pequenas quantidades de um DNA específico a
partir de um molde do DNA, usando uma reação enzimática simples, sem um
organismo vivo.
RFLP: O polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA (RFLP) é obtido
através do tratamento do DNA com enzimas de restrição. O ensaio RFLP
consiste na obtenção do DNA alvo e o tratamento do mesmo com enzima de
restrição, seguido de eletroforese para separação dos fragmentos de acordo
com o seu comprimento (tamanho)
Iniciador (primer): uma pequena seqüência de DNA ou RNA a partir da qual
pode começar a replicação do DNA.
4. APLICÁVEL A
Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à
pesquisa clínica.
5. RESPONSABILIDADES
Pessoal encarregado da coleta das amostras da pesquisa.
Pessoal envolvido na realização da PCR nas amostras recebidas no laboratório
de biologia molecular.
Chefia do laboratório de biologia molecular.
6.
POP'S RELACIONADOS
Seguimento dos participantes no estudo “Epidemiologia da Malária no Município
do Careiro, Amazonas” (versão atual do POP_MAL_TC_002).
Caracterização da Malária Grave por Plasmodium vivax na Fundação de
Medicina Tropical do Amazonas, Brasil (versão atual do POP_MAL_HO_001).
7.
RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Amostra sanguínea.
Sangue total de paciente a ser testado, armazenado em tubo 0,5 mL a 8ºC.
6.2 Materiais:
•
Ponteiras com filtro para pipetas automáticas (10 µL, 100 µL, 1000 µL)
•
Tubos de 0,2 mL; 0,5 mL; 1,5 mL e 2mL
•
Plástico (tipo Magic Pac)
6.3 Equipamentos:
•
Tubos de 1,5ml
•
Ponteiras com filtro
•
Pipetas automáticas (10 µL, 100 µL, 1000 µL)
•
Isopropanol
•
Etanol 70%
•
Promega: Wizard® Genomic DNA Purification Kit.
•
Centrífuga
6.4 Reagentes:
6.4.1 Extração de DNA:
REAGENTES PARA AS ETAPAS DE EXTRAÇÃO
ARMAZENAMENTO
1. Isopropanol
Temp. ambiente
2. Etanol 70%
Temp. ambiente
3. Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega)
Temp. ambiente
6.4.2 PCR e Fracionamento eletroforético:
REAGENTES PARA O MIX DA PCR
ARMAZENAMENTO
1. Água destilada autoclavada
Temp. ambiente
2. Buffer 10X
Temp. ambiente
3. MgCl 2 (50Mm)
- 20ºC
4. dNTP (100ng/ µL)
- 20ºC
5. Fy AB1 forward (100ng/µL)
- 20ºC
6. Fy AB2 reverse (100ng/µL)
- 20ºC
7. Fy N1 forward (100ng/µL)
- 20ºC
8. Fy n2 reverse (100ng/µL)
- 20ºC
9. Taq* (5u/ µL)
- 20ºC
REAGENTES PARA O GEL DE AGAROSE E POLIACRILAMIDA
1. Agarose
Temp. ambiente
2. TEB 10X
Temp. ambiente
3. Ladder 25 pb, 100 pb
- 20ºC
4. Azul de bromofenol
8ºC
5. Acrilamida 40%
Temp. ambiente
6. Agua destilada autoclavada
Temp. ambiente
7. Persulfato de amônia (APS) 10%
Temp. ambiente
8. TEMED
Temp. ambiente
- Seqüência dos primers:
Exon 2 - Fy AB 1 : 5’-TCC CCC TCA ACT GAG AAC TC-3’
- Fy AB 2 : 5’-AAG GCT GAG CCA TAC CAG AC-3’
GATTA
- Fy N1: 5´-CAA GGC CAG TGA CCC CCA TA-3´
- Fy N2: 5´-CAT GGC ACC GTT TGG TTC AG-3´
6.4.3 RFLP (digestão enzimática)
REAGENTES PARA RFLP-DUFFY
Água injetável
ARMAZENAMENTO
Temperatura ambiente
Buffer
- 20ºC
Enzima de restrição
- 20ºC
Enzimas de restrição a serem utilizadas:
BanI ou BshNI (para diferenciar FYA de FYB)
StyI (para identificar a mutação GATTA FYB – 33C)
MspA1I (para identificar o SNP 265 C→T)
MwoI (para identificar o SNP 298 G→A)
7
EXTRAÇÃO DO DNA
7.1 Obtenções de sangue total
Obter 300-400µL de sangue da porção digital, com o uso de lanceta comum,
em tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mL identificado contendo 15 µL de
EDTA.
