CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO LEITE KARLA T. M. GOLLNER REIS AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DO PETRIFILMTM AC FRENTE À QUALIDADE DO LEITE PASTEURIZADO APÓS IMPLANTAÇÃO DA I.N. 51 DO MAPA. Londrina 2011 2 KARLA T. M. GOLLNER REIS AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DO PETRIFILMTM AC FRENTE À QUALIDADE DO LEITE PASTEURIZADO APÓS IMPLANTAÇÃO DA I.N. 51 DO MAPA. Dissertação apresentada à Universidade Norte do Paraná - UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia do Leite. Orientador: Prof. Dr. Salvador Massaguer Roig. Londrina 2011 3 KARLA T. M. GOLLNER REIS AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DO PETRIFILMTM AC FRENTE À QUALIDADE DO LEITE PASTEURIZADO APÓS IMPLANTAÇÃO DA I.N. 51 DO MAPA. Dissertação, apresentada à UNOPAR - Universidade Norte do Paraná, no Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia do Leite, com nota final igual a _______, conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores: Prof. Dr. Salvador Massaguer Roig Universidade Norte do Paraná Profa. Dra. Vaneli Beloti Universidade Estadual de Londrina Profa. Dra. Elsa Helena. W. Santana Universidade Norte do Paraná Londrina, 09 de junho de 2011. 4 Dedico este trabalho aos Joãos de Minha Vida: As duas Graças Divinas – João Batista Reis e João Paulo Gollner Reis. 5 AGRADECIMENTOS A Deus, por sua presença em todos os instantes de minha vida. Ao Prof. Salvador Massaguer Roig, pela orientação, boa vontade e compreensão. Agradeço de forma muito especial por sua inigualável paciência. As Profas. Vaneli Beloti e Elsa H. W. Santana, por compartilharem seus conhecimentos e experiências. Especialmente pela presença neste importante momento do meu conhecimento. Ao Prof. Marco Antonio Laffranchi, pela capacidade visionária de apoio aos estudos e por sempre confiar no meu trabalho. Aos companheiros de mestrado pela divisão de conhecimentos, colaboração, união de “forças” e presença nestes dois anos de estudos. A Lucia C. Gollner M. Moreira (Dindinha) por sua benevolência e perseverança. Aos meus Amigos de Candinha, em especial ao Alencar Moreira, Andréia Moreira e Maria Tereza Cratiu, pelo companheirismo e abdicação laticinista. E por serem os Anjos de Guarda da Razão da Minha Vida. Ao Meu João meu marido (companheiro e cúmplice) e ao meu filho João Paulo (Razão da Minha Vida) pelo carinhoso apoio incondicional. Aos Mestres da Arte de Ser Professor, pela perspicácia de Saber Ensinar Aprendendo com a Vida. 6 Mulheres “Elas sorriem quando querem gritar. Elas cantam quando querem chorar. Elas choram quando estão felizes. E riem quando estão nervosas. Elas brigam por aquilo que acreditam. Elas levantam-se para injustiça. Elas não levam "não" como resposta quando acreditam que existe melhor solução. Elas andam sem novos sapatos para suas crianças poder tê-los. Elas vão ao medico com uma amiga assustada. Elas amam incondicionalmente. Elas choram quando suas crianças adoecem e se alegram quando suas crianças ganham prêmios. Elas ficam contentes quando ouvem sobre um aniversario ou um novo casamento”. Pablo Neruda 7 GOLLNER-REIS, Karla, T.M.. Avaliação do desempenho do PetrifilmTM AC frente a qualidade do leite pasteurizado após a implantação da I.N. 51 do MAPA. 2011. 193p. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia do Leite) – Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2011. RESUMO Na busca por agilidade e precisão, métodos rápidos de análise microbiológica foram introduzidos na rotina do controle da qualidade laticinista, dentre esses as placas PetrifilmTM. No Brasil, o PetrifimTM AC não são recomendadas para enumeração de micro-organismos aeróbios mesófilos (MAM) de leite pasteurizado (LP). Pesquisas relacionaram o desempenho insatisfatório com a deficitária qualidade do leite In natura e conseqüente presença de micro-organismos termoresistentes no LP. Os objetivos deste estudo consistem do diagnostico do atendimento dos parâmetros da IN 51/2002 pelo LP e respectiva influência no emprego das placas AC para enumeração de MAM e termodúricos (TER). Foram analisadas 80 amostras de LP coletadas na indústria e no comércio. A qualidade físico-química e microbiológica foi determinada através de metodologias oficiais (BRASIL, 2006; 2003) e os resultados comparados com os parâmetros da IN 51/2002. Foram também realizadas a análises de lactofermentação (LAC) e detecção de resíduos de substancias antimicrobianas (RSA). Para o desempenho das placas AC os valores médios (log10 UFC/mL) de MAM e TER foram avaliados por análise estatística de variância ANOVA (p<0,05) e por correlação (r). Para todos os tipos de LP ocorreu a redução na concentração de MAM, porém o diagnóstico obtido demonstra a necessidade da avaliação dos procedimentos de garantia da qualidade industrial. Neste estudo obteve-se o índice de 33,7% das amostras de LP em desacordo com a IN 51, com maior incidência para RSA (16,5%). A análise da LAC demonstrou ser uma importante ferramenta da qualidade, onde 22,4% das amostras com coágulo digerido apresentaram TER/MAM superior a 10% e nas LAC líquido 53,8% possuíam relação direta com presença de RSA. A concentração de MAM como fator único de qualidade microbiológica, demonstrou não possuir relevância frente às atuais condições. A carga de TER tornou-se um fator importante do monitoramento e segurança da cadeia produtiva do leite de consumo. O desempenho das placas AC manteve a dependência direta com o tipo de microbiota remanescente da pasteurização. Foi obtida boa correlação para MAM (r: 0,8426) e regular para TER (r: 0,7089). Quando da separação por tipo de leite a correlação de MAM apresentase diferente para em função do tipo de leite. O desempenho do método parece também sofrer influencia de fatores como: condições da origem (tipo de microbiota); processamento tecnológico; capacidade de recuperação pós estresse térmico e período do monitoramento. O diagnóstico obtido demonstrou a necessidade de avaliação criteriosa frente às características regionais e tecnológicas de cada laticínios, de forma a permitir o emprego do PetrifilmTM AC. Palavras-chave: Mesófilos. Termodúricos. Antimicrobianos. Lactofermentação. 8 GOLLNER-REIS, Karla, T.M.. Performance Evaluation of PetrifilmTM AC as for Pasteurized Milk Quality after Implementation of MAPA Norm 51. 2011. 193p. Dissertation (Master’s Degree Program in Milk Science and Technology) – Center of Health and Biological Sciences, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2011. ABSTRACT In search of agility and precision, fast methods for microbiological analyses such as PetrifilmTM were applied in the dairy quality control routine control. In Brazil, PetrifilmTM AC are not recommended for numbering mesophilic aerobe microorganisms (MAM) of pasteurized milk (PM). Researchers have related unsatisfactory results to the deficient quality of In natura milk and consequent presence of thermal resistant microorganisms in pasteurized milk. The purposes of this study comprehended the diagnosis of compliance to IN 51/2002 parameters and respective influence in the use of AC plaques for numbering MAM and thermoduric bacteria (TER). Eighty samples of pasteurized milk collected from the industry and the market were analyzed. The physical-chemical and microbiological quality was determined by means of official methodologies (BRASIL, 2006; 2003) and the results compared to IN 51/2002 parameters. Analyses of lacto-fermentation (LAC) and detection of residues of antimicrobial substances (RAS) were also performed. As to the performance of AC plaques, the mean values (log10 UFC/mL) of MAM and TER were evaluated by ANOVA (p<0,05) and by correlation (r). For all types of PM there was a reduction of MAM concentration; however, the final diagnosis evidences the need for evaluation of procedures of industrial quality control. This study could identify an index of 33,7% of PM samples in no compliance with IN 51, a higher occurrence for RAS (16,5%). LAC analysis was proved to be an important quality tool, where 22,4% of the samples with digested clotting had TER/MAM above 10% and in liquid LAC, 53,8% had a direct relation with the presence of RAS. The MAM concentration, as the only factor of microbiological quality, evidenced no relevance for current conditions. TER load was an important factor for the monitoring and safety of the milk for consumption productive chain. AC plaques performance kept a direct dependence on the type of pasteurization flora remaining. A good correlation for MAM (r: 0,8426) and regular for TER (r: 0,7089) was obtained. Upon sorting out of milk type, the MAM correlation differs accordingly. The method performance also seems to be affected by factors such as: origin conditions (type of microbiota); technological process; post thermal stress recovery capacity and period of monitoring. The final diagnosis also evidenced the need for a detailed evaluation in regard to regional and technological characteristics of each dairy product in order to use PetrifilmTM AC. Key Words: Mesophilic. Thermoduric. Antimicrobials. Lacto-fermentation. 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Esquema da redução do cloreto de trifeniltetrazólio e formação de cloreto de trifenil formazana...................................................... 63 Figura 2 – Kit reativo para pesquisa Fosfatase Alcalina.................................. 67 Figura 3 – Interpretação dos resultados da pesquisa de Fosfatase Alcalina.. Figura 4 – Interpretação dos resultados da pesquisa de Peroxidase.............. 69 Figura 5 – Chapa incubadora para pesquisa de resíduos de antibióticos....... 69 Figura 6 – Interpretação dos resultados de resíduos de antibióticos: beta- 68 lactâmicos tetraciclinas................................................................... 70 Figura 7 – Interpretação dos resultados do método Iogurte – Indicador para detecção de resíduos de substâncias antimicrobianas.................. Figura 8 – 85 Interpretação dos resultados da analise de Lactofermentação Coagulo dessorado (DE) com coluna de soro e coagulo homogêneo (HO)............................................................................ Figura 9 – 97 Interpretação dos resultados da analise de Lactofermentação: Coagulo digerido (DI), não formação de coágulo (LI), coágulo gasoso (GA), coágulo homogêneo (HO) e coágulo gasoso (GA)................................................................................................ Figura 10 – 98 Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos de 62 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)....................................................... 105 Figura 11 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)................................ 106 Figura 12 – Placa com Agar Padrão com TTC - Colônias de micro-organimos aeróbios mesofilos de leite pasteurizado....................................... 108 Figura 13 – Placa PetrifilmTM AC – Colônias de micro-organimos aeróbios mesófilos de leite pasteurizado...................................................... 109 Figura 14 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos, 10 por tipo de leite, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)........................... 111 Figura 15 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos, por tipo de leite, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... 114 Figura 16 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos, por planta industrial, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 117 2010).............................................................................................. Figura 17 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das plantas X e Y, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... 119 Figura 18 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das plantas Z e W, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... 120 Figura 19 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos por intervalos de tempo (t1:0h, t2:24h e t3:48h), das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)........................................................................ 124 Figura 20 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos por intervalo de tempo (t2: 24h e t3:48h), das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – .novembro de 2010)...................................................... 126 Figura 21 – Placa PetrifilmTM AC - *Colônia gel liquefeito da contagem de 11 micro-organismos mesófilos aeróbios de leite pasteurizado.......... 128 Figura 22 – Placa como meio Agar Padrão TTC – Colônias de microorganismos termodúricos de leite pasteurizado............................. 129 Figura 23 – Placa como meio Agar Padrão – Colônias de micro - organismos termodúricos de leite pasteurizado............................................... 130 Figura 24 – Placa como meio Agar Padrão com TTC – Colônias de micro organismos termodúricos de leite pasteurizado............................. 131 Figura 25 – Placa PetrifilmTM AC – Colônias de micro - organismos termodúricos de leite pasteurizado. *Colônias “ponta de alfinete”........................................................................................... 132 Figura 26 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos de 61 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)....................................................... 135 Figura 27 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)................................ 136 Figura 28 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos, por tipo de leite, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)................................ 138 Figura 29 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens termodúricos, por tipo de de micro-organismos leite, de amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... 140 Figura 30 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos por intervalos de tempo (t1:0h, t2:24h e t3:48h), das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)........................................................................ 142 Figura 31 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das .contagens de micro-organismos 12 termodúricos por intervalo de tempo (t2: 24h e t3:48h), das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – .novembro de 2010)...................................................... 145 Figura 32 – Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens termodúricos, das plantas X e Z, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)....................................................... 146 13 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Requisitos de qualidade do leite cru refrigerado por regiões – IN 51/2002........................................................................................... 28 Tabela 2 – Qualidade do leite cru de diversas regiões do Brasil, em função da concentração de micro-organismos mesófilos aeróbios (1997 – 2009)........................................................................................... Tabela 3 – 30 Qualidade do leite pasteurizado em diversas regiões do Brasil, em função da concentração de micro-organismos mesófilos aeróbios (1997 – 2009).................................................................. Tabela 4 – Diferentes estudos da correlação do PetrifilmTM AC 39 e metodologia tradicional (1984 – 2009).......................................... 57 Tabela 5 – Parâmetros da interpretação do teste de Lactofermentação......... 77 Tabela 6 – Requisitos de físico-químicos e de composição previstos na IN 51/2002 para leites pasteurizados.................................................. 78 Tabela 7 – Requisitos microbiológicos previstos na IN 51/2002 para leites pasteurizados................................................................................. Tabela 8 – 78 Média dos resultados de composição e físico-químicos de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)....................................................... Tabela 9 – 80 Resultados das pesquisas de Fosfatase e Peroxidase de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)....................................................... 82 Tabela 10 – Concentrações detectáveis de resíduos de antibióticos pelo método Charm MRL BL/TET Test e os limites máximos de resíduos do Programa de Controle de Resíduos em Leite - PCRL 83 Tabela 11 – Resultados das pesquisas de resíduos de antibióticos e resíduos de substâncias antimicrobianas de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... Tabela 12 – Média dos resultados das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos de 30 amostras de leites pasteurizados da 84 14 região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)................ 88 Tabela 13 – Média dos resultados das contagens de termodúricos de 27 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)....................................................... 91 Tabela 14 – Média dos resultados das contagens de psicrotróficos de 30 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)....................................................... 93 Tabela 15 – Média dos resultados das contagens de coliformes totais e Escherichia coli de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)................ 95 Tabela 16 – Resultados da análise de Lactofermentação de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)........................................................................ 96 Tabela 17 – Correlação entre os resultados da lactofermentação e das análises de detecção de resíduos de substancias antimicrobianas e peroxidase negativa de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... 101 Tabela 18 – Correlação entre os resultados da lactofermentação líquida e resultados das análises de detecção de resíduos de substancias antimicrobianas e peroxidase de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... 102 Tabela 19 – Correlação entre os resultados de detecção de substâncias antimicrobianas e resultados da análise de lactofermentação de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)....................................................... 103 Tabela 20 – Resultados estatísticos das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos dos métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)................ 104 Tabela 21 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das 15 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)....................................................... 104 Tabela 22 – Resultados estatísticos por tipo de leite das contagens de microorganismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)................ 110 Tabela 23 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de microorganismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por tipo de leite................................................................ 112 Tabela 24 – Resultados estatísticos por tipo de leite das contagens de microorganismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... 113 Tabela 25 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por tipo de leite............................. 113 Tabela 26 – Resultados estatísticos por planta industrial das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... 116 Tabela 27 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de microorganismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por planta industrial......................................................... 117 Tabela 28 – Resultados estatísticos por planta industrial das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de 16 leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)........................................................................ 118 Tabela 29 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por planta industrial....................... 118 Tabela 30 – Resultados estatísticos por intervalo de tempo das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... 123 Tabela 31 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de microorganismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por intervalo de tempo..................................................... 123 Tabela 32 – Resultados estatísticos por intervalo de tempo das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)........................................................................ 125 Tabela 33 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por intervalo de tempo.................. 125 Tabela 34 – Resultados estatísticos das contagens de micro-organismos termodúricos dos métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)........................... 134 Tabela 35 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das 17 contagens de micro-organismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)........................................................................ 134 Tabela 36 – Resultados estatísticos por tipo de leite das contagens de microorganismos termodúricos dos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)........................... 137 Tabela 37 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de microorganismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por tipo de leite..................................................................................... 137 Tabela 38 – Resultados estatísticos por tipo de leite das contagens de microorganismos termodúricos dos métodos: PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... 139 Tabela 39 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por tipo de leite............................................... 139 Tabela 40 – Resultados estatísticos por intervalo de tempo das contagens de micro-organismos termodúricos dos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)................ 141 Tabela 41 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de microorganismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por intervalo de tempo.......................................................................... 143 Tabela 42 – Resultados estatísticos por intervalo de tempo das contagens de micro-organismos termodúricos dos métodos: PetrifilmTM AC, 18 Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)......................................................................................... 144 Tabela 43 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por intervalo de tempo.................................... 144 Tabela 44 – Resultados estatísticos por planta industrial das contagens de termodúricos pelos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)............................................... 146 Tabela 45 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por planta industrial......................................................................................... 147 Tabela 46 – Resultados estatísticos por planta industrial das contagens de termodúricos pelos métodos: PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010)........................... 147 19 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS a Inclinação da reta AC Placa PetrifilmTM AC AFNOR Association Française de Normalizations AL Alizarol 75º GL APHA American Public Health Association AOAC Association of Official Analytical Chemists Aus. Ausência b Intercepção da reta BC Baixa carga bacteriana c Número máximo de amostras com resultados entre m e M CC Coliformes Totais CDP Peptídeo Derivado da Caseína CGMP Caseinoglicomacropeptídeos CIM Concentração Inibitória Mínima CLAE-UV Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – detector Ultra Violeta CMP Caseinomacropeptídeo CPP Contagem Padrão por Placas CO Conservantes CSC Contagem Células Somáticas D15º C Densidade relativa corrigida a 15º C DE Dessorado DI Digerido DP Desvio Padrão DPC Depressão do Ponto de Congelamento EC Escherichia coli / E. coli ESD Extrato Seco Desengordurado FIL Federação Internacional de Latínicios FO Fosfatase GA Gasoso Gb Teor de gordura 20 GMP glicomacropetídeos ºD Acidez Dornic ºH Graus Horvet IDF International Dairy Federation IN Instrução Normativa INB Inibidores HO Homogêneo HTST High Temperature Short Time – Alta Temperature Tempo Curto LAC Lactofermentação LC Leite Cru LCR Leite Cru Refrigerado LI Liquido LMR Limite Máximo de Resíduos LP Leite Pasteurizado LPA Leite Pasteurizado Tipo A LPB Leite Pasteurizado Tipo B LPD Leite Pasteurizado Desnatado LPI Leite Pasteurizado Integral LPP Leite Pasteurizado Padronizado M Limite máximo m Limite inferior MAM Micro-organismos mesófilos aeróbios MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Max. Máximo Min. Mínimo N. Número de amostras n Número de amostras do plano de amostragem ND Número de amostras com resultado detectado n.ND Número de amostras com resultado não detectado NE Negativo NR Não referenciado PAMVET Programa de Análises de Resíduos de Medicamentos Veterinários PCA Método tradicional – Agar Padrão Contagem PCATTC PCA adicionado de TTC 21 PCRL Programa Controle de Resíduos em Leite PE Peroxidase PNCR Programa Nacional de Controle de Resíduos %ADL Percentual de amostras em desacordo com a legislação PNMQL Programa Nacional de Melhoria da Qualidade do Leite PO Positivo PSI Psicrotróficos PT Teor de proteínas r Coeficiente de correlação r2 Coeficiente de determinação RA Resíduos de Antibióticos RAII Resíduos de Antimicrobiano – Método Iogurte-Indicador RATB Resíduos de Antibióticos Tetraciclinas e Beta-lactâmicos RBQL Rede Brasileira de Laboratórios de Análises da Qualidade do Leite RCB Redução da carga bacteriana RSA Resíduos de Substâncias Antimicrobianas s Desvio Padrão 2 S Variância Média SNG Sólidos não gordurosos RTIQL Regulamento Técnico de Qualidade do Leite SU Suspeito TER Termodúricos TER/MAM Relação concentração de TER por concentração de MAM TTC Cloreto de Trifeniltetrazólio TTF Cloreto de Trifeniltetrazólio Formazana TVU Tempo de Vida Útil UFC Unidade Formadora de Colônias x Média 22 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 25 2 OBJETIVOS...................................................................................................... 26 2.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................................. 26 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................... 26 3 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................. 27 3.1 INSTRUÇÃO NORMATIVA N. 51/2002................................................................... 27 3.2 QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DO LEITE CRU....................................................... 28 3.2.1 Micro-organismos Mesófilos........................................................................ 29 3.2.2 Micro-organismos Psicrotróficos.................................................................. 32 3.3 QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DO LEITE PASTEURIZADO....................................... 37 3.3.1 Micro-organismos Mesófilos Aeróbios......................................................... 38 3.3.2 Micro-organismos Indicadores..................................................................... 40 3.3.3 Micro-organismos Termodúricos................................................................. 41 3.4 VALIDAÇÃO DO PROCESSO DE PASTEURIZAÇÃO................................................... 45 3.4.1 Fosfatase Alcalina........................................................................................ 45 3.4.2 Lactoperoxidase........................................................................................... 46 3.5 PRESENÇA DE RESÍDUOS DE ANTIBIÓTICO E DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS.. 48 3.6 LACTOFERMENTAÇÃO: MONITORAMENTO DA MICROBIOTA BACTERIANA ................ 53 3.7 SISTEMA PETRIFILM™ PARA CONTAGEM MESÓFILOS AERÓBIOS – PLACAS AC...... 55 3.8 CORRELAÇÃO PETRIFILM™ AC E A METODOLOGIA TRADICIONAL PARA LEITE PASTEURIZADO BRASILEIRO..................................................................................... 60 4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 65 4.1 AMOSTRAGEM................................................................................................... 65 4.2 CRITÉRIO DO INTERVALO PARA REALIZAÇÃO DAS ANÁLISES.................................. 65 4.3 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS................................................................................ 66 4.3.1 - Requisitos de Qualidade: Físico-químicos e de Composição................... 66 4.3.2 - Monitoramento do Processo de Pasteurização – Fosfatase Alcalina........ 67 4.3.3 - Monitoramento do Processo de Pasteurização – Peroxidase................... 68 23 4.3.4 - Detecção de Resíduos de Antibióticos: Charm MRLBL/TET Test............ 69 4.3.5 - Detecção de Resíduos Substâncias Antimicrobianas: Método Iogurte – Indicador............................................................................................................... 70 4.4 PREPARO DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS.............................. 72 4.5 CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS AERÓBIOS MESOFILOS (MAM)..................... 72 4.5.1 - Método Tradicional Agar Padrão - MAMPCA.............................................. 72 4.5.2 - Método Tradicional Agar Padrão com TTC - MAMPCATTC ......................... 73 4.5.3 - Método Sistema PetrifilmTM placas AC - MAMAC...................................... 73 4.6 CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS TERMODÚRICOS (TER)................................ 74 4.6.1 - Método Tradicional Agar Padrão - TERPCA ............................................... 74 4.6.2 - Método Tradicional Agar Padrão - TERPCATTC........................................... TM 4.6.3 - Método Sistema Petrifilm 75 placas AC - TERAC......................................... 75 4.7 CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS PSICROTRÓFICOS (PSI)............................... 75 4.7.1 - Método Tradicional Agar Padrão - PSIPCA................................................. 75 4.7.2 - Método Tradicional Agar Padrão - PSIPCATTC............................................ 75 4.7.3 - Método Sistema PetrifilmTM placas AC - PSIAC.......................................... 75 4.8 CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E ESCHERICHIA COLI – CTEC ...................... 76 4.9 ANÁLISE DE LACTOFERMENTAÇÃO...................................................................... 76 4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................... 77 5 RESULTADOS e DISCUSSÃO......................................................................... 78 5.1 DIAGNÓSTICO DA QUALIDADE DOS LEITES PASTEURIZADOS: REQUISITOS FÍSICO QUÍMICOS E DE COMPOSIÇÃO................................................................................... 79 5.2 DIAGNÓSTICO DA QUALIDADE DOS LEITES PASTEURIZADOS: MONITORAMENTO DO PROCESSO DE PASTEURIZAÇÃO............................................................................... 81 5.3 DETECÇÃO DE RESÍDUOS DE ANTIBIÓTICOS E DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS EM LEITES PASTEURIZADOS..................................................................................... 82 5.3.1 Detecção de Resíduos de Antibióticos........................................................ 85 5.3.2 Detecção de Resíduos de Substâncias Antimicrobianas............................ 86 5.4 DIAGNÓSTICO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DOS LEITES PASTEURIZADOS....... 87 5.4.1 Concentração de Mesófilos Aeróbios.......................................................... 88 5.4.2 Concentração de Termodúricos................................................................... 90 5.4.3 Concentração de Psicrotróficos................................................................... 93 24 5.4.4 Contagem de Coliformes Totais e E. coli..................................................... 94 5.5 A LACTOFERMENTAÇÃO COMO DIAGNÓSTICO DA MICROBIOTA PREDOMINANTE DOS LEITES PASTEURIZADOS................................................................................... 96 5.6 CORRELAÇÃO ENTRE OS RESULTADOS DE ALGUNS PARÂMETROS DE QUALIDADE... 100 5.7 CORRELAÇÃO PETRIFILMTM AC E MÉTODO TRADICIONAL PARA CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS............................................................. 104 5.8 CORRELAÇÃO PETRIFILMTM AC E MÉTODO TRADICIONAL PARA CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS TERMODÚRICOS...................................................................... 129 5.9 DIAGNÓSTICO DA QUALIDADE DO LEITE PASTEURIZADO E CORRELAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS............................................................................................................... 148 CONCLUSÕES..................................................................................................... 151 REFERÊNCIAS.................................................................................................... 152 ANEXO................................................................................................................. 184 ANEXO A – Resultados Físico-químicos e Microbiológicos ................................ 185 INTRODUÇÃO Nos últimos anos a melhoria da qualidade do leite “In natura” vem sendo um dos principais objetivos do setor lácteo brasileiro. Avanços foram obtidos a partir da implantação das normas da Instrução Normativa 51/2002 (BRASIL, 2002) pelo setor, como ferramenta de qualidade. Nas últimas décadas, métodos rápidos microbiológicos foram introduzidos na rotina do controle de qualidade laticinista, em substituição da metodologia tradicional, buscando agilidade e precisão. Dentre esses métodos encontra-se o sistema Petrifilm™. Porém o desempenho destes métodos possui dependência direta com as características intrínsecas e de qualidade de cada alimento (FRANCO,1994; 2006). No Brasil, quando da implantação das placas PetrifilmTM AC para a enumeração de mesófilos aeróbios em leite pasteurizado, foi evidenciado não existir repetibilidade e boa correlação com o método padrão para enumeração de microorganismos aeróbios mesófilos (BELOTI, 2000). Estudos diagnosticaram como causa da não correlação a influência direta da deficitária qualidade higiênico-sanitária do leite “In natura”, e a presença de microrganismos termoresistentes (remanescentes da pasteurização) não capazes de reduzir o corante cloreto de trifeniltetrazólio (TTC), como uma provável razão das diferenças dos resultados (BELOTI et al., 1999; BELOTI, 2000; NERO; BELOTI; BARROS, 2000). Com o advento da IN 51/2002 e respectiva implantação de melhorias na qualidade higiênico-sanitária em toda a cadeia produtiva do leite, espera-se que tenha ocorrido modificações no que tange a concentração e ao tipo predominante de microbiota bacteriana. Desta forma, percebe-se uma carência de dados atualizados que evidenciem a influencia dos avanços da qualidade da matéria prima e do leite pasteurizado, frente ao possível emprego do sistema Petrifilm™ AC na rotina dos laboratórios de garantia da qualidade das indústrias lácteas nacionais. 26 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL: Diagnosticar a qualidade dos leites pasteurizados na região de Londrina – PR, frente o atendimento dos parâmetros de qualidade da IN 51/2002 e a respectiva influencia sobre o desempenho do sistema PetrifilmTM AC. 2.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Avaliar a eficiência das placas Petrifilm™ AC e dos fatores pertinentes para enumeração de micro-organismos aeróbios mesófilos (MAM) e termodúricos (TER) frente à qualidade atual dos leites pasteurizados. Determinar a correlação entre as placas AC e o método padrão da contagem desses micro-organismos e diagnosticar os fatores que influenciam a performance e a validação da metodologia. 27 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 INSTRUÇÃO NORMATIVA N. 51/2002 A melhoria da qualidade do leite cru é um dos objetivos primordiais do setor lácteo brasileiro, que somente começou a ocorrer a partir da união de esforços dos seguimentos envolvidos (produtores, processadores e governo federal). Avanços foram alcançados a partir da criação e aplicação de políticas econômicas favoráveis ao setor; buscando a produção de leite com qualidade (MARTINS et al., 2004). Em meados dos anos 90, através do Programa Nacional de Melhoria da Qualidade do Leite (PNMQL), Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) iniciou uma série de discussões com o setor produtivo nacional, sobre a melhoria da qualidade do leite e respectiva modernização do setor, culminando com a instituição e publicação da Instrução Normativa n. 51 (IN 51/2002), de 18 de setembro de 2002 do MAPA (BRASIL, 2002). A IN 51 visa a melhoria da qualidade dos leites das diversas regiões do país. Consiste em um conjunto de regulamentos técnicos, que descrevem normas na produção, identidades e requisitos de qualidade (físico-químico e microbiológico) para leites tipos A, B e C, dos leites pasteurizados, cru refrigerado e equivalentes, bem como normas para o sistema de transporte a granel (BRASIL, 2002). Dentre as diversas obrigatoriedades na produção, encontra-se a refrigeração do leite cru na propriedade (≤ 4ºC) após no máximo 3 horas da ordenha), durante o transporte a granel (≤ 7ºC) e no momento da recepção (≤ 10ºC) na plataforma industrial (BRASIL, 2002). Foram também descriminados os requisitos máximos para a contagem de células somáticas (CCS) e da contagem padrão em placas (CPP) do leite cru refrigerado (Tabela 1), até então, não preconizados e/ou descritos pela legislação anterior. Bem como, os diferentes prazos para o seu atendimento por toda a cadeia láctea nacional, de acordo com a localização geográfica da produção (BRASIL, 2002). Uma das diretrizes, também determinadas pela IN 51/2002, foi o prazo para a extinção do leite cru resfriado tipo C e do leite pasteurizado tipo C e a 28 introdução do leite cru refrigerado (LCR) e leite pasteurizado (BRASIL, 2002). A extinção do leite cru resfriado tipo C, também foi delimitada de acordo com a região geográfica produtora: a partir de julho/2005 nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste e julho/2007 nas regiões Norte e Nordeste (BRASIL, 2002; NERO, 2005). Tabela 1 – Requisitos de qualidade do leite cru refrigerado por regiões – IN 51/2002 Sul, Sudeste e Centro-oeste Até 06/2005 07/2005 a 6/2008 7/2008 a 6/2011 Após 7/2011 Norte e Nordeste Até 06/2007 07/2007 a 6/2010 07/2010 a 6/2012 Após 7/2012 Contagem padrão (máx. UFC/mL) 1,0 x 10 * Contagem de Células Somáticas (máx. cel./mL) 1,0 x 10 * 6 1,0 x 10 6 7,5 x 10 5 6 1,0 x 10 6 7,5 x 10 5 5 1,0 x 10 ** e 5 3,0 x 10 *** 5 4,0 x 10 LCR: Leite cru refrigerado / *Estabelecimentos habilitados ao programa / **Leite individual/ ***Leite conjunto Fonte: adaptado da IN 51/2002 (BRASIL, 2002). Por apresentar parâmetros e diretrizes diferentes e/ou contraditórios aqueles descritos pelo Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal – RIISPOA (BRASIL, 1997) pode-se dizer que a IN 51/2002 ainda encontra-se como uma legislação de “adoção voluntária”. Enquanto não ocorrer a publicação das alterações e atualizações do RIISPOA, o reconhecimento da IN 51/2002, como legislação de referencia é conseguido através de sua inserção nos memoriais descritivos de registro de rótulo das empresas sob regime de inspeção federal. 