RSV + hMPV Assay
Instructions for Use
For the qualitative detection and identification of respiratory syncytial virus and human
metapneumovirus viral RNA extracted from nasal swab and nasopharyngeal swab
specimens
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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Contents
Intended Use ........................................................................................................................................... 3
Summary and Explanation ...................................................................................................................... 3
Principle of the Procedure ...................................................................................................................... 3
Materials Provided .................................................................................................................................. 4
Optional Materials .................................................................................................................................. 4
Materials Required But Not Provided ..................................................................................................... 4
Warnings and Precautions ...................................................................................................................... 5
Storage and Handling of Kit Reagents .................................................................................................... 6
Specimen Collection, Storage, and Handling .......................................................................................... 6
Nucleic Acid Extracts Storage.................................................................................................................. 6
Nucleic Acid Extraction Programming Instructions ................................................................................ 6
Initial Thermocycler Programming ......................................................................................................... 8
SmartCycler II Programming Instructions ........................................................................................... 8
Applied Biosystems 7500 Fast DX Programming Instructions ..........................................................10
QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument Dx Programming Instructions......................................13
Assay Procedure....................................................................................................................................13
Amplification Protocol on the Cepheid SmartCycler II .....................................................................14
Amplification Protocol on the Applied Biosystem 7500 Fast Dx Thermocycler ...............................14
Amplification Protocol on the QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument .....................................15
Interpretation of Results .......................................................................................................................16
Interpretation of Results using the Cepheid SmartCycler II .............................................................16
Interpretation of Results using the ABI 7500 Fast Dx .......................................................................17
Interpretation of Results using the QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument .............................17
Quality Control ......................................................................................................................................17
Limitations ............................................................................................................................................18
Expected Values ....................................................................................................................................18
Clinical Performance .............................................................................................................................18
Analytical Performance .........................................................................................................................20
Level of Detection .............................................................................................................................20
Analytical Reactivity (Inclusivity) ......................................................................................................21
Reproducibility Study ........................................................................................................................21
Analytical Specificity – Cross-reactivity.............................................................................................22
Analytical Specificity – Interfering Substances .................................................................................23
Carryover and Cross-contamination Studies ....................................................................................23
Customer and Technical Support ..........................................................................................................23
Intellectual Property .............................................................................................................................23
Trademarks .......................................................................................................................................23
Patents ..............................................................................................................................................23
Glossary .................................................................................................................................................25
References ............................................................................................................................................26
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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Intended Use
The Quidel Molecular RSV + hMPV assay is a multiplex Real Time RT-PCR assay for the qualitative detection
and identification of respiratory syncytial virus and human metapneumovirus RNA extracted from nasal and
nasopharyngeal swabs specimens from patients with signs and symptoms of respiratory infection. This in vitro
diagnostic test is intended to aid in the differential diagnosis of respiratory syncytial virus and human
metapneumovirus infections in humans in conjunction with clinical and epidemiological risk factors. This test is
not intended to differentiate the two subtypes of RSV or the four genetic sub-lineages of hMPV.
Negative results do not preclude RSV infection and/or hMPV infection and should not be used as the sole basis
for diagnosis, treatment or other patient management decisions.
Summary and Explanation
RSV: Human respiratory syncytial virus (RSV) is a negative single-stranded RNA virus of the family
Paramyxoviridae. RSV is the major cause of lower respiratory tract infection and hospital visits during infancy
and childhood. In the United States, 60% of infants are infected during their first RSV season, and nearly all
1
children will have been infected with the virus by 2–3 years of age. Of those infected with RSV, 2–3% will
2
develop bronchiolitis, necessitating hospitalization. Natural infection with RSV induces protective immunity
that wanes over time—possibly more so than other respiratory viral infections—and thus people can be
infected multiple times. Sometimes an infant can become symptomatically infected more than once, even
within a single RSV season. Severe RSV infections have increasingly been found among elderly patients.
RSV subtypes A and B are present either simultaneously or alternately during yearly epidemics and there are
several supporting studies indicating that RSV-A induced bronchiolitis is more severe than an RSV-B induced
3
one.
hMPV: Human metapneumovirus (hMPV) is a negative single-stranded RNA virus of the family
4
Paramyxoviridae first isolated in 2001 in the Netherlands. hMPV may be the second most common cause
(after RSV) of lower respiratory infection in young children. Compared with RSV, infection with hMPV tends to
occur in slightly older children and produce disease that is less severe. Co-infection with both viruses can occur
and is generally associated with more severe disease.
5
hMPV accounts for approximately 7.1% of respiratory tract infections. The virus appears to be distributed
worldwide and have a seasonal distribution with its incidence comparable to that for the influenza viruses
during winter. Serologic studies have shown that by the age of five, virtually all children have been exposed to
6
the virus. hMPV generally causes mild respiratory tract infection. However, small children, the elderly, and
immuno-compromised individuals are at risk for severe disease and hospitalization.
Sequence analyses of the hMPV genome have shown that hMPV strains circulating around the world can be
divided into two main genetic lineages (A and B) representing two serotypes, each comprising two sublineages
7
(A1, A2, B1, and B2).
Principle of the Procedure
The assay detects viral nucleic acids that have been extracted from a patient sample. A multiplex Real-time RTPCR reaction is carried out under optimized conditions in a single tube generating amplicons for RSV, hMPV
and the Process Control (PRC). Identification of RSV and hMPV and the PRC occurs by the use of target-specific
primers and fluorescent-labeled probes that hybridize to conserved regions in the NS2 and polymerase genes
of RSV and, polymerase gene of hMPV and the PRC.
Quidel Molecular Probe Labels
Target
RSV
hMPV
PRC
Dye
FAM
CAL Fluor® Red 610
Quasar® 670
The following is a summary of the procedure:
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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1.
Sample Collection: Obtain nasal or nasopharyngeal swabs specimens using standard techniques from
symptomatic patients. Transport, store, and process these specimens according to established laboratory
8
procedures.
2.
Nucleic Acid Extraction: Extract Nucleic Acids from the specimens with the NucliSENS® easyMAG® System
following the manufacturer’s instructions and using the appropriate reagents (See Materials Required but
Not Provided). Use of other extraction systems with the Quidel Molecular RSV+hMPV assay has not been
validated. Validated of these other systems is the responsibility of the end user.
Prior to the extraction procedure, add 20 µL of the Process Control (PRC) to each 180 µL aliquot of
specimen. The PRC serves to monitor inhibitors in the extracted specimen, assures that adequate
amplification has taken place, and confirms that the nucleic acid extraction was sufficient.
3.
Rehydration of Master Mix: Rehydrate the lyophilized Master Mix using the Rehydration Solution. The
Master Mix contains oligonucleotide primers, fluorophore and quencher-labeled probes targeting
conserved regions of RSV and hMPV, as well as the Process Control sequence.
4.
Nucleic Acid Amplification and Detection: Add 15 µL of the rehydrated Master Mix to each reaction tube
or plate well. Then add 5 µL of extracted nucleic acids (specimen with PRC) to the plate well or
appropriately labeled reaction tube. Place the tube or plate into either , the Life Technologies
QuantStudio™ Dx Real-Time PCR Instrument, Applied Biosystems® (ABI) 7500 Fast Dx instruments or the
Cepheid® SmartCycler II or, respectively.
Once the reaction tube or plate is added to the instrument, initiate the assay protocol. This protocol
initiates reverse transcription of the RNA targets generating complementary DNA, and the subsequent
amplification of the target sequences occurs. The Quidel Molecular RSV + hMPV assay is based on
TaqMan® chemistry and uses an enzyme with reverse transcriptase, DNA polymerase, and 5’-3’
exonuclease activities. During DNA amplification, this enzyme cleaves the probe bound to the
complementary DNA sequence, separating the quencher dye from the reporter dye. This step generates
an increase in fluorescent signal upon excitation by a light source of the appropriate wavelength. With
each cycle, additional dye molecules are separated from their quenchers resulting in additional signal. If
sufficient fluorescence is achieved the sample is reported as positive for the detected target sequence.
Materials Provided
SKU # M103
Detection Kit (96 Reactions) – Store at 2° to 8°C
#
Component
Quantity


Rehydration Solution Part M5003
1 vial/kit 1.9 mL
Quidel Molecular RSV + hMPV Master Mix Part M5035
12 vials/kit,
8 reactions/vial
Lyophilized Contents:
DNA polymerase enzyme with reverse transcriptase activity
Primers and probes
dNTPs
Stabilizers
Process Control Part M5005
1 vial/kit 2.0 mL
Optional Materials
External controls for RSV and hMPV (i.e. Quidel Molecular RSV + hMPV Control Set #M107 which serves as an
external processing and extraction control)
Materials Required But Not Provided
Micropipettors (range between 1 to 10 μL and 100 to 1000 μL)
Non-aerosol pipette tips
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument or Applied Biosystems 7500Fast Dx
instrument
96 well PCR plate
Optical plate films
Plate centrifuge for ABI 96 well plate
bioMerieux NucliSENS easyMAG software version 2.0
bioMerieux NucliSENS easyMAG Buffers 1, 2, 3
bioMerieux NucliSENS easyMAG Lysis Buffer
bioMerieux NucliSENS easyMAG Silica Magnetic Beads
bioMerieux NucliSENS easyMAG disposables
Or
Micropipettors (range between 1 to 10 μL and 100 to 1000 μL)
Non-aerosol pipette tips
Cepheid SmartCycler II
SmartCycler disposables
SmartCycler centrifuge
bioMerieux NucliSENS easyMAG software version 2.0
bioMerieux NucliSENS easyMAG Buffers 1, 2, 3
bioMerieux NucliSENS easyMAG Lysis Buffer
bioMerieux NucliSENS easyMAG Silica Magnetic Beads
bioMerieux NucliSENS easyMAG disposables
Warnings and Precautions
For In Vitro Diagnostic Use
Performance characteristics of this test have been established with the specimen types listed in the
Intended Use Section only. The performance of this assay with other specimen types or samples has not
been evaluated.
Use of extraction systems other than the NucliSENS easyMAG System has not been validated. Validation
of these system is the responsibility of the end-user.
Using cycling conditions other than those indicated in the Thermocycler Programming Instructions
section may give erroneous results.
Use of this product should be limited to personnel with sufficient training in PCR and RT-PCR techniques.
Treat all specimen/samples as potentially infectious. Follow universal precautions when handling samples,
this kit, and its contents.
Proper sample collection, storage, and transport are essential for correct results.
Store assay reagents as indicated on their individual labels.
Wear suitable protective clothing, gloves, eye, and face protection when using this kit.
For accurate results, pipette carefully using only calibrated equipment.
Thoroughly clean and disinfect all surfaces with a 10% bleach solution followed by molecular grade water.
Use micropipettes with an aerosol barrier or positive displacement tips for all procedures.
Avoid microbial and cross contamination of the kit reagents. Follow Good Laboratory Procedures.
Do not mix reagents from kits with different lot numbers.
Do not use reagents from other manufacturers with this kit.
Do not use product after its expiration date.
Proper workflow planning is essential to minimize contamination risk. Always plan laboratory workflow in
a uni-directional manner, beginning with pre-amplification and moving through amplification and
detection.
Use dedicated supplies and equipment in pre-amplification and amplification areas.
Do not allow cross movement of personnel or equipment between areas.
Keep amplification supplies separate from pre-amplification supplies at all times.
Do not open sample tubes or unseal plates post amplification.
Dispose of amplified material carefully and in accordance with local laws and regulations in order to
minimize the risk of amplicon contamination.
Do not use supplies dedicated for reagent or sample preparation for processing target nucleic acid.
MSDS is available upon request or can be accessed on the product website.
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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Storage and Handling of Kit Reagents
Store the unopened kit at 2° to 8°C until the expiration date listed on the outer kit box.
The rehydrated Master Mix may be stored at room temperature for up to 24 hours or at 2° to 8°C or ≤–
20°C for up to 2 days. The rehydrated Master Mix should be recapped, sealed with parafilm, and stored in
an upright position. Protect the Master Mix from light during storage.
Indications of Instability or Deterioration of Reagents
Cloudiness of the Rehydration Solution may indicate deterioration of this reagent. Contact Quidel Technical
Support for a replacement.
Specimen Collection, Storage, and Handling
Specimens used for the validation of the Quidel Molecular RSV + hMPV assay were obtained using standard
techniques from patients with upper respiratory tract infection symptoms. These specimens were collected,
transported, stored, and processed according to CLSI M41-A. Briefly, samples should be transported
refrigerated at 2 to 8 C and stored refrigerated (2 to 8 C) for 72 hours before processing. Any additional
leftover specimen should be stored ≤ -70 C.
A series of studies were preformed evaluating a number of routinely used viral transport medium at a volume
of 2mL: M4, M4-RT, M5, M6, and UTM. No significant difference in assay performance was seen between the
five different types of viral transport media.
Nucleic Acid Extracts Storage
Eluates can be stored at room temperature (20 to 25 C) for up to 4 hours, at 2 to 8 C for 6 hours and at –
20°C for 1 month. The extracted RNA is stable for up to three freeze/thaws cycles when stored at -20°C.
Nucleic Acid Extraction Programming Instructions
Note: A RSV/hMPV positive processing/extraction control (i.e. Quidel Molecular RSV + hMPV Control Set
#M107 or previously characterized positive RSV or hMPV specimen) and a negative process control (i.e., viral
transport media or previously characterized RSV and hMPV negative specimen) should be included in each
extraction run.
1. Turn on the instrument and wait for instrument light to appear orange. Then switch on the
computer/launch easyMAG software.
2.
Barcode reagents after pressing the ‘Instrument’
3.
To enter samples, press the ‘Daily Use’
screen. Select the following settings:
a.
Sample ID:
b.
Matrix:
c.
Request:
d.
Volume (mL):
e.
Eluate (µL):
f.
Type:Primary
g.
Priority:
4.
Upon pressing the ‘Save’
and ‘Reagent Inventory’
buttons.
button, which will default to the ‘Define Request’
Enter the sample name using the keyboard.
Select Other from the drop-down menu.
Select Generic from the drop-down menu.
Select 0.200 from the drop-down menu.
Select 50 from the drop-down menu.
Normal
button, the sample will appear in the ‘Unassigned Sample’ window on the
left side of the screen. Press the ‘Enter New Extraction Request’
button, and repeat the process
for additional samples. Alternatively multiple samples can be entered by pressing the ‘Auto Create New
Extraction Requests’
5.
button.
Once all samples are created, go to ‘Organize Runs’ by clicking on the
page. Create a run by pressing the ‘Create Run’
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
icon near the top of the
button. Enter a run name, or use the default.
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6.
Add samples to the run by using the ‘Auto Fill Run’
button (auto fills up to 24 samples from the
‘Unassigned Sample list’ on the left hand side of the screen). Alternatively, individual samples may be
moved into and out of the run by using the left and right ‘Positioning icons’
after selecting
the appropriate sample. The sample order within the run may be changed using the ‘Move Extraction
7.
8.
Request Up/Down’ buttons
.
Obtain 1 to 3 (for 8 to 24 samples, respectively) sample vessel(s), and add 20 µl of Process Control to each
sample well used.
Add 180 µl of each sample to the appropriate well as designated.
9.
Go to ‘Load Run’ by pressing the
button near the top of the screen. Insert tips and sample
vessel(s) into the instrument
10. Enter the barcode(s) of the sample vessel(s)
11. Enter the barcode(s) of silica beads to be used
12. Assign silica beads to samples as follows:
a. Click the reagents symbol below number 1 in the picture below. The lot number of the silica
beads should appear below the Silica tab at number 2 in the picture below.
b. Highlight and select the samples in the run for which beads need to be assigned (in the box
containing number 3 in the picture below)
c.
d.
Click the
positioning icon (below number 4 in the picture below) to assign the silica lot
number to the selected samples
If the bead symbol to the right of number 5 in the picture below is selected, the silica bead lot
number should be displayed for each sample
1
2
4
5
3
13. Print work list by touching ‘Load Run’ icon followed by pressing the ‘Print Work List’ icon
.
14. Press the ‘Dispense Lysis’
button. The on-board lysis will take approximately 12 minutes to
complete.
15. For each sample vessel, prepare magnetic particles using the Biohit pipettor and tips for up to eight
reactions as follows:
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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a.
b.
c.
d.
e.
f.
Using 1 tip and Program 1, aspirate 550 µl nuclease-free water and dispense into a 1.5 ml DNAse
/ RNAse free microfuge tube.
Vortex the magnetic silica. Using 1 tip and Program 1, aspirate 550 µl of magnetic silica, dispense
into the water and mix by vortexing.
Using 1 tip and Program 2, aspirate 1050 µl of the magnetic silica mixture and dispense 25 µl back
into the same tube.
Dispense 125 µl magnetic silica mixture 8 times into 8 wells of an ELISA strip plate. Discard tip.
After Lysis is complete (NB: the ‘Instrument Status’ at the bottom of the screen must be ‘IDLE’!),
using 8 tips and Program 3, aspirate 100 µl of magnetic silica mixture in strip wells, dispense 100
µl of magnetic silica mixture in strip wells, and aspirate 100 µl of magnetic silica mixture in strip
wells.
Insert tips into liquid within the sample vessels. Aspirate 800 µl, then dispense 900 µl of magnetic
silica mixture back into vessel. Aspirate 1000 µl of magnetic silica mixture from vessel, and
dispense 1000 µl of magnetic silica back into vessel. Repeat aspiration / dispensing of 1000 µl two
more times.
16. Close the instrument, and press the ‘Start’
button to begin the run.
17. Upon completion of the run, transfer purified nucleic acid to nuclease-free tubes. Eluates can be stored at
room temperature (20° to 25 C) for up to 4 hours, at 2 to 8°C for 6 hours and at –20°C for 1 month. The
extracted RNA is stable for up to three freeze/thaws cycles when stored at -20°C.
Initial Thermocycler Programming
SmartCycler II Programming Instructions
1.
2.
Launch the Cepheid SmartCycler Dx Version 3.0b software package.
Create the Quidel Molecular RSV + hMPV assay
a. Select the Define Assays button from the top of the screen
b. Name the assay:
i. Select the New button at the bottom left corner of the screen.
ii. Type in ‘Quidel Molecular RSV + hMPV’ and select OK .
iii. ‘Quidel Molecular RSV + hMPV’ will be added to the top of the Assay Name list located on the
upper left-hand of the screen.
c. Set the analysis values: Under the Assay Type: Research section, select the Analysis Settings tab, and
make sure the following specifications are set:
i. Select FCTC25 from the Dye Set drop-down menu.
ii. The Analysis Type drop-down menu should be set to Qualitative (Default setting).
iii. In the Channel Name column, enter ‘RSV’ for Channel 1, ‘hMPV’ for Channel 3 and ‘PRC’ for
Channel 4.
iv. In the Usage column, select Target from the drop down menus for RSV and hMPV, and select
Internal Control for PRC. When selecting Internal Control, a window below will pop up. Select
the Yes button.
v. In the Curve Analysis column, enter Primary Curve for each channel (RSV, hMPV, PRC) (Default
setting).
vi. In the Thresh Setting column, enter Manual Threshold for each channel (RSV, hMPV, PRC)
(Default setting).
vii. In the Manual Thresh Fluor Units column, enter the following thresholds:
a. RSV: 20.0
b. hMPV: 10.0
c. PRC: 10.0
viii. In the Valid Min Cycle column (scroll to the right if not immediately visible), enter 5 for each
channel (RSV, hMPV, PrC).
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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ix. In the Valid Max Cycle column (scroll to the right if not immediately visible), enter 50 for each
channel (RSV, hMPV, PrC).
x. In the Bkgnd Sub column, use “ON” for each channel (RSV, hMPV, PRC) (Default setting).
xi. In the Bkgnd Min Cycle column, enter 5 for each channel (RSV, hMPV, PRC).
xii. In the Bkgnd Max Cycle column, enter 35 for each channel (RSV, hMPV, PRC).
xiii. In the Boxcar Avg cycles column, keep 0 for each channel (RSV, hMPV, PRC) (Default setting).
xiv. In the End Pt Threshold column, enter 20, 10, 10 for each channel (RSV, hMPV, PRC) (Default
setting).
xv. In the NC IC% column, keep “NA” for each channel (PRC) (Default setting).
xvi. In the IC Delta column, keep “NA” for each channel (RSV, hMPV (Default setting)
xvii. In the Customize Result Text section (below the table), select Organism Based Result Text
from the drop-down menu. The warning window below will pop up. Select Yes.
xviii. Select the Customize button to open the Organism-Based Result Text dialog window. Select
the Add button, enter ‘RSV’ in the Organism Name column and check the RSV box. Select the
Add button again, enter ‘hMPV’ in the Organism Name column and check the hMPV box.
d.
Click OK at the bottom of the pop up window.
Set the RT-PCR cycling times and temperatures as follows:
i. Stage 1
1. Hold
2. Temp:
55.0
3. Secs:
300
4. Optics:
OFF
ii. Stage 2
1. Hold
2. Temp:
60.0
3. Secs:
300
4. Optics:
OFF
iii. Stage 3
1. Hold
2. Temp:
65.0
3. Secs:
300
4. Optics:
OFF
iv. Stage 4
1. 2-Temperature Cycle
2. Times to Repeat:
50
3. First Temperature Row:
a. Temp:
92.0
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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3.
b. Secs:
5
c. Optics:
OFF
4. Second Temperature Row
a. Temp:
57.0
b. Secs:
40
c. Optics:
ON
Save the protocol by selecting the Save button at the bottom of the screen.
Figure of the completed Quidel Molecular RSV + hMPV Protocol:
Applied Biosystems 7500 Fast DX Programming Instructions
1.
2.
Launch the ABI 7500 Fast Dx software package.
The Quick Startup document dialog window will open. Select the Create New Document button to start
the New Document Wizard. Follow each step to initiate the Quidel Molecular RSV + hMPV protocol.
a. Define Document: Most of the following should be the default setting. If not, change
accordingly.
i. Confirm or enter the following information:
Assay: Standard Curve (Absolute Quantitation)
Container: 96-Well Clear
Template: Blank Document
Run Mode: Fast 7500
Operator: your operator name
Comments: SDS v1.4
Plate Name: ’Quidel Molecular RSV + hMPV’
ii. Select the Next button.
iii. Select Detectors: New detectors for hMPV, RSV and the process control (PRC), must
be added. For each target, select the New Detector button to open the New
Detector pop-up window. Alternatively, use the Create Another button from within
the New Detector pop-up window for the last two detectors Enter the following
information for each detector:
Name Reporter Dye Quencher Dye Color
RSV
FAM
(none)
(Select)
hMPV Texas Red
(none)
(Select)
PRC
Cy5
(none)
(Select)
iv. Select a unique color to represent each detector.
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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v. Highlight the new detectors and add to the Detectors in Document column using
the Add button.
vi. Select (none) from the Passive Reference drop-down menu.
vii. Select the Next button.
viii. Select the Finish button without setting any wells.
b. The wizard will close, and the software will open, starting with the Setup tab. This will show
the sample plate that was set up during the quick start. For the initial set up, nothing
needs to be changed here.
c. Define the Thermocycler Protocol:
i. Select the Instrument tab to set up the Quidel Molecular RSV + hMPV RT-PCR
cycling times and temperatures.
ii. Under Thermal Profile there should be a default 2-stage protocol. Each stage will
have 3 user-editable text boxes. The top box value represents the number of reps or
cycles for that stage. The middle box value represents the temperature (˚C), and the
lowest box value represents the time (minutes: seconds).
iii. Make the following changes to the default Thermal Cycler Protocol:
1. Stage 1
a. Reps: 1
b. Temp: 55
c. Time: 5:00
2. Select the bar between Stage 1 and Stage 2. Select the Add Hold button to
add another stage.
3. Stage 2
a. Reps: 1
b. Temp: 60
c. Time: 5:00
4. Select the bar between Stage 2 and Stage 3. Select the Add Hold button to
add another stage.
5. Stage 3
a. Reps: 1
b. Temp: 65
c. Time: 5:00
6.
Stage 4 (2-Step Amplification Stage)
a. Reps: 10
b. Step 1
i. Temp: 92
ii. Time: 0:05
c. Step 2
i. Temp: 57
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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ii. Time: 0:40
Select the bar to the right of Stage 4. Select the Add Cycle button to add
another stage.
8. Stage 5 (2-Step Amplification Stage)
a. Reps: 35
b. Step 1
i. Temp: 92
ii. Time: 0:05
c. Step 2
i. Temp: 57
ii. Time: 0:40
9. If a wrong stage is added, the stage may be removed by pressing the
Delete button after highlighting the stage between the vertical lines.
iv. Under Settings, enter the following:
Sample Volume (μL): 20 (default)
Run Mode: 7500 Fast (default)
Data Collection: Stage 5, Step 2(57.0 @ 0:40)
NOTE: Do not check the check box next to ‘Expert Mode’.
7.
v. Final protocol
d. Set threshold for each analyte as follows:
i. Select the Results tab.
ii. Select the Amplification Plot tab.
iii. Select RSV from the Detector tab in the top right corner.
iv. In the Analysis Settings block, set the Threshold to 8.0e4.
v. Select the Auto Baseline radio button.
vi. Repeat iii-v for hMPV setting the Threshold to 5.4e4.
vii. Repeat iii-v for PRC setting the Threshold to 2.7e4.
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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viii. Repeat iii-v for PRC setting the Threshold to 2.7e4.
e. Save the new protocol as a template for future uses.
i. At the top of the screen select File and then Save As.
ii. Save In: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\.
iii. File name: ‘Quidel Molecular RSV + hMPV’.
iv. Save as type: ‘SDS Templates (*.sdt)’.
f. Exit the software.
QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument Dx Programming Instructions
Quidel Molecular provides a pre-defined template for the assay on a CD that must be uploaded to the
QuantStudio™ Dx instrument. Please contact a Quidel Representative at (800) 874-1517 (toll-free in the U.S.A.)
or (858) 552-1100, Monday through Friday, between 8:00 a.m. and 5:00 p.m., Eastern Time to obtain this CD.
These templates contain the run parameters such that no instrument programming is needed to get started.
To install a test definition document:
1. From the QuantStudio™ Dx Software Home tab, click Manage Test in the Tools panel.
2. From the Test Menu, click Install.
3. Navigate to your test definition document (.tdd) file, select the file, and click Open. The QuantStudio™
Dx Software automatically adds the selected test to the Test Menu.
4. Click Close to close the Test Menu and save your changes.
Assay Procedure
Run the following procedures at the controlled room temperature of 20 to 25 C.
Nucleic Acid Extraction Procedure
Refer to the bioMerieux NucliSENS easyMAG System Programming Instructions above.
1. Add 20 µL of the Process Control to the sample extraction well.
2. Add 180 µL of patient sample or external control to a sample extraction well.
3. Follow extraction procedure as per manufacturer’s instructions.
4. Eluates can be stored at room temperature (20 to 25 C) for up to 4 hours, at 2 to 8 C for 6 hours
and at -20 C for 1 month. The extracted RNA is stable for up to three freeze/thaws cycles when stored
at -20 C.
Master Mix Rehydration Procedure
1. Determine the number of specimens to be tested, and obtain the correct number of eight-test
lyophilized Master Mix vials for testing.
2. Return unused reagents to the appropriate storage conditions.
3. Open Master Mix carefully to avoid disruption of the pellet.
4. Add 135 µL of Rehydration Solution to the Master Mix.
5. Place vial at room temperature for 1-2 minutes to allow rehydration of pellet.
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
Page 13 of 26
6.
Gently pipette up and down 2-3 times (avoiding the formation of bubbles) prior to dispensing into the
first PCR tube or plate well.
Note: The rehydrated Master Mix is sufficient for eight reactions.
Note: The rehydrated Master Mix may be kept at room temperature for up to 24 hours or at 2 to 8 C
or ≤–20 C for up to 2 days. (See “Storage and Handling of Kit Reagents” section for additional storage
options).
RT-PCR Set-up Procedure:
1.
2.
3.
4.
5.
Add 15 µL of the rehydrated Master Mix to each reaction tube or plate well.
Add 5 µL of extracted nucleic acid (specimen with the process control) into the reaction tubes or plate
wells. Mixing of reagents is not required.
Note: Use a micropipettor with a new non-aerosol tip with each extracted specimen.
Close the reaction tubes or seal the plate.
Note: Quidel suggests that each thermocycler run should include a reaction tube or plate well with an
extracted RSV/hMPV External Positive Control (i.e., Quidel Molecular RSV + hMPV Control Set #M107
or previously characterized positive RSV or hMPV specimen) and a reaction tube or plate well with a
Negative Control controls in keeping with your lab practices and policies accordance with local, state,
federal accrediting organizations, as applicable.
Centrifuge the reaction tubes or plate for a minimum of 15 seconds. Ensure that all liquid is at the
bottom of the tube.
Insert tubes or plate into the thermocycler.
Amplification Protocol on the Cepheid SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Switch on SmartCycler Block(s).
Launch the SmartCycler Dx Version 3.0b software package.
Select the Create Run button from the top of the screen to set up the run.
Under Run Name, enter a name for the current run (e.g., YYMMDD-Quidel Molecular RSV + hMPV).
Under Notes, enter any notes about the run for future reference.
Under Assay, select the ‘Quidel Molecular RSV + hMPV’ assay from the drop-down menu.
Under Assay Information, enter lot number and expiration date of the kit.
To select the wells that will be used, do one of the following:
a. To automatically assign wells do the following:
i. Under Number of specimens, enter the number of samples in the provided text box.
ii. Select the Apply button. The entered number of rows will appear in the Site Table.
b. To manually choose wells on the SmartCycler blocks, do the following:
i. Select the Add/Remove Sites button towards the bottom of the screen.
ii. This will open the Select Sites pop-up window with two columns. The column on the left
(Sites) lists all available sites, and the column on the right (Selections) holds all selected
sites.
iii. To select all sites, click the Select All Sites button.
iv. To select specific sites, highlight one or more sites, and select the right arrow to add the
site(s) to the Selections column.
v. Select the OK button to close the window. The selected sites will appear in the Site Table.
Enter the sample identifiers under the Sample ID column within the Site Table (this can also be done
after the run is started).
Enter any notes under the Notes column, and leave the Sample Type column entries as ‘SPEC’.
Select the Start Run button at the bottom of the screen.
Select the View Results button to view the progress of the run.
Save the run after it is finished and prior to exiting the software.
Amplification Protocol on the Applied Biosystem 7500 Fast Dx Thermocycler
1.
2.
3.
4.
5.
Switch on 7500 Fast Dx.
Launch the 7500 Fast Dx software package.
The Quick Startup document dialog window will open.
Click on Create a new document.
Most of the following should be the default setting. If not, change accordingly.
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
Page 14 of 26
Assay:
Container:
96-Well Clear
Template:
Quidel Molecular RSV + hMPV
Run Mode:
Operator:
6.
7.
8.
Standard Curve (Absolute Quantitation)
Fast 7500
your operator name
Comments:
SDS v1.4 (add more if needed)
Plate Name:
YYMMDD-Quidel Molecular RSV + hMPV
Set Up Sample Plate:
a. Under the Setup and Plate tabs the plate setup will appear.
b. Select all wells that will contain sample, right-click and select the Well Inspector from the dropdown menu. When the Well Inspector pop-up window opens, select the detectors for RSV, hMPV
and PRC.
c. Use the Well Inspector to enter the sample names. Patient IDs may be entered in the Well
Inspector window; however, it is recommended that this is done prior to resuspending the
lyophilized master mix, post run, or using the import function to minimize the time the PCR
reactions will sit at room temperature prior to starting the run.
d. Save the run as YYMMDD-Quidel Molecular RSV + hMPV.sds.
e. A window will open asking for the “Reason for change of entry”. Enter “Setup” and any other
comments relevant to the run.
Starting the PCR:
a. Select the Instrument tab.
b. Insert the 96 well PCR plate into the machine.
c. Under Instrument Control, select the Start button to initiate the run.
Post PCR:
a. IMPORTANT: When the run is finished, press OK. Analyze the data by pressing the “Analyze”
button in the top menu, and save the file.
b. Save the file by pressing Save Document in the task bar. A window will open asking for the
“Reason for change of entry”. Enter “Data analysis post run” and any other comments relevant
to the run.
Amplification Protocol on the QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Switch on QuantStudio Dx.
Choose IVD mode on the instrument.
Launch the QuantStudio Dx IVD software package.
Enter the system Username included in every extraction and Password when prompted.
The Home screen window will open.
In the Setup box, highlight the previously loaded test name “Quidel Molecular RSV + hMPV.”
Click the Setup button to begin a RT-PCR run.
The Setup, Test Properties screen will be displayed. Enter run information accordingly.
a. Enter the Experiment Name (default setting launches the run with a date and time stamp).
b. Enter the Plate Barcode information.
c. Record material lot numbers under Reagent Information.
d. Save the run with a unique identifier as an “.sds” file (e.g., YYMMDD-runID#-Quidel Molecular C
difficile.sds).
e. A window will open asking for the “Reason for change of entry.” Enter “Setup” and any other
comments relevant to the run.
9. In the left menu bar, select Define.
10. Edit sample information.
a. Enter specific sample information for each well by deleting the default identifier (Patient 1,
Patient 2, etc.) and entering new information, OR
b. Select Import from File across the top of the display to upload a predefined plate map from a
Text (tab delimited) file.
11. In the left menu bar, select Assign to verify proper plate setup.
12. Loading the sample plate.
a. Eject the instrument tray.
b. Insert the 96-well PCR plate into the machine with the A1 well positioned in the top, left corner.
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
Page 15 of 26
c. Retract the instrument tray.
13. Starting the run.
a. In the left menu bar, select Run.
b. Click the green Start Run button at the top of the screen.
i. If prompted, select the serial number specific to the instrument being used.
14. When the run is complete, select Analysis in the left menu bar.
a. Save the file by pressing Save in the task bar. A window will open asking for the “Reason for
change of entry.” Enter “Data analysis post run” and any other comments relevant to the run.
b. The Amplification Plot will show by default. To view other plot types, select them from the left
menu bar.
c. To view run information with Ct values, select the Well Table tab in the right side of the screen.
15. Printing a report.
a. In the top menu bar, select Print Report. Customize the report contents by selecting or
deselecting boxes from the report window.
b. Select the “Print Report” button at the bottom of the dialogue box.
16. Exporting data files.
a. In the left menu bar, select Export.
b. Enter the Export File Location OR click Browse to locate the desired path.
c. The Export File Name will default to that of the saved run.
d. Select Excel as the file type.
e. Customize the exported data report by toggling across the provided tabs and selecting or
deselecting options.
Select Start Export along the bottom of the screen.