7.2 Procedimentos para extração do DNA a partir de tubo
Protocolo de extração retirado da “bula” do Wizard® Genomic DNA Purification
Kit.
Volume de amostra sanguínea: 300µL
Obs: Antes de dar início ao procedimento homogeneizar o tubo com sangue
até o mesmo ficar completamente homogeneizado.
Procedimentos:
1. Adicione 900µL de solução Cell Lysis. Inverta o tubo 5 a 6 vezes para
misturar o sangue e a solução de lise.
2. Incube por 10 minutos à temperatura ambiente, homogeneizando por
inversão duas a três vezes.
3. Centrifugue entre 13.000 e 16.000 x g por 20 minutos a temperatura
ambiente.
4. Descarte o sobrenadante.
5. Agite o tubo vigorosamente no vortex. Ressuspenda completamente as
células brancas.
6. Adicione 300 µL de solução Nuclei Lysis. Pipete a mistura 5-6 vezes para
lisar as células brancas.
7. OPCIONAL: Adicione 1,5 µL de solução RNAase ao lisado nuclear e misture
as amostras invertendo o tubo 2-5 vezes.Incube a mistura a 37ºC por 15
minutos e esfrie a temperatura ambiente.
8. Adicione 100µL de solução Protein Preciptation ao lisado nuclear e
homogeneíze vigorosamente no vortex de 10-20 segundos.
9. Centrifugue o tubo entre 13.000-16.000 x g por três minutos à temperatura
ambiente.
10. Transfira o sobrenadante para um tubo limpo de 1,5mL contendo 300µL de
isopropanol a temperatura ambiente.
11. Gentilmente misture a solução por inversão até que as brancas cadeias de
DNA formem uma cadeia visível.
12. Centrifugue entre 13.000-16.000 x g por um minuto à temperatura
ambiente.
13. Decante o sobrenadante e adicione uma amostra de um volume de etanol a
70% à temperatura ambiente. Gentilmente inverta o tubo algumas vezes
para lavar o precipitado de DNA e os lados do microtubo.
14. Centrifugue como na etapa 11.
15. Cuidadosamente aspire o etanol. Inverta o tubo em um papel absorvente
limpo e seque ao ar o precipitado por 10 a 15 minutos.
16. Adicione 100µL da solução DNA rehydration ao tubo e reidrate o DNA
incubando à 65ºC por uma hora. Periodicamente homogeneíze gentilmente
a solução. Alternativamente reidrate o DNA incubando a solução overnigth à
temperatura amibiente.
17. Armazene o DNA entre 2-8ºC.
8
PCR (REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE) PARA DUFFY E GATA
Para a amplificação dos genes FYA e FYB foi utilizada a reação de PCR
padronizada pelo Laboratório de biologia molecular do Hemocentro do
Amazonas-HEMOAM. A banda específica de DNA resultante para Duffy
deverá apresentar apenas 1 banda de 392 pb. e para GATA deverá
apresentar também apenas 1 banda de 189 pb.
8.1 Reagentes para o mix da PCR (Duffy e GATA)
DNA extraído
5 µL
Água destilada autoclavada
33,7 µL (qsp 50 µL)
Buffer
5 µL (sempre 10% do volume final)
MgCl 2
3 µL
dNTP (100mM)
0,8 µL
Primer 1 forward (100ng/µL)
1,0 µL
Primer 2 reverse (100ng/µL)
1,0 µL
Taq polymerase (5u/ µL)
0,5 µL
Primers:
PCR Duffy:
Primer 1 (Fy AB1) e Primer 2 (Fy AB2)
PCR GATTA:
Primer 1 (Fy N1) e Primer 2 (Fy N2)
a.
Reação de PCR
Procedimentos:
1. Para o preparo do mix, deve-se multiplicar os valores dos volumes de cada
reagente do mix pela quantidade de amostra. Deve-se acrescentar no cálculo
das amostras o branco da reação.