3.2 QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DO LEITE CRU O leite por natureza é um alimento rico em nutrientes e em função de suas características bioquímicas e físicas torna-se um substrato ideal para a proliferação de micro-organismos, que além da deterioração também podem representar um risco à saúde humana (SANTOS; FONSECA, 2007; TRONCO, 2008). Para que o leite cru seja considerado como de boa qualidade, deve 29 apresentar baixa carga bacteriana, ausência de micro-organismos patogênicos, reduzida contagem de células somáticas e ausência de resíduos de substâncias químicas (LORENZETTI, 2006; PANTOJA; REINEMANN; RUEGG,2009; SANTOS; FONSECA, 2007). 3.2.1 Micro-organismos Mesófilos A carga microbiana inicial do leite pode ser definida, como a concentração de micro-organismos presentes no leite imediatamente após a sua ordenha, estando este já armazenado no tanque de resfriamento (PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006; SANTOS; FONSECA, 2007). A qualidade do leite cru refrigerado (LCR) está diretamente relacionada com as condições higiênico sanitárias de sua obtenção, armazenamento e transporte; sendo dependente do grau de contaminação inicial e do binômio temperatura/tempo do resfriamento em que o leite permanece desde a ordenha até o seu processamento (ELMOSLEMAY et al., 2009a; HUTCHISON, 2004; PANTOJA; REINEMANN; RUEGG;2009, PEREIRA, 2010; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006; GUIMARÃES, 2002; SANVIDO, 2007). A contaminação e proliferação dos micro-organismos no LC, também possuem dependência direta de fatores como: condições sanitárias do rebanho, procedimentos higiênico - sanitários na ordenha, potabilidade e dureza da água empregada e do processo de higienização das ordenhadeiras e instalações (ELMOSLEMAY, et al., 2009a; 2009b; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006; SANTANA, et al., 2004; SANTOS; FONSECA, 2007; YAMAZI et al., 2010). Efeitos sazonais, também podem influenciar na concentração de MAM e CCS do leite cru, alguns autores relatam poder existir um incremento nos meses de verão (CIMIANO; ALVAREZ, 1986; ELMOSLEMANY et al., 2009, 2009a; HUTCHISON, 2004; PANTOJA; REINEMANN; RUEGG; 2009). Fangan et al. (2008) descrevem diferenças significativas nas contagens de MAM em função da época do ano, independente da tecnologia empregada na produção. O perfil microbiológico do leite cru produzido em diferentes regiões do território nacional é constantemente estudado, sendo realidade bastante conhecida (ATAÍDE, 2006; ARCURI et al., 2008; BRUM, 2004; MARTINS et al., 2008; MENDONÇA et al., 2001; NERO, 2005). Uma revisão de alguns estudos realizados no Brasil, sobre a 30 incidência de MAM no leite cru, em diversas regiões, permite a visualização de sua qualidade quanto à concentração de MAM (Tabela 2). Tabela 2 – Qualidade do leite cru de diversas regiões do Brasil, em função da concentração de micro-organismos mesófilos aeróbios (1997 – 2009) UF Ano n % [MAM] Referências MG MG RS MG SP MG RS PR SP GO RS MG/RJ SP PR PE MG MG PR MG SP PB PR RS PE PR MG PR GO GO GO PR 1997 1999 2000/2001 2001 2002 2002/2003 2002/2003 2002/2003 2002/2003 2004 [2004] [2004] 2004/2005 2004/2005 2005 2005 2005/2006 2005/2006 2006 [2006] 2006 2006/2007 2006/2008 2007/2008 2007/2008 2007/2008 2008 2008 2008 2008 2009 16 22 20 75 3 47 50 63 50 30 12 24 36 320* 44 3 53 46 12 20 14 169.188 6* 322 30 1.176.000 59 7 13 78 1132 100 52,5 80 32 100 21,3 56 47,6 68 30 75 17 38,9 50 83 12 37,3 45,6 100 55 100 42 50 59,3 69,5 17,5% 25 57 100 100 28 >1,0 x 10 UFC/mL >1,0 x 106 UFC/mL >1,0 x 106 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL >1,0 x 106 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 4 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL >1,0 x 106 UFC/mL >1,0 x 106 UFC/mL >1,0 x 106 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 5 >7,5 x 10 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL >1,0 x 106 UFC/mL 6 >1,0 x 10 UFC/mL 5 >7,5 x 10 UFC/mL 5 >7,5 x 10 UFC/mL 5 >7,5 x 10 UFC/mL 6 Oliveira et al., 2000 Souza et al., 1999 Rosa;Queiroz, 2007 Mendonça et al.; 2001 Oliveira, 2005 Nero et al., 2005 Nero et al., 2005 Nero et al., 2005 Nero et al., 2005 Martins et al., 2008 Morães et al., 2005 Arcuri et al., 2006 Souto et al., 2009 Fagan et al., 2008 Mattos et al., 2010 Pinto; Martins, Vanetti, 2006 Sá et al., 2009 Vallin et al, 2009 Araújo; Badaró;Carvalho, 2007 Dias; Avanço; Ponsano, 2007 Ataide et al., 2008 Córdova;Filho;Hilgenberg, [2007] Silva et al., 2010a Jatobá, 2009 Bersor et al., 2009 Fonseca et al., 2008 Pereira at al., 2009 Pereira,2010 Silva et al., 2010 Silva et al, 2009a Andrade;Hartmann;Masson,2009. N: número de amostras/ %: percentagem de amostras com resultado superior / [MAM]: concentração de micro-organismos aeróbios mesófilos referenciados como padrão/ *Leite cru resfriado Tipo A Nero et al. (2005) em um estudo das perspectivas de atendimento da IN 51 do leite cru (quatro regiões brasileiras), relatam que 48,6% das amostras estavam fora do limite preconizado para MAM (> 106 UFC/mL). Na época, os autores concluíram que algumas regiões do país poderiam enfrentar dificuldades para adequação à IN 51. Fato reiterado por Córdova; Filho; Hilgenberg, [2007] a partir dos resultados encontrados em um monitoramento da qualidade do leite cru refrigerado oriundos da maioria dos laticínios do Estado do Paraná. Em contra partida, Souto et al. (2009) em estudo da qualidade 31 higiênico – sanitária do LC produzido em 36 propriedades de 14 municípios do Estado de São Paulo, entre 2004 e 2005, encontraram 61,1% das amostras atendendo a IN 51 no requisito contagem MAM. Nero (2005) relata que 88,2% das amostras de LCR da região de Londrina-PR, apresentaram os resultados com valor inferior a 106 UFC por mL. Sendo este leite oriundo de cooperados da maior usina de beneficiamento da região. Trabalho desenvolvido por Souza (2010) em Pelotas-RS, descreve que 100% das amostras do leite cru refrigerado atendiam a IN 51/2002, no que diz respeito à concentração de MAN no leite, com valor médio 6,1 x 104 UFC/mL. Fonseca et al. (2008) avaliando a situação da qualidade do LC em Minas Gerais, relatam que em 1.176.000 amostras enviadas para laboratório estadual da Rede Brasileira de Laboratórios de Análises da Qualidade do Leite – RBQL, encontram 82,5% atendiam a IN 51/2002 (MAM < 106 UFC/mL). Em estudo da contagem bacteriana total (CBT) de leites crus analisados no laboratório da RBQL do Paraná, Horts; Valloto ([2008]) apresentaram os dados de melhoria obtidos para contagem de bacteriana no período de julho/ 2005 a julho/2008. E neste estudo, os autores concluíram que após a implantação da IN 51/2002, ocorreu não só um incremento do número de rebanhos monitorados, mas principalmente o conhecimento da realidade da qualidade do leite produzido. Nero; Viçosa; Pereira (2009) verificando a interferência de diferentes práticas e perfis da atividade leiteira na região de Viçosa – MG, frente à qualidade do leite cru (60 propriedades em 2007), reporta o índice de 78,3% das amostras atendendo a IN 51/2002 (47 propriedades com MAM<106UFC/mL). Os autores, salientam que contagem de MAM superior a 105 UFC/mL é indicativa de problemas higiênicos – sanitários na obtenção, armazenamento e transporte. No mesmo estudo, os autores também descrevem 40,0% das amostras com valor de MAM menor ou igual a 105 UFC/mL (padrão para 2011 da IN 51/MAPA) e descrevem que o procedimento de maior incidência sobre os bons resultados da região, foi à refrigeração do leite aplicada de forma adequada. Outros estudos apontam que adoção de medidas profiláticas de higiene na cadeia produtiva, através da implantação das boas práticas de produção, permite uma redução da microbiota contaminante do leite cru (BELOTI et al., 2007; FAGUNDES et al., 2006; GUERREIRO et al., 2005; MONTEIRO, et al., 2007; SANTANA et al., 2001; VALLIN et al., 2009; YAMAZI et al., 2010). 32 Como o reflexo da adoção dos procedimentos higiênico – sanitários e da refrigeração coerente, na produção do leite, são visualizados e descritos por Nero; Viçosa; Pereira (2009) que relatam o incremento do número de produtores com perfil atendendo aos requisitos da IN 51/2002. Horts; Valloto ([2008]) assinalam que comprobatoriamente as empresas e cooperativas que possuem programas internos voltados à melhoria da qualidade do leite e capacitação do quadro de produtores, têm obtido resultados significativos. 3.2.2 Micro-organismos Psicrotróficos A refrigeração do leite em toda cadeia produtiva, foi um dos maiores avanços obtidos pela implantação da IN 51/2002, através da minimização da multiplicação de MAM, responsáveis pela acidificação e/ ou coagulação do leite, e respectiva inviabilização do beneficiamento (NORNBERG et al., 2010; SANTANA, et al., 2004; SANTOS; FONSECA, 2007; SILVA et al., 2008). O resfriamento do leite na origem possibilitou sua estocagem na propriedade, descentralizou a recepção em entrepostos, permitindo sua capitação via coleta granel em diferentes regiões e diluiu o custo do transporte via coleta da matéria em dias alternados (FUKUDA, 2003; MAGALHÃES, 2008). O procedimento reduziu a perda do leite por acidificação, mas acarretou o problema da seleção térmica, como a multiplicação de bactérias psicrotróficas e produção de suas enzimas termoestáveis (proteolíticas e lipolíticas), resultantes da atividade metabólica (ARCURI et al., 2008; FUKUDA, 2003; MELLO JUNIOR, 2005; NORNBERG et al., 2010; PINTO et al., 2003; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006; SANTOS; FONSECA; 2007; SANTOS; CARVALHO; ABREU, 1999). Afora, as alterações físico-químicas e bioquímicas sobre a qualidade tecnológica e sensorial do leite. Uma vez que em função das condições do processo de refrigeração, o frio pode gerar alterações nas duas fases do leite: fase coloidal (caseínas e sais) e fase lipídica (LOURENÇO-NETO, 1998). Dependendo da velocidade do resfriamento, agitação e o tempo de armazenagem, o leite sob refrigeração, por tempos longos, pode sofrer a dissociação do complexo das caseínas, diminuição do tamanho das micelas, a solubilização do cálcio; que podem gerar dificuldades no processo de coagulação do 33 leite e fabricação de queijos (LOURENÇO-NETO, 1998; RAMOS,2009). As alterações na fase lipídica, ocorrem via cristalização dos triglicerídeos; rompimento e alteração da membrana dos glóbulos de gordura; retração com perda da estabilidade da emulsão e aglomeração desses. E conseqüente formação de uma camada espessa de creme ou de grumos de gordura no leite, facilitando ação das lípases naturais e conseqüente alteração do sabor e odor do leite (LOURENÇO-NETO, 1998; WALSTRA; JENNESS, 1987). Referindo-se aos psicrotróficos, a inserção do termo microorganismos psicrotróficos ocorreu 1960 e foi melhor definido pela Federação Internacional de Laticínios (FIL/IDF) em 1976, como aqueles micro-organismos que possuem a capacidade de multiplicação a 7ºC ou menores (HAJDENWURCEL, 2004). Mesmo não sendo essas a sua temperatura ideal de multiplicação (FRANCO; LANDGHAF, 2008; HAJDENWURCEL, 2004, JAY, 2005). Vale dizer que a legislação brasileira preconiza como valor de controle para a microbiota psicrofílica e termofílica contaminante do leite pasteurizado, o índice de no máximo 10% da contagem de MAM (BRASIL, 1997), não referenciando valor para a microbiota psicrotrófica para leite cru e leite pasteurizado. As bactérias Gram negativas são descritas como bactérias psicrotróficos de maior incidência em leite cru refrigerado e derivados, tendo como principais representantes os gêneros: Acinetobacter, Achromobacter, Aerobacter Aeromonas, Alcaligenes, Chromobacterium, Flavobacterium, Pseudomonas, Salmonellas e Yersínia (ALMEIDA, 1998; CUNHA; BRANDÃO, 2000; FAGUNDES, et al., 2006; JAYARÃO et al., 2004; NORNBERG et al., 2010; PINTO et al., 2003; SANTOS; CARVALHO; ABREU, 1999; VALERIANO et al., 2007; WALSTRA et al., 2001). Embora em menor incidência, as bactérias Gram positivas também podem ser encontradas no leite cru refrigerando, sendo os gêneros mais referenciados: Arthrobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Listéria, Microbacterium Micrococcus, Staphylococcus e Streptococcus (ALMEIDA, 1999; BRANDÃO, 2005; 2000; CUNHA; BRANDÃO, 2000; NORNBERG et al., 2010; PINTO et al., 2003). Resultados de trabalhos científicos indicam uma predominância de 34 altas concentrações de micro-organismos MAM, com porcentagem significativa de psicrotróficas (PSI) e de psicrotróficas proteolíticos (ARCURI et al., 2006; JATOBÁ, 2009; MORÃES et al., 2001; NORNBERG et al., 2010; RAJPUT et al., 2009; SANTANA , 2001; VILLAR et al., 1996). Santana (2001) estudando a contaminação do leite cru por psicrotróficos proteolíticos e os principais pontos envolvidos, reporta que as contagens de psicrotróficos superaram as de MAM. Tendo identificado a predominância de bacilos Gram negativos como contaminantes do processo e os bacilos Gram positivo como os mais freqüentes. Pinto; Martins; Vanetti (2006) reportam o valor de 75% de psicrotróficos proteolíticos (104 a 126UFC/mL) em leite cru resfriado contido em silos de uma usina da Zona da Mata mineira. Silva (2004) estudando a qualidade de leites cru resfriado de usinas processadoras de UHT de 4 estados brasileiros (RS; SP; RJ e GO) evidenciou altas concentração de psicrotróficos (104 a 107 UFC/mL) e diferenças significativas foram detectadas em função da estação e do estado. Estudo realizado no Brasil por Nornberg et al (2010) em leite cru resfriado do Rio Grande do Sul, descrevem a maior incidência de psicrotróficos Gram negativo (82%), com predominância de Enterobacter spp (30%). A contaminação e proliferação de PSI no leite da produção/armazenamento até o seu beneficiamento, podem originar-se da não observância do manejo sanitário, de procedimentos com condições higiênicosanitárias insatisfatórios, do sistema de resfriamento deficiente e suprimento de água inadequado (ELMOSLEMANY et al., 2009; 2009a; 2009b; FANGAM et al., 2008; PEREIRA, 2010; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006; SANTOS; FONSECA, 2007; TAMANINI et al., 2007; VILLAR et al., 1996). Principalmente no acumulo de água residual nos equipamentos da ordenha e da refrigeração do leite (SANTANA, 2001; WALSTRA et al., 2001). Embora os psicrotróficos apresentem um tempo de geração relativamente lento, sob refrigeração o metabolismo é bastante ativo; uma concentração inicial de 104 UFC/mL em leite refrigerado a 4ºC/ 3 a 4 dias, ocorrerá à prevalência de multiplicação, podendo atingir concentrações de 107 a 108 UFC/mL (SANTOS; FONSECA, 2007). Em sua grande maioria, os psicrotróficos são eliminados pelos 35 tratamentos térmicos de beneficiamento do leite. A relevância desses microorganismos encontra-se na alta capacidade de sintetizar enzimas exógenas ou extracelulares (proteases e lípases) termoestáveis frente aos diferentes binômios empregados no beneficiamento do leite (PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006; VIDAL-MARTINS et al.,2005; WALSTRA et al., 2001). A presença de psicrotróficos em concentrações superior a 106 UFC/mL é correlacionada com a produção dessas enzimas em concentração significativas (PINTO; MARTINS; VANETTI,2006; ROQUE; SHUMASCHER; PAIVA, 2003; VIDAL-MARTINS et al., 2005) e nos respectivos produtos resultante das proteólises e lipólises (BARBANO; MA; SANTOS, 2006; GUIMARÃES, 2002; VIDALMARTINS et al., 2005). Izidoro (2008) sugere uma oscilação na ordem da produção entre metabólitos (lípases e proteases) pelos psicrotróficos e menciona que o fato pode ter alguma correlação com a fase de adaptação e/ou competitiva por substratos do meio. A atividade bioquímica dessas enzimas pode ser intensa sobre os constituintes do leite: proteínas e gordura (ROQUE, SHUMACHER; PAIVA, 2003; GUIMARÃES, 2002; IZIDORO, 2008). Essa atividade resulta a alteração de formação de sabor indesejável (amargo e de ranço), limitando a qualidade sensorial e tecnológica do leite (BARBANO; MA; SANTOS, 2006; FUKUDA, 2003; MAGALHÃES, 2008; NORNBERG; TONDO; BRANDELLI, 2009; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006; SANTOS et al., 2003; WALSTRA et al., 2001). E principalmente reduzindo o “tempo de vida de útil” – TVU do leite de consumo e dos derivados lácteos (BARBANO; MA; SANTOS,2006; BURDOVÁ et al., 2002; MAGALHÃES, 2008; MORÃES et al., 2001; NERO, 2005; NORNBERG et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2000; SPADOTI et al., 2010; WALSTRA et al., 2001). As lípases microbianas termoestáveis (fosfolipases) podem atuar sobre os fosfolipídios da membrana dos glóbulos de gordura, hidrolisando-os, e expondo os triglicerídeos a ação das lípases do leite, originando o sabor de ranço (GUIMARÃES, 2002; IZIDORO, 2008; LORENZETTI, 2006). Outro fator preponderante às proteases termoestáveis dos psicrotróficos, consiste da sua atividade de hidrolisar a fração K-caseína liberando peptídeos menores, como o glicomacropetídeos (GMP); de forma bem similar à 36 ação proteolítica da quimosina sobre a mesma fração das micelas de caseína (FUKUDA, 2003; IZIDORO,2008). Na fase primária da coagulação do leite, a quimosina atua sobre a fração k-caseína (clivagem da fração 105 – 106) das micelas de caseínas, liberando peptídeos diferentes: o para-k-caseina fica retido na massa do queijo e o caseinomacropeptídeo (CMP) é liberado para o soro (MAGALHÃES, 2008). O CMP é uma das nomenclaturas empregadas para os peptídeos resultantes da hidrólise da k-caseína, podendo também ser denominado de caseinoglicomacropeptídeo (CGMP); ou peptídeo derivado da caseína (CDP) ou de GMP (TULLIO, 2007). O mesmo autor relata que o teor de GMP (forma glicosada – alta concentração de carboidratos) / CMP (forma não glicosada) possui composição diferenciada em função da fonte e processo de obtenção do soro. O teor desses peptídeos, GMP/CMP, em leite possui a característica de ser marcador da proteólise sofrida pelo leite e derivados (FUKUDA, 2003; VIDALMARTINS et al., 2005). A determinação da concentração GMP/CMP é também empregada para detecção e/ou quantificação da possível fraude no leite de consumo por soro de leite (FUKUDA, 2003; MAGALHÃES, 2008; TULLIO, 2007). De acordo com Magalhães (2008) em leites com concentrações de psicrotróficos menores a 106UFC/mL, não ocorre à produção de GMP/CMP oriundas da proteólise microbiana. Leites com teor de CMP de até 30mg/L é considerado como apto para beneficiamento como leite de consumo (BRASIL, 2006a). Leites beneficiados com índice CMP igual ou superior a 30mg/L podem ser considerados como fraudados (BRASIL, 2006a) e/ou de má qualidade pelo desenvolvimento de psicrotróficos (MAGALHÃES, 2008), tendo seu aproveitamento condicional ou condenação descrita pela legislação (BRASIL, 2006a). Em face das questões acima citadas, vale salientar que estão intimamente ligadas ao resfriamento marginal do leite cru, em toda a sua cadeia de produção (NORNBERG et al., 2010) e as altas contagens de psicrotróficos são relacionadas ao resfriamento inadequado e/ou por tempo prolongado na produção (NORNBERG; TONDO; BRANDELLI, 2009; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006). 37 3.3 QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DO LEITE PASTEURIZADO O leite pasteurizado de consumo pode ser definido como o leite que foi submetido ao tratamento térmico da pasteurização (72 – 75ºC/ 15 – 20 seg.) e imediatamente resfriado a no mínimo 4º C (BRASIL, 2002; 1997), com a finalidade destruir a microbiota microbiana patogênica, sem causar alterações sensíveis na sua constituição física, equilíbrio químico, composição nutricional e características sensoriais (BRASIL, 1997; FAO/WHO, 2007). O binômio do tratamento térmico da pasteurização HTST - alta temperatura por tempo curto está fundamentado na eliminação dos microorganismos patogênicos não formadores de esporos de maior resistência térmica, a Coxiella burnetti (D72ºC: 1,3seg.) e o Mycobacterium tuberculosis (D72ºC: 1seg.), garantindo assim o caráter salubre do LP (FORSYTHE, 2002; ORDONEZ et al., 2005; WALSTRA et al., 2001). O processo de pasteurização visa à eliminação de toda a microbiota patogênica, inativação das enzimas deteriorantes e a quase a totalidade da microbiota saprófita deteriorante do leite cru. (BRASIL, 1997; FAO/WHO, 2007). A microbiota sobrevivente e remanescente ao tratamento da pasteurização, pode ser composta por micro-organismos termoresistente a pasteurização (termodúricos) e aqueles formadores de esporos (esporulados). Os gêneros mais referenciados são: Micrococcus, Microbacterium, Lactobacillus e Streptococcus termoresistentes e como formadores de esporos os Clostridium e Bacillus (FORSYTHE, 2002; FRANCO; LANDGRAF, 2008; FRAZIER; WESTHOFF, 1993; WALSTRA et al., 2001). Os termodúricos são micro-organismos que resistem a altas temperaturas, sem, contudo multiplicarem-se a essas temperaturas (FRANCO; LANDGRAF,2008; FRAZIER;WESTHOFF, 1993; HAJDENWURCEL, 2004). Os microrganismos esporulados são aqueles capazes de alterarem sua forma vegetativa para esporos (sua forma de maior resistência) visando à sobrevivência às condições extremas do meio (FORSYTHE, 2002; FRANCO;LANDGRAF, 2008) e incluindo assim a resistência térmica aos processos empregados para o leite, como: termização, concentração, pasteurização, esterilização e secagem (HUCK; BOOR, 2006; MACHADO, 1998; OLIVEIRA et al., 2000; WALSTRA et al., 2001). 38 A carga bacteriana inicial possui influência direta na qualidade do leite pasteurizado, pois mesmo que o tratamento térmico seja capaz de proporcionar a destruição dos micro-organismos deteriorante, os termodúricos (TER), esporulados e as enzimas termoestáveis dos psicrotróficos (PSI), são capazes de causarem posteriores alterações no leite e derivados (LORENZETTI; 2006; PEREIRA; 2010; RAJPUT et al., 2009; HUCK; SONNEN; BOOR, 2008; HUCK et al., 2007; SANTOS; FONSECA, 2007). Desta forma, a qualidade de um produto acabado esta diretamente relacionada com as características microbiológicas da matéria prima (BARBANO; MA; SANTOS, 2006; FREITAS; NERO; CARVALHO, 2009; HUCK et al., 2007; HUCK; BOOR, 2006; PANTOJA; REINENN; RUEGG, 2009; PEREIRA; 2010; RANIERI; BOOR, 2009; SANTOS; MA; BARBANO, 2003). 3.3.1 Micro-organismos Mesófilos Aeróbios A enumeração de micro-organismos mesófilos aeróbios (MAM) em leite pasteurizado, assim como em outros alimentos, é um parâmetro delineador da sua qualidade e das condições higiênico-sanitárias do processamento (ARCURI et al., 2008; FREITAS; NERO; CARVALHO, 2009; HAJDENWURCEL, 2004; SANTOS; FONSECA; 2007). Podendo ser um fator indicativo e/ou determinante do tempo de vida útil (TVU) e da qualidade do produto acabado (BARBANO; MA; SANTOS, 2006; FROMM; BOOR, 2004; HUCK; BOOR, 2006; SANVIDO, 2007). As altas concentrações de MAM, em leite pasteurizado, podem apontar possíveis condições insatisfatórias na produção, armazenamento e transporte da matéria prima, e do beneficiamento/processamento do leite (ATAÍDE, 2006; FREITAS; NERO; CARVALHO, 2009; JAY, 2005). Acrescido do agravante econômico operacional da redução ou limitação do TVU dos leites pasteurizados (BARBANO; MA; SANTOS, 2006; HUCK; SONNEN; BOOR, 2008; HUCK; BOOR, 2006; SANVIDO, 2007; WHITE,1993). Sanvido (2007) descreve a influencia do tempo e temperatura da armazenagem do leite cru como um importante fator determinante da qualidade e do TVU de leite pasteurizado, em relação à contagem de micro-organismos mesófilos, termodúricos e psicrotróficos. Altas contagens de CCS do leite cru são correlacionadas com uma maior concentração de enzimas termoestáveis (lípases e proteases) no leite 39 pasteurizado (BARBANO; MA; SANTOS, 2006; JAYARÃO, et al., 2004; SANTOS; MA; BARBANO, 2003). A presença dessas enzimas termoestáveis pode ser o primeiro fator de limitação do TVU do leite pasteurizado, pois a deterioração pode ocorrer primeiro por ação das enzimas proteolíticas e depois por ação ou multiplicação bacteriana (SANTOS et al.; 2003; SPADOTI et al., 2010). O estudo da concentração de MAM em leites pasteurizados, dos diversos estados brasileiros, vem sendo o objetivo de diversos trabalhos científicos. Uma revisão desses estudos permite uma avaliação da qualidade microbiológica dos leites pasteurizado nacional (Tabela 3), sendo possível verificar a respectiva incidência de amostras em desacordo com a legislação vigente e referenciada pelos autores. Tabela 3 - Qualidade do leite pasteurizado de diversas regiões do Brasil, em função da concentração de micro-organismos mesófilos aeróbios (1997 – 2009) UF Ano n % Legislação MA MG DF RJ BA RS DF RS PR SP MG MG SP PR SP MG MG MG AL MG MG RS RJ RJ PR RS PE PR 1997 1998 1999 1999/2000 2000 2000/2001 1997/2001 2001 2001 [2002] [2003] 2004 [2004] 2004/2005 [2006] 2006 2000/2006 2006/2007 2006/2007 2004/2007 2006/2008 2006/2008 2007/2008 [2008] 2008 2008 2009 [2009] 11 21 30 189 20 88 148 74 40 27 15 30 23 80 15 24 107 35 348 125 60 3 100 20 4 14 9 12 18 19 10 28,6 5 1,2 6,8 4,1 3,1 14,8 33,3 3,3 17,4 4,9 100 16,6 4,7 34,3 25 7,1 30 66,6 3,4 0 0 0 17,4 0 RIISPOA/1997 Port. 451/1997 Port. 451/1997 Port. 451/1997 Port. 451/1997 Port. 451/1997 Port. 451/1997 Port. 451/1997 RIISPOA/1997 IN 51/2002 IN 51/2002 RDC 12/2001 RDC 12/2001 IN 51/2002 IN 51/2002 IN 51/2002 RDC 12/2001 IN 51/2002 IN 51/2002 IN 51/2002 IN 51/2002 IN 51/2002 IN 51/2002 IN 51/2002 IN 51/2002 IN 51/2002 IN 51/2002 IN 51/2002 Referências Costa; Ferreira; Alves, 2002. Barcelos et al., 1999. Tinoco et al, 2002. Rodriguezset al, 2001. Leite et al., 2002. Tim et al, 2003. Cardoso; Araújo,2003. Tim et al, 2001. Zocche et al., 2002. Oliveira, 2005. Carvalho; Freitas; Campos, 2006. Mendes et al, 2005. Gusmão; Gonçalves; Hoffmann, 2005. Tamanini et al.; 2007. Bernardi et al., 2006. Lopes;Teixeira;Rodrigues, 2007. Sá et al., 2009. Roncoleta et al, 2009. Silva et al, 2008. Húngaro et al., 2008. Andrade et al., 2008 Silva et al, 2010a. Bastos et al., 2009. Souza et al., 2009. Pietrowski et al., 2008. Souza, 2010. Leal et al., 2009. Bernardino et al., 2009. n: número de amostras/ %: percentagem de amostras com resultado em desacordo com a legislação referenciada/ RIISPOA/1997(BRASIL, 1997) / Port. 451/1997 (BRASIL, 1997a) /RDC 12/2001(BRASIL, 2001) / IN 51/2002(BRASIL, 2002). A presença de uma elevada concentração destes micro-organismos em leites pasteurizados, pode estar relacionada e/ou ser indicativa de fatores como: 40 carga bacteriana inicial excessivamente alta, falhas no processamento térmico, contaminação após o processamento, temperatura inadequada na armazenagem, deficiências/falhas no sistema higienização dos equipamentos (GARRIDO et al., 2001; PAIVA et al., 2007; SANTANA, 2001; SILVA et al., 2008; TESSARI; CARDOSO, 2002; ZOCCHE et al., 2002). 3.3.2 Micro-organismos Indicadores A determinação dos micro-organismo Indicadores é uma das ferramentas que vem sendo utilizadas pela indústria de alimentos, como forma de avaliar e monitorar a segurança dos processamentos, produto acabado e fatores correlacionados; no que tange: a pós contaminação, possível presença de patógenos, estimativa do potencial de deterioração e determinação do TVU (ALMEIDA; PINTO; HAJDENWURCEL, 1996; FRANCO; LANDGRAF, 2008; HAJDENWURCEL, 2004). Segundo Forsythe (2002) o termo micro-organismo indicador foi proposto por Ingran, em 1977; referindo-se a organismo marcador cuja presença possa detectar a possível presença de outro micro-organismo patogênico, com características ecologicamente similares. São considerados como micro-organismos indicadores os coliformes totais, coliformes termotolerantes, enterococos e enterobactérias totais como indicadores de condições higiênico-sanitárias; a Escherichia coli como indicadora da contaminação de origem fecal (humanos de animais de sangue quente); e os microorganismos aeróbios mesófilos, psicrotróficos, termófilos, bolores e leveduras como indicadores da condição de deterioração do alimento e das condições ambientais (ALMEIDA; PINTO; HAJDENWURCEL, 1996; FRANCO; LANDGRAF, 2008; HAJDENWURCEL, 2004). A presença de micro-organismos psicrotróficos e termodúricos em leite cru e leite pasteurizado, foi durante décadas e vem sendo a razão de publicações científicas (estudos e revisões) sobre técnicas microbiológicas de detecção; relação com a eficiência de tratamentos térmicos, das condições higiênicas de processos e prováveis efeitos sobre o TVU de leites e derivados (BARBANO; MA; SANTOS, 2006; BRUM; MUSSOI, 1974; HASSAN; ABDALLA; NOUR, 2009; HILLEMAN; MOSS; STEAD, 1941; HUTCHISON, 2004; MACHADO, 1998; MARTIN, 1981; SANTOS; MA; BARBANO, 2003). 41 Nos últimos anos, a detecção de micro-organismo psicrotróficos, termodúricos, esporulados, proteolíticos e lipolíticos vêm sendo muito utilizadas como forma de diagnostico da relação intrínseca (microbiológica e enzimática) da matéria prima com o produto acabado (HUCK; SONNEN; BOOR, 2008; HUCK et al., 2007; HUCK; BOOR, 2006; NORNBERG et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2000; RANIERI et al., 2009; RANIERI; BOOR, 2009; SAVINDO, 2007). Afora, a relação direta com as das condições de processamento, das instalações e com a qualidade do produto acabado. Bem como da delimitação do seu TVU (FERRAZ, 2009; FROMM; BOOR, 2004; HAJDENWURCEL, 2004; HUCK; BOOR, 2006; HUTCHISON, 2004; OLIVEIRA et al., 2000; RAJPUT et al., 2009; RANIERI et al., 2009). 3.3.3 Micro-organismos Termodúricos Os microrganismos termodúricos, formadores ou não de esporos, são aqueles com capacidade de sobreviver ao tratamento térmico da pasteurização do leite (FRANCO; LANDGRAF, 2008; JAY, 2005; MORENO; VIALTA; VALLE, 2006; WALSTRA et al., 2001), podendo ocorrer a presença daqueles que são capazes de multiplicar a baixas temperaturas, produzir enzimas extracelulares termoestáveis, e consequentemente compromete a qualidade e o TVU do leite pasteurizado (HUCK; SONNEN; BOOR, 2008; RANIERI; BOOR, 2009; WALSTRA et al., 2001). Bem como, comprometer o caráter de salubridade do processamento e do produto acabado (SANVIDO, 2007; WALSTRA et al., 2001). Os gêneros termodúricos psicrotróficos mais correlacionados ao leite pasteurizados são os Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus Microbacterium e Micrococcus (HASSAN; ABDALLA; NOUR, 2009; LEITÃO; TEIXEIRA; MORI, 1987; JOHNSTON; BRUCE, 1982; MORENO; VIALTA; VALLE, 2006; NORNBERG et al., 2010; RANIERI et al., 2009). Sendo o gênero Bacillus o mais evidenciado e referenciado (HUCK; SONNEN; BOOR, 2008; RANIERI et al., 2009). Algumas bactérias termoresistentes não são esporuladas e suas células vegetativas são capazes de sobreviver à pasteurização, como os estreptococos termófilos, Microbacterium lacticum e algumas espécies de micrococos (WALSTRA et al., 2001). Segundo Silva et al., (2007) os Enterococcus faecalis e o Enterococcus faecium podem apresentar essa característica frente à 42 pasteurização do leite. Como forma de reduzir à carga de deteriorantes mesófilos e psicrotróficos a indústria láctea pode empregar a bactofugação (MORENO; VIALTA; VALLE, 2006; SPREER, 1991; WALSTRA et al., 2001) e a termização do leite como “pré-etapaS” do beneficiamento (MORENO; VIALTA; VALLE, 2006; NORNBERG et al., 2010; RAMOS, 2009; SILVA, 2004; SPREER, 1991; WALSTRA et al., 2001). A bactofugação é um tratamento mecânico de separação física, empregado com intuito de reduzir a concentração de bactérias e esporos no leite (MORENO; VIALTA; VALLE, 2006; SPREER, 1991), realizado em centrífugas capazes de eliminar cerca de 90 – 95% dos esporos presentes no leite (SPREER, 1991) incluindo esporo de B. cereus (WALSTRA et al., 2001). A termização consiste no emprego de um binômio de tratamento térmico “brando”, seguido de resfriamento para armazenamento, não substituindo o processo de pasteurização; devendo o leite manter os parâmetros enzimáticos de leite cru (BRASIL, 1997). Ou seja, a termização não poderá ser suficiente para desnaturar a enzima fosfatase (MORENO; VIALTA; VALLE, 2006). Diferentes binômios de termização são descritos na literatura, como: 63ºC/ 15 seg. (CHAMBERS, 2002); 63 – 65ºC/ 10 seg. (LOURENÇO-NETO; KNUDSEN, 2004); 64 – 68ºC/ 10 – 15 seg. (MORENO; VIALTA; VALLE, 2006); 60 – 66º C/ 5 – 20 seg. (SANTOS; CARVALHO; ABREU, 1999); 65ºC/ 10 seg. (SILVA et al., 2000) e 60 – 69ºC/ 20 seg. (WALSTRA et al., 2001). A avaliação da eficiência da termização foi estuda por Silva et al. (2000), como recurso de melhoria da qualidade microbiológica do leite cru do leite granelizado e estocado sob refrigeração na recepção industrial. Os autores relatam a efetividade do processo com índices de redução de 92,4% da microbiota mesófila e 98,6% psicrotrófica. A enumeração de micro-organismos termodúricos psicrotróficos, parece ser uma importante ferramenta do controle da qualidade da matéria prima, processamento, produto acabado e processo de higienização de usinas de beneficiamento de leite (CHAMBERS, 2002; FRONN; BOOR, 2004; HUCK; SONNEN; BOOR, 2008; HUCK; BOOR, 2006; OLIVEIRA et al., 2000). Os termodúricos psicrotróficos, são considerados como pouco competitivos e são relacionados com ambientes que possuem condições não propícias para outra microbiota contaminante. Desta forma, são principalmente 43 correlacionados com equipamentos da ordenha, em função de uma “seleção bacteriana” pelo emprego de altas temperaturas (>60ºC) no processo de higienização das ordenhadeiras (FROMM; BOOR, 2004; HUCK; BOOR; 2006; HUTCHISON, 2004; WALSTRA et al., 2001; VILLAR, et al, 1996). A relevância deste grupo de micro-organismos encontra-se na multiplicação e produção de enzimas metabólicas lipolíticas e proteolíticas, responsáveis pela redução do tempo de vida útil do leite pasteurizado, que podem originar a formação de sabor: ranço, “podre”, amargo e “ardido” (BURDOVÁ et al., 2002; FRONN; BOOR, 2004; HUCK et al., 2007; HUCK; BOOR, 2006; JONSTON; BRUCE, 1982; NORNBERG; TONDO; BRANDELLI, 2009; WALSTRA et al., 2001). A deterioração do leite pasteurizado durante o seu TVU é influenciada pela concentração de micro-organismos dos gêneros Bacillus spp e Paenibacillus spp, por também serem capazes de crescer no armazenamento sob refrigeração (HUCK et al., 2007; RANIERI; BOOR, 2009; RANIERI et al., 2009), onde tal fato pode ser responsável por resultados de contagem bacteriana superior aqueles previstos na legislação (RANIERI et al., 2009). O B. cereus é citado como causador da coagulação doce em leites pasteurizado e formação de aromas indesejáveis, influenciando no TVU o armazenado sob refrigeração (ALMEIDA, 1999; 1998; MACHADO, 1998; MORENO; VIALTA; VALLE, 2006; WALSTRA et al., 2001) e principalmente quando armazenado a ≥7º C/ 10h (WALSTRA et al., 2001). Fromm; Boor (2004) em um estudo de identificação e verificação da influência de TER psicrotróficos no TVU de leite pasteurizados (em 3 plantas/ EUA) relatam os gêneros de maior incidência o Paenibacillus (39%), Bacillus spp (32%), Microbacterium (14%) e Acinetobacter spp (1%). Leitão; Teixeira; Mori (1987) avaliando a presença de TER não esporogênico em leite pasteurizado descrevem a proporção de 58% sobre os resultados de MAM e não diagnosticaram a presença de TER psicrotróficos. Silva et al., (2001), estudando a presença de E. coli enteropatogênica em leite pasteurizado, reportam terem detectado termodúricos em todas as amostras analisadas, em concentração variando de 102 a 106 UFC/mL. Huck; Sonenn; Boor (2008) relatam a importância dos endósporos como limitante do TVU do leite de consumo, encontrados em 336 amostras leite pasteurizado e descrevem a incidência de 23,8% de Bacillus spp; 76,2% 44 Paenibacillus spp, ambos psicrotróficos esporulados. A presença de TER mesófilos psicrotróficos em leite pasteurizado é relatada como fator determinante e limitante do TVU de leites pasteurizados, tanto quanto a temperatura de sua armazenagem (FRAZIER; WESTHOFF, 1993; HUCK et al., 2007; NORNBERG et al., 2010; RANIERI et al., 2009; RANIERI; BOOR, 2009; SANVIDO, 2007). De acordo com HUCK et al. (2007) o monitoramento de psicrotróficos termoresistentes (Bacillus e Paenibacillus) no leite, em toda a cadeia de produção, nos últimos anos tornou-se um fator determinante da qualidade e do TVU do leite pasteurizado. Sanvido (2007) estudando o efeito de diferentes relações temperatura/tempo, frente à durabilidade do leite pasteurizado, concluiu que a validade do produto acabado poderá ser maior, quanto menor for o tempo de estocagem do leite cru e menor a temperatura do armazenamento do leite pasteurizado. No Brasil, deficiências na cadeia do frio são um dos fatores responsáveis pela redução do TVU do leite pasteurizado e sua respectiva deterioração (PETRUS; LOIOLA; OLIVEIRA, 2010; PETRUS et al., 2009). Petrus; Loiola; Oliveira (2010) descrevem que um aumento de 2ºC na temperatura de armazenagem pode gerar uma redução de 50% na estabilidade do leite pasteurizado durante seu TVU. Burdová et al. (2002) verificando a correlação entre a temperatura de armazenamento do leite pasteurizado com o seu TVU, concluíram que a armazenagem a 10ºC reduz em 33% o TVU do LP e para o LP integral a redução pode chegar a 49%; quando comparada com a conservação a 4ºC. Cromie (1991 apud in AIRES, 2007; PETRUS; LOIOLA; OLIVEIRA; 2010; PETRUS et al., 2009) relata que a relação do TVU e qualidade microbiológica do leite pasteurizado, pode ser influenciada por fatores como: o tipo e capacidade da microbiota termoresistentes ao processo de pasteurização, principalmente aqueles capazes de crescer em temperatura de armazenagem sob refrigeração; ação dos micro-organismos contaminantes pós processamento; temperatura do binômio da pasteurização; sistema de embalagem; temperatura de armazenamento do produto acabado e qualidade do leite cru. O mesmo autor descreve que o emprego de temperatura de 45 pasteurização mais alta, pode levar o surgimento de contagens bacterianas elevadas, em função da maior destruição de antimicrobianos naturais; ativação de esporos e menor competição bacteriana e gerando consequentemente a redução do TVU do leite pasteurizado. 