Interpretation of Results
Interpretation of Results using the Cepheid SmartCycler II
1. Select View Results tab after the run is finished.
2. Select Sample Results tab.
3. The SmartCycler II software will automatically report whether RSV and/or hMPV viral RNA has been
detected in the samples or whether the run was invalid (unresolved).
4. More detailed information may be found under the respective tabs of each analyte in the same window. If
there is a positive call for either RSV or hMPV (or both), the PRC result is not applicable. The PRC is only
required for negative calls.
Interpretation of the Quidel Molecular RSV + hMPV Assay Results on Cepheid SmartCycler II
Process
Assay Result
RSV
hMPV
Interpretation of Results
Control Result
RSV and hMPV nucleic acid not detected; PRC
Negative
Pass
NEG
NEG
Detected
RSV Positive
NA*
POS
NEG
RSV nucleic acid detected
hMPV Positive
NA*
NEG
POS
hMPV nucleic acid detected
RSV and hMPV
NA*
POS
POS
RSV and hMPV nucleic acid detected**
Positive
Unresolved – PCR inhibition or reagent failure.
Retest the same purified sample. If this test is also
Invalid
Fail
NEG
NEG
invalid, re‐extract and retest another aliquot of the
same sample or obtain a new sample and retest.
*No value is required for the Process Control to make a positive call.
** Dual infections are rare. Repeat testing using the same purified sample. If the retest confirms this result,
collect and test a new specimen. Contact Quidel if multiple samples provide this result.
Error Code 3079: Warning/Error Code 3079 may be observed with RSV and/or hMPV positive samples.
Warning/Error Code 3079 occurs when the fluorescence (RFU) signal is too high. In this case, all results for that
sample are reported by the Dx software as ND (Not Determined). If a Ct value ≥ 5 is reported for either virus,
the sample results may be recorded as Positive for the corresponding virus. If the Ct value is <5 the
corresponding virus is reported as Negative.
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
Page 16 of 26
Interpretation of Results using the ABI 7500 Fast Dx
Interpretation of the Quidel Molecular RSV + hMPV Assay Results on the 7500 Fast Dx Thermocycler
Detector:
Assay
Detector:
Detector:
Process
Interpretation of Results
Result
RSV
hMPV
Control
Undetermine
No RSV or hMPV viral RNA detected;
Negative
Undetermined
5.0 ≤ Ct ≤ 35.0
d
PRC Detected
Undetermine
RSV viral RNA detected
RSV Positive 5.0≤ Ct ≤35.0
NA*
d
hMPV
5.0 ≤ Ct ≤
Undetermined
NA*
hMPV viral RNA detected
Positive
35.0
RSV and
5.0≤ Ct ≤35.0
5.0≤ Ct ≤35.0
NA*
RSV and hMPV viral RNA detected**
hMPV
No RSV or hMPV viral RNA and no PRC
detected; invalid test.
Undetermine
Retest the same purified sample. If this
Invalid
Undetermined
Undetermined
d
test is also invalid, re‐extract and retest
another aliquot of the same sample or
obtain a new sample and retest.
*No Ct value is required for the Process Control to make a positive call.
** Dual infections are rare. Repeat testing using the same purified sample. If the retest confirms this result,
collect and test a new specimen. Contact Quidel if multiple samples provide this result.
Interpretation of Results using the QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
Interpretation of the Quidel Molecular RSV + hMPV Assay Results on the
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
Detector:
Assay
Detector:
Detector:
Interpretation of Results
RSV
Result
hMPV
Process Control
No Ct-value
No Ct-value
No RSV or hMPV viral RNA
Negative
Ct-value reported
Reported
Reported
detected; PRC Detected
RSV
No Ct-value
RSV viral RNA detected
Ct-value reported
NA*
Positive
Reported
hMPV
No Ct-value
Ct-value reported
NA*
hMPV viral RNA detected
Positive
Reported
RSV and
RSV and hMPV viral RNA
Ct-value reported
Ct-value reported
NA*
hMPV
detected**
No RSV or hMPV viral RNA
and no PRC detected;
invalid test.
Retest the same purified
No Ct-value
No Ct-value
No Ct-value
Invalid
sample. If this test is also
Reported
Reported
Reported
invalid, re‐extract and
retest another aliquot of
the same sample or obtain
a new sample and retest.
*No Ct value is required for the Process Control to make a positive call.
** Dual infections are rare. Repeat testing using the same purified sample. If the retest confirms this result,
collect and test a new specimen. Contact Quidel if multiple samples provide this result.
Quality Control
The Quidel Molecular RSV+hMPV assay incorporates several controls to monitor assay performance.
1. The Process Control should be used during extraction and amplification in the assay. This control should
be added to each sample aliquot prior to extraction.
2. Commercially available external positive RSV/hMPV controls may be treated as a patient specimen and
should be used in accordance with your lab standards. Previously characterized positive RSV or hMPV
specimens may be used in lieu of a commercial RSV/hMPV control.
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
Page 17 of 26
3.
Viral transport media or previously characterized negative specimen may be used as an external negative
control. This must be treated as a patient specimen and should be performed in accordance with currently
lab standards.
Limitations
This test is not intended to differentiate RSV or hMPV subtypes. Additional testing is required if subtype
differentiation is required.
Negative results do not preclude infection with RSV or hMPV and should not be the sole basis of a
treatment decision.
As with other assays of this type, there is a risk of false negative results due to the presence of sequence
variants in the viral target.
Improper collection, storage, or transport may lead to false negative results.
Inhibitors present in the sample and/or errors in following the assay procedure may lead to false negative
results.
A trained health care professional should interpret assay results in conjunction with the patient’s medical
history, clinical signs and symptoms, and the results of other diagnostic tests.
The performance of the assay has not been established in individuals who received nasally administered
corticosteroids.
The performance of the assay has not been established in individuals who received nasally administered
Influenza vaccine.
Results from the analytical studies show that at 2x LoD the B2 subtype of hMPV was inhibited by RSV at a
level 10,000 above the reported RSV LoD on the ABI 7500 Fast Dx. The same study performed on the
Cepheid SmartCycler II demonstrated that at 2x LoD the B2 subtype of hMPV was inhibited by RSV at a
level 3 logs above the reported RSV LoD. The incidence of co-infection with RSV and hMPV seen in the
current clinical trial for the Quidel Molecular RSV + hMPV Assay was 0.1% (1/949). This low prevalence,
and may vary depending on the prevalence and population tested.
Expected Values
Clinical studies were performed with the Quidel Molecular RSV + hMPV assay using the Cepheid SmartCycler®
II platform and the Applied Biosystems® 7500 Fast Dx. Testing was performed with prospective specimens
received from throughout the United States in the winter of 2012 (January 2012 to March 2012). The table
below provides the expected value for each virus on the two instruments.
Expected Values for the Winter of 2012
Instrument
RSV
Cepheid SmartCycler® II
15.6% (158/1014)
Applied Biosystems® 7500 Fast Dx
16.4% (166/1012)
hMPV
14.6% (148/1014)
15.5% (157/1012)
A smaller clinical study was performed with the Quidel Molecular RSV + hMPV assay using Life Technologies
QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument. Testing was performed with prospective specimens received from
throughout the United States in the winter of 2013 (January 2013 to February 2013). The table below provides
the expected value for each virus on the two instruments.
Expected Values for the Winter of 2013
Instrument
RSV
Life Technologies QuantStudio Dx Real- 18.6% (59/317)
Time PCR Instrument
hMPV
14.4% (45/317)
Clinical Performance
Performance characteristics of the Quidel Molecular RSV + hMPV assay using the Cepheid SmartCycler® II
instrument and the Applied Biosystems® 7500 Fast Dx platform were established during a prospective study
during the 2012 respiratory virus season (January to March 2012). Samples used for this study were fresh (414)
and frozen (600) swab specimens that were collected for routine respiratory virus testing four sites across the
United States. A single specimen was collected per patient and tested (direct specimen DFA and culture with
DFA). The residual samples were extracted with the bioMériuex easyMAG and tested with Quidel Molecular
RSV + hMPV assay using both the ABI 7500 Fast Dx instrument and the Cepheid SmartCycler II instrument.
Aliquots of each specimen were sent to a central location for testing with a FDA Cleared hMPV molecular test.
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
Page 18 of 26
The age demographics
Applied BioSystem 7500 Fast Dx
Age
Group
(years)
Cepheid SmartCycler II
RSV
Positive
Prevalence
hMPV
Positive
Prevalence
total
tested
<1
72
28.3%
38
15.0%
254
71
27.5%
35
13.6%
258
1 to 5
72
19.9%
76
21.5%
354
67
19.0%
73
20.7%
352
6 to 10
6
4.5%
17
12.7%
134
6
4.5%
16
11.9%
134
11 to 15
3
4.8%
7
11.3%
62
3
4.8%
6
9.7%
62
16 to 21
3
9.1%
1
3.0%
33
3
9.1%
1
3.0%
33
>21
10
5.7%
18
10.3%
175
8
4.6%
17
9.7%
175
157
15.5%
1012*
158
15.6%
148
14.6%
1014
Total
166
16.4%
* Two specimens were Invalid.
RSV
hMPV
Positive Prevalence Positive Prevalence
total
tested
Prospective Clinical Study – Cepheid SmartCycler® II
One thousand and fourteen (1014) specimens were tested by both the subject and comparative methods for
RSV. One (1) specimen was contaminated and three (3) were toxic in cell culture (0.4%). These four (4)
specimens have been excluded from analysis. Results for the remaining one thousand and ten (1010)
specimens are detailed in the table below.
Combined Site - Respiratory syncytial virus
DSFA & Cell Culture w/DFA
POS
NEG
Total
Sensitivity
97.9%
POS
137
21*
158
Specificity
97.6%
Quidel Molecular
RSV + hMPV
NEG
3
849
852
Total
140
870
1010
* All originally discordant specimens were positive for RSV by an FDA-cleared RT-PCR assay.
95% CI
93.9%
99.3%
96.3%
98.4%
Nine hundred and sixty (960) specimens were tested by both the subject and comparative devices for hMPV
(the comparator device was unavailable to complete comparison testing for fifty-four (54) specimens). Nine
(9) specimens were invalid in the comparative device (0.9%). These nine (9) specimens have been excluded
from analysis. Results for the remaining nine hundred and fifty-one (951) specimens are detailed in the table
below.
Combined Site - Human metapneumovirus
FDA Cleared hMPV Molecular Test
POS
NEG
Total Positive percent agreement
145
3
148
Negative percent agreement
Quidel Molecular POS
RSV + hMPV
NEG
5
798
803
Total
150
801
951
96.7%
99.6%
95% CI
92.4% 98.6%
98.9% 99.9%
Prospective Clinical Study - Applied Biosystems® 7500 Fast Dx
One thousand and fourteen (1014) specimens were tested by both the subject and comparative methods for
RSV. One (1) specimen was contaminated and three (3) were toxic in cell culture (0.4%). Two (2) specimens
were invalid in the subject methods (0.2%). These six (6) specimens have been excluded from analysis. Results
for the remaining one thousand and eight (1008) specimens are detailed in the table below.
Combined Site - Respiratory syncytial virus
DSFA & Cell Culture w/DFA
95% CI
POS
NEG
Total
Sensitivity
98.6% 94.9%
99.6%
POS
138
28*
166
Specificity
96.8% 95.4%
97.8%
Quidel Molecular
RSV + hMPV
NEG
2
840
842
Total
140
868
1008
* 25 of 28 originally discordant specimens were positive for RSV by a FDA-cleared RT-PCR assay.
Nine hundred and sixty (960) specimens were tested by both the subject and comparative devices for hMPV
(the comparator device was unavailable to complete comparison testing for fifty-four (54) specimens). Nine (9)
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
Page 19 of 26
specimens were invalid in the comparative device (0.9%). Two (2) specimens were invalid in the subject
methods (0.2%). These eleven (11) specimens have been excluded from analysis. Results for the remaining
nine hundred and forty-nine (949) specimens are detailed in the table below.
Combined Site - Human metapneumovirus
FDA Cleared hMPV Molecular Test
POS
NEG
Total Positive percent agreement
147
9
156
Negative percent agreement
Quidel Molecular POS
RSV + hMPV
NEG
3
790
793
Total
150
799
949
98.0%
98.9%
95% CI
94.3% 99.3%
97.9% 99.4%
Prospective Clinical Study – Life Technologies QuantStudio Dx
Performance characteristics of the Quidel Molecular RSV + hMPV assay using the Life Technologies
QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument was established during a prospective study during the 2013
respiratory virus season (January to February 2013). Samples used for this study were fresh (317) swab
specimens that were collected for routine respiratory virus testing in the United States. A single specimen was
collected per patient and tested (direct specimen DFA and culture with DFA) for RSV immediately after
collection. The specimens were extracted with the bioMériuex easyMAG and tested with Quidel Molecular RSV
+ hMPV assay. Aliquots of each specimen were sent to a central location for testing with a FDA cleared hMPV
molecular test.
Respiratory syncytial virus
DSFA & Cell Culture w/DFA
95% CI
POS
NEG
Total
Sensitivity
100%
92%
100%
POS
45
14*
59
Specificity
95%
92%
97%
Quidel Molecular
RSV + hMPV
NEG
0
258
258
Total
45
272
317
* Of the fourteen (14) False Positive RSV samples by the QM RSV + hMPV Assay, nine (9) are positive for RSV
using a CE-marked Assay.
Human metapneumovirus
FDA Cleared hMPV Molecular Test
POS
NEG
Total Positive percent agreement
43
2
45
Negative percent agreement
Quidel Molecular POS
RSV + hMPV
NEG
0
268
268
Total
43
270
313
* Four specimens are INVALID on comparator and not included in this table
100%
99%
95% CI
92%
100%
97%
100%
Analytical Performance
Level of Detection
The analytical sensitivity (limit of detection or LoD) of the Quidel Molecular RSV + hMPV assay was determined
using quantified (TCID50/mL) cultures of 2 RSV strains and 4 hMPV strains (1 A1, 1 A2, 1 B1, 1B2) serially
diluted in negative nasopharyngeal matrix. Each dilution was extracted in replicates of 20 per concentration of
virus using the NucliSENS easyMAG System and tested on the three platforms (only the hMPV subtypes A2 and
B2 were tested on the QuantStudio). Analytical sensitivity (LoD) is defined as the lowest concentration at
which 95% of all replicates tested positive.
LoD Value Summary
Virus
RSV A
RSV B
hMPV-A1
hMPV-A2
hMPV-B1
hMPV-B2
LoD TCID50/mL
7500 Fast Dx
6.29E-01
7.5E-01
1.7E+01
4.17E+00
1.05E+00
3.21E+00
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
LoD TCID50/mL
SmartCycler
1.89E+00
2.25E+00
2.65E+01
4.17E+00
7.88E+00
9.63E+00
LoD TCID50/mL
QuantStudio
6.29E-01
2.25E-01
2.91E+00
2.25E+00
Page 20 of 26
Analytical Reactivity (Inclusivity)
The reactivity of the Quidel Molecular RSV + hMPV assay was evaluated against multiple strains of RSV and
hMPV. The analytical reactivity panel consisted of 5 RSV strains and 11 hMPV strains (2 A-1, 2 A-2, 2 B-1, 4 B-2,
and 1 non-typed). Each panel member was extracted using the NucliSens easyMAG instrument and tested in
triplicate on both the Cepheid SmartCycler II and ABI 7500 Fast Dx platforms.
RSV Inclusivity Panel
Subtype
Strain
TCID50/mL
A (NIBSC)
A
B
B
B
A-2
A-2
Washington
9320
CH9318(1B)
N/A
5.67E+00
2.25E+00
2.25E+00
2.25E+00
Quidel Molecular
RSV + hMPV assay
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
hMPV Inclusivity Panel
Subtype
Strain
TCID50/mL
A1
A1
A2
A2
B1
B1
B2
B2
B2
B2
hMPV (NIBSC)
IA3-2002 G Gene
IA10-2003
IA14-2003 G Gene
Clinical Isolate
Peru2-2002 G Gene
Peru3-2003 G Gene
Peru1-2002 G Gene
Peru6-2003
IA18-2003 G Gene
IA18-2003 G Gene
N/A
7.95E+01
7.95E+01
1.25E+1
1.25E+1
2.36E+01
2.36E+01
9.63E+00
9.63E+00
9.63E+00
9.63E+00
N/A
Quidel Molecular
RSV + hMPV assay
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
The Quidel Molecular RSV + hMPV assay detected 100% of the RSV and hMPV strains tested on both the ABI
7500 Fast Dx and Cepheid SmartCycler® II platforms.
Reproducibility Study
The reproducibility of the Quidel Molecular Influenza RSV + hMPV assay was evaluated at 3 laboratory sites.
Reproducibility was assessed using a panel of 4 simulated samples that include medium positive and low
positive, high negative RSV, hMPV and negative samples. Panels and controls were tested at each site by 2
operators for 5 days (triplicate testing x 2 operators x 5 days x 3 sites = 90 results per level for each virus). The
LoD values were based on the values obtained in the LoD study. The panels and controls were extracted using
the bioMérieux easyMAG system and tested on the Cepheid SmartCycler II and the Applied Biosystems 7500
Fast DX.
Reproducibility Results – Cepheid SmartCycler II
Site 1
Panel Member ID
AVE Ct*
8/30
Site 2
%CV
Positive
Results
AVE Ct*
44.3
9.3
6/30
30/30
31.2
7.3
30/30
29.6
RSV Negative
0/30
RSV Negative Control
Site 3
Total
Positive
Results
%CV
Positive
Results
AVE Ct*
%CV
47.4
5.4
1/30
48.7
N/A
15/90
30/30
31.4
4.1
30/30
30.9
1.5
90/90
5.7
30/30
29.7
3.1
30/30
29.5
2.0
90/90
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
RSV Positive Control
30/30
30.0
1.8
30/30
31.0
3.3
30/30
30.6
1.2
90/90
hMPV High Negative
0.15x LoD
12/30
34.3
8.3
6/30
41.8
6.3
8/30
34.9
6.4
26/90
RSV High Negative
0.05x LoD
RSV Low Positive
2x LoD
RSV Med Positive 5x
LoD
Positive
Results
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
Page 21 of 26
Reproducibility Results – Cepheid SmartCycler II
Site 1
Panel Member ID
%CV
AVE Ct*
31.1
6.7
30/30
30/30
29.3
2.0
0/30
N/A
hMPV Negative Control 0/30
hMPV Positive Control
hMPV Negative
AVE Ct*
30/30
Site 2
Positive
Results
hMPV Low Positive
2x LoD
hMPV Med Positive 5x
LoD
Positive
Results
30/30
Site 3
Total
Positive
Results
%CV
Positive
Results
AVE Ct*
%CV
32.2
6.2
30/30
31.1
3.3
90/90
30/30
29.9
3.2
30/30
29.8
3.4
90/90
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
30.3
1.4
30/30
30.9
1.9
30/30
30.8
2.5
90/90
* Average Ct based on the average of only positive results. Ct values of 0 were left out of this calculation.
Reproducibility Results – Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Site 1
Panel Member ID
%CV
AVE Ct*
30.7
8.3
3/30
30/30
23.7
7.4
30/30
20.5
RSV Negative
0/30
RSV Negative Control
RSV Positive Control
Total
Positive
Results
%CV
AVE Ct*
%CV
33.8
2.4
9/30
32.3
4.0
26/90
30/30
23.8
3.1
30/30
23.4
4.5
90/90
4.0
30/30
21.8
2.2
29/29
21.1
2.2
89/89
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
30/30
19.7
6.5
30/30
20.0
8.5
30/30
19.6
1.9
90/90
14/30
24.9
19.5
6/30
29.1
10.2
10/30
25.1
16.9
30/90
30/30
21.0
8.7
30/30
21.5
4.1
30/30
21.6
5.8
90/90
30/30
18.9
3.3
30/30
19.6
3.0
29/29
19.2
2.6
89/89
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
hMPV Negative Control 0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
19.7
3.9
30/30
20.0
1.7
30/30
19.9
1.4
90/90
hMPV Negative
hMPV Positive Control
14/30
Site 3
Positive
Results
hMPV High Negative
0.15x LoD
hMPV Low Positive
2x LoD
hMPV Med Positive 5x
LoD
AVE Ct*
Site 2
Positive
Results
RSV High Negative
0.05x LoD
RSV Low Positive
2x LoD
RSV Med Positive 5x
LoD
Positive
Results
30/30
* Average Ct based on the average of only positive results. Ct values of 0 were left out of this calculation.
Analytical Specificity – Cross-reactivity
The analytical specificity of the Quidel Molecular RSV + hMPV assay was evaluated by testing a panel consisting
of 34 viruses, 26 bacteria and 1 yeast strain representing common respiratory pathogens or flora commonly
present in nasopharynx. Samples were extracted using the NucliSENS easyMAG instrument and tested in
triplicate on both the Applied Biosystems 7500 Fast Dx and the Cepheid SmartCycler II. Analytical specificity of
the Quidel Molecular RSV + hMPV assay was 100%.
Organisms used for the study were the following:
Viruses
Influenza A/Mexico/4108/2009, Influenza B/Florida/04/2006, Adenovirus 1/Adenoid 71, Adenovirus 2,
Adenovirus 3, Adenovirus 4, Adenovirus 5, Adenovirus 7, Adenovirus 11, Adenovirus 14, Adenovirus 31,
Coronavirus NL63, Coronavirus 229E, Coronavirus OC43, Coxsackievirus B4, Coxsackievirus B5/10/2006,
Cytomegalovirus, Echovirus 7, Echovirus 9, Echovirus 6, Echovirus 11, Enterovirus 71, Enterovirus 70, Epstein
Barr Virus, HSV Type 1 Maclnytre strain, Human Rhinovirus, HSV Type 2 G strain, Measles virus, Mumps virus,
Parainfluenza Type 1, Parainfluenza Type 2, Parainfluenza Type 3, Parainfluenza Type 4, Varicella Zoster Virus
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
Page 22 of 26
Bacteria
Bordetella pertussis, , Bordetella bronchiseptica, Chlamydophila pneumonia, Chlamydia trachomatis, Legionella
pneumophila, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycoplasma
pneumoniae, Haemophilus influenza, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, Neisseria mucosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Moraxella
catarrhalis, Corynebacterium diptheriae, Lactobacillus plantarum, Streptococcus pneumonia, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus salivarius, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus.
Yeast
Candida albicans
Analytical Specificity – Interfering Substances
The performance of Quidel Molecular RSV + hMPV assay was evaluated with potentially interfering substances
that may be present in nasopharyngeal specimens. The potentially interfering substances were evaluated using
RSV B and hMPV B1 at a concentration of 3x and 10x LoD. There was no evidence of interference caused by
the substances tested at 3x or 10x LoD.
Substance Name
Mucin (Bovine Submaxillary Gland, type I-S)
Blood (human), EDTA anticoagulated
Neo-Synephrine
Afrin Nasal Spray
Zicam Homeopathic Non-Drowsy Allergy
Relief No Drip Liquid Nasal Gel
Concentration Tested
60 µg/mL
2% (vol/vol)
15% (vol/vol)
15% (vol/vol)
Saline Nasal Spray
15% (vol/vol) of dose
Throat Lozenges
Zanamivir
Tobramycin
Mupirocin
Oseltamivir phosphate
5% (vol/vol)
0.68g/mL; 1/18 drop, crushed; active
ingredients: 1.7 mg/mL menthol
3.3-5 mg/mL
4.0 µg/mL
6.6-10 mg/mL
7.5-25 mg/mL
Carryover and Cross-contamination Studies
In an internal study there was no evidence of carry-over/cross contamination with the Quidel Molecular RSV +
hMPV assay using the NucliSENS easyMAG automated nucleic acid extraction instrument and the three
thermocycler platforms. Applied Biosystems 7500 Fast Dx or the Cepheid SmartCycler.
Customer and Technical Support
To place an order or for technical support, please contact a Quidel Representative at (800) 874-1517 (toll-free
in the U.S.A.) or (858) 552-1100 (outside the U.S.A), Monday through Friday, between 8:00 a.m. and 5:00 p.m.,
Eastern Time. Orders may also be placed by fax at (740) 592-9820. For e-mail support contact
[email protected] or [email protected]. For services outside the U.S., please
contact your local distributor. Additional information about Quidel, our products, and our distributors can be
found on our website quidel.com.
Intellectual Property
Trademarks
Smartcycler® is a registered trademark of Cepheid Corporation. Applied Biosystems® is a registered trademark
of Life Technologies. NucliSENS® and easyMAG® are registered trademarks of bioMerieux, Inc. TaqMan® is a
registered trademark of Roche. CAL Flour® Red 610 and Quasar®670 are registered trademarks of BioSearch
Technologies, Inc.
Patents
Dye compounds in this product are sold under license from BioSearch Technologies, Inc. and protected by U.S.
and world-wide patents either issued or under application.
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
Page 23 of 26
The purchase of this product grants the purchaser rights under certain Roche patents to use it solely for
providing human in vitro diagnostic services. No general patent or other license of any kind other than this
specific right of use from purchase is granted hereby.
This product is covered by U.S. Pat. Nos. 7,531,342; 7,449,374; international counterparts thereof; other U.S.
and international Patents Pending.
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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Glossary
Contents / Contains
Control
Consult instructions for use
Intended Use
96
Contains sufficient for 96 determinations
Biological risks
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
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References
1
2
3
4
5
6
7
8
Glezen et. Al. 1986. American journal of diseases of children (1960) 140(6): 543–6.
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van den Hoogen, B. G. et al. 2004. EID. 10:658-666.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Viral Culture; Approved Guidelines. CLSI document M41-A [ISBN
1562386239] Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
Pennsylvania 19087-1898, USA 2006.
M103 – Quidel Molecular RSV+hMPV Assay Kit
MDSS GmBH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Germany
Quidel Corporation
Worldwide Headquarters
10165 McKellar Court
San Diego, CA 92121 USA
quidel.com
M103en v2013MAR13
Quidel Molecular RSV+hMPV Assay (CE)
Page 26 of 26
Test RSV+ hMPV
Instructions d'utilisation
Pour la détection qualitative et l'identification du virus respiratoire syncytial et du génome
ARN viral du métapneumovirus humain extrait par prélèvement nasaux et rhinopharyngiens
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 1 sur 28
Sommaire
Utilisation prévue.................................................................................................................................... 3
Résumé et explication ............................................................................................................................. 3
Principe de la procédure ......................................................................................................................... 3
Matériel fourni ........................................................................................................................................ 4
Matériel facultatif ................................................................................................................................... 4
Matériel requis non fourni ...................................................................................................................... 5
Mises en garde ........................................................................................................................................ 5
Stockage et manipulation des kits de réactifs ........................................................................................ 6
Prélèvement, stockage et manipulation ................................................................................................. 6
Stockage des extraits d'acide nucléique ................................................................................................. 6
Instructions de programmation de l'extraction des acides nucléiques .................................................. 6
Programmation initiale du thermocycleur ............................................................................................. 9
Instructions de programmation du SmartCycler II ............................................................................. 9
Instructions de programmation de l'instrument Applied Biosystems 7500 Fast DX ........................11
Instructions de programmation de l'appareil ACP en temps réel QuantStudio Dx ..........................14
Procédure de test..................................................................................................................................14
Protocole d'amplification sur l’instrument Cepheid SmartCycler II .................................................15
Protocole d'amplification sur le thermocycleur Applied Biosystem 7500 Fast Dx ...........................16
Protocole d'amplification sur l'appareil d'ACP en temps réel QuantStudio Dx ................................16
Interprétation des résultats ..................................................................................................................17
Interprétation des résultats à l'aide du Cepheid SmartCycler II .......................................................17
Interprétation des résultats en utilisant l'ABI 7500 Fast Dx .............................................................18
Interprétation des résultats à l'aide de l'appareil de détection en temps réel d'ACP QuantStudio Dx
..........................................................................................................................................................18
Contrôle qualité ....................................................................................................................................19
Limitations ............................................................................................................................................19
Valeurs attendues .................................................................................................................................20
Performance clinique ............................................................................................................................20
Performances analytiques ....................................................................................................................22
Niveau de détection ..........................................................................................................................22
Réactivité analytique (inclusivité) .....................................................................................................23
Étude de reproductibilité ..................................................................................................................23
Tableau Spécificité analytique – réactivité croisée...........................................................................25
Spécificité analytique – Substances interférentes ............................................................................25
Études de rémanence et de contamination croisée .........................................................................26
Assistance clientèle et technique .........................................................................................................26
Propriété intellectuelle .........................................................................................................................26
Marques déposées ............................................................................................................................26
Brevets ..............................................................................................................................................26
Glossaire................................................................................................................................................27
Références ............................................................................................................................................28
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 2 sur 28
Utilisation prévue
Le test moléculaire RSV + hMPV Quidel est un test multiplexé d’ACP en temps réel pour la détection qualitative
et l'identification du virus respiratoire syncytial et du génome ARN du métapneumovirus humain à partir de
prélèvements nasaux et rhinopharyngiens sur des patients qui montrent des signes et des symptômes
d'infection respiratoire. Ce test de diagnostic in vitro est destiné à faciliter le diagnostic différentiel des
infections dues au virus respiratoire syncytial et au métapneumovirus humain en parallèle des facteurs de
risques cliniques et épidémiologiques. Ce test n'est pas destiné à différencier les deux sous-types de RSV ou les
quatre sous-lignées génétiques du hMPV.
Des résultats négatifs ne signifient pas l’absence d’infection au RSV ou au hMPV. Ils ne doivent pas être utilisés
comme la seule base du diagnostic, d'un traitement ou d'autres décisions de prise en charge des patients.
Résumé et explication
RSV: Le virus respiratoire syncytial humain (RSV) est un virus à ARN simple brin négatif de la famille des
paramyxoviridae. Le virus RSV est la principale cause d'infection des voies respiratoires inférieures et de
consultation à l'hôpital pendant la petite enfance et l'enfance. Aux États-Unis, 60 % des nourrissons sont
infectés au cours de leur première saison RSV, et presque tous les enfants sont infectés par ce virus entre l'âge
1
de 2 et 3 ans. Parmi les personnes infectées par le RSV, 2 à 3 % vont développer une bronchiolite, nécessitant
2
une hospitalisation. L'infection naturelle par le RSV induit une immunité protectrice qui décline au fil du
temps, peut-être plus rapidement que les autres infections virales respiratoires. Ces personnes peuvent ainsi
être infectées à plusieurs reprises. Parfois, un enfant peut développer plusieurs fois la même infection
symptomatique, même au cours de la même saison RSV. De graves infections RSV ont été décelées chez des
patients de plus en plus âgés.
Les sous-types A et B du RSV sont présents simultanément ou alternativement au cours des épidémies
annuelles. Plusieurs études ont montré qu’une bronchiolite induite par le RSV-A est plus grave qu’une
3
bronchiolite induite par le RSV-B.
hMPV : Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus à ARN simple brin négatif de la famille des
4
paramyxoviridae isolé pour la première fois aux Pays-Bas en 2001. Le hMPV est la seconde cause d'infection
respiratoire inférieure (après le RSV) chez les jeunes enfants. En comparaison avec le RSV, l'infection par le
hMPV a tendance à se manifester chez les enfants légèrement plus âgés et à induire une maladie moins grave.
Une co-infection par les deux virus peut se produire et est habituellement associée à une maladie plus grave.
5
Le hMPV représente environ 7,1 % des infections des voies respiratoires. Le virus semble être disséminé dans
le monde entier et présente une distribution saisonnière avec une incidence comparable à celle des virus de la
grippe au cours de l'hiver. Des études sérologiques ont montré qu'à l'âge de cinq ans, pratiquement tous les
6
enfants ont été exposés au virus. Le hMPV provoque habituellement une infection légère des voies
respiratoires. Toutefois, les jeunes enfants, les personnes âgées et les personnes immunodéprimées
présentent un risque de complication puis d'hospitalisation.
Le séquençage du génome hMPV a montré que les souches hMPV, qui circulent dans le monde entier, peuvent
être divisées en deux lignées génétiques principales (A et B) représentant les deux sérotypes, comprenant
7
chacun deux sous-lignées (A1, A2, B1, et B2).
Principe de la procédure
Le test détecte les acides nucléiques viraux qui ont été extraits à partir d'un échantillon du patient. Une
réaction d’ACP multiplexée en temps réel est réalisée dans des conditions optimisées dans un seul tube
générant des amplicons pour le RSV, le hMPV et la solution témoin. L’identification du RSV, du hMPV et du
témoin se produit grâce à l'utilisation d’amorces spécifiques de la cible et des sondes fluorescentes qui
hybrident les régions conservées dans le NS2 et les gènes polymérases du RSV, et le gène polymérase du hMPV
et du témoin.
Étiquettes de sonde moléculaire Quidel
Cible
RSV
hMPV
ACP
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Colorant
FAM
CAL Fluor® Red 610
Quasar® 670
Page 3 sur 28
Voici un résumé de la procédure :
1. Prélèvement : Obtenir les écouvillons de prélèvement nasal ou rhinopharyngien sur des patients
symptomatiques à l'aide des techniques standard. Transporter, stocker et traiter ces échantillons,
8
conformément aux procédures de laboratoire établies.
2.
Extraction des acides nucléiques : Extraire les acides nucléiques des échantillons avec le système
NucliSENS® easyMAG® en suivant les instructions du fabricant et en utilisant les réactifs appropriés (voir
les équipements requis mais non fournis). L'utilisation d'autres systèmes d'extraction avec le kit de test
RSV + hMPV de Quidel n'a pas été validée. La validation de ces autres systèmes relève de la responsabilité
de l'utilisateur final.
Avant la procédure d'extraction, ajouter 20 µL de solution témoin dans chaque aliquote d’échantillon de
180 µL. Le témoin contrôle les inhibiteurs dans l'échantillon extrait, assure que l'amplification adéquate a
eu lieu et confirme que l'extraction de l'acide nucléique est suffisante.
3.
Réhydratation du mélange étalon : Réhydrater le mélange étalon lyophilisé en utilisant la solution de
réhydratation. Le mélange étalon contient des oligonucléotides amorces, des sondes libérant un
fluorophore et d’extinction ciblant les régions conservées des RSV et hMPV, ainsi que la séquence témoin.
4.
Amplification et détection de l'acide nucléique Ajouter 15 µL de mélange étalon réhydraté dans chaque
tube de réaction ou puits de plaque. Puis ajouter 5 µL d’acides nucléiques extraits (échantillon avec
témoin) dans les puits ou dans le tube à réaction étiqueté approprié. Placer le tube ou la plaque soit dans
un appareil d’ACP en temps réel Life Technologies QuantStudio™ Dx, un appareil Applied Biosystems®
(ABI) 7500 Fast Dx ou un Cepheid® SmartCycler II, ou respectivement.