2. Prepare o mix em um tubo com a capacidade para o volume final após o
cálculo realizado. Sempre utilizar ponteiras estéreis.
3. Deve-se adicionar 45µL do mix em cada microtubo (0,2 mL) previamente
identificado para cada amostra.
4. Em seguida adicionar 5 µL de DNA correspondente a cada amostra
identificada em seu respectivo microtubo.
5. Levar as amostras ao termociclador.
8.3 Condições de amplificação – Programação do Termociclador (para
amplificação Duffy e GATA)
TEMPERATURA (ºC)
TEMPO
NÚMERO DE
CICLOS
95
5 – minutos
1
94
20 - segundos
35
62
20 - segundos
35
72
20 - segundos
35
72
10 - minutos
1
4
∞
modo de espera
Obs:. O produto de PCR será analisado posteriormente em gel de agarose a
1,5%. É importante observar a qualidade de DNA. Um bom DNA deve ter as
seguintes características:
1. Não apresentar rastro no gel.
2. Não apresentar mais de uma banda.
8.1 Restrições e limitações da PCR
Possibilidade de contaminação da reação no momento da extração do DNA ou
no momento do preparo da mix do PCR, dada a sensibilidade da técnica
9
GEL DE AGAROSE PARA ANÁLISE DO PRODUTO DA PCR
Preparação do gel de Agarose 1,5%
1. Em um Erlemeyer pesar 1,5 g de Agarose
2. Completar com TEB 1x para 100 mL ,
3. Tampar o Erlemeyer com plástico (Tipo Magic pac) fazendo pequenos furos
no mesmo.
4. Levar o material ao forno de microondas por aproximadamente 3 minutos até
ficar com aspecto transparente.
5. Acrescentar o Brometo de Etídio no Erlemeyer (0,7 µL para 100 mL).
6. Prepara o suporte de polimerização colocando o pente com a quantidade
desejada de poços.
7. Esperar esfriar o Erlemeyer e despejar a agarose a 1,5% no suporte de
polimerização.
8. Aguardar a formação do gel (solidificação) e retirar o pente.
9. Colocar o suporte de polimerização com o gel na cuba de eletroforese.
10. Adicionar na cuba tampão TEB 1X até cobrir a superfície do gel.
Aplicação da amostra no gel de Agarose
1. Homogeneizar em um plástico (tipo Mag Pac) 4 µL da amostra de DNA
(produto da PCR) com 2µL de azul de bromofenol. Obs.: Evitar ao
homogeneizar as amostras no plástico que as mesmas tenham contato entre
si. Deixar espaço entre elas.
2. Deve-se iniciar aplicação das amostras nos poços do gel com 4 µL de
Ladder (Não precisa homogeneizar com azul de bromofenol, pois o mesmo
já vem corado)
3. Em seguida a amostra negativa (branco) já homogeneizada com a gota de
azul de bromofenol deve ser dispensada no poço seguinte. Obs: Sempre
aplicar na seguinte ordem: Ladder, branco e DNA's.
4. Aplicar a amostra homogeneizada nos poços formados no gel.
5. Reservar um poço para utilização de um padrão de corrida (Ladder-100pb).
6. Ajustar a voltagem para 100 volts por 1,5 horas.
7. Analisar o gel sob radiação ultravioleta.
8. Tirar foto do gel para posterior análise dos resultados obtidos.
Obs: As corridas em gel de agarose são para observar se houve amplificação
durante o PCR, assim como verificar a qualidade do DNA amplificado, ou
seja, se o mesmo está em boa quantidade (Bandas fortes), se não há rastro
(não está degradado).
10
RFLP (POLIMORFISMO DE COMPRIMENTO DE FRAGMENTOS DE DNA)
Para a análise RFLP serão utilizados os produtos de PCR amplificados na PCR
GATTA e PCR Duffy. Será utilizado a enzima de restrição BanI (BshN1), StyI,
MspA1I e MwoI.
10.1 Reagentes para o preparo mix da digestão enzimática
Produto PCR (Duffy)
12 µL
Água destilada autoclavada
5,5 µL (qsp 50 µL)
Buffer 10 X
2 µL
Enzima de restrição
0,5 µL
Procedimentos:
1. Multiplicar as quantidades de reagente do protocolo pelo número de
amostras a serem digeridas e preparar o mix. Sempre utilizar ponteiras
estéreis.