3.4 VALIDAÇÃO DO PROCESSO DE PASTEURIZAÇÃO A qualidade físico-química e microbiológica dos leites pasteurizados é preconizada na IN 51/2002 através dos requisitos, composição e procedimentos específicos de controle da qualidade (BRASIL, 2002). O monitoramento da qualidade do leite envolve parâmetros e metodologias para diagnósticos das condições de processo e do produto acabado, através do Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Leite (RTIQL) do MAPA /2002 (BRASIL, 2002). Estando prescritos a determinação da composição centesimal, acidez titulável, estabilidade térmica, pesquisa das enzimas fosfatase e peroxidase, detecção de resíduos de antibióticos, pesquisas de substancias reconstituintes/ conservantes e análises microbiológicas de microrganismos indicadores (ALMEIDAMURADIAN; DUARTE, 2007; BRASIL, 2002; TRONCO, 2007). O tratamento térmico da pasteurização do leite pelo sistema HTST alta temperaturas em tempo curto, com o binômio de 72–75ºC/15–20 seg., pode ser definido como sendo capaz de eliminar a microbiota patogênica, com intensidade de inativar a enzima fosfatase alcalina sem alterar a enzima lactoperoxidase (BRASIL, 1997). Desta forma, a pesquisa de detecção dessas enzimas é utilizada na rotina industrial da garantia de qualidade, como procedimento de monitoramento do processo e da validação do processamento térmico. 3.4.1 Fosfatase Alcalina O processo de pasteurização visa à eliminação de toda a microbiota patogênica e quase a totalidade da microbiota saprófita deteriorante do leite, eliminando toda a microbiota vegetativa, mas não a microbiota esporulada. É capaz de inativar a enzima fosfatase alcalina, não alterando a enzima lactoperoxidase, 46 (BRASIL, 1997; FAO/WHO, 2007; MAHAUT et al., 2004; RANKIN et al., 2010; SILVA; 2004; TRONCO, 2008; WALSTRA et al., 2001). A curva de inativação, cinética térmica, da fosfatase alcalina se sobrepõe à curva do tratamento térmico da pasteurização, frente aos patógenos. A ausência desta enzima no leite pasteurizado é indicativa do processamento térmico adequado e/ou eficiente (BRASIL, 2002; FAO/WHO, 2007; RANKIN et al., 2010; PINHEIRO; MOSQUIM, 1991; SCOTT, 1991; VEISSEYRE, 1980). Resultados positivos podem ser indicativos da deficiência do tratamento térmico, contaminação pós processo por leite cru, resfriamento inadequado imediatamente após o binômio do processo e / ou armazenamento deficiente após o envase do produto acabado (LIMA; 1987; PINHEIRO; MOSQUIM, 1991; PETRUS; LOIOLA; OLIVEIRA, 2010; PETRUS et al 2009). A fosfatase pode sofrer reativação no armazenamento pós processo de pasteurização, podendo se reestruturar e recuperar parte de sua atividade (PINHEIRO; MOSQUIM, 1991; WALSTRA et al., 2001). Quando o leite pasteurizado sofre resfriamento inadequado (LIMA, 1981) ou é armazenado sob refrigeração inadequada (PINHEIRO; MOSQUIM, 1991) a reativação da fosfatase pode ocorrer e gerar interpretação errônea falso positivo, no momento da leitura da pesquisa e consequentemente subjugar o processamento (LIMA; 1987; PINHEIRO; MOSQUIM,1991; WALSTRA; JENNESS, 1987). Esta possibilidade deve ser considerada como resultado falso – positivo, em análise de leites pasteurizados, com mais de 24h pós processo (ALMEIDA-MURADIAN; DUARTE,2007; LIMA;1987). O fundamento da análise da pesquisa de fosfatase alcalina com adição da solução de p-nitrofenil fosfato, consiste que na presença da fosfatase, esse substrato é decomposto, produzindo fosfato e o p-nitrofenol de cor amarela, e dessa forma a amostra testada adquire a mesma coloração. Se o processo de pasteurização foi efetivado, a pesquisa da fosfatase tem resultado negativo (CIMIANO, 1982; PEARSON, 1998; TRONCO, 2008), ou seja, não ocorre mudança de coloração. 3.4.2 Lactoperoxidase A verificação da atividade enzimática da Lactoperoxidase, também denominada de Peroxidase, é utilizada para validação do processo de 47 beneficiamento do leite de consumo, por ser termoestável ao binômio da pasteurização. A peroxidase é uma enzima presente no leite, que somente é destruída quando o leite atinge temperatura superior a 75ºC, por tempo maior do que 20 seg.; sendo esses parâmetros limites de configuração do processo eficiente da pasteurização HTST de leites pasteurizados de consumo (ALMEIDA-MURADIAN; DUARTE, 2007; LIMA, 1987). Assim, em leite pasteurizado a pesquisa da Peroxidase deve apresentar resultado positivo (BRASIL, 2002; LIMA, 1987; PINHEIRO; MOSQUIM, 1991). Desta forma, sua presença no leite pasteurizado demonstra que o binômio temperatura/tempo da pasteurização não foi superior aquele preconizado pela legislação vigente (LIMA, 1987; PEREIRA et al., 2001; TRONCO, 2008) indicando a manutenção da qualidade nutricional a níveis aceitáveis (BRASIL, 1997). O leite pasteurizado com resultado negativo para a prova de peroxidase pode indicar o seu o superaquecimento com intuito de “remediar e/ou mascarar” de forma incorreta, a péssima qualidade microbiológica da matéria prima (SILVA, 2010; ZOCCHE et al.,2002). O princípio da pesquisa de peroxidase encontra-se na capacidade da enzima transferir o hidrogênio do indicador guaiacol para o peróxido de hidrogênio adicionado, oxidando o indicador guaiacol a tetraguaiacol, composto de coloração salmão (PINHEIRO; MOSQUIM, 1991; TRONCO, 2008). Na pesquisa da peroxidase, a formação de um halo de coloração salmão, interface leite guaiacol, indica o resultado positivo, demonstrado que a enzima está ativa, validando a pasteurização com binômio correto (BRASIL, 2005; LIMA, 1987; TRONCO, 2008). A permanência da coloração branca, halo incolor, demonstra a inativação da enzima e conseqüente o tratamento térmico elevado e/ou demasiado (LIMA, 1987; PEREIRA et al., 2001; TRONCO, 2008). Na rotina laboratorial dos laticínios é comum a interpretação dos resultados via emprego de 3 interpretações. Uma não formação do halo salmão é definida como resultado negativo, enzima inativada, demonstrando leite pasteurizado a temperatura superior a 80ºC ou leite fervido. A formação do halo salmão lida como resultado positivo (enzima ativa) e a intensidade da coloração, associada como o resultado da pesquisa de fosfatase alcalina, permitem as 48 interpretações como: halo salmão discreto, leite pasteurizado (72ºC > Binômio da Pasteurização < 80ºC) e halo salmão intenso como leite cru (TEC-LAB, 1999). Santos et al. (1963) descrevem que amostra de leite que apresenta o desenvolvimento da coloração róseo salmão, após adição da solução do Guaiacol e antes da adição do peróxido de heterogêneo, demonstra a previa presença da água oxigenada, uma vez que possuí o mesmo princípio da pesquisa de fraude no leite por adição de peróxido de hidrogênio. Assim como a fosfatase alcalina, a peroxidase também possui a capacidade de reativação, recuperando sua atividade (PINHEIRO; MOSQUIM, 1991; WALSTRA; JENNESS, 1987) e essa pode iniciar 20h após o tratamento térmico, período necessário para que ocorram as ligações estruturais que permitam sua reativação (PINHEIRO; MOSQUIM, 1991). 3.5 PRESENÇA DE RESÍDUOS DE ANTIBIÓTICO E DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS No Brasil o monitoramento de resíduos nos leites de consumo é realizado pelo Programa de Análises de Resíduos de Medicamentos Veterinários – PAMVET, Resolução RDC n. 253/2003 (BRASIL, 2003a) e pelo Programa Nacional de Controle de Resíduos em alimentos de origem animal – PNCR, através da IN n. 42/ 1999 – do MAPA onde se encontra prescrito os requisitos do Programa Controle de Resíduos no Leite – PCRL (BRASIL, 1999). A inclusão do leite, nestes programas, foi considerada como um grande avanço, no que tange: a segurança de alimentos; subsídio para enfrentamento de barreiras sanitárias internacionais e principalmente no direito do consumidor de adquirir alimentos seguros (PORFÍRIO, 2002; SPISSO; NOBREGA; MARQUES, 2009). Os resíduos de antibióticos (RA) são considerados como um contaminante químico, oriundos de tratamento de patologias do rebanho leiteiro; quando não respeitado o prazo de carência (descarte) prescrito em bula, em função da não separação e identificação dos animais tratados (rebanho em lactação e daqueles tratados na fase pré parição ou “vacas secas”) ou ainda como resíduos oriundos de suplementos incorporados à alimentação (BIACCHI; JORGE; UENO, 2004; BRITO; LANGE; 2005; DIETRICH, 2008; MENDES et al, 2008; PORTO et al., 49 2002; SANTOS; FONSECA, 2007). O período de carência preconizado em cada medicamento é um fato muito questionado. Estudos alertam que o tempo de persistência de resíduos em níveis detectáveis para quimioterápicos de tratamento sistêmico (animais em lactação e/ou em terapia de secagem) pode ser maior do aquele informado em bula (RAIA JUNIOR, 2001; FAGUNDES; 2003). O período de descarte do leite pode ser dependente de fatores como: dose ministrada; esquema do tratamento; via de administração; metabolismo; produção animal; terapia de secagem e antecipação da parição (OLIVEIRA; CARNEIRO, 2000; RAIA JUNIOR., 2001; FAGUNDES; 2003; SANTOS; FONSECA, 2007). Podendo também estar correlacionado com alterações da glândula mamária, pela incidência persistente de mastite (OLIVEIRA; CARNEIRO, 2000). Segundo Dietrich (2008) a contaminação do leite pode ser minimizada, quando realiza - se o teste de RA antes da liberação do animal. Por serem resistentes aos processamentos térmicos de beneficiamento do leite (MACEDO; FREITAS, 2009; NERO et al, 2007; SANTOS;FONSECA;BRITO, 2005) a prevalência de RA no leite oferece riscos à saúde publica e perdas econômicas para cadeia produtiva do leite (BOSQUIROLLI, 2004; DENOBILE; NASCIMENTO, 2004; MACEDO; FREITAS, 2009; MORAIS et al., 2010; NERO et al., 2007; SANTOS; FONSECA; BRITO,2005). Em relação aos riscos a saúde da população, via consumo de leite e derivados com RA, os problemas são eminentes para humanos, como: o consumo por indivíduos alérgicos pode gerar hipersensibilidade e em casos mais graves choque anafilático; gerar desequilíbrio da microbiota intestinal; resultar resistência microbiana em bactérias patogênicas; seleção de bactérias resistentes, e efeitos toxicológicos (BECKER et al., 2010; DIETRICH, 2008; FOLLY; MACHADO, 2001; MACEDO; FREITAS, 2009; NASCIMENTO; MAESTRO; CAMPOS, 2001; SANTOS; FONSECA, 2007). Referindo-se as perdas econômicas para o setor lácteo, a presença de RA no leite pode resultar na inibição da cultura lática empregada na fabricação dos produtos lácteos, como iogurte, queijo e bebida láctea, e conseqüente danos á qualidade do produto acabado; interferir nos resultados dos monitoramentos microbiológicos da qualidade, com resultados falso satisfatórios; custo por horas ociosas de fabricação; prejuízos pelo descarte punitivo do leite cru para o produtor e 50 para indústria; custo com transporte para usinas de tratamento de dejetos (DIETRICH, 2008; MACEDO; FREITAS, 2009; NASCIMENTO; MAESTRO; CAMPOS, 2001; RAIA JUNIOR, 2001; SANTOS; FONSECA; BRITO, 2005). No Brasil, o limite máximo de resíduos (LMR) de antibióticos no leite e a sistematização do monitoramento, são prescritos na IN 51/2002; PCNR/1999 e pelo PAMVET/2003 (BRASIL, 1999;2002;2003a). O PCRL estabelece como métodos oficiais da rede de laboratórios federais a CLAE-UV (cromatografia líquida de alta eficiência – detector ultra violeta) e o ELISA (método enzima imunoensaio), bem como os LMR para cada antimicrobiano (BRASIL, 1999): Penicilina,ampicilina e amoxilina (LMR 4µg/kg); eritromicina (LMR 40µg/kg); tetraciclina, ampicilina, amoxilina e ceftiofur (LMR 100 µg/kg); estreptomicina (LMR 200µg/kg) e neomicina (LMR 500µg/kg) e outros (BRASIL, 1999; GUEDES et al., 2009). No mercado nacional, existem vários testes comerciais importados para triagem de RA usados pelos laticínios. Estes testes qualitativos são classificados de acordo com seu princípio: inibição do crescimento bacteriano, testes enzimáticos receptores e testes imunoensaio competitivo do tipo imunoabsorvente com ligação enzimática ou Enzime Linked immunosorbent Assay – ELISA (DIETRICH, 2008; DENOBILE; NASCIMENTO, 2004; FOLLY, MACHADO, 2001; GUEDES et al., 2009; RODRIQUES; VASCONCELOS; SOUZA, 2010; SANTOS; FONSECA, 2007). Os kits enzimáticos são baseados na reação específica para cada grupo de substâncias ou para detecção de simultâneas de mais de um grupo e são empregados para a triagem de RA em leite cru (DIETRICH, 2008; MACEDO; FREITAS, 2009; RODRIQUES; VASCONCELOS; SOUZA, 2010). Alguns kits são empregados para detecção simultânea de betalactâmicos, tetraciclinas e sulfonamidas (FOLLY; MACHADO, 2001; MACEDO; FREITAS, 2009; OLIVEIRA; CARNEIRO, 2000; VILLA, 2007). Sendo que, utilizam algumas horas de incubação para obtenção do resultado, em geral, não são muito específicos e podem apresentar limitações para detecção de alguns tipos antibióticos (OLIVEIRA; CARNEIRO, 2000; RUELA et al., 2005; SANTOS; FONSECA, 2007). A incidência pertinente de resultados suspeitos é outro fato há ser considerado, pois pode significar níveis de resíduos não detectáveis (MACEDO; 51 FREITAS, 2009; VILLA, 2007). Assim como, algumas interferências podem gerar resultados errôneos: falso positivo, falso negativo e suspeito. Quando da incidência de mastite, o sistema imunológico do animal é ativado, levando ao aumento da concentração de células somáticas e das substâncias endógenas naturais, com capacidade de inibição bacteriana como a lactoferrina, a lisozima e a lactoperoxidase, passíveis de influenciar no desenvolvimento do microrganismo teste, podendo gerar resultado falso-positivo (BECKER et al., 2010; GATICA; GESCHE, 2007; MENDES et al., 2008; RUELA et al., 2005; SANTOS; FONSECA, 2007). A sensibilidade dos testes pode variar de acordo com o tipo e concentração da substância antimicrobiana, bem como, de acordo com a microbiota predominante (BRITO, 1993; SANTOS; FONSECA, 2007; SCHAELLIBAUM, 2000) e para as culturas láticas a sensibilidade aos antimicrobianos, tipo e concentração, pode variar em função do tipo de cultura e entre uma mesma espécie (BRITO, 1993; SCHAELLIBAUM, 2000). Outro fator preponderante consiste no tratamento térmico da amostra, antes da realização do teste propriamente dito, a não observância do binômio temperatura/tempo preconizado, pode levar a incidência de resultado falsopositivo (GATICA; GESCHE, 2007; HAJDENWURCEL; 1980; OLIVEIRA; CARNEIRO, 2000). O tratamento térmico possui a finalidade de inativar os inibidores naturais do leite (lactoferrina, lisozima), eliminar bacteriófagos e a microbiota predominante da amostra (BECKHER et al., 2010; GATICA; GESCHE, 2007; HAJDENWURCEL; 1980; MACEDO; FREITAS, 2009; MENDES et al., 2008; NASCIMENTO; MAESTRO; CAMPOS, 2001; OLIVEIRA; CARNEIRO, 2000; SCOTT, 1991; TENÓRIO, 2007). Além dos resíduos de antibióticos o leite pode apresentar resíduos de outras substâncias oriundas de produtos e/ou insumos da agropecuária e resíduos ambientais, como: antiparasitários, promotores de crescimento, produtos de higienização de ordenha, metais pesados e micotoxinas (SANTOS; FONSECA; BRITO, 2005). Estudo realizado por Gomes (2005) avaliando a detecção de Ivermectina e Abamectina por kits comerciais de detecção de RA (enzimáticos, inibição bacteriana e ELISA) concluiu que os antiparasitários não são detectados 52 e/ou não interferem nos resultados dos kits testados. Os métodos microbiológicos tradicionais empregam cultura de microorganismo sensíveis (micro-organismo teste) com a característica de possuir elevada sensibilidade às baixas concentrações de resíduos de antibióticos e/ou de substâncias inibidoras, como: detergentes, sanitizantes e conservantes (HAJDENWURCEL; 1980; TRONCO, 2008; MAGALHÃES et al., 1995). Estes métodos apresentam as características positivas de baixo custo, facilidade de execução e a capacidade de detectar substâncias inibidoras, de diferentes origens (DIETRICH, 2008; GATICA; GESCHE, 2007; HAJDENWURCEL, 1980; MACEDO; FREITAS, 2009; TRONCO, 2007). Em contra partida, requerem maior tempo para obtenção do resultado, treinamento do quadro funcional criterioso, laboratório com estrutura mínima para microbiologia e o acompanhamento rigoroso da atividade do micro-organismo teste (CARRARO; VEIGA, 2000; DIETRICH, 2008; GATICA; GESCHE, 2007; HAJDENWURCEL, 1980; MACEDO; FREITAS, 2009; TRONCO, 2007). Na década de 80 e meados da década de 90, o teste de antibiótico da “Cultura do Iogurte” ou “Misturinha de Iogurte” ou método ”Rápido do IogurteIndicador”, foi muito difundido e/ou empregado pelos laticínios, como uma forma eficiente e com baixo custo, em substituição do único kit comercial importado, na época disponível no mercado nacional. Seu emprego era voltado para detecção de RA e de outras substancias antimicrobianas (RA, conservantes e inibidoras). Entre as metodologias microbiológicas encontra-se também, “Método das 5 Placas”, descrito em Gatica; Gesche (2007) como sendo um método recomendado pela. FIL/IDF, com a propriedade de detecção da concentração inibitória mínima (CIM) de alguns antimicrobianos específicos. O referido método utiliza o sistema de CIM com “poços” para detecção do halo de inibição, com emprego de 3 cepas sensíveis (Bacillus stearothermophilus var. calidolacts, Bacillus cereus e E. coli.) inoculadas em meio Agar nutritivo com 4 faixas diferentes de pH. Os testes acima descritos são qualitativos para seleção de leites isentos de RA ou de outras substâncias antimicrobianas, contaminante do leite (DENOBILE; NASCIMENTO, 2004; DIETRICH, 2008; NERO et al., 2007; SANTOS; FONSECA, 2007). Autores sugerem a sua utilização para monitoramento de triagem e 53 como estratégia econômica de seleção das amostras positivas; uma vez que apenas essas seriam enviadas para análise específica de definição e quantificação do resíduo (MORÃIS et al., 2010; NERO et al., 2007). 3.6 LACTOFERMENTAÇÃO: MONITORAMENTO DA MICROBIOTA BACTERIANA DO LEITE O teste de lactofermentação é muito empregado em usinas de laticínios, como forma de avaliar a qualidade da matéria prima e do leite de processo da fabricação de queijos (ALMEIDA, 1998a; DEMETER, 1969; PASSOS, 1979; PEREIRA, 2010; RAMOS,2009. A coagulação do leite; o aspecto do coagulo obtido e o tempo necessário para sua formação, podem fornecer indicações qualitativas e quantitativas sobre o tipo da microbiota mesofílica predominante, permitindo intuir sobre a sua origem e possíveis conseqüências tecnológicas (ALMEIDA, 1998; DEMETER, 1969; DILANJAN, 1976; HAJDENWURCEL; 1980; PASSOS, 1979; SILVA; ALBURQUERQUE; THIELMAM, 1990). Trata-se de um método indireto, de certa forma subjetivo,com desenvolvimento simples, pouco dispendioso e com baixa exigência de recursos laboratoriais (HAJDENWURCEL; 1980; RAMOS, 2009). Consiste em manter a amostra do leite em banho-maria a 37ºC por 24h e ao término do período observar o conteúdo dos tubos e classificar os leites segundo o aspecto, odor e tipo de coagulo formado e os resultados são expressos com base nos seguintes critérios (DEMETER, 1969; HAJDENWURCEL; 1980; SILVA; ALBURQUERQUE; THIELMAM, 1990): Coágulo homogêneo: coagulo gelatinoso liso e uniforme, oriundo de fermentação lática mesofílica, com predominância de bactérias láticas; considerado como normal para um leite de boa qualidade. Coagulo dessorado: coagulo com aspecto gelatinoso com fendas ou ranhuras nas laterais, com soro límpido na superfície e/ou nas laterais, predominância de bactérias láticas com alta capacidade acidificante; considerado como de qualidade normal para fabricação de queijos. Coágulo gasoso/ sulcado: coagulo com intensa presença de bolhas de gás, sulcos irregulares, aspecto de esponja, odor “azedo” e presença de soro claro 54 e abundante. Oriundo de fermentação em função da presença de bactérias do grupo coliformes, associados à microbiota lática. Indicativo de matéria prima obtida em condições higiênico-sanitárias deficiente, contaminação do leite pós pasteurização e em queijo uma possível ocorrência de “estufamento” precoce. Coágulo floculoso: grãos ou flocos de caseína, com intensa presença de bolhas de gás, soro branco leitoso. Possível presença de fungos e Pseudomonas spp e enzimas termoestáveis. Formação de sabor amargo e aroma desagradável, oriundos de lipólises ou proteólises. Coágulo digerido: coágulo aspecto de esponja esfacelada ou retraída e com soro leitoso. Proveniente de fermentação proteolítica, devido à presença de micro-organismos proteolíticos, para queijos possível ocorrência do “estufamento” tardio, e em leites pasteurizados de consumo formação de sabor indesejável e redução do TVU. Coágulo caseoso: Coagulo contraído no fundo do tubo, com soro leitoso e pouco ácido. Possível predominância de bacilos esporulados, Micrococcus spp, Proteus e leveduras. Pode levar a proteólise e lipólise intensa com formação de sabor indesejável (amargo, ranço e “azedo”) e de “olhaduras “em queijos de massa “mole”. Coágulo líquido: leite sem coagulação, indicativo da impossibilidade de crescimento de micro-organismos não mesófilos ou baixa concentração bacteriana, presença de substancias inibidoras, resíduos de drogas veterinárias ou leites patológicos (mastite). Para leite cru, a prova pode ser realizada a partir do teste de redutase (TRAM – teste redução do azul de metileno) mantendo-se os tubos em banho-maria, após a leitura do resultado da redução da solução de azul de metileno (DILANJAN, 1976; HAJDENWURCEL; 1980; PASSOS, 1979). Porém em função de apresentar a característica de leitura “empírica” e da necessidade do aprimoramento, com a prática diária, o teste pode possuir interpretações próprias e de importância de acordo com parâmetros delineados por cada planta processadora. 55 3.7 SISTEMA PETRIFILM™ PARA CONTAGEM MESÓFILOS AERÓBIOS – PLACAS AC As análises microbiológicas de alimentos foram desenvolvidas no final do século XIX (SILVA; CAVALLI; OLIVEIRA, 2006) e vem sendo empregadas por mais de 100 anos como método oficial de controle da qualidade de alimentos (FUNG, [2008]; 2002a). Essas análises são denominadas de técnicas “convencionais” ou metodologias “tradicionais” para enumeração/ detecção de micro-organismos em alimentos, em função de serem empregadas como métodos oficiais (FRANCO; 2006). As metodologias tradicionais de enumeração de micro-organismos em alimentos são consideradas complexas, laboriosas, lentas e requerem a utilização intensa de material (CARVALHO; OLIVEIRA; GALLO, 2002; CHEN et al., 2007; DALLA VALLE; CASATI; 2009; FUNG, 2002a; HAJDENWURCEL; SOUZA, 1998; VASAVADA, 1993) e em muitas vezes não são adequadas para avaliar a qualidade e a durabilidade dos alimentos lácteos perecíveis (CHEN et al., 2007; VASAVADA, 1993) principalmente pela demora na obtenção dos resultados (FUNG, 2002). Nas últimas décadas técnicas alternativas, denominadas de “métodos rápidos” ou sistemas “prontos para uso”, foram desenvolvidas com o objetivo de substituírem as metodologias tradicionais (FRANCO, 1994; 2006; FUNG, 2002) buscando rapidez, sensibilidade, especificidade e principalmente maior produtividade laboratorial (FERRATI et al., 2005; FRANCO, 2006; BELOTI, 2000; CHAMPAGNE et al., 1994; FUNG, 2002; NERO et al., 2002; SANT’ANA; CONCEIÇÃO; AZEREDO, 2003; SILVA; CAVALLI; OLIVEIRA, 2006). No mercado é possível verificar a existência de diferentes métodos rápidos (MR) para análises microbiológicas de alimentos (enumeração e detecção) e para diagnóstico de micro-organismos indicadores das condições higiênicas do processamento, de superfícies de equipamentos e de manipuladores (FERRATI et al., 2005; FRANCO, 2006; JASSON et al., 2010). Entre os diversos MR utilizados pela indústria alimentícia brasileira, encontra-se o sistema Petrifilm™, cujas placas foram desenvolvidas e são fabricadas pela 3M Company (St. Paul, MN) dos Estados Unidos e comercializadas pela 3M do Brasil Ltda. (FRANCO, 1994; BELOTI, 2000). 56 O sistema Petrifilm™ para enumeração microbiológica é aprovado como método oficial para análise de diversos tipos de alimentos (GARCIAARNESTO et al., 1993; DALLA VALLE; CASATI; 2009; CURRIALE et al., 1990; VASAVADA, 1993; 3M/USA, 2007). É uma metodologia microbiológica reconhecida por órgãos oficiais como: a Association of Official Analytical Chemists – AOAC; Association Française de Nomalisation – AFNOR; American Public Health Association – APHAN e pela Federação Internacional de Laticínios / International Dairy Federation – FIL/IDF (FRANCO 1994; BELOTI, 2000; ROSMINI et al., 2004; SILVA et al., 2007; VASAVADA, 1993; 3M/ USA, 2007). Também possui aprovação por órgãos oficiais de vários outros paises como Alemanha, Austrália, Bélgica, Canadá, Chile, Coréia, Dinamarca, Finlândia, Japão, México, Noruega, Venezuela, entre outros (3M/BR, 2007). No Brasil, é referenciado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento - MAPA, como método alternativo aprovado para análises oficiais do Ministério (BRASIL, 2010; 3M/USA, 2007). A aprovação do sistema PetrifilmTM pela AOAC em 1983, como metodologia oficial para enumeração de bactérias totais aeróbias e de coliformes em laticínios, envolveu um estudo colaborativo entre 11 laboratórios, nos Estados Unidos (FRANCO, 1994; NERO;BELOTI;BARROS, 2000). Os resultados desse estudo demonstraram que o sistema PetrifilmTM – placas AC apresenta-se equivalência com o método tradicional (CURIALE et al., 1990;1989) e sua reprodutibilidade permitiu a aprovação oficial final pela AOAC – método 989.10 (CURIALE et al.;1990; FRANCO, 1994). Na literatura científica internacional é possível encontrar diferentes trabalhos empregando-se as placas PetrifilmTM para análises de diversos tipos de alimentos (FRANCO, 1994). Muitas dessas literaturas, comparam o sistema PetrifilmTM com a metodologia tradicional e descrevem o método rápido como possuidor de características como: especificidade; reprodutibilidade; repetibilidade e exatidão (BLACKBURN;BAYLIS;PETITT, 1996; CHAIN; FUNG, 1991; CURIALE et al., 1989; DAWKINS;HOLINGSWORTH;HAMILTON, 2005; GINN;PACKARD;FOX, 1986; JORDANO et al., 1995; McCARRON et al., 2009; SILVA et al., 2008), com simplicidade e praticidade na utilização (BLACKBURN;BAYLIS;PETITT, 1996; CHEN et al.; 2007; FUNG, 2002a; JASSON et al., 2010; PARCK et al., 2001); de menor 57 tempo de execução (BLACKBURN;BAYLIS;PETITT, 1996; CHAMPAGNE et al., 1994; FUNG,2010; [2008]; GARCIA-ARNESTO et al., 1993; PARCK et al., 2001) e em muitas vezes com um menor custo por análise (GARCIA-ARNESTO et al., 1993; ROSMINI et al., 2004). Desta forma, o PetrifilmTM apresenta-se como um método alternativo e/ou substituto do tradicional (BLACKBURN;BAYLIS;PETITT,1996; CHAMPAGNE et al., 2009; CURIALE et al., 1989; ELLIS;MELDUM, 2002; GINN;PACKARD;FOX, 1986; McGREGOR et al., 1995; SENYK et al., 1987; ORTOLANI, et al., 2007). A placa PetrifilmTM AC para contagem de mesófilos aeróbios, consiste de um cartão de papel quadriculado, revestido externamente com um polietileno recoberto com substratos desidratados e um gel hidrossolúvel a frio, protegido por um filme superior (polietileno) transparente revestido internamente pelo mesmo gel e com o cloreto de trifeniltetrazólio (TTC), um corante indicador que permite a visualização das colônias (BELOTI, 2000; FRANCO, 1994; 2006; JASSON et al., 2010; HOUGHTB; MATURIN; KOENIG, 1993; NERO; BELOTI; BARROS, 2000; 3M/BR, 2006). Quando da adição da amostra os nutrientes e o gel se hidratam (água da amostra ou da solução diluente), a distribuição do inoculo e delimitação da área de crescimento é formada com auxílio de um difusor plástico, colocado sobre o filme superior da placa. Em poucos minutos, ocorre a geleificação e solidificação do meio e a placa está pronta para incubação (BELOTI, 2000; FRANCO, 2006; FUNG, 2002a; HOUGHTB; MATURIN; KOENIG, 1993; NERO; BELOTI; BARROS, 2000; 3M/BR, 2006). A incubação deve ser feita na posição horizontal, com a face transparente para cima, sendo possível empilhar até o máximo de 20 placas. O binômio de incubação pode variar de acordo com o método/alimento empregado (3M/BR, 2006). Para leite e derivados a AOAC recomenda 32ºC ±1ºC/ 48h ±3h (método oficial–986.33 e 986.10) e a AFNOR descreve como método aprovado para lácteos (3M.01/1-09/89) a incubação de 30ºC ±1ºC/ 72h ±3h (SILVA et al., 2007; 3M/BR, 2006). O resultado é obtido pela visualização e contagem das colônias vermelhas, decorrentes da redução do indicador TTC (BELOTI, 2000; FRANCO, 2006; 3M/BR, 2006). 58 No Brasil, a comercialização e o emprego do sistema PetrifilmTM nas indústrias, iniciou em 1993. Franco (1994) realizou estudo de verificação e da adequação do sistema as condições de trabalho e de diferentes alimentos nacionais. Neste estudo com diversos alimentos, Franco (1994) concluiu existir uma equivalência entre os métodos de enumeração de MAM em leites pasteurizado e queijos. Porém descreve haver necessidade de validação da metodologia frente à singularidade de cada alimento e as respectivas condições regionais. O desempenho dos métodos rápidos pode ser influenciado e/ou ser dependente de características intrínsecas de cada alimento, da microbiota predominante, pela presença de resíduos e por sua própria coloração; que podem causar alterações no metabolismo (inibir ou acelerar) e interferir em reações enzimáticas que fundamentam os métodos (DAWKINS; HOLLINGSWHORTH; HAMILTON, 2005; FRANCO,1994; TAVOLARO et al., 2005; 3M/BR, 2009). Outro fator preponderante é o efeito do tratamento térmico do alimento, frente a sua microbiota remanescente, uma vez que o desempenho dos métodos rápidos para micro-organismos injuriados não é muito conhecido (BELOTI, 2000; FERRATI et al.; 2005). Nos últimos 25 anos os métodos rápidos foram testados intensivamente por órgãos oficiais e pela comunidade acadêmica (FUNG, 2010; [2008]). Fato também possível de ser evidenciado com o Petrifilm™ AC; com diferentes estudos de avaliação de correlação da eficiência frente à metodologia tradicional para contagem de diferentes grupos de micro-organismos em leite e derivados (Tabela 4). O sistema PetrifilmTM é considerado como uma boa alternativa adequada para as indústria de alimentos, por possuir características de: facilitar os procedimentos analíticos, contemplar menos etapas de análise (FERRAZ, 2009; FRANCO, 2006; JASSON et al., 2010; KADAKA et al., 2010; PARCK et al., 2001), requerer menor espaço de incubação (GARCIA-ARNESTO et al., 1993; PARCK et al., 2001), maior facilidade na leitura e interpretação dos resultados (JASSON et al., 2010; OYARZABAL; HUSSAIN, 2010), com boa repetibilidade; especificidade e reprodutibilidade, e conseqüente confiabilidade (DAWKINS; HOLLINGSWORTH; HAMILTON, 2005; GINN; PACKARD; FOX,1986; McCARRON et al., 2009). 59 Tabela 4 – Diferentes estudos da correlação do PetrifilmTM AC e metodologia tradicional (1984 – 2009) Alimento/Amostra LC LP LP Derivados lácteos LP, iogurte e sorveteb c Leite, creme e queijo LP Tipo A LP Tipo B LP Tipo C LC LC Sorvete LC LC LP de Cabra LP de Cabra Queijo de cabra Culturas láticas LC LP de Cabra LP de Cabra Culturas láticas LC LC LC LC LC LC LC, LP e queijo LP com probióticos a Análise r Referências MAM MAM MAM MAM MAM MAM MAM MAM MAM MAM MAM MAM MAM MAM MAM PSI 7ºC/10dias MAM BAL/MRS BAL/MRS MAM PSI BAL/MRS,KF,KFS BAL/MRS BAL/KF BAL/KFS MAM 32ºC/48h MAM 32ºC/48h MAM 30ºC/72h PSI 21ºC/25h MAM/PCA 0,946 0,78 0,99 0,98 0,897 0,989 0,852 0,770 0,693 0,947 0,968 0,979 0,92 0,993 0,886 0,748 0,971 0,992 0,984 0,997 0,974 0,97 0,97 0,84 0,82 0,99 0,99 0,99 0,979 0,99 Ginn;Pachard;Fox, 1984 Senyk et al., 1987 Senyk et al., 1987 McAllister et al., 1987d Jordano et al., 1995 Blackburn; Baylis;Pettit, 1996 Beloti, 2000. Beloti, 2000. Beloti, 2000. Hayes et al., 2001 Carvalho; Oliveira; Gallo, 2002 Sant`Ana; Conceição; Azeredo,2003 Rosmini et al.,2004 Barancelli et al., 2004 Tavolaro et al., 2005 Tavolaro et al., 2005 Souza et al., 2005 Nero et al., 2006. Nero et al., 2006. Chen et al., 2007 Chen et al., 2007 Ortolani et al., 2007 Ortolani et al., 2007 Ortolani et al., 2007 Ortolani et al., 2007 Freitas; Nero; Carvalho, 2009 Freitas; Nero; Carvalho, 2009 Freitas; Nero; Carvalho, 2009 Souza et al., [2009] Champagne et al., 2009 b c d r: índice ou coeficiente de correlação entre os métodos/ + 4 alimentos/ + 86 alimentos/ apud in Nero et al., 2005/ LC: leite cru/ LP: leite pasteurizado/ MAM: Micro-organism os aeróbios mesófilos/ PSI: psicrotróficos/ BAL: bactérias ácido láticas/ MRS: Man-Rogosa-Sharpe / KF: kang-Fung/ KFS: Kang-Fung-Sol. Além de outros fatores como: por empregar um menor volume de material durante execução e de resíduos de descarte (KADAKA et al., 2010; 3M/BR, 2009), permitir a recuperação de células para posterior identificação bioquímica (FRANCO,1994; FERRAZ, 2009; SILVA; CAVALLI; OLIVEIRA,2006; 3M/BR, 2009); poder ser congelada para posterior estudo (FRANCO, 1994; BELOTI, 2002); possibilitar monitoramento no local e menor tempo para ação preditiva (FERRAZ, 2009; KADAKA et al., 2010; WHITE,1993; 3M/BR, 2009), em muitas vezes por apresentar igual, ou melhor, eficiência da metodologia tradicional (ELLIS; MELBRUM, 2002; FERRAZ, 2009). Acrescido do fato de permitir o emprego de um contador automático (FUNG, 2002a; GARRY; PESTA; WILLIANS, 2004; GAMBRELLENARZ; LINDBERG, 2004; SILVA et al., 2009). Atualmente são comercializadas no Brasil, as placas PetrifilmTM para contagem de coliformes totais (CC, HS e RCC - série 2000), coliformes totais e 60 E. coli simultaneamente (EC), Bolores e Leveduras (YM), Staphylococcus aureus (RSA), Enterobacteriaceae (EB) e Listeria spp. Sendo o último tipo recomendado para monitoramento ambiental (3M /BR, 2009). Em diversos estudos científicos, é possível verificar o emprego do TM Petrifilm com finalidade não específica do controle da qualidade de alimentos, como: diagnostico de mastite em rebanho (McCARRON et al., 2009; SILVA et al., 2005), isolar agente da mastite (SILVA et al., 2005), determinação TVU e/ou correlação com formação de compostos aromáticos indesejáveis (LABRECHE et al., 2009; PHILLIPS; GRIFFTHS, 1990), determinação de CIM – antibiograma (WU et al., 2008), calibração - curva padrão de aparelho (JATOBÁ, 2009), detecção e determinação do antagonismo de bactérias láticas (ORTOLANI et al., 2009; TAMANINI et al, 2008), relação microbiota bacteriana leite cru e detecção de L. monocytogenes (PERES et al., 2010) e potabilidade da água (BELOTI et al.,2002a; DANTAS et al., 2010; SCHARAF; WATTERWORTH, 2005; VAIL et al., 2003; WOHLSEN et al., 2006). 3.8 CORRELAÇÃO PETRIFILM™ AC E A METODOLOGIA TRADICIONAL PARA LEITE PASTEURIZADO BRASILEIRO No Brasil, por apresentar resultados inferiores àqueles obtidos pelo método tradicional do Plate Count Agar – PCA (BELOTI, 2000; FREITAS; NERO; CARVALHO, 2009) as placas PetrifilmTM AC não é recomendada para análise de micro-organismos mesófilos aeróbios (MAM) em leite pasteurizado (3M/BR, 2006). Algumas bactérias ácido láticas e alguns micrococos poderão não ser detectadas nas placas PetrifilmTM AC, enquanto outras cepas poderão ser recuperadas em níveis mais elevados do que os obtidos na contagem padrão por placas (3M/BR, 2006). A orientação é que se proceda à validação criteriosa das placas AC, frente às condições da matéria prima recebida e beneficiada pelos laticínios. Beloti (2000) estudando os fatores que poderiam influenciar e/ou interferir nos resultados do Petrifilm™ AC para enumeração de MAM do leite pasteurizado, comparando o método com a metodologia tradicional, encontrou diferente correlação para cada tipo de leite: tipo A (r: 0,8518), tipo B (r: 0,7697) e 61 para o tipo C (r: 0,6926). Na época, o autor concluiu que a microbiota presente no o leite pasteurizado não podia ser detectada em sua totalidade, principalmente para o leite pasteurizado tipo C. Possuindo relação direta a qualidade da matéria prima (BELOTI, 2002). No leite cru brasileiro, obtido em condições higiênicas precárias, a microbiota é muito rica e constituída por diferentes grupos de microrganismos, com pequena ocorrência de micro-organismos não redutores do TTC, como micrococos, cocobacilos e alguns bacilos (BELOTI, 2000; BELOTI et al., 2002; 1999; NERO,BELOTI;BARROS, 2000). Porém após tratamento térmico, essa pequena prevalência inicial torna-se significativa, uma vez que em sua grande maioria são termoresistentes (BELOTI, 2000; BELOTI et al, 2000; 1999; NERO; BELOTI; BARROS, 2000). Nero et al. (2002) também relatam terem evidenciado a influencia da qualidade microbiológica do leite pasteurizado no estudo de correlação da enumeração de MAM de outro método rápido. E sugerem que essa influencia, também pode ser resultante da concentração, tipo e capacidade de redução do indicador presente no método, pela microbiota predominante. Os autores reportam que naqueles casos em que os resultados apresentaram falso-negativos, ocorreu uma importante participação dos microorganismos Gram positivos, com lenta capacidade de crescimento e/ou baixa capacidade redutora do indicador presente no meio. Em estudo recente da correlação do Petrifilm™ AC com o método padrão para leite cru e leite pasteurizado, empregando três protocolos de incubação para enumeração de MAM, Freitas; Nero; Carvalho (2009) descrevem que para o LP ocorreu diferença significativa entre as correlações dos protocolos. E concluem que a microbiota do leite pasteurizado interferiu negativamente no desempenho do Petrifilm™ AC. Em contra partida, Tavolaro, et al. (2005) em trabalho sobre o desempenho de dois sistemas prontos para contagem de MAM em leite de cabra pasteurizado congelado; encontraram um bom índice de correlação para o Petrifilm™ AC (r:0,886) e relatam que para esse tipo de leite, parece não ocorrer influência do tipo de microbiota presente. Desta forma o desempenho insatisfatório do método PetrifilmTM AC na enumeração de MAM de leite pasteurizado brasileiro, pode ser justificado pela 62 alta presença de micro-organismos não redutores do TTC ou com baixa capacidade de reduzi-lo (BELOTI, 2000; BELOTI et al., 2002a; 1999; FREITAS; NERO; CARVALHO, 2009). O TTC é um corante de oxidoredução, empregado para detecção do crescimento, atividade e mobilidade bacteriana e de tecidos vivos (DIAS; SILVA, 1958; GABRIELSON et al., 2002; PRAVEEN-KUMAR; TARAFDAR, 2003; TENGERDY; NAGY; MARTIN, 1967; VENZKE et al., 2008; ZIMBRO et al., 2009). Essa capacidade de “revelar” o crescimento microbiano envolve a reação de redução dos componentes da cadeia transportadora de elétrons das mitocôndrias em procariontes e da membrana citoplasmática dos procariontes (STUKER, 2007, apud in GUNTZEL, 2008). Na forma oxidada o TTC é um composto incolor e solúvel. Pela ação do metabolismo enzimático dos micro-organismos, o TTC é reduzido a cloreto de trifeniltetrazólio formazana – TTF (Figura 1), um composto insolúvel de coloração vermelha (BOCHNER; SAVAGEAU, 1977; BOU-CHACRA; OHARA, 2003; DIAS; SILVA, 1958; GRABIELSON et al., 2002; PRAVEEN-KUMAR; TARAFDAR, 2003; OYARZABAL; HUSSAIM, 2010). Em microbiologia de alimentos, o indicador TTC é empregado em meios de cultura com a finalidade de: possibilitar a visualização de colônias em meios com muita opalescência (BOU-CHACRA; OHARA, 2003; OHARA;TAKAKO, 1993) e em análise de leite com diluições menores (BELOTI, 2000), para eliminar a interferência de partículas de alimentos (HANDEWURCEL, 2004), na detecção da inibição por bacteriófagos em culturas láticas (LISKA;CALBERT, 1958), na determinação da CIM de antimicrobianos e da ação bactericida ou bacteriostática (BEERENS;LUQUET, 1990; BOU-CHACRA; OHARA, 2003; OHARA,TAKAKO. 