Une fois que le tube à réaction ou la plaque est ajoutée dans l'instrument, initier le protocole de test. Ce
protocole lance la transcription inverse de l'ARN cible générant de l’ADN complémentaire. L'amplification
des séquences cibles se produit ensuite. Le test RSV + hMPV de Quidel est basé sur le principe chimique
TaqMan® et utilise des enzymes avec transcriptase inverse, ADN polymérase et activités exonucléases 5'-3
'. Pendant l'amplification de l'ADN, cette enzyme clive la sonde liée à la séquence ADN complémentaire,
séparant alors l'inhibiteur de signal fluorescent du rapporteur fluorescent. Cette étape génère une
augmentation du signal de fluorescence lors de l'inhibition par une source de lumière de longueur d'onde
appropriée. Avec chaque cycle, d'autres molécules de colorant sont séparées de leurs solutions
d’extinction résultant en un signal supplémentaire. Si une fluorescence suffisante est obtenue,
l'échantillon est considéré comme positif pour la séquence cible détectée.
Matériel fourni
SKU n°M103
Kit de détection (96 réactions) – Entreposé entre 2 et 8 °C
#
Composant
Quantité


Solution de réhydratation Réf. M5003
1 fiole / kit de 1,9 mL
Mélange étalon RSV + hMPV Quidel Réf. M5035
12 fioles / kit,
8 réactions / fiole
Contenus lyophilisés :
Enzyme ADN polymérase avec activité transcriptase inverse
Amorces et sondes
dNTPs
Stabilisants
Témoin Réf. M5005
1 fiole / kit de 2,0 mL
Matériel facultatif
Témoins externes pour le RSV et le hMPV (par ex. l'ensemble de témoins moléculaires RSV + hMPV n°M107 qui
sert de traitement externe et de témoin d'extraction)
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 4 sur 28
Matériel requis non fourni
Micropipeteurs (plage comprise entre 1 et 10 μL et 100 et 1 000 μL)
Embouts de pipette sans aérosol
Appareil de d'ACP en temps réel Life Technologies QuantStudio Dx ou instrument Applied Biosystems
7500 Fast Dx
Plaque ACP 96 puits
Films pour plaque optique
Plaque centrifuge pour plaque ABI à 96 puits
Logiciel NucliSENS easyMAG version 2.0 de bioMérieux
Tampons 1, 2, 3 NucliSENS easyMAG de bioMérieux
Tampon de lyse NucliSENS easyMAG de bioMérieux
Perles magnétiques de silice NucliSENS easyMAG de bioMérieux
Matériels jetables bioMérieux NucliSENS easyMAG
Ou
Micropipeteurs (plage comprise entre 1 et 10 μL et 100 et 1 000 μL)
Embouts de pipette sans aérosol
Cepheid SmartCycler II
SmartCycler jetable
SmartCycler centrifuge
Logiciel NucliSENS easyMAG version 2.0 de bioMérieux
Tampons 1, 2, 3 NucliSENS easyMAG de bioMérieux
Tampon de lyse NucliSENS easyMAG de bioMérieux
Perles magnétiques de silice NucliSENS easyMAG de bioMérieux
Matériels jetables bioMérieux NucliSENS easyMAG
Mises en garde
Usage en Diagnostic In Vitro
Les caractéristiques de performance de ce test ont été établies avec les types d'échantillons indiqués dans
la section Utilisation prévue uniquement. La mise en œuvre de ce test avec d'autres types d'échantillons
ou de spécimens n'a pas été évaluée.
L’utilisation d’un système d’extraction différent du NucliSENS easyMAG n'a pas été validée. La validation
de ces systèmes relève de la responsabilité de l'utilisateur final.
L’utilisation de conditions de cycle autres que celles indiquées dans la section Instructions de
programmation du thermocycleur peut donner des résultats erronés.
L’utilisation de ce produit doit être limitée aux personnes parfaitement formées aux techniques de
solutions témoin et d’ACP en temps réel.
Traiter tous les spécimens/échantillons comme étant potentiellement infectés. Suivre les précautions
universelles lors de la manipulation des échantillons, de ce kit et de son contenu.
Le prélèvement, l’entreposage et le transport adéquats des échantillons sont indispensables pour obtenir
des résultats corrects.
Stocker les réactifs du test comme indiqué sur leurs étiquettes individuelles.
Porter des vêtements de protection, des gants ainsi que des lunettes de protection et un masque lors de
l'utilisation de ce kit.
Pour des résultats précis, pipeter soigneusement en utilisant uniquement un équipement calibré.
Nettoyer et désinfecter toutes les surfaces avec une solution à 10 % de javel puis avec de l'eau de qualité
moléculaire.
Utiliser des micropipettes avec une barrière aérosol ou des embouts volumétriques pour toutes les
procédures.
Éviter toute contamination croisée et microbienne des réactifs du kit. Suivre les procédures de bonnes
pratiques de laboratoire.
Ne pas mélanger les réactifs provenant de kits avec des numéros de lot différents.
Ne pas utiliser de réactifs d'autres fabricants avec ce kit.
Ne pas utiliser le produit après sa date de péremption.
Une planification appropriée du déroulement est essentielle pour minimiser le risque de contamination.
Toujours planifier le déroulement des tâches de laboratoire d'une manière unidirectionnelle, à
commencer par la pré-amplification puis seulement l'amplification et la détection.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 5 sur 28
Utiliser des fournitures et un équipement dédiés dans les zones de pré-amplification et d'amplification.
Ne pas autoriser le déplacement du personnel et des équipements entre les zones.
Toujours tenir à l'écart les fournitures pour pré-amplification et celles employées dans le cadre de
l’amplification.
Ne pas ouvrir les tubes d'échantillons ou les plaques non-scellées après l’amplification.
Mettre les matériaux amplifiés au rebut avec précaution et conformément aux lois et règlements locaux
afin de minimiser le risque de contamination induit par les amplicons.
Ne pas utiliser les fournitures dédiées à la préparation des réactifs ou des échantillons pour le traitement
de l'acide nucléique cible.
Une fiche de données de sécurité est disponible sur simple demande ou peut être consultée sur le site
Web du fabricant.
Stockage et manipulation des kits de réactifs
Conserver le kit encore scellé entre 2 et 8 °C jusqu'à la date de péremption indiquée à l'extérieur du
conditionnement du kit.
Le mélange étalon réhydraté peut être conservé à température ambiante pendant une durée maximale de
24 heures ou à une température comprise entre 2 et 8 °C ou une température ≤ –20 °C pendant une durée
maximale de 2 jours. Le mélange étalon réhydraté doit être rebouché, scellé avec du parafilm et conservé
en position verticale. Protéger le mélange étalon de la lumière pendant le stockage.
Indications d'instabilité ou de détérioration des réactifs
Une nébulosité dans la solution de réhydratation peut indiquer une détérioration de ce réactif. Contacter
l’assistance technique Quidel pour un remplacement.
Prélèvement, stockage et manipulation
Les échantillons utilisés pour la validation du test RSV + hMPV Quidel ont été obtenus auprès de patients
présentant des symptômes d’infection des voies respiratoires supérieures à l'aide de techniques standard. Ces
échantillons ont été recueillis, transportés, entreposés puis traités selon la norme CLSI M41-A. En résumé, les
échantillons doivent être transportés en conditions réfrigérées entre 2 et 8 C puis conservés au réfrigérateur
(2 à 8 C) pendant les 72 heures précédant le traitement. Tout reste d'échantillon doit être conservés à une
température inférieure ou égale à -70 C.
Une série d'études a été menée pour l'évaluation d'un moyen couramment utilisé de transport des virus avec
un volume de 2 mL : M4, M4-RT, M5, M6, et UTM. Aucune différence d'importance au cours de la réalisation
des test n'a été constatée entre ces cinq modes de transport des virus.
Stockage des extraits d'acide nucléique
Les éluats peuvent être conservés à température ambiante (entre 20 et 25 C) pendant 4 heures, entre 2 et
8 C pendant 6 heures et à -20 °C pendant 1 mois. L'ARN extrait reste stable pour trois cycles de
congélation/décongélation lorsqu'il est conservé à -20 °C.
Instructions de programmation de l'extraction des acides nucléiques
Remarque: Un témoin positif RSV/hMPV au traitement ou à l'extraction (par ex. l'ensemble de témoins RSV +
hMPV Quidel n°M107 ou des échantillons déclarés positifs au RSV et au hMPV) et un témoin négatif (par ex. un
moyen de transport viral ou un échantillon déclaré négatif au RSV et au hMPV) doivent être intégrés à chaque
cycle d'extraction.
1. Mettre l’instrument sous tension et attendre que le voyant orange de l’instrument s’allume. Mettre le PC
sous tension et lancer le logiciel easyMAG.
2.
Scanner le code à barres des réactifs après avoir appuyé sur les boutons « Instrument »
« Inventaire des réactifs »
3.
et
.
Pour entrer les échantillons, appuyer sur le bouton « Utilisation quotidienne »
(, qui ouvre par
défaut l'écran « Définir la requête »
. Sélectionner les paramètres suivants :
a. ID échantillon : Entrer le nom de l'échantillon à l'aide du clavier.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 6 sur 28
b.
c.
d.
e.
f.
g.
4.
Matrice :
Requête :
Volume (mL) :
Éluat (µL) :
Type :
Priorité :
Sélectionner Autre dans le menu déroulant.
Sélectionner Générique dans le menu déroulant.
Sélectionner 0,200 dans le menu déroulant.
Sélectionner 50 dans le menu déroulant.
primaire
normale
En cliquant sur le bouton « Enregistrer »
, l'échantillon va apparaître dans la fenêtre « Échantillon
non-attribué » sur le côté gauche de l'écran. Cliquer sur le bouton « Entrer une nouvelle demande
d'extraction »
, et répéter le traitement des échantillons supplémentaires. Par ailleurs, plusieurs
échantillons peuvent être entrés en appuyant sur le bouton « Création automatique de nouvelles
demandes d'extraction »
5.
.
Dès que tous les échantillons sont créés, aller à « Organiser les tests » en cliquant sur l'icône
haut de la page. Créer un test en utilisant le bouton « Créer un test »
utiliser le nom par défaut.
6.
en
. Entrer un nom de cycle ou
Ajouter des échantillons au test en utilisant le bouton « Test à remplissage automatique »
(permettant de remplir automatiquement jusqu'à 24 échantillons à partir de la « Liste d'échantillons non
attribués » située sur le côté gauche de l'écran). Alternativement, des échantillons individuels peuvent
être insérés ou retirés du test en utilisant les « icônes de positionnement » situées à gauche et à droite
après avoir sélectionné l'échantillon approprié. L'ordre des échantillons au sein du test
peut être changé en utilisant les boutons « Déplacer les demandes d'extraction vers le haut / vers le bas »
7.
8.
.
Obtenir 1 à 3 récipients d'échantillon (pour respectivement 8 à 24 échantillons) et ajouter 20 µL de
solution témoin pour chaque puits d'échantillon utilisé.
Ajouter 180 µL de chaque échantillon dans le puits approprié.
9.
Aller à « Charger un test » en cliquant que le bouton
en haut de l'écran. Insérer les embouts et
le(s) récipient(s) d'échantillon dans l'instrument.
10. Entrer le(s) code(s) à barres du(des) récipient(s) d'échantillon.
11. Entrer le(s) code(s) à barres des billes de silice à utiliser.
12. Attribuer des billes de silice aux échantillons comme suit :
a. Cliquer sur le symbole des réactifs en dessous du repère 1 dans l'image ci-dessous. Le numéro de
lot des billes de silice doit apparaître sous l'onglet Silice au numéro 2 de l'image ci-dessous.
b. Mettre en surbrillance et sélectionner les échantillons de test pour lesquels des billes doivent
être attribuées (dans la boîte avec le repère 3 dans l'image ci-dessous).
c.
d.
Cliquer sur
l'icône de positionnement (sous le numéro 4 de l'image ci-dessous) pour
assigner le numéro de lot des billes de silice aux échantillons sélectionnés .
Si le symbole des billes situé à droite du numéro 5 de l'image ci-dessous est sélectionné, le
numéro de lot des billes de silice doit apparaître pour chaque échantillon.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 7 sur 28
1
2
4
5
3
13. Imprimer la liste de travail en cliquant sur l'icône « Charger le cycle » puis sur l'icône « Imprimer la liste de
travaux »
.
14. Cliquer sur le bouton « Distribuer des tampons de lyse »
. La réalisation de la lyse prendra environ
12 minutes.
15. Pour chaque récipient contenant un échantillon, préparer des particules magnétiques à l'aide de la pipette
Biohit et suivre les conseils pour un maximum de huit réactions comme suit :
a. En utilisant 1 embout et le programme 1, aspirer 550 µL d’eau sans nucléase et distribuer le tout
dans un tube microfuge de 1,5 mL sans DNase / RNase.
b. Agiter la silice magnétique. En utilisant 1 embout et le programme 1, aspirer 550 µL de silice
magnétique, verser dans l'eau et mélanger à l'aide d'un agitateur vortex.
c. En utilisant 1 embout et le programme 2, aspirer 1050 µL de silice magnétique et reverser 25 µL
dans le même tube.
d. Verser 125 µL de mélange de silice magnétique à 8 reprises dans 8 puits d'une plaque ELISA. Jeter
l'embout.
e. Une fois que la lyse est terminée (Remarque : le « statut de l'instrument » en bas de l'écran doit
indiquer « EN ATTENTE » (IDLE) !), aspirer 100 µL de mélange de silice magnétique dans la bande
de puits en utilisant 8 embouts et le programme 3, verser 100 µL de mélange de silice
magnétique dans la bande de puits, puis aspirer 100 µL de mélange de silice magnétique dans la
bande de puits.
f. Insérer les embouts dans le liquide contenu dans les récipients d'échantillon. Aspirer 800 µL, puis
reverser 900 µL de mélanger de silice magnétique dans le récipient. Aspirer 1 000 µL de mélange
de silice magnétique dans le récipient, et reverser 1 000 µL de mélange de silice magnétique dans
le récipient. Répéter encore deux fois la procédure d'aspiration et de distribution de 1 000 µL.
16. Fermer l'instrument et appuyer sur le bouton « Démarrer »
pour démarrer le cycle.
17. Dès la fin du test, transférer l'acide nucléique purifié dans des tubes sans nucléase. Les éluats peuvent être
conservés à température ambiante (entre 20 ° et 25 C) pendant 4 heures, entre 2 et 8 °C pendant
6 heures et à -20 °C pendant 1 mois. L'ARN extrait reste stable pour trois cycles de
congélation/décongélation lorsqu'il est conservé à -20 °C.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 8 sur 28
Programmation initiale du thermocycleur
Instructions de programmation du SmartCycler II
1.
2.
Lancer le progiciel Cepheid SmartCycler Dx Version 3.0b.
Créer le test RSV + hMPV Quidel
a. Sélectionner le bouton Définir les dosages en haut de l'écran.
b. Nommer le test :
i. Sélectionner le bouton Nouveau en bas à gauche de l'écran.
ii. Saisir « Quidel Molecular RSV + hMPV » et sélectionner OK.
iii. « Quidel Molecular RSV + hMPV » sera ajouté au début de la liste Nom du test en haut à
gauche de l'écran.
c. Définir les valeurs d'analyse : Dans la section Type de test : recherche, sélectionner l'onglet
Paramètres d'analyse et s'assurer que les spécifications suivantes sont bien définies :
i. Sélectionner FCTC25 dans le menu déroulant Kit colorant
ii. Le menu déroulant Type d'analyse doit être réglé sur Qualitatif (par défaut).
iii. Dans la colonne Nom de canal, entrer « RSV » pour le canal 1, « hMPV » pour le canal 3 et
« PRC » pour le canal 4.
iv. Dans la colonne Utilisation, sélectionner Cible partir des menus déroulants pour RSV et hMPV,
et sélectionner Témoin interne pour PRC. La fenêtre illustrée ci-dessous s'affiche lors de la
sélection du Témoin interne. Cliquer sur le bouton Oui.
v. Dans la colonne Courbe d'analyse, entrer une Courbe primaire pour chaque canal (RSV, hMPV,
PRC) (réglage par défaut).
vi. Dans la colonne Réglage du seuil, entrer Seuil manuel pour chaque canal (RSV, hMPV, PRC)
(réglage par défaut).
vii. Dans la colonne Seuil manuel unités fluorescentes, entrer les seuils suivants :
a. RSV : 20,0
b. hMPV : 10,0
c. ACP : 10,0
viii. Dans la colonne Cycle min. valide (faire défiler vers la droite si la colonne n'est pas
immédiatement visible), entrer 5 pour chaque canal (RSV, hMPV, PRC).
ix. Dans la colonne Cycle max. valide (faire défiler vers la droite si la colonne n'est pas
immédiatement visible), entrer 50 pour chaque canal (RSV, hMPV, PRC).
x. Dans la colonne Bkgnd Sub, utiliser « ON » pour chaque canal (RSV, hMPV, PRC) (réglage par
défaut).
xi. Dans la colonne Bkgnd Min Cycle, saisir 5 pour chaque canal (RSV, hMPV, PRC).
xii. Dans la colonne Bkgnd Max Cycle, saisir 35 pour chaque canal (RSV, hMPV, PRC).
xiii. Dans la colonne Boxcar Avg cycles, garder 0 pour chaque canal (RSV, hMPV, PRC) (réglage par
défaut).
xiv. Dans la colonne End Pt Threshold, entrer 20, 10, 10 pour chaque canal (RSV, hMPV, PRC)
(réglage par défaut).
xv. Dans la colonne NC IC%, laisser « S.O. » pour chaque canal (témoin) (réglage par défaut).
xvi. Dans la colonne IC Delta, garder «S.O.» pour chaque canal (RSV, hMPV) (réglage par défaut)
xvii. Dans la section Personnaliser le libellé du résultat (sous le tableau), sélectionner Libellé du
résultat basé sur l'organisme dans le menu déroulant. La fenêtre de mise en garde
représentée ci-dessous s'affiche. Cliquer sur Oui.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 9 sur 28
xviii. Cliquer sur le bouton Personnaliser pour ouvrir la fenêtre de dialogue Libellé du résultat basé
sur l'organisme. Cliquer sur le bouton Ajouter, entrer « RSV » dans la colonne Nom de
l'organisme et cocher la case RSV . Cliquer de nouveau sur le bouton Ajouter, entrer « hMPV »
dans la colonne Nom de l'organisme et cocher la case hMPV.
Cliquer sur OK en bas de la fenêtre contextuelle.
Régler les temps de cyclage de l’ACP en temps réel et les températures comme suit :
i. Niveau 1
1. T° de
2. Temp. :
55,0
3. Secondes : 300
4. Optiques : OFF
ii. Niveau 2
1. T° de
2. Temp. :
60,0
3. Secondes : 300
4. Optiques : OFF
iii. Niveau 3
1. T° de
2. Temp. :
65,0
3. Secondes : 300
4. Optiques : OFF
iv. Étape 4
1. Cycle de température 2
2. Nombre de répétitions :
50
3. Première ligne de température :
a. Temp. :
92,0
b. Secondes : 5
c. Optiques : OFF
4. Deuxième ligne de température
a. Temp. :
57,0
b. Secondes : 40
c. Optiques : ON
Enregistrer le protocole en cliquant sur le bouton Enregistrer en bas de l'écran.
d.
3.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 10 sur 28
Représentation du protocole Quidel Molecular RSV+hMPV terminé :
Instructions de programmation de l'instrument Applied Biosystems 7500 Fast DX
1.
2.
Lancer le progiciel ABI 7500 Fast Dx.
La fenêtre de dialogue Document de démarrage rapide s'ouvre. Cliquer sur le bouton Créer un nouveau
document pour démarrer l'Assistant Nouveau Document. Suivre chaque étape pour initier le protocole
RSV + hMPV Quidel.
a. Définir un document: Ce qui suit concerne le paramétrage par défaut. Sinon, modifier en
conséquence.
i. Confirmer ou entrer les informations suivantes :
Test : Courbe standard (quantification absolue)
Conteneur : transparent avec 96 puits
Modèle : document vide
Mode d'exécution : Fast 7500
Opérateur : le nom de l'opérateur
Commentaires : SDS v1.4
Désignation de la
« Quidel Molecular RSV + hMPV »
plaque :
ii. Cliquer sur le bouton Suivant.
iii. Sélectionner les détecteurs: De nouveaux détecteurs doivent être ajoutés pour
hMPV, RSV et la solution témoin . Pour chaque cible, cliquer sur le bouton Nouveau
détecteur pour ouvrir la fenêtre Nouveau détecteur. Il est également possible
d'utiliser le bouton Créer un autre dans la fenêtre contextuelle Nouveau détecteur
pour les deux derniers détecteurs. Saisir les informations suivantes pour chaque
détecteur :
Produit
Colorant de
Colorant
Couleur
chimique notification
d'extinction
RSV
FAM
(aucun)
(sélectionner)
hMPV
Rouge Texas
(aucun)
(sélectionner)
ACP
Cy5
(aucun)
(sélectionner)
iv. Sélectionner une couleur unique pour représenter chaque détecteur.
v. Mettre en surbrillance les nouveaux détecteurs et les ajouter dans la colonne
Détecteurs dans un document en utilisant le bouton Ajouter.
vi. Sélectionner aucun dans le menu déroulant Référence passive.
vii. Cliquer sur le bouton Suivant.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 11 sur 28
b.
c.
viii. Cliquer sur le bouton Terminer sans définir le moindre puits.
L'assistant se ferme et le logiciel s'ouvre, puis démarre avec l'onglet Installation. Cela va
faire apparaître la plaque d'échantillon qui a été installée pendant le démarrage rapide.
Rien ne doit être changé ici pour l'installation initiale.
Définir le protocole du thermocycleur :
i. Cliquer sur l'onglet Instrument pour configurer les temps de cyclage de l’ACP en
temps réel RSV + hMPV Quidel ainsi que les températures.
ii. Sous l'option Profil thermique se trouve un protocole par défaut à 2 niveaux.
Chaque niveau comporte 3 zones de texte modifiables par l'utilisateur. La valeur de
la zone supérieure représente le nombre de répétitions ou de cycles pour ce niveau.
La valeur de la zone intermédiaire représente la température (˚C), et la valeur de
zone inférieure représente le temps (minutes:secondes).
iii. Apporter les changements suivants au protocole du thermocycleur par défaut :
1. Niveau 1
a. Répétition :
1
b. Temp. :
55
c. Durée :
5:00
2. Sélectionner la barre entre le Niveau 1 et le Niveau 2. Sélectionner le
bouton Ajouter un stade pour ajouter un autre stade.
3. Niveau 2
a. Répétition :
1
b. Temp. :
60
c. Durée :
5:00
4. Sélectionner la barre entre le Niveau 2 et le Niveau 3. Sélectionner le
bouton Ajouter un stade pour ajouter un autre stade.
5. Niveau 3
a. Répétition :
1
b. Temp. :
65
c. Durée :
5:00
6.
7.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Niveau 4 (niveau d'amplification en 2 étapes)
a. Répétition :
10
b. Étape 1
i. Temp. : 92
ii. Durée : 0:05
c. Étape 2
i. Temp. : 57
ii. Durée : 0:40
Sélectionner la barre sur la droite du Niveau 4. Cliquer sur le bouton
Ajouter un cycle pour ajouter un autre cycle.
Page 12 sur 28
8.
Niveau 5 (niveau d'amplification en 2 étapes)
a. Répétition : 35
b. Étape 1
i. Temp. : 92
ii. Durée : 0:05
c. Étape 2
i. Temp. : 57
ii. Durée : 0:40
9. Si un niveau erroné est ajouté, ce niveau peut être supprimé en appuyant
sur le bouton Supprimer après avoir mis en surbrillance le niveau entre les
lignes verticales.
iv. Entrer les informations suivantes sous Paramètres :
Volume d'échantillon (μL) : 20 (par défaut)
Mode d'exécution : 7500 Fast (par défaut)
Collecte des données : Niveau 5, étape 2 (57,0 à 0:40)
REMARQUE : Ne pas cocher la case à côté de « Mode expert ».
v. Protocole final
d.
Définir un seuil pour chaque analyse comme suit :
i. Sélectionner l'onglet Résultats.
ii. Sélectionner l'onglet Tracé d'amplification.
iii. Sélectionner RSV dans l'onglet Détecteur situé dans le coin supérieur droit.
iv. Dans le bloc Paramètres d'analyse, régler le seuil sur 8,0e5.
v. Sélectionner le bouton radio Base de référence auto.
vi. Répéter iii-v pour hMPV en réglant le seuil sur 5,4e4.
vii. Répéter iii-v pour le témoin en réglant le seuil sur 2,7e4.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 13 sur 28
viii. Répéter iii-v pour le témoin en réglant le seuil sur 2,7e4.
e.
f.
Enregistrer le nouveau protocole comme modèle pour de futures utilisations.
i. En haut de l'écran, cliquer sur Fichier puis sur Enregistrer sous.
ii. Enregistrer sous : D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\.
iii. Nom de fichier : « Quidel Molecular RSV + hMPV »
iv. Type d'enregistrement : « Modèles SDS (*.sdt) ».
Quitter le logiciel.
Instructions de programmation de l'appareil ACP en temps réel QuantStudio Dx
Le test Quidel fournit un modèle prédéfini d'un test sur CD qui doit être téléchargé sur l'appareil QuantStudio™
Dx. Veuillez contacter un représentant Quidel au +1 800 874 1517 (appel gratuit depuis les États-Unis) ou le
+1 858 552 1100 du lundi au vendredi de 8h à 17h (heure de l'est) pour recevoir votre CD. Ces modèles
contiennent les paramètres d'exécution. Aucune programmation de l'appareil n'est requise pour démarrer.
Procédure d'installation d'un document de définition de test :
1. À partir de l'onglet d'accueil du logiciel QuantStudio™ Dx, cliquer sur Gérer les tests dans la fenêtre
Outils.
2. À partir du menu Test, cliquer sur Installer .
3. Accéder au fichier (.tdd) correspondant au document de définition de test, sélectionner le fichier et
cliquer sur Ouvrir. Le logiciel QuantStudio™ Dx ajoute automatiquement le test choisi dans le menu
Test.
4. Cliquer sur Fermer pour fermer le menu Test et enregistrer les modifications.
Procédure de test
Exécuter les procédures suivantes, à une température ambiante régulée entre 20 et 25 C.
Procédure d'extraction des acides nucléiques
Se reporter aux instructions de programmation du système NucliSENS easyMAG de bioMerieux ci-dessus.
1. Ajouter 20 µL de la solution témoin dans le puits d'extraction de l'échantillon.
2. Ajouter 180 µL de l'échantillon du patient ou de solution témoin externe dans un puits d’extraction
d'échantillons.
3. Suivre la procédure d'extraction selon les instructions du fabricant.
4. Les éluats peuvent être conservés à température ambiante (20 à 25 C) pendant 4 heures maxi, et
entre 2 et 8 C pendant 6 heures et à -20 C pendant 1 mois. L'ARN extrait reste stable pour trois
cycles de congélation et décongélation lorsqu'il est conservé à -20 C.
Procédure de réhydratation du mélange étalon
1. Déterminer le nombre de spécimens destinés à être testés et obtenir le nombre correct de huit fioles
de mélange étalon lyophilisé pour les tests.
2. Retourner les réactifs non utilisés dans les conditions de stockage appropriées.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 14 sur 28
3.
4.
5.
6.
Ouvrir soigneusement le mélange étalon pour éviter toute perturbation des pastilles.
Ajouter 135 µL de solution de réhydratation au mélange étalon.
Placer la fiole à température ambiante pendant 1 à 2 minutes afin de permettre la réhydratation des
pastilles.
Pipeter doucement de haut et en bas à 2 ou 3 reprises (en évitant la formation de bulles) avant toute
distribution dans le premier tube ou puits de témoin.
Remarque : Le mélange étalon réhydraté est suffisant pour huit réactions.
Remarque : Le mélange étalon réhydraté peut être conservé à température ambiante pendant
24 heures maxi ou entre 2 et 8 C ou à une température inférieure ou égale à -20 C pendant 2 jours
maxi. (Voir « Manipulation et entreposage des kits de réactifs » pour les options de stockage
supplémentaires)
Procédure d'installation de l’ACP en temps réel :
1.
2.
3.
4.
5.
Ajouter 15 µL de mélange étalon réhydraté dans chaque tube de réaction ou puits de plaque.
Ajouter 5 µL d'acide nucléique extrait (spécimen avec le témoin) dans les tubes à réaction ou les puits.
Le mélange des réactifs n'est pas nécessaire.
Remarque : Utiliser une micropipette pourvue d’un nouvel embout sans aérosol avec chaque
échantillon extrait.
Fermer les tubes réactionnels ou sceller la plaque.
Remarque : Quidel suggère que chaque cycle du thermocycleur contienne un tube à réaction ou un
puits de plaque avec un témoin externe positif RSV/hMPV extrait (par ex. un ensemble de témoins
RSV + hMPV n°M107 Quidel ou un échantillon déjà déclaré positif au RSV ou hMPV) et un tube à
réaction ou une plaque de puits avec un témoin négatif, conformément aux pratiques de votre
laboratoire et aux politiques locales et nationales qui s'appliquent à votre organisme, le cas échéant.
Centrifuger les tubes réactionnels ou la plaque pendant 15 secondes minimum. Faire en sorte que
tout le liquide se trouve au fond du tube.
Insérer les tubes ou la plaque dans le thermocycleur.
Protocole d'amplification sur l’instrument Cepheid SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Mettre le(s) bloc(s) SmartCycler sous tension.
Lancer le progiciel SmartCycler Dx Version 3.0b.
Cliquer sur le bouton Créer un cycle en haut de l'écran pour configurer le cycle.
Sous Nom du cycle, entrer un nom pour le cycle en cours (par ex., AAMMJJ-Quidel Molecular
RSV + hMPV).
Sous Notes, entrer des notes concernant le cycle pour référence ultérieure.
Sous Test, sélectionner « Quidel Molecular RSV + hMPV » dans le menu déroulant.
Sous Informations de test, entrer un numéro de lot et la date d'expiration du kit.
Pour sélectionner les puits qui seront utilisés, procéder avec l'une des options suivantes :
a. Pour attribuer automatiquement des puits, procéder comme suit :
i. Sous Nombre d’échantillons, entrer le nombre d'échantillons dans la zone de texte prévue.
ii. Cliquer sur le bouton Appliquer. Le nombre de lignes entrées apparaît dans le tableau des
sites.
b. Pour choisir manuellement les puits sur les blocs du SmartCycler, procéder comme suit :
i. Cliquer sur le bouton Ajouter / supprimer des sites en bas de l'écran.
ii. Cela va ouvrir la fenêtre contextuelle Sélectionner des sites avec deux colonnes. La colonne
de gauche (Sites) récapitule tous les sites disponibles et la colonne de droite (Sélections)
contient tous les sites sélectionnés.
iii. Pour sélectionner tous les sites, cliquer sur le bouton Sélectionner tous les sites.
iv. Pour sélectionner des sites spécifiques, mettre en évidence un ou plusieurs sites puis cliquer
sur la flèche droite pour ajouter le(s) site(s) dans la colonne Sélections.
v. Cliquer sur le bouton OK pour fermer la fenêtre. Les sites sélectionnés vont apparaître dans
le Tableau des sites.
Entrer les identifiants d'échantillons dans la colonne ID échantillon du Tableau des sites (cette
opération peut être réalisée après le démarrage du cycle).
Entrer des notes dans la colonne Notes et laisser les entrées de la colonne Type d'échantillon avec la
note « SPEC ».
Cliquer sur le bouton Lancer cycle en bas de l'écran.
Cliquer sur le bouton Afficher les résultats pour visualiser la progression du cycle.
Enregistrer le cycle après son achèvement et avant de quitter le logiciel.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 15 sur 28
Protocole d'amplification sur le thermocycleur Applied Biosystem 7500 Fast Dx
1.
2.
3.
4.
5.
Mettre le thermocycleur 7500 Fast Dx sous tension.
Lancer le progiciel 7500 Fast Dx.
La fenêtre de dialogue Document de démarrage rapide s'ouvre.
Cliquer sur Créer un nouveau document.
Ce qui suit concerne le paramétrage par défaut. Sinon, modifier en conséquence.
Test :
Conteneur :
Modèle :
Mode d'exécution :
Opérateur :
Commentaires :
Désignation de la
plaque :
6.
7.
8.
Courbe standard (quantification absolue)
transparent avec 96 puits
RSV + hMPV Quidel Molecular
Fast 7500
le nom de l'opérateur
SDS v1.4 (ajouter davantage le cas échéant)
AAMMJJ-Quidel Molecular RSV + hMPV
Installation d'une plaque d'échantillon :
a. La procédure d'installation d'une plaque apparaît sous les onglets Installation et Plaque.
b. Sélectionner tous les puits qui contiennent un échantillon, cliquer droit et sélectionner
Inspecteur de puits dans le menu déroulant. Lorsque la fenêtre contextuelle Inspecteur de puits
s'ouvre, sélectionner les détecteurs pour RSV, hMPV et PRC.
c. Utiliser l’Inspecteur de puits pour entrer les noms d'échantillons. Les identifiants de patients
peuvent être entrés dans la fenêtre Inspecteur de puits ; il est toutefois recommandé que cela
soit fait avant la remise en suspension du mélange étalon lyophilisé, après amplification. Sinon
l'utilisation de la fonction d'importation pour minimiser la durée de réaction des témoins va
nécessiter une stabilisation à température ambiante avant toute exécution.
d. Enregistrer le test sous AAMMJJ-Quidel Molecular RSV + hMPV.sds.
e. Une fenêtre va s'ouvrir pour demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer
la «Configuration» et d'autres commentaires pertinents au sujet de l'amplification.
Démarrage de l'ACP :
a. Cliquer sur l'onglet Instrument.
b. Insérer la plaque ACP à 96 puits dans l'instrument.
c. Sous Contrôle de l'instrument, cliquer sur le bouton Démarrer pour démarrer l'amplification.
Post ACP :
a. IMPORTANT : Cliquer sur OK lorsque le test est terminé. Analyser les données en cliquant sur le
bouton « Analyser » dans le menu supérieur puis enregistrer le fichier.
b. Enregistrer le fichier en cliquant sur Enregistrer le document dans la barre des tâches. Une
fenêtre va s'ouvrir pour demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer
«l'analyse des données après amplification» et d'autres commentaires pertinents au sujet de
l'amplification.
Protocole d'amplification sur l'appareil d’ACP en temps réel QuantStudio Dx
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Mettre l'appareil QuantStudio Dx sous tension.