2. Prepare o mix em um tubo com a capacidade para o volume final após o
cálculo realizado.
3. Utilizar tubo de 0,2 mL para no preparo da digestão de cada amostra.
4. Deve-se adicionar 8µL do mix em cada microtubo previamente identificado
para cada amostra.
5. Em seguida adicionar 12 µL de DNA correspondente a cada amostra
identificada em seu respectivo microtubo.
6. Levar as amostras ao termociclador.
10.2 Programação do Termociclador para as digestões enzimáticas
(Condições de incubação)
ENZIMA
BanI
StyI
MspA1I
MwoI
TEMPERATURA
37ºC
37ºC
37ºC
60ºC
TEMPO
4 horas
4 horas
4 horas
4 horas
A leitura das bandas da digestão enzimática para a enzima BanI será feita em
gel de agarose a 1,5% (ítem 9).
- O genótipo FYA deverá mostrar apenas a banda de 210 pb.
- O genótipo FYB deverá mostrar apenas a banda de 306 pb.
- O genótipo FYAB deverá mostrar duas bandas 306 e 210 pb.
A leitura das bandas da digestão enzimática para as enzimas StyI, MspA1I e
MwoI será feita em gel de poliacrilamida a 12% (ítem 11).
- StyI: O genótipo com o GATA mutado deverá mostrar a banda extra de 61 pb
e o GATA normal deverá mostrar apenas as bandas com 108 e 81 pb.
- MspAI: Os genótipos mutados para o SNP 265 C→T apresentaram banda
extra de 161pb e os genótipos sem a mutação apresentarão apenas as bandas
124pb e 118 pb.
- MwoI: Os genótipos mutados para o SNP 298 G→A apresentaram banda
extra de 343pb e os genótipos sem a mutação apresentarão apenas as
bandas 270pb e 73 pb.
11 GEL DE POLIACRILAMIDA PARA ANÁLISE DO PRODUTO DA DIGESTÃO
ENZIMÁTICA
Reagentes para o preparo do gel de Poliacrilamida a 12%:
1. Acrilamida 40%
6,4 mL
2. TEB 10X
2,0 mL
3. Água Dest
12,4 mL
4. Persulfato de Amônia (APS) 10%
200 µL
5. TEMED
16 µL
Preparo da Base para receber o Gel
1. Em um Erlemeyer adicione a água, seguido pelo TEB 10X, Acrilamida 40%,
Persulfato de Amônia (APS) 10% e por último o TEMED.
2. O preenchimento das placas de vidro deve ser rápido, devido a gelificação.
Preparo da Base para receber o Gel
1. Preparar os suportes com as placas de vidro.
2. Prender os suportes nas bases.
3. Prepara o Gel.
4. Encher a placa de vidro com o gel preparado utilizando uma seringa de 10 mL
com agulha.
5. Verificar a presença de bolhas e eliminá-las com a agulha caso ocorram.
6. Colocar o pente para a formação dos poços.
7. Aguardar a formação do gel. (2 horas)
8. Após a formação do gel, verificar, com agulha e seringa, se os poços estão
obstruídos.
9. Em seguida aplicar as amostras.
Aplicação de amostras no gel de Poliacrilamida
1. Encher a cuba de corrida com TEB 1x conforme as marcas na cuba.
2. Aplicar as amostras:
- Ladder: 2 µL + 2 µL azul de bromofenol (5x).
- DNA: 10 µL + 2 µL azul de bromofenol (5x).
3. Programar a voltagem da cuba de corrida para 100 V. o tempo de corrida é
1,5h aproximadamente.
4. Após a corrida retirar a lâmina com gel da cuba e colocar o gel com a lâmina
em uma cuba com água destilada ou tampão TEB 1x já adicionado brometo
de etídio (0,8 µL para cada 100mL de água) e aguardar 5 minutos.
5 Fazer a leitura e fotografar o gel no sistema de documentação.- Retirar a
lâmina com gel da cuba de corrida
- Colocar o gel com a lâmina em uma cuba com Água Destilada ou tampão
TEB 1x
- Adicionar 5uL ou 10 uL de brometo de etídio e aguardar 5 minutos.