1993) e como forma de evidenciar o crescimento bacteriano e/ou da concentração por oxidoredução (MOHAMMADZADEH et al., 2006). Sendo também referenciado o emprego do TTC em meios de culturas utilizados para diferenciação entre espécies, classificação taxonômica e avaliação do metabolismo. Bacteriano (BOCHNER; SAVAGEAU, 1977; LISKA; CALBERT; KNIGHT, 1958; MACKEY et al., 2006; MATALON; SANDINE, 1986; MOHAMMADZADEH et al., 2006; ZIMBRO et al., 2009). 63 Figura 1: Esquema da redução do cloreto de trifeniltetrazólio e formação de cloreto de trifenil formazana. Fonte: STUKER, 2007 apud in GUNTZEL, 2008. A singularidade do TTC, frente a outros corantes de oxidoredução, é o fato de sua reação ser irreversível e a coloração permanecer estável (BOCHNER; SAVAGEAU, 1977; ZIMBRO et al., 2009). A capacidade e intensidade da redução do TCC são diferentes entre os micro-organismos, podem ser variáveis entre as diferentes espécies de microorganismos, em função dos substratos empregados no meio de cultura e do sistema enzimático microbiano envolvido (BOCHNER; SAVAGEAU, 1977; LISKA; CALBERT, KNIGHT, 1958; GABRIELSON et al., 2002; MATALON; SANDINE, 1986; TENGERDY; NAGY; MARTIN, 1967; ZIMBRO et al., 2009). Assim como, a velocidade de redução e a intensidade da coloração podem variar em função do estado do meio empregado (sólido ou caldo) para o cultivo (DIAS; SILVA, 1958). Algumas bactérias reduzem o TTC em menor intensidade originando colônias com diferentes nuances da cor rosa (DEMETER, 1969) e para os outros micro-organismos não são capazes de reduzi-lo as colônias apresentam-se na coloração branca ou em variações de creme (BOCHNER; SAVAGEAU, 1977). Dentre os micro-organismos classificados como com baixa capacidade de redução do TTC ou não redutores, encontram-se o Lactococcus cremoris (McGREGOR et al., 1995; TURNER et al., 1963); Streptococcus thermophilus (DAWKINS; HOLLINGSWORTH; HAMILTON, 2005; NERO et al., 2006;.ORTOLANI.et.al.,.2007); Lactococcus mesenteroides (NERO et al., 2006) e Streptococcus viridans... (DAWKINS;.HOLLINGSWOTH;.HAMILTON, 2005). Existindo outras espécies do gênero Streptococcus spp., que 64 também são referenciadas ou consideradas como pobres redutoras (DAWKIS; HOLLINGSWORTH; HAMILTON, 2005; ORTOLANI et al., 2007; TURNER et al., 1963). A redução do TTC pode sofrer interferência de outros fatores como o pH, a temperatura e a presença de sais e/ou de metais, bem como, da própria concentração presente no meio (BELOTI, 2000; MAHMOUD; GHALY, 2004; ZIMBRO et al., 2009). Apesar do seu emprego como indicador de crescimento bacteriano, o TTC também pode possuir a capacidade de causar inibição bacteriana, e o grau dessa inibição pode ser em função da concentração empregada frente aos diferentes micro-organismo (BOU-CHACRA; OHARA, 2003; GABRIELSON et al., 2002; LISKA; CALBERT; KNIGHT, 1958; OHARA; TAKAKO, 1993; TENGERDY; NAGY; MARTIN, 1967). Podendo também ser diferente entre uma mesma espécie (LISKA; CALBERT; KNIGHT, 1958). Para evitar o efeito inibitório e/ou deletério do TTC, algumas metodologias sugerem sua adição após o período de incubação (seguida de uma incubação de tempo menor) como forma de promover a coloração das colônias ou revelar o desenvolvimento do cultivo sem o comprometimento da viabilidade celular (BOU-CHACRA; OHARA, 2003; LISKA; CALBERT, 1958; OHARA; TAKAKO, 1993; TENGERDY; NAGY; MARTIN, 1967). 65 4- MATERIAL E METODOS 4.1 AMOSTRAGEM Foram coletadas 80 amostras de leite pasteurizado no período de outubro a novembro de 2010, sendo constituídas por: 29 amostras de Leite Pasteurizado Tipo A (LPA), 3 amostras de Leite Pasteurizado Tipo B (LPB), 19 amostras de Leite Pasteurizado Integral (LPI), 27 amostras de Leite Pasteurizado Padronizado (LPP) e 2 amostras de Leite Pasteurizado Desnatado (LPD). As coletas foram realizadas considerando-se 2 critérios a partir da data de processamento: 48 amostras (60%) foram coletadas ao término do processamento no interior da câmara fria de armazenagem de dois laticínios da região de Londrina - PR (22 LPA, 12 LPI e 14 LPP) e 32 amostras (40%) foram adquiridas no comércio da cidade de Londrina – PR, após 24h do processamento (7 LPA, 3 LPB, 7 LPI, 13 LPP e 2LPD). Imediatamente após a coleta as amostras foram codificadas, conservadas em caixa térmica (com gelo reciclável), e transportadas para o laboratório da garantia e controle da qualidade da Granja Leiteira, localizado na Fazenda Experimental da UNOPAR - Tamarana – PR. 4.2 CRITÉRIO DO INTERVALO PARA REALIZAÇÃO DAS ANÁLISES As amostras foram analisadas em três períodos de intervalo de tempo, entre a sua produção e momento da análise propriamente dito, assim distribuído: 6 amostras (7,5%) no mesmo dia do processamento (t1: 0h); 44 amostras (55,0%) no dia posterior ao beneficiamento (t2: 24h) e 30 amostras (37,5%) foram analisadas no 2º dia posterior ao seu beneficiamento (t3: 48h). Todas as amostras foram mantidas sob refrigeração, em câmara fria (≤ 4º C), até o momento da realização das análises. 66 4.3 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS No momento da análise, cada amostra foi homogeneizada por agitação e realizaram-se as análises físico-químicas (duplicata) de monitoramento dos requisitos de qualidade e/ou composição do leite; do processo de pasteurização (validação do tratamento térmico); detecção da presença de resíduos de antibióticos e da presença de substancias antimicrobianas (conservantes ou inibidores). 4.3.1 - Requisitos de Qualidade: Físico-químicos e de Composição Acidez Dornic: acidez titulável do leite, por método titrimétrico com solução Dornic - NaOH N/9 (Hexis Cientifica S/A – Campinas, SP), em presença do indicador fenolftaleína 1% (Hexis Científica– Campinas, SP) e com emprego do Acidimetro de Dornic (NALGON Equip. Científicos – Itupeva, SP). Os resultados expressos em graus Dornic (ºD) – método IN 68/2006 (BRASIL, 2006). Alizarol 75 ºGL: estabilidade do leite ao alizarol 75% (Hexis Científica – Campinas, BR). Os resultados expressos como normal (NO) para amostra estável, sem precipitação e para amostra com formação de grumos ou precipitação, como instável (IS) – método IN 68/2006 (BRASIL, 2006). Densidade relativa à 15º C (D15ºC): por emprego de termolactodensimetro (Incoterm - Porto Alegre, RS) – método IN 68/2006 (BRASIL, 2006). Índice Crioscópico (Depressão do ponto de congelamento – DPC / Crioscopia): empregando-se crioscópio eletrônico digital (MK540, ITR Instrumentos Ltda., Campinas; BR) – método IN 68/2006 (BRASIL, 2006) e conforme recomendação do fabricante. Extrato Seco Total (EST) e Extrato Seco Desengordurado (ESD): através do disco de Ackermann (Funke Gerber) – método IN 68/2006 (BRASIL, 2006). Teor de Gordura (%Gb) e Proteínas Totais (%PT): Foram determinadas através do aparelho Analisador Ultrasônico Lactoscan SA-60L (Milkotronic Ltda. – Nova Zagora; Bulgária), conforme recomendação do fabricante. 67 4.3.2 - Monitoramento do Processo de Pasteurização: Fosfatase Alcalina Na pesquisa da enzima fosfatase foi empregado o método do teste qualitativo colorimétrico Fosfatase Alcalina FS (DiaSys Diagnostic Systems – Alemanha; importado e distribuído por BioSys Ltda. – Niterói, RJ). O procedimento consiste do preparo da “Solução reativa trabalho” a partir da solução reativa de p-nitrofenol fosfato do Kit comercial (Figura 2): adicionar 5 mL da solução R2 (Substrato: frasco tampa vermelha) em 4,5 mL da solução R1 (Tampão: frasco tampa branca), homogeneizar e armazenar sob refrigeração ≤ 8ºC. Nessas condições a solução é estável por 7dias (HEXIS, 2003; MACIEL;CAPELETO, [2005]). Figura 2: Kit reativo para pesquisa Fosfatase Alcalina. A análise foi realizada em duplicata, transferindo 2 mL da solução trabalho para um tubo de ensaio identificado e adicionando 0,1 mL de leite, seguida de homogeneização e repouso a temperatura ambiente/ 7 minutos. Em paralelo foram realizadas duas provas em branco/controle (positiva: leite cru e negativa: leite recém pasteurizado). A interpretação do resultado foi realizada com o seguinte critério (Figura 3): Resultado Positivo (PO): ocorre à formação da coloração amarelo (amarela cítrica brilhante). Resultado Negativo (NE): conteúdo do tubo não modifica sua coloração (branca amarelada clara e opaca). 68 RT PO NE Figura 3: Interpretação dos resultados da pesquisa de Fosfatase Alcalina. RT: solução reativa trabalho /PO:positivo/ NE:negativo 4.3.3 - Monitoramento do Processo de Pasteurização - Peroxidase Para determinação da presença da enzima peroxidase nas amostras de leites pasteurizado foi empregado o método I.N. n. 68/2006 (BRASIL, 2006). Um teste qualitativo da reação colorimétrica do guaiacol solução 1%, frente ao produto da enzima peroxidase e o peróxido de hidrogênio 10 V (BRASIL, 2006). O procedimento foi realizado em duplicata, transferindo 10 mL da amostras de leite, para um tubo de ensaio; aquecendo as amostras para ativação da enzima, em banho-maria a 45ºC/ 5 - 6 minutos. Em seguida foi acrescento 2 mL da solução de Guaiacol 1% (Hexis Científica – Campinas, SP), lentamente pela parede de cada tubo, repouso na grade metálica, foram adicionadas 3 gotas de Peróxido de Hidrogênio 10 V (Hexis Científica– Campinas, SP) em cada tubo. Os tubos foram mantidos em repouso a temperatura ambiente/5 – 6 min. Em paralelo foi realizado prova em branco/ controle (prova positiva: leite cru e prova negativa: leite recém fervido e resfriado). A interpretação do resultado foi realizada da seguinte forma (Figura 4): Resultado Positivo (PO): formação de um halo de coloração salmão, na interface leite/guaiacol (enzima ativa / Pasteurização adequada). Resultado Negativo (NE): não formação de um halo na interface leite/guaiacol (enzima inativa / leite superaquecido). 69 PO PO NE Figura 4: Interpretação dos resultados da pesquisa de Peroxidase. PO: positivo / NE: negativo 4.3.4 - Detecção de Resíduos de Antibióticos: Charm MRL BL/TET Test A detecção de resíduos de antibiótico foi realizada através do emprego do kit comercial imunoreceptor Charm MRL BL/TET Test (Charm Sciences Inc – Massachusetts, EUA); constituído por um dispositivo “conjunto duplo” para detecção de resíduos de antibióticos do grupo tetraciclinas e beta-lactâmicos. Figura 5: Chapa incubadora para pesquisa resíduos de antibióticos. O teste foi realizado segundo as orientações do fabricante (CHARM, 2010), onde o dispositivo conjunto é previamente inserido na chapa incubadora 70 (chapa aquecedora HEXIS – Hexis Cientifica S/A – Campinas, SP) para pré aquecimento a 55º C (±1ºC). A alíquota de 300µL de cada amostra foi dispensada lentamente no dispositivo conjunto, com auxílio de micropipeta, a chapa aquecedora foi tampada e a incubação realizada a 55º C (±1ºC) por 8 min. (Figura 5). Em paralelo realizou-se prova positiva, com emprego de leite “fraudado” com comprimido teste do kit. A interpretação dos resultados (Figura 6), através da leitura visual da formação de coloração nas linhas/faixas do dispositivo; linha C (controle); linha B (beta-lactâmicos) e linha TE (tetraciclinas): PO NE Figura 9: Interpretação dos resultados de resíduos de antibióticos: beta-lactâmicos e tetraciclinas. PO: positivo / NE: negativo Teste Negativo: Linha C com coloração rósea de menor ou igual intensidade que a linha teste BL e TL. Teste Positivo para Beta-lactâmicos: Linha C com coloração rósea de maior intensidade que a linha BL. Teste Positivo para Tetracíclicas: Linha C com coloração rósea de maior intensidade que a linha TE. Teste Positivo para Beta-lactâmicos e tetracíclicas: Linha C com coloração rósea de maior intensidade que a linha teste BL e TE. 4.3.5 - Detecção de Resíduos Substâncias Antimicrobianas: Método Iogurte – Indicador A determinação da presença de resíduos de substâncias 71 antimicrobianas – RSA (inibidores e/ ou conservantes e/ ou resíduos de antibióticos) no leite foi realizada através do método com cultura termofílica de iogurte e púrpura de bromocresol, conhecido como “Método do Iogurte-Indicador ou Método Rápido do Iogurte” (HAJDENWURCEL; 1980; TRONCO, 2008). O processo fermentativo é realizado na presença da solução de púrpura de bromocresol - 0,35%, que permite a visualização do resultado através da mudança de coloração da amostra. Na ausência de substancia inibidoras e/ou conservantes, ocorre à multiplicação da cultura de iogurte (Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus) acarretando a redução do pH e conseqüente coagulação do leite, via fermentação da lactose com produção de ácido lático. Foram transferidos 10 mL de leite de cada amostra, em condições assépticas, para um tubo de ensaio com tampa rosca, em seguida foi realizado o tratamento térmico da amostra, para eliminar possíveis interferências (inibidores naturais e/ou bacteriófagos e/ou da microbiota predominante nas amostras). Os tubos foram colocados em banho-maria (ITR Instrumentos Ltda. – Campinas, SP) e foram termizados a 85ºC (±1ºC) por 7 minutos, respeitando-se a imersão total da “coluna” do leite na água do banho-maria. Ao término do tratamento térmico, as amostras foram imediatamente resfriadas a 43º C (±1ºC) em banho de água fria. No momento do emprego, foi preparada a solução “Mistura Indicadora”: transferindo 1 parte de água destilada esterilizada para um tubo de ensaio com tampa rosca, adicionando 1 parte de cultura de iogurte com atividade conhecida (YOMIX 1-30 Visbvac – Danisco Cultor – Niebull, Germany) e 2 parte de solução de púrpura de bromocresol a 0,35% (Synth- Lapsynth – Diadema, SP). Após homogeneização da mistura de iogurte-indicador, foi transferido 1mL dessa para cada tubo com amostra. Fez-se a homogeneização e as amostras foram incubadas em banho-maria (ITR Instrumentos Ltda., Campinas; BR) a 43ºC (±1º C) por 2h:30 min + 30 min.. Ao término da incubação, os resultados foram interpretados com base na formação e coloração do coágulo e foram expressos através dos critérios: Resultado Negativo: coágulo homogêneo firme e com coloração amarela. Resultado suspeito: coagulo homogêneo de consistência fraca ou mole e com coloração amarelo esverdeada. Resultado positivo: não formação de coágulo. Leite com coloração roxa. 72 Em paralelo, foi realizado o teste controle com uma amostra testemunha negativa (leite cru de animal em lactação que não passou por terapia por antibióticos ou carrapaticidas nos últimos 60 dias). 4.4 PREPARO DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS No momento da análise, cada amostra foi homogeneizada por agitação e após assepsia da embalagem procedeu-se o plaqueamento direto da amostra (1 mL) e das às diluições de acordo com cada tipo de metodologia de enumeração por amostra. Empregou-se como diluente a solução salina 0,85% (Cloreto de sódio cristal PA – QHEMIS - São Paulo, SP) estéril, conforme IN 62/2003 do MAPA (BRASIL, 2003). As diluições decimais seriadas foram homogeneizadas por agitação (25 vezes) e transferidas em duplicatas para respectivo plaqueamento em duplicata. As amostras foram analisadas para 3 grupos de micro-organismos mesófilos aeróbios (MAM) e micro-organismos termodúricos (TER) e psicrotróficos (PSI). Empregando-se a metodologia tradicional de contagem bacteriana por placas, com Agar Padrão (PCA); com Agar Padrão adicionado do corante TTC (PCATTC) e com as placas PetrifilmTM AC (AC). As analises foram realizadas em duplicata por plaqueamento direto da amostra ou da diluição. Na enumeração de coliformes totais e Escherichia coli utilizou-se TM placas Petrifilm EC. 4.5 CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS AERÓBIOS MESOFILOS (MAM) 4.5.1 - Método Tradicional Agar Padrão - MAMPCA A partir da diluição 1:2 e das diluições seriadas 1:10; 1:100 ou 1:1000, realizou-se o plaqueamento em profundidade, com o emprego do Agar Padrão de contagem em placas - PCA (Standard Methods Agar – Acumedia Lansing Michigan, EUA). Após solidificação do meio, as placas foram invertidas e incubadas em estufa bacteriológica (Modelo 002CB - FAMEM Ltda. - São Paulo; SP) a 36º C 73 (±1º C) por 48 h (BRASIL, 2003). A contagem das placas foi realizada com auxílio de contador de colônias (CP 608 – PHOMIX Equip. Científicos Ltda. – Araraquara, SP) observandose o critério de colônias com ou sem halo branco (branco ou transparente). Os resultados, expressos em unidades formadoras de colônia – UFC/mL foram obtidos através da somatória de todas as colônias contadas, em cada placa, multiplicando-se o resultado pelo inverso da diluição correspondente. 4.5.2 - Método Tradicional Agar Padrão com TTC - MAMPCATTC Procedeu-se a enumeração de micro-organismos aeróbios mesófilos utilizando-se a mesma metodologia descrita no item 4.5.1 - MAMPCA, empregando-se o meio PCA adicionado 3 mL de solução estoque estéril 0,5% (p/v) do indicador cloreto de trifeniltetrazólio – TTC, obtendo-se a concentração final 0,015% /100mL de meio PCA. A contagem das placas foi realizada com auxílio de contador de colônias, observando-se o critério de colônias vermelhas (redução do TTC), colônias róseas e suas nuances (redução “parcial” do TTC) e colônias brancas (não redutoras do TCC); bem como, a presença de halo ao redor das colônias (branco; rosa ou transparente) e os resultados expressos conforme descrito no item 4.5.1 – MAMPCA. 4.5.3 - Método Sistema PetrifilmTM placas AC - MAMAC Foram empregadas as placas PetrifilmTM AC (3M Microbiology, St. Paul, MM, EUA) para enumeração de micro-organismos aeróbios mesófilos, de acordo com as instruções do fabricante (3M/BR, 2006). Onde 1 mL de cada amostra e das diluições (1:2 e decimais seriadas) foi inoculado no centro da base do filme, recoberto pelo filme superior e seguida foi aplicado o difusor em acrílico para delineamento da área de inoculação (30 cm2 – difusor placas PetrifilmTM YM). Após a solidificação do gel, as placas foram incubadas em estufa bacteriológica (Modelo 002CB – FAMEM Ltda. – São Paulo, SP) a 36ºC (±1ºC) por 48h (BRASIL, 2003) sem serem invertidas, conforme orientação do fabricante (3M/BR, 2006). A contagem das placas realizada com auxílio de contador de colônias (CP 608 – PHOMIX Ltda. – São Paulo, SP), observando-se o critério de 74 colônias vermelhas (redução do TTC) e colônias róseas e suas nuances (redução parcial do TTC). Sendo também verificada a presença de colônias com gel liquefeito e a presença de colônias “brancas”. Os resultados em unidades formadoras de colônia – UFC/mL foi obtido multiplicando-se o resultado pelo inverso da diluição correspondente, de cada placa. As placas que apresentaram o último tipo de colônias foram novamente incubadas por mais 24h (36ºC/72h), apenas para confirmação da modificação da coloração, ou melhor, visualização das colônias. 4.6 CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS TERMODÚRICOS (TER) Para enumeração de micro-organismos termodúricos, remanescentes do processo de pasteurização dos leites, realizou-se previamente a termização das amostras antes do plaqueamento. Foram transferidos 15 mL de leite de cada amostra, em condições assépticas, para um tubo de ensaio com tampa rosca, sendo em seguida colocados em banho-maria (ITR Instrumentos Ltda. – Campinas, SP) submetidos ao tratamento térmico de 62ºC (±0,5ºC) por 30 minutos e ao término do tempo, imediatamente resfriado a 10ºC, em banho de gelo (ALMEIDA, 1998; HAJDENWURCEL,1980). O monitoramento do binômio e do resfriamento foi realizado, em paralelo, com inserção de termômetro mercúrio (com certificado de calibração) em um tubo de ensaio com 15 mL de leite, respeitando a imersão total da “coluna” do leite dos tubos, totalmente imersa na água do banho-maria. 4.6.1 - Método Tradicional Agar Padrão - TERPCA Após a termização das amostras, procedeu-se a enumeração de micro-organismos termodúricos utilizando-se a mesma metodologia descrita no item 4.5.1 - MAMPCA, exceto pela incubação das placas a 32º C (±1º C) por 48 h (ALMEIDA, 1998; FRANK et al., 1993; HAJDENWURCEL, 1980) em estufa bacteriológica. 75 4.6.2 - Método Tradicional Agar Padrão - TERPCATTC Após a termização das amostras, procedeu-se a enumeração de micro-organismos termodúricos, utilizando-se a mesma metodologia descrita para no item 4.5.2 - MAMPCATTC e binômio da incubação como TER no item 4.6.1 - TERPCA. 4.6.3 - Método Sistema PetrifilmTM placas AC - TERAC Após a termização das amostras, procedeu-se a enumeração de micro-organismos termodúricos utilizando-se a mesma metodologia descrita no item 4.5.3 – MAMAC e binômio da incubação como TER no item 4.6.1 - TERPCA. As placas que apresentaram colônias “brancas”, foram novamente incubadas por mais 24h (32ºC/72h), apenas para confirmação da modificação da coloração, ou melhor, visualização das colônias. 4.7 CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS PSICROTRÓFICOS (PSI) 4.7.1 - Método Tradicional Agar Padrão - PSIPCA Para enumeração de micro-organismos psicrotróficos foi realizada a mesma metodologia descrita no item 4.5.1, exceto pela modificação do sistema de incubação para 7ºC (±1º C) por 10 dias (adaptado FIL, 1991), em geladeira comercial (Cônsul do Brasil – Campinas, BR), com monitoramento constante da temperatura (Termômetro de mínima e máxima – Incoterm Ind. de Termômetros Porto Alegre, RS). 4.7.2 - Método Tradicional Agar Padrão - PSIPCATTC Para enumeração de micro-organismos psicrotróficos realizou-se a mesma metodologia descrita no item 4.5.2 - MAMPCATTC e incubação como descrito em 4.7.1 - PSIPCA. 4.7.3 - Método Sistema PetrifilmTM placas AC - PSIAC Na enumeração de micro-organismos psicrotróficos com a placa AC, realizou-se a mesma metodologia descrita no item 4.5.3 – MAMAC e incubação como descrito em 4.7.1 - PSIPCA. 76 4.8 CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E ESCHERICHIA COLI - CTEC Foram empregadas as placas PetrifilmTM EC (3M Microbiology, St. Paul, MM, EUA) para enumeração simultânea de coliformes totais (CT) e E. coli (EC), de acordo com as instruções do fabricante (3M/BR,2007). Foi inoculado 1 mL de cada amostra, sem diluição, no centro da base do filme, sendo em seguida recoberto pelo filme superior e aplicado o difusor em acrílico para distribuição da amostras na área de inoculação (20 cm2). Após a solidificação do gel, as placas foram incubadas com a face transparente para cima, a 36º C (±1ºC) por 48 h (±2ºC) em estufa bacteriológica (Modelo 002CB – FAMEM Ltda. – São Paulo, SP). Para contagem das placas foi realizada sem auxílio de contador de colônias (CP 608 – PHOMIX Ltda. – São Paulo; SP), observando-se os critérios de interpretação descritos pelo fabricante. Onde colônias azuis que apresentavam bolhas de gás são consideradas como sendo de E. coli e a somatória das colônias vermelhas e azuis com bolhas de gás são registradas como de coliformes totais. Os resultados foram expressos unidades formadoras de colônia – UFC/mL. 4.9 ANÁLISE DE LACTOFERMENTAÇÃO As amostras de leites pasteurizados foram submetidas à prova de lactofermentação, para determinação do tipo de microbiota mesofílica predominante no leite, baseando-se no aspecto e tipo de coagulo formado. Foram transferidos 10 mL do leite de cada amostra, em condições assépticas, para tubo de ensaio com tampa rosca estéril, em duplicata e incubados a 36ºC (±1ºC) / 24h (±2h) em banho-maria (ITR Instrumentos Ltda. – Campinas, SP). Ao término da incubação, interpretou-se o coágulo formado através da observação do aspecto e características (Tabela 5) e os resultados foram expressos com base em critérios descritos por Hajdenwurcel, 1980 e Silva; Albuquerque; Thielmam, 1990. 77 Tabela 5 – Parâmetros da interpretação do teste de Lactofermentação COÁGULO ASPECTOS MICROBIOTA/ EFEITOS Homogêneo (HO) Coagulo gelatinoso liso e uniforme; fermentação lática. Bactérias láticas mesofílicas. Leite com boa qualidade. Dessorado (DE) Aspecto gelatinoso com fendas ou ranhuras nas laterais com ou sem soro límpido na superfície e/ou nas laterais. Bactérias láticas com alta capacidade acidificante. Leite com boa qualidade. Gasoso (GA) Coagulo com intensa presença de bolhas de gás, sulcos irregulares, aspecto de esponja, odor “azedo” e soro claro. Bactérias do grupo coliformes. Estufamento precoce em queijos. Digerido (DI) Coágulo aspecto esponja dissolvida, esfacelada ou retraída e com soro leitoso. Bactérias proteolíticas e/ou enzimas proteolíticas. Estufamento tardio em queijos, sabor indesejável em leite de consumo. Caseoso (CA) Coagulo contraído no fundo do tubo, com soro leitoso e pouco ácido. Bacilos esporulados, enzimas proteolíticas e lipolíticas. Sabor amargo, ranço e “azedo” em leite de consumo. Líquido (LI) Leite sem coagulação ou não formação de coágulo Baixa carga bacteriana e/ou presença de substancias inibidoras e/ou resíduos de antibióticos. Fonte: adaptado de HAJDENWURCEL, 1980; SILVA; ALBURQUERQUE; THIELMAM, 1990. 4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados obtidos nas análises físico-químicas e microbiológicas foram utilizados para o calculado dos parâmetros estatísticos da média e do desvio padrão. Os resultados obtidos foram comparados com os requisitos de qualidade preconizados pela IN 51/2002. Na análise estatística da correlação da enumeração de microorganismos entre o método tradicional e o método PetrifilmTM AC, as contagens foram convertidas a log10 e foram calculados os parâmetros estatísticos da média (x); desvio padrão (s) e variância média (S2) utilizando-se o programa Microsoft Office Excel, 2007. Os valores médios foram comparados por análise de variância (ANOVA) para identificar as diferenças estatísticas significativas (p<0,05), também comparadas pela correlação (r); considerando-se a mesma variável utilizando-se o programa Statistic 6.0 software. 78 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos nas análises físico-químicas e microbiológicas das 80 amostras de leites pasteurizados (LP) foram comparados com aqueles parâmetros (Tabela 6 e 7) previstos na IN 51/2002 (BRASIL, 2002) e adotados por estabelecimentos sob regime de Inspeção Federal e Inspeção Estadual. Tabela 6 – Requisitos de físico-químicos e de composição previstos na IN 51/2002 para leites pasteurizados REQUISITOS Gordura – GB (g/100g) Sólidos não gordurosos – SNG (g/100g) Acidez em ácido lático (g/100 mL) Estabilidade ao alizarol 72% (v/v) Índice crioscópico - DPC Pesquisa de Fosfatase Pesquisa de Peroxidase LPI original Mín. 8,40 LPP 3,0 LPS LPD 0,6 a 2,9 máx. 0,5 SNGa 0,14 a 0,18 Estável Max. - 0,530 º H (- 0,512 ºC) Negativa Positiva A SNG = 8,652 – (0,084 x GB) / LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado / LPS: Leite Pasteurizado Semi Desnatado/ LPD: Leite Pasteurizado Desnatado. Fonte: adaptado da IN. 51/2002, BRASIL, 2002. Tabela 7 – Requisitos microbiológicos previstos na IN 51/2002 para leites pasteurizados REQUISITOS Mesófilos (UFC/mL) Coliformes 30/35ºC (UFC/mL) Coliformes 45ºC (UFC/mL) Salmonella spp. (em 25 mL) n 5 5 5 5 c 2 0 0 0 LPA m 2 5 x 10 <1 aus. aus. * M 3 1 x 10 n 5 5 5 5 c 2 2 1 0 ** LPB e LP m M 4 4 4 x 10 8 x 10 * ** * ** 2 5 2 4 * ** * ** 1 2 1 2 aus. aus. LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPB: Leite Pasteurizado Tipo B/ LPA: Leite Pasteurizado/ n: plano de amostragem lote/ C: N. máximo de amostras entre M e M para lote de qualidade aceitável/ M: limite inferior / M: limite máximo/ AUS.: ausência. Fonte: adaptado da IN. 51/2002, BRASIL, 2002. O estudo da correlação entre o método convencional ou método “tradicional” do Agar Padrão (PCA) e o sistema PetrifilmTM AC para enumeração de micro-organismos aeróbios mesófilos (MAM), termodúricos (TER) e psicrotróficos (PSI) de leites pasteurizados (LP) produzidos e/ou comercializados na região de Londrina-PR, foi realizado em duas etapas distintas. Na primeira etapa, foi empregado o meio PCA adicionado do corante Cloreto de Trifeniltetrazólio - TTC (PCATTC) e as placas PetrifilmTM AC (AC). Na segunda, o diferencial encontra-se na utilização do método tradicional com o meio Agar Padrão (PCA) sem adição do TTC, além dos outros dois métodos, mantendose os mesmos critérios de diluição, incubação, expressão dos dados e cálculos dos resultados. 79 A média dos resultados em UFC/mL, das contagens de MAM e TER foram transformadas para log10 UFC/mL, e a partir dessas foi determinada a correlação entre as metodologias, bem como, os demais parâmetros estatísticos. Devido à baixa incidência de micro-organismos psicrotróficos detectada nas enumerações de PSI dos LP, obtida neste trabalho, cujo número de resultados positivos não é passível ser considerado em uma avaliação estatística, dessa forma não possibilitou a realização do estudo de correlação entre os métodos para esse grupo de micro-organismos. 5.1 DIAGNÓSTICO DA QUALIDADE DOS LEITES PASTEURIZADOS: REQUISITOS FÍSICO- QUÍMICOS E DE COMPOSIÇÃO A partir dos dados obtidos nas análises, foram calculados a média dos resultados e o desvio padrão (Tabela 8). Bem como, o percentual da incidência de amostras em desacordo com a legislação (Tabela 6), sendo esses utilizados como indicativos da qualidade dos leites pasteurizados da cidade de Londrina – PR, para os diferentes tipos de leites. Na análise de acidez, a média dos resultados variou de 13,8ºD a 16,3 ºD, com resultado mínimo de 13ºD e máximo de 18ºD. A legislação preconiza como 0,14g de ácido lático/100mL (14ºD), como valor mínimo para acidez de leite pasteurizado, neste estudo foi encontrado menor valor em 6 amostras (7,5%), respectivamente 2 amostras (2,5%) com 13ºD e 4 amostras (5,0%) com 13,5º D. Resultados semelhantes também são descrito por Ataíde (2006); Campos (2004) e Rheinheimer et al. (2006), em estudos da qualidade do leite pasteurizado. O índice crioscópico médio obtido para LPP foi de – 0,539ºH, sendo que 3 amostras (11,1%) o valor estava acima de – 0,530ºH. Fato que pode ser correlacionado a possíveis falhas no processo de seleção da matéria prima e/ou na “sangria” de equipamentos (água residual da higienização dos equipamentos) e/ou fraude intencional por aguagem do leite (ALMEIDA, 2006; PEREIRA, 2010; SILVA, 2010; SILVA et al., 2008). Diversos estudos brasileiros, sobre a qualidade do leite pasteurizado de diferentes regiões, indicam alterações no índice crioscópio obtido, com diferentes 80 percentuais de amostras em desacordo com a legislação (BORSATO-MOYSES; CARVALHO; HOFFMANN, 2009; PAIVA, 2007; SILVA, 2010a). Tabela 8 – Média dos resultados de composição e físico-químicos de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) Tipo o D 14,4 0,52 15,0 13,0 Alizarol ESTÁVEL D15 (g/L) 31,4 0,34 32,2 30,7 DPC(º H) - 0,543 0,003 - 0,548 - 0,538 %ESD 8,86 0,09 9,05 8,66 %GB 4,01 0,17 4,49 3,76 %PT 2,93 0,09 3,02 2,53 n. 29 LPB DP Max. Min. %ADL (n.) 16,3 1,15 17,0 15,0 ESTÁVEL 31,0 0,42 31,5 30,7 - 0,540 0,005 - 0,546 - 0,537 8,69 0,10 8,81 8,61 3,68 0,01 3,69 3,68 3,10 0,11 3,17 2,97 3 LPI DP Max. Min. %ADL (n.) 14,4 1,03 18,0 13,5 ESTÁVEL 31,2 0,75 32,2 29,5 - 0,539 0,003 - 0,544 - 0,533 8,76 0,19 8,92 8,26 5,26 (1) 3,38 0,15 3,75 3,16 2,99 0,04 3,06 2,90 19 LPP DP Max. Min. %ADL (n.) 14,2 0,51 15,5 13,0 ESTÁVEL 31,5 0,67 32,4 29,8 - 0,539 0,005 - 0,545 - 0,526 11,1 (3) 8,74 0,16 8,93 8,31 3,70 (1) 3,25 0,12 3,48 3,03 3,00 0,07 3,26 2,92 27 LPD DP Max. Min. %ADL LP %ADL(n.) 13,8 0,35 14,0 13,5 ESTÁVEL 34,9 0,07 35,0 34,9 - 0,538 0 - 0,538 - 0,538 9,12 0,03 9,14 9,10 3,27 0,02 3,29 3,26 2 3,75 (3) 2,50 (2) 0,89 0,06 0,94 0,85 100 (2) 2,50 (2) LPA DP Max. Min. %ADL (n.) LPA: Leite pasteurizado Tipo A / LPB: Leite Pasteurizado Tipo B / LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado / LPD: Leite Pasteurizado Desnatado/ ºD: acidez em graus Dornic/ D15ºC: densidade relativa à 15ºC/ DPC: depressão no ponto de congelam ento em ºH:graus Horvet /ESD: extrato seco desengordurado/ GB: teor de gordura/ PT: teor de proteína/ N.:amostras/ DP: desvio padrão/ Max.: máximo/ Min.: mínimo/ %ADL: amostras em desacordo com a legislação/ LP%ADL: Leite pasteurizado % de amostras em desacordo com a legislação. Na determinação do teor de gordura, os resultados obtidos para as amostras de LPA, LPB, LPI e LLP, estavam em conformidade com classificação dos leites e/ou de acordo com os dizeres de rotulagem nutricional. Exceto LPD que apresentou resultados (100%) a quem do parâmetro mínimo da IN 51/2002 e com os dizeres de sua rotulagem. O teor de gordura encontrado em LPD foi superior ao da sua classificação, podendo ser resultante de falhas no processo de desnate, seja na regulagem da padronizadora, padronização do leite ou na análise de liberação para o envase. Podendo dessa forma, possuir um caráter de causar “dano ou engano” ao consumidor. 81 Borsato-Moyses; Carvalho; Hoffmann (2009) apontam índice de 6,45% das amostras analisadas com teor de gordura abaixo do valor requerido para a classificação dos leites. Fato também evidenciado por Freitas;Oliveira;Galindo (2005) e Silva (2010a) que descrevem, respectivamente, o percentual de 8,69% e 5,26% das amostras com teor de gordura menor que o preconizado pela legislação. Para os diferentes tipos de leite pasteurizados, classificados como integral, a legislação preconiza o valor mínimo do teor de ESD de 8,40%. Nas demais classificações, esse valor mínimo é corrigido por fórmula, empregando-se o respectivo teor de GB (BRASIL, 2002). Partindo deste princípio, neste estudo, 2 amostras (2,5%) apresentaram resultados abaixo do limite mínimo permitido, uma em LPI (ESD:8,26%) e a outra de LPP (ESD:8,31%). Resultados diferentes são descritos em trabalhos realizados por Freitas; Oliveira; Galindo (2005), Paiva (2007) e Silva (2010a), com percentual de 16,2% e 11,26% de amostras em desacordo. 5.2 DIAGNÓSTICO DA QUALIDADE DOS LEITES PASTEURIZADOS: MONITORAMENTO DO PROCESSO DE PASTEURIZAÇÃO O monitoramento da eficiência do processo de pasteurização, realizado no beneficiamento dos LP, foi verificado através dos resultados das pesquisas das enzimas fosfatase e peroxidase. Nesse estudo (Tabela 9), todas as amostras apresentaram resultados negativo para análise de fosfatase alcalina, indicando o correto emprego do binômio de tratamento térmico e a eficiência do processamento com relação à garantia do caráter salubre dos LP. Fato também evidenciado por Almeida, 2006; Brum, 2004; Oliveira, 2009 e Silva, 2010b. A pesquisa da peroxidase permite diagnosticar o emprego de altas temperaturas no beneficiamento de LP, em detrimento do seu valor nutricional, como falha de processo ou por ação intencional de remediar condições inadequadas da matéria prima, mascarar qualidade microbiológica e de garantir a durabilidade do produto acabado (ATAÍDE, 2006; ALMEIDA, 2006; PRATA, 2001; SILVA, 2010a; SILVA et al., 1999). 82 Do total de amostras analisadas, 5 amostras (6,25%) apresentaram resultado negativo, comprovando a inativação da enzima peroxidase. Denotando erros no monitoramento do processo da pasteurização, com conseqüente superaquecimento do leite e maior perda nutricional. Tabela 9 – Resultados das pesquisas de Fosfatase e Peroxidase de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) TIPOS FOSFATASE PEROXIDASE NEGATIVO P OSITIVO N EGATIVO P OSITIVO LPA %ADL 29 0 0 29 LPB %ADL 3 0 0 3 LPI %ADL 19 0 2 10,5 17 LPP %ADL 27 0 3 11,1 24 LPD %ADL 2 0 0 2 LP %ADL (N.) 6,25 (5) LPA: Leite pasteurizado Tipo A / LPB: Leite Pasteurizado Tipo B / LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado / LPD: Leite Pasteurizado Desnatado/ %ADL: amostras em desacordo com a legislação/ LP%ADL: Leites pasteurizados percentual de amostras em desacordo com a legislação/(n.): número de amostras. Condição inadequada também evidenciada e descrita por estudos da qualidade do leite pasteurizado realizados por Ataíde et al. (2008); Almeida (2006); Freitas; Oliveira; Galindo (2005); Garcia et al. (2007); Paiva (2007); Serafim; Moro; Stumer, 2001; Silva (2010); Silva et al. (2010b) e Tamanini et al. (2007) em estudos da qualidade de LP de diferentes regiões do país. 5.3 DETECÇÃO DE RESÍDUOS DE ANTIBIÓTICOS E DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS EM LEITES PASTEURIZADOS 5.3.1 Detecção de Resíduos de Antibióticos A detecção de resíduos de antibióticos em leite tem sido uma preocupação constante do meio laticinista e da comunidade acadêmica, sendo razão de estudos científicos envolvendo a detecção de RA e dos fatores inerentes a sua ocorrência em leites “In natura” e de consumo (ALVA 2009; BANDO et al., 2009; BIACHI; JORGE; UENO; 2004; CAMPOS, 2004; DÍAZ et al., 2010; MACEDO; 83 FREITAS, 2009; OLIVEIRA; BANDO; MACHINSKI, 2007; RAIA JUNIOR, 2001; ROSA; QUEIROZ, 2007; TOLENTINO et al., 2005; VILLA, 2007). Afora os estudos de validação de metodologias de detecção (GATICA; GESCHE, 2007; GUEDES et al., 2009; RUELA et al., 2005; TENÓRIO, 2007). Buscando diagnosticar o perfil de presença ou ausência de resíduos de tetraciclinas e beta-lactâmicos nas amostras de LP, neste trabalho, empregou-se o kit comercial Charm MRL BL/TET Test, para detecção simultânea. Segundo CHARM (2010) a sensibilidade de detecção do kit Charm MRL BL/TET Test. atende aos limites máximos de resíduos (LMRs) estabelecidos pela legislação brasileira – PCRL. Tabela 10 – Concentrações detectáveis de resíduos de antibióticos pelo método Charm MRL BL/TET Test e os limites máximos de resíduos do Programa de Controle de Resíduos em Leite - PCRL 1 GRUPO/SUBSTÂNCIA Beta-lactâmicos Amoxicilina Ampicilina Cefalexina Cefazolina Cefaquinonas Ceftiofur Cefapirina Cloxacilina Dicloxacilina Penicilina Tetraciclinas Clortetraciclina Oxitetraciclina Tetraciclina 2 Charm MRL BL/TET (μ/kg ou ppb) LMRs / PCRL (μ/kg ou ppb) 2,5 – 4 2,5 – 4 15 – 30 8 – 16 15 – 20 20 – 50 A 4–8 25 – 35 20 – 30 B 2–3 4 4 NR NR NR 100 NR NR NR 4 50 – 100 50 – 100 20 – 40 100 100 C 100 C C A LMRs: limites máximos de resíduos/ PCRL: Programa de controle de resíduos em leite/ ND: não referenciado / : e seus B C metabólitos/ : penicilina G/ : somatória de todas as tetracíclicas. 1 2 Fonte: adaptado de CHARM/ 2010 e BRASIL, 1999. Todas as 80 amostras de LP (100%) apresentaram resultados negativos na análise de detecção de resíduos de antibióticos: beta-lactâmicos e tetraciclinas (Tabela 11), estando dessa forma, de acordo à legislação brasileira. De acordo com Souza; Ferreira; Filho (2006) o monitoramento rigoroso e o controle sanitário do rebanho possibilitam a produção de leite isento de resíduos de antibióticos. O percentual encontrado é diferente daqueles descritos para betalactâmicos, por Alva (2009) em leite esterilizado (66,6%) do Callao no Peru e Folly; Machado (2001) em leite pasteurizado (1,66%) do Rio de Janeiro. 