Choisir le mode IVD de l'appareil.
Lancer le progiciel QuantStudio Dx IVD.
Saisir le nom d'utilisateur présent sur chaque extraction et le mot de passe au moment de la requête.
La fenêtre Écran d'accueil va s'ouvrir.
Dans la boîte Configurer, mettre en surbrillance le nom du test précédemment chargé « Quidel
Molecular RSV + hMPV ».
Cliquer sur le bouton Configurer pour lancer un cycle d’ACP en temps réel.
L'écran Configurer, propriétés du test est affiché. Saisir les informations du cycle en conséquence.
a. Saisir le nom de l'expérience (le paramétrage par défaut lance le cycle avec un horodatage).
b. Saisir les informations du code à barres de la plaque.
c. Consigner les numéros de lot des matériaux sous Informations sur les réactifs.
d. Enregistrer le cycle sous un identifiant unique en tant que fichier « .sds » (par ex., AAMMJJ-cycle
n°X-Quidel Molecular C difficile.sds).
e. Une fenêtre va s'ouvrir pour demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer
la «Configuration» et d'autres commentaires pertinents au sujet de l'amplification.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 16 sur 28
9. Dans la barre de menu gauche, sélectionner Définir.
10. Modifier les informations de l'échantillon.
a. Entrer des informations d’échantillon spécifiques pour chaque puits en écrasant l’identifiant par
défaut (Patient 1, Patient 2, etc.) et saisir de nouvelles informations, OU
b. Sélectionner Importer à partir du fichier dans la partie supérieure de l'écran pour télécharger
une configuration de plaque prédéfinie depuis un fichier texte (délimité par des tabulations).
11. Dans la barre de menu gauche, cliquer sur Attribuer pour vérifier la configuration correcte de la
plaque.
12. Chargement de la plaque d'échantillon.
a. Éjecter le plateau de l'instrument.
b. Insérer la plaque ACP à 96 puits dans l’appareil avec le puits A1 bien positionné en haut à gauche.
c. Retirer le plateau de l'instrument.
13. Démarrage du cycle.
a. Dans la barre de menu gauche, sélectionner Cycle.
b. Cliquer sur le bouton vert Lancer cycle situé dans la partie supérieure de l'écran.
i. En cas d’invite, sélectionner le numéro de série spécifique de l'instrument utilisé.
14. Lorsque le cycle est terminé, sélectionner Analyse dans la barre de menu à gauche.
a. Enregistrer le fichier en cliquant sur Enregistrer dans la barre des tâches. Une fenêtre va s'ouvrir
pour demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer «l'analyse des
données après amplification» et d'autres commentaires pertinents au sujet de l'amplification.
b. Le tracé d'amplification sera affiché par défaut. Pour afficher d'autres types de tracés,
sélectionner ces derniers dans la barre de menu à gauche.
c. Pour afficher des informations de cycle avec les valeurs Ct, cliquer sur l'onglet Tableau des puits
sur le côté droit de l'écran.
15. Impression d'un rapport.
a. Dans la barre de menu supérieure, sélectionner Imprimer un rapport. Personnaliser le contenu
du rapport en cochant ou décochant des cases dans la fenêtre des rapports.
b. Cliquer sur le bouton « Imprimer un rapport » en bas de la boîte de dialogue.
16. Exportation des fichiers de données.
a. Dans la barre de menu gauche, sélectionner Exporter.
b. Spécifier l'emplacement du fichier d'exportation OU cliquer sur Parcourir pour localiser le
chemin souhaité.
c. Le nom du fichier d'exportation sera par défaut celui du cycle enregistré.
d. Sélectionner Excel comme type de fichier.
e. Personnaliser le rapport de données exporté en basculant entre les onglets et en sélectionnant
ou désélectionnant les options.
Sélectionner Démarrer l’exportation en bas de l'écran.
Interprétation des résultats
Interprétation des résultats à l'aide du Cepheid SmartCycler II
1. Sélectionner l'onglet Afficher les résultats dès la fin du cycle de mesure.
2. Cliquer sur l'onglet Résultats de l'échantillon.
3. Le logiciel SmartCycler II va automatiquement indiquer si de l’ARN viral RSV ou hMPV a été détecté dans
les échantillons ou si le cycle n'était pas valide (non résolu).
4. Des informations plus détaillées sont disponibles sous les onglets respectifs de chaque analyse dans la
même fenêtre. En cas de faux positif pour le RSV ou le hMPV (ou les deux), le résultat du témoin n'est pas
applicable. Le témoin est seulement nécessaire en cas de faux négatifs.
Interprétation des résultats de test RSV + hMPV Quidel sur Cepheid SmartCycler II
Résultat du
Processus
RSV
hMPV
Interprétation des résultats
test
Résultat témoin
Acide nucléique RSV et hMPV non détecté ; Témoin
Négatif
Accepté
NÉG
NÉG
détecté
RSV positif
S/O*
POS
NÉG
Acide nucléique RSV détecté
hMPV positif
S/O*
NÉG
POS
Acide nucléique hMPV détecté
RSV et hMPV
S/O*
POS
POS
Acide nucléique RSV et hMPV détecté**
positifs
Non valide
Échec
NÉG
NÉG
Non résolu - inhibition ACP ou échec du réactif.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 17 sur 28
Interprétation des résultats de test RSV + hMPV Quidel sur Cepheid SmartCycler II
Résultat du
Processus
RSV
hMPV
Interprétation des résultats
test
Résultat témoin
Tester à nouveau le même échantillon purifié. Si le
test est également invalide, extraire et tester de
nouveau une autre aliquote du même échantillon
ou obtenir un nouvel échantillon et recommencer
le test.
*Aucune valeur n'est requise en cas de faux positif du témoin.
** Les doubles infections sont rares. Refaire le test à l'aide du même échantillon purifié. Si le deuxième test
confirme le résultat, recueillir et rester un nouvel échantillon. Contacter Quidel si des échantillons multiples
confirment ce résultat.
Code d'erreur 3079: Le code d’avertissement ou d’erreur 3079 peut être observé avec des échantillons RSV et
/ ou hMPV positifs. Le code d’avertissement / d'erreur 3079 se produit lorsque le signal fluorescent (RFU) est
trop élevé. Dans ce cas, tous les résultats pour cet échantillon sont signalés par le logiciel Dx comme ND (non
déterminés). Si une valeur Ct ≥ 5 est signalée pour l'un des virus, les résultats de l'échantillon peuvent être
enregistrés comme positifs pour le virus concerné. Si la valeur Ct est < 5, le virus concerné est signalé comme
négatif.
Interprétation des résultats en utilisant l'ABI 7500 Fast Dx
Interprétation des résultats de test RSV + hMPV Quidel sur le thermocycleur 7500 Fast Dx
Résultat du
Détecteur :
Détecteur :
Détecteur :
Interprétation des résultats
test
RSV
hMPV
Témoin
Pas d'ARN viral RSV ou hMPV détecté ;
Négatif
Indéterminé
Indéterminé
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
Témoin détecté
ARN viral RSV détecté
RSV positif
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
Indéterminé
S/O*
hMPV
5,0 ≤ Ct ≤
Indéterminé
S/O*
ARN viral hMPV détecté
positif
35,0
RSV et
5,0 ≤ Ct ≤
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
S/O*
ARN viral hMPV et RSV détecté**
hMPV
35,0
Aucun ARN viral RSV ou hMPV et aucun
témoin n'a été détecté ; test invalide.
Tester à nouveau le même échantillon
purifié. Si le test est également invalide,
Non valide
Indéterminé
Indéterminé
Indéterminé
extraire et tester de nouveau une autre
aliquote du même échantillon ou
obtenir un nouvel échantillon et
recommencer le test.
*Aucune valeur Ct n'est requise en cas de faux positif du témoin.
** Les doubles infections sont rares. Refaire le test à l'aide du même échantillon purifié. Si le deuxième test
confirme le résultat, recueillir et rester un nouvel échantillon. Contacter Quidel si des échantillons multiples
confirment ce résultat.
Interprétation des résultats à l'aide de l'appareil d'ACP en temps réel QuantStudio Dx
Résultat du
test
Négatif
RSV positif
hMPV
positif
Interprétation des résultats de test RSV + hMPV Quidel sur l'
appareil d'ACP en temps réel Life Technologies QuantStudio Dx
Détecteur :
Détecteur :
Détecteur :
Interprétation des
RSV
hMPV
Témoin
résultats
Pas d'ARN viral RSV ou
Aucune valeur-Ct
Aucune valeur-Ct
Valeur-Ct
hMPV détecté ; Témoin
signalée
signalée
signalée
détecté
Aucune valeur-Ct
ARN viral RSV détecté
Valeur-Ct signalée
S/O*
signalée
Aucune valeur-Ct
Valeur-Ct signalée
S/O*
ARN viral hMPV détecté
signalée
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 18 sur 28
Interprétation des résultats de test RSV + hMPV Quidel sur l'
appareil d'ACP en temps réel Life Technologies QuantStudio Dx
Détecteur :
Résultat du
Détecteur :
Détecteur :
Interprétation des
RSV
test
hMPV
Témoin
résultats
RSV et
ARN viral hMPV et RSV
Valeur-Ct signalée
Valeur-Ct signalée
S/O*
hMPV
détecté**
Aucun ARN viral RSV ou
hMPV et aucun témoin n'a
été détecté ; test invalide.
Tester à nouveau le même
échantillon purifié. Si le test
Aucune valeur-Ct
Aucune valeur-Ct
Aucune valeur-Ct est également
Non valide
signalée
signalée
signalée
invalide, extraire et tester
de nouveau une autre
aliquote du même
échantillon ou obtenir un
nouvel échantillon et
recommencer le test.
*Aucune valeur Ct n'est requise en cas de faux positif du témoin.
** Les doubles infections sont rares. Refaire le test à l'aide du même échantillon purifié. Si le deuxième test
confirme le résultat, recueillir et rester un nouvel échantillon. Contacter Quidel si des échantillons multiples
confirment ce résultat.
Contrôle qualité
Le kit de test RSV + hMPV de Quidel incorpore plusieurs témoins servant à surveiller la performance du test.
1. Le témoin doit être utilisé lors de l'extraction et de l'amplification pendant le dosage. Ce témoin doit être
ajouté à chaque aliquote d’échantillon avant l'extraction.
2. Disponible dans le commerce, des témoins RSV et hMPV positifs externes peuvent être traités comme un
échantillon de patient et doivent être utilisés en accord avec les normes en vigueur dans le laboratoire.
Des spécimens RSV et hMPV déjà signalés positifs peuvent être utilisés en lieu et place des témoins RSV et
hMPV du commerce.
3. Un milieu de transport viral ou un spécimen précédemment caractérisé négatif peut être utilisé comme
témoin négatif externe. Il doit être traité comme un échantillon de patient et doit être utilisé
conformément aux normes actuelles de laboratoire.
Limitations
Ce test n'est pas destiné à différencier les sous-types RSV ou hMPV. La différenciation des sous-types
nécessite la réalisation de tests supplémentaires.
Des résultats négatifs n’excluent pas une infection par le RSV ou l'hMPV et ne doivent pas servir comme
seule base de décision de traitement.
Comme avec d'autres essais de ce type, il existe un risque de faux négatifs dû aux variantes de séquences
dans la cible virale.
Un prélèvement, un stockage voire un transport inapproprié peut induire des faux négatifs.
Les inhibiteurs présents dans l'échantillon ou les erreurs dans la procédure de test suivante peuvent
induire des faux négatifs.
Un professionnel de santé correctement formé doit interpréter les résultats d'analyse parallèlement au
dossier médical du patient, les signes et symptômes cliniques et les résultats d'autres tests diagnostiques.
Les performances de ce test n'ont pas été établies chez des individus qui ont reçu un traitement aux
corticostéroïdes à injection nasale.
Les performances de ce test n'ont pas été établies chez des individus qui ont reçu un vaccin contre la
grippe par injection nasale.
Les résultats des études analytiques montrent que à deux fois sa LoD, le sous-type B2 de l'hMPV a été
inhibé par le RSV à un niveau de 10 000 au-dessus de la LoD signalée du RSV sur l'appareil ABI 7500 Fast
Dx. La même étude réalisée sur le Cepheid SmartCycler II a montré que à deux fois sa LoD, le sous-type B2
de l'hMPV a été inhibé par le RSV à 3 points au-dessus de la LoD du RSV signalée. L'incidence de la
coinfection au RSV et à l'hMPV observée dans les essais cliniques actuels pour le test RSV + hMPV Quidel a
été de 0,1 % (1/949). Cette faible prévalence peut varier selon la prévalence et la population testée.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 19 sur 28
Valeurs attendues
Des études cliniques ont été réalisées sur le test RSV + hMPV Quidel à l'aide de la plateforme Cepheid
SmartCycler® II et de l'appareil Applied Biosystems® 7500 Fast Dx. Ces essais ont été réalisés avec des
échantillons prospectifs collectés depuis l'ensemble du territoire des États-Unis en hiver 2012 (de janvier à
mars 2012). Le tableau ci-dessous montre les valeurs attendues pour chaque virus sur les deux appareils.
Valeurs attendues en hiver 2012
Instrument
Cepheid SmartCycler® II
Applied Biosystems 7500 Fast Dx
RSV
15,8 % (158/1014)
16,4 % (166/1012)
hMPV
14,6 % (148/1014)
15,5 % (157/1012)
Une étude clinique de moindre ampleur a été réalisée sur le test RSV + hMPV Quidel à l'aide de l'appareil
d'ACP en temps réel Life Technologies QuantStudio Dx. Ces essais ont été réalisés avec des échantillons
prospectifs collectés depuis l'ensemble du territoire des États-Unis en hiver 2013 (de janvier à février 2013). Le
tableau ci-dessous montre les valeurs attendues pour chaque virus sur les deux appareils.
Valeurs attendues en hiver 2013
Instrument
Appareil d'ACP en temps réel Life
Technologies QuantStudio Dx
RSV
18,6 % (59/317)
hMPV
14,4 % (45/317)
Performance clinique
Les caractéristiques de performance du test RSV + hMPV Quidel à l'aide de l'appareil Cepheid SmartCycler® II
et de la plateforme Applied Biosystems® 7500 Fast Dx ont été établies au cours d'une étude prospective
pendant la saison 2012 de propagation du virus (de janvier à mars 2012). Les échantillons utilisés pour cette
étude étaient des prélèvements frais (414) et d'autres congelés (600) recueillis pour des tests respiratoires de
routine sur quatre sites aux États-Unis. Un seul échantillon a été recueilli par patient puis testé
(immunofluorescence direct sur l'échantillon et culture avec immunofluorescence). Les échantillons résiduels
ont été extraits à l'aide d'easyMAG bioMérieux puis testés à l'aide du test RSV + hMPV Quidel à l'aide des deux
appareils ABI 7500 Fast Dx et Cepheid SmartCycler II. Les aliquotes de chaque échantillon ont été envoyées à
un laboratoire central pour subir un test moléculaire hMPV agréé par la FDA.
Répartition démographique par âge
Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Groupe
d'âge
(ans)
Cepheid SmartCycler II
RSV
positif
Prévalence
hMPV
positif
Prévalence
total
testé
RSV
positif
Prévalence
hMPV
positif
Prévalence
total
testé
<1
72
28,3 %
38
15,0 %
254
71
27,5 %
35
13,6 %
258
de 1 à 5
de 6
à 10
de 11
à 15
de 16
à 21
72
19,9 %
76
21,5 %
354
67
19,0 %
73
20,7 %
352
6
4,5 %
17
12,7 %
134
6
4,5 %
16
11,9 %
134
3
4,8 %
7
11,3 %
62
3
4,8 %
6
9,7 %
62
3
9,1 %
1
3,0 %
33
3
9,1 %
1
3,0 %
33
>21
10
5,7 %
18
10,3 %
175
8
4,6 %
17
9,7 %
175
1012*
158
15,6 %
148
14,6 %
1014
Total
166
16,4 %
157
15,5 %
* Deux échantillons n'étaient pas valables.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 20 sur 28
Étude clinique prospective – Cepheid SmartCycler® II
Mille quatorze (1014) échantillons ont été testés à la fois par la méthode comparative et subjective pour le
RSV. Un (1) échantillon a été contaminé et trois (3) étaient toxiques dans la culture de cellules (0,4 %). Ces
quatre (4) échantillons ont été exclus de l'analyse. Les résultats pour les mille dix (1010) échantillons restants
sont présentés en détail dans le tableau ci-dessous.
Tous sites confondus : virus syncitial respiratoire
DSFA et culture de cellules
avec immunofluorescence
directe
95 % IC
POS
NÉG
Total
Sensibilité
97,9 % 93,9 % 99,3 %
137
21*
158
Spécificité
97,6 % 96,3%
98,4 %
RSV + hMPV Quidel POS
Molecular
NÉG
3
849
852
Total
140
870
1010
* Tous les échantillons discordants à l'origine ont été positifs au RSV à l'aide d'un test d'ACP en temps réel
agréé par la FDA.
Neuf cent soixante (960) échantillons ont été testés par des moyens subjectifs et comparatifs à l'hMPV (le
dispositif comparatif a été indisponible pour compléter le test de comparaison de cinquante-quatre (54)
échantillons). Neuf (9) échantillons ont été non valables dans le dispositif comparatif (0,9 %). Ces neuf (9)
échantillons ont été exclus de l'analyse. Les résultats des neuf cent cinquante et un (951) échantillons restants
sont présentés en détail dans le tableau ci-dessous.
Tous sites confondus - Human metapneumovirus
Test moléculaire hMPV agréé FDA
RSV + hMPV Quidel
POS
Molecular
NÉG
Total
POS
NÉG
Total
145
5
150
3
798
801
148
803
951
95 % IC
Pourcentage de
concordance positive
Pourcentage de
concordance négative
96,7 %
92,4 %
98,6 %
99,6 %
98,9 %
99,9 %
Étude clinique prospective - Applied Biosystems® 7500 Fast Dx
Mille quatorze (1014) échantillons ont été testés à la fois par la méthode comparative et subjective pour le
RSV. Un (1) échantillon a été contaminé et trois (3) étaient toxiques dans la culture de cellules (0,4 %). Deux (2)
échantillons ont été non valables pour la méthode en objet (0,2 %). Ces six (6) échantillons ont été exclus de
l'analyse. Les résultats pour les mille huit (1008) échantillons restants sont présentés en détail dans le tableau
ci-dessous.
Tous sites confondus : virus syncitial respiratoire
DSFA et culture de cellules
avec immunofluorescence
directe
95 % IC
POS
NÉG
Total
Sensibilité
98,6 % 94,9 % 99,6 %
138
28*
166
Spécificité
96,8 % 95,4 % 97,8 %
RSV + hMPV Quidel POS
Molecular
NÉG
2
840
842
Total
140
868
1008
* 25 des 28 échantillons discordants à l'origine ont été positifs au RSV à l'aide d'un test d'ACP en temps réel
agréé par la FDA.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 21 sur 28
Neuf cent soixante (960) échantillons ont été testés par des moyens subjectifs et comparatifs à l'hMPV (le
dispositif comparatif a été indisponible pour compléter le test de comparaison de cinquante-quatre (54)
échantillons). Neuf (9) échantillons ont été non valables dans le dispositif comparatif (0,9 %). Deux (2)
échantillons ont été non valables pour la méthode en objet (0,2 %). Ces onze (11) échantillons ont été exclus
de l'analyse. Les résultats des neuf cent quarante-neuf (949) échantillons restants sont présentés en détail
dans le tableau ci-dessous.
Tous sites confondus - Human metapneumovirus
Test moléculaire hMPV agréé FDA
RSV + hMPV Quidel
POS
Molecular
NÉG
Total
POS
NÉG
Total
147
3
150
9
790
799
156
793
949
95 % IC
Pourcentage de
concordance positive
Pourcentage de
concordance négative
98,0 %
94,3 %
99,3 %
98,9 %
97,9 %
99,4 %
Étude clinique prospective - Life Technologies QuantStudio Dx
Les caractéristiques de performance du test RSV + hMPV Quidel à l'aide de l'appareil d'ACP en temps réel Life
Technologies QuantStudio Dx ont été établies par une étude prospective au cours de la saison de propagation
du virus respiratoire (de janvier à février 2013). Les échantillons utilisés au cours de cette étude étaient des
prélèvements frais (317) qui ont été recueillis pour des tests de routine de virus respiratoires aux États-Unis.
Un seul échantillon a été recueilli par patient puis testé (immunofluorescence direct et culture avec
immunofluorescence) pour le RSV immédiatement après avoir été prélevé. Ces échantillons ont été extraits à
l'aide d'easyMAG bioMérieux puis testé avec le test RSV + hMPV Quidel. Les aliquotes de chaque échantillon
ont été envoyées à un laboratoire central pour subir un test moléculaire hMPV agréé par la FDA.
Virus respiratoire syncytial
DSFA et culture de cellules
avec immunofluorescence
directe
95 % IC
POS
NÉG
Total
Sensibilité
100 %
92 %
100 %
45
14*
59
Spécificité
95 %
92 %
97 %
RSV + hMPV Quidel POS
Molecular
NÉG
0
258
258
Total
45
272
317
* Sur les quatorze (14) échantillons faux positifs au RSV découverts par le test RSV + hMPV Quidel, neuf (9)
sont positifs au RSV à l'aide d'un test agréé CE.
Métapneumovirus humain
Test moléculaire hMPV agréé FDA
POS
NÉG
Total
95 % IC
Pourcentage de
concordance positive
Pourcentage de
concordance négative
100 %
92 %
RSV + hMPV Quidel
POS
43
2
45
99 % 97 %
Molecular
NÉG
0
268
268
Total
43
270
313
* Quatre échantillons sont NON VALABLES sur le comparateur et ne sont pas repris dans le tableau
100 %
100 %
Performances analytiques
Niveau de détection
La sensibilité analytique (limite de détection ou LOD) du test RSV + hMPV Quidel a été déterminée en utilisant
des cultures quantifiées (TCID50/mL) de 2 souches du RSV et de 4 souches du hMPV (1 A1, 1 A2, 1 B1, 1B2),
diluées en série dans une matrice rhinopharyngienne négative. Chaque dilution a été extraite en répliquats de
20 par concentration de virus à l'aide du système NucliSENS easyMAG et testée sur les trois plateformes (seuls
les sous-types A2 et B2 du hMPV ont été testés sur le QuantStudio). La sensibilité analytique (limite de
détection ou LoD) est définie comme étant la concentration la plus faible à laquelle 95 % de toutes les
répétitions ont été testées positives.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 22 sur 28
Résumé des valeurs LoD
Virus
RSV A
RSV B
hMPV-A1
hMPV-A2
hMPV-B1
hMPV-B2
LoD TCID50/mL
7500 Fast Dx
6,29E-01
7,5E-01
1,7E+01
4,17E+00
1,05E+00
3,21E+00
LoD TCID50/mL
SmartCycler
1,89E+00
2,25E+00
2,65E+01
4,17E+00
7,88E+00
9.63E+00
LoD TCID50/mL
QuantStudio
6,29E-01
2,25E-01
2,91E+00
2,25E+00
Réactivité analytique (inclusivité)
La réactivité du test moléculaire RSV+hMPV Quidel a été évaluée sur plusieurs souches du RSV et hMPV. Le
panel de réactivité analytique consistait en 5 souches de RSV et en 11 souches de hMPV (2 A-1, 2 A-2, 2 B-1, 4
B-2 et 1 non typé) Chaque membre du panel a été extrait à l'aide d'un appareil NucliSens easyMAG puis testé
à trois reprises sur les deux plateformes Cepheid SmartCycler II et ABI 7500 Fast Dx.
Panel d'inclusivité RSV
Sous-type
Souche
TCID50/mL
A (NIBSC)
A
B
B
B
A-2
A-2
Washington
9320
CH9318(1B)
Non disponible
5,67E+04
2,25E+00
2,25E+00
2,25E+00
Test
RSV+ hMPV Quidel
Molecular
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Panel d'inclusivité hMPV
Sous-type
Souche
TCID50/mL
A1
A1
A2
A2
B1
B1
B2
B2
B2
B2
hMPV (NIBSC)
Gène G IA3-2002
IA10-2003
Gène G IA14-2003
Isolats cliniques
Gène G Peru2-2002
Gène G Peru3-2003
Gène G Peru1-2002
Peru6-2003
Gène G IA18-2003
Gène G IA18-2003
Non disponible
7,95E+01
7,95E+01
1,25E+1
1,25E+1
2,36E+01
2,36E+01
9.63E+00
9.63E+00
9.63E+00
9.63E+00
Non disponible
Test
RSV+ hMPV Quidel
Molecular
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Le test RSV + hMPV Quidel a détecté 100 % des RSV et hMPV sur les deux plates-formes 7500 Fast Dx et
Cepheid SmartCycler® II.
Étude de reproductibilité
La reproductibilité du test de la grippe RSV +hMPV Quidel a été évaluée sur trois sites de laboratoire. La
reproductibilité a été évaluée à l'aide d'un panel de quatre échantillons simulés qui comprennent des
échantillons RSV et hMPV moyens positifs, faibles positifs, hautement négatifs au RSV et hMPV, et négatifs. Les
groupes et les témoins ont été testés sur chaque site par 2 opérateurs pendant 5 jours (test tripliqué x
2 opérateurs x 5 jours x 3 sites = 90 résultats par concentration pour chaque virus). Les valeurs de limite de
détection (LoD) sont fondées sur les valeurs obtenues au cours de l'étude LoD. Les groupes et les témoins ont
été extraits en utilisant le système easyMAG de bioMérieux puis testés sur l'instrument Cepheid SmartCycler II
et ABI 7500Fast Dx.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Page 23 sur 28
Résultats de reproductibilité : Cepheid SmartCycler II
Site n°1
Identifiant du
membre du panel
Haut négatif RSV
0,05 x LoD
Bas positif RSV
2x LoD
Positif moyen RSV
5 x LoD
Site n°2
Site n°3
Résultats
AVE Ct*
positifs
Total de
résultat
s
positifs
Résultats
AVE Ct*
positifs
%CV
Résultats
AVE Ct*
positifs
%CV
8/30
44.3
9.3
6/30
47.4
5.4
1/30
48.7
Non
dispo
nible
15/90
30/30
31.2
7.3
30/30
31.4
4.1
30/30
30.9
1.5
90/90
30/30
29.6
5.7
30/30
29.7
3.1
30/30
29.5
2.0
90/90
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispon
ible
Non
dispon
ible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
%CV
RSV négatif
0/30
Témoin RSV négatif
0/30
Témoin RSV positif
30/30
30.0
1.8
30/30
31.0
3.3
30/30
30.6
1.2
90/90
12/30
34.3
8.3
6/30
41.8
6.3
8/30
34.9
6.4
26/90
30/30
31.1
6.7
30/30
32.2
6.2
30/30
31.1
3.3
90/90
30/30
29.3
2.0
30/30
29.9
3.2
30/30
29.8
3.4
90/90
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispon
ible
Non
dispon
ible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
30.3
1.4
30.9
1.9
30.8
2.5
Haut négatif hMPV
0,15 x LoD
Bas positif hMPV
2x LoD
Positif moyen hMPV
5 x LoD
hMPV négatif
0/30
Témoin hMPV négatif
0/30
Témoin hMPV positif
30/30
0/30
0/30
0/30
0/30
30/30
0/30
0/30
0/30
0/30
30/30
0/90
0/90
0/90
0/90
90/90
* Ct moyen basé sur la moyenne des résultats positifs uniquement. Valeurs Ct égales à 0 ont été exclues de ce
calcul.
Résultats de reproductibilité – Applied Biosystems 7500 Fast DX
Site n°1
Identifiant du
membre du panel
Haut négatif RSV
0,05 x LoD
Bas positif RSV
2x LoD
Positif moyen RSV
5 x LoD
Site n°2
Site n°3
Résultats
AVE Ct*
positifs
Total de
résultat
s
positifs
Résultats
AVE Ct*
positifs
%CV
Résultats
AVE Ct*
positifs
%CV
14/30
30.7
8.3
3/30
33.8
2.4
9/30
32.3
4.0
26/90
30/30
23.7
7.4
30/30
23.8
3.1
30/30
23.4
4.5
90/90
30/30
20.5
4.0
30/30
21.8
2.2
29/29
21.1
2.2
89/89
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
Non
dispon
ible
Non
dispon
ible
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
%CV
RSV négatif
0/30
Témoin RSV négatif
0/30
Témoin RSV positif
30/30
19.7
6.5
30/30
20.0
8.5
30/30
19.6
1.9
90/90
14/30
24.9
19.5
6/30
29.1
10.2
10/30
25.1
16.9
30/90
30/30
21.0
8.7
30/30
21.5
4.1
30/30
21.6
5.8
90/90
30/30
18.9
3.3
30/30
19.6
3.0
29/29
19.2
2.6
89/89
0/30
Non
dispo
Non
dispo
0/30
Non
dispo
Non
dispo
0/30
Non
dispon
Non
dispo
0/90
Haut négatif hMPV
0,15 x LoD
Bas positif hMPV
2x LoD
Positif moyen hMPV
5 x LoD
hMPV négatif
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
0/30
0/30
0/30
0/30
0/90
0/90
Page 24 sur 28
Résultats de reproductibilité – Applied Biosystems 7500 Fast DX
Site n°1
Identifiant du
membre du panel
Résultats
AVE Ct*
positifs
Témoin hMPV négatif
0/30
Témoin hMPV positif
30/30
Site n°2
%CV
nible
Non
dispo
nible
nible
Non
dispo
nible
19.7
3.9
Site n°3
Résultats
AVE Ct*
positifs
0/30
30/30
%CV
nible
Non
dispo
nible
nible
Non
dispo
nible
20.0
1.7
Résultats
AVE Ct*
positifs
0/30
30/30
%CV
ible
Non
dispon
ible
nible
Non
dispo
nible
19.9
1.4
Total de
résultat
s
positifs
0/90
90/90
* Ct moyen basé sur la moyenne des résultats positifs uniquement. Valeurs Ct égales à 0 ont été exclues de ce
calcul.
Tableau Spécificité analytique – réactivité croisée
La spécificité analytique du test RSV + hMPV Quidel a été évaluée en testant un panel comprenant 34 virus,
26 bactéries et une levure représentatifs des maladies pathogènes communes des voies respiratoires ou de la
flore présente dans le rhinopharynx. Les échantillons ont été extraits à l'aide d'un appareil NucliSens easyMAG
puis testé à trois reprises sur les deux plateformes Cepheid SmartCycler II et ABI 7500 Fast Dx. La spécificité
analytique du test RSV + hMPV Quidel était de 100 %.
Les organismes utilisés pendant l'étude étaient les suivants :
Virus
Grippe A/Mexique/4108/2009,
Grippe B/Floride/04/2006,
Adénovirus 1/Adénoïde 71,
Adénovirus 2,
Adénovirus 3, Adénovirus 4, Adénovirus 5, Adénovirus 7, Adénovirus 11, Adénovirus 14, Adénovirus 31,
Coronavirus NL63, Coronavirus 229E, Coronavirus OC43, Coxsackievirus B4, Coxsackievirus B5/10/2006,
Cytomégalovirus, Échovirus 7, Échovirus 9, Échovirus 6, Échovirus 11, Entérovirus 71, Entérovirus 70, virus
Epstein-Barr, HSV Type 1 souche Maclntyre, Rhinovirus humain, HSV Type 2 souche G, virus de la rougeole,
virus des oreillons, Parainfluenza Type 1, Parainfluenza Type 2, Parainfluenza Type 3, Parainfluenza Type 4,
virus varicelle-zona
Bactéries
Bordetella pertussis, , Bordetella bronchiseptica, Chlamydophila pneumonia, Chlamydia trachomatis, Legionella
pneumophila, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycoplasma
pneumoniae, Haemophilus influenza, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, Neisseria mucosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Moraxella
catarrhalis, Corynebacterium diptheriae, Lactobacillus plantarum, Streptococcus pneumonia, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus salivarius, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus.
Levures
Candida albicans
Spécificité analytique – Substances interférentes
La performance du test moléculaire RSV + hMPV Quidel a été évaluée avec des substances potentiellement
interférentes qui peuvent être présentes dans les échantillons rhinopharyngiens. Les substances
potentiellement interférentes ont été évaluées à l'aide du RSV B et du hMPV B1à une concentration de trois et
dix fois la limite de détection (LoD). Il n'y avait aucune preuve d'interférence induite par les substances testées
à trois et dix fois la LoD.
Nom de la substance
Mucine (glande sous-maxillaire bovine,
type I-S)
Sang (humaine), anticoagulé à l'EDTA
Néosynéphrine
Aérosol nasal Afrin
Gel nasal liquide homéopathique
antiallergique sans goutte et sans
somnolence Zicam
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
Concentration testée
60 µg/mL
2 % (vol/vol)
15 % (vol/vol)
15 % (vol/vol)
5 % (vol/vol)
Page 25 sur 28
Nom de la substance
Aérosol nasal contenant une solution saline
Pastilles pour la gorge
Zanamivir
Tobramycine
Mupirocine
Phosphate d'oseltamivir
Concentration testée
15 % (vol/vol) de la dose
0,68 g/mL ; goutte 1/18, concassé ;
ingrédients actifs : 1,7 mg/mL menthol
3,3 à 5 mg/mL
4,0 µg/mL
6,6 à 10 mg/mL
7,5 à 25 mg/mL
Études de rémanence et de contamination croisée
Une étude interne a démontré l'absence de preuve de rémanence ou de contamination croisée avec le test
RSV + hMPV Quidel à l'aide de l'instrument d'extraction automatisée des acides nucléiques NucliSens
easyMAG et des trois plateformes de thermocycleur. Applied Biosystems 7500 Fast Dx ou Cepheid
SmartCycler.
Assistance clientèle et technique
Pour passer une commande ou pour obtenir une assistance technique, veuillez contacter un représentant
Quidel au +1 800 874 1517 (appel gratuit aux États-Unis) ou +1 858 552 1100 (en dehors des États-Unis), du
lundi au vendredi, entre 8h00 et 17h00 (heure de l'Est) Les commandes peuvent être passées par fax au
+1 740 592 9820.
Pour
obtenir
des
informations
par
courrier
électronique,
contacter
[email protected] ou [email protected]. Pour tout service à l'extérieur des ÉtatsUnis, veuillez contacter votre distributeur local. Des informations supplémentaires sur Quidel, nos produits et
nos distributeurs sont consultables sur notre site Web à l’adresse quidel.com.