- Fazer a leitura e fotografar o gel no sistema de documentação.
12
BIOSSEGURANÇA
Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança.
13
REGISTRO DOS RESULTADOS
O resultado da PCR/RFLP será preenchido pelo responsável do procedimento
no questionário de Fenotipagem e Genotipagem
(POP_MAL_LB_003_A01_v02_PT), indicando resultado, o código e a
assinatura do membro da equipe do projeto e a data do resultado.
14
REFERÊNCIAS
1. Castilho, L.; Rios, M.; Pellegrino, J.; Saad ST.; Costa FF.; Reid ME. A Novel FY
Allele in Brazilians. Vox Sang., 87(3), 190-5, 2004.
2. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de
microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; 2001.
15
REGISTRO DOS ANEXOS
TÍTULO DO ANEXO
Título do anexo 1: Questionário de
Fenotipagem/Genotipagem
NOME DO ANEXO:
Novo
Revisão
Tradução
Revisão
Justificativa
CÓDIGO DO ANEXO
(Incluindo versão/idioma):
POP_MAL_LB_005_A01_v02_PT
CÓDIGO DO ANEXO
(Incluindo versão/idioma):
Aprovado
Criado por:
por:
Data e
assinatura
Tradução
Data e
assinatura
A versão atual deste POP foi traduzida a
____________________ e a versão traduzida entra em efeito
em ___/___/_____.
dd
mm
aa
Assinatura do responsável: ______________________
9.5 Anexo 5 - Questionário de Fenotipagem
Procedimento Operacional Padrão
Gerência de Malária
Código POP
POP_MAL_LB_004_v02_PT
Título
Procedimento para realização da técnica de Fenotipagem Duffy
Idioma da versão
original
PORTUGUÊS
Traduzido por:
Revisado por:
Aprovado por:
Data de aplicação:
Cynthia Ferreira Oliveira
Paulo Roberto Ribeiro de Lima
Roberto Carlos Reyes Lecca
Sérgio Roberto L. Albuquerque
Marcus Vinícius G. Lacerda
24 de abril de 2009
Data & assinatura
Data da próxima
revisão:
Data & assinatura
Emenda
Data & assinatura
Razão da emenda
1. OBJETIVOS
Verificar a expressão do fenótipo Fy(a-b-) do sistema sanguíneo Duffy.
2. DEFINIÇÕES
Anticorpos monoclonais: ou mAb surgem a partir de um único linfócito B, que
é clonado e imortalizado, produzindo sempre os mesmos anticorpos, em
resposta um agente patogénico. Estes anticorpos apresentam-se iguais entre si
em estrutura, especificidade e afinidade, ligando-se por isso ao mesmo epítopo
no antigénio.
3. APLICÁVEL A
Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à
pesquisa clínica.
4. RESPONSABILIDADES
Pessoal encarregado da coleta das amostras da pesquisa.
Pessoal envolvido na realização da PCR nas amostras recebidas no laboratório
de biologia molecular.
Chefia do laboratório de biologia molecular.
5. POP'S RELACIONADOS
Procedimento para realização da técnica PCR/RFLP. (versão atual do
POP_MAL_LB_005_v02_PT).
6. PROCEDIMENTOS
6.1 Recursos necessários
Sangue total de paciente a ser testado, armazenado em tubo de 0,5 mL a 8ºC.
6.1.2 Materiais:
• Ponteiras com filtro para pipetas automáticas (10 µL, 100 µL, 1000 µL)
• Tubos de 1,5 mL
6.1.3 Equipamentos:
• Centrífuga de cartão
• Centrífuga
• Pipetas automáticas de 10 µL, 100 µL
6.1.4 Reagentes:
Fenotipagem Duffy:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Reagentes
Hemácias anticoaguladas (EDTA)
Anticorpos Anti-Fya de origem humana
Anticorpos Anti-Fyb de origem humana
LISS
Solução salina 0,9%
Cartões de gelcentrifugação com gel de
sephadex, contendo soro poliespecífico
antiglobulina humana (anti-IgG de coelho e
anti-C3d monoclonal, linhagem celular C
139-9), suspensos em gel.