84 Estudo realizado por Morais et al., (2010) da presença de resíduos de antibióticos em LP de 3 Estados brasileiros (ES; MG; e RJ) descreve o índice de 64,9% de amostras positivas, para diferentes tipos de resíduos de drogas veterinárias. Em amostras de LP comercializados no Estado do Paraná, Zanella et al. (2010) e Bando et al. (2009) encontraram resultados positivos para diferentes tipos de resíduos de antibióticos e acusam a incidência desses em 41,0% e 30,8% das amostras, respectivamente analisadas. Na literatura é possível verificar a informação da maior utilização do Kit comercial para detecção de beta-lactâmicos, por parte dos laticínios brasileiros, em função de ser a linha de antibióticos, até então, considerada como maior emprego no território nacional, para o tratamento de mastites (DIETRICH, 2008; NERO et al. 2007; SANTOS; FONSECA, 2007; SOUZA; BENEDET, 2000). Contrariando, os resultados obtidos por outros autores, que demonstram um maior índice de detecção para tetraciclina frente à realidade até então preconizada para beta-lactâmicos. Tabela 11 – Resultados das pesquisas de resíduos de antibióticos e resíduos de substâncias antimicrobianas de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) TIPOS ANTIBIÓTICOS N EGATIVO P OSITIVO SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS POSITIVO N EGATIVO SUSPEITO LPA %ADL 29 0 0 28 1 3,4 LPB %ADL 3 0 1 33,3 1 1 33,3 LPI %ADL 19 0 0 15 4 21,0 LPP %ADL 27 0 2 7,4 21 4 14,8 LPD %ADL 2 0 0 2 0 LP %ADL (N.) 3,75 (3) 12,5(10) LPA: Leite pasteurizado Tipo A / LPB: Leite Pasteurizado Tipo B / LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado / LPD: Leite Pasteurizado Desnatado/ %ADL: amostras em desacordo com a legislação/ LP%ADL: Leites pasteurizados percentual de amostras em desacordo com a legislação/ (n.): número de amostras. Bando et al.,(2009); Bosquiroli (2004); Zanella et al. (2010) e Morais et al (2010) em estudo da presença de resíduos de antibióticos em LP, descrevem a maior incidência de tetraciclina frente aos beta-lactâmicos, respectivamente em 85 24,2%; 3,7%; 18,5% e 40,3%. Vale dizer que os 3 primeiros estudos foram realizados com amostras de leite comercializados no Paraná. 5.3.2 Detecção de Resíduos de Substâncias Antimicrobianas A detecção da possível presença de resíduos de substancias antimicrobianas como antibióticos, inibidores e conservantes; neste trabalho, foi realizada pelo método do Iogurte-Indicador. A metodologia é fundamentada no princípio da inibição microbiana (Figura 7), onde na ausência dessas substancias, a cultura termofílica encontra condições ideais de multiplicação, acidificando o meio pela produção de ácido lático, gerando a coagulação do leite e a da mudança de coloração de violeta para amarelo; pela presença do indicador púrpura de bromocresol, sendo o resultado reportado como negativo (BARROS; JESUS; SILVA, 2001; COSTA; LOBATO, 2009; HAJDENWURCEL; 1980; TRONCO, 2008). PO NE SU Figura 7: Interpretação dos resultados do método Iogurte – Indicador para detecção de resíduos de substâncias antimicrobianas. PO: positivo/ NE: negativo/ SU: suspeito. Em contra partida, na presença de resíduos ocorre à inibição ou retardo da multiplicação do micro-organismo indicador, e conseqüente não acidificação e desta forma o meio permanece líquido com coloração violeta, sendo o resultado reportado como positivo. Caso ocorra à formação de um coágulo semi líquido ou muito frágil, com coloração intermediária (verde amarelado), o resultado é 86 reportado como suspeito para RSA (HAJDENWURCEL; 1980; TRONCO, 2008; 2007). Os resultados obtidos (Tabela 11) acusam a presença de resíduos de substancias antimicrobianas em 13 amostras (16,25%) em desacordo com a legislação vigente. Onde 3 amostras apresentaram resultado positivo (3,75%) e 10 amostras como suspeitas (12,5%), distribuída em: 3,4% de LPA; 66,3% LPB; 21,0%LPI e 22,2%. Apenas para LPD não foi detectada a presença de RSA. Estudo realizado por Fonseca et al. (2009) empregando o método do Iogurte – Indicador em 100 amostras de leites UHT (10 marcas) de 5 Estados brasileiros (GO; MG; RJ; PR e SP) descrevem ter encontrado resultado positivo em 4% das amostras mineiras e 100% negativos para as amostras dos demais Estados. Considerando-se que todas as amostras apresentaram resultados negativos de beta-lactâmicos e tetraciclinas, os resultados obtidos pelo método do Iogurte – Indicador são indicativos da possível presença de outros tipos/linhas de antibióticos (não detectados pelo Kit específico); de antiparasitários e/ou a presença de substancias conservantes e/ou inibidoras, como: resíduos acidental ou intencional de sanitizantes, detergentes e/ou a adição substâncias conservadoras do leite. Estudos realizados com diferentes tipos de kit comercial para RSA, com a detecção também fundamentada na inibição microbiana, revelam resultados positivos em leite cru e em diferentes tipos de leite de consumo, com níveis variados da incidência (BARROS; JESUS; SILVA, 2001; COSTA; LOBATO, 2009; DÍAZ et al., 2010; FOLLY; MACHADO, 2001; MATTAR et al., 2009; NERO et al., 2007;2004; RHEINHERMER et al.,2006; SOUZA et al., 2010, e VILLA, 2007). A presença de resíduos de substancias antimicrobianas ou de resíduos de antibióticos em leites pasteurizados de consumo, além dos possíveis riscos a saúde humana (BECKER et al., 2010; MACEDO; FREITAS, 2009; SANTOS; FONSECA, 2007) pode possuir o intuito de promover uma ação antimicrobiana (bactericida ou bacteriostática) para intervir na deterioração e de inferir uma melhor qualidade microbiológica ao produto acabado (BORSATO-MOYSÉS; CARVALHO; HOFFMANN, 2009). Outro fator preocupante encontra-se na detecção de resíduos de clorafenicol em leite, um antimicrobiano de emprego proibido para animais destinado ao consumo humano (BRASIL, 2007a; 2007; COSTA; LOBATO, 2009; OLIVEIRA; 87 BANDO; MACHINSKI, 2007). Resultados positivos para resíduos de clorafenicol, são descritos pelo PANVET – 2006/2007 em leite UHT (0,64%) e leite em pó integral - LPI (0,43%) e para leite pasteurizado do Paraná, outros estudos demonstram índices variando de 1,5% a 2,64% (BANDO et al.,2009; OLIVEIRA; BANDO; MACHINSKI, 2007; ZANELLA et al., 2010). Tolentino et al. (2005) também relata a detecção do clorafenicol em leite pasteurizado do México. O PANVET – 2006/2007 (BRASIL, 2009) também pontua o diagnóstico da presença de resíduos antiparasitários (UHT: 48,2% e LPI: 25,8%) e de sulfonamidas (UHT: 11,4% e LPI: 10,3%). Embora o relatório esclareça que os níveis detectados estavam abaixo do LMR; não deixa de salientar que a presença de RA e de antiparasitários demonstra a falha nas Boas Praticas Veterinária. Bem como, alerta sobre a situação preocupante da detecção clorafenicol, fato que pode gerar a intervenção da empresa e da propriedade produtora pelo órgão competente; por ser um medicamento de uso proibido em animais, no território nacional (BRASIL, 2009). Esses resultados, somados aos resultados obtidos nesse estudo, sugerem que o emprego de kits comercial para resíduos de antibióticos, com detecção exclusiva de único grupo de antibiótico e a não realização de pesquisa de outros RSA, pode estar fornecendo uma “falsa segurança” da não existência de resíduos no leite pasteurizado. 5.4 DIAGNÓSTICO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DOS LEITES PASTEURIZADOS Os resultados das análises microbiológicas de micro-organismos aeróbios mesófilos (MAM), termodúricos e psicrotróficos de leites pasteurizados, podem ser indicativos da qualidade microbiológica da matéria prima, da possível condição de deterioração e da determinação do tempo de vida útil (TVU) do produto acabado. Bem como, os resultados das análises de coliformes totais e Escherichia coli podem ser utilizados como indicadores das condições higiênicosanitárias do processamento e produto acabado. Os resultados obtidos nas análises microbiológicas foram 88 comparados com aqueles limites de aceitação (Tabela 7) previstos pela IN 51/2002 (BRASIL, 2002). Embora a legislação brasileira não preconize um parâmetro da concentração de micro-organismos psicrotróficos e termodúricos para o leite “In natura” e leites de consumo, diversos estudos científicos demonstram a necessidade do monitoramento desses grupos (AYRES, 2007; NERO et al., 2005; PEREIRA, 2010; SANVIDO, 2007; TEBALDI et al.; 2008). O artigo 540 do RIISPOA/1997 preconiza que a concentração de micro-organismos psicrofílicos e de termofílicos dos leites pasteurizados não deva ultrapassar 10% da contagem total de mesófilos, sugerindo o controle da contaminação por esse tipo de microbiota. Embora sejam grupos diferentes de micro-organismos, o presente estudo, fez-se a determinação da concentração de psicrotróficos e de termodúricos, como forma de diagnosticar o perfil da relação desses com a concentração total de micro-organismos aeróbios mesófilos. 5.4.1 Concentração de Mesófilos Aeróbios A média dos resultados obtidos (Tabela12) de 30 amostras de leites pasteurizados das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos, pelo método tradicional (PCA) pode ser utilizada para o diagnostico das condições acima descritas. Tratando-se das 13 amostras de LPA, a média obtida para a contagens de MAM foi de 2,99 x 102 UFC/mL, possuindo reflexo direto da amostra que extrapolou o valor de M, com valor estimado > 3,0x103 UFC/mL. Tabela 12 – Média dos resultados das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos de 30 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) TIPO Média (UFC/mL) LPA LPB LPI LPP Média LP 2 2,99 x 10 4 1,44 x 10 2 3,41 x 10 3 9,64 x 10 3 4,52 x 10 <M >M (n.) (n.) 12 2 5 8 27 1 1 0 1 3 %ADL Min. Max. (UFC/mL) 7,7 33,3 11,1 10,0 n. (UFC/mL) 1 2,10 x 10 2 3,55 x 10 1 9,30 x 10 1 8,80 x 10 1 2,10 x 10 3 3,00 x 10 4 4,00 x 10 2 4,78 x 10 4 8,00 x 10 4 8,00 x 10 13 3 5 9 30 LPA: Leite pasteurizado Tipo A / LPB: Leite Pasteurizado Tipo B / LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado / Média LP: Média de todas as amostras de leites pasteurizados/ M: parâmetro amostra indicativa/ %ADL: amostras em desacordo com a legislação/ Mín.: mínimo /Max.:máximo/ n: número de amostras. Excluindo-se essa amostra e aquela com resultado suspeito para RAII, nas demais 11 amostras de LPA, as contagens encontradas foram 89 relativamente baixas, variando de 2,10 x 101 UFC/mL a 1,49 x 102 UFC/mL, embora justificáveis, por serem oriundas de granjas leiteiras, que beneficiam o leite “In natura” resfriado em um curto intervalo de tempo entre a produção e processamento. Para LPB, as amostras apresentaram maior faixa de variação para concentração de MAM, sendo 1 amostra com valor superior ao M (> 4,0 x 104 UFC/mL) e outras 2 amostras com valor de 3,55 x 102 e 2,75 x 103 UFC/mL, sendo em ambas foi detectada a presença RAII (suspeito e positivo). Em LPI, média geral de MAM foi de 3,41 x 102 UFC/mL.Excluindo-se os resultados das 2 amostras suspeitas em RAII a concentração média passa ser de 3,89 x 102 UFC/mL. Valor considerado baixo para este tipo de leite, porém pode ser justificado pelo fato das amostras, serem oriundas de uma usina de beneficiamento com 100% da matéria prima resfriada, granelizada, bactofugada e termizada no momento da recepção. LPP apresentou valor médio de 9,64 x 103 UFC/mL para a contagem de MAM. Excluindo-se 2 amostras (positiva em RAII e a com MAM > M) o intervalo dos resultados foi de 1,45 x 102 a 1,58 x103 UFC/mL. Dessas, 3 amostras são oriundas da mesma usina de LPI e as demais de uma planta com 100% da matéria prima resfriada e granelizada. O intervalo entre as contagens também pode estar correlacionado com aspectos da logística de distribuição do produto acabado, uma vez que o sistema de armazenagem e distribuição (temperatura e tempo) possui influencia direta sobre a oscilação da carga bacteriana, e pode ser um fator determinante da qualidade e do tempo de vida útil do produto acabado (FREITAS; OLIVEIRA; GALINDO, 2005; PEREIRA, 2010; SOUZA et al., 2009). No contexto geral, os resultados das 30 amostras de LP, indicaram a predominância de uma baixa carga bacteriana de MAM, com média de 4,52 x 103 UFC/mL. Media bastante semelhante aquelas encontradas em LP de Pelotas-RS, Londrina – PR, Ponta Grossa – PR e Curitiba – PR; por Souza (2010), Martins, 2009, Pietrowski (2008) e Baggio et al. (2005). Tamanini et al. (2007) obtiveram o índice de 27,6% de LP com contagem menor de 1,0 x 103 UFC/mL e Bernardino et al. (2009) reportam a média de 5,0 a 5,10 x 103 UFC/mL, ambos em estudo da qualidade do LP de Londrina – PR e região. Souza et al. (2009) em estudo do LP de Valença – RJ, observaram 90 média de 2,54 x 103 UFC/mL para MAM e descrevem que a baixa carga bacteriana possibilita um maior TVU do produto acabado. Húngaro et al. (2008) avaliando LP comercializado em Juiz de Fora – MG e região (2004 a 2007), concluíram que os dados obtidos refletiam a efetivação das mudanças propostas pela IN 51/2002, em toda a cadeia de produção. Neste estudo, baixas contagem de MAM foram encontradas, exceto em 3 amostras, que apresentaram valor superior ao referenciado pelo parâmetro do RTIQL do MAPA/2002; correspondendo ao percentual geral de 10% de amostras em desacordo com a legislação. Índices maiores podem ser evidenciados, em outros trabalhos sobre a carga bacteriana do LP nacional, cujos autores relatam contagens mais elevadas e maiores percentuais de resultados em desacordo com a legislação (FERREIRA, et al., 2007; FREITAS; OLIVEIRA; GALINDO, 2005; OLIVEIRA, 2005; PAIVA, 2007; SILVA et al., 2009b). Nos referidos trabalhos evidencia-se que o diagnóstico encontrado pode indicar deficiências na qualidade da matéria prima e/ou processamento inadequado e/ou contaminação pós processamento (embalagem e equipamentos do envase) e/ou falhas na higienização da planta e/ou condições inadequadas na armazenagem do produto acabado (ATAÍDE, 2006; CROMIE, 1991 apud in AIRES, 2007; FREITAS; OLIVEIRA; GALINDO, 2005; FROMM; BOOR, 2004; PAIVA, 2007; TAMANINI et al., 2007; SILVA et al., 2008). Silva et al. (2010b) em estudo da eficiência do processo de pasteurização frente às condições microbiológicas do LP do Rio de Janeiro – RJ sugerem uma maior associação da qualidade com os fatores relacionados às etapas intercaladas à pasteurização, do que com o processamento térmico propriamente dito. 5.4.2 Concentração de Termodúricos Por serem capazes de sobreviver ao processo de pasteurização do leite, os micro-organismos termodúricos (TER) são representantes da microbiota remanescente do processo térmico. Onde alguns deles podem possuir a capacidade de multiplicar a baixas temperaturas e produzir enzimas metabólicas, que pode comprometer a qualidade e no tempo de vida útil do leite pasteurizado (HUCK; SONNEM; BOOR, 2008; NORNBERG; TONDO; BRANDELLI, 2009; RANIERI; 91 BOOR, 2009). Desta forma, a enumeração de TER assume o importante papel no monitoramento das condições da matéria prima, do beneficiamento e dos processos de higienização dos equipamentos na produção, captação e processamento do LP (CHAMBERS, 2002; FRONN; BOOR, 2004; HUCK; SONNEN; BOOR, 2008). Referindo-se a contagem de TER, a média dos resultados obtidos para 27 amostras de LP (Tabela 13) analisadas pelo método tradicional com Agar padrão, foi de 9,70x 101 UFC/mL, com faixa de variação de < 0,20 x 101 a 9,20 x 102 UFC/mL, correspondendo a uma relação de 20,9% de TER sobre a concentração média de MAM (relação TER/MAM), com faixa de variação de 2,68% a 124,07%. Considerando-se que a relação TER/MAM para leite pasteurizado seja semelhante ao limite de 10% preconizado pelo RIISPOA/1997 para psicrófilos e termófilos, embora sejam grupos diferentes de micro-organismos, neste trabalho, em 20 amostras (74%) a relação TER/MAM foi superior aos 10%, estando assim distribuídas: 9 LPA (75%);1 LPB (50%); 5 LPI (100%) e 5 LPP (63%). A exceção correspondeu aos resultados de 3 amostras com resultado < 0,2 x 101 UFC/mL (2LPA e 1LPB), 4 amostras (LPP) com índice no intervalo de 2,6% a 8,72% e 1 com 9,07% (LPA). O percentual médio TER/MAM de 22,9% encontrado para LPA, corresponde a 75% das amostras com concentração relevante de termoresistente, podendo estar correlacionada à microbiota típica de tetos, dos equipamentos da ordenha mecânica e respectivas condições higiênicas (HUCK; BOOR, 2006; VILLAR et al., 1996). Tabela 13 – Média dos resultados das contagens de termodúricos de 27 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) TIPO LPA LPB LPI LPP Média LP Média TER Média MAM (UFC/mL) (UFC/mL) 1 1,70 x 10 1 1,90 x 10 2 2,05 x 10 1,70 x 102 9,7 x 101 1 7,40 x 10 3 1,55 x 10 2 3,41 x 10 8,50 x 102 4,63 x 102 %TER/ MAM 22,9 1,2 60,1 20,0 20,9 TER Min. TER Max. (UFC/mL) (UFC/mL) 1 < 0,20 x 10 1 < 0,20 x 10 1 1,50 x 10 1,10 x 101 <0,20 x 101 1 4,80 x 10 1 3,80 x 10 2 3,66 x 10 9,20 x 102 9,20 x 102 n. 12 2 5 8 27 Média TER: média de TER para o tipo de leite/ Média MAM: média de MAM obtida pelas mesmas amostras/ %TER/MAM: média de relação TER/MAM ou média percentual TER sobre o valor médio de MAM das amostras/ Mín.: mínimo/ Max.:máximo/ n: núm ero de am ostras/ LPA: Leite pasteurizado Tipo A / LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado / média LP: média de todas as amostras de Leites Pasteurizados. Todas as amostras de LPI apresentaram alto percentual para TER/MAM, com faixa de 16,31% a 124,7%. A elevada concentração de TER e 92 conseqüente índice de TER/MAM, podem ser resultantes da seleção bacteriana dos processos da bactofugação e termização, empregados na matéria prima pela planta industrial. Para LPP, relação TER/MAM <10% foi obtida em 4 amostras, que também apresentaram uma maior contagem de MAM. Nessas, a carga de TER e MAM, foram respectivamente de 1,1x 101 a 1,38 x 102 UFC/mL e 4,10 x 102 UFC/mL a 1,58 x 103 UFC/mL. Nas demais amostras de LPP, cuja TER/MAM foi superior ao percentual e a concentração de TER variou de 5,0 x 101 a 9,20 x 102 UFC/mL e para MAM de 8,80 x 101 UFC/mL a 1,49 x 103 UFC/mL. Sendo que 3 amostras, são oriundas da mesma usina de LPI e 5 de uma planta com 100% da matéria prima resfriada e granelizada. Esses índices são diferentes dos encontrados por Silva et al. (2001) que obteve o valor de 67,7% para a relação de TER/MAM, em amostras de LP do Rio de Janeiro – RJ. Os resultados das contagens microbiológicas, obtidos por Oliveira (2005) em amostras de LPA, LPB e leite pasteurizado tipo C de Piracicaba - SP corresponde respectivamente aos índices de 13,1%; 25,5% e 11,6% para relação TER/MAM e de 5,22%, 0,36% e 4,50% para TER/PSI. Tanto a incidência, quanto o intervalo entre as contagens, podem estar correlacionados com aspectos regionais da captação e da qualidade da matéria prima, acrescido às características operacionais do beneficiamento e distribuição do produto acabado, singulares a cada planta industrial (EDEMA; AKINGBADE, 2007; ELMOSLEMAY et al., 2009; FROMM; BOOR, 2004; HUCK; BOOR, 2006; ROSSI-JUNIOR et al., 2006). De acordo com Huck; Sonnen; Boor (2008) os esporulados psicrotróficos, que sobrevivem à pasteurização podem representar um alto potencial de deterioração para o LP; uma vez que alguns são capazes de multiplicar na temperatura de armazenagem. Sanvido (2007) descreve ter diagnosticado o desenvolvimento de TER mesofílicos durante a estocagem do LP e sugere poder existir diferentes tempos de geração, em função das condições de armazenagem da matéria prima (temperatura/tempo). O mesmo autor, relata que quanto maior for à temperatura de 93 estocagem do LP, mais acelerada poderá ser a evolução dos esporos mesofílicos, em contra partida os esporos de psicrotróficos, em qualquer temperatura de armazenagem, possuem o mesmo comportamento. Pereira (2010) em LP de Goiás, encontrou variações da concentração de TER ao longo do tempo de vida útil do produto acabado e correlacionou o diagnóstico com uma possível presença de esporos, com diferentes capacidades de multiplicação ao longo do armazenamento. O monitoramento da carga de TER da matéria prima, ao longo do processamento e no produto acabado, parece ser o desafio técnico emergente para manutenção da qualidade do LP, sendo a razão de diferentes estudos (HASSAN; ABDALLA; NOUR, 2009; HUCK et al., 2007; HUCK; BOOR, 2006; RANIERI et al., 2009). 5.4.3 Concentração de Psicrotróficos O controle da concentração de micro-organismos psicrotróficos (PSI) vem despertando interesse por parte da indústria laticinista, em função de fatores como: a seleção da microbiota psicrotrófica e produção de enzimas termoestáveis, em função do resfriamento da matéria prima na produção; da possível presença de PSI termodúricos, e a devida influencia dessa carga bacteriana sobre o tempo de vida útil do LP (AIRES, 2007; PETRUS et al., 2009; PINTO et al, 2006; TEBALDI et al., 2008; 2006). Tabela 14 – Média dos resultados das contagens de psicrotróficos de 30 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) TIPO LPA LPB LPI LPP Média LP n.< 2* 11 3 5 8 24 n.> 2* 2 1 3 Média PSI Média MAM (UFC/mL) (UFC/mL) 1 0,14 x 10 < 0,2 x 101 < 0,2 x 101 1 0,17 x 10 1 0,16 x 10 2 2,99 x 10 1,44 x 104 3,41 x 102 3 9,64 x 10 3 4,52 x 10 %PSI/ MAM 0,67 PSI Max. 1,60 x 10 0,02 0,04 1,60 x 10 1 1,60 x 10 n. (UFC/mL) 1 1 13 3 5 9 30 2*: 2 UFC/mL/ Média PSI: médias das amostras com resultado PSI > 2 UFC/mL/ Média MAM: média de MAM/%PSI/MAM: média da relação PSI/MAM ou percentual médio PSI sobre o valor de médio de MAM /PSI Max.: valor máximo de PSI/ n: número de amostras/ LPA: Leite pasteurizado Tipo A / LPB: Leite pasteurizado tipo B/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado / Média LP: Média de todas as amostras de Leites pasteurizados. Neste estudo, os resultados das contagens de PSI (Tabela 14) das 30 amostras analisadas, variaram de < 2 UFC/mL a 16 UFC/mL, com valor médio de 2 UFC/mL. Demonstrando uma baixa incidência de micro-organismos psicrotróficos e conseqüente baixo percentual na relação PSI/MAM, considerando-se que a 94 relação TER/MAM para leite pasteurizado seja semelhante ao limite de 10% preconizado pelo RIISPOA/1997 para psicrófilos e termófilos, embora sejam grupos diferentes de micro-organismos. Das 30 amostras analisadas, em 27 delas, não foi detectada a presença de PSI em 2mL de amostra (< 2 UFC/mL). A exceção concentrou-se em 2 amostras de LPA e 1 amostra de LPP, cujo resultados foram de 1,50 x 101 UFC/ML; 1,60 x 101 UFC/ML e 1,60 x 101 UFC/ML, respectivamente. A não detecção de PSI em LP comercializados na região de Londrina-PR, também foi evidenciada no trabalho de Martins (2009), para diferentes tipos de LP: LPA (100%), LPB (75%); LPI (50%) e LPP (33%). Silva (2010) em estudo da qualidade do LP de Brasília – DF, descreve não ter detectado PSI em 42% das amostras e 26% apresentaram contagem média < 2,9 x 101 UFC/mL. Resultados diferentes do presente estudo são descritos por Silva et al (2008), Silva et al. (2001) que apontam índices de 68,8% e 44,4% das amostras, com correlação PSI/MAM maior que 10%. Um fator há ser considerado, é a realização da análise em intervalos de 24 e 48h após a produção do leite pasteurizado, que pode ser responsável pelo baixo índice de detecção obtido. No estudo realizado por Petrus et al. (2009) da estabilidade sensorial e microbiológica do LP de Pirassununga-SP, pode-se evidenciar a variação de 0,1 log UFC/mL de PSI no dia do processamento para 1,4 até 1,5 log UFC/mL de PSI, após armazenagem a 4ºC/10 dias. Outros estudos também relatam o aumento significativo da concentração de PSI em LP, ao longo do TVU e em diferentes temperaturas de estocagem (AIRES, 2007; MARTINS, 2009; SANVIDO, 2007). 5.4.4 Contagem de Coliformes Totais e E. coli As condições higiênico-sanitárias das 80 amostras de LP podem ser evidenciadas através dos resultados (Tabela 15) das contagens de Coliformes Totais (CC) e Escherichia coli (EC). Foram encontrados resultados positivos para CC em 7 amostras de LP, correspondendo ao percentual de 8,75% de amostras em desacordo com o parâmetro para amostra indicativa (M) para cada tipo de leite, da IN 51/2002 95 (BRASIL, 2002) Para LPA o valor encontrado na única amostra positiva foi de 2 UFC/mL. Para LPI, 2 amostras apresentaram resultado fora do padrão, com valores de 8 UFC/mL e 60 UFC/mL. Uma maior incidência de amostras com resultado alterados para CC ocorreu em LPP, com 2 amostras com valor de 5 UFC/mL, 1 amostra com 11 UFC/mL e 1 amostra com 80 UFC/mL. Tabela 13 – Média dos resultados das contagens de coliformes totais e Escherichia coli de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) TIPO COLIFORMES TOTAIS n. ND Média n. D (UFC/mL) LPA LPB LPI LPP LPD Média LP 28 3 17 23 2 73 <1 <1 <1 <1 <1 <1 Média E. coli %ADL n.ND n. D 2 3,4 34 25 10,5 14,8 24 8,75 29 3 19 27 2 80 0 0 0 0 0 0 (UFC/mL) 1 0 2 4 0 7 Média n %ADL (UFC/mL) <1 <1 <1 <1 <1 <1 29 3 19 27 2 80 LPA: Leite pasteurizado Tipo A / LPB: Leite Pasteurizado Tipo B / LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado / LPD: Leite Pasteurizado Desnatado/ Média LP: Média de todas as amostras de leites pasteurizados/ n.: número de amostras/ n.ND: número de am ostras não detectado/ n.D: número de amostras detectado/ %ADL: amostras em desacordo com a legislação. Levando-se em conta que os micro-organismos do grupo coliformes são destruídos pelo binômio da pasteurização do leite, e que as mesmas amostras apresentaram resultados comprobatórios de adequado processo térmico, os valores obtidos sugerem uma contaminação pós pasteurização e/ou falhas no processo de higienização dos equipamentos do beneficiamento e/ ou do envase do LP (BUENO et al., 2007; CATÃO; CEBALLOS, 2001; HAJDENWURCEL, 2004; MENDES et al., 2005; PAIVA, 2007; PRATA, 2001; TAMANINI et al., 2007). O percentual obtido neste estudo soma-se a realidade das condições higiênico-sanitárias insatisfatórias encontradas por TAMANINI et al. (2007) para LP da região norte do Paraná. Situação também descrita por outros autores em estudos da qualidade do LP, de diferentes regiões do país (ATAÍDE et a., 2008; BUENO et al., 2007; FERREIRA et al., 2007; PAIVA, 2007; PEREIRA, 2010; SILVA, 2010; SILVA et al., 2010b; TESSARI; CARDOSO, 2002). Tratando-se dos resultados das análises de Escherichia coli, não foi detectada sua presença nas amostras de LP analisadas, sendo este resultado semelhante aos encontrados para coliformes termotolerantes (coliformes a 45ºC) 96 obtidos por Bernardino et al. (2009) e Martins (2009) para LP comercializado na região metropolitana de Londrina – PR. No entanto, os dados obtidos são diferentes dos resultados descritos por Ataíde et al. (2008), Tamanini et al. (2007), Silva (2010) e Silva et al. (2010); respectivamente para LP da Paraíba (57,1%), de Londrina – PR (17,5%); de Brasília – DF (10,5%) e do Rio de Janeiro – RJ (57,5%). 5.5 A LACTOFERMENTAÇÃO COMO DIAGNÓSTICO DA MICROBIOTA PREDOMINANTE DOS LEITES PASTEURIZADOS O teste de lactofermentação é descrito como uma prova que permite o diagnóstico qualitativo da microbiota predominante no leite, evidenciando-se seu maior emprego para a classificação de matéria prima e no diagnóstico do leite pasteurizado destinado a fabricação de queijos (PEREIRA, 2010; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006; RAMOS, 2009). O fundamento da técnica encontra-se na interpretação do aspecto do tipo de coagulo formado (ou da não formação) após incubação da amostra a 36ºC/24h (PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006; RAMOS, 2009; PASSOS, 1979). Embora a análise de lactofermentação não seja referenciada para análise da qualidade de leite pasteurizado, neste estudo, a lactofermentação (LAC) foi realizada com o intuito de evidenciar qualitativamente o a microbiota mesofílica remanescente da pasteurização através do tipo de coágulo formado; uma possível correlação com os resultados microbiológicos e a influencia da presença de substâncias antimicrobianas. Tabela 17 – Resultados da análise de Lactofermentação de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) TIPOS HOMOGÊNEO DESSORADO N. % N. % N. LIQUIDO % N. DIGERIDO % N. LPA LPB LPI LPP 9 1 9 13 31,0 33,3 47,4 48,2 11 37,9 10,4 15,8 18,5 20,7 66,7 15,8 14,8 3 3 5 6 2 3 4 4 5 21,0 18,5 29 3 19 27 LPD Total 32 40,0 19 23,75 1 16 50,0 20,0 1 13 50,0 16,25 2 80 LP: Leite pasteurizado/ LPA: Leite pasteurizado Tipo A / LPB: Leite Pasteurizado Tipo B / LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado / LPD: Leite Pasteurizado Desnatado/ N.: número de amostras /%: percentual equivalente da lactoferm entação. 97 A partir dos dados de interpretação do teste (Tabela 5), foram obtidos 4 tipos de resultados (Tabela 16): Coagulo homogêneo (HO), dessorado (DE) e digerido (DI), bem como a não formação de coagulo, interpretada como coagulo liquido (LI). Foi observada uma maior incidência de coagulo homogêneo (40,0%) e dessorado (23,75%), seguidos por resultados líquidos (20,0%) e por coagulo digerido (16,25%) Os dois primeiros tipos de LAC são descritos como oriundos de matéria prima com boa qualidade tecnológica e possível prevalência de bactérias láticas (Figura 8). DE DE HO Figura 8: Interpretação dos resultados da analise de Lactofermentação Coagulo dessorado (DE) com coluna de soro e coagulo homogêneo (HO) A formação de coagulo do tipo digerido pode ser considerada como oriunda da predominância de bactérias proteolíticas e/ ou enzimas proteolíticas (Figura 9), neste estudo, a ocorrência de maior intensidade foi em LPI (21,0%); LPP (18,5%) e LPD (50,0%), correspondendo a 10 amostras, e dessas amostras, 6 são originarias de 2 usinas de beneficiamento com matéria prima 100% resfriada/ granelizada. Em 50% dessas amostras, o índice de TER/MAM foi superior a 10% (variando de 34,4% a 93,2%), acrescido do percentual de 60% como 98 lactofermentação do tipo DI, fatos que reforçam a possível presença de termodúricos proteolíticos e/ou de enzimas proteolíticas termoestáveis de psicrotróficos. Para leite pasteurizado de consumo, essa característica pode levar à formação de sabor desagradável (amargo) e/ ou redução do TVU (BURDOVÁ et al., 2002; HUCK et al., 2007; NORNBERG; TONDO; BRANDELLI, 2009; RANIERI; BOOR, 2009; SAVINDO, 2007). DI LI GA HO GA Figura 13: Interpretação dos resultados da analise de Lactofermentação Coagulo digerido (DI), não formação de coágulo (LI), coágulo gasoso (GA), coágulo homogêneo (HO) e coágulo gasoso (GA). O valor de 10,4% de LPA com coágulo digerido pode estar relacionado às condições do processo de higienização dos equipamentos da ordenha, uma vez que os termodúricos são referenciados como microbiota típica, através da seleção térmica resultante do emprego de altas temperaturas durante a fase da limpeza (FROMM; BOOR, 2004; HUCK;BOOR, 2006; HUTCHISON, 2004). Acrescido do fato de 2 das 3 amostras apresentarem valor de 19,5% e 20,0% para relação TER/MAM. Estudos realizados com leite cru, de outras regiões do Brasil, 99 também demonstram a prevalência da lactofermentação indesejável com coágulos do tipo digerido; caseoso ou esfacelado. Descritas como oriundas de microbiota deteriorante e relacionada com leite de qualidade ruim (MATTOS et al., 2010; NERO, et al., 2004; NERO, 2005; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006). Silva (2010) estudando o perfil do LP do Distrito Federal descreve ter encontrado 87,4% das amostras LP e 14,2% das amostras de leite cru, com lactofermentação do tipo esfacelado, e ressalta que os resultados obtidos são indicativos do efeito deletério da atividade proteolítica de psicrotróficos. Também reporta que 85,7% das amostras de leite cru e 14,7% de leite pasteurizado apresentaram resultado do tipo gelatinoso. Analisando os resultados obtidos no estudo de Silva (2010), pode-se interpreta-los como um fato que permiti visualizar uma relação inversamente proporcional entre os resultados das amostras de leite cru e leite pasteurizado e respectivo percentuais de coágulo esfacelado e gelatinoso. Podendo essa relação ser também comprobatória da seleção térmica e conseqüente prevalência de termodúricos após o tratamento térmico da pasteurização. Considerando-se a somatória dos resultados de LAC obtidos, neste trabalho, como coágulo homogêneo e dessorado, por cada tipo de leite, maior valor foi evidenciado em LPA (68,9%), seguido por LPP (63,2%), LPP (48,2%) e LPB (33,3%). Resultado similar foi descrito por Pereira (2010), embora com amostras de leite cru, que relata ter encontrado 71,4% de coágulo gelatinoso para a LAC das amostras avaliadas de leites do Estado de Goiás. No contexto geral a LAC homogêneo e dessorado, neste trabalho, perfaz o valor de 63,7% das amostras analisadas e permite intuir uma melhora significativa na qualidade microbiológica da matéria prima em toda a sua cadeia produtiva, bem como, do processo de beneficiamento realizado pela plantas de laticínios. A melhoria da qualidade também sugerida e/ou correlacionada por Nero (2005), que descreve que as amostras analisadas de LC de Londrina – PR apresentaram uma freqüência maior e regular de coágulo gelatinoso (25,4%), em relação às demais regiões avaliadas; apesar da maior incidência de coagulo esfacelado (39,7%), típicos de microbiota produtora de gás. Vale salientar que para aqueles leites cuja LAC apresentou coágulo 100 gelatinoso, definido como resultante da ação de bactérias láticas (com alta capacidade acidificante), uma maior atenção deva ser dada para conservação do produto acabado, empregando-se o armazenamento à baixa temperatura; de modo a não permitir a multiplicação da microbiota mesofílica diagnosticada. A presença de resíduos de substâncias antimicrobianas e a baixa incidência de micro-organismos mesofílicas, são descritos como possíveis causas da obtenção de LAC do tipo líquido (HAJDENWURCEL, 1980; PEREIRA et al., 2009; NERO, 2005; RAMOS, 2009). Nesse estudo, o valor de LAC do tipo líquido (Figura 13) independente do tipo de leite, correspondeu a 20% do total das amostras analisadas. Para LPA o resultado poderia ser considerado como próprio dos parâmetros requeridos para leite oriundo de Granja Leiteira: controle sanitário do rebanho, produção própria, beneficiamento na origem e as condições higiênicosanitárias das edificações/ instalações, da água de abastecimento, da produção e da industrialização. Parâmetros, que de certa forma, também são empregados para LPB, respeitando-se as diferenças entre as 2 classificações (produção em estabelecimentos relacionados – ER, emprego de transporte e beneficiamento em usina terceira). Para os demais leites, o percentual pode ser correlacionado à adoção das normas e requisitos descritos pela IN 51/2002. 5.6 CORRELAÇÃO ENTRE OS RESULTADOS DE ALGUNS PARÂMETROS DE QUALIDADE Um dos objetivos da realização da análise de lactofermentação foi o de verificar uma possível correlação entre o diagnóstico da microbiota predominante e os resultados da detecção de resíduos de substâncias antimicrobiana; da pesquisa de peroxidase e com a qualidade microbiológica dos LP (Tabela 17). Vale lembrar que neste estudo, todas as amostras apresentaram resultados negativos na análise de detecção de resíduos de antibióticos tetraciclinas e beta-lactâmicos, razão da exclusão da influencia destas drogas veterinárias sobre a ocorrência de LI. Assim sendo, considerando-se todos os resultados de 101 lactofermentação líquida (16 amostras) e resultados de detecção de substâncias antimicrobianas, positivo (3 amostras) e suspeitos (10 amostras), para todos os tipos de leite, não foi possível observar uma correlação direta entre as análises e respectivos resultados. Exceto para sete amostras, que apresentaram lactofermentação líquida e detecção de resíduos de substancias antimicrobianas; respectivamente, 1 amostra de LPA (suspeito); 2 amostras de LPB (1 positivo e 1suspeito) e 4 amostras LPP (1positivo e 3suspeitos). Nero (2005) também descreve não ter encontrado uma correlação perfeita entre os resultados obtidos da LAC tipo líquida e resíduos de antibióticos positivos. Em seu estudo, das 7 amostras com resultado líquido, apenas 2 apresentaram resultado positivo na detecção de RA. Tabela 17 – Correlação entre os resultados da lactofermentação e das análises de detecção de resíduos de substancias antimicrobianas e peroxidase negativa de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) TIPOS PE RAII LI LPA 29 0 PO SU NE 1SU 3 0 PO SU NE 2PO/SU Total LPB Total LPI Total LPP Total LPD 17 2 2NE PO SU NE 4SU 24 3 3NE PO SU NE 6PO/SU 2 0 PO SU NE Total TOTAL 5 NE 1 5 6 DI 3 3 LAC DE Possível Correlação HO 11 11 9 9 1 1 2 0 0 1 1 3 3 1 3 4 1 2 3 2 7 9 1 3 1 4 1 4 5 5 5 12 13 1 1 1 1 0 0 0 0 16 13 19 32 100% INB/CO (1) = LI 83,3% LI (5) = BC 16,7% LI (1) = RSA 100% RSA (2) = LI 100% RSA (4) = NI 66,6% LI (2) = BC 33,3% LI (1) = PE NE 66,6% RSA (4) = LI 33,3% RSA(2) = NI 100% LI (4) = RSA 50% LI (2) = PE NE 100% LI (1) = BC LPA: Leite pasteurizado Tipo A / LPB: Leite Pasteurizado Tipo B / LPI: Leite Pasteurizado Integral / LPP: Leite Pasteurizado Padronizado / LPD: Leite Pasteurizado Desnatado/ PE: peroxidase/ RSA: Resíduos de substâncias antimicrobianas/LAC: lactoferm entação/ LI: Liquida / DI: Digerida/ DE:Dessorada/ HO: Homogênea/ PO: Positivo/ SU: Suspeito / NE: negativo/ NI: Não inibição/ BC: baixa carga bacteriana. 102 Referindo-se ao total de 16 amostras (20%) com lactofermentação líquida, independente do tipo de leite (Tabela 19), uma possível correlação pode ser sugerida entre os resultados da pesquisa de peroxidase, contagem de MAM e detecção de RSA. Na literatura é possível encontrar algumas possibilidades para esse tipo de resultado, como: 8 amostras (50%) apresentaram resultado negativo para resíduos de substancias antimicrobianas e peroxidase positiva, estando o resultado de LAC líquido provavelmente relacionado com uma baixa concentração bacteriana (HAJDENWURCEL, 1980; PEREIRA, 2010; NERO, 2005; RAMOS, 2009) ou por baixa carga bacteriana mesofílica (ALMEIDA, 1998A; HAJDENWURCEL, 1980; PASSOS, 1979) fato evidenciado pelos resultados obtidos das contagens de MAM. Neste estudo, para 5 amostras (31,2%) a LAC liquida parece ser resultante da presença de substâncias antimicrobianas, detectadas pelo método do Iogurte-Indicador. Para outras 2 amostras (12,5%) o resultado líquido pode estar ligado a interferência da presença de substâncias antimicrobianas e do resultado negativo para análise de peroxidase onde a somatória dos 2 resultados pode inferir maior redução da carga bacteriana pelo superaquecimento do leite e respectiva inibição dessa carga pela substância antimicrobiana presente. Tabela 18 – Correlação entre os resultados da lactofermentação líquida e resultados das análises de detecção de resíduos de substancias antimicrobianas e peroxidase de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) LAC LI (N.