Propriété intellectuelle
Marques déposées
Smartcycler® est une marque déposée de Cepheid Corporation. Applied Biosystems® est une marque déposée
de Life Technologies. NucliSENS® et easyMAG® sont des marques déposées de bioMérieux, Inc. TaqMan® est
une marque déposée de Roche. CAL Flour® Red 610 et Quasar®670 sont des marques déposées de BioSearch
Technologies, Inc.
Brevets
Les composés colorants de ce produit sont commercialisés sous licence de Biosearch Technologies, Inc. et
protégés par des brevets américains et du monde entier soit émis soit en application.
L'achat de ce produit accorde à l'acheteur des droits conférés par certains brevets de Roche visant à autoriser
son utilisation uniquement dans le cadre de la fourniture de services de diagnostic in vitro pour l'homme.
Aucun brevet général ni aucune autre licence de toute autre nature que ce droit d'usage spécifique à l'achat
n’est accordée par les présentes.
Ce produit est protégé par les brevets américains N° 7,531,342; 7,449,374 ; leurs contreparties internationales
; d'autres brevets américains et internationaux en instance.
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
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Glossaire
Contenu / Contient
Témoin
Consultez les instructions d’utilisation
Utilisation prévue
96
Contenu suffisant pour 96 déterminations
Risques biologiques
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
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Références
1
2
3
4
5
6
7
8
Glezen et. Al. 1986. American journal of diseases of children (1960) 140(6): 543–6.
Hall, Caroline Breese. et al. 2009. New England Journal of Medicine 360(6): 588–98
Papadopoulos, N. G. et. al. 2004. Respiratory Med. 98 :879-882.
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Sloots T.P. et al. 2006 EID. 12:1236-66.
Ebihara, T. et al. 2004 J Med Virol 70:281-283.
van den Hoogen, B. G. et al. 2004. EID. 10:658-666.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Viral Culture; Approved Guidelines. CLSI document M41-A [ISBN
1562386239] Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
Pennsylvania 19087-1898, USA 2006.
M103 – Kit de test moléculaire Quidel RSV+hMPV
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hanovre,
Allemagne
Quidel Corporation
Siège mondial
10165 McKellar Court
San Diego, CA 92121 États-Unis
quidel.com
M103en v2013MAR13
Kit de test RSV + hMPV Quidel (CE)
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RSV + hMPV-Assay
Gebrauchsanweisung
Zum qualitativen Nachweis und zur Identifizierung respiratorischer syncytialvirus- und
human-metapneumovirus-viraler RNA, die aus Nasen- und Nasenrachenabstrichproben
extrahiert wird.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
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Inhalt
Einsatzbereich ......................................................................................................................................... 3
Zusammenfassung und Erläuterung ....................................................................................................... 3
Funktionsprinzip...................................................................................................................................... 3
Mitgelieferte Materialien........................................................................................................................ 4
Optionale Materialien ............................................................................................................................. 5
Erforderliche, jedoch nicht mitgelieferte Materialien ............................................................................ 5
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen.............................................................................................. 5
Aufbewahrung und Handhabung der Kit-Reagenzien ............................................................................ 6
Entnahme, Aufbewahrung und Handhabung der Proben ...................................................................... 6
Aufbewahrung von Nukleinsäureextrakten ............................................................................................ 6
Anleitung zum Programmieren der Nukleinsäureextraktion.................................................................. 6
Anfangsprogrammierung des Thermocyclers ......................................................................................... 9
Anleitung zum Programmieren des SmartCycler II ............................................................................. 9
Anleitung zum Programmieren des Applied Biosystems 7500 Fast DX ............................................11
Anleitung zum Programmieren des QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument Dx .......................14
Assayverfahren .....................................................................................................................................14
Amplifikationsprotokoll auf dem Cepheid SmartCycler II.................................................................15
Amplifikationsprotokoll auf dem Applied Biosystem 7500 Fast Dx Thermocycler ...........................16
Amplifikationsprotokoll auf dem QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument ................................16
Auswertung der Ergebnisse ..................................................................................................................17
Auswertung der Ergebnisse mit dem Cepheid SmartCycler II ..........................................................17
Auswertung der Ergebnisse mit dem ABI 7500 Fast Dx ....................................................................18
Auswertung der Ergebnisse mit dem QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument ..........................19
Qualitätskontrolle .................................................................................................................................19
Einschränkungen ...................................................................................................................................19
Erwartete Werte ...................................................................................................................................20
Klinische Leistung ..................................................................................................................................20
Analytische Leistung .............................................................................................................................23
Nachweisgrenze ................................................................................................................................23
Analytische Reaktivität (Inklusivität).................................................................................................23
Reproduzierbarkeitsstudie ................................................................................................................24
Analytische Spezifizität – Kreuzreaktivität ........................................................................................25
Analytische Spezifizität – Störsubstanzen.........................................................................................25
Carryover- und Kreuzkontaminationsstudien ...................................................................................26
Kundendienst und technischer Support ...............................................................................................26
Geistiges Eigentum ...............................................................................................................................26
Handelsmarken .................................................................................................................................26
Patente ..............................................................................................................................................26
Glossar ..................................................................................................................................................27
Literaturverweise ..................................................................................................................................28
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 2 von 28
Einsatzbereich
Der Quidel Molecular RSV + hMPV-Assay ist ein Multiplex-Echtzeit-RT-PCR-Assay für den qualitativen Nachweis
und die Identifizierung respiratorischer syncytialvirus- und human-metapneumovirus-viraler RNA, die aus
Nasen- und Nasenrachenabstrichproben von Patienten mit Anzeichen und Symptomen von
Atemwegsinfektionen extrahiert wird. Dieser In-vitro-Diagnostik-Test ist als Hilfsmittel bei der
Differentialdiagnose von Infektionen durch das respiratorische Syncytial-Virus und humane Metapneumovirus
beim Menschen in Verbindung mit klinischen und epidemiologischen Risikofaktoren bestimmt. Der Test dient
nicht der Unterscheidung der beiden Subtypen von RSV oder der vier genetischen hMPV-Untergruppen.
Negative Ergebnisse schließen eine RSV- und/oder hMPV-Infektion nicht aus und sollten nicht als alleinige
Basis für die Diagnose, Behandlung oder andere Patienten-Management-Entscheidungen herangezogen
werden.
Zusammenfassung und Erläuterung
RSV: Das humane respiratorische Syncytial-Virus (RSV) ist ein negatives einzelsträngiges RNA-Virus der Familie
der Paramyxoviridae. RSV ist eine der häufigsten Ursachen für Infektionen der unteren Atemwege und
Krankenhausaufenthalte von Säuglingen und Kindern. In den USA infizieren sich 60 % aller Säuglinge während
ihrer ersten RSV-Saison, und bis zum Alter von zwei bis drei Jahren haben sich fast alle Kleinkinder mit dem
1
Virus infiziert. Etwa 2 bis 3 % der mit RSV infizierten Kinder erkranken an Bronchiolitis, die einen
2
Krankenhausaufenthalt erfordert. Die natürliche Infektion mit RSV induziert eine schützende Immunität, die –
möglicherweise mehr als bei anderen viralen Atemwegsinfektionen – mit der Zeit schwindet; daher können
sich Menschen mehrmals infizieren. Manche Säuglinge erleiden selbst innerhalb einer einzigen RSV-Saison
mehrmals eine symptomatische Infektion. Schwere RSV-Infektionen werden zunehmend bei älteren Patienten
festgestellt.
Die RSV-Subtypen A und B sind entweder gleichzeitig oder wechselweise während der jährlichen Epidemien
vorhanden, und mehrere Studien weisen darauf hin, dass eine RSV-A-induzierte Bronchiolitis ernster ist als
3
eine RSV-B-induzierte.
hMPV: Das humane Metapneumovirus (hMPV) ist ein negatives, einzelsträngiges RNA-Virus der Familie der
4
Paramyxoviridae, das erstmals 2001 in den Niederlanden isoliert wurde. hMPV ist möglicherweise die
zweithäufigste Ursache (nach RSV) für das Auftreten von Infektionen der unteren Atemwege bei Kleinkindern.
Im Vergleich zu RSV treten hMPV-Infektionen gewöhnlich eher bei etwas älteren Kindern auf und lösen eine
weniger ernste Krankheit aus. Koinfektion mit beiden Viren kann auftreten und ist im Allgemeinen mit einer
ernsthafteren Erkrankung verbunden.
5
hMPV ist für etwa 7,1 % aller Atemwegserkrankungen verantwortlich. Das Virus scheint weltweit verbreitet
und jahreszeitlich verteilt zu sein; die Auftretenshäufigkeit ist mit der der Influenzaviren im Winter
vergleichbar. Serologische Studien haben gezeigt, dass praktisch alle Kinder bis zum Alter von fünf Jahren dem
6
Virus ausgesetzt waren. hMPV verursacht gewöhnlich eine leichte Atemwegsinfektion. Bei Kleinkindern,
älteren Menschen und immungeschwächten Personen besteht jedoch die Gefahr einer schweren Erkrankung
mit Krankenhausaufenthalt.
Sequenzanalysen des hMPV-Genoms haben gezeigt, dass die weltweit zirkulierenden hMPV-Stämme in zwei
vorrangige Genotypen (A und B) unterteilt werden können, die zwei Serotypen repräsentieren, die jeweils zwei
7
Untergruppen (A1, A2, B1 und B2) umfassen.
Funktionsprinzip
Der Assay weist virale Nukleinsäuren nach, die aus einer Patientenprobe extrahiert wurden. Eine MultiplexEchtzeit-RT-PCR-Reaktion wird unter optimierten Bedingungen in einem einzigen Röhrchen durchgeführt,
wobei Amplikone für RSV, hMPV und die Prozesskontrolle (PRC) generiert werden. Die Identifizierung von RSV,
hMPV und der PRC erfolgt durch die Verwendung zielspezifischer Primer und fluoreszenzmarkierter Sonden,
die in konservierten Regionen in den NS2- und Polymerase-Genen von RSV sowie dem Polymerase-Gen von
hMPV und der PRC hybridisieren.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 3 von 28
Quidel Molecular Sonden-Etiketten
Ziel
RSV
hMPV
PRC
Farbstoff
FAM
CAL Fluor® Red 610
Quasar® 670
Zusammenfassung des Verfahrens:
1. Probennahme: Unter Anwendung von Standardverfahren Nasen- oder Nasenrachenabstrichproben bei
symptomatischen Patienten entnehmen. Die so gewonnenen Proben in Übereinstimmung mit den
8
etablierten Laborverfahren transportieren, lagern und verarbeiten.
2.
Nukleinsäureextraktion Mithilfe des NucliSENS® easyMAG®-Systems unter Einhaltung der
Herstelleranweisungen und Verwendung der entsprechenden Reagenzien (siehe Erforderliche, jedoch
nicht mitgelieferte Materialien) Nukleinsäure aus den Proben extrahieren. Die Verwendung anderer
Extraktionssysteme mit dem Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay wurde nicht validiert. Die Validierung
dieser anderen Systeme liegt in der Verantwortung des Endbenutzers.
Vor dem Extraktionsverfahren 20 µl der Prozesskontrolle (PRC) zu je 180 µl Aliquot der Probe hinzugeben.
Die PRC dient der Überwachung von Inhibitoren in der extrahierten Probe, gewährleistet, dass eine
angemessene Amplifikation stattgefunden hat und bestätigt, dass die Extraktion der Nukleinsäure
ausreichend war.
3.
Rehydrierung des Mastermix: Den lyophilisierten Mastermix mithilfe der Rehydrierungslösung
rehydrieren. Der Mastermix enthält Oligonukleotidprimer, Fluorophor und mit Quencher markierte
Sonden, die konservierte RSV- und hMPV-Regionen erfassen, und die Prozesskontrollsequenz.
4.
Amplifikation und Nachweis von Nukleinsäure In jedes Reagenzröhrchen bzw. in jede
Testplattenvertiefung 15 µl des rehydrierten Mastermix geben. Anschließend 5 µl extrahierte
Nukleinsäure (Präparat mit PRC) in die Testplattenvertiefung oder das entsprechend beschriftete
Reagenzröhrchen geben. Die Testplatte oder das Reagenzröhrchen in das Life Technologies QuantStudio™
Dx Real-Time PCR Instrument, das Applied Biosystems® (ABI) 7500 Fast Dx Instrument oder den Cepheid®
SmartCycler II platzieren.
Nachdem das Reagenzröhrchen oder die Testplatte in das Instrument gestellt wurde, das Assay-Protokoll
starten. Dieses Protokoll initiiert eine reverse Transkription der RNA-Ziele, wobei komplementäre DNA
generiert wird, und die anschließende Amplifikation der Zielsequenzen findet statt. Der Quidel Molecular
RSV + hMPV-Assay basiert auf der TaqMan®-Chemie und nutzt ein Enzym mit Reverse-Transkriptase-,
DNA-Polymerase- und 5’-3’-Exonuklease-Aktivitäten. Während der DNA-Amplifikation spaltet dieses
Enzym die an der komplementären DNA-Sequenz gebundene Sonde und löst den Quencher-Farbstoff vom
Reporter-Farbstoff. Dieser Schritt generiert bei Anregung durch eine Lichtquelle von entsprechender
Wellenlänge einen Anstieg des Fluoreszenzsignals. Mit jedem Zyklus werden weitere Farbstoffmoleküle
von ihren Quenchern getrennt, was ein weiteres Signal verursacht. Wenn ausreichend Fluoreszenz erzielt
wird, wird die Probe für die nachgewiesene Zielsequenz als positiv gemeldet.
Mitgelieferte Materialien
SKU-Nr. M103
Nachweiskit (96 Reaktionen) – Bei 2 bis 8 °C aufbewahren
#
Komponente
Menge/Anzahl


Rehydrierungslösung Artikel-Nr. M5003
1 Fläschchen/Kit 1,9 ml
Quidel Molecular RSV + hMPV-Mastermix Artikel-Nr. M5035
12 Fläschchen/Kit,
8 Reaktionen/Fläschchen
Lyophilisierter Inhalt:
DNA-Polymerase-Enzym mit Reverse-Transkriptase-Aktivität
Primer und Sonden
dNTPs
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 4 von 28
Stabilisatoren
Prozesskontrolle Artikel-Nr. M5005
1 Fläschchen/Kit 2,0 ml
Optionale Materialien
Externe Kontrollen für RSV und hMPV (d. h. Quidel Molecular RSV + hMPV-Kontrollset, Artikel-Nr. M107, das
als externe Prozess- und Extraktionskontrolle dient)
Erforderliche, jedoch nicht mitgelieferte Materialien
Mikro-Pipettierer (zwischen 1 und 10 μl sowie 100 und 1000 μl)
Aerosolfreie Pipettenspitzen
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument oder Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Instrument
PCR-Platte mit 96 Vertiefungen
Verschlussfolie
Plattenzentrifuge für ABI-Testplatte mit 96 Vertiefungen
bioMerieux NucliSENS easyMAG Software Version 2,0
bioMerieux NucliSENS easyMAG Puffer 1, 2, 3
bioMerieux NucliSENS easyMAG Lysepuffer
bioMerieux NucliSENS easyMAG Silica-Magnetkügelchen
bioMerieux NucliSENS easyMAG Verbrauchsmaterial
Oder
Mikro-Pipettierer (zwischen 1 und 10 μl sowie 100 und 1000 μl)
Aerosolfreie Pipettenspitzen
Cepheid SmartCycler II
SmartCycler II-Verbrauchsmaterial
SmartCycler II-Zentrifuge
bioMerieux NucliSENS easyMAG Software Version 2,0
bioMerieux NucliSENS easyMAG Puffer 1, 2, 3
bioMerieux NucliSENS easyMAG Lysepuffer
bioMerieux NucliSENS easyMAG Silica-Magnetkügelchen
bioMerieux NucliSENS easyMAG Verbrauchsmaterial
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
Zur In-vitro-Diagnose
Die Leistungsmerkmale dieses Tests wurden nur anhand der im Abschnitt Bestimmungsgemäßer
Gebrauch aufgeführten Präparattypen bestimmt. Die Leistung dieses Assays mit anderen Präparattypen
oder Proben wurde nicht untersucht.
Die Verwendung anderer Extraktionssysteme als dem NucliSENS easyMAG-System wurde nicht geprüft.
Die Validierung dieser Systeme liegt in der Verantwortung des Endbenutzers.
Die Verwendung anderer Zyklusbedingungen als der im Abschnitt „Anleitung zum Programmieren des
Thermocyclers“ beschriebenen kann zu falschen Ergebnissen führen.
Die Verwendung dieses Produkts sollte Personen mit ausreichender Übung bei PCR- und RT-PCRMethoden vorbehalten sein.
Alle Präparate/Proben sind als potenziell infektiös zu behandeln. Bei der Arbeit mit Proben, diesem Kit und
dessen Inhalt sind universelle Vorsichtsmaßnahmen zu befolgen.
Korrekte Ergebnisse setzen eine ordnungsgemäße Gewinnung und Lagerung und einen sachgemäßen
Transport der Proben voraus.
Die Assay-Reagenzien sind entsprechend den Angaben auf ihren jeweiligen Etiketten aufzubewahren.
Bei der Verwendung dieses Kits geeignete Schutzkleidung, Handschuhe, Schutzbrille und Mundschutz
tragen.
Um genaue Ergebnisse beim Pipettieren zu erhalten, sorgfältig vorgehen und nur kalibrierte Geräte
verwenden.
Alle Oberflächen mit einer 10%igen Bleichelösung und anschließend mit molekularbiologisch gereinigtem
Wasser reinigen und desinfizieren.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 5 von 28
Bei allen Arbeitsschritten Mikro-Pipettierer mit einer Aerosolbarriere oder Spitzen mit positiver
Verdrängung verwenden.
Mikrobielle Kontamination bzw. Kreuzkontamination der Kitreagenzien vermeiden. Nach den Prinzipien
der Guten Laborpraxis arbeiten.
Reagenzien aus Kits mit unterschiedlichen Chargennummern dürfen nicht gemischt werden.
Keine Reagenzien anderer Hersteller mit diesem Kit verwenden.
Das Produkt nicht nach Ablauf seines Verfallsdatums nicht verwenden.
Die richtige Planung des Arbeitsablaufs ist eine Grundvoraussetzung zur Minimierung des
Kontaminationsrisikos. Den Arbeitsablauf im Labor stets in eine Richtung, beginnend bei der
Präamplifikation und weiter in Richtung Amplifikation und Detektion ablaufend, planen.
Im Präamplifikations- und Amplifikationsbereich jeweils eigenes Zubehör und eigene Gerätschaften
verwenden.
Zwischen den Bereichen darf weder Personenverkehr noch Austausch von Gerätschaften stattfinden.
Das Zubehör für die Amplifikation und das Zubehör für die Präamplifikation jederzeit voneinander
getrennt halten.
Probenröhrchen oder Platten nach der Amplifikation nicht mehr öffnen bzw. entsiegeln.
Amplifiziertes Material sorgfältig und nach vor Ort geltenden Gesetzen und Bestimmungen entsorgen, um
das Risiko einer Amplifikatkontamination zu minimieren.
Zubehör, das nur für die Reagenzien- oder Probenvorbereitung bestimmt ist, nicht für die Verarbeitung
von Zielnukleinsäure verwenden.
Sicherheitsdatenblätter sind auf Anfrage erhältlich und stehen auf der Produkt-Website zur Verfügung.
Aufbewahrung und Handhabung der Kit-Reagenzien
Das ungeöffnete Kit bis zu dem auf der äußeren Kitschachtel aufgedruckten Verfallsdatum bei 2 bis 8 °C
aufbewahren.
Der rehydrierte Mastermix kann bei Raumtemperatur bis zu 24 Stunden oder bei 2 ° bis 8 °C bzw. ≤-20 °C
bis zu 2 Tage aufbewahrt werden. Der rehydrierte Mastermix sollte wieder mit einem Deckel verschlossen,
mit Parafilm versiegelt und in aufrechter Position gelagert werden. Den Mastermix lichtgeschützt
aufbewahren.
Anzeichen für Instabilität oder Qualitätsbeeinträchtigung der Reagenzien
Eine Trübung der Rehydrierungslösung kann ein Anzeichen für eine Qualitätsbeeinträchtigung dieses
Reagenzes sein. In diesem Fall kann beim Technischen Kundendienst von Quidel ein Ersatzreagenz angefordert
werden.
Entnahme, Aufbewahrung und Handhabung der Proben
Die für die Validierung des Quidel Molecular RSV + hMPV-Assays verwendeten Proben wurden mit
Standardverfahren von Patienten mit Symptomen einer Infektion der oberen Atemwege entnommen. Diese
Proben wurden den Anforderungen von CLSI M41-A entsprechend entnommen, transportiert, gelagert und
verarbeitet. Generell sollten Proben gekühlt bei 2 bis 8 C transportiert und vor der Verarbeitung 72 Stunden
lang bei 2 bis 8 C gelagert werden. Etwaige Probenreste sollten bei ≤ -70 C aufbewahrt werden.
Es wurde eine Serie von Studien durchgeführt, die die Auswertung einer Reihe gewöhnlich verwendeter
Virustransportmedien bei einem Volumen von 2 ml zum Ziel hatten: M4, M4-RT, M5, M6 und UTM. Bezüglich
der Assay-Leistung für die fünf verschiedenen Typen von Virustransportmedien wurden keine signifikanten
Unterschiede festgestellt.
Aufbewahrung von Nukleinsäureextrakten
Eluate können bei Raumtemperatur (20 bis 25 C) bis zu 4 Stunden, bei 2 bis 8 C 6 Stunden und bei -20 °C
1 Monat lang aufbewahrt werden. Bei -20 °C gelagert, bleibt die extrahierte RNA über drei Gefrier/Auftauzyklen hinweg stabil.
Anleitung zum Programmieren der Nukleinsäureextraktion
Hinweis: In jeden Extraktionslauf sollten eine positive Prozess- und Extraktionskontrolle für RSV/hMPV (d. h.
Quidel Molecular RSV + hMPV Kontrollset, Artikel-Nr. M107 oder bereits charakterisierte positive RSV- oder
hMPV-Proben) sowie eine negative Prozesskontrolle (d. h. Virustransportmedien oder bereits charakterisierte
negative RSV- oder hMPV-Proben) eingeschlossen werden.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 6 von 28
1.
Das Gerät einschalten und warten, bis das Lämpchen auf Orange umschaltet. Anschließend den Computer
einschalten und die easyMAG-Software starten.
2.
Nach Drücken der Schaltfläche „Instrument“
Barcode versehen.
3.
Zur Eingabe von Proben die Schaltfläche „Tägliche Verwendung“
und „Reagenzinventar“
die Reagenzien mit
drücken, mit der standardmäßig
der Bildschirm „Anforderung definieren“
geöffnet wird. Folgende Einstellungen auswählen:
a.
Proben-ID: Mit der Tastatur den Probennamen eingeben.
b.
Matrix:
Aus dem Dropdown-Menü Andere auswählen.
c.
Request
Anforderung:
Aus
dem
Dropdown-Menü
Generisch
auswählen.
d.
Volumen (ml): Aus dem Dropdown-Menü 0,200 auswählen.
e.
Eluat (µl):
Aus dem Dropdown-Menü 50 auswählen.
f.
Typ: Primär
g.
Priorität:
Normal
4.
Nach Drücken der Schaltfläche „Speichern“
wird die Probe im Fenster „Nicht zugewiesene Probe“
links auf dem Bildschirm angezeigt. Die Schaltfläche „Neue Extraktionsanforderung eingeben“
drücken und den Vorgang für die anderen Proben wiederholen. Alternativ können durch Drücken der
Schaltfläche „Neue Extraktionsanforderungen automatisch erstellen“
werden.
5.
Nach Erstellung aller Proben durch Anklicken des Symbols
mehrere Proben eingegeben
oben auf der Seite „Läufe organisieren“
aufrufen. Durch Drücken der Schaltfläche „Lauf erstellen“
einen Lauf erstellen. Eine Bezeichnung
für den Lauf eingeben oder die Standardbezeichnung verwenden.
6.
Mithilfe der Schaltfläche „Lauf automatisch füllen“
können dem Lauf Proben hinzugefügt werden
(aus der Liste „Nicht zugewiesene Probe“ links im Bildschirm werden dem Lauf automatisch bis zu 24
Proben hinzugefügt). Alternativ können mithilfe der Positionierungssymbole links und rechts
werden.
7.
8.
nach entsprechender Auswahl einzelne Proben in den Lauf eingefügt oder darauf entfernt
Mit den Schaltflächen „Extraktionsanforderung nach oben/unten verschieben“
kann die Reihenfolge der Proben im Lauf geändert werden.
1 bis 3 Probengefäße (für 8 bis 24 Proben) bereitstellen und in jede verwendete Probenvertiefung 20 µl
Prozesskontrolle pipettieren.
In die entsprechenden Vertiefungen 180 µl jeder Probe pipettieren.
9.
Durch Drücken der Schaltfläche
oben im Bildschirm „Lauf beladen“ aufrufen. Spitzen und
Probengefäß(e) in das Instrument einsetzen.
10. Den/die Barcode(s) des/der Probengefäße(s) eingeben.
11. Den/die Barcode(s) der zu verwendenden Silica-Kügelchen eingeben.
12. Die Silica-Kügelchen wie folgt den Proben zuweisen:
a. Auf das Reagenziensymbol unter der Nummer 1 im Bild unten klicken. Die Chargennummer der
Silica-Kügelchen sollte nun unterhalb der Registerkarte „Silica“ bei der Nummer 2 im Bild unten
angezeigt werden.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 7 von 28
b.
Die Proben in dem Lauf, denen die Kügelchen zugewiesen werden müssen, markieren und
auswählen (in dem Kästchen mit der Nummer 3 im Bild unten).
c.
Zur
Zuweisung der Silica-Chargennummer zu den ausgewählten Proben das
Positionierungssymbol (unter der Nummer 4 im Bild unten) anklicken
Wenn das Symbol für die Kügelchen rechts von der Nummer 5 im Bild unten ausgewählt wird,
muss für jede Probe die Chargennummer der Silica-Kügelchen angezeigt werden.
d.
1
2
4
5
3
13. Die Arbeitsliste ausdrucken, indem zuerst das Symbol für „Lauf beladen“ und anschließend das Symbol
„Arbeitsliste ausdrucken“
gedrückt wird.
14. Die Schaltfläche „Lysepuffer verteilen“
drücken. Der vom Gerät durchgeführte Lysevorgang dauert
ca. 12 Minuten.
15. Die Magnetpartikel für jedes Probengefäß mit der Biohit-Pipette und die Spitzen für bis zu acht Reaktionen
wie folgt vorbereiten:
a. Unter Verwendung von 1 Spitze und von Programm 1 550 µl nukleasefreies Wasser aufziehen
und in ein 1,5 ml DNase-/RNase-freies Mikrofugenröhrchen pipettieren.
b. Die Silica-Magnetkügelchen vortexen. Unter Verwendung von 1 Spitze und dem Programm 1
550 µl Silica-Magnetkügelchen aufziehen, in das Wasser geben und auf dem Vortex mischen.
c. Unter Verwendung von 1 Spitze und dem Programm 2 1050 µl des Silica-MagnetkügelchenGemisches aufziehen und 25 µl zurück in das Röhrchen geben.
d. 125 µl Silica-Magnetkügelchen-Gemisch 8 Mal in 8 Vertiefungen einer ELISA-Teststreifenplatte
pipettieren. Die Spitze entsorgen.
e. Nach Beendigung der Lyse (Hinweis: Der unten im Bildschirm angezeigte „Gerätestatus“ muss
„BEREIT“ lauten!) unter Verwendung von 8 Spitzen und Programm 3 100 µl SilicaMagnetkügelchen-Gemisch aus den Vertiefungen der Teststreifen aufziehen, 100 µl SilicaMagnetkügelchen-Gemisch in die Vertiefungen der der Teststreifen geben und 100 µl SilicaMagnetkügelchen-Gemisch aus den Vertiefungen der Teststreifen aufziehen.
f. Die Spitzen jeweils in die Flüssigkeit derselben Gefäße eintauchen. Von dem SilicaMagnetkügelchen-Gemisch 800 µl aufziehen und dann wieder 900 µl in das Gefäß zurückgeben.
1000 µl des Silica-Magnetkügelchen-Gemischs aus dem Gefäß aufziehen und wieder zurück in das
Gefäß geben. Die Aspiration/Rückführung der 1000 µl noch zweimal wiederholen.
16. Das Gerät schließen und die Schaltfläche „Start“
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
drücken, um mit dem Lauf zu beginnen.
Seite 8 von 28
17. Nach Abschluss des Laufs die gereinigten Nukleinsäuren in nukleasefreie Röhrchen übertragen. Eluate
können bei Raumtemperatur (20 ° bis 25 C) bis zu 4 Stunden, bei 2 bis 8 °C 6 Stunden und bei -20 °C 1
Monat lang aufbewahrt werden. Bei -20 °C gelagert, bleibt die extrahierte RNA über drei Gefrier/Auftauzyklen hinweg stabil.
Anfangsprogrammierung des Thermocyclers
Anleitung zum Programmieren des SmartCycler II
1.
2.
Das Softwarepaket des Cepheid SmartCycler Dx Version 3.0b starten.
Erstellung des Quidel Molecular RSV + hMPV-Assays
a. Oben im Bildschirm die Schaltfläche Assays definieren auswählen
b. Eine Bezeichnung für den Assay eingeben:
i. Unten links im Bildschirm die Schaltfläche Neu auswählen.
ii. „Quidel Molecular RSV + hMPV“ eingeben und OK wählen.
iii. Nun wird „Quidel Molecular RSV + hMPV“ der Liste Assayname oben links im Bildschirm
hinzugefügt.
c. Die Analysewerte festlegen: Im Abschnitt Forschung die Registerkarte Analyseeinstellungen
auswählen und folgende Spezifikationen verwenden:
i. Aus dem Dropdown-Menü Farbstoffe FCTC25 wählen.
ii. Das Dropdown-Menü Analysetyp sollte auf Qualitativ (Standardeinstellung) eingestellt
werden.
iii. In der Spalte Kanal-Name „RSV“ für Kanal 1, „hMPV“ für Kanal 3 und „PRC“ für Kanal 4
eingeben.
iv. In der Spalte Gebrauch aus dem Dropdown-Menü Ziel für RSV und hMPV und für PRC Interne
Kontrolle auswählen. Beim Auswählen von Interne Kontrolle erscheint das unten gezeigte
Fenster. Die Schaltfläche Ja auswählen.
v. In der Spalte Kurvenanalyse die Option Primäre Kurve für jeden Kanal (RSV, hMPV, PRC)
wählen (Standardeinstellung).
vi. In der Spalte Einstellung des Schwellenwerts für jeden Kanal (RSV, hMPV, PRC) Manueller
Schwellenwert eingeben (Standardeinstellung).
vii. In der Spalte Manueller Schwellenwert für Fluoreszenzeinheiten folgende Schwellenwerte
eingeben:
a. RSV: 20,0
b. hMPV: 10,0
c. PRC: 10,0
viii. In der Spalte Gültige Mindestanzahl Zyklen (falls nicht direkt sichtbar, nach rechts scrollen) für
jeden Kanal (RSV, hMPV, PRC) 5 eingeben.
ix. In der Spalte Gültige Höchstzahl Zyklen (falls nicht direkt sichtbar, nach rechts scrollen) für
jeden Kanal (RSV, hMPV, PRC) 50 eingeben.
x. In der Spalte Leerwertsubtraktion für jeden Kanal (RSV, hMPV, PRC) „EIN“ wählen
(Standardeinstellung).
xi. In der Spalte Mindestanzahl Zyklen, Leerwert für jeden Kanal (RSV, hMPV, PRC) 5 eingeben.
xii. In der Spalte Höchstzahl Zyklen, Leerwert für jeden Kanal (RSV, hMPV, PRC) 35 eingeben.
xiii. In der Spalte Durchschnittl. Anzahl Zyklen Boxcar für jeden Kanal (RSV, hMPV, PRC) 0
beibehalten (Standardeinstellung).
xiv. In der Spalte Endpunkt Schwellenwert für jeden Kanal (RSV, hMPV, PRC) 20, 10, 10 eingeben
(Standardeinstellung).
xv. In der Spalte NC IC% für jeden Kanal (PRC) „NA“ belassen (Standardeinstellung).
xvi. In der Spalte IC Delta für jeden Kanal (RSV, hMPV) „NA“ belassen (Standardeinstellung).
xvii. Im Abschnitt Ergebnistext anpassen (unterhalb der Tabelle) aus dem Dropdown-Menü
Organismusbasierter Ergebnistext wählen. Daraufhin wird das nachstehende Warnfenster
geöffnet. Ja wählen.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 9 von 28
xviii. Mit der Schaltfläche Anpassen das Dialogfenster Organismusbasierter Ergebnistext öffnen. Die
Schaltfläche Hinzufügen auswählen, in der Spalte Bezeichnung des Organismus „RSV“
eingeben und das Kästchen RSV markieren. Noch einmal die Schaltfläche Hinzufügen
auswählen, in der Spalte Bezeichnung des Organismus „hMPV“ eingeben und das Kästchen
hMPV markieren.
Unten in dem Popup-Fenster auf OK klicken.
Die Dauer und die Temperaturen der RT-PCR-Zyklen wie folgt einstellen:
i. Phase 1
1. Halten
2. Temperatur: 55,0
3. Sekunden: 300
4. Optik:
AUS
ii. Phase 2
1. Halten
2. Temperatur: 60,0
3. Sekunden: 300
4. Optik:
AUS
iii. Phase 3
1. Halten
2. Temperatur: 65,0
3. Sekunden: 300
4. Optik:
AUS
iv. Phase 4
1. Zyklus mit 2 Temperaturen
2. Anzahl der Wiederholungen: 50
3. Erste Temperatur Reihe:
a. Temperatur:
92,0
b. Sekunden:
5
c. Optik:
AUS
4. Zweite Temperatur Reihe:
a. Temperatur:
57,0
b. Sekunden:
40
c. Optik:
EIN
Das Protokoll durch Auswahl der Schaltfläche Speichern unten im Bildschirm speichern.
d.
3.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 10 von 28
Abbildung des vollständigen Protokolls für das Quidel Molecular RSV + hMPV-Protokoll:
Anleitung zum Programmieren des Applied Biosystems 7500 Fast DX
1.
2.
Das ABI 7500 Fast Dx Softwarepaket starten.