Armazenamento
8ºC
8ºC
8ºC
Temp. ambiente
Temp. ambiente
Temp. ambiente
6.2 Obtenção de sangue total
Obter 300-400µL de sangue da porção digital, com o uso de lanceta comum,
em tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mL identificado contendo 15 µL de EDTA
6.3 Fenotipagem Duffy:
O procedimento Técnico de fenotipagem pela técnica de gel centrifugação,
consiste:
Procedimentos
1. Inicialmente lavar as hemácias a serem fenotipadas, três vezes com solução
salina 0,9%
2. Centrifugar por 1 minuto a 3.500 rpm a cada lavagem.
3. Preparar uma suspensão das hemácias a serem fenotipadas a 1% em
solução de baixa força iônica (LISS).
4. Em seguida identificar o cartão de gel centrifugação
5. Pipetar 50 uL dos reagentes anti-Fya e anti-Fyb nos respectivos canalículos
no cartão de gel.
6. Depois dispensar 25 uL da suspensão de hemácias a ser testada em cada 1
dos dois tubos.
7. O cartão deve ser incubabo por 10 minutos à 37°C em banho seco e
centrifugado em seguida por 10 minuto.
8. A leitura deve ser realizada de acordo com os padrões indicados pelo
fabricante.
Exemplo de interpretação dos possíveis resultados obtidos:
- Reação Positiva ++++: Hemácias totalmente concentradas na parte
superior do gel após a centrifugação.
- Reação Positiva +++: Hemácias concentradas na parte superior porém se
estendendo ao 1° terço superior do gel.
- Reação Positiva ++: Hemácias se estendendo da parte superior do gel até
a parte central do canalículo.
- Reação Positiva +: Hemácias se estendendo da parte central do gel até a
parte inferior do canalículo.
- Reação negativa: Hemácias totalmente concentradas na parte inferior do
gel após a centrifugação.
6.4 Biossegurança
Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança.
6.5 Registro dos resultados
O resultado da PCR será preenchido pelo responsável do procedimento no
questionário de Fenotipagem/Genotipagem (POP_MAL_LB_003_A01_v02_PT),
indicando resultado, o motivo em caso de não ter realizado o exame, a ordem de
armazenamento, o código e a assinatura do membro da equipe do projeto e a data
do resultado.
7.
REFERÊNCIAS
1. Castilho, L.; Rios, M.; Pellegrino, J.; Saad ST.; Costa FF.; Reid ME. A Novel FY
Allele in Brazilians. Vox Sang., 87(3), 190-5, 2004.
2. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de
microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; 2001.
.
8.
REGISTRO DOS ANEXOS
TÍTULO DO ANEXO
Título do anexo 1: Questionário de
Fenotipagem/Genotipagem
NOME DO ANEXO:
Novo
Revisão
Tradução
Revisão
Tradução
Justificativa
CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo
versão/idioma):
POP_MAL_LB_003_A01_v02_PT
CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo
versão/idioma):
Criado por:
Aprovado por:
Data e
assinatura
Data e
assinatura
A versão atual deste POP foi traduzida a
____________________ e a versão traduzida entra em efeito
em ___/___/_____.
dd
mm
aa
Assinatura do responsável: ______________________
9.6 Anexo 5 - Questionário de Resultados PCR/RFLP
Consórcio P. vivax
EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA NO CAREIRO
Questionário de Fenotipagem/Genotipagem
(POP_MAL_LB_005_A01_v02_PT)
IDENTIFICAÇÃO
|__|-|__|__|__|-|__|__|
Número de identificação permanente
RESULTADO DA FENOTIPAGEM DUFFY
|__|
|__|
|__|
|__|
Fy(a+b-)
Fy(a+b+)
Fy(a-b+)
Fy(a-b-)
(1= positivo; 0= negativo)
RESULTADO DA GENOTIPAGEM DUFFY
FYA/FYA
X
FYA/FY
FYA/FYB-33
FYA/FYB
FYB/FYB
|__|
|__|
|__|
|__|
|__|
X
FYB/FY
FYB/FYB-33
X
FY /FYX
x
FYB-33/FYB-33
|__|
|__|
|__|
|__|
(1= positivo; 0= negativo)
9.7 Anexo 7 – Registro de aprovação do CEP