=16) Diagnóstico N RSA negativo e 8 Peroxidase positiva % 50,0 Possibilidades Baixa carga bacteriana Tipo de microbiota RSA positivo 5 31,2 Ação de inibição sobre a microbiota RSA negativo e Peroxidase negativa 2 12,5 Ação de inibição sobre a microbiota Maior redução da concentração bacteriana Peroxidase negativa 1 6,30 Maior redução da concentração bacteriana LAC: lactofermentação/ LI: líquida/ N.: amostras/ RSA: Resíduos de substâncias antimicrobianas Em 1 amostra (6,3%) o superaquecimento do leite (peroxidase negativa ) e conseqüente maior eliminação de bactérias, podem ser a causa da LAC 103 líquida, embora o grau de redução dependa da intensidade do superaquecimento (AIRES, 2007). Tratando-se das 13 amostras (16,25%) onde foi detectada a presença de resíduos de substâncias antimicrobianas (Tabela 19), para 7 amostras (53,8%) entende-se que possua forte correlação com lactofermentação líquida. Nas outras 6 amostras (46,2%), não foi encontrada a inibição da microbiota predominante, evidenciada pela formação de coagulo (homogêneo, dessorado e digerido) e desta forma podem ser consideradas 3 situações: baixa concentração dos resíduos de substâncias antimicrobianas, não suficientemente capaz de inibir a microbiota mesofílica predominante; o princípio ativo de substancia detectada não possuía efeito inibitório frente à microbiota e nas condições da analise; e a perda do princípio ativo ou da ação inibitória. Trabalhos científicos reportam as situações acima sugeridas, como justificativas de resultado falso - negativo ou diferença de detecção entre os métodos (BRITO 1993; FOLLY; MACHADO, 2001; SANTOS; FONSECA, 2007), e o fato da sensibilidade das bactérias láticas pode variar de acordo com a faixa ideal de multiplicação (mesófilas e termófilas) e dentro de uma mesma espécie (BRITO 1993; SANTOS; FONSECA, 2007; SCHAELLIBAUM, 2000). Tabela 19 – Correlação entre os resultados de detecção de substâncias antimicrobianas e resultados da análise de lactofermentação de 80 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) RSA Lactofermentação N % Possibilidades Líquida 7 53,8 Ação de inibição sobre a microbiota Formação de coágulo: homogêneo, dessorado ou digerido 6 46,2 Não capacidade de ação de inibição sobre a microbiota. PO/SU (N.=13) RSA: Resíduos de substâncias antimicrobianas/ N.: amostras/ PO/SU: positivo ou suspeito 104 5.7 CORRELAÇÃO PETRIFILMTM AC E MÉTODO TRADICIONAL PARA CONTAGEM MICRO- DE ORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS. O estudo da correlação entre o método convencional ou método tradicional do Agar Padrão (PCA) e o sistema PetrifilmTM AC para enumeração de micro-organismos aeróbios mesófilos (MAM), foi realizado em duas etapas distintas: 1º etapa - emprego método PCA com o corante Cloreto de Trifeniltetrazólio - TTC (PCATTC) e as placas PetrifilmTM AC (AC). 2º etapa - métodos AC; PCATTC e método tradicional com Agar Padrão (PCA) sem adição do TTC. A média dos resultados em UFC/mL, das contagens de MAM foram transformadas para log10 UFC/mL, e a partir dessas foi determinada a correlação entre as metodologias, bem como, os demais parâmetros estatísticos. Tabela 20 – Resultados estatísticos das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos dos métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODO AC PCATTC AC PCA TTC PCA 2 n. x s S 62 62 25 24 24 1,8241 1,7389 2,0380 1,9063 2,1980 0,3776 0,4732 0,4972 0,5636 0,5314 0,1426 0,2240 0,2472 0,3176 0,2824 MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ n.: número de amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S2: Variância média/ PCATTC: TM Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão. Tabela 21 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) 2 2 MÉTODOS n. r r p t a b S PCATTC / AC PCATTC / AC PCA / AC PCA / PCATTC 62 24 24 23 0,7295 0,7290 0,8426 0,5845 0,5322 0,5315 0,7099 0,3416 0,00 0,00 0,00 0,00 8,2627 4,9950 7,3370 3,3010 0,5822 0,5345 0,7929 0,6753 0,8117 0,9631 0,3142 0,4590 0,1836 0,2404 0,2657 0,2975 2 MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ n.: número de amostras/ r: coeficiente de correlação/ r : coeficiente de 2: TM determinação/ t: valor de t / a: inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão. Os resultados estatísticos obtidos das enumerações (Tabela 20) e das comparações entre as metodologias de enumeração de MAM (Tabela 21) demonstram diferentes correlações e dispersões dos dados. Na comparação entre AC/PCATTC, de 62 amostras de LP, maior 105 média de contagem foi obtida pelo método AC (1,8241 log10 UFC/mL), com menor valor para desvio padrão (s) e para variância (S2), respectivamente de 0,3776 e 0,1426. Os valores geraram uma correlação regular (r: 0,7296), acompanhada de parâmetros estatísticos fracos para a inclinação (a: 0,5822) e intercepção (b: 0,8117). A dispersão desses dados (Figura 10) demonstra o nível da aglomeração dos pontos próximo à reta e linhas s. Contagem MAM - Leites Pasteurizados (AC/PCATTC) 3,0 PETRIFILM TM AC (log10 UFC/mL) 2,8 2,6 AC = 0,81173 + 0,58219 * PCA TTC r = 0,72955 n = 62 p < 0,05 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 PCATTC (log10 UFC/mL) Figura 10: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos de 62 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) Na comparação entre os resultados das 3 metodologias (Tabela 20) de enumeração de MAM (AC; PCATTC e PCA), maior média de contagem foi obtida pelo método PCA (2,198 log10 UFC/mL); seguida pelo método AC (2,038 Log10 UFC/mL). Nessa etapa, a comparação dos resultados de 24 amostras (Tabela 21) entre os métodos AC/PCATTC apresentou r de 0,7295, classificada como de nível regular e parâmetros a e b fracos, com grande dispersão dos pontos pela reta (Figura 11). Entre os métodos PCA/PCATTC, para as 23 amostras consideradas, pode-se dizer que não existe correlação (r: 0,5845), uma vez que o valor obtido define-a como fraca ou ruim (Figura 11). 106 Contagem MAM - Leites Pasteurizados (AC/PCA TTC) 3,0 2,8 PetrifilmTM AC (log10 UFC/mL) 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 AC = 0,96309 + 0,53447 * PCA TTC r = 0,72905 n = 24 p < 0,05 1,6 1,4 1,2 1,0 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 PCATTC (log10 UFC/mL) Contagem MAM - Leites Pasteurizados (AC/PCA) 3,6 3,4 PETRIFILM TM AC (log10 UFC/mL) 3,2 AC = 0,31422 + 0,79299 * PCA r = 0,84258 n = 24 p < 0,05 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 2,8 3,0 3,2 3,4 PCA (log10 UFC/mL) Contagem MAM - Leites Pasteurizados (PCATTC/ PCA) 3,8 3,6 3,4 PCATTC = 0,45900 + 0,67531 * PCA r = 0,58449 n = 23 p = < 0,05 PCATTC (log10 UFC/mL) 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 PCA (log10 UFC/mL) Figura 11: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) 107 Em contra partida na comparação entre AC/PCA (24 amostras) foi encontrada uma boa correlação (r: 0,8426), acompanhada de bom valor para os parâmetros estatísticos, com a: 0,7929 e b: 0,3142. Também apresentando uma melhor dispersão dos dados na reta, com maior aglomeração dos pontos e menor distancia entre as linhas de s (Figura 11). O índice de correlação entre AC/PCA obtido neste trabalho, é próximo ao obtido por Beloti (2000), que encontrou boa correlação (r: 0,8775) em estudo da comparação entre os métodos para contagem de MAM de LP brasileiro. Apresentando-se diferente daquele encontrado por Prata, et al. (1998, apud in SANT`ANA; CONCEIÇÃO; AZEREDO, 2003) que obteve uma correlação regular (r : 0,763) para as amostras de LP testadas. Considerando-se que em todas as comparações não existiu diferença estatística significativa (p<0,05) entre os resultados, os valores encontrados para AC/PCATTC e PCA/PCATTC, apontam para a existência de interferência (s) nas determinações; tanto pelo valor de r, quanto pelos outros parâmetros estatísticos (a e b). Parâmetros esses, que são considerados úteis na avaliação de correlação de regressão linear entre métodos (BARANCELLI et al., 2004; FREITAS; NERO; CARVALHO, 2009). Entendendo que a comparação AC/PCA obteve um bom índice (r: 0,8518) e as demais comparações (AC/PCATTC e PCA/PCATTC) apresentaram índices insatisfatórios, e tendo essas correlações como fator comum o método PCATTC, sugere que o fator limitante seja a presença do corante de TTC, por uma possível ação de inibição ou pela não capacidade de redução da microbiota presente. Na enumeração de micro-organismos dos alimentos, o corante TTC é empregado para detecção do crescimento microbiológico, via formação de coloração vermelha (e suas nuances) nas colônias, através de sua capacidade irreversível de oxidoredução (BOCHNER; SAVAGEAU, 1977; GRABIELSON et al., 2002; ZIMBRO et al., 2009; 3M/BR, 2006). O TTC atua como revelador, permite a visualização das colônias em meios com muita opalência (BOU-CHACRA; OHARA, 2003), diminuindo a interferência das partículas do alimento (HANDEWURCEL, 2004; ZIMBRO et al., 2009) e principalmente eliminando a opacidade do meio de cultura na análise de leite pasteurizado quando da utilização de diluição menores (BELOTI, 2000), 108 causada por seus constituintes. Entretanto, o TTC pode exercer efeito inibidor da multiplicação bacteriana, em função da relação concentração empregada frente o tipo de microbiota presente no alimento (BOU-CHARA; OHARA, 2003; GRABIELSON et al., 2002; OHARA; TAKAKO, 1993). Podendo o grau da inibição variar entre uma mesma espécie (LISKA; CALBERT; KNIGT, 1958). Embora não seja evidenciado um senso comum, sobre a concentração ideal de TTC, capaz de permitir a visualização sem apresentar ação de inibição (BELOTI et al.,1999). As placas AC também possuem o corante TTC, em sua formulação, atuando como revelador da formação de colônias, permitindo sua visualização sobre o fundo branco opaco da placa (3M/BR, 2006). A concentração empregada e a forma de liberação para o meio, não são reveladas pelo fabricante. Existindo a hipótese da liberação ocorrer de forma lenta e suficientemente capaz de minimizar a possível ação deletéria (HUGHES; SUTHERLAND, 1987; GINN et al., 1984; apud in BELOTI, 2000). Neste estudo, foi empregada solução de TTC 0,5%, com concentração final no meio de 0,015%. Concentração descrita por Beloti (2000) como suficiente para permitir a visualização de colônias, sem influenciar na capacidade do desenvolvimento bacteriano, frente às condições e/ou realidades microbiológicas do LP, na época do estudo. Figura 12: Placa com Agar Padrão com TTC Colônias de micro-organimos aeróbios mesofilos de leite pasteurizado. 109 Durante a realização das contagens das placas do método PCATTC e método AC, foram observados e considerados o parâmetro de coloração das colônias (brancas, vermelhas, rosa e suas nuances). Assim como, a presença de halo (rosa, branco ou transparente) para as placas de PCATTC e PCA. No contexto do total de colônias (dados brutos) nas placas do método PCATTC (Figura 12) foram contadas 7.059 colônias, assim distribuídas: 4.526 vermelhas (64,1%); 2.123 rosas e suas nuances (30,1%) e 410 brancas (5,8%). Foi realizado o preparo de lâminas, a partir de algumas colônias, para posterior observação morfotinturial. Nas placas do método AC (Figura 13) foram contadas 13.154 colônias, sendo 10.010 com coloração vermelhas (76,10%) e 3.144 rosa ou suas nuances (23,90%). As placas foram congeladas para um futuro estudo de morfologia e/ou identificação da microbiota predominante. As placas de AC também apresentaram a presença de colônias muito pequenas (“ponta de alfinete”) com tonalidade do rosa (claro ao branco) que poderia gerar erro na leitura dos resultados, principalmente por analista não “familiarizado” com a metodologia ou não sabedor da possibilidade. Neste estudo, o efeito foi minimizado pelo emprego do contador de colônias. Figura 13: Placa PetrifilmTM AC – Colônias de micro-organimos aeróbios mesófilos de leite pasteurizado. Estudos da enumeração de MAM, realizados por Blackburn; Baylis; Petitt (1996) e Beloti (2000) também apresentam o relato da formação de colônias com diâmetro muito pequeno (“ponta de alfinete”) e coloração fraca em placas AC. 110 Outro fator há ser considerado na avaliação dos resultados, consiste no fato da capacidade de redução do TTC, poder variar entre os diferentes grupos de micro-organismos, bem como a intensidade e velocidade de redução (BOCHENER; SAVAGEAU, 1977; DAWKINS; HULNGSWORTH; HAMILTON, 2005; NERO et al., 2006; ORTOLANI et al., 2007; TURNER et al., 1963). Sendo dessa forma, diretamente dependente do tipo da microbiota presente na amostra. Assim como, a composição do meio com substratos diferentes, pode gerar formações distintas de colônias (coloração e halos) para um mesmo grupo de micro-organismo (BOCHENER; SAVAGEAU, 1977; BEERENS; LUQUET, 1990; COGAN; BERESFORD, 2002; MATALON; SAVINE, 1986). Verifica-se que a qualidade microbiológica do LP brasileiro foi relatada como a razão da não eficiência do desempenho das placas PetrifilmTM AC (BELOTI, et al., 2002; 2002a), em função da microbiota remanescente da pasteurização, ser formada por micro-organismos com “deficiente” capacidade de redução do TTC (BELOTI et al., 2000; FREITAS; NERO; CARVALHO, 2009), possuindo importante influencia e/ou relação direta com a qualidade microbiológica da matéria – prima (BELOTI, 2002; NERO et al. 2002; FREITAS; NERO;CARVALHO, 2009). Buscando visualizar a possível influencia da qualidade microbiológica da matéria prima e das condições do beneficiamento, frente à presença do TTC e conseqüente eficiência dos métodos, fez-se o estudo de comparação dos resultados AC/PCATTC por tipo de LP, empregando-se as médias dos resultados obtidos (Tabela 22) para obtenção da respectiva correlação (Tabela 23 e Figura 14). Tabela 22 – Resultados estatísticos por tipo de leite das contagens de microorganismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODO AC PCATTC AC PCATTC AC PCATTC Tipo LPA LPI LPP 2 n. x s S 24 24 16 16 1,6259 1,5540 1,9784 1,9663 0,2333 0,2878 0,3845 0,5773 0,0544 0,0828 0,1479 0,3333 22 22 1,9274 1,7754 0,4194 0,4919 0,1759 0,2420 2: MAM:Micro-organismos aeróbios mesófilos/ n.: número de amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S Variância média/ PCATTC: TM Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado 111 Contagem MAM - Leite Pasteurizado Tipo A (AC/PCA TTC) 2,1 PETRIFILM TM AC (log10 UFC/mL) 2,0 1,9 1,8 AC = 0,75444 + 0,56083 * PCA r = 0,69175 n = 24 p < 0,05 TTC 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 PCATTC (log10 UFC/mL) Contagem MAM - Leite Pasteurizado Integral (AC/PCA TTC) 2,8 PETRIFILM TM AC (log10 UFC/mL) 2,6 2,4 2,2 2,0 AC = 1,0725 + 0,46074 * PCA TTC r = 0,69167 n = 16 p < 0,05 1,8 1,6 1,4 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 PCATTC (log10 UFC/mL) Contagem MAM - Leite Pasteurizado Padronizado (AC/PCA TTC) 2,8 2,4 2,2 2,0 PETRIFILM TM AC (log10 UFC/mL) 2,6 1,8 AC = 0,85544 + 0,60378 * PCA TTC r = 0,70819 n = 22 p < 0,05 1,6 1,4 1,2 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 PCATTC (log 10 UFC/mL) Figura 14: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos, por tipo de leite, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) 112 Tabela 23 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por tipo de leite. TIPO n. r r2 p t a b S2 PCATTC / AC PCATTC / AC LPA 24 0,6917 0,4785 0,00 4,4931 0,5608 0,7544 0,0685 LPI 16 0,6916 0,4784 0,00 3,5833 0,4607 1,0725 0,2328 PCATTC / AC LPP 22 0,7082 0,5015 0,00 4,4859 0,6038 0,8554 0,2100 MÉTODOS 2 MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ n.: número de amostras/ r: coeficiente de correlação/ r : coeficiente de 2: TM determinação/ t: valor de t / a: inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. As médias das contagens de MAM pelo método AC foram maiores que o PCATTC, para LPA e LPP. Onde LPA apresentou, respectivamente 1,6259 e 1,5540 log10 UFC/mL; e LPP de 1,92,71 e 1,7754log10UFC/mL. Para LPI as médias de contagem foram muitos próximas entre AC (1,9784 log10 UFC/mL) e PCATTC (1,9663 log10 UFC/mL). Porém quando comparadas com as médias obtidas por LP, apenas LPA foi evidenciado menor valor em ambos os métodos. De maneira em geral, a comparação AC/PCATTC por tipo de leite (Figura 14), apresentaram menor valor que LP (r: 0,7296 e r: 0,7290), onde LPA obteve r: 0,6917; LPI com r: 0,6916 e LPP com r: 0,7082. Desta forma, os valores acima descritos, demonstram que a correlação por tipo de leite entre AC/PCATTC, apresenta-se como de nível regular. No entanto cada valor obtido parece indicar a influencia da relação concentração por tipo de microbiota predominante. Da mesma forma indica existência de fator (es) limitante (s) e/ou interferência (s) independentemente da classificação por tipo, no que se refere à concentração da carga bacteriana da matéria prima, via condições da produção. Em face de tais diagnósticos e procurando entender a influencia da qualidade da matéria prima na correlação entre os três métodos AC, PCATTC e PCA sobre as amostras analisadas, embora com um número muito reduzido de repetições (Tabela 24), fez-se o mesmo estudo da correlação por tipo de leite, entre os 3 métodos (Tabela 25). Tratando-se da maior média de resultado obtido, cada tipo de leite demonstrou uma singularidade própria da capacidade de detecção por método, com respectiva correlação e dispersão dos dados (Figuras 15). Os resultados empregados nas comparações dos métodos, em sua grande maioria, apresentaram 113 diferença estatística significativa (p >0,05), exceto para AC/PCATTC em LPA e LPI. Tabela 24 – Resultados estatísticos por tipo de leite das contagens de microorganismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODO 2 Tipo n. x s S AC PCA TTC PCA LPA 12 12 12 1,6697 1,6578 1,8031 0,2017 0,2417 0,2667 0,0407 0,0584 0,0711 AC PCA TTC PCA LPI 5 5 5 2,4196 2,4042 2,4720 0,1943 0,8839 0,2927 0,0377 0,7812 0,0857 AC PCA TTC PCA LPP 8 7 7 2,3576 1,9768 2,6791 0,5558 0,5037 0,5004 0,3089 0,2538 0,2504 2: MAM: Micro-organismos aeróbios mesofilos/ n.: número de amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S Variância média/ PCA: Agar Padrão/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm TM AC/LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. Tabela 25 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por tipo de leite. MÉTODOS PCATTC / AC PCA/ AC PCA / PCATTC PCATTC / AC PCA/ AC PCA / PCATTC PCATTC / AC PCA/ AC PCA / PCATTC TIPO LPA LPI LPP n. r r 2 p t a b S 2 12 12 12 5 5 5 0,7638 0,4699 0,4877 0,9564 0,6427 0,7782 0,5834 0,2208 0,2378 0,9146 0,4130 0,6056 0,00 0,12 0,11 0,00 0,24 0,12 3,7420 1,6835 1,7664 5,6703 1,4529 2,1462 0,6373 0,3554 0,4420 0,2102 0,4265 2,3497 0,6132 1,0288 0,8607 1,9142 1,3652 -3,4040 0,0470 0,0581 0,0675 0,3641 0,0556 0,3866 7 7 6 0,6207 0,6745 0,3027 0,3853 0,4549 0,0916 0,13 0,09 0,56 1,7703 2,0431 0,6352 0,4645 0,6841 0,3348 1,2864 0,6298 1,1496 0,1967 0,2471 0,3301 2 MAM: micro-organismos aeróbios mesófilos/ n.: número de amostras/ r: coeficiente de correlação/ r : coeficiente de 2: TM determinação/ t: valor de t / a: inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão/ LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. LPA obteve uma maior média de contagem no método PCA (1,8031 log10 UFC/mL), seguido de resultados semelhante para AC (1,6697 log10 UFC/mL) e PCATTC (1,6578 log10 UFC/mL). Melhor correlação, mesmo que regular, foi obtida por AC/PCATTC (r: 0,7638); acompanhada de correlações fracas para AC/PCA (r: 0,4699) e PCA/PCATTC (r: 0,4877). Em todos os estudos de LPA, os parâmetros estatísticos (a e b) apresentaram índices classificados como regular e fraca (Figura 15). Para LPA, as correlações com PCA indicam o problema de recuperação dos outros 2 métodos. Os valores encontrados enfatizam a hipótese da interferência e/ou influencia do TTC (não redução ou lenta capacidade de redução), 114 ser em função do tipo de microbiota presente na matéria prima (FREITAS; CARVALHO; NERO, 2009; NERO et al., 2002), oriundas das condições sanitárias do rebanho, higiênicas ambientais da sala de ordenha e da higienização das instalações (HUCK et al., 2007; HUCK; BOOR, 2006; VILLAR, et al., 1996). Em LPP, novamente maior média foi evidenciada por PCA (2,6791 log10 UFC/mL) seguida por AC (2,3576 log10 UFC/mL) e menor média para PCATTC (1,9768 log10 UFC/mL). Foram encontradas correlações classificadas como do tipo regular para AC/PCA (r: 0,6745) e AC/PCATTC (r: 0,6207) e ausência de correlação para PCA/PCATTC (r: 0,3027), acrescidos dos parâmetros a e b, considerados como de nível regular e fraco (Figura15). Para essas amostras, AC pareceu ter uma melhor capacidade de recuperação frente PCATTC, e de forma intermediara entre os métodos. A correlação entre PCA/PCATTC reforça o fato, quando demonstra “não existir” correlação. Contagem MAM - Leite Pasteurizado Tipo A (AC/PCA TTC ) Contagem MAM - Leite Pasteurizado Integral (AC/PCA TTC ) 2,0 Contagem MAM - Leite Pasteurizado Padronizado (AC/PCA TTC ) 3,8 3,6 3,6 3,4 AC = 0,61321 + 0,63729 * PCA TTC r = 0,76380 n = 12 p < 0,05 1,2 AC (log10 UFC/mL) 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 TM 2,2 2,0 Petrifilm AC (log10 UFC/mL) 1,4 Petrifilm Petrifilm TM 1,6 TM AC (log10 UFC/mL) 3,4 1,8 AC = 1,9142 + 0,21023 * PCA TTC 1,8 r = 0,95638 n=5 p < 0,05 1,6 1,4 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 3,6 3,6 3,4 AC (log10 UFC/mL) 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 AC= 1,3652 + 0,42655 * PCA r = 0,64267 n=5 p > 0,05 1,6 1,4 1,2 2,0 1,0 1,0 2,2 1,2 1,4 1,6 1,8 PCA (log10 UFC/mL) 1,6 1,8 2,0 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 2,2 3,0 3,2 3,2 2,8 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,4 3,6 3,4 3,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 3,4 3,6 1,4 1,4 3,8 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 PCA (log10 UF/mL) Contagem MAM - Leite Pasteurizado Padronizado (PCA/PCA TTC ) 3,8 3,6 3,6 2,0 2,6 2,6 Contagem MAM - Leite Pasteurizado Integral (AC/PCA) 2,1 2,4 AC = 0,62981 + 0,68409 * PCA r = 0,67453 n=7 p > 0,05 3,0 PCA (log10 UFC/mL) Contagem MAM - Leite Pasteurizado Tipo A (PCA/PCA TTC ) 3,4 1,8 1,7 1,5 1,4 PCA TTC = 0,86075 + 0,44202 * PCA r = 0,48766 n = 12 p > 0,05 1,3 1,2 1,4 1,6 1,8 PCA (log10 UFC/mL) 3,2 3,0 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 AC= 1,3652 + 0,42655 * PCA r = 0,64267 n=5 p > 0,05 1,6 1,4 1,2 1,1 1,2 PETRIFILM TM 1,6 3,2 PCA TTC (log10 UFC/mL) AC (log10 UFC/mL) 3,4 1,9 PCA TTC (log10 UFC/mL) 2,0 PCA TTC (log10 UFC/mL) TM PETRIFILM PETRIFILM AC= 1,0288 + 0,35541 * PCA r = 0,46995 n = 12 p > 0,05 1,8 2,2 Contagem MAM - Leite Pasteurizado Padronizado (AC/PCA) PETRIFILM AC (log10 UFC/mL) TM 1,6 TM AC (log10 UFC/mL) 1,8 1,6 2,4 1,4 1,4 3,8 3,4 1,4 r = 0,62071 n=7 p > 0,05 Contagem MAM - Leite Pasteurizado Integral (AC/PCA) 2,0 1,2 AC = 1,2864 + 0,46453 * PCA TTC 2,6 PCA TTC (log10 UFC/mL) Contagem MAM - Leite Pasteurizado Tipo A (AC/PCA) 1,2 2,8 1,6 1,2 PCA TTC (log10 UFC/mL) 1,4 3,0 1,8 1,2 1,0 1,0 3,2 2,0 2,2 1,0 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 PCA (log10 UFC/mL) 3,0 3,2 3,4 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 PCA TTC = 1,1496 + 0,33485 * PCA r = 0,30272 n=6 p > 0,05 1,8 1,6 3,6 3,8 1,4 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 PCA (log10 UFC/mL) Figura 15: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos, por tipo de leite, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) 115 Também em LPI maior média foi obtida por PCA (2,4720 log10 UFC/mL) e médias análogas para os métodos PCA e AC (2,4196 log10 UFC/mL) e (2,4042 log10 UFC/mL). O PCATTC maior valor para s e S2, em função do grande intervalo entre os resultados. No estudo de comparação dor resultados de LPI (Figura 15), ótima correlação foi obtida para AC/PCATTC (r: 0,9564) e correlações regulares para PCA/PCATTC (r: 0,7638) e AC/PCA (r: 0,6427). Um efeito “mediador” parece ser assumido por AC. Considerando-se que o requisito microbiológico para contagem de micro-organimos aeróbios mesófilos (MAM) da matéria prima são os mesmos para LPI e LPP, no que tange a concentração, assim como aqueles descritos para o beneficiamento e produto acabado, e dessa forma independem da denominação comercial do LP, em função disto, a análise dos diagnósticos de correlação encontrados pode levar há um incrementando da hipótese da influência do TTC. Estando está influencia relacionada com microbiota bacteriana da matéria prima (carga e tipo), frente à capacidade de redução do corante e/ou o grau de inibição deste (BOU-CHARA; OHARA, 2003; GRABIELSON et al., 2002; GINN, et al., 1984; ZIMBRO et al., 2009). Porém, também pode existir a interferência de outros fatores inerentes às condições do beneficiamento e processamento de cada planta (CHAMBERS, 2002; HUCK; SONNEN; BOOR, 2008; NERO; BELOTI; BARROS, 2000; RANIERI, et al., 2009; SILVA, et al., 2009b; WHITE, 1993); que acarretam situações distintas. Neste instante, analisando o conjunto de informações obtidas pelos diagnósticos das correlações por tipo de LP, as seguintes situações chamam atenção para a interpretação dos resultados: O método PCA apresenta a maior média de resultado, confirmando a sua melhor capacidade de recuperação, quando comparado com os outros métodos. O diagnóstico da correlação regular é mantido para o AC/PCATTC em LPA e LPP; para LPI assume situação singular; passando de correlação regular para correlação ótima, em relação aos resultados das amostras de cada comparação. 116 Na presença do PCA, as correlações deixam de existir (correlação fraca), quando se faz a comparação entre AC e PCATTC. A somatória desses fatos aponta incisivamente para a existência de interferência (s) comum (uns) entre AC e PCATTC, que somente é revelada na presença do PCA. Ou seja, AC e PCATTC “arrastam” ou “encobrem” um “problema comum” nos resultados. Salvo melhor juízo, os diagnósticos encontrados e acima descritos, podem nortear a possibilidade da singularidade intrínseca a cada tipo de leite com seu beneficiado e da possível influencia dos fatores relacionado aos processamentos empregados, alem daqueles ligados a qualidade microbiológica da matéria prima. O fato é que cada planta industrial possui condições próprias em etapas relacionadas com a matéria prima (produção, captação e estocagem da matéria prima); com o beneficiamento e com o produto acabado (armazenagem e distribuição). Neste trabalho, as amostras são oriundas de 6 plantas industriais: 2 Granjas Leiteira (LPA) e 4 Usinas de Beneficiamento (LPI e LPP) e dessa forma , podem apresentar diferentes características ao longo de toda a cadeia produtiva. Na busca de verificar o possível reflexo das características inerentes aos laticínios, sobre os diagnósticos das correlações entre AC/PCATTC, fez-se o estudo por planta industrial (n =4), assim codificada: Granjas Leiteiras: Plantas X e Y; Usinas de Beneficiamento plantas Z e planta W (Tabela 26 e 27). Tabela 26 – Resultados estatísticos por planta industrial das contagens de microorganismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODO 2 PLANTA n. x s S TIPO AC PCATTC X 18 18 1,6843 1,6223 0,2120 0,2592 0,0450 0,0672 LPA AC PCATTC Y 6 6 1,4537 1,3490 0,2162 0,2919 0,0467 0,0852 LPA AC PCATTC Z 27 27 1,9352 1,8857 0,4268 0,5523 0,1821 0,3050 LPP LPI AC PCATTC W 7 7 2,1154 1,8704 0,3574 0,5354 0,1277 0,2867 2: LPI MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ n.: número de amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S Variância média/ PCATTC: TM Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão/ LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. 117 Tabela 27 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por planta industrial n. r r2 p t a b S2 PCATTC / AC PLANTA X 18 0,5683 0,3229 0,00 2,7626 0,4648 0,9301 0,0550 TIPO LPA PCATTC / AC Y 6 0,7843 0,6152 0,06 2,5288 0,5807 0,6703 0,0630 LPA PCATTC / AC Z 27 0,7454 0,5556 0,00 5,5900 0,5759 0,8491 0,2396 LP* PCATTC / AC W 7 0,4953 0,2453 0,25 1,2748 0,3306 1,4971 0,2074 LPI MÉTODOS 2 MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ n.: número de amostras/ r: coeficiente de correlação/ r : coeficiente de 2: TM determinação/ t: valor de t / a: inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão/ LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LP*: Leite Pasteurizado Integral/ Integral e Leite Pasteurizado Padronizado/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaX (AC/PCATTC ) Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaY (AC/PCATTC ) 2,1 1,8 AC = 0,93017 + 0,46484 * PCA TTC r = 0,56830 n = 18 p < 0,05 1,9 1,7 PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 2,0 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 AC = 0,67028 + 0,58072 * PCATTC r = 0,78435 n=6 p > 0,05 1,6 1,5 1,4 1,3 1,3 1,2 1,2 1,1 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 1,1 0,8 2,2 0,9 1,0 1,1 PCATTC (log 10 UFC/mL) 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 2,8 2,8 2,6 2,6 PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 1,3 Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaW (AC/PCATTC ) Contagem MAM - Leites Pasteurizados Planta Z (AC/PCATTC ) 3,0 2,4 2,2 2,0 AC = 0,84913 + 0,57595 * PCATTC r = 0,74537 n = 27 p < 0,05 1,8 1,6 2,4 2,2 AC = 1,4971 + 0,33059 * PCATTC r = 0,49530 n=7 p > 0,05 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 0,8 1,2 PCATTC (log 10 UFC/mL) 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 PCATTC (log 10 UFC/mL) 1,4 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 PCATTC (log 10 UFC/mL) Figura 16: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos, por planta industrial, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) Considerando-se o valor de r obtido na comparação entre AC/PCATTC (Figura 16), apenas para planta Y (r: 0,7843) e planta Z (r: 0,7454) foi encontrada correlação com nível regular, não ocorrendo diferença estatística significativa (p<0,05). Para a planta X (r: 0,5683) e W (r: 0,4953) pode-se dizer que não ocorreu correlação entre os métodos. 118 Quando os dados das enumerações são separados por planta processadora, o número da amostragem torna-se ainda mais reduzido, ou seja, o conjunto sofre novo fracionamento. Todavia, na tentativa de visualizar as situações específicas de cada planta, “desconsiderou-se” o peso do fracionamento e pensando que o diagnóstico obtido venha somar ou confirmar a existência de fatores limitantes possivelmente relacionados ao beneficiamento industrial. Tabela 28 – Resultados estatísticos por planta industrial das contagens de microorganismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODO 2 PLANTA n. x s S TIPO AC PCA TTC PCA X 7 7 7 1,7843 1,8063 1,8546 0,1194 0,1585 0,1975 0,0143 0,0251 0,0390 LPA AC PCA TTC PCA Y 5 5 5 1,5092 1,4498 1,7310 0,1878 0,1742 0,3548 0,0353 0,0303 0,1259 LPA AC PCA TTC PCA Z 7 7 7 2,3036 2,2381 2,3521 0,2760 0,7754 0,3209 0,0762 0,6013 0,1030 AC PCA TTC PCA W 5 5 5 2,6422 2,1212 2,9298 0,4771 0,5787 0,3080 0,2276 0,3349 0,0949 LPI LPP LPP 2: MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ n.: número de amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S Variância média/ PCATTC: TM Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão/ LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. Tabela 29 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por planta industrial MÉTODOS PLANTA n. r r 2 p t a b S 2 7 7 7 5 5 5 0,3874 0,4701 0,5745 0,6079 0,4213 0,4425 0,1500 0,2210 0,3301 0,3696 0,1775 0,1957 0,39 0,28 0,17 0,27 0,47 0,45 0,9395 1,1911 1,5696 1,3263 0,8047 2,7620 0,2919 0,2843 0,4609 0,6555 0,2230 0,2172 1,2568 1,2570 0,9514 0,5587 1,1231 1,0738 0,0180 0,0260 0,0302 0,0300 0,0853 0,0910 PCATTC / AC PCA / AC PCA / PCATTC X PCATTC / AC PCA / AC PCA / PCATTC Y PCATTC / AC PCA / AC PCA / PCATTC Z 7 7 7 0,7772 0,8099 0,7743 0,6041 0,6559 0,5995 0,00 0,00 0,00 2,7621 3,0874 2,7358 0,2766 0,6965 1,8712 1,6840 0,6652 -0,216 0,3138 0,0830 0,3285 PCATTC / AC PCA / AC PCA / PCATTC W 5 5 5 0,3563 0,3389 0,1239 0,1269 0,1149 0,0150 0,55 0,58 0,84 0,6604 0,5768 0,2163 0,2937 0,5250 0,2328 2,0192 1,1040 1,4390 0,3254 0,1663 0,3726 TIPO LPA LPA LPI LPP LPP 2 MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ n.: número de amostras/ r: coeficiente de correlação/ r : coeficiente de 2: TM determinação/ t: valor de t / a: inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão/ LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. Assim, o mesmo raciocínio foi empregado com os dados obtidos nas 3 enumerações (métodos AC; PCATTC e PCA) e os resultados (Tabela 28) 119 empregados para obtenção do diagnóstico da correlação (Tabela 29). Na separação dos valores de MAM por planta, é possível verificar que as maiores médias foram obtidas pelo método PCA (Tabela 28), confirmando os diagnósticos anteriores da existência de um ou mais fatores limitantes para o método AC e PCATTC. Apenas para a planta Z o valor de AC e PCATTC foram próximo do encontrado por PCA, não apresentado diferença estatística significante (p< 0,05). Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaY ( AC/PCATTC ) Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaX (AC/PCATTC ) 1,8 2,00 1,95 1,85 AC = 1,2569 + 0,29198 * PCATTC r = 0,38736 n=7 p > 0,05 1,6 AC PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 1,7 1,90 1,80 1,5 AC = 0,55878 + 0,65556 * PCA TTC r = 0,60796 n=5 p > 0,05 1,75 1,4 1,70 1,3 1,65 1,60 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 1,2 1,1 2,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 PCATTC PCATTC (log10 UFC/mL) Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaX (AC/PCA) Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaY (AC/PCA) 2,00 1,8 1,95 1,85 1,80 PetrifilmTM AC (log 10Ufc/mL) PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 1,7 1,90 AC = 1,2570 + 0,28431 * PCA r = 0,47014 n=7 p > 0,05 1,75 1,70 1,6 1,5 AC = 1,1231 + 0,22302 * PCA r = 0,42136 n=5 p > 0,05 1,4 1,3 1,65 1,60 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 1,2 1,2 2,1 1,3 1,4 1,5 2,0 1,7 1,9 1,6 1,8 1,7 PCATTC = 0,95140 + 0,46096 * PCA r = 0,57455 n=7 p > 0,05 1,5 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 PCA (log10 UFC/mL) 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaY (PCA/PCATTC ) 1,8 PCATTC (log 10 UFC/mL) PCATTC (log 10 UFC/mL) Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaX (PCATTC /PCA) 2,1 1,6 1,6 PCA (log10 UFC/mL) PCA (log10 UFC/mL) 1,9 2,0 1,5 1,4 PCATTC = 1,0738 + 0,21720 * PCA r = 0,44249 n=5 p > 0,05 1,3 1,2 2,1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 PCA (log10 UFC/mL) Figura 17: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das plantas X e Y, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) 120 Analisando-se as correlações obtidas (Figura 17 e 18), a condição limitante torna-se ainda mais forte. Na maioria dos casos, foi detectada a não existência de correlação, onde 58,33% foram classificadas como fraca ou ruim. Com relevância para a planta W (100% r fraca) seguida pelas plantas X e Y, onde 2 das 3 correlações foram assim classificadas. Contagem MAM - Leites Pasteurizados Planta Z (AC/PCATTC ) Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaW (AC/PCATTC ) 2,7 3,6 3,4 2,5 PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 2,6 2,4 2,3 2,2 2,1 AC = 1,6845 + 0,27659 * PCATTC r = 0,77723 n=7 p < 0,05 2,0 1,9 3,0 AC = 2,0192 + 0,29371 * PCATTC r = 0,35627 n=5 p > 0,05 2,8 2,6 2,4 2,2 1,8 1,7 1,0 3,2 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 2,0 1,4 3,8 1,6 1,8 PCATTC (log 10 UFC/mL) Contagem MAM - Leites Pasteurizados PlantaZ (AC/PCA) 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaW (AC/PCA) 3,6 2,6 3,4 PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 2,5 PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 2,2 PCATTC (log 10 UFC/mL) 2,7 2,4 2,3 2,2 2,1 AC = 0,66520 + 0,69654 * PCA r = 0,80990 n=7 p < 0,05 2,0 1,9 3,2 3,0 AC = 1,1040 + 0,52500 * PCA r = 0,33895 n=5 p > 0,05 2,8 2,6 2,4 2,2 1,8 1,7 1,9 2,0 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,0 2,5 2,8 2,6 2,7 PCA (log 10 UFC/mL) 2,8 2,9 3,0 3,1 3,2 3,3 3,2 3,3 PCA (log10 UFC/mL) Contagem MAM - Leite Pasteurizado PlantaW (PCA/PCATTC ) Contagem MAM - Leites Pasteurizados PlantaZ (PCA/PCATTC ) 3,2 3,8 3,6 PCATTC (log 10 UFC/mL) 3,2 3,0 3,0 PCATTC = -2,163 + 1,8712 * PCA r = 0,77428 n=7 p < 0,05 2,8 PCATTC (log 10 UFC/mL) 3,4 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 PCATTC = 1,4390 + 0,23285 * PCA r = 0,12393 n=5 p >0,05 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,6 1,2 1,0 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4 PCA (log10 UFC/mL) 2,5 2,6 2,7 2,8 1,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3,0 3,1 PCA (log10 UFC/mL) Figura 18: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das plantas Z e W, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) 121 Correlação regular foi obtida em 33,3% das comparações, envolvendo resultados de 2 plantas. Para a planta X em PCA/PCATTC (r: 0,5745) e planta Y AC/PCATTC (r: 0,6079). Exceção foi obtida para planta Z, cujo diagnóstico evidenciou uma boa correlação entre AC/PCA (r: 0,8099), acompanhado de correlação regular entre AC/PCATTC (r: 0,7772) e PCA/PCATTC (r: 0,7743). Vale lembrar que a referida planta, possui 100% da matéria prima resfriada, granelizada, termizada e bactofugada no momento da recepção do leite. Os processamentos da bactofugação e termização reduzem a carga bacteriana e geram uma seleção do tipo de microbiota predominante (MORENO; VIALTA; VALLE, 2006; NORNBERG, et al., 2010; SPREER,1991; WALSTRA, et al., 2001), antes mesmo do processo de pasteurização, podendo de certa forma ter influenciado nos resultados obtidos nas amostras de LP da planta Z, que emprega esses processos como etapa de pré beneficiamento da matéria prima. Em todas as correlações os parâmetros a e b, independente do valor de r obtido, demonstraram a situação frágil das correlações. O diagnóstico encontrado não deve ser invalidado em sua totalidade, pelo número reduzido de amostras, uma vez que colabora com a (s) hipótese (s) da interferência estar correlacionada com as condições microbiológicas da matéria prima (concentração e tipo de microbiota predominante) e características tecnológicas de cada planta (processamentos e condições logísticas). Vindo ao encontro do diagnóstico obtido por outros estudos que evidenciaram que a microbiota presente no LP não podia ser detectada em sua totalidade pelo método AC (BELOTI, 2002; NERO et al. 2002; FREITAS; NERO; CARVALHO, 2009) e do fato do TTC poder interferir nos resultados (SANT`ANA; CONCEIÇÃO; AZEREDO, 2003). Entende-se que o desempenho de um método rápido também pode sofrer influencias das características intrínsecas do alimento, da microbiota predominante e da presença de substancias e/ou constituintes que possam interferir na obtenção dos resultados (DAWKINS; HOLLINGSWHORTH; HAMILTON,2005; FRANCO, 1994; TAVOLARO et al., 2005); bem como das condições regionais (FRANCO, 1994; FROMM; BOOR, 2004; HUCK, et al., 2007; WHITE, 1993). Evidencias também demonstram que as estruturas e funções celulares podem sofrer interferências de acordo com as condições de crescimento presentes no meio e no ambiente. Bem como, são também afetadas a 122 susceptibilidade ás injurias térmicas sofridas e a respectiva capacidade de recuperação (BUSTA, 1979 e WESCHE et al., 2009 apud in SOLA, 2009). Os resultados obtidos pelas amostras de LP na determinação do atendimento dos requisitos de qualidade da IN 51/2002 e do estudo da correlação confirmam as influencia das condições da matéria prima (produção, captação e pré beneficiamento) condições do processamento e da logística na distribuição do produto acabado (CHAMBERS, 2002; RANIERI, et al., 2009; WHITE, 1993). Neste momento torna-se ainda mais evidente a necessidade do conhecimento específico e inerente ao regionalismo da cadeia produtiva do leite, com intensidade pronunciada sobre aqueles destinados ao estudo da correlação para implantação de uma metodologia microbiológica. Em face dos diagnósticos encontrados, outro fator preponderante a eficiência de metodologias microbiológicas, consiste das conseqüências do tratamento térmico do alimento frente sua microbiota, uma vez que o conhecimento do efeito da injúria térmica sobre o desempenho dos métodos rápidos ainda não encontra-se totalmente esclarecido. (BELOTI, et al., 1999; BLACKBURN; BAYLIS; PETITT, 1996; FERRATI et al., 2005). Sabe-se que a maioria dos laticínios concentra as análises microbiológicas ao longo do período produtivo, ou seja, monitoram as condições do processo e do produto acabado no mesmo dia do beneficiamento/produção. O intervalo entre o término do processamento e o momento da realização da análise microbiológica, pode ser uma forma de verificar o possível efeito do estresse térmico sobre a viabilidade bacteriana e respectiva capacidade de recuperação de um método microbiológico. Visando apurar as condições acima descritas, fez-se a separação dos dados por tempo de intervalo processo/análise, obtendo-se 3 grupos de resultados: análise no mesmo dia do processamento (t1:0h); no 1º dia posterior ao processamento (t2:24h) e no 2º dia pos beneficiamento (t3:48h). As médias dos resultados de cada grupo (Tabela 30) foram empregadas para obtenção da correlação de cada um dos intervalos de tempo, entre o processamento e o momento da análise (Tabela 31) e respectiva dispersão dos dados (Figura 19). 