Das Dialogfenster Kurzanleitung zur Inbetriebnahme wird geöffnet. Die Schaltfläche Neues Dokument
erstellen auswählen, um den Assistenten für neue Dokumente aufzurufen. Zur Initiierung des Quidel
Molecular RSV + hMPV-Protokolls die nachstehenden Schritte befolgen.
a. Dokument definieren: Bei den meisten der folgenden Eingaben handelt es sich um
Standardeinstellungen. Andernfalls die entsprechenden Änderungen vornehmen.
i. Die folgenden Daten bestätigen bzw. eingeben:
Assay: Standardkurve (Absolute Quantifizierung)
Behältnis: 96 Vertiefungen, transparent
Vorlage: Leeres Dokument
Laufmodus: Fast 7500
Bediener: Ihr Bedienername
Anmerkungen: SDS v1.4
Bezeichnung
„Quidel Molecular RSV + hMPV“
der Platte:
ii. Die Schaltfläche Weiter auswählen.
iii. Detektoren auswählen: Es müssen neue Detektoren für hMPV, RSV und die
Prozesskontrolle (PRC) hinzugefügt werden. Für jedes Ziel die Schaltfläche Neuer
Detektor auswählen, um das Popup-Fenster Neuer Detektor aufzurufen. Alternativ
die Schaltfläche Weiteren erstellen aus dem Popup-Fenster Neuer Detektor für die
letzten zwei Detektoren verwenden und für jeden Detektor die folgenden
Informationen eingeben:
Bezeichnung
Reporter-Farbstoff
Quencher-Farbstoff
Farbe
RSV
FAM
(keiner)
(Auswahl)
hMPV
Texas Red
(keiner)
(Auswahl)
PRC
Cy5
(keiner)
(Auswahl)
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 11 von 28
iv. Für jeden Detektor eine eigene Farbe auswählen.
v. Die neuen Detektoren markieren und der Spalte Detektoren in Dokument mit der
Schaltfläche Hinzufügen hinzufügen.
vi. Aus dem Dropdown-Menü Passive Referenz (Keine) auswählen.
vii. Die Schaltfläche Weiter auswählen.
viii. Die Schaltfläche „Fertigstellen“ auswählen, ohne vorher Vertiefungen festzulegen.
b. Der Assistent wird geschlossen, und die Software wird aufgerufen, wobei zunächst die
Registerkarte Vorbereitung angezeigt wird. Hier wird die Probenplatte angezeigt, die
während des Schnellstarts erstellt worden ist. Bei der ersten Einrichtung muss auf dieser
Registerkarte nichts geändert werden.
c. Definition des Thermocycler-Protokolls:
i. Die Registerkarte Gerät auswählen, um Dauer und Temperaturen der RT-PCR-Zyklen
für den Quidel Molecular RSV+hMPV-RT-PCR einzustellen.
ii. Unter Thermoprofil sollte ein aus 2 Phasen bestehendes Standardprotokoll
vorhanden sein. Jede Phase hat 3 vom Benutzer bearbeitbare Textfelder. Der Wert
im obersten Feld gibt die Anzahl der Wiederholungen oder Zyklen für die
betreffende Phase an. Der Wert im mittleren Feld gibt die Temperatur (˚C) und das
unterste Feld gibt die Zeit (in Minuten: Sekunden) an.
iii. Das Thermalcycler-Standardprotokoll wie folgt ändern:
1. Phase 1
a. Wiederholungen: 1
b. Temperatur:
55
c. Dauer:
5:00
2. Den Balken zwischen Phase 1 und Phase 2 auswählen. Die Schaltfläche
Pause hinzufügen auswählen, um eine weitere Phase hinzuzufügen.
3. Phase 2
a. Wiederholungen: 1
b. Temperatur:
60
c. Dauer:
5:00
4. Den Balken zwischen Phase 2 und Phase 3 auswählen. Die Schaltfläche
Pause hinzufügen auswählen, um eine weitere Phase hinzuzufügen.
5. Phase 3
a. Wiederholungen: 1
b. Temperatur:
65
c. Dauer:
5:00
6.
Phase 4 (Aus 2 Schritten bestehende Amplifikationsphase)
a. Wiederholungen: 10
b. Schritt 1
i. Temperatur:
92
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 12 von 28
ii. Dauer:
0:05
Schritt 2
i. Temperatur:
57
ii. Dauer:
0:40
7. Den Balken rechts von Phase 4 wählen. Die Schaltfläche Zyklus hinzufügen
auswählen, um eine weitere Phase hinzuzufügen.
8. Phase 5 (Aus 2 Schritten bestehende Amplifikationsphase)
a. Wiederholungen: 35
b. Schritt 1
i. Temperatur:
92
ii. Dauer:
0:05
c. Schritt 2
i. Temperatur:
57
ii. Dauer:
0:40
9. Wurde eine falsche Phase hinzugefügt, kann diese entfernt werden, indem
nach dem Markieren der Phase zwischen den senkrechten Linien die
Schaltfläche Löschen gedrückt wird.
iv. Unter Einstellungen Folgendes eingeben:
Probenvolumen (μl): 20 (Standard)
Laufmodus: 7500 Fast (Standard)
Datenerfassung: Phase 5, Schritt 2 (57,0 @ 0:40)
HINWEIS: Das Kontrollkästchen neben „Expertenmodus“ nicht markieren.
c.
v. Endgültiges Protokoll
d. Den Schwellenwert für jeden Analyten wie folgt eingeben:
i. Die Registerkarte Ergebnisse öffnen.
ii. Die Registerkarte Amplifikationsplot öffnen.
iii. Aus der Registerkarte „Detektor“ oben rechts „RSV“ wählen.
iv. Im Block Analyseeinstellungen den Schwellenwert auf 8,0e4 setzen.
v. Das Optionsfeld Automatische Basislinie auswählen.
vi. Schritt iii-v für hMPV wiederholen und den Schwellenwert auf 5,4e4 setzen.
vii. Schritt iii-v für PRC wiederholen und den Schwellenwert auf 2,7e4 setzen.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 13 von 28
viii. Schritt iii-v für PRC wiederholen und den Schwellenwert auf 2,7e4 setzen.
e. Das neue Protokoll für spätere Verwendungen als Matrize speichern.
i. Oben im Bildschirm Datei und anschließend Speichern als auswählen.
ii. Speichern unter: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\.
iii. Dateiname: „Quidel Molecular RSV + hMPV“.
iv. Dateityp: „SDS Templates (*.sdt)“.
f. Die Software beenden.
Anleitung zum Programmieren des QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument Dx
Quidel Molecular bietet eine vordefinierte Vorlage für den Assay auf einer CD, die auf das QuantStudio™ Dx
Instrument hochgeladen werden muss. Wenden Sie sich bitte an einen Quidel-Repräsentanten unter der
Nummer (800) 874-1517 (gebührenfrei in den USA) oder unter (858) 552-1100, Montag bis Freitag zwischen 8
und 17 Uhr (Ostküstenzeit), um diese CD zu erhalten. Diese Vorlagen enthalten die Durchlaufparameter,
sodass keine Instrumentenprogrammierung erforderlich ist, um zu beginnen. Installieren des
Testdefinitionsdokuments:
1. Auf der Registerkarte „QuantStudio™ Dx Software Home“ im Fenster „Instrumente“ auf „Test
verwalten“ klicken.
2. Im Testmenü auf „Installieren“ klicken.
3. Zur .tdd-Datei (Test Definition Document) navigieren, die Datei auswählen und auf „Öffnen“ klicken.
Die QuantStudio™ Dx Software fügt automatisch den ausgewählten Test zum Testmenü hinzu.
4. Auf „Schließen“ klicken, um das Testmenü zu schließen und die Änderungen zu speichern.
Assayverfahren
Die folgenden Arbeitsschritte werden bei einer geregelten Raumtemperatur von 20 bis 25 C durchgeführt.
Vorgehensweise zur Nukleinsäureextraktion
Die Anleitung zum Programmieren des bioMerieux NucliSENS easyMAG Systems oben beachten.
1. In die Probenextraktionsvertiefung 20 µl der Prozesskontrolle geben.
2. In die Probenextraktionsvertiefung 180 µl Patientenprobe oder externe Kontrolle geben.
3. Die Extraktion nach den Anweisungen des Herstellers durchführen.
4. Eluate können bei Raumtemperatur (20 bis 25 C) bis zu 4 Stunden, bei 2 bis 8 C 6 Stunden und
bei -20 C 1 Monat lang aufbewahrt werden. Bei -20 C gelagert, bleibt die extrahierte RNA über drei
Gefrier-/Auftauzyklen hinweg stabil.
Vorgehensweise zum Rehydrieren des Mastermix:
1. Die Anzahl der zu testenden Proben bestimmen und die entsprechende Anzahl an lyophilisierten
Mastermix-Fläschchen (für jeweils acht Reaktionen) für den Assay bereitstellen.
2. Unbenutzte Reagenzien wieder unter ihren jeweiligen Aufbewahrungsbedingungen aufbewahren.
3. Den Mastermix vorsichtig öffnen, um eine Beschädigung des Pellets zu vermeiden.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 14 von 28
4.
5.
6.
Dem Mastermix 135 µl der Rehydrierungslösung zugeben.
Das Fläschchen 1 bis 2 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, damit das Pellet rehydriert.
Vor dem Verteilen in das erste PCR-Röhrchen oder die Testplattenvertiefung vorsichtig und unter
Vermeidung der Bildung von Luftbläschen 2 bis 3 Mal auf- und abpipettieren.
Hinweis: Der rehydrierte Mastermix ist ausreichend für acht Reaktionen.
Hinweis: Der rehydrierte Mastermix kann bei Raumtemperatur bis zu 24 Stunden oder bei 2 bis 8 C
oder ≤-20 C bis zu 2 Tage aufbewahrt werden. (Weitere Optionen zur Aufbewahrung sind dem
Abschnitt „Aufbewahrung und Handhabung der Kit-Reagenzien“ zu entnehmen.)
Vorgehensweise zum Vorbereiten der RT-PCR:
1.
2.
3.
4.
5.
In jedes Reagenzröhrchen bzw. in jede Testplattenvertiefung 15 µl des rehydrierten Mastermix geben.
In jedes Reagenzröhrchen bzw. in jede Testplattenvertiefung 5 µl extrahierte Nukleinsäure (Präparat
mit Prozesskontrolle) geben. Ein Mischen der Reagenzien ist nicht erforderlich.
Hinweis: Für jeden Probenextrakt eine neue Mikro-Pipettierer mit einer neuen aerosolfreien Spitze
verwenden.
Die Reagenzröhrchen schließen bzw. die Platte versiegeln.
Hinweis: Quidel empfiehlt, in jeden Thermocycler-Lauf ein Reagenzröhrchen oder eine
Testplattenvertiefung mit einer extrahierten externen positiven Kontrolle für RSV/hMPV (d. h. Quidel
Molecular RSV + hMPV-Kontrollset, Artikel-Nr. M107, oder bereits charakterisierte positive RSV- oder
hMPV-Proben) sowie ein Reagenzröhrchen oder eine Testplattenvertiefung mit einer negativen
Kontrolle einzuschließen. So kann bei Bedarf sichergestellt werden, dass die im Labor üblichen
Vorgehensweisen und Protokolle den Bestimmungen örtlicher bzw. staatlicher
Akkreditierungsorganisationen entsprechen.
Die Reagenzröhrchen bzw. die Platte mindestens 15 Sekunden zentrifugieren. Darauf achten, dass
sich die gesamte Flüssigkeit am Boden der Platte befindet.
Die Röhrchen bzw. die Platte in den Thermocycler setzen.
Amplifikationsprotokoll auf dem Cepheid SmartCycler II
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Den Block / die Blöcke des SmartCyclers einschalten.
Das Softwarepaket des SmartCycler Dx Version 3.0b starten.
Die Schaltfläche Lauf erstellen oben im Bildschirm auswählen, um den Lauf einzustellen.
Unter Name des Laufs einen Namen für den aktuellen Lauf (z. B. JJMMTT-Quidel Molecular RSV +
hMPV) eingeben.
Unter Anmerkungen etwaige Anmerkungen zum Lauf zur künftigen Bezugnahme eingeben.
Unter Assay den Assay „Quidel Molecular RSV + hMPV“ aus dem Dropdown-Menü auswählen.
Unter Assay-Informationen die Chargennummer und das Verfallsdatum des Kits eingeben.
Zur Auswahl der zu verwendenden Vertiefungen wie folgt vorgehen:
a. Zur automatischen Zuordnung von Vertiefungen wie folgt vorgehen:
i. Unter Anzahl der Proben die Anzahl der Proben in das dazu vorgesehene Textfeld eingeben.
ii. Die Schaltfläche Anwenden auswählen. Die eingegebene Anzahl an Reihen wird in der
Positionstabelle angezeigt.
b. Manuelles Schließen der Vertiefungen der SmartCycler-Blöcke:
i. Die Schaltfläche Positionen hinzufügen/entfernen weiter unten auf dem Bildschirm wählen.
ii. Dadurch wird das Popup-Fenster Positionen auswählen mit zwei Spalten aufgerufen. Die
Spalte links (Positionen) führt alle verfügbaren Positionen auf, die Spalte rechts
(Auswahlen) enthält alle ausgewählten Positionen.
iii. Zur Auswahl aller Positionen auf die Schaltfläche Alle Positionen wählen klicken.
iv. Zur Auswahl spezifischer Positionen mindestens eine Position markieren und die Position(en)
mithilfe des Rechtspfeils der Spalte Auswahlen hinzufügen.
v. Zum Schließen des Fensters die Schaltfläche OK drücken. Die ausgewählten Positionen
werden in der Positionstabelle angezeigt.
Die Probenkennungen in die Spalte Proben-ID in der Positionstabelle eingeben (dies kann auch erst
nach Beginn des Laufs durchgeführt werden).
In die Spalte Anmerkungen etwaige Anmerkungen eintragen und die Einträge in der Spalte Probentyp
bei „SPEC“ belassen.
Unten im Bildschirm die Schaltfläche Lauf starten auswählen.
Zur Anzeige des Fortschritts des Laufs die Schaltfläche Ergebnisse anzeigen wählen.
Den Lauf nach seinem Abschluss und vor dem Schließen der Software speichern.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
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Amplifikationsprotokoll auf dem Applied Biosystem 7500 Fast Dx Thermocycler
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Den 7500 Fast Dx einschalten.
Das 7500 Fast Dx Softwarepaket starten.
Das Dialogfenster Kurzanleitung zur Inbetriebnahme wird geöffnet.
Auf Neues Dokument erstellen klicken.
Bei den meisten der folgenden Eingaben handelt es sich um Standardeinstellungen. Andernfalls die
entsprechenden Änderungen vornehmen.
Assay:
Behältnis:
Vorlage:
Laufmodus:
Bediener:
Anmerkungen:
Bezeichnung
der Platte:
6.
7.
8.
Standardkurve (Absolute Quantifizierung)
96 Vertiefungen, transparent
Quidel Molecular RSV + hMPV
Fast 7500
Ihr Bedienername
SDS v1.4 (ggf. weitere hinzufügen)
JJMMTT-Quidel Molecular RSV + hMPV
Vorbereitung einer Probenplatte:
a. Auf den Registerkarten Vorbereitung und Platte wird das Platten-Layout angezeigt.
b. Alle Vertiefungen auswählen, die Proben enthalten werden, die rechte Maustaste drücken und
aus dem Dropdown-Menü die Option Well Inspector wählen. Im Popup-Fenster Well Inspector
die Detektoren für RSV, hMPV und PRC wählen.
c. Zur Eingabe der Probenbezeichnungen die Option Well Inspector verwenden. Im Fenster „Well
Inspector“ können auch die Patienten-IDs eingegeben werden. Es wird empfohlen, dies vor dem
Resuspendieren des lyophilisierten Mastermix, nach dem Lauf oder mithilfe der Import-Funktion
durchzuführen, damit die PCR-Reaktionen vor Beginn des Laufs möglichst kurze Zeit der
Raumtemperatur ausgesetzt sind.
d. Den Lauf als JJMMTT-Quidel Molecular RSV + hMPV.sds speichern.
e. Es wird ein Fenster geöffnet, in dem der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist.
„Vorbereitung“ bzw. andere Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
Starten der PCR:
a. Die Registerkarte Gerät aufrufen.
b. Die PCR-Platte mit 96 Vertiefungen in das Gerät setzen.
c. Unter Gerätesteuerung die Schaltfläche Start wählen, um den Lauf zu starten.
Nach der PCR:
a. WICHTIG: Nach Beendigung des Laufs auf OK drücken. Die Daten durch Drücken der Schaltfläche
„Analysieren“ im Menü oben analysieren. Anschließend die Datei speichern.
b. Zum Speichern der Datei Dokument speichern in der Taskleiste drücken. Es wird ein Fenster
geöffnet, in dem der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist. „Datenanalyse nach
dem Lauf“ bzw. andere Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
Amplifikationsprotokoll auf dem QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
1.
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8.
Den QuantStudio Dx einschalten.
Den IVD-Modus auf dem Instrument auswählen.
Das QuantStudio Dx IVD Softwarepaket starten.
Wenn eine entsprechende Aufforderung angezeigt wird, den in jeder Extraktion enthaltenen
Benutzernamen und das Passwort eingeben.
Der Startbildschirm wird geöffnet.
Im Kästchen Vorbereitung den Namen des zuvor geladenen Tests „Quidel Molecular RSV + hMPV“
eingeben.
Auf die Schaltfläche Vorbereitung klicken, um einen RT-PCR-Lauf zu starten.
Der Bildschirm Vorbereitung, Testeigenschaften erscheint. Entsprechende Lauf-Informationen
eingeben.
a. Experimentname eingeben (Standardeinstellung startet den Lauf mit einem Datum und
Zeitstempel).
b. Die Information Platten-Barcode eingeben.
c. Unter Reagenzinformationen die Material-Chargennummern notieren.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
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d.
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14.
15.
16.
Den Lauf mit einer eindeutigen Bezeichnung als „.sds“-Datei (z. B. JJMMTT-Lauf-ID-Nr.-Quidel
Molecular C difficile.sds) speichern.
e. Ein Fenster wird geöffnet, in dem der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist.
„Vorbereitung“ bzw. andere Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
In der linken Menüleiste Definieren auswählen.
Die Probeninformationen bearbeiten.
a. Spezifische Probeninformationen für jede Vertiefung eingeben, indem die Standard-ID (Patient 1,
Patient 2 usw.) gelöscht wird und neue Informationen eingegeben werden, ODER
b. Oben auf der Anzeige Aus Datei importieren auswählen, um eine vordefinierte Plattenkarte aus
einer Text-Datei (tabulator-getrennt) auszuwählen.
In der linken Menüleiste Zuweisen auswählen, um die richtige Plattenvorbereitung sicherzustellen.
Laden der Probenplatte.
a. Den Instrumententräger auswerfen.
b. Die PCR-Platte mit 96 Vertiefungen in die Maschine einführen, wobei die Vertiefung A1 in der
linken oberen Ecke positioniert wird.
c. Den Instrumententräger einziehen.
Den Lauf starten.
a. In der linken Menüleiste Lauf auswählen.
b. Oben im Bildschirm auf die Schaltfläche Lauf starten klicken.
i. Bei entsprechender Aufforderung die Seriennummer für das verwendete Instrument
auswählen.
Wenn der Lauf abgeschlossen ist, in der linken Menüleiste Lauf auswählen.
a. Zum Speichern der Datei Speichern in der Taskleiste drücken. Ein Fenster wird geöffnet, in dem
der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist. „Datenanalyse nach dem Lauf“ bzw.
andere Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
b. Standardmäßig erscheint Amplifikationsplot. Um andere Plotarten anzuzeigen, können diese aus
der linken Menüleiste ausgewählt werden.
c. Um Laufinformationen mit Ct-Werten anzuzeigen, die Registerkarte Vertiefungstabelle rechts im
Bildschirm auswählen.
Drucken eines Berichts.
a. In der oberen Menüleiste Bericht drucken auswählen. Den Inhalt des Berichts anpassen, indem
Kontrollkästchen im Berichtsfenster ausgewählt werden oder ihre Auswahl aufgehoben wird.
b. Unten im Dialogfeld die Schaltfläche Bericht drucken auswählen.
Exportieren von Datendateien.
a. In der linken Menüleiste Exportieren auswählen.
b. Den Pfad der Exportdatei auswählen ODER auf Durchsuchen klicken, um den gewünschten Pfad
zu suchen.
c. Der Name der Exportdatei ist standardmäßig der des gespeicherten Laufs.
d. Excel als Dateityp auswählen.
e. Den exportierten Datenbericht anpassen, indem zwischen den Registerkarten hin- und
hergewechselt wird und Optionen ausgewählt werden oder ihre Auswahl aufgehoben wird.
Unten im Bildschirm die Schaltfläche „Export starten“ auswählen.
Auswertung der Ergebnisse
Auswertung der Ergebnisse mit dem Cepheid SmartCycler II
1. Nach Beendigung des Laufs die Registerkarte Ergebnisse anzeigen aufrufen.
2. Die Registerkarte Probenergebnisse öffnen.
3. Die SmartCycler II-Software gibt automatisch an, ob in den Proben RSV- und/oder hMPV-virale RNA
nachgewiesen wurde oder ob der Lauf ungültig war (nicht erkannt).
4. Ausführlichere Informationen sind in den jeweiligen Registerkarten jedes Analyten im selben Fenster
angegeben. Wenn ein positives Ergebnis auf RSV oder hMPV (oder beides) vorliegt, kommt das PRCErgebnis nicht zum Tragen. Die PRC ist nur für negative Ergebnisse erforderlich.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
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Auswertung der Ergebnisse des Quidel Molecular RSV + hMPV-Assays auf dem Cepheid SmartCycler II
Verfahren
AssayErgebnisse der
RSV
hMPV
Auswertung der Ergebnisse
Ergebnis
Kontrollen
Kein Nachweis von RSV- und hMPV-Nukleinsäure;
Negativ
Bestanden
NEG
NEG
Nachweis von PRC
RSV-positiv
N. z.*
POS
NEG
RSV-Nukleinsäure nachgewiesen
hMPV-positiv
N. z.*
NEG
POS
hMPV-Nukleinsäure nachgewiesen
RSV- und
N. z.*
POS
POS
RSV- und hMPV-Nukleinsäure nachgewiesen**
hMPV-positiv
Nicht erkannt – PCR-Inhibition oder Versagen der
Reagenzien.
Den Test mit derselben gereinigten Probe
wiederholen. Wenn dieser Test ebenfalls ungültig
Ungültig
Fehlgeschlagen
NEG
NEG
ist, ein anderes Aliquot derselben Probe
extrahieren und erneut testen oder eine neue
Probe entnehmen und einen neuen Test
durchführen.
*Für die Prozesskontrolle ist zur Einstufung als positives Ergebnis kein Wert erforderlich.
** Doppelinfektionen sind selten. Test mit derselben gereinigten Probe wiederholen. Wenn der erneute Test
dieses Ergebnis bestätigt, eine neue Probe nehmen und testen. Wenn mehrere Proben dieses Ergebnis
aufweisen, Kontakt zu Quidel aufnehmen.
Fehlercode 3079: Der Warnhinweis/Fehlercode 3079 kann bei RSV- und/oder hMPV-positiven Proben
angezeigt werden. Der Warnhinweis/Fehlercode 3079 bedeutet, dass das Fluoreszenzsignal (RFU) zu hoch ist.
In diesem Fall werden alle Ergebnisse für die jeweilige Probe von der Dx-Software als ND (Nicht bestimmt)
angegeben. Wenn für eines der Viren ein Ct-Wert ≥ 5 gemeldet wird, können die Probenergebnisse für das
betreffende Virus als positiv aufgezeichnet werden. Bei einem Ct-Wert < 5 wird das jeweilige Virus als negativ
aufgezeichnet.
Auswertung der Ergebnisse mit dem ABI 7500 Fast Dx
Auswertung der Ergebnisse mit dem Quidel Molecular RSV + hMPV-Assay auf dem 7500 Fast Dx
Thermocycler
Detektor:
AssayDetektor
Detektor
Prozesskontroll
Auswertung der Ergebnisse
Ergebnis
RSV
hMPV
e
Nicht
Kein Nachweis von RSV- oder hMPVNegativ
Nicht bestimmt
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
bestimmt
viraler RNA; Nachweis von PRC
Nicht
Nachweis von RSV-viraler RNA
RSV-positiv
5,0≤ Ct ≤35,0
N. z.*
bestimmt
hMPVNicht bestimmt 5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
N. z.*
Nachweis von hMPV-viraler RNA
positiv
RSV und
Nachweis von RSV- und hMPV-viraler
5,0≤ Ct ≤35,0
5,0≤ Ct ≤35,0
N. z.*
hMPV
RNA**
Kein Nachweis von RSV- oder hMPVviraler RNA und kein Nachweis von
PRC; ungültiger Lauf.
Den Test mit derselben gereinigten
Nicht
Probe wiederholen. Wenn dieser Test
Ungültig
Nicht bestimmt
Nicht bestimmt
bestimmt
ebenfalls ungültig ist, ein anderes
Aliquot derselben Probe extrahieren
und erneut testen oder eine neue
Probe entnehmen und einen neuen
Test durchführen.
*Für die Prozesskontrolle ist zur Einstufung als positives Ergebnis kein Ct-Wert erforderlich.
** Doppelinfektionen sind selten. Test mit derselben gereinigten Probe wiederholen. Wenn der erneute Test
dieses Ergebnis bestätigt, eine neue Probe nehmen und testen. Wenn mehrere Proben dieses Ergebnis
aufweisen, Kontakt zu Quidel aufnehmen.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 18 von 28
Auswertung der Ergebnisse mit dem QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
Auswertung der Ergebnisse des Quidel Molecular RSV + hMPV-Assays auf dem
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
Detektor
AssayDetektor
Detektor
Auswertung der Ergebnisse
RSV
Ergebnis
hMPV
Prozesskontrolle
Kein Nachweis von RSVKein Ct-Wert
Kein Ct-Wert
Ct-Wert
Negativ
oder hMPV-viraler RNA;
gemeldet
gemeldet
gemeldet
Nachweis von PRC
Kein Ct-Wert
Nachweis von RSV-viraler
RSV-positiv Ct-Wert gemeldet
N. z.*
gemeldet
RNA
hMPVKein Ct-Wert
Nachweis von hMPV-viraler
Ct-Wert gemeldet
N. z.*
positiv
gemeldet
RNA
RSV und
Nachweis von RSV- und
Ct-Wert gemeldet
Ct-Wert gemeldet
N. z.*
hMPV
hMPV-viraler RNA**
Kein Nachweis von RSVoder hMPV-viraler RNA und
kein Nachweis von PRC;
ungültiger Lauf.
Den Test mit derselben
gereinigten Probe
wiederholen. Wenn der
Kein Ct-Wert
Kein Ct-Wert
Kein Ct-Wert
Ungültig
Test ebenfalls
gemeldet
gemeldet
gemeldet
ungültig ist, ein anderes
Aliquot derselben Probe
extrahieren und erneut
testen oder eine neue
Probe entnehmen und
einen neuen Test
durchführen.
*Für die Prozesskontrolle ist zur Einstufung als positives Ergebnis kein Ct-Wert erforderlich.
** Doppelinfektionen sind selten. Test mit derselben gereinigten Probe wiederholen. Wenn der erneute Test
dieses Ergebnis bestätigt, eine neue Probe nehmen und testen. Wenn mehrere Proben dieses Ergebnis
aufweisen, Kontakt zu Quidel aufnehmen.
Qualitätskontrolle
Der Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay enthält mehrere Kontrollen zur Überwachung der Leistung des Assays.
1. Während der Extraktion und der Amplifikation im Assay muss die Prozesskontrolle verwendet werden.
Diese Kontrolle muss vor der Extraktion jedem Probenaliquot zugegeben werden.
2. Handelsübliche externe positive RSV-/hMPV-Kontrollen können wie eine Patientenprobe behandelt
werden. Ihre Handhabung sollte nach den im Labor üblichen Standardvorgehensweisen erfolgen. Anstelle
einer handelsüblichen RSV- oder hMPV-Kontrolle können auch bereits charakterisierte positive RSV/hMPV-Proben verwendet werden.
3. Als externe negative Kontrolle eignen sich ein Virustransportmedium oder bereits charakterisierte
negative Proben. Diese sind wie eine Patientenprobe und nach den aktuellen Standardvorgehensweisen
im Labor zu behandeln.
Einschränkungen
Dieser Test ist nicht zur Differenzierung der RSV- oder hMPV-Subtypen bestimmt. Wenn eine
Differenzierung des Subtyps erforderlich ist, müssen weitere Tests durchgeführt werden.
Negative Ergebnisse schließen eine Infektion mit RSV oder hMPV nicht aus und dürfen nicht als alleinige
Basis für eine Behandlungsentscheidung herangezogen werden.
Wie bei anderen Assays dieser Art besteht ein Risiko für falsch negative Ergebnisse aufgrund des
Vorhandenseins von Variationen in der viralen Zielsequenz.
Unsachgemäße Entnahme und Lagerung oder unsachgemäßer Transport können zu falsch negativen
Ergebnissen führen.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 19 von 28
Auch Inhibitoren in der Probe und/oder Fehler bei der Durchführung des Assays können zu falsch
negativen Ergebnissen führen.
Die Assay-Ergebnisse sollten von ausgebildetem medizinischem Fachpersonal und in Verbindung mit der
Krankengeschichte, klinischen Anzeichen und Symptomen sowie den Ergebnissen sonstiger DiagnostikTests ausgewertet werden.
Die Leistung des Assays wurde nicht für Personen bestimmt, denen Corticosteroide nasal verabreicht
wurden.
Die Leistung des Assays wurde nicht für Personen bestimmt, denen Grippeimpfstoffe nasal verabreicht
wurden.
Ergebnisse der analytischen Studien zeigen, dass bei 2x LoD der hMPV-Subtyp B2 von RSV verglichen mit
der aufgezeichneten RSV-LoD auf dem ABI 7500 Fast Dx um das 10.000-Fache gehemmt wurde. Auf dem
Cepheid SmartCycler II durchgeführt, ergab dieselbe Studie, dass bei 2x LoD der hMPV-Subtyp B2 von RSV
in einem Maß gehemmt wurde, das drei Logarithmen über der aufgezeichneten RSV-LoD lag. Die in der
klinischen Studie zum Quidel Molecular RSV + hMPV-Assay beobachtete Auftretenshäufigkeit von
Koinfektionen mit DRSV und hMPV lag bei 0,1 % (1/949). Dies ist eine niedrige Prävalenz, die in
Abhängigkeit von der allgemeinen Prävalenz und der getesteten Studienpopulation schwanken kann.
Erwartete Werte
Es wurden klinische Studien mit dem Quidel Molecular RSV + hMPV-Assay unter Verwendung der Cepheid
SmartCycler® II-Plattform und dem Applied Biosystems® 7500 Fast Dx durchgeführt. Prospektive Proben aus
den gesamten USA wurden im Winter 2012 (Januar bis März 2012) getestet. Die unten stehende Tabelle
enthält die erwarteten Werte für die Viren auf den beiden Geräten.
Erwartete Werte für Winter 2012
Gerät
Cepheid SmartCycler® II
Applied Biosystems® 7500 Fast Dx
RSV
15,6 % (158/1014)
16,4 % (166/1012)
hMPV
14,6 % (148/1014)
15,5 % (157/1012)
Es wurde eine kleinere klinische Studie mit dem Quidel Molecular RSV + hMPV-Assay unter Verwendung des
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR-Instruments durchgeführt. Prospektive Proben aus den
gesamten USA wurden im Winter 2013 (Januar bis Februar 2013) getestet. Die unten stehende Tabelle enthält
die erwarteten Werte für die Viren auf den beiden Geräten.
Erwartete Werte für Winter 2013
Gerät
Life Technologies QuantStudio Dx RealTime PCR Instrument
RSV
18,6 % (59/317)
hMPV
14,4 % (45/317)
Klinische Leistung
Die Leistungsmerkmale des Quidel Molecular RSV + hMPV-Assays unter Verwendung des Cepheid
SmartCycler® II-Instruments und der Applied Biosystems® 7500 Fast Dx-Plattform wurden anhand einer 2012
während der Welle viraler Atemwegserkrankungen (Januar bis März) durchgeführten prospektiven Studie
durchgeführt. Bei den für diese Studie verwendeten Proben handelte es sich um frische (414) und gefrorene
(600) Abstrichproben, die im Zuge routinemäßiger Tests auf Atemwegserkrankungen in den USA gesammelt
wurden. Pro Patient wurde eine Probe entnommen und getestet (direkte DFA der Probe und Kultur mit DFA).
Die Residualproben wurden mit dem bioMériuex easyMAG extrahiert und mit dem Quidel Molecular RSV +
hMPV-Assay unter Verwendung des ABI 7500 Fast Dx Instruments und des Cepheid SmartCycler II Instruments
getestet. Aliquote jeder Probe wurden an einem zentralen Standort mit einem von der FDA zugelassenen
molekularbiologischen Messinstrument auf hMPV getestet.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 20 von 28
Die Altersdemografie
Applied BioSystem 7500 Fast Dx
Altersgruppe RSV(Jahre)
positiv
Cepheid SmartCycler II
Prävalenz
hMPVpositiv
Prävalenz
insgesamt RSVgetestet positiv
Prävalenz
hMPVpositiv
Prävalenz
insgesamt
getestet
<1
72
28,3 %
38
15,0 %
254
71
27,5 %
35
13,6 %
258
1 bis 5
72
19,9 %
76
21,5 %
354
67
19,0 %
73
20,7 %
352
6 bis 10
6
4,5 %
17
12,7 %
134
6
4,5 %
16
11,9 %
134
11 bis 15
3
4,8 %
7
11,3 %
62
3
4,8 %
6
9,7 %
62
16 bis 21
3
9,1 %
1
3,0 %
33
3
9,1 %
1
3,0 %
33
>21
10
5,7 %
18
10,3 %
175
8
4,6 %
17
9,7 %
175
157
15,5 %
1012 %
158
15,6 %
148
14,6 %
1014
Gesamt
166
16,4 %
* Zwei Proben waren ungültig.
Prospektive klinische Studie – Cepheid SmartCycler® II
Eintausendvierzehn (1014) Proben wurden sowohl mit den hier besprochenen als auch mit
Vergleichsmethoden auf RSV getestet. Eine (1) Probe war verschmutzt und drei (3) waren toxisch in Zellkultur
(0,4 %). Diese vier (4) Proben wurden von der Analyse ausgeschlossen. Die Ergebnisse für die verbleibenden
eintausendzehn (1010) Proben sind in der nachfolgenden Tabelle detailliert angegeben.
Kombinierte Standorte – respiratorisches Syncytial-Virus
DSFA und Zellkultur mit DFA
95 % KI
POS
NEG
Gesamt
Sensitivität
97,9 % 93,9 % 99,3 %
POS
137
21*
158
Spezifizität
97,6 % 96,3 % 98,4 %
Quidel Molecular
RSV + hMPV
NEG
3
849
852
Gesamt
140
870
1010
* Alle ursprünglich diskordanten Proben wurden von in einem von der FDA zugelassenen RT-PCR-Assay positiv
auf RSV getestet.
Neunhundertsechzig (960) Proben wurden sowohl mit dem hier besprochenen als auch mit
Vergleichsinstrumenten auf hMPV getestet (das Vergleichsinstrument stand für den vollständigen
Vergleichstest von vierundfünfzig (54) Proben nicht zur Verfügung). Neun (9) Proben waren im
Vergleichsinstrument ungültig (0,9 %). Diese neun (9) Proben wurden von der Analyse ausgeschlossen. Die
Ergebnisse für die verbleibenden neunhunderteinundfünfzig (951) Proben sind in der nachfolgenden Tabelle
detailliert angegeben.
Kombinierte Standorte – humanes Metapneumovirus
Von der FDA zugelassenes
molekularbiologisches
Messinstrument
Quidel Molecular
POS
RSV + hMPV
NEG
Gesamt
POS
NEG
145
5
150
3
798
801
Positiv-Übereinstimmung,
Gesamt Prozent
Negativ-Übereinstimmung,
148
Prozent
803
951
95 % KI
96,7 %
92,4 %
98,6 %
99,6 %
98,9 %
99,9 %
Prospektive klinische Studie – Applied Biosystems® 7500 Fast Dx
Eintausendvierzehn (1014) Proben wurden sowohl mit den hier besprochenen als auch mit
Vergleichsmethoden auf RSV getestet. Eine (1) Probe war verschmutzt und drei (3) waren toxisch in Zellkultur
(0,4 %). Zwei (2) Proben waren bei den hier besprochenen Methoden ungültig (0,2 %). Diese sechs (6) Proben
wurden von der Analyse ausgeschlossen. Die Ergebnisse für die verbleibenden eintausendacht (1008) Proben
sind in der nachfolgenden Tabelle detailliert angegeben.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 21 von 28
Kombinierte Standorte – respiratorisches Syncytial-Virus
DSFA und Zellkultur mit DFA
95 % KI
POS
NEG
Gesamt
Sensitivität
98,6 % 94,9 % 99,6 %
POS
138
28*
166
Spezifizität
96,8 % 95,4 % 97,8 %
Quidel Molecular
RSV + hMPV
NEG
2
840
842
Gesamt
140
868
1008
* Von den 28 ursprünglich diskordanten Proben wurden 25 in einem von der FDA zugelassenen RT-PCR-Assay
positiv auf RSV getestet.
Neunhundertsechzig (960) Proben wurden sowohl mit dem hier besprochenen als auch mit
Vergleichsinstrumenten auf hMPV getestet (das Vergleichsinstrument stand für den vollständigen
Vergleichstest von vierundfünfzig (54) Proben nicht zur Verfügung). Neun (9) Proben waren im
Vergleichsinstrument ungültig (0,9 %). Zwei (2) Proben waren bei den hier besprochenen Methoden ungültig
(0,2 %). Diese elf (11) Proben wurden von der Analyse ausgeschlossen. Die Ergebnisse für die verbleibenden
neunhundertneunundvierzig (949) Proben sind in der nachfolgenden Tabelle detailliert angegeben.
Kombinierte Standorte – humanes Metapneumovirus
Von der FDA zugelassenes
molekularbiologisches
Messinstrument
Quidel Molecular
POS
RSV + hMPV
NEG
Gesamt
POS
NEG
147
3
150
9
790
799
Positiv-Übereinstimmung,
Gesamt Prozent
Negativ-Übereinstimmung,
156
Prozent
793
949
95 % KI
98,0 %
94,3 %
99,3 %
98,9 %
97,9 %
99,4 %
Prospektive klinische Studie – Life Technologies QuantStudio Dx
Die Leistungsmerkmale des Quidel Molecular RSV + hMPV-Assays unter Verwendung des Life Technologies
QuantStudio Dx Real-Time PCR Instruments wurden anhand einer während der Welle viraler
Atemwegserkrankungen (Januar bis Februar) 2013 durchgeführten prospektiven Studie durchgeführt. Bei den
für diese Studie verwendeten Proben handelte es sich um frische (317) Abstrichproben, die im Zuge
routinemäßiger Tests auf Atemwegserkrankungen in den USA gesammelt wurden. Pro Patient wurde eine
Probe entnommen und sofort auf RSV getestet (direkte DFA der Probe und Kultur mit DFA). Die Proben
wurden mit dem bioMériuex easyMAG extrahiert und mit dem Quidel Molecular RSV + hMPV-Assay getestet.
Aliquote jeder Probe wurden an einem zentralen Standort mit einem von der FDA zugelassenen
molekularbiologischen Messinstrument auf hMPV getestet.
Respiratorisches Syncytial-Virus
DSFA und Zellkultur mit DFA
95 % KI
POS
NEG
Gesamt
Sensitivität
100 %
92 %
100 %
POS
45
14*
59
Spezifizität
95 %
92 %
97 %
Quidel Molecular
RSV + hMPV
NEG
0
258
258
Gesamt
45
272
317
* Von den vierzehn (14) falsch positiven RSV-Proben im QM RSV + hMPV-Assay wurden in einem Assay mit CEKennzeichnung neun (9) positiv auf RSV getestet.
Humanes Metapneumovirus
Von der FDA zugelassenes
molekularbiologisches
Messinstrument
95 % KI
Positiv-Übereinstimmung,
Gesamt Prozent
100 %
Negativ-Übereinstimmung,
Quidel Molecular
POS
43
2
45
Prozent
99 %
RSV + hMPV
NEG
0
268
268
Gesamt
43
270
313
* Vier Proben fielen im Vergleichstest UNGÜLTIG aus und sind in dieser Tabelle nicht enthalten.
POS
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
NEG
92 %
100 %
97 %
100 %
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Analytische Leistung
Nachweisgrenze
Die analytische Sensitivität (Nachweisgrenze oder LoD) des Quidel Molecular RSV + hMPV-Assays wurde
anhand von quantifizierten (TCID50/ml) Kulturen von 2 RSV-Stämmen und 4 hMPV-Stämmen (1 A1, 1 A2, 1 B1,
1B2) bestimmt, die seriell in negativer Nasenrachen-Matrix verdünnt wurden. Jede Verdünnung wurde mithilfe
des NucliSENS easyMAG Systems in Replikaten von 20 pro Virus-Konzentration extrahiert und auf drei
Plattformen getestet (nur die hMPV-Subtypen A2 und B2 wurden auf dem QuantStudio untersucht).
Analytische Sensitivität (LoD) wird als die niedrigste Konzentration definiert, bei der 95 % aller Replikate positiv
testeten.
Zusammenfassung der LoD-Werte
LoD TCID50/ml
Virus
7500 Fast Dx
RSV A
6,29E-01
RSV B
7,5E-01
hMPV-A1
1,7E+01
hMPV-A2
4,17E+00
hMPV-B1
1,05E+00
hMPV-B2
3,21E+00
LoD TCID50/ml
SmartCycler
1,89E+00
2,25E+00
2,65E+01
4,17E+00
7,88E+00
9,63E+00
LoD TCID50/ml
QuantStudio
6,29E-01
2,25E-01
2,91E+00
2,25E+00
Analytische Reaktivität (Inklusivität)
Die Reaktivität des Quidel Molecular RSV + hMPV-Assays wurde anhand von mehreren RSV- und hMPVStämmen evaluiert. Das Panel der analytischen Reaktivität bestand aus 5 RSV-Stämmen und 11 hMPVStämmen (2 A-1, 2 A-2, 2 B-1, 4 B-2 und 1 nicht typisiert). Die Proben wurden unter Verwendung des
NucliSENS easyMAG Instruments extrahiert und als Triplikat sowohl auf der Cepheid SmartCycler II- als auch
auf der ABI 7500 Fast Dx Plattform getestet. s
RSV Inklusivitäts-Panel
Subtyp
Stamm
TCID50/ml
A (NIBSC)
A
B
B
B
A-2
A-2
Washington
9320
CH9318(1B)
N. z.
5,67E+00
2,25E+00
2,25E+00
2,25E+00
Quidel Molecular
RSV + hMPV-Assay
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
hMPV Inklusivitäts-Panel
Subtyp
Stamm
TCID50/ml
A1
A1
A2
A2
B1
B1
B2
B2
B2
B2
hMPV (NIBSC)
IA3-2002 G Gen
IA10-2003
IA14-2003 G Gen
Klinisches Isolat
Peru2-2002 G Gen
Peru3-2003 G Gen
Peru1-2002 G Gen
Peru6-2003
IA18-2003 G Gen
IA18-2003 G Gen
N. z.
7,95E+01
7,95E+01
1,25E+1
1,25E+1
2,36E+01
2,36E+01
9,63E+00
9,63E+00
9,63E+00
9,63E+00
N. z.
Quidel Molecular
RSV + hMPV-Assay
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Der Quidel Molecular RSV + hMPV-Assay wies 100 % des RSV und hMPV sowohl auf der 7500 Fast Dx- als auch
auf der Cepheid SmartCycler® II-Plattform nach.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 23 von 28
Reproduzierbarkeitsstudie
Die Reproduzierbarkeit des Quidel Molecular Influenza RSV + hMPV-Assays wurde an drei Laborstandorten
evaluiert. Die Reproduzierbarkeit wurde anhand eines Panels mit 4 simulierten Proben beurteilt, darunter
mittel und niedrig positive, hoch negative RSV, hMPV und negative Proben. Die Panels und Kontrollen wurden
5 Tage lang an jedem Standort von zwei Bedienern getestet (Triplikat-Tests x 2 Bediener x 5 Tage x 3 Standorte
= 90 Ergebnisse je Level für jedes Virus). Die LoD-Werte basierten auf den in der LoD-Studie erhobenen Daten.
Die Panels und Kontrollen wurden mithilfe des bioMérieux easyMAG Systems extrahiert und auf dem Cepheid
SmartCycler II und dem Applied Biosystems 7500 Fast DX getestet.
Ergebnisse zur Reproduzierbarkeit – Cepheid SmartCycler II
Standort 1
Panel-Element-ID
RSV hoch negativ
0,05x LoD
RSV niedrig positiv
2x LoD
RSV mittel positiv 5x
LoD
Standort 2
Standort 3
%
%
%
Positive
Positive
Vertra Positive
Vertra
Vertra
AVE Ct*
AVE Ct*
Ergebniss AVE Ct*
Ergebnisse
uensw Ergebnisse
uensw
uensw
e
ert
ert
ert
Positive
Ergebni
sse
insgesa
mt
8/30
44.3
9.3
6/30
47.4
5.4
1/30
48.7
N. z.
15/90
30/30
31.2
7.3
30/30
31.4
4.1
30/30
30.9
1.5
90/90
30/30
29.6
5.7
30/30
29.7
3.1
30/30
29.5
2.0
90/90
RSV negativ
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/90
RSV-negative Kontrolle
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/90
RSV-positive Kontrolle
30/30
30.0
1.8
30/30
31.0
3.3
30/30
30.6
1.2
90/90
12/30
34.3
8.3
6/30
41.8
6.3
8/30
34.9
6.4
26/90
30/30
31.1
6.7
30/30
32.2
6.2
30/30
31.1
3.3
90/90
30/30
29.3
2.0
30/30
29.9
3.2
30/30
29.8
3.4
90/90
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/90
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/90
30/30
30.3
1.4
30/30
30.9
1.9
30/30
30.8
2.5
90/90
hMPV hoch negativ
0,15x LoD
hMPV niedrig positiv
2x LoD
hMPV mittel positiv 5x
LoD
hMPV negativ
hMPV-negative
Kontrolle
hMPV-positive
Kontrolle
* Durchschnitts-Ct auf Basis ausschließlich positiver Ergebnisse. Ct-Werte mit 0 gingen in diese Berechnung
nicht ein.
Ergebnisse zur Reproduzierbarkeit – Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Standort 1
Panel-Element-ID
RSV hoch negativ
0,05x LoD
RSV niedrig positiv
2x LoD
RSV mittel positiv 5x
LoD
Standort 2
Standort 3
%
%
%
Positive
Positive
Vertra Positive
Vertra
Vertra
AVE Ct*
AVE Ct*
Ergebniss AVE Ct*
Ergebnisse
uensw Ergebnisse
uensw
uensw
e
ert
ert
ert
Positive
Ergebni
sse
insgesa
mt
14/30
30.7
8.3
3/30
33.8
2.4
9/30
32.3
4.0
26/90
30/30
23.7
7.4
30/30
23.8
3.1
30/30
23.4
4.5
90/90
30/30
20.5
4.0
30/30
21.8
2.2
29/29
21.1
2.2
89/89
RSV negativ
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/90
RSV-negative Kontrolle
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/90
RSV-positive Kontrolle
30/30
19.7
6.5
30/30
20.0
8.5
30/30
19.6
1.9
90/90
14/30
24.9
19.5
6/30
29.1
10.2
10/30
25.1
16.9
30/90
30/30
21.0
8.7
30/30
21.5
4.1
30/30
21.6
5.8
90/90
hMPV hoch negativ
0,15x LoD
hMPV niedrig positiv
2x LoD
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 24 von 28
Ergebnisse zur Reproduzierbarkeit – Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Standort 1
Panel-Element-ID
Standort 2
Standort 3
%
%
%
Positive
Positive
Vertra Positive
Vertra
Vertra
AVE Ct*
AVE Ct*
Ergebniss AVE Ct*
Ergebnisse
uensw Ergebnisse
uensw
uensw
e
ert
ert
ert
Positive
Ergebni
sse
insgesa
mt
hMPV mittel positiv 5x
LoD
30/30
18.9
3.3
30/30
19.6
3.0
29/29
19.2
2.6
89/89
hMPV negativ
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/90
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/30
N. z.
N. z.
0/90
30/30
19.7
3.9
30/30
20.0
1.7
30/30
19.9
1.4
90/90
hMPV-negative
Kontrolle
hMPV-positive
Kontrolle
* Durchschnitts-Ct auf Basis ausschließlich positiver Ergebnisse. Ct-Werte mit 0 gingen in diese Berechnung
nicht ein.
Analytische Spezifizität – Kreuzreaktivität
Die analytische Spezifizität des Quidel Molecular RSV + hMPV-Assays wurde durch Testen eines Panels aus 34
Viren, 26 Bakterien und 1 Hefestamm evaluiert, die häufige Atemwegspathogene oder häufig im
Nasenrachenraum anzutreffende Flora repräsentieren. Die Proben wurden unter Verwendung des NucliSENS
easyMAG Instruments extrahiert und als Triplikat sowohl auf dem Applied Biosystems 7500 Fast Dx als auch
auf dem Cepheid SmartCycler II getestet. Die analytische Spezifizität des Quidel Molecular RSV + hMPV-Assays
betrug 100 %.
Für die Studie wurden folgende Organismen verwendet:
Viren
Influenza A/Mexiko/4108/2009, Influenza B/Florida/04/2006, Adenovirus 1/Adenoid 71, Adenovirus 2,
Adenovirus 3, Adenovirus 4, Adenovirus 5, Adenovirus 7, Adenovirus 11, Adenovirus 14, Adenovirus 31,
Coronavirus NL63, Coronavirus 229E, Coronavirus OC43, Coxsackievirus B4, Coxsackievirus B5/10/2006,
Cytomegalovirus, Echovirus 7, Echovirus 9, Echovirus 6, Echovirus 11, Enterovirus 71, Enterovirus 70, EpsteinBarr-Virus, HSV Typ 1 MacInytre-Stamm, Humanes Rhinovirus, HSV Typ 2 Stamm G, Masernvirus, Mumpsvirus,
Parainfluenza Typ 1, Parainfluenza Typ 2, Parainfluenza Typ 3, Parainfluenza Typ 4, Varicella-Zoster-Virus
Bakterien
Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica, Chlamydophila pneumonia, Chlamydia trachomatis, Legionella
pneumophila, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycoplasma
pneumoniae, Haemophilus influenza, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, Neisseria mucosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Moraxella
catarrhalis, Corynebacterium diptheriae, Lactobacillus plantarum, Streptococcus pneumonia, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus salivarius, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus.
Hefen
Candida albicans
Analytische Spezifizität – Störsubstanzen
Die Leistung des Quidel Molecular RSV + hMPV-Assays wurde mit potenziellen Störsubstanzen beurteilt, die in
Nasenrachenabstrichproben vorhanden sein können. Die potenziellen Störsubstanzen wurden mithilfe von
RSV B und hMPV B1 bei Konzentrationen von 3x und 10x LoD beurteilt. Es gab keine Hinweise darauf, dass die
bei 3x bzw. 10x LoD getesteten Substanzen Störungen verursachten.
Bezeichnung der Substanz
Mucin (Rinder-Unterkieferdrüse, Typ I-S)
Blut (vom Menschen), EDTA-antikoaguliert
Neo-Synephrine
Afrin-Nasenspray
Zicam Allergie-Homöopathikum, nicht
ermüdendes, tropffreies flüssiges Nasengel
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Getestete Konzentration
60 µg/ml
2 % (vol/vol)
15 % (vol/vol)
15 % (vol/vol)
5 % (vol/vol)
Seite 25 von 28
Bezeichnung der Substanz
Kochsalzlösung-Nasenspray
Halsbonbons
Zanamivir
Tobramycin
Mupirocin
Oseltamivirphosphat
Getestete Konzentration
15 % (vol/vol) der Dosis
0,68 g/ml; 1/18 Bonbon, zerstampft;
Wirkstoffe: 1,7 mg/ml Menthol
3,3 bis 5 mg/ml
4,0 µg/ml
6,6 bis 10 mg/ml
7,5 bis 25 mg/ml
Carryover- und Kreuzkontaminationsstudien
Eine interne Studie lieferte keine Hinweise auf Carry-over-/Kreuzkontamination mit dem Quidel Molecular RSV
+ hMPV-Assay unter Verwendung des automatischen NucliSENS easyMAG Nukleinsäure-Extraktionsgeräts und
drei Thermocycler-Plattformen. Applied Biosystems 7500 Fast Dx oder der Cepheid SmartCycler
Kundendienst und technischer Support
Um eine Bestellung aufzugeben oder technischen Support anzufordern, wenden Sie sich bitte an einen QuidelRepräsentanten unter der Nummer (800) 874-1517 (gebührenfrei in den USA) oder (858) 552-1100 (außerhalb
der USA), Montag bis Freitag zwischen 8 und 17 Uhr (Ostküstenzeit). Bestellungen können auch per Fax
aufgegeben werden: (740) 592-9820. Für Support per E-Mail kontaktieren Sie bitte
[email protected] oder [email protected]. Für Dienstleistungen außerhalb der USA
wenden Sie sich bitte an Ihren Distributor vor Ort. Weitere Informationen über Quidel, unsere Produkte und
unsere Distributoren sind auf unserer Website quidel.com zu finden.
Geistiges Eigentum
Handelsmarken
Smartcycler® ist eine eingetragene Marke der Cepheid Corporation. Applied Biosystems® ist eine eingetragene
Marke von Life Technologies. NucliSENS® und easyMAG® sind eingetragene Marken von bioMerieux, Inc.
TaqMan® ist eine eingetragene Marke von Roche. CAL Flour® Red 610 und Quasar®670 sind eingetragene
Marken von BioSearch Technologies, Inc.
Patente
Die Farbstoffe in diesem Produkt werden unter Lizenz von BioSearch Technologies, Inc. verkauft und sind
durch ausgestellte oder angemeldete US- und weltweite Patente geschützt.
Der Käufer dieses Produkts gewährt dem Käufer Rechte unter bestimmten Roche-Patenten zur Verwendung
ausschließlich als In-vitro-Diagnostik-Services für den Menschen. Keine allgemeinen Patente oder anderen
Lizenzen jeglicher Art, außer diesem Recht zur Nutzung aufgrund von Erwerb, werden hiermit gewährt.
Dieses Produkt ist durch die US- Patentnummern 7,531,342; 7,449,374; deren internationale Gegenstücke
sowie andere angemeldete US- und internationale Patente geschützt.
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 26 von 28
Glossar
Inhalt/Enthält
Kontrolle
Gebrauchsanweisung lesen
Einsatzbereich
96
Inhalt ist ausreichend für 96 Bestimmungen
Biologische Risiken
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 27 von 28
Literaturverweise
1
2
3
4
5
6
7
8
Glezen et. al. 1986. American journal of diseases of children (1960) 140(6): 543–6.
Hall, Caroline Breese. et al. 2009. New England Journal of Medicine 360(6): 588–98
Papadopoulos, N. G. et. al. 2004. Respiratory Med. 98 :879-882.
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Sloots T.P. et al. 2006 EID. 12:1236-66.
Ebihara, T. et al. 2004 J Med Virol 70:281-283.
van den Hoogen, B. G. et al. 2004. EID. 10:658-666.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Viral Culture; Approved Guidelines. CLSI-Dokument M41-A [ISBN
1562386239] Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
Pennsylvania 19087-1898, USA 2006.
M103 – Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay-Kit
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Deutschland
Quidel Corporation
Weltweite Unternehmenszentrale
10165 McKellar Court
San Diego, CA 92121 USA
quidel.com
M103en v2013MAR13
Quidel Molecular RSV+hMPV-Assay (CE)
Seite 28 von 28
Dosaggio RSV + hMPV
Istruzioni per l’uso
Per il rilevamento qualitativo e l'identificazione del virus sinciziale respiratorio e dell'RNA
virale di metapneumovirus umano estratti da campioni di tamponi nasali e tamponi
rinofaringei
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 1 di 28
Contenuto
Uso previsto ............................................................................................................................................ 3
Riassunto e spiegazione .......................................................................................................................... 3
Principio della procedura ........................................................................................................................ 3
Materiali forniti ....................................................................................................................................... 4
Materiali facoltativi ................................................................................................................................. 4
Materiali necessari ma non forniti .......................................................................................................... 4
Avvertenze e precauzioni........................................................................................................................ 5
Conservazione e manipolazione dei reagenti del kit .............................................................................. 6
Prelievo, conservazione e manipolazione dei campioni ......................................................................... 6
Conservazione degli acidi nucleici estratti .............................................................................................. 6
Istruzioni di programmazione per l'estrazione degli acidi nucleici ......................................................... 6
Programmazione iniziale del termociclatore .......................................................................................... 9
Istruzioni per la programmazione di SmartCycler II ........................................................................... 9
Istruzioni per la programmazione di Applied Biosystems 7500 Fast DX...........................................11
Istruzioni per la programmazione dello strumento QuantStudio Dx per la reazione
PCR in tempo reale ...........................................................................................................................14
Procedura del dosaggio.........................................................................................................................14
Protocollo di amplificazione su Cepheid SmartCycler II ...................................................................15
Protocollo di amplificazione sul termociclatore Applied Biosystem 7500 Fast Dx ...........................15
Protocollo di amplificazione sullo strumento QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale 16
Interpretazione dei risultati ..................................................................................................................17
Interpretazione dei risultati con Cepheid SmartCycler II ..................................................................17
Interpretazione dei risultati con lo strumento ABI 7500 Fast Dx .....................................................18
Interpretazione dei risultati con lo strumento QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale
..........................................................................................................................................................19
Controllo di qualità ...............................................................................................................................19
Limitazioni .............................................................................................................................................19
Valori previsti ........................................................................................................................................20
Prestazioni cliniche ...............................................................................................................................20
Prestazioni analitiche ............................................................................................................................22
Livello di rilevamento ........................................................................................................................22
Reattività analitica (Inclusività) .........................................................................................................23
Studio sulla riproducibilità ................................................................................................................23
Specificità analitica – Reattività crociata ..........................................................................................24
Specificità analitica – Sostanze interferenti ......................................................................................25
Carry-over e contaminazione crociata ..............................................................................................25
Servizio clienti e assistenza tecnica ......................................................................................................25
Proprietà intellettuale...........................................................................................................................26
Marchi di fabbrica .............................................................................................................................26
Brevetti..............................................................................................................................................26
Glossario ...............................................................................................................................................27
Bibliografia ............................................................................................................................................28
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 2 di 28
Uso previsto
Il dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV è un dosaggio multiplex RT-PCR in tempo reale per il rilevamento
qualitativo e l'identificazione del virus sinciziale respiratorio e dell'RNA di metapneumovirus umano estratti da
campioni di tamponi nasali e rinofaringei da pazienti con segni e sintomi di infezione respiratoria. Questo test
diagnostico in vitro è d'ausilio nella diagnosi differenziale delle infezioni da virus sinciziale respiratorio e da
metapneumovirus umano negli esseri umani unitamente ai fattori di rischio clinico ed epidemiologici. Questo
test non differenzia i due sottotipi di RSV o i quattro sottoceppi genetici dell'hMPV.
I risultati negativi non escludono l'infezione da RSV e/o hMPV e non devono essere utilizzati come sola base
per la diagnosi, il trattamento o altre decisioni di gestione del paziente.
Riassunto e spiegazione
RSV: il virus sinciziale respiratorio umano (RSV) è un virus a RNA a singolo filamento negativo appartenente
alla famiglia Paramyxoviridae. L'RSV è la causa principale delle infezioni del tratto respiratorio inferiore e delle
visite ospedaliere in età neonatale e nell'infanzia. Negli Stati Uniti, il 60% dei neonati viene infettato durante la
1
sua prima stagione RSV, e quasi tutti i bambini vengono infettati dal virus nei primi 2–3 anni di vita. Fra coloro
2
che vengono infettati dall'RSV, il 2–3% sviluppa bronchiolite, con necessità di ospedalizzazione. L'infezione
naturale da RSV induce una risposta immunitaria protettiva che diminuisce nel tempo, probabilmente più di
quanto accade con altre infezioni respiratorie virali: ciò significa che una stessa persona può infettarsi più
volte. A volte un neonato può infettarsi sintomaticamente più di una volta, anche durante una singola stagione
RSV. Sono in aumento i casi di infezioni gravi da RSV fra i pazienti anziani.
Nelle epidemie annuali, i sottotipi A e B del virus RSV sono presenti simultaneamente o in modo alterno; vari
3
studi indicano che la bronchiolite indotta da RSV-A è più grave di quella indotta da RSV-B.
hMPV: il metapneumovirus umano (hMPV) è un virus a RNA a singolo filamento negativo, appartenente alla
4
famiglia Paramyxoviridae e isolato per la prima volta nel 2001, nei Paesi Bassi. L'hMPV è la seconda causa più
comune (dopo l'RSV) di infezione respiratoria inferiore nei bambini. Rispetto all'infezione da RSV, l'infezione da
hMPV tende a verificarsi in bambini di età leggermente maggiore e a causare malattie meno gravi. È possibile
che si verifichi una coinfezione con entrambi i virus, generalmente associata a malattie più gravi.
5
L'hMPV è responsabile di circa il 7,1% delle infezioni del tratto respiratorio. Il virus sembra essere presente in
tutto il mondo e avere una distribuzione stagionale, con un'incidenza che durante l'inverno è simile a quella
dei virus influenzali. Studi sierologici hanno dimostrato che quasi tutti i bambini entrano in contatto con il virus
6
prima di arrivare ai cinque anni di età. L'hMPV causa generalmente infezioni del tratto respiratorio di lieve
entità. I bambini più piccoli, gli anziani e gli individui immunocompromessi sono però a rischio di patologie
gravi e ospedalizzazione.
Le analisi sequenziali eseguite sul genoma del virus hMPV hanno indicato che i ceppi di hMPV presenti nel
mondo possono essere divisi in due ceppi genetici principali (A e B) che rappresentano due sierotipi, ciascuno
7
costituito da due sottoceppi (A1, A2, B1 e B2).
Principio della procedura
Il dosaggio rileva gli acidi nucleici che sono stati estratti da un campione del paziente. Viene eseguita una
reazione multiplex RT-PCR in tempo reale in condizioni ottimizzate all'interno di una singola provetta,
generando ampliconi per l'RSV, l'hMPV e il controllo di processo (PRC). L'identificazione dell'RSV, dell'hMPV e
del PRC avviene tramite l'uso di primer specifici per il target e di sonde con etichette fluorescenti, che si
ibridizzano in regioni conservate nei genomi NS2 e di polimerase dell'RSV e nei genomi di polimerase
dell'hMPV e del PRC.
Etichette per sonde Quidel Molecular
Target
Risultato
hMPV
PRC
Colorante
FAM
CAL Fluor® Red 610
Quasar® 670
Di seguito viene riepilogata la procedura.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 3 di 28
1.
Raccolta dei campioni: acquisire campioni di tamponi nasali o rinofaringei da pazienti sintomatici,
utilizzando le tecniche standard. Trasportare, conservare ed elaborare tali campioni conformemente alle
8
procedure di laboratorio stabilite.
2.
Estrazione degli acidi nucleici: estrarre gli acidi nucleici dai campioni utilizzando il sistema NucliSENS®
easyMAG®, seguendo le istruzioni del produttore e usando i reagenti appropriati (vedere la sezione
Materiali necessari ma non forniti). L'uso di altri sistemi di estrazione con il dosaggio Quidel Molecular
RSV+hMPV non è stato convalidato. La convalida di tali altri sistemi è di responsabilità dell'utente finale.
Prima della procedura di estrazione, aggiungere 20 µL di controllo di processo (PRC) a ciascuna aliquota di
campione da 180 µL. Il PRC monitora gli inibitori all'interno del campione estratto, garantisce che avvenga
un'adeguata amplificazione e verifica che l'estrazione degli acidi nucleici sia sufficiente.
3.
Reidratazione del master mix: reidratare il master mix liofilizzato usando la soluzione reidratante. Il
Master Mix contiene inneschi oligonucleotidici, sonde etichettate con fluorocromo e quencher che hanno
come target le regioni conservate di RSV e hMPV, nonché la sequenza del controllo di processo.
4.
Amplificazione e rilevamento degli acidi nucleici: Aggiungere 15 µL di master mix reidratato a ciascuna
provetta di reazione o pozzetto della piastra. Aggiungere poi 5 µL di acidi nucleici estratti (campione con
PRC) al pozzetto della piastra o alla provetta di reazione adeguatamente etichettata. Posizionare la
provetta o la piastra rispettivamente nello strumento Life Technologies QuantStudio™ Dx per la reazione
PCR in tempo reale, nello strumento Applied Biosystems® (ABI) 7500 Fast Dx o Cepheid ® SmartCycler II.
Dopo aver aggiunto allo strumento la provetta di reazione o la piastra, avviare il protocollo del dosaggio.
Questo protocollo avvia la trascrizione inversa dei target RNA generando DNA complementare e portando
alla conseguente amplificazione delle sequenze target. Il dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV si basa sui
sistemi di analisi chimica TaqMan® e utilizza un enzima con trascrittasi inversa, DNA polimerasi e attività
esonucleasiche 5’-3’. Durante l’amplificazione del DNA, questo enzima divide la sonda legata alla sequenza
di DNA complementare, separando il colorante quencher dal colorante reporter. Questa fase genera un
aumento del segnale fluorescente in risposta all’eccitazione da parte di una fonte luminosa con opportuna
lunghezza d’onda. Ad ogni ciclo, altre molecole di colorante vengono separate dai loro quencher, dando
origine a segnale aggiuntivo. Se si ottiene una fluorescenza sufficiente, il campione viene refertato come
positivo alla sequenza target rilevata.
Materiali forniti
Codice di inventario M103
Kit di rilevazione (96 reazioni) – Conservare a una temperatura compresa fra 2 °C e 8 °C
#
Componente
Quantità


Soluzione reidratante Parte M5003
1 flacone/kit da 1,9 mL
Master Mix Quidel Molecular RSV+hMPV Parte M5035
12 flaconi/kit,
8 reazioni/flacone
Contenuti liofilizzati:
enzima DNA polimerasi con attività di trascrittasi inversa;
inneschi e sonde;
dNTP (deossinucleotidi trifosfati);
stabilizzatori.
Controllo di processo Parte M5005
1 flacone/kit da 2,0 mL
Materiali facoltativi
Controlli esterni per l'RSV e l'hMPV (ad es. il set di controllo Quidel Molecular RSV + hMPV codice M107, che
serve da controllo esterno per l'elaborazione e l'estrazione)
Materiali necessari ma non forniti
Micropipettatori (da 1 a 10 μL e da 100 a 1.000 μL)
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Punte non aerosol per pipette
Strumento Life Technologies QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale o strumento Applied
Biosystems 7500Fast Dx
Piastra PCR a 96 pozzetti
Pellicole ottiche per piastra
Centrifuga per piastra a pozzetti ABI 96
Software bioMerieux NucliSENS easyMAG versione 2.0
Tamponi 1, 2, 3 bioMerieux NucliSENS easyMAG
Tamponi di lisi bioMerieux NucliSENS easyMAG
Perle di silice magnetica bioMerieux NucliSENS easyMAG
Materiali di consumo bioMerieux NucliSENS easyMAG
Oppure
Micropipettatori (da 1 a 10 μL e da 100 a 1.000 μL)
Punte non aerosol per pipette
Cepheid SmartCycler II
Materiali di consumo SmartCycler
Centrifuga SmartCycler
Software bioMerieux NucliSENS easyMAG versione 2.0
Tamponi 1, 2, 3 bioMerieux NucliSENS easyMAG
Tamponi di lisi bioMerieux NucliSENS easyMAG
Perle di silice magnetica bioMerieux NucliSENS easyMAG
Materiali di consumo bioMerieux NucliSENS easyMAG
Avvertenze e precauzioni
Per uso diagnostico in vitro
Le caratteristiche di rendimento di questo test sono state stabilite solo con i tipi di campioni elencati nella
sezione Uso previsto. Il rendimento di questo dosaggio con altri tipi di campioni non è stato valutato.
Sistemi di estrazione diversi dal sistema NucliSENS easyMAG non sono stati convalidati per l'uso. La
convalida di tali sistemi è di responsabilità dell'utente finale.
L'utilizzo di condizioni di ciclaggio diverse da quelle indicate nella sezione Istruzioni per la
programmazione del termociclatore può produrre risultati erronei.
L'utilizzo di questo prodotto deve essere limitato a personale competente nelle tecniche di PCR e RT-PCR.
Considerare tutti i campioni come potenzialmente infettivi. Rispettare le precauzioni universali nel
maneggiare i campioni, questo kit e il suo contenuto.
Raccolta, conservazione e trasporto adeguati dei campioni sono elementi essenziali per ottenere risultati
corretti.
Conservare i reagenti del dosaggio come indicato sulle rispettive etichette.