123 Tabela 30 – Resultados estatísticos por intervalo de tempo das contagens de microorganismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) th n. x s S2 AC PCATTC 0 0 24 24 6 6 34 34 1,6362 1,6838 1,8468 1,7945 0,2192 0,1647 0,3817 0,5247 0,0480 0,0271 0,1457 0,2753 AC PCATTC 48 48 22 22 1,8403 1,6680 0,4033 0,4476 0,1627 0,2003 MÉTODO AC PCATTC LP: Leites Pasteurizados/ MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ th: intervalo entre produção e analise/ n.: número de 2: TM amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S Variância média/ AC: Petrifilm AC/ PCATTC: Agar Padrão com TTC. Tabela 31 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por intervalo de tempo MÉTODOS PCATTC / AC PCATTC / AC PCATTC / AC th n. r r 2 p t a b S 2 0 24 48 6 34 22 0,6127 0,7494 0,7412 0,3753 0,5616 0,5494 0,19 0,00 0,00 1,5500 6,4030 4,9385 0,8154 0,5452 0,6679 0,2631 0,8684 0,7261 0,0350 0,2081 0,1848 MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ th: intervalo entre produção e analise/ n.: número de am ostras/ r: coeficiente de 2 2: correlação/ r : coeficiente de determinação/ t: valor de t / a: inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar TM Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC. O estudo permitiu a visualização de médias próximas em t1, para AC e PCATTC, respectivamente 1,6362 e 1,6838 log10 UFC/mL, embora com diferença estatística significativa (p<0,05). Maior média foi obtida pelo método AC em t2 (1,8468 log10 UFC/mL) e em t3, (1,8403 log10 UFC/mL) frente os resultados de PCATTC em t2 (1,7945 log10 UFC/mL) e em t3, (1,6680 log10 UFC/mL), e não apresentaram diferença estatística significativa (p<0,05). Esses resultados levaram a configuração da correlação regular (Figura 19) para todos os períodos, como menor valor para em t1 (r: 0,6127), sendo importante salientar que t1 é constituindo apenas por amostras de LPA, com baixa carga bacteriana. Para os outros dois intervalos AC/PCATTC apresentou valor de correlação semelhante em t2 (r: 0,7494) e em t 3 (r: 0,7412). Todas as correlações apresentaram valor frágil para os parâmetros estatísticos (a e b). 124 Contagem MAM- Leite Pasteurizados (AC/PCATTC- t1:0h) 2,1 AC = 0,26312 + 0,81543 * PCA TTC r = 0,61267 n=6 p > 0,05 Petrifilm TM AC (log10 UFC/mL) 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,45 1,50 1,55 1,60 1,65 1,70 1,75 1,80 1,85 1,90 PCATTC (log10 UFC/mL) Contagem MAM - Leites Pasteurizados (AC/PCA TTC- t2:24h) 3,0 2,8 Petrifilm TM AC (log10 UFC/mL) 2,6 2,4 AC = 0,86843 + 0,54520 * PCA TTC r = 0,74942 n = 34 p < 0,05 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 PCATTC (log10 UFC/mL) Contagem MAM - Leites Pasteurizados (AC/PCATTC- t3:48h) 3,0 2,8 Petrifilm TM AC (log10 UFC/mL) 2,6 2,4 AC = 0,72614 + 0,66795 * PCA TTC r = 0,74124 n = 22 p < 0,05 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 PCATTC (log10 UFC/mL) Figura 19: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos por intervalos de tempo (t1:0h, t2:24h e t3:48h), das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) 125 O mesmo raciocínio de tempo foi empregado para os resultados dos métodos AC; PCATTC e PCA (Tabela 32) para obtenção da correlação (Tabela 33). Referindo-se a comparação entre os 3 métodos por tempo, novamente maior média foi obtida pelo PCA nos tempos do estudo (Tabela 32) e em t2 e t3 os valores de AC e PCATTC foram muito próximos, embora diferentes em função de cada tempo. Tabela 32 – Resultados estatísticos por intervalo de tempo das contagens de microorganismos aeróbios mesófilos dos métodos: PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODO AC PCATTC PCA AC PCATTC PCA 2 th n. x s S 24 24 24 48 48 48 14 14 14 6 6 6 2,0684 2,0251 2,2126 1,8960 1,7427 2,0033 0,4286 0,6542 0,4547 0,4586 0,4919 0,5108 0,1837 0,4280 0,2068 0,2104 0,2420 0,2609 LP: Leites Pasteurizados/ MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ th: intervalo entre produção e analise/ n.: número de 2: TM amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S Variância média/ AC: Petrifilm AC/ PCATTC: Agar padrão com TTC/ PCA: Agar Padrão. Tabela 33 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por intervalo de tempo MÉTODOS th n. r r 2 p t a b S 2 PCATTC / AC PCA / AC PCA / PCATTC PCATTC / AC PCA / AC PCA / PCATTC 24 24 24 48 48 48 14 14 14 6 6 6 0,7538 0,8619 0,8169 0,8033 0,8334 0,5479 0,5682 0,7428 0,6774 0,6452 0,6945 0,3002 0,00 0,00 0,00 0,05 0,03 0,26 3,9737 5,8839 4,9071 2,6971 3,0158 1,3100 0,4938 0,8123 1,1753 0,7488 0,7483 0,5277 1,0684 0,2708 -0,5756 0,5909 0,3968 0,6854 0,2845 0,1865 0,3035 0,2120 0,2173 0,2471 MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ th: intervalo entre produção e analise/ n.: número de am ostras/ r: coeficiente de 2 2: correlação/ r : coeficiente de determinação/ t: valor de t / a: inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar TM Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão. O diagnostico encontrado para as comparações entre os métodos (Figura 20), demonstrou ser diferente daqueles obtidos até o momento. Boa correlação foi encontrada para AC/PCA em t2 (r: 0,8619) e t3 (r: 0,8334), sendo acompanhadas de bons parâmetros estatísticos de a e b em t2. Também foi obtida uma boa correlação para PCA/PCATTC no período t2 (r: 0,8169) e para AC/PCATTC em t3 (r: 0,8033), seguidas bom valor para os parâmetros a e b. Em contra partida, foi encontrada correlação regular para AC/PCATTC em t2 (r: 0,7538) e correlação fraca para PCA/PCATTC em t3 (r: 0,5479). 126 Contagem MAM - Leites Pasteurizados (AC/PCATTC - t3 :48h) 2,8 2,8 2,6 2,6 PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) Contagem MAM - Leites Pasteurizados (AC/PCATTC - t2:24h) 3,0 2,4 2,2 2,0 AC = 1,0684 + 0,49380 * PCA TTC r = 0,75379 n = 14 p < 0,05 1,8 1,6 2,2 2,0 1,8 AC = 0,59095 + 0,74888 * PCA TTC r = 0,80325 n=6 p > 0,05 1,6 1,4 1,4 1,2 1,0 2,4 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 1,2 1,2 3,8 1,4 1,6 Contagem MAM Leites Pasteurizados (AC/PCA - t2 : 24h) PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 2,4 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 AC = 0,27088 + 0,81237 * PCA r = 0,86191 n = 14 p < 0,05 1,6 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 2,8 2,6 2,8 2,6 2,8 2,2 2,0 1,8 1,6 1,2 1,2 3,4 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 PCA (log10 UFC/mL) Contagem MAM - Leites Pasteurizados (PCA/PCATTC - t2:24h) Contagem MAM - Leites Pasteurizados (PCA/PCATTC - t3 :48h) 2,8 3,8 3,6 PCATTC = 0,68544 + 0,52774 * PCA r = 0,54795 n=6 p > 0,05 2,6 PCATTC = - 0,5757 + 1,1754 * PCA r = 0,81695 n = 14 p < 0,05 2,4 PCATTC (log 10 UFC/mL) PCATTC (log 10 UFC/mL) 2,6 AC = 0,39688 + 0,74831 * PCA r = 0,83339 n=6 p < 0,05 PCA (log10 UFC/mL) 3,0 2,4 1,4 1,4 3,2 2,2 2,6 2,8 3,4 2,0 Contagem MAM - Leites Pasteurizados (AC/ PCA - t3 :48h) 3,0 1,2 1,4 1,8 PCATTC (log 10 UFC/mL) PCATTC (log 10 UFC/mL) 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 2,2 2,0 1,8 1,6 1,6 1,4 1,4 1,2 1,0 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 PCA (log10 UFC/mL) 2,8 3,0 3,2 3,4 1,2 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 PCA (log10 UFC/mL) Figura 20: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das .contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos por intervalo de tempo (t2: 24h e .t3:48h), das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – .novembro de 2010) Embora os intervalos apresentem número reduzido de repetições e considerando que o resultado do PCA foi capaz de recuperar todas as células presentes, os diagnósticos encontrados (para as amostras deste estudo) parecem indicar a interferência do período da realização da análise, quando do emprego dos métodos AC e PCATTC. A microbiota não redutora ou com “lenta” capacidade de redução presente no LP pode também ter interferido neste diagnóstico, porém, parece que o desempenho dos métodos demonstra a influencia do tempo de recuperação da 127 viabilidade celular pós tratamento térmico, seja pelo estresse térmico ou pelo próprio tempo de geração de cada micro-organismo. Estudando a correlação do AC para enumeração de MAM em leite pasteurizado (integral e desnatado) armazenado sob refrigeração (6,1ºC), Senyk, et al. (1987) encontraram diferente valor de correlação em função do período da analise. Para o intervalo de analise pós envase (t0: 0h) foi encontrado o menor valor de correlação (r: 0,78) quando comparada dos demais tempos de estudo sob refrigeração: 7dias (r: 0,98); 10dias (r: 0,99) e 14dias (r: 0,99). Os autores descrevem que a diferenças nas contagens (consequentemente no r) tenha uma possível influencia da injúria térmica sobre a carga bacteriana. E ressaltam que o método tradicional (PCA) apresenta melhor capacidade de reversão da injúria e/ou melhor, capacidade de permitir a recuperação da viabilidade bacteriana. Byrne; Bishop (1991, apud in Blackurn; Baylis; Petitt, 1996) em estudo de enumeração de TER em leite cru; encontraram um menor número de colônias em algumas placas do AC e descreveram o emprego de uma etapa de pré incubação das amostras 4h a temperatura ambiente, como forma de permitir a recuperação da viabilidade e minimizar o efeito do estresse causado pelo tratamento térmico da metodologia (tratamento térmico das amostras antes da enumeração). Outros estudos também correlacionam os resultados de análises microbiológicas com a capacidade do meio de cultura, ser capaz de permitir a recuperação das bactérias injuriadas (ALMEIDA, 2006; SOLA, 2009; WU, 2008) bem como, com variações dos resultados ao longo do TVU. Alguns desses estudos relacionando a variação da concentração ao longo do TVU com a qualidade da matéria prima, não só com o tipo de microbiota, mas também com capacidade de adaptação do metabolismo para multiplicação nas condições de refrigeração, como o tempo de geração ou de recuperação pós estresse térmico da microbiota remanescente (ALFENAS, 2000; FAGUNDES et al., 2006; FORZYTHE, 2002; SANVIDO, 2007; SOUZA et al., 2009; PEREIRA, 2010). Durante a realização deste estudo, embora com pouca incidência, foi evidenciada a ocorrência de colônias vermelhas “espalhadas” com “aspecto de conter líquido” (Figura 21), fato também referenciado em outros estudos com as placas AC (BLACKURN et al., 1996; DAWKINS; HOLLINGSWORTH; HAMILTON, 2005). 128 Este fenômeno é atribuído à presença de micro-organismos com capacidade de liquefazer o gel que ao se espalhar pode gerar dificuldades e/ou impedir a visualização de outras colônias (3M/BR, 2006; BLACKBURN; BAYLIS; PETITT, 1996). * Figura 21: Placa PetrifilmTM AC - *Colônia gel liquefeito Contagem de micro-organismos mesófilos aeróbios de leite pasteurizado. Em estudo da incidência da liquefação do AC e identificação dos micro-organismos envolvidos, DAWKINS; HOLLINGSWORTH; HAMILTON (2005) reportam que em derivados lácteos, os Bacillus licheniformis e Bacillus subtilis foram responsáveis por 16% da incidência. E enfatizam a razão do conhecimento do tipo de microbiota predominante no alimento, antes do emprego do sistema. No contexto geral, pode-se observar maior freqüência de correlação regular para as comparações realizadas entre as metodologias, visto que os resultados obtidos na maioria das comparações foram computados em conjunto, independentemente das diferentes influencias passíveis de existir nas enumerações. Tais influências podem ser oriundas das características próprias da matéria prima e do produto acabado, como concentração e tipo de microbiota; efeito seletivo do pré beneficiamento; do processamento térmico e das condições da armazenagem. 129 5.8 CORRELAÇÃO PETRIFILMTM AC E MÉTODO TRADICIONAL PARA CONTAGEM DE MICROORGANISMOS TERMODÚRICOS. Por serem capazes de sobreviver ao processo de pasteurização do leite, os micro-organismos termodúricos (TER) são representantes da microbiota do leite cru remanescente do processo térmico da pasteurização. Alguns microrganismos, deste grupo, são possuidores da capacidade de multiplicar a baixas temperaturas e produzir enzimas metabólicas, gerando o comprometimento da qualidade e o TVU do leite pasteurizado (HUCK; SONEN; BOOR, 2008; NORNBERG; TONDO; BRANDELLI, 2009; RANIERI; BOOR, 2009). Desta forma, a enumeração de TER assume importante papel no monitoramento das condições da matéria prima, do beneficiamento e dos processos de higienização dos equipamentos da cadeia produtiva do LP (CHAMBERS, 2002; FRONN; BOOR, 2004; HUCK; SONNEN; BOOR, 2008). Visando diagnosticar o possível emprego das placas PetrifilmTM AC para enumeração de TER em leite pasteurizado, e a possível influencia desta microbiota sobre a contagem de micro-organismos mesófilos aeróbios, foram realizadas análises com 3 metodologias de enumeração. Figura 22: Placa como meio Agar Padrão TTC – Colônias de micro - organismos termodúricos de leite pasteurizado 130 Foram utilizados os métodos: placas PetrifilmTM AC (AC), como o meio Agar Padrão (PCA) e com o meio Agar Padrão adicionado do corante trifeniltetrazólio - TTC (PCATTC) e os resultados empregados para comparação e determinação da respectiva correlação para contagem de TER. Durante da etapa de contagem das placas, foram observadas e registradas as características de coloração das colônias e da presença de halo (tipo e cor). As placas de PCA apresentaram colônias de coloração variando do laranja, creme e branco, com o sem presença de halo (de cor branca ou transparente). Nas placas com o meio PCATTC ocorreu à formação de diferentes tipos de colônias (Figura 22), sendo possível observar varias colorações (vermelha, rosa, nuances de rosa, laranja, creme e branca) e diferentes configurações do arranjo de cor entre o centro e o halo ao redor (centro vermelho com halo rosa, branco ou transparente; centro rosa com halo branco ou transparente e centro branco com halo transparente). Uma freqüência relativamente grande de colônias com halo transparente, foi observada nas placas de PCA (Figura 23) e PCATTC, (Figura 24) principalmente quando do emprego de menor diluição (1:2), onde a maior concentração dos constituintes do leite gerou a coloração branca opaca ao meio, que permitindo a melhor visualização do halo. Figura 23: Placa como meio Agar Padrão – Colonias de micro - organismos termodúricos de leite pasteurizado. 131 Figura 24: Placa como meio Agar Padrão com TTC – Colônias de micro - organismos termodúricos de leite pasteurizado. A formação de halo transparente em meio enriquecido ou suplementado com leite em pó desnatado é utilizada para o diagnóstico de bactérias proteolíticas (HANDENWURCEL, 2004; TEBALDI et al., 2008). Desta forma, a incidências das colônias típicas, pode ser indicativa da presença de TER proteolíticos nas amostras analisadas de LP. Para as placas PetrifilmTM AC, o fator diferencial durante a contagem, foi à presença de colônias rosa de diâmetro muito pequeno (“ponta de alfinete”) e a suspeita da formação de colônias brancas, fatos que causam dificuldades na leitura. Assim como no estudo de MAM, o emprego do contador de colônia permitiu a contagem das placas que apresentavam com diâmetro pequeno e/ ou com nuances de rosa muito claro e das colônias “brancas”. Em muitos casos, a visualização e confirmação dessas colônias (Figura 25) nas placas AC, ocorreu somente após o aumento de 24h no período da incubação, ou seja, leitura das placas após incubação por 72h (valores não considerados no presente estudo). O tempo de 72h de incubação foi sugerido como capaz de melhor permitir a redução do TTC e conseqüente melhor visualização das colônias e/ou leitura, para enumeração de MAM com AC (BLACKBURN;BAYLIS;PETITT; 1996; FREITAS;NERO;CARVALHO, 2009). 132 * Figura 25: Placa PetrifilmTM AC – Colônias de micro - organismos termodúricos de leite pasteurizado. *Colônias “ponta de alfinete”. Algumas metodologias para enumeração de TER, preconizam a etapa de incubação de 30ºC por 72h (BEERENS; LUQUET, 1990; DEMETER, 1969; HAJEDENWURCEL, 1980), ou seja, menor temperatura por maior período em relação ao empregado neste trabalho. Blackburn; Baylis; Petitt (1996) e Freitas; Nero; Carvalho (2009) discursando sobre o fato na enumeração de MAM, reportam que a provável causa encontrava-se na presença de uma microbiota composta por micro-organismos com baixa ou lenta capacidade de redução e sugerem o tempo de incubação 72h, como forma de permitir o desenvolvimento adequado dessas colônias. Em geral a microbiota TER de leite do leite cru, com respectiva incidência no leite pasteurizado é referenciada como constituída por microorganismos dos gêneros Bacillus; Micrococcus; Microbacterium; Mycobacterium; Paenibacillus; Pediococcus; Lactobacillus e por Streptococcus (EDEMA; AKINGBADE, 2007; FROMM; BOOR, 2004; HASSAN; ABDALA; NOUR, 2008; HUCK et al., 2007; RANIERI; BOOR, 2009; RANIERI et al., 2009). Beloti (2000) descreve que em seu estudo, os micrococos mostraram-se bastante sensíveis ao TTC. 133 Byrne; Bishop (1991, apud in BARANCELLI; SARKIS; GALLO, 2004 e FRANCO,1994) relatam um bom crescimento de TER em placas AC, incluindo as espécies Bacillus, Streptococcus, Corynebacterium e Micrococcus. Embora algumas espécies de Micrococcus tenham obtido menor número de colônias no AC (BARANCELLI;SARKIS;GALLO, 2004). A questão resume-se na possibilidade da microbiota presente ter baixa capacidade redutora do TTC, consequentemente não são visualizados e não sendo enumeradas, interferindo na expressão dos resultados. Com relação ao total de colônias encontradas (dados brutos) nas placas do método PCATTC foram contadas 5.221 colônias, assim distribuídas: 2.890 vermelhas (57,1%); 983 rosas e as suas nuances (18,8%) e 1.258 brancas ou creme (24,1%). Nas placas do método AC foram contadas 3.197 colônias, sendo 1.528 com coloração vermelhas (47,8%), 974 rosa e suas nuances (30,5%) e 695 “brancas” (21,7%). Em face da situação descrita, neste estudo, o método PCATTC apresentou maior valor total de enumeração que o método AC, correspondendo a um déficit de 2.024 colônias (- 38,7%) do AC em relação ao PCATTC. Considerando apenas o número total de colônias encontradas na 2º etapa deste estudo (dados brutos), possibilitando a inclusão dos dados obtidos pelo PCA, a distribuição apresenta-se de outra forma. No PCA foi obtido o total de 3.085 colônias, seguido pelo PCATTC com 2.853, correspondendo a um valor menor de 232 (7,5%) não detectadas em relação ao PCA. Quanto à coloração estavam assim distribuídas: 1.123 vermelhas (39,4%); 765 rosas e nuances (26,8%) e 965 brancas (33,8%). Em relação ao PCATTC, nesta etapa, foram contadas 856 colônias vermelhas (48,7%); 288 rosas e nuances (16,4%) e 614 brancas (34,9%), perfazendo o valor de 1.758 colônias. Com déficit de 1.327 colônias (-43,0%) em relação ao PCA e menos 1.095 (- 38,4%) em relação ao PCATTC. Os valores obtidos pré indicaram uma menor capacidade de detecção por parte do método AC, em relação aos métodos PCA e PCATTC, para a enumeração de TER em LP. Assim como no estudo de micro-organismos mesófilos aeróbios, foram feitas laminas com esfregaço de diferentes colônias de TER, para posterior observação morfotinturial e as placas AC foram congeladas para um futuro estudo 134 de morfologia e/ou identificação da microbiota predominante. A partir dos dados de cada uma das metodologias, fez-se o estudo da correlação entre os métodos AC; PCATTC e PCA para enumeração de TER de LP. Os resultados estatísticos das médias das 3 enumerações (Tabela 34) e das comparações entre as metodologias de TER (Tabela 35) demonstram o tipo da correlação e dispersão (Figura 26 e Figura 27). Tabela 34 – Resultados estatísticos das contagens de micro-organismos termodúricos dos métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODO AC PCATTC AC PCA TTC PCA 2 n. x s S 61 61 25 25 22 1,2547 1,3127 1,3135 1,4428 1,5600 0,5022 0,6441 0,5820 0,6595 0,5428 0,2522 0,4149 0,3387 0,4349 0,2946 2: TER: Termodúricos/ n.: número de amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ TM AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão. Tabela 35 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODOS n. r r 2 p t a b S 2 PCATTC / AC PCATTC / AC PCA / AC PCA / PCATTC 61 25 24 23 0,5273 0,6925 0,7089 0,6772 0,2780 0,4795 0,5026 0,4585 0,00 0,00 0,00 0,00 4,7670 4,6036 4,4958 4,1157 0,4111 0,6111 0,7576 0,8022 0,7150 0,4318 0,1615 0,1743 0,3813 0,3832 0,3201 0,3338 2 TER: Termodúricos / n.: número de amostras/ r: coeficiente de correlação/ r : coeficiente de determinação/ t: valor de t / a: 2: TM inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão. Na correlação AC/PCATTC, das 61 amostras de LP, maior média de contagem foi obtida pelo método PCATTC (1,327 log10 UFC/mL), com maior valor para desvio padrão (s) e variância (S2), respectivamente de 0,6441 e 0,4149. Consequentemente, menor contagem foi obtida por AC (1,2547 log10 UFC/mL), acompanhada por menor valor de s (0,5022) e S2 (0,2522), quando comparado com os obtidos por PCATTC, embora não tenha ocorrido diferença estatística significativa (p<0,05) entre as médias dos métodos. A comparação entre AC/PCATTC (Figura 26) apresentou uma correlação regular (r: 0,5273), acompanhada de parâmetros estatísticos fracos para a inclinação (a: 0,4111) e intercepção (b: 0,7150). 135 Contagem TER - Leites Pasteurizados (AC/PCA TTC) 2,6 2,4 Petrifilm TM AC (log10 UFC/mL) 2,2 2,0 AC = 0,71501 + 0,41115 * PCATTC r = 0,52732 n = 61 p < 0,05 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 PCATTC (log10 UFC/mL) Figura 26: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos de 61 amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) Em relação aos resultados dos 3 métodos de enumeração de TER (Tabela 35), observa-se que a maior média de contagem foi obtida pelo método PCA (1,5600 log10 UFC/mL); seguida pelo método PCATTC (1,4428 log10 UFC/mL) e AC (1,3135 log10 UFC/mL), todavia não apresentaram diferença estatísticas significativa (p<0,05) no momento da correlação dos métodos. Os resultados das comparações entre os métodos, AC/PCATTC; AC/PCA e PCA/PCATTC (Tabela 36) apresentaram correlação classificadas como de nível regular, respectivamente com r de: 0,6925; 0,7089 e 0,6772 (Figura 27). Em geral os diagnósticos obtidos até o momento, indicam a existência de interferência (s) que resultam na configuração de correlação do tipo regular, para todas as comparações realizadas. A capacidade de redução do TTC, seja na intensidade e/ou velocidade pode variar entre os diferentes grupos de micro-organismos. Sendo dessa forma, diretamente dependente do tipo da microbiota presente na amostra (BOCHENER; SAVAGEAU, 1977; DAWKINS; HULNGSWORTH; HAMILTON, 2005; NERO et al., 2006; ORTOLANI et al., 2007; TURNER et al., 1963). Neste trabalho foi evidenciado o diagnóstico da qualidade microbiológica dos leites pasteurizados no que tange concentração de termodúricos 136 Contagem TER - Leites Pasteurizados (AC/PCA TTC) 2,6 2,4 Petrifilm TM AC (log10 UFC/mL) 2,2 2,0 AC = 0,43179 + 0,61112 * PCA TTC r = 0,69251 n = 25 p < 0,05 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 PCATTC (log10 UFC/mL) Contagem TER - Leites Pasteurizados (AC/PCA) 2,6 2,4 AC = 0,16151 + 0,75761 * PCA r = 0,70897 n = 22 p < 0,05 Petrifilm TM AC (log10 UFC/mL) 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 2,2 2,4 2,6 2,8 PCA (log10 UFC/mL) Contagem TER - Leites Pasteurizados (PCA/PCA TTC) 2,6 2,4 2,2 PCATTC (log10 UFC/mL) 2,0 1,8 1,6 PCATTC = 0,17435 + 0,80226 * PCA r = 0,67718 n = 22 p < 0,05 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 PCA (log10 UFC/mL) Figura 27: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) 137 e respectiva relação termodúricos na concentração de micro-organismos aeróbios mesófilos (TER/MAM), onde os resultados indicaram uma incidência relevante de termoresistentes nas amostras de LPA (75%), LPI (100%) e LPP (63%). Fato que denota a influencia da qualidade da matéria com os resultados encontrados no produto acabado. Considerando poder existir essa influencia da qualidade da matéria prima (concentração e tipo), bem como, uma possível incidência de TER com baixa capacidade de redução do TTC em função da origem, fez-se a separação dos dados para realizar a comparação entre os métodos por tipo de leite. Os resultados obtidos nas contagens de TER por tipo de leite, foram então empregados para comparação de AC/PCATTC (Tabela 36 e 37). Tabela 36 – Resultados estatísticos por tipo de leite das contagens de microorganismos termodúricos dos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODO Tipo AC PCATTC AC PCATTC AC PCATTC LPA LPI LPP 2 n. x s S 24 24 14 14 0,9222 1,0511 1,4793 1,6024 0,3388 0,4908 0,5803 0,7945 0,1148 0,2409 0,3367 0,6312 23 23 1,4650 1,4094 0,4123 0,6074 0,1700 0,3689 2: TER: Termodúricos/ n.: número de amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ TM AC: Petrifilm AC/LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. Tabela 37 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por tipo de leite. MÉTODOS TIPO n. r r2 p t a b S2 PCATTC / AC PCATTC / AC LPA 24 -0,2774 0,0769 0,19 -1,3540 -0,1915 1,1235 0,1783 LPI 14 0,7214 0,5203 0,00 3,6081 0,5268 0,6350 0,4700 PCATTC / AC LPP 23 0,6364 0,4050 0,00 3,7812 0,4320 0,8561 0,2643 2 TER: Termodúricos / n.: número de amostras/ r: coeficiente de correlação/ r : coeficiente de determinação/ t: valor de t / a: 2: TM inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. LPI apresentou maior média em PCATTC. Para LPA e LPI as médias foram análogas. Quanto às comparações obtidas entre os métodos, correlação regular foi encontrada para LPI (r: 0,7214) e LPP (r: 0,6364). Para LPA (r:-0,2774) pode-se dizer que não apresentou correlação, valor obtido classifica-a como fraca (Figura 28). Todos os parâmetros estatísticos a e b das 3 correlações são considerados como fracos. 138 Contagem TER - Leite Pasteurizado Tipo A (AC/PCATTC) 1,8 Petrifilm TM AC (log10 UFC/mL) 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 AC = 1,1235 - 0,1915 * PCA TTC r = - 0,2774 n = 24 p > 0,05 0,4 0,2 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 PCATTC (log10 UFC/mL) Contagem TER - Leite Pasteurizado Integral (AC/PC TTC) 2,6 2,4 2,0 1,8 1,6 1,4 Petrifilm TM AC (log10 UFC/mL) 2,2 1,2 AC = 0,63506 + 0,52684 * PCA TTC r = 0,72136 n = 14 p < 0,06 1,0 0,8 0,6 0,4 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 2,6 2,8 PCATTC (log10 UFC/mL) Contagem TER - Leite Pasteurizado Padronizado (AC/PCA TTC) 2,6 2,4 Petrifilm TM AC (log 10 UFC/mL) 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 AC = 0,85610 + 0,43206 * PCA TTC r = 0,63645 n = 23 p < 0,05 1,2 1,0 0,8 0,6 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 PCATTC (log10 UFC/mL) Figura 28: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos, por tipo de leite, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) 139 Embora com um número muito reduzido de repetições, realizou-se o levantamento por tipo de leite, dos dados de cada enumeração dos 3 métodos, para possibilitar a comparação entre eles (Tabela 38 e 39). Tabela 38 – Resultados estatísticos por tipo de leite das contagens de microorganismos termodúricos dos métodos: PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODO Tipo AC PCA TTC PCA LPA AC PCA TTC PCA AC PCA TTC PCA LPI LPP n. x s S2 8 8 8 1,0336 0,9649 1,0954 0,2418 0,3081 0,3286 0,0585 0,0949 0,1079 5 5 5 7 7 7 1,7768 1,9822 2,1008 1,5013 1,6223 1,7060 0,8714 0,7673 0,5887 0,4045 0,5064 0,3353 0,7594 0,5887 0,3466 1,636 0,2565 0,1124 2: TER: Termodúricos/ n.: número de amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S Variância média/ PCA: Agar Padrão/ PCATTC: TM Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. Tabela 39 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por tipo de leite. MÉTODOS PCATTC / AC PCA/ AC PCA / PCATTC PCATTC / AC PCA/ AC PCA / PCATTC PCATTC / AC PCA/ AC PCA / PCATTC TIPO LPA LPI LPP n. r r 2 p t a b S 2 8 8 8 5 5 5 0,3905 -0,0660 0,6534 0,9876 0,9698 0,9908 0,1524 0,0043 0,4269 0,9753 0,9404 0,9817 0,33 0,87 0,07 0,00 0,00 0,00 1,0389 -0,1621 2,1143 10,8935 6,8829 12,6999 0,3064 -0,0486 0,6127 1,1217 1,4354 1,2913 0,7379 1,0869 0,2936 -0,4466 -1,2386 -0,7305 0,0728 0,0787 0,0992 0,6109 0,5207 0,4196 7 7 7 0,4145 0,4466 0,2985 0,1718 0,1995 0,0891 0,35 0,31 0,51 1,0185 1,1163 0,6995 0,3311 0,5388 0,4509 0,9642 0,5820 0,8529 0,1978 0,1387 0,1721 2 TER: Termodúricos / n.: número de amostras/ r: coeficiente de correlação/ r : coeficiente de determinação/ t: valor de t / a: 2: TM inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão/ LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. Os resultados demonstram valores relativamente próximos entre as médias das contagens de LPA e de LPP, apenas para LPI, o método PCA apresentou uma maior faixa de variação entre as médias. Referindo-se as correlações obtidas (Figura 29), LPA apresentou correlação regular para PCA/PCATTC (r: 0,6534) e não foi encontrada correlação entre os métodos AC/PCATTC (r: 0,3905) e AC/PCA (r: - 0,0660). Assim como para LPP, o mesmo diagnóstico foi obtido em todas as comparações realizadas: AC/PCATTC(r: 0,4145); AC/PCA (r: 0,4466) e PCA/PCATTC (r: 0,2985). 140 Contrariando os resultados de LPA e LPP, os valores obtidos para LPI classificam todas as comparações como correlação de nível ótimo: AC/PCATTC (r: 0,9876); AC/PCA (r: 0,9698) e PCA/PCATTC (r: 0,9908) Contagem TER - Leite Pasteurizado Tipo A (AC/PCA TTC ) 2,4 r = 0,39049 n=8 p > 0,05 2,2 1,1 TM 1,0 0,9 0,8 0,7 AC = - 0,4466 + 1,1217 * PCA TTC 1,8 r = 0,98759 n=5 p < 0,05 1,6 1,4 1,2 1,0 1,0 1,2 1,4 0,8 0,4 0,6 1,6 AC = 0,96416 + 0,33109 * PCA TTC 1,2 r = 0,41453 n=7 p > 0,05 1,0 1,2 1,4 2,6 1,5 2,4 2,0 2,2 2,4 2,6 0,8 0,8 2,8 1,0 1,2 1,4 AC = 1,0869 - 0,0486 * PCA r = - 0,0660 n=8 p > 0,05 TM 1,0 0,9 0,8 1,8 1,6 2,2 2,4 2,6 Contagem TER - Leite Pasteurizado Padronizado (AC/PCA) 1,8 AC = -1,239 + 1,4354 * PCA r = 0,96977 n=5 p < 0,05 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,7 2,0 2,0 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 AC = 0,58203 + 0,53883 * PCA r = 0,44667 n=7 p > 0,05 TM 1,3 1,6 PCA TTC (log10 UFC/mL) Petrifilm AC (log10 UFC/mL) 1,4 1,1 1,8 Contagem TER - Leite Pasteurizado Integral (AC/PCA) 1,6 1,2 1,6 PCA TTC (log10 UFC/mL) Petrifilm AC (log10 UFC/mL) TM Petrifilm 1,4 1,0 0,8 AC(log10 UFC/mL) 0,8 Contagem TER - Leite Pasteurizado Tipo A (AC/PCA) 1,2 1,0 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 0,2 1,0 1,8 1,2 1,4 1,6 PCA (log10 UFC/mL) 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 0,8 0,8 2,8 Contagem TER - Leite Pasteurizado Tipo A (PCA/PCA TTC ) 2,4 1,0 0,8 2,2 2,0 1,6 1,8 2,0 2,2 2,0 2,2 2,6 2,4 PCA TTC = - 0,7305 + 1,2913 * PCA 2,2 r = 0,99083 n=5 p < 0,05 PCA TTC (log10 UFC/mL) r = 0,65342 n=8 p > 0,05 PCA TTC (log10 UFC/mL) PCA TTC = 0,29365 + 0,61278 * PCA 1,4 Contagem TER - Leite Pasteurizado Padronizado (PCA/PCA TTC ) Contagem TER - Leite Pasteurizado Integral (PCA/PCA TTC ) 2,6 1,2 1,2 PCA (log10 UFC/mL) 2,8 1,4 1,0 PCA (log10 UFC/mL) 1,6 PCA TTC (log10 UFC/mL) 1,6 0,6 0,6 PCA TTC (log10 UFC/mL) 0,6 0,4 1,8 TM 1,2 2,0 AC (log10 UFC/mL) AC = 0,73796 + 0,30643 * PCA TTC Petrifilm 1,3 AC (log10 UFC/mL) 1,4 Petrifilm AC (log10 UFC/mL) TM Petrfilm 2,0 2,6 1,5 0,6 0,4 Contagem TER - Leite Pasteurizado Padronizado (AC/PCA TTC ) Contagem TER - Leite Pasteurizado Integral (AC/PCA TTC ) 1,6 1,8 1,6 1,4 1,2 2,0 1,8 PCA TTC = 0,85296 + 0,45095 * PCA r = 0,29857 n=7 p > 0,05 1,6 1,4 1,2 1,0 0,6 1,0 0,8 0,4 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 PCA (log10 UFC/mL) 1,4 1,6 1,8 0,6 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 PCA(log10 UFC/mL) 2,2 2,4 2,6 2,8 0,8 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 PCA (log10 UFC/mL) Figura 29: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos, por tipo de leite, de amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010). O diagnóstico encontrado para relação TER/MAM de cada tipo de leite (22,9% para LPA; 60,1% para LPI e 20,0% para LPP), demonstrou-se superior a 10% considerado neste trabalho como um índice de controle desse tipo de contaminação, levando-se em conta o mesmo padrão referência descrito no RIISPOA para termófilos e psicrófilos; embora sejam grupos diferentes de microorganismos. Somando-se aos evidenciados na correlação por tipo de leite, permiti dizer que são indicativos de uma maior incidência de TER na matéria prima, com baixa capacidade de redução do TTC e consequentemente no produto acabado, independentemente da respectiva concentração bacteriana total de classificação do leite. A evidencia pode ser justificada pelo aumento no número de 141 propriedade com ordenha mecânica e uma provável e conseqüente prevalência de psicrotróficos termodúricos, resultantes da “tecnificação” na produção leiteira da região. Desta maneira, parece emergente o monitoramento da incidência de TER na matéria prima, no beneficiamento e processamento do LP e dos processos de higienização dos equipamentos de toda cadeia produtiva, como ferramenta do controle de qualidade do leite (CHAMBERS, 2002; FRONN; BOOR, 2004; HUCK; SONNEN; BOOR, 2008). Sabe-se que a injúria térmica, de certa forma, acarreta a necessidade de um período para reparação da viabilidade celular da microbiota do leite recém pasteurizado, assim como em outros processos de conservação de alimentos (ALMEIDA, 2006; ALFENAS, 2000; FAGUNDES et al., 2006; FORZYTHE, 2002). Entendendo que o intervalo entre o processamento térmico e a realização da análise, possa ser um importante fator limitante da detecção de TER, em função do efeito deletério do estresse térmico e o fato da microbiota poder apresentar diferente tempo de geração (TG), fez-se a avaliação dos métodos em função do parâmetro tempo. Mantendo-se o mesmo raciocínio empregado no estudo de microorganismos aeróbios mesófilos, os dados obtidos nas contagens de TER foram separados, em 3 grupos de intervalo de tempo do pós processamento e o momento de realização da análise (t1:0h; t2: 24h e t3: 48h). No estudo entre os métodos placa PetrifilmTM AC e o método Agar padrão com TTC, os resultados obtidos (Tabela 40) demonstraram que AC apresentou maior média no intervalo t3 e PCATTC nos outros 2 intervalos (t1 e t2). Tabela 40 – Resultados estatísticos por intervalo de tempo das contagens de microorganismos termodúricos dos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODO 2 th n. x s S AC PCATTC 0 0 6 6 0,8032 1,2482 0,1412 0,4723 0,0199 0,2230 AC PCATTC 24 24 32 32 1,2265 1,4319 0,4956 0,6761 0,2456 0,4571 AC PCATTC 48 48 23 23 1,4080 1,1638 0,5107 0,6260 0,2608 0,3919 LP: Leites Pasteurizados/ TER: Term odúricos / th: intervalo entre produção e analise/ n.: número de amostras/ x: média/ s: 2: TM Desvio Padrão/ S Variância média/ AC: Petrifilm AC/ PCATTC: Agar Padrão com TTC. 142 Contagem TER - Leites Pasteurizados (AC/PCA TTC- t1:0h) 1,10 1,00 0,95 AC = 0,97773 - 0,1399 * PCA TTC r = - 0,4677 n=6 p > 0,05 0,90 0,85 Petrifilm TM AC (log10 UFC/mL) 1,05 0,80 0,75 0,70 0,65 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 PCATTC (log10 UFC/mL) Contagem TER - Leites Pasteurizados (AC/PCA TTC- t2 :24h) 2,6 2,4 AC = 0,50616 + 0,50307 * PCATTC r = 0,68622 n = 32 p < 0,05 Petrifilm TM AC (log10 UFC/mL) 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 PCATTC (log10 UFC/mL) Contagem TER - Leites Pasteurizados (AC/PCA TTC- t3: 48h) 2,6 2,4 Petrifilm TM AC (log10 UFC/mL) 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 AC = 0,89359 + 0,44201 * PCA r = 0,54179 n = 23 p < 0,05 0,8 0,6 TTC 0,4 0,2 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 PCATTC (log10 UFC/mL) Figura 30: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos por intervalos de tempo (t1:0h, t2:24h e t3:48h), das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) 143 Tabela 41 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por intervalo de tempo MÉTODOS PCATTC / AC PCATTC / AC PCATTC / AC th n. r r2 p t a b S2 0 24 48 6 32 23 -0,4677 0,6862 0,5418 0,2187 0,4708 0,2935 0,35 0,00 0,00 -1,0582 5,1671 2,9539 -0,1399 0,5030 0,4420 0,9777 0,5061 0,8936 0,1645 0,3565 0,3343 2 TER: Termodúricos / th: intervalo entre produção e analise/ n.: número de am ostras/ r: coeficiente de correlação/ r : coeficiente 2: de determinação/ t: valor de t / a: inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: TM Petrifilm AC. A comparação resultou em correlação regular para t2 (r: 0,6862) e para t3 (r: 0,5418). Para t1 (r: -0,4677), pode-se dizer que não foi encontrada correlação (Tabela 41). Os parâmetros a e b obtidos confirmam as classificações obtidas, assim como a dispersão dos dados (Figura 30). Entende-se que o reduzido número de repetições de t, e o fato dos resultados apresentarem diferença estatística significativa (p>0,05), em uma análise simplista não apresentem o peso da representatividade, porém o seu valor encontrase na possível influência sobre as outras correlações realizadas anteriormente. Podendo sua maior importância estar em ser um indicador do fator limitante nos diagnósticos de LPA, uma vez que todas as amostras desse período são assim classificadas pela origem. Referindo-se a comparação por tempo entre os três métodos, maior média foi obtida pelo PCA em t2, seguido por PCATTC. Para o intervalo de 48h (t3) maior media foi obtida por AC, acompanhado por PCA (Tabela 42). Mesmo assim apenas PCA/PCATTC apresentou diferença estatística significativa (p>0,05) entre as médias estudadas. O diagnostico encontrado para as correlações dos métodos (Tabela 43) demonstrou ser diferente daqueles obtidos até o momento, quando não considerando o índice de repetições método/período (Figura 31). Correlações de nível regular foi evidenciada em todas as 3 comparações do período de 24h (t2): AC/PCA (r: 0,7853); AC/PCATTC (r: 0,7167) e PCA/ PCATTC (r: 0,6154). Neste intervalo, a composição das amostras é constituída por cerca de 40% por LPA e 60% de LPI/LPP. Assim como para PCA/ PCATTC (r: 0,6842) no intervalo de 48h (t3). Boa correlação foi encontrada para AC/PCATTC em t3 (r: 0,8170) e ótima correlação AC/PCA (r: 0,9545). Nas amostras deste intervalo, LPI/LPP correspondem a 50%. 144 Tabela 42 – Resultados estatísticos por intervalo de tempo das contagens de microorganismos termodúricos dos métodos: PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) MÉTODO 2 th n. x s S AC PCATTC 24 24 15 15 1,2899 1,5942 0,6192 0,6326 0,3835 0,4002 AC PCA PCATTC PCA 24 24 24 24 14 14 13 13 1,2765 1,7083 1,5772 1,7296 0,6550 0,4529 0,6980 0,4640 0,4290 0,2051 0,4872 0,2153 AC PCATTC AC PCA 48 48 48 48 8 8 6 6 1,4576 1,2596 1,5217 1,3702 0,5672 0,7427 0,5046 0,7099 0,3217 0,5516 0,2546 0,5039 PCATTC PCA 48 48 6 6 1,4210 1,3702 0,9002 0,7099 0,8103 0,5039 LP: Leites Pasteurizados/ TER: Termodúricos / th: intervalo entre produção e analise / n.: número de amostras/ x: média/ s: 2: TM Desvio Padrão/ S Variância média/ AC: Petrifilm AC/ PCATTC: Agar padrão com TTC/ PCA: Agar Padrão. Tabela 43 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das contagens de micro-organismos termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por intervalo de tempo MÉTODOS th n. r r 2 p t a b S 2 PCATTC / AC PCA / AC PCA / PCATTC 24 24 24 15 14 13 0,7167 0,7853 0,6154 0,5137 0,6168 0,3787 0,00 0,00 0,00 3,7063 4,3952 2,5898 0,7016 1,1357 0,9257 0,1713 -0,6637 -0,0239 0,4023 0,3537 0,3432 PCATTC / AC PCA / AC PCA / PCATTC 48 48 48 8 6 6 0,8170 0,9545 0,6842 0,6675 0,9111 0,4682 0,00 0,00 0,13 3,4711 6,4043 1,8766 0,6239 0,6785 0,8676 0,6716 0,5919 0,2321 0,4180 0,3511 0,5981 2 TER: Termodúricos / th: intervalo entre produção e analise/ n.: número de am ostras/ r: coeficiente de correlação/ r : coeficiente 2: de determinação/ t: valor de t / a: inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: TM Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão. A somatória dos resultados encontrados pode ser indicativa da recorrente necessidade de avaliação quanto ao melhor período para realização das análises de monitoramento de qualidade, frente as atuais condições da cadeia produtiva. De maneira em geral, justificam os relatos feito por analistas de laticínios da região de Londrina-PR, que descrevem o aumento significativo da carga bacteriana do leite pasteurizado ao longo do TVU, com relevância para o 3º dia pós processamento. 145 Contagem TER - Leites Pasteurizados (AC/PCA TTC - t2 :24h) Contagem TER - Leites Pasteurizados (AC/PCA TTC - t3 : 48h) 2,6 2,6 2,4 2,0 1,8 2,4 2,2 AC = 0,17131 + 0,70164 * PCATTC r = 0,71679 n = 15 p < 0,05 PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 2,2 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 AC = 0,67163 + 0,62399 * PCATTC r = 0,81705 n=8 p < 0,05 0,8 0,6 0,6 0,4 0,2 0,2 2,0 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 0,4 0,2 2,8 0,4 0,6 0,8 1,0 PCATTC (log 10 UFC/mL) 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 2,6 2,8 PCATTC (log 10 UFC/mL) Contagem TER - Leites Pasteurizados (PCA/AC - t2: 24h) Contagem TER - Leites Pasteurizados (AC/PCA - t3 : 48h) 2,6 2,6 2,4 2,4 2,0 1,8 AC = -0,6637 + 1,1358 * PCA r = 0,78539 n = 14 p < 0,05 PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 2,2 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 2,2 2,0 AC = 0,59196 + 0,67854 * PCA r = 0,95454 n=6 p < 0,05 1,8 1,6 1,4 1,2 0,6 1,0 0,4 0,2 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 0,8 0,4 2,6 0,6 0,8 1,0 1,2 PCA (log10 UFC/mL) Contagem TER - Leites Pasteurizados (PCA/PCA TTC - t2 :24h) 2,8 2,4 2,6 2,2 2,4 1,8 2,0 2,2 2,4 2,2 PCATTC (log 10 UFC/mL) 2,0 PCATTC (log 10 UFC/mL) 1,6 Contagem TER - Leites Pasteurizados (PCA/PCATTC - t3 : 48h) 2,6 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 PCA TTC = - 0,0240 + 0,92577 * PCA r = 0,61546 n = 13 p < 0,05 0,8 0,6 2,0 1,8 1,6 PCA TTC = 0,23212 + 0,86769 * PCA r = 0,68426 n=6 p > 0,05 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,8 1,4 PCA (log10 UFC/mL) 0,4 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 PCA (log10 UFC/mL) 2,0 2,2 2,4 2,6 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 PCA (log10 UFC/mL) Figura 31: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das .contagens de micro-organismos termodúricos por intervalo de tempo (t2: 24h e t3:48h), das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – .novembro de 2010) Entendendo que as singularidades da cadeia produtiva do leite, de cada planta industrial, possam também intervir na concentração de TER do LP, fezse o estudo da comparação dos dados obtidos pelos métodos AC e PCATTC da planta X (LPA) e da planta Z (LPI e LPP). Em vista do número muito reduzido de repetições das demais plantas (Y e Z) optou-se pela não realização do estudo. Na separação dos resultados de TER por planta (Tabela 44), maior média foi obtida pelo PCATTC, reforçando a situação do AC de não possuir boa 146 capacidade de detecção (recuperação celular nas condições da análise), além daqueles relacionados à presença do TTC e/ou sua respectiva redução para visualização na enumeração de TER pelo método AC. Contagem TER - Leite Pasteurizado Plantax (AC/ PCA TTC ) 1,4 AC = 0,90858 - 0,1256 * PCATTC r = - 0,2627 n = 17 p > 0,05 PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 PCATTC (log 10 UFC/mL) Contagem TER - Leites Pasteurizados Planta z (AC/PCA TTC ) 2,6 2,4 AC = 0,60363 + 0,54026 * PCATTC r = 0,74828 n = 25 p < 0,05 PetrifilmTM AC (log 10 UFC/mL) 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 PCA TTC(log 10UFC/mL) Figura 32: Correlação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens termodúricos, plantas X e Z, das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) Tabela 44 – Resultados estatísticos por planta industrial das contagens de termodúricos pelos métodos: PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) PLANTA n. x s S2 TIPO AC PCATTC X 17 17 0,7832 0,9987 0,2169 0,4537 0,0470 0,2059 LPA AC PCATTC Z 25 25 1,4263 1,5228 0,5210 0,7215 0,5206 0,2714 LPI LPP MÉTODO 2: TER: Termodúricos / n.: número de amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ TM AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão/ LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. As comparações (Tabela 45) indicaram haver correlação regular apenas para a planta Z (r: 0,7428). Para a planta X o valor encontrado define a correlação como não existente (r: -0,2627). A dispersão dos dados na reta e nas 147 linhas de s, da correlação de AC/PCATTC por planta permite melhor visualização do diagnóstico (Figura 32). Tabela 45 – Resultados estatísticos de comparação entre os métodos PetrifilmTM AC e Agar Padrão com TTC das contagens de termodúricos das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010) por planta industrial n. r r 2 p t a b S PCATTC / AC PLANTA X 17 -0,2627 0,069 0,30 -1,054 -0,1255 0,9085 0,1346 TIPO LPA PCATTC / AC Z 25 0,7482 0,559 0,00 5,409 0,5402 0,6036 0,3903 LP* MÉTODOS 2 2 MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ n.: número de amostras/ r: coeficiente de correlação/ r : coeficiente de 2: TM determinação/ t: valor de t / a: inclinação/ b: intercepção/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão/ LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LP*: Leite Pasteurizado Integral e Leite Pasteurizado Padronizado. Considerando a separação dos resultados de TER, daquelas amostras submetidas à enumeração pelos 3 métodos (Tabela 46), é possível verificar que maior média foi obtida pelo método PCA, seguido pelo PCATTC. Em geral, a capacidade de recuperação e/ou detecção do método tradicional do PCA confirmam os diagnósticos anteriores da possível existência de um ou mais fatores limitantes para o método AC. Para LPA beneficiado pela planta X, a fraca correlação AC/PCATTC pode estar no tipo de microbiota predominante e relação com o intervalo de tempo, na medida em que o intervalo t1 possa influenciar na obtenção dos resultados, seja na enumeração de MAM quanto de TER. Sugerindo estudo mais aprofundado. A correlação obtida pela planta Z, parece novamente confirmar a influencia direta do emprego de processos de bactofugação e termização nos resultados microbiológicos das amostras de LPI e LPP. Tabela 46 – Resultados estatísticos por planta industrial das contagens de termodúricos pelos métodos: PetrifilmTM AC, Agar Padrão e Agar Padrão com TTC das amostras de leites pasteurizados da região de Londrina - PR (outubro – novembro de 2010). MÉTODO 2 PLANTA n. x s S TIPO AC PCATTC PCA X 5 5 5 0,8884 0,9632 1,1708 0,1280 0,2922 0,2677 0,0164 0,0854 0,0717 LPA AC PCATTC PCA Z 7 7 7 1,5947 1,8356 2,0167 0,7807 0,6748 0,5055 0,6095 0,4553 0,2556 LPI LPP 2: TER: Termodúricos / n.: número de amostras/ x: média/ s: Desvio Padrão/ S Variância média/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ TM AC: Petrifilm AC/ PCA: Agar Padrão/ LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/ LPP: Leite Pasteurizado Padronizado. Em face dos diagnósticos obtidos, a incidência de fatores 148 relacionados à cadeia produtiva e das condições da metodologia propriamente dita, pareceu interferir na validação do método AC para enumeração de TER. A capacidade de recuperação da microbiota pelo referido método, frente às condições do estresse térmico e viabilidade celular pode ser um fator limitante, merecendo melhor avaliação investigativa. O fato é que as condições atuais da cadeia produtiva, evidenciadas neste estudo, demonstram que os laticínios da região precisam priorizar o monitoramento e redução da carga de TER na produção da matéria prima e assegurar uma menor contaminação do produto acabado, via processo de higienização dos equipamentos (EDEMA;AKINGBADE, 2007; FROMM:BOOR, 2004; HUCK;SONNEN; BOOR, 2008; HUCK et al., 2007; HUTCHISON, 2004; RANIERI et al., 2009). 5.9 DIAGNÓSTICO DA QUALIDADE DO LEITE PASTEURIZADO E CORRELAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS Comprobatoriamente ocorreram melhorias na qualidade do leite após o incremento das novas normas e/ou requisitos para a cadeia produtiva, oriundos da IN 51/2002. Todavia os diagnósticos obtidos neste estudo, demonstraram a necessidade de nova avaliação dos procedimentos de garantia da qualidade da matéria prima e do processamento industrial. No contexto geral, considerando todos os requisitos analisados e comparados com o RTIQ da IN 51/2002, obteve-se o índice de 33,7% das amostras em desacordo com a legislação vigente. Apesar do diagnóstico da qualidade do LP da região de Londrina – PR, acima descrito, seja diferente do obtido por Bernardino et al, (2009), outros estudos realizados em diferentes regiões do Brasil, revelam situação semelhante, com índices variando de 15,2% a 68,4% de amostras não atendendo a legislação (BORSATO-MOYSÉS; CARVALHO; HOFFMANN, 2009; PAIVA, 2007; SILVA, 2010; SILVA et al, 2010a; SILVA et al., 2008). Neste estudo, o requisito em desacordo com a legislação, de maior incidência foi a detecção de resíduos de substâncias antimicrobianas - RSA (16,5%), 149 seguido pela presença de coliformes totais (8,75%) e inativação da enzima peroxidase (6,25%). Parece ser emergencial a implantação de técnicas para a detecção de RSA na seleção da matéria prima, uma vez que foi evidenciada uma lacuna no monitoramento exclusivo de detecção de resíduos de antibióticos, transmitindo uma segurança tênue ao leite beneficiado. A análise de lactofermentação, tanto quanto na fabricação de derivados, demonstrou ser uma importante ferramenta de avaliação do processamento, do produto acabado e respectiva validade, no que tange a microbiota predominante e/ou presença de enzimas termoestáveis. Neste estudo, 22,4% das amostras com formação de coágulo digerido apresentaram relação termodúricos / mesofílicas, superior ao índice de 10%, considerado neste trabalho como valor de referência para o monitoramento da contaminação. Assim como, o resultado líquido correspondeu a 53,8% de leites com suspeita ou presença de RSA. Os avanços tecnológicos e a tecnificação da cadeia produtiva regional, gerou a redução da carga bacteriana, porém agregou fatores que podem levar a modificação do tipo de microbiota predominante, incluem os grupos classificados como psicrotróficos, termodúricos ou com ambas as capacidades. Assim como já praticado em outros países, a determinação desses grupos tornou-se fator muito importante do monitoramento e da segurança da cadeia produtiva do leite fluido de consumo (leite pasteurizado). O emprego das placas PetrifilmTM AC para enumeração de microorganismos aeróbios mesófilos (MAM) e termodúricos (TER) de leite pasteurizados, demonstrou sofrer influencia da microbiota remanescente da pasteurização, com maior ênfase quanto ao tipo de microbiota. Nas duas etapas do estudo a comparação AC/PCATTC apresentou correlação regular (n = 62 com r: 0,7296 e n = 24 com r: 0,7260) e PCA/PCATTC apresentou fraca correlação (r: 0,5845). A presença do indicador TTC no meio Agar (PCATTC) demonstrou causar interferência na determinação de MAM, seja por sua ação deletéria ou pela incapacidade/intensidade de sua redução pela microbiota presente. A boa correlação encontrada para as placas AC na determinação da concentração de MAM em leite pasteurizado (r: 0,8426), reflete o conjunto dos dados 150 a partir da incorporação dos diferentes intervalos de resultados, não pontuando as situações singulares e/ ou específicas de cada leite. Quando da separação por tipo de leite, a correlação apresenta-se como regular para LPI (r: 0,6427) e LPP (r: 0,6745) e fraca para LPA (r: 0,4469); a análise torna-se mais rigorosa, por considerar intervalos menores e sofrer maior influencias de fatores como: condições da origem tipo de microbiota predominante; processamento tecnológico empregado; capacidade de recuperação da viabilidade celular pós estresse térmico; intervalo de tempo do monitoramento pós beneficiamento e realização da análise e características intrínsecas do produto acabado. Mesmo assim, nas condições do presente trabalho, AC apresenta-se mais eficiente para as condições da enumeração de mesófilos (r: 0,8426) em relação ao seu emprego para determinação da carga de micro-organismos TER (r: 0,7089). Nas duas etapas do estudo da enumeração de TER a comparação AC/PCATTC apresentou correlação regular, porém com valores distintos (n = 61 com r: 0,5273 e n = 25 com r: 0,6925). Assim como, correlação regular também obtida por PCA/PCATTC (r: 0,6772). A alta freqüência de micro-organismos com “lenta” capacidade de reduzir o TTC das placas AC e/ou a menor capacidade de recuperação celular por parte dessas placas, frente às condições empregadas neste estudo, demonstrou não existir correlação aceitável para determinação da microbiota termodúrica. Fato sugerido pela incidência de placas cujas colônias somente foram visíveis, após maior tempo de incubação. A freqüência dessas colônias também pode estar interligada a outros fatores singulares a cada planta industrial (produção; captação; processos tecnológicos e logísticos). O período de intervalo entre o processamento térmico e a realização da análise microbiológica, apresentou-se como um ponto crítico, para obtenção de resultados confiáveis e compatíveis com as condições atuais da cadeia leiteira. Os resultados obtidos demonstram a manutenção da influência da qualidade do leite pasteurizado, frente ao desempenho do PetrifilmTM AC. E podem ser utilizados como indicadores da necessidade de avaliação investigativa mais detalhada. Sugerindo novos estudos com maior número de repetições e que pontuem os fatos referenciados. 151 6 CONCLUSÕES Apesar dos avanços técnicos alcançados na cadeia produtiva do leite, o sistema de garantia da qualidade apresenta lapso, que permiti a existência e comercialização de leite pasteurizado em desacordo com a legislação. Nas condições atuais da cadeia produtiva, parece ser essencial a implantação da enumeração e definição de padrão classificatório para os grupos termodúricos e psicrotróficos. A partir dos resultados deste estudo, pode-se dizer que o desempenho do sistema PetrifilmTM AC na rotina laboratorial de laticínios, possui dependência do tipo de microbiota remanescente da pasteurização, em função da qualidade da matéria prima e processamento tecnológico. Portanto o PetrifilmTM AC requer uma validação rigorosa, correlacionada com as características do produto acabado, bem como, dos fatores relacionados à cadeia produtiva regional e inerente as tecnologias empregadas, por cada planta industrial. Os resultados obtidos reportam ser relevante a realização de novos estudos frente às condições das plantas processadoras; da prevalência bacteriana; do intervalo do monitoramento pós tratamento térmico e do binômio de incubação da metodologia microbiológica, principalmente para a enumeração de termodúricos. 152 REFERÊNCIAS AIRES, G. S. B.. 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Consultado: 15.set.2010. 183 ANEXOS 184 ANEXO A – Resultados físico-químicos e microbiológicos Tabela 47 – Resultados físico-químicos e microbiológicos de 29 amostras de Leite Pasteurizado Tipo A Integral da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) Cda Cdp th 1 2 7 12 13 18 19 20 23 24 28 29 30 37 42 43 51 52 X X X X X X X Y X Y X X Y X X X X X 53 56 57 58 62 63 68 69 71 72 79 o D Aliz %Gb D15ºC DPC ºH %Pt %ESD Fo Pe RATB RAII Lact 24 48 24 24 0 24 0 24 24 48 0 24 48 24 24 0 48 24 14,0 14,0 13,0 14,0 14,5 14,0 14,0 15,0 14,5 14,0 14,0 14,0 14,0 14,0 15,0 15,0 15,0 14,5 No No No No No No No No No No No No No No No No No No 3,86 3,92 4,06 3,95 4,10 4,02 3,97 3,82 3,99 3,79 3,85 3,92 3,81 4,07 4,07 4,06 4,22 4,12 31,5 31,3 31,6 31,4 31,2 31,6 31,8 31,2 31,5 31,4 31,4 32,2 31,2 31,5 31,7 31,5 31,2 31,4 -0,545 -0,541 -0,541 -0,543 -0,541 -0,543 -0,542 -0,539 -0,543 -0,539 -0,540 -0,544 -0,539 -0,542 -0,541 -0,540 -0,543 -0,542 2,97 2,93 3,02 2,89 2,94 2,93 2,94 2,95 2,94 2,96 2,94 3,00 2,95 2,96 2,98 2,97 2,88 2,90 8,85 8,81 8,91 8,84 8,82 8,90 8,94 8,76 8,87 8,81 8,82 9,03 8,76 8,89 8,94 8,89 8,84 8,87 Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne LI LI LI DE HO DE DE DE DE DE LI LI DI HO HO HO HO DE X X X Y X Y X Y 0 0 24 48 24 24 24 48 14,5 15,0 14,5 14,5 15,0 14,0 14,0 15,0 No No No No No No No No 4,15 4,32 4,24 3,76 4,10 3,80 4,49 3,81 31,3 30,8 31,1 31,8 30,7 31,3 31,2 32,2 -0,543 -0,546 -0,545 -0,538 -0,545 -0,545 -0,547 -0,543 2,95 2,92 2,88 2,98 2,91 2,98 2,88 3,00 8,86 8,76 8,82 8,90 8,70 8,79 8,90 9,01 Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Po Po Po Po Po Po Po Po Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Sus Ne Ne Ne Ne DE HO DE LI HO DE DE DI X Y Y 24 48 24 15,0 15,0 15,0 No No No 4,09 4,14 3,88 31,6 31,1 31,8 -0,545 -0,548 -0,548 2,93 2,53 3,00 8,92 9,05 8,66 Ne Ne Ne Po Po Po Ne Ne Ne Ne Ne Ne HO DI HO LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ Cda: Código amostra/ Cdp: Código planta/ th: Intervalo produção e análise/ ºD: Acidez em graus Dornic/ Aliz: Alizarol 75º GL/ Gb: Teor de gordura/ D15ºC: Densidade corrigida a 15ºC g/L/ DPCºH: Depressão do ponto de congelamento – Crioscopia em graus Horvet/ Pt: Teor de proteína / ESD: Extrato seco desengordurado/ Fo: Fosfatase/ Pe: Peroxidase/ RATB: Resíduos de antibióticos – Tetraciclinas e Beta-lactâmicos/ RA II: Resíduos de substancias antimicrobianas - método Iogurte-indicador/ Lact: Lactofermentação/ No: Normal estável/ Ne: Negativo/ Po: Positivo/ Sus: Suspeito/ HO: Homogêneo/DE: Dessorado/ DI: digerido / LI: Líquido. Tabela 48 – Resultados físico-químicos e microbiológicos de 3 amostras de Leite Pasteurizado Tipo B Integral da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) Cda Cdp th o D Aliz %Gb D15ºC DPC ºH %Pt %ESD Fo Pe RATB RAII Lact 54 55 80 V V V 48 24 24 17 17 15 No No No 3,69 3,68 3,68 30,7 31,5 30,9 -0,538 -0,537 -0,546 3,15 3,17 2,97 8,61 8,81 8,66 Ne Ne Ne Po Po Po Ne Ne Ne Sus Po Ne LI LI HO LPB: Leite Pasteurizado Tipo B/ Cda: Código amostra/ Cdp: Código planta// th: Intervalo produção e análise/ ºD: Acidez em graus Dornic/ Aliz: Alizarol 75º GL/ Gb: Teor de gordura/ D15ºC: Densidade corrigida a 15ºC g/L/ DPCºH: Depressão do ponto de congelamento – Crioscopia em graus Horvet/ Pt: Teor de proteína / ESD: Extrato seco desengordurado/ Fo: Fosfatase/ Pe: Peroxidase/ RATB: Resíduos de antibióticos – Tetraciclinas e Beta-lactâmicos/ RA II: Resíduos de substancias antimicrobianas - método Iogurte-indicador/ Lact: Lactofermentação/ No: Normal estável/ Ne: Negativo/ Po: Positivo/ Sus: Suspeito/ HO: Homogêneo/DE: Dessorado/ DI: digerido / LI: Liquido. 185 Cont.Tabela 47 – Resultados físico-químicos e microbiológicos* de 29 amostras de Leite Pasteurizado Tipo A Integral da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) MAM TER PSI Cda Cdp CC EC PCATTC AC PCA PCATTC AC PCA PCATTC 1 2 7 12 13 18 19 20 23 24 28 29 30 37 42 43 51 52 53 56 57 X X X X X X X Y X Y X X Y X X X X X X X X Y X Y X Y X Y Y <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 50 19 15 42 31 30 45 <2 2 2 31 <2 7 12 66 63 53 66 73 64 75 56 43 15 49 29 31 23 5 31 16 40 32 15 60 79 97 75 43 54 47 79 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR 79 94 86 35 119 8 42 9 12 18 3 4 <2 <2 5 73 <2 8 3 6 49 2 3 8 15 13 6 2 1 5 6 3 8 13 1 42 5 5 32 18 8 5 4 7 5 11 8 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR <2 9 17 9 40 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR <2 <2 <2 <2 <2 <1 <1 <1 <1 2 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 25 33 16 109 33 48 28 20 55 22 87 57 36 39 21 41 39 88 35 106 149 4 13 198 14 8 <2 25 28 16 6 3 9 14 4 30 20 4 <2 48 13 7 27 29 <2 <2 <2 <2 <2 <2 4 4 <2 <1 <1 <1 <1 <1 5 5 <1 <2 <2 <2 <2 <2 16 15 <2 58 62 63 68 69 71 72 79 3 3 Est. 3x10 3 Est. 3x10 Est. 3x10 AC PCA LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ *: UFC/mL/ Cda: Código amostra/ Cdp: Código planta/ CC: Coliformes Totais/ EC: Escherichia coli / MAM: TM Micro-organismos aeróbios mesófilos/ TER: Termodúricos/ PSI: Psicrotróficos/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC / PCA: Agar Padrão / <1: < 1UFC/mL/ <2: <2UFC/mL./ Est.: Estimado /NR: não realizado/NC: Não considerado. Cont.Tabela 48 – Resultados físico-químicos e microbiológicos* de 3 amostras de Leite Pasteurizado Tipo B Integral da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) MAM Cda Cdp CC EC 54 55 80 V V V <1 <1 <1 <1 <1 <1 PCATTC 4 7 4 Est. >4x10 TER PSI AC PCA PCATTC AC PCA 134 736 355 2750 11 <2 <2 5 9 6 38 <2 3 4 Est. >4x10 4 Est. >4x10 PCATTC AC <2 <2 <2 <1 <1 <1 PCA <2 <2 <2 LPB: Leite Pasteurizado Tipo B/ *: UFC/mL/ Cda: código amostra/ Cdp: código planta/ CC: Coliformes Totais/ EC: Escherichia coli MAM: TM Micro-organismos aeróbios mesófilos/ TER: Termodúricos/ PSI: Psicrotróficos// PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC / PCA: Agar Padrão /<1: < 1UFC/mL/ <2: <2UFC/mL./ Est.: Estimado / NR: Não realizado/ NC: Não considerado. 186 Tabela 49 – Resultados físico-químicos e microbiológicos de 19 amostras de Leite Pasteurizado Integral da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) Cda Cdp th 3 4 8 9 14 15 22 25 32 36 38 39 44 49 59 64 74 75 77 Z Z Z Z Z Z K Z Z K Z Z Z K Z Z Z Z Z 24 24 24 24 24 24 48 48 48 48 24 24 48 48 24 48 24 24 24 o D Aliz %Gb D15ºC DPC ºH %Pt %ESD Fo Pe RATB RAII Lact 13,5 13,5 15,0 14,0 14,0 13,5 13,5 14,0 14,0 18,0 14,0 14,0 14,5 14,0 14,0 15,0 15,0 14,5 15,0 No No No No No No No No No No No No No No No No No No No 3,46 3,48 3,42 3,47 3,36 3,31 3,24 3,22 3,24 3,16 3,52 3,27 3,52 3,21 3,75 3,45 3,45 3,30 3,44 30,9 31,1 31,4 31,6 32,2 32,0 30,2 31,4 32,0 30,2 31,6 31,8 31,8 30,2 30,9 31,8 31,2 31,8 29,5 -0,540 -0,538 -0,542 -0,542 -0,539 -0,538 -0,535 -0,538 -0,538 -0,535 -0,540 -0,538 -0,542 -0,533 -0,539 -0,540 -0,543 -0,542 -0,544 3,01 3,01 3,02 3,06 2,99 3,00 2,90 2,98 2,96 2,96 3,01 2,97 3,06 2,92 3,01 3,04 3,00 3,04 2,94 8,62 8,67 8,73 8,79 8,92 8,86 8,40 8,69 8,85 8,38 8,80 8,80 8,85 8,39 8,68 8,84 8,69 8,81 8,26 Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Ne Ne Po Po Po Po Po Po Po Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Sus Ne Ne Ne Sus Ne Ne Ne Sus Ne Ne Sus Ne LI LI HO HO HO HO DI HO HO DI DE LI DE DI HO DE DI HO HO LPI: Leite Pasteurizado Integral/ Cda: Código amostra/ Cdp: Código planta/ t h: Intervalo produção e análise/ ºD: Acidez em graus Dornic/ Aliz: Alizarol 75º GL/ Gb: Teor de gordura/ D15ºC: Densidade corrigida a 15ºC g/L/ DPCºH: Depressão do ponto de congelamento – Crioscopia em graus Horvet/ Pt: Teor de proteína / ESD: Extrato seco desengordurado/ Fo: Fosfatase/ Pe: Peroxidase/ RATB: Resíduos de antibióticos – Tetraciclinas e Beta-lactâmicos/ RA II: Resíduos de substâncias antimicrobianas - método Iogurte-indicador/ Lact: Lactofermentação/ No: Normal estável/ Ne: Negativo/ Po: Positivo/ Sus: suspeito/ HO: Homogêneo/DE: Dessorado/ DI: digerido / LI: Liquido. Tabela 50 – Resultados físico-químicos e microbiológicos de 2 amostras de Leite Pasteurizado Desnatado da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) Cda Cdp th 35 48 W W 48 48 o D Aliz %Gb D15ºC DPC ºH %Pt %ESD Fo Pe RATB RAII Lact 13,5 14,0 No No 0,94 0,85 35,0 34,9 -0,538 -0,538 3,26 3,29 9,14 9,10 Ne Ne Po Po Ne Ne Ne Ne LI DI LPD: Leite Pasteurizado Desnatado/ Cda: Código amostra/ Cdp: Código planta/ th: Intervalo produção e análise/ ºD: Acidez em graus Dornic/ Aliz: Alizarol 75º GL/ Gb: Teor de gordura/ D15ºC: Densidade corrigida a 15ºC g/L/ DPCºH: Depressão do ponto de congelamento – Crioscopia em graus Horvet/ Pt: Teor de proteína / ESD: Extrato seco desengordurado/ Fo: Fosfatase/ Pe: Peroxidase/ RATB: Resíduos de antibióticos – Tetraciclinas e Beta-lactâmicos/ RA II: Resíduos de substancias antimicrobianas - método Iogurte-indicador/ Lact: Lactofermentação/ No: Normal estável/ Ne: Negativo/ Po: Positivo/ Sus: Suspeito/ HO: Homogêneo/DE: Dessorado/ DI: digerido / LI: Liquido. 187 Cont.Tabela 50 – Resultados físico-químicos e microbiológicos* de 19 amostras de Leite Pasteurizado Integral da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) MAM TER Cda Cdp CC EC PCATTC AC PCA PCATTC 3 4 8 9 14 15 22 25 32 36 38 39 44 49 59 64 74 75 77 Z Z Z Z Z Z K Z Z K Z Z Z K Z Z Z Z Z <1 <1 <1 <1 <1 <1 8 <1 <1 80 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <100 <100 80 51 72 46 40 71 133 <100 <100 62 166 39 29 74 132 85 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR 93 295 395 443 478 685 227 <10 <10 26 23 <2 16 10 <10 7 16 1 2 7 384 34 349 256 4 4 Est. >8x10 Est. >8x10 33 29 45 125 17 519 72 488 3.400 32 43 34 80 158 340 167 335 417 PSI AC PCA PCATTC AC PCA 24 55 8 2 15 14 14 48 36 20 9 12 6 13 4 236 12 269 251 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR 15 366 71 269 305 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <1 <1 <1 <1 <1 <1 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR <2 <2 <2 <2 <2 4 3 Est. >3x10 Est. >9x10 30 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 87 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 LPI: Leite Pasteurizado Integral/ *: UFC/mL/ Cda: código amostra/ Cdp: código planta/ CC: Coliformes Totais/ EC: Escherichia coli MAM: TM Micro-organismos aeróbios mesófilos/ TER: Termodúricos/ PSI: Psicrotróficos// PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC / PCA: Agar Padrão / NR: não realizado/ <1: <1UFC/mL/ <2: <2UFC/mL/ Est.: Estimado. Cont.Tabela 51 – Resultados físico-químicos e microbiológicos* de 2 amostras de Leite Pasteurizado Desnatado da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) MAM Cda Cdp 35 48 w w CC <1 <1 EC <1 <1 TER PCATTC AC PCA PCATTC 7 209 28 182 NR NR 22 16 AC 19 13 PSI PCA PCATTC NR NR Est. >3x10 Est. >3x10 <2 <1 4 AC PCA 4 NR NR LPD: Leite Pasteurizado Desnatado/ *: UFC/mL/ Cda: código amostra/ Cdp: código planta/ CC: Coliformes Totais/ EC: Escherichia coli MAM: TM Micro-organismos aeróbios mesófilos/ TER: Termodúricos/ PSI: Psicrotróficos/ / / PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC / PCA: Agar Padrão / NR: não realizado/ <1: <1UFC/mL/ <2: <2UFC/mL./ Est.: Estimado. 188 Tabela 51 – Resultados físico-químicos e microbiológicos de 27 amostras de Leite Pasteurizado Padronizado da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) Cda Cdp th 5 6 10 11 16 17 21 26 27 31 33 34 40 41 45 46 47 50 60 61 65 66 67 70 73 76 78 Z Z Z Z Z Z W Z W K Z W Z Z Z Z W K Z W Z W W W W W Z 24 24 24 24 24 24 24 48 48 48 48 48 24 24 48 48 48 48 24 24 48 48 24 48 24 48 24 o D Aliz %Gb D15ºC DPC ºH %Pt %ESD Fo Pe RATB RAII Lact 14,0 13,5 14,0 14,0 14,0 13,0 14,0 14,0 14,5 14,0 14,0 14,0 14,0 14,0 15,0 14,5 14,0 14,5 15,0 14,0 14,5 14,0 14,5 14,5 14,0 15,5 15,0 No No No No No No No No No No No No No No No No No No No No No No No No No No No 3,18 3,17 3,06 3,10 3,05 3,03 3,28 3,28 3,11 3,41 3,41 3,23 3,24 3,20 3,28 3,24 3,21 3,23 3,19 3,35 3,28 3,44 3,35 3,36 3,43 3,48 3,28 32,0 32,2 32,4 31,6 31,0 31,2 31,2 31,2 30,8 32,2 32,2 32,2 31,9 32,2 32,0 32,2 32,2 32,1 32,1 31,0 30,8 30,6 30,8 31,4 31,0 31,3 29,8 -0,541 -0,541 -0,544 -0,542 -0,526 -0,527 -0,538 -0,538 -0,527 -0,538 -0,540 -0,537 -0,540 -0,540 -0,541 -0,541 -0,537 -0,537 -0,539 -0,541 -0,542 -0,540 -0,541 -0,541 -0,541 -0,543 -0,545 3,05 3,05 3,05 3,06 2,95 2,95 2,95 2,99 2,98 2,96 3,01 2,97 3,26 3,00 3,08 3,10 3,00 2,96 3,02 2,92 3,04 2,94 2,93 2,97 2,96 2,97 2,92 8,84 8,88 8,91 8,72 8,56 8,61 8,66 8,66 8,52 8,93 8,93 8,90 8,82 8,89 8,86 8,90 8,89 8,87 8,86 8,62 8,56 8,54 8,57 8,72 8,82 8,72 8,31 Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Po Ne Ne Po Po Po Ne Po Po Po Po Po Po Po Po Po Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Sus Po Ne Sus Sus Ne Ne Ne Sus Po Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne Ne HO HO HO HO HO HO HO HO DE LI LI HO LI LI HO HO DE DI HO DI HO DI DE DE DI DE DI LPP: Leite Pasteurizado Padronizado/ Cda: Código amostra/ Cdp: Código planta/ th: Intervalo produção e análise/ ºD: Acidez em graus Dornic/ Aliz: Alizarol 75º GL/ Gb: Teor de gordura/ D15ºC: Densidade corrigida a 15ºC g/L/ DPCºH: Depressão do ponto de congelamento – Crioscopia em graus Horvet/ Pt: Teor de proteína / ESD: Extrato seco desengordurado/ Fo: Fosfatase/ Pe: Peroxidase/ RATB: Resíduos de antibióticos – Tetraciclinas e Beta-lactâmicos/ RA II: Resíduos de substancias antimicrobianas - método Iogurte-indicador/ Lact: Lactofermentação/ No: Normal estável/ Ne: Negativo/ Po: Positivo/ Sus: Suspeito/ HO: Homogêneo/DE: Dessorado/ DI: Digerido / LI Liquido. 189 Cont.Tabela 51 – Resultados físico-químicos e microbiológicos* de 27 amostras de Leite Pasteurizado Padronizado da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) MAM TER Cda Cdp CC EC PCATTC 5 6 10 11 16 17 21 26 27 31 33 34 40 41 45 46 47 50 60 61 65 66 Z Z Z Z Z Z W Z W K Z W Z Z Z Z W K Z W Z W <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 5 <1 11 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 80 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <100 <100 144 154 155 43 58 47 25 12 352 49 20 9 33 12 112 54 65 46 1.625 Est.>8x10 Est.>8x10 Est.>8x10 270 180 9 90 65 95 600 2 33 20 349 20 15 2 19 5 4 26 31 140 883 84 67 70 73 76 78 W W W W Z <1 <1 5 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 185 990 35 45 68 440 408 161 210 159 380 1195 1515 410 145 269 8 30 29 28 AC PCA <100 <100 172 69 56 56 67 36 170 40 548 32 22 34 38 24 128 42 67 2.680 4 Est.>8x10 4 4 PCATTC NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR 88 1.580 1.490 4 PSI AC PCA PCATTC AC PCA 2 2 28 30 40 55 48 12 23 19 251 130 13 8 7 14 25 21 10 85 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 Est.>3x10 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR 82 138 920 85 Est.>3x10 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <1 3 <1 <1 <1 <1 2 <1 <1 <1 990 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 3 7 <1 <1 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR <2 <2 <2 <2 87 71 27 12 19 51 51 54 11 50 <2 <2 16 <2 <2 <1 <1 4 <1 <1 <2 <2 16 <2 <2 3 4 Est.3x10 3 LPP: Leite Pasteurizado Padronizado/ *: UFC/mL/ Cda: código amostra/ Cdp: código planta/ CC: Coliformes Totais/ EC: Escherichia coli / MAM: MicroTM organismos aeróbios mesófilos/ TER: Termodúricos/ PSI: Psicrotróficos/ PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC / PCA: Agar Padrão / NR: não realizado/ <1: < 1UFC/mL/ <2: <2UFC/mL./ Est.: Estimado. 190 Tabela 52 – Resultados microbiológicos (log10 UFC/mL) de 29 amostras de Leite Pasteurizado Tipo A Integral da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) MAM Cda Cdp 1 2 7 12 13 18 19 20 23 24 28 29 30 37 42 43 51 52 53 56 57 X X X X X X X Y X Y X X Y X X X X X X X X 58 62 63 68 69 71 72 79 Y X Y X Y X Y Y PCATTC TER AC PCA 1,699 1,279 1,176 1,623 1,491 1,477 1,653 ND 0,301 0,301 1,491 ND 0,845 1,079 1,820 1,799 1,724 1,820 1,863 1,806 1,875 1,748 1,633 1,176 1,690 1,462 1,491 1,362 0,699 1,491 1,204 1,602 1,505 1,176 1,778 1,898 1,987 1,875 1,633 1,732 1,672 1,898 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 1,897 1,973 1,934 1,544 2,075 1,398 1,519 1,204 2,037 1,519 1,681 1,447 NC 1,301 1,740 1,342 1,940 1,756 1,556 1,591 NC 1,322 1,613 1,591 1,944 1,544 2,025 2,173 NC PCATTC 0,903 1,623 0,954 1,079 1,255 0,477 0,602 ND ND 0,699 1,863 ND 0,903 0,477 0,778 1,690 0,301 0,477 0,903 1,176 1,114 0,602 1,114 2,297 1,146 0,903 ND 1,398 1,447 AC PCA 0,778 0,301 NC 0,699 0,778 0,477 0,903 1,114 NC 1,623 0,699 0,699 1,505 1,255 0,903 0,699 0,602 0,845 0,699 1,041 0,903 1,204 0,778 0,477 0,954 1,146 0,602 1,477 1,301 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR ND 0,954 1,230 0,954 1,602 0,602 ND 1,681 1,114 0,845 1,431 1,462 ND LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ Cda: código amostra/ Cdp: código planta/ MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ TER: Termodúricos/ TM PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC / PCA: Agar Padrão / NR: não realizado/ ND: não detectado/NC: não considerado. 191 Tabela 53 – Resultados microbiológicos (log10 UFC/mL) de 19 amostras de Leite Pasteurizado Integral da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) MAM Cda Cdp 3 4 8 9 14 15 22 25 32 36 38 39 44 49 59 64 74 75 77 Z Z Z Z Z Z K Z Z K Z Z Z K Z Z Z Z Z PCATTC NC NC 1,903 1,708 1,857 1,663 1,602 1,851 2,124 NC 1,519 1,462 1,653 2,097 1,230 2,715 1,857 2,688 3,531 TER AC PCA NC NC 1,792 2,220 1,591 1,462 1,869 2,121 1,929 NC 1,505 1,633 1,531 1,903 2,199 2,531 2,223 2,525 2,620 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR 1,968 2,470 2,597 2,646 2,679 PCATTC 2,836 2,356 ND ND 1,415 1,362 ND 1,204 1,000 ND 0,845 1,204 NC 0,301 0,845 2,584 1,531 2,543 2,408 AC PCA 1,380 1,740 0,903 0,301 1,176 1,146 1,146 1,681 1,556 1,301 0,954 1,079 0,778 1,114 0,602 2,373 1,079 2,430 2,400 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR 1,176 2,563 1,851 2,430 2,484 LPI: Leite Pasteurizado Padronizado/ Cda: código amostra/ Cdp: código planta/ MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ TER: TM Termodúricos / PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC / PCA: Agar Padrão / NR: não realizado/ ND: não detectado/ NC: não considerado. 192 Tabela 54 – Resultados microbiológicos (log10 UFC/mL) de 27 amostras de Leite Pasteurizado Padronizado da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) MAM Cda Cdp 5 6 10 11 16 17 21 26 27 31 33 34 40 41 45 46 47 50 60 61 65 Z Z Z Z Z Z W Z W K Z W Z Z Z Z W K Z W Z 66 67 70 73 76 78 W W W W W Z PCATTC ND ND 2,158 2,188 2,190 1,633 1,763 1,672 1,398 1,079 2,547 1,690 1,301 0,954 1,519 1,079 2,049 1,732 1,813 1,663 3,211 NC 2,267 2,996 1,544 1,653 1,833 TER AC PCA ND ND 2,236 1,839 1,748 1,748 1,826 1,556 2,230 1,602 2,739 1,505 1,342 1,531 1,580 1,380 2,107 1,623 1,826 3,428 NC NC 2,643 2,611 2,207 2,322 2,201 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR 1,944 3,199 3,173 NC 2,580 3,077 3,180 2,613 2,161 PCATTC 2,432 2,256 0,954 1,954 1,813 1,978 2,778 0,301 1,519 1,301 2,543 1,301 1,176 0,301 1,279 0,699 0,602 1,415 1,491 2,146 2,946 1,924 2,430 0,903 1,477 1,462 1,447 AC PCA 0,301 0,301 1,447 1,477 1,602 1,740 1,681 1,079 1,362 1,279 2,400 2,114 1,114 0,903 0,845 1,146 1,398 1,322 1,000 1,929 NC 1,929 1,940 1,851 1,431 1,079 1,279 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR 1,914 2,140 2,964 NC 1,708 1,708 1,732 1,041 1,699 LPP: Leite Pasteurizado Padronizado/ Cda: código amostra/ Cdp: código planta/ MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ TER: Termodúricos TM / PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC / PCA: Agar Padrão / NR: não realizado/ ND: não detectado/NC:não considerado. 193 Tabela 55 – Média dos resultados microbiológicos (UFC/mL) das amostras de Leite Pasteurizado da região de Londrina – PR (outubro – novembro de 2010) MAM TIPO LPA LPI LPP TG TG 2º Etapa PCATTC 43 121 181 114 200 TER AC PCA 44 137 246 136 257 74 341 850 376 376 PCATTC 16 97 75 68 76 AC PCA 11 55 44 34 53 16 205 170 111 111 LPA: Leite Pasteurizado Tipo A/ LPI: Leite Pasteurizado Integral/LPP: Leite Pasteurizado Padronizado/ TG: Total geral – média todas as TM amostras/ MAM: Micro-organismos aeróbios mesófilos/ TER: Termodúricos / PCATTC: Agar Padrão com TTC/ AC: Petrifilm AC / PCA: Agar Padrão.