Indossare indumenti protettivi, guanti e dispositivi di protezione degli occhi e del viso adeguati quando si
usa questo kit.
Per ottenere risultati accurati, pipettare con cura utilizzando solo apparecchiature calibrate.
Pulire a fondo e disinfettare tutte le superfici con una soluzione di candeggina al 10% seguita da acqua
ultrapura per applicazioni in biologia molecolare.
Utilizzare micropipette con barriera aerosol o punte a erogazione positiva in tutte le procedure.
Evitare la contaminazione microbica e crociata dei reagenti del kit. Seguire le buone pratiche di
laboratorio.
Non mescolare reagenti provenienti da kit con numeri di lotto diversi.
Non utilizzare reagenti di altri produttori con questo kit.
Non utilizzare il prodotto oltre la data di scadenza.
Una pianificazione accurata del flusso di lavoro è essenziale per ridurre al minimo il rischio di
contaminazione. Pianificare sempre il flusso di lavoro in maniera unidirezionale, partendo dalla preamplificazione e procedendo con l’amplificazione e il rilevamento.
Utilizzare forniture e apparecchiature specifiche per le aree di pre-amplificazione e amplificazione.
Impedire il movimento incrociato di personale o apparecchiature fra aree diverse.
Mantenere sempre separati gli articoli per l’amplificazione da quelli per la pre-amplificazione.
Non aprire le provette dei campioni né dissigillare le piastre dopo l’amplificazione.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 5 di 28
Smaltire il materiale amplificato con cura e nel rispetto delle norme locali vigenti in proposito, al fine di
ridurre al minimo il rischio di contaminazione degli ampliconi.
Non utilizzare articoli destinati alla preparazione di reagenti o campioni per il trattamento dell’acido
nucleico bersaglio.
Le schede tecniche MSDS sono disponibili su richiesta, oppure sul sito web del prodotto.
Conservazione e manipolazione dei reagenti del kit
Conservare il kit non aperto a 2–8 °C fino alla data di scadenza riportata sulla scatola esterna.
Il Master Mix reidratato può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 24 ore, oppure
a 2–8 °C o a temperature ≤ –20 °C per un massimo di 2 giorni. Richiudere il Master Mix reidratato, sigillare
con parafilm e conservare in posizione verticale. Proteggere il master mix dalla luce durante la
conservazione.
Indicazioni di instabilità o deterioramento dei reagenti
La torbidezza della soluzione reidratante può indicare il deterioramento del reagente. Contattare l’assistenza
tecnica Quidel per richiederne la sostituzione.
Prelievo, conservazione e manipolazione dei campioni
I campioni usati per la convalida del dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV sono stati ottenuti da pazienti con
sintomi di infezione del tratto respiratorio superiore, utilizzando tecniche standard. Questi campioni sono stati
raccolti, trasportati, conservati ed elaborati conformemente allo standard CLSI M41-A. In breve, i campioni
devono essere trasportati in frigorifero a 2–8 C e conservati in frigorifero (a 2–8 C) per 72 ore prima di essere
elaborati. L'eventuale campione residuo deve essere conservato a ≤ -70 C.
È stata eseguita una serie di studi per valutare numerosi mezzi di trasporto virali comunemente usati a un
volume di 2mL: M4, M4-RT, M5, M6 e UTM. Nono state riscontrate differenze significative nelle prestazioni del
dosaggio tra i diversi tipi di mezzi di trasporto virali.
Conservazione degli acidi nucleici estratti
Gli eluati possono essere conservati a temperatura ambiente (20–25 C) per 4 ore, a 2–8 C per 6 ore e a –20
°C per 1 mese. L'RNA estratto è stabile fino a tre cicli di congelamento/scongelamento, se conservato a -20 °C.
Istruzioni di programmazione per l'estrazione degli acidi nucleici
Nota: un controllo positivo per l'elaborazione/estrazione dell'RSV/hMPV (ad es., il set di controllo Quidel
Molecular RSV + hMPV codice M107 o campione di RSV o hMPV positivo precedentemente caratterizzato) e un
controllo di processo negativo (ad es., mezzi di trasporto virali o campione negativo di RSV e hMPV
precedentemente caratterizzato) devono essere inclusi in ogni ciclo di estrazione.
1. Accendere lo strumento e attendere che la spia dello strumento diventi arancione. Accendere quindi il
computer e lanciare il software easyMAG.
2.
Leggere il codice a barre dei reagenti dopo aver premuto i tasti "Strumento"
reagenti"
3.
e "Inventario
.
Per immettere i campioni, premere il tasto "Uso giornaliero"
, che richiamerà automaticamente la
schermata "Definizione richiesta"
. Selezionare le seguenti impostazioni:
a. ID campione: digitare con la tastiera il nome del campione;
b. Matrice:
selezionare Altro dal menu a discesa.
c. Richiesta:
selezionare Generico dal menu a discesa.
d. Volume (mL): selezionare 0.200 dal menu a discesa.
e. Eluato (µL):
selezionare 50 dal menu a discesa.
f. Tipo:
Primario
g. Priorità:
Normale
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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4.
Dopo aver premuto il tasto "Salva"
, il campione verrà visualizzato nella finestra "Campione non
assegnato" sul lato sinistro dello schermo. Premere il tasto "Immettere nuova richiesta di estrazione"
e ripetere l'operazione per gli altri campioni. Si possono immettere campioni multipli anche
premendo il tasto "Crea automaticamente nuove richieste di estrazione"
5.
Una volta creati tutti i campioni, passare a "Organizza cicli" facendo clic sull'icona
superiore della pagina. Creare un ciclo premendo il tasto "Crea ciclo"
ciclo o usare il nome predefinito.
6.
8.
vicino alla parte
. Immettere un nome per il
Aggiungere i campioni al ciclo usando il tasto "Riempi automaticamente il ciclo"
(che aggiunge
automaticamente fino a 24 campioni dall'elenco "Campioni non assegnati" a sinistra dello schermo). Si
possono spostare campioni singoli nel ciclo e fuori dal ciclo anche usando le ‘icone di posizionamento’
sinistra e destra
7.
.
dopo aver selezionato il campione appropriato. L'ordine dei campioni nel
ciclo può essere cambiato usando i tasti ‘Sposta richiesta di estrazione Su/Giù'
.
Reperire 1 o 3 contenitori (per 8 o 24 campioni, rispettivamente) e aggiungere 20 µl di controllo di
processo a ciascun pozzetto di campione usato.
Aggiungere 180 µl di ciascun campione al pozzetto appropriato, come designato.
9.
Passare a "Carica ciclo" premendo il tasto
nella parte superiore dello schermo. Inserire le punte
e il/i vaso/i campione nello strumento.
10. Immettere i codici a barre dei contenitori del/dei vaso/i campione.
11. Immettere i codici a barre delle perle di silice da usare.
12. Assegnare le perle di silice ai campioni nel seguente modo.
a. Fare clic sul simbolo dei reagenti sotto il numero 1 nella figura qui sotto; il numero di lotto delle
perle di silice dovrebbe apparire sotto la scheda Silica, numero 2 nella figura qui sotto.
b. Evidenziare e selezionare i campioni del ciclo a cui devono essere assegnate le perle (nella casella
con il numero 3 nella figura qui sotto)
c.
d.
Fare clic sull'icona di posizionamento
(sotto al numero 4 nella figura qui sotto) per
assegnare il numero di lotto della silice ai campioni selezionati.
Se si seleziona il simbolo delle perle a destra del numero 5 nella figura qui sotto, il numero di
lotto delle perle di silice dovrebbe apparire per ciascun campione.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 7 di 28
1
2
4
5
3
13. Stampare l'elenco di lavoro toccando l'icona "Carica ciclo" e premendo l'icona "Stampa elenco di lavoro"
.
14. Premere il tasto "Distribuisci lisi"
. Per il completamento della lisi incorporata occorrono circa 12
minuti.
15. Per ciascun contenitore di campione, preparare particelle magnetiche usando il pipettatore Biohit e punte
per un massimo di otto reazioni, nel seguente modo.
a. Usando una punta e il Programma 1, aspirare 550 µl di acqua senza nucleasi e versare in una
provetta microfuga senza DNAse / RNAse da 1,5 ml.
b. Vorticare le particelle magnetiche di silice. Usando una punta e il Programma 1, aspirare 550 µl di
silice magnetica, aggiungere all'acqua e mescolare vorticando.
c. Usando una punta e il Programma 2, aspirare 1.050 µl della miscela magnetica di silice e
rimettere 25 µl nella stessa provetta.
d. Versare 125 µl della miscela magnetica di silice 8 volte negli 8 pozzetti di una piastra di strisce
ELISA. Gettare la punta.
e. Una volta completata la lisi (NB: "Stato strumento" in fondo alla schermata deve indicare
"INATTIVO"!), usando 8 punte e il Programma 3 aspirare 100 µl della miscela magnetica di silice
nei pozzetti della striscia, versare 100 µl della miscela magnetica di silice nei pozzetti della striscia
e aspirare 100 µl della miscela magnetica di silice nei pozzetti della striscia.
f. Inserire le punte nel liquido negli stessi contenitori dei campioni. Aspirare 800 µl, quindi
rimettere 900 µl della miscela magnetica di silice nel contenitore. Aspirare 1.000 µl della miscela
magnetica di silice dal contenitore e rimettere 1.000 µl di silice magnetica nel contenitore.
Ripetere l'aspirazione / distribuzione dei 1.000 µl altre due volte.
16. Chiudere lo strumento e premere il tasto 'Avvio'
per avviare il ciclo.
17. Al completamento del ciclo, trasferire l'acido nucleico purificato nelle provette prive di nucleasi. Gli eluati
possono essere conservati a temperatura ambiente (20–25 C) per 4 ore, a 2–8 °C per 6 ore e a –20 °C per
1 mese. L'RNA estratto è stabile fino a tre cicli di congelamento/scongelamento, se conservato a –20 °C.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 8 di 28
Programmazione iniziale del termociclatore
Istruzioni per la programmazione di SmartCycler II
1.
2.
Lanciare il pacchetto software Cepheid SmartCycler Dx versione 3.0b.
Creare il dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV
a. Selezionare il tasto Definisci dosaggi nella parte superiore dello schermo.
b. Assegnare un nome al dosaggio:
i. Selezionare il tasto Nuovo in basso a sinistra dello schermo.
ii. Digitare ‘Quidel Molecular RSV + hMPV’ e selezionare OK.
iii. ‘Quidel Molecular RSV + hMPV’ sarà aggiunto nella parte superiore dell'elenco Nome
dosaggio, nell'angolo in alto a sinistra dello schermo.
c. Impostare i valori dell’analisi: nella sezione Tipo dosaggio: Ricerca, selezionare la scheda Impostazioni
analisi e verificare che sia effettuato quanto segue:
i. Selezionare FCTC25 dal menu a discesa Set coloranti.
ii. Il menu a discesa Tipo analisi deve essere impostato su Qualitativo (impostazione predefinita).
iii. Nella colonna Nome canale, immettere ‘RSV’ per Canale 1, ‘hMPV’ per Canale 3 e ‘PRC’ per
Canale 4.
iv. Nella colonna Utilizzo, selezionare Target dal menu a discesa per RSV e hMPV, quindi
selezionare Controllo interno per PRC. Se si seleziona Controllo interno appare la finestra
mostrata qui sotto. Selezionare Sì.
v. Nella colonna Analisi curva, immettere Curva principale per ciascun canale (RSV, hMPV, PRC)
(impostazione predefinita).
vi. Nella colonna Impostazione soglia, immettere Soglia manuale per ciascun canale (RSV, hMPV,
PRC) (impostazione predefinita).
vii. Nella colonna Unità soglia fluor manuale, immettere le seguenti soglie:
a. RSV: 20,0
b. hMPV: 10,0
c. PRC: 10,0
viii. Nella colonna Ciclo min valido (scorrere verso destra se non è immediatamente visibile),
immettere 5 per ciascun canale (RSV, hMPV, PRC).
ix. Nella colonna Ciclo max valido (scorrere verso destra se non è immediatamente visibile),
immettere 50 per ciascun canale (RSV, hMPV, PRC).
x. Nella colonna Sub sfondo, usare “ON” per ciascun canale (RSV, hMPV, PRC) (impostazione
predefinita).
xi. Nella colonna Ciclo min sfondo, immettere 5 per ciascun canale (RSV, hMPV, PRC).
xii. Nella colonna Ciclo max sfondo, immettere 35 per ciascun canale (RSV, hMPV, PRC).
xiii. Nella colonna Cicli medi boxcar, lasciare 0 per ciascun canale (RSV, hMPV, PRC) (impostazione
predefinita).
xiv. Nella colonna Soglia Pt finale, immettere 20, 10, 10 per ciascun canale (RSV, hMPV, PRC)
(impostazione predefinita).
xv. Nella colonna NC IC%, lasciare “NA” per ciascun canale (PRC) (impostazione predefinita).
xvi. Nella colonna IC Delta, lasciare “NA” per ciascun canale (RSV, hMPV) (impostazione
predefinita).
xvii. Nella sezione Personalizza testo risultati, sotto la tabella, selezionare Testo risultati basato
sugli organismi dal menu a discesa. Apparirà la finestra di avvertenza mostrata qui sotto.
Selezionare Sì.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 9 di 28
xviii. Selezionare il tasto Personalizza per aprire la finestra di dialogo Testo risultati basato sugli
organismi. Selezionare il tasto Aggiungi, immettere ‘RSV’ nella colonna Nome organismo e
spuntare la casella RSV. Selezionare di nuovo il tasto Aggiungi, immettere ‘hMPV’ nella colonna
Nome organismo e spuntare la casella hMPV.
Fare clic su OK in fondo alla finestra popup.
Impostare i tempi di ciclo RT-PCR e le temperature nel seguente modo:
i. Fase 1
1. Mantenimento
2. Temp:
55,0
3. Sec:
300
4. Elementi ottici:
OFF
ii. Fase 2
1. Mantenimento
2. Temp:
60,0
3. Sec:
300
4. Elementi ottici:
OFF
iii. Fase 3
1. Mantenimento
2. Temp:
65,0
3. Sec:
300
4. Elementi ottici:
OFF
iv. Fase 4
1. Ciclo 2 temperature
2. Ripetizioni:
50
3. Fila prima temperatura:
a. Temp:
92,0
b. Sec:
5
c. Elementi ottici:
OFF
4. Fila seconda temperatura:
a. Temp:
57,0
b. Sec:
40
c. Elementi ottici:
ON
Salvare il protocollo selezionando il tasto Salva in fondo alla schermata.
d.
3.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 10 di 28
Illustrazione del protocollo Quidel Molecular RSV + hMPV completato:
Istruzioni per la programmazione di Applied Biosystems 7500 Fast DX
1.
2.
Lanciare il pacchetto software ABI 7500 Fast Dx.
Si aprirà la finestra di dialogo Avvio rapido documento. Selezionare il tasto Crea nuovo documento per
avviare Creazione automatica nuovo documento. Seguire tutte le fasi per avviare il protocollo Quidel
Molecular RSV + hMPV.
a. Definizione del documento: la maggior parte di quanto segue dovrebbe essere
l’impostazione predefinita. Se non è così, cambiare di conseguenza.
i. Confermare o immettere le seguenti informazioni:
Dosaggio: Curva standard (Quantificazione assoluta)
Contenitore: Trasparente, a 96 pozzetti
Modello: Documento vuoto
Run Mode
Fast 7500
(Modalità ciclo):
Operatore: Nome dell'operatore
Commenti: SDS v1.4
Nome della
’Quidel Molecular RSV + hMPV’
piastra:
ii. Selezionare il tasto Avanti.
iii. Selezione dei rilevatori: occorre aggiungere nuovi rilevatori per l'hMPV, l'RSV e il
controllo di processo (PRC). Per ciascun target, selezionare il tasto Nuovo rilevatore
per aprire la finestra Nuovo rilevatore. In alternativa si può usare il pulsante Crea
un altro dalla finestra popup Nuovo rilevatore per gli ultimi due rilevatori. Inserire
le seguenti informazioni per ciascun rilevatore:
Colorante
Colorante
Colore
Nome
reporter
quencher
Risultato FAM
(nessuno)
(selezionare)
hMPV
Texas Red
(nessuno)
(selezionare)
PRC
Cy5
(nessuno)
(selezionare)
iv. Selezionare un colore univoco per rappresentare ciascun rilevatore.
v. Evidenziare i nuovi rilevatori e aggiungere alla colonna Rilevatori nel documento
usando il tasto Aggiungi.
vi. Selezionare (nessuno) dal menu a discesa Riferimento passivo.
vii. Selezionare il tasto Avanti.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 11 di 28
b.
c.
viii. Selezionare il tasto Fine senza impostare alcun pozzetto.
La creazione automatica si chiuderà e il software si avvierà con la scheda Impostazione,
che mostra la piastra dei campioni impostata durante l’avviamento rapido. Per
l’impostazione iniziale, non occorre fare cambiamenti in questo momento.
Definizione del protocollo del termociclatore:
i. selezionare la scheda Strumento per impostare i tempi e le temperature di ciclo
della RT-PCR Quidel Molecular RSV+hMPV.
ii. Sotto Profilo termico dovrebbe essere presente un protocollo predefinito in 2 fasi.
Ciascuna fase ha 3 caselle di testo modificabili dall’utente. Il valore della prima
casella in alto rappresenta il numero di ripetizioni o cicli per quella fase. Il valore
della seconda casella rappresenta la temperatura (˚C) e il valore dell’ultima casella
rappresenta il tempo (minuti: secondi).
iii. Apportare le seguenti modifiche al Protocollo termociclatore predefinito.
1. Fase 1
a. Ripetizioni:
1
b. Temp:
55
c. Tempo:
5:00
2. Selezionare la barra fra Fase 1 e Fase 2. Selezionare il tasto Aggiungi
mantenimento per aggiungere un'altra fase.
3. Fase 2
a. Ripetizioni:
1
b. Temp:
60
c. Tempo:
5:00
4. Selezionare la barra fra Fase 2 e Fase 3. Selezionare il tasto Aggiungi
mantenimento per aggiungere un'altra fase.
5. Fase 3
a. Ripetizioni:
1
b. Temp:
65
c. Tempo:
5:00
6.
7.
Fase 4 (fase di di dissociazione in due fasi)
a. Ripetizioni: 10
b. Passaggio 1
i. Temp: 92
ii. Tempo: 0:05
c. Passaggio 2
i. Temp: 57
ii. Tempo: 0:40
Selezionare la barra alla destra della Fase 4. Selezionare il tasto Aggiungi
ciclo per aggiungere un’altra fase.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 12 di 28
8.
Fase 5 (fase di di dissociazione in due fasi)
a. Ripetizioni: 35
b. Passaggio 1
i. Temp: 92
ii. Tempo: 0:05
c. Passaggio 2
i. Temp: 57
ii. Tempo: 0:40
9. Se si aggiunge una fase errata, la si può rimuovere premendo il tasto
Elimina dopo averla evidenziata fra le righe verticali.
iv. Sotto Impostazioni, immettere quanto segue:
Volume campione (μL): 20 (predefinito)
Run Mode (Modalità
7500 Fast (predefinita)
ciclo):
Raccolta dati: Fase 5, fase 2 (57,0 @ 0:40)
NOTA: non spuntare la casella accanto a "Modalità esperta".
v. Protocollo finale
d.
Impostare la soglia per ciascun analita, come segue.
i. Selezionare la scheda Risultati.
ii. Selezionare la scheda Tracciato amplificazione.
iii. Selezionare RSV dalla scheda Rilevatore nell'angolo in alto a destra.
iv. Nel blocco Impostazioni analisi, impostare Soglia su 8.0e4.
v. Selezionare il tasto Linea base automatica.
vi. Ripetere i passaggi iii-v per hMPV impostando il valore di Soglia su 5.4e4.
vii. Ripetere i passaggi iii-v per PRC, impostando il valore di Soglia su 2.7e4.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 13 di 28
viii. Ripetere i passaggi iii-v per PRC, impostando il valore di Soglia su 2.7e4.
e.
f.
Salvare il nuovo protocollo come modello per uso futuro.
i. Nella parte superiore della schermata, selezionare File e poi Salva con nome.
ii. Salvare in: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\.
iii. Nome file: ‘Quidel Molecular RSV + hMPV’.
iv. Salvare come: ‘SDS Templates (*.sdt)’.
Uscire dal software.
Istruzioni per la programmazione dello strumento QuantStudio Dx per la reazione PCR in
tempo reale
Quidel Molecular fornisce un modello predefinito per il dosaggio su un CD che deve essere caricato nello
strumento QuantStudio™ Dx. Per richiedere il CD, contattare un rappresentante Quidel al numero (800) 8741517 (gratuito negli Stati Uniti), oppure al numero +1 (858) 552-1100, dal lunedì al venerdì, dalle 8:00 alle
17:00, ora della costa orientale. Questi modelli contengono i parametri del ciclo, in modo che non sia
necessario programmare lo strumento per iniziare le operazioni. Per installare un documento di definizione del
test:
1. Dalla scheda Home del software QuantStudio™ Dx, fare clic su Gestisci test nel pannello Strumenti.
2. Nel menu Test, fare clic su Installa.
3. Cercare il file del documento di definizione del test (.tdd), selezionare il file e fare clic su Apri. Il
software QuantStudio™ Dx aggiunge automaticamente il test selezionato al menu Test.
4. Fare clic su Chiudi per chiudere il menu Test e salvare le modifiche.
Procedura del dosaggio
Eseguire le seguenti procedure alla temperatura ambiente controllata di 20-25 C.
Procedura di estrazione degli acidi nucleici
Consultare le istruzioni di programmazione del sistema bioMerieux NucliSENS easyMAG riportate sopra.
1. Aggiungere 20 µL di controllo di processo al pozzetto di estrazione del campione.
2. Aggiungere 180 µL di campione clinico o di controllo esterno al pozzetto di estrazione del campione.
3. Seguire le istruzioni fornite dal produttore circa la procedura di estrazione.
4. Gli eluati possono essere conservati a temperatura ambiente (20–25 C) per 4 ore, a 2–8 C per 6 ore
e a –20 C per 1 mese. L'RNA estratto è stabile fino a tre cicli di congelamento/scongelamento, se
conservato a –20 C.
Procedura di reidratazione del master mix
1. Stabilire il numero di campioni da testare e ottenere il numero corretto di flaconi di Master Mix
liofilizzato per otto test.
2. Riportare gli agenti inutilizzati alle condizioni di conservazione appropriate.
3. Aprire con cura il master mix, evitando di rovinare i pellet.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 14 di 28
4.
5.
6.
Aggiungere 135 µL di soluzione reidratante al master mix.
Lasciare il flacone a temperatura ambiente per 1 o 2 minuti per consentire la reidratazione dei pellet.
Pipettare delicatamente su e giù per 2 o 3 volte, evitando la formazione di bolle, prima di dispensare
nella prima provetta PCR o nel pozzetto della piastra.
Nota: il master mix reidratato è sufficiente per otto reazioni.
Nota: il Master Mix reidratato può essere conservato a temperatura ambiente per 24 ore o a 2–8 C o
≤–20 C per 2 giorni. (Vedere la sezione “Conservazione e manipolazione dei reagenti del kit” per
ulteriori opzioni di conservazione).
Procedura di approntamento RT-PCR:
1.
2.
3.
4.
5.
Aggiungere 15 µL di master mix reidratato a ciascuna provetta di reazione o pozzetto della piastra.
Aggiungere 5 µL di acido nucleico estratto (campione con il controllo di processo) alle provette di
reazione o ai pozzetti della piastra. Non è necessario mescolare i reagenti.
Nota: per ciascun campione estratto, usare un micropipettatore con una punta non aerosol nuova.
Chiudere le provette di reazione o sigillare la piastra.
Nota: Quidel suggerisce che ogni ciclo del termociclatore includa una provetta di reazione o pozzetto
della piastra con un controllo positivo esterno di RSV/hMPV estratto (ad es., set di controllo Quidel
Molecular RSV + hMPV codice M107 o campione di RSV o hMPV positivo precedentemente
caratterizzato) e una provetta di reazione o pozzetto della piastra con un controllo negativo per
eseguire controlli secondo le prassi e le procedure del proprio laboratorio con organismi di
certificazione locali, statali, federali, laddove applicabile.
Centrifugare le provette di reazione o la piastra per un minimo di 15 secondi. Assicurarsi che tutto il
liquido si trovi sul fondo della provetta.
Inserire le provette o la piastra nel termociclatore.
Protocollo di amplificazione su Cepheid SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Attivare il blocco (o i blocchi) SmartCycler.
Lanciare il pacchetto software SmartCycler Dx versione 3.0b.
Selezionare il tasto Crea ciclo in alto nella schermata per impostare il ciclo.
Sotto Nome del ciclo, digitare il nome del ciclo attuale (GGMMAA-Quidel Molecular RSV + hMPV).
Sotto Note, inserire eventuali note sul ciclo per riferimento futuro.
Sotto Dosaggio, selezionare il dosaggio ‘Quidel Molecular RSV + hMPV’ dal menu a discesa.
Sotto Dati del dosaggio, digitare il numero di lotto e la data di scadenza del kit.
Per selezionare i pozzetti da usare, procedere in uno dei modi seguenti.
a. Per assegnare automaticamente i pozzetti, procedere nel modo seguente.
i. Sotto Numero di campioni, digitare il numero di campioni nella casella di testo fornita.
ii. Selezionare il tasto Applica. Il numero di file immessi compare nella tabella dei siti.
b. Per scegliere manualmente i pozzetti sui blocchi SmartCycler, procedere nel modo seguente:
i. Selezionare il tasto Aggiungi/Rimuovi siti, verso la parte bassa dello schermo.
ii. Si aprirà la finestra popup Seleziona siti, con due colonne. La colonna a sinistra (Siti) elenca
tutti i siti disponibili, mentre quella di destra (Selezioni) mostra tutti i siti selezionati.
iii. Per selezionare tutti i siti, fare clic sul tasto Seleziona tutti i siti.
iv. Per selezionare siti specifici, evidenziarne uno o più e selezionare la freccia destra per
aggiungerli alla colonna Selezioni.
v. Selezionare il tasto OK per chiudere la finestra. I siti selezionati appariranno nella tabella
dei siti.
Digitare gli identificatori dei campioni sotto la colonna ID campione della tabella dei siti(questa
operazione può essere eseguita anche dopo l’inizio del ciclo).
Inserire eventuali note nella colonna Note e lasciare invariate le voci "SPEC" della colonna Tipo di
campione.
Selezionare il tasto Esegui ciclo in fondo allo schermo.
Selezionare il tasto Visualizza risultati per lo stato di avanzamento del ciclo.
Salvare il ciclo quando è terminato e prima di uscire dal software.
Protocollo di amplificazione sul termociclatore Applied Biosystem 7500 Fast Dx
1.
2.
3.
4.
Accendere il 7500 Fast Dx.
Lanciare il pacchetto software 7500 Fast Dx.
Si aprirà la finestra di dialogo Avvio rapido documento.
Fare clic su Crea un nuovo documento.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 15 di 28
5.
La maggior parte di quanto segue dovrebbe essere l’impostazione predefinita. Se non è così, cambiare
di conseguenza.
Dosaggio:
Contenitore:
Modello:
Run Mode
(Modalità ciclo):
6.
7.
8.
Curva standard (Quantificazione assoluta)
Trasparente, a 96 pozzetti
Quidel Molecular RSV + hMPV
Fast 7500
Operatore:
Nome dell'operatore
Commenti:
SDS v1.4 (aggiungerne altri se necessario)
Nome della
piastra:
GGMMAA-Quidel Molecular RSV + hMPV
Impostazione della piastra dei campioni:
a. Sotto le schede Impostazione e Piastra apparirà l’impostazione della piastra.
b. Selezionare tutti i pozzetti che conterranno il campione, fare clic con il tasto destro del mouse e
selezionare Ispettore pozzetto dal menu a discesa. Quando si apre la finestra popup Ispettore
pozzetto, selezionare i rilevatori di RSV, hMPV e PRC.
c. Usare Ispettore pozzetto per inserire i nomi dei campioni. Gli ID paziente possono essere inseriti
nella finestra Ispettore pozzetto; si consiglia però di farlo prima di procedere con la risospensione del master mix liofilizzato, dopo il ciclo o utilizzando la funzione di importazione per
ridurre al minimo il tempo durante il quale le reazioni PCR vengono tenute a temperatura
ambiente prima di iniziare il ciclo.
d. Salvare il ciclo come GGMMAA-Quidel Molecular RSV + hMPV.sds.
e. Si aprirà una finestra che chiede "Motivo della modifica della voce". Inserire "Impostazione" e
altri eventuali commenti attinenti al ciclo.
Avvio della PCR:
a. Selezionare la scheda Strumento.
b. Inserire la piastra PCR a 96 pozzetti nella macchina.
c. Sotto Controllo strumento, selezionare il tasto Avvio per avviare il ciclo.
Dopo la PCR:
a. IMPORTANTE: al termine del ciclo, premere OK. Analizzare i dati premendo il tasto "Analizza" nel
menu superiore, poi salvare il file.
b. Salvare il file premendo Salva documento nella barra degli strumenti. Si aprirà una finestra che
chiede "Motivo della modifica della voce". Inserire "Analisi dati post ciclo" e altri eventuali
commenti attinenti al ciclo.
Protocollo di amplificazione sullo strumento QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo
reale
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Accendere il QuantStudio Dx.
Scegliere la modalità IVD sullo strumento.
Lanciare il pacchetto software QuantStudio Dx IVD.
Quando viene richiesto, inserire nome utente incluso in ogni estrazione e password del sistema.
Si aprirà la finestra Schermata principale.
Nella casella Impostazioni, evidenziare il nome del test caricato precedentemente: "Quidel Molecular
RSV + hMPV".
7. Fare clic sul tasto Impostazioni per avviare un ciclo PCR in tempo reale.
8. Verrà visualizzata la schermata Impostazioni, Proprietà del test. Inserire i dati relativi al ciclo.
a. Inserire Nome esperimento (per impostazione predefinita, il ciclo viene avviato con un indicatore
data e ora).
b. Immettere i dati del codice a barre piastra.
c. Registrare i numeri di lotto del materiale sotto Dati del reagente.
d. Salvare il ciclo con un identificatore univoco come file “.sds” (ad es., GGMMAA-IDciclo-Quidel
Molecular C difficile.sds).
e. Si aprirà una finestra che chiede "Motivo della modifica della voce". Inserire "Impostazione" e
altri eventuali commenti attinenti al ciclo.
9. Nella barra del menu di sinistra, selezionare Definisci.
10. Modificare i dati dei campioni.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 16 di 28
a.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Immettere i dati dei campioni specifici di ciascun pozzetto, cancellando l’elemento identificativo
predefinito (Paziente 1, Paziente 2, ecc.) e inserendo i nuovi dati, OPPURE
b. selezionare Importa da file nella parte superiore dello schermo per caricare una mappa
predefinita della piastra da un file di testo (delimitato da tabulazioni).
Nella barra del menu di sinistra, selezionare Assegna per verificare le corrette impostazioni della
piastra.
Caricamento della piastra dei campioni.
a. Espellere il vassoio strumenti.
b. Inserire la piastra PCR a 96 pozzetti nella macchina con il pozzetto A1 posizionato nell’angolo in
alto a sinistra.
c. Retrarre il vassoio strumenti.
Avviare il ciclo.
a. Nella barra del menu di sinistra, selezionare Ciclo.
b. Fare clic sul tasto verde Esegui ciclo nella parte superiore dello schermo.
i. Se richiesto, selezionare il numero di serie specifico dello strumento in uso.
Una volta completato il ciclo, nella barra del menu di sinistra, selezionare Analisi.
a. Salvare il file premendo Salva nella barra degli strumenti. Si aprirà una finestra che chiede
"Motivo della modifica della voce". Inserire "Analisi dati post ciclo" e altri eventuali commenti
attinenti al ciclo.
b. Per impostazione predefinita, viene visualizzata la finestra Tracciato amplificazione. Per
visualizzare altri tipi di tracciato, selezionarli dalla barra del menu a sinistra.
c. Per visualizzare i dati sul ciclo con i valori Ct, selezionare la scheda Tabella pozzetti sulla destra
dello schermo.
Stampa di un rapporto.
a. Nella barra del menu di sinistra, selezionare Stampa rapporto. Personalizzare i contenuti del
rapporto selezionando o deselezionando i riquadri nella finestra.
b. Selezionare il tasto Stampa rapporto in fondo allo schermo.
Esportazione dei file di dati.
a. Nella barra del menu di sinistra, selezionare Esporta.
b. Inserire la Posizione del file di esportazione OPPURE fare clic su Sfoglia per individuare il
percorso desiderato.
c. Per impostazione predefinita, il campo Nome file di esportazione sarà compilato con il nome del
ciclo salvato.
d. Come tipo di file, selezionare Excel.
e. Personalizzare il rapporto dei dati esportati scorrendo le schede e selezionando o deselezionando
le opzioni.
Selezionare il tasto Avvia esportazione nella parte inferiore dello schermo.
Interpretazione dei risultati
Interpretazione dei risultati con Cepheid SmartCycler II
1. Selezionare la scheda Visualizza risultati al termine del ciclo.
2. Selezionare la scheda Campione risultati.
3. Il software SmartCycler II indicherà automaticamente se è stato rilevato RNA virale di RSV e/o di hMPV nei
campioni, oppure se il ciclo non è valido (non risolto).
4. Nelle schede di ciascun analita, nella stessa finestra, sono presenti informazioni più dettagliate. In caso di
indicazione positiva per l'RSV o l'hMPV (o entrambi), il risultato PRC non è applicabile. Il PRC è richiesto
solo per le indicazioni negative.
Interpretazione dei risultati del dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV su Cepheid SmartCycler II
Risultato
Risultato
Controllo di
Risultato
hMPV
Interpretazione dei risultati
dosaggio
processo
Non rilevato acido nucleico né di RSV né di hMPV;
Negativo
Superato
NEG.
NEG.
rilevato PRC
Positivo
N.A.*
POS.
NEG.
Acido nucleico di RSV rilevato
all'RSV
Positivo
N.A.*
NEG.
POS.
Acido nucleico di hMPV rilevato
all'hMPV
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 17 di 28
Interpretazione dei risultati del dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV su Cepheid SmartCycler II
Risultato
Risultato
Controllo di
Risultato
hMPV
Interpretazione dei risultati
dosaggio
processo
Positivo
all'RSV e
N.A.*
POS.
POS.
Acido nucleico di RSV e hMPV rilevato**
all'hMPV
Non risolto – Inibizione PCR o insuccesso del
reagente.
Ripetere il test sullo stesso campione purificato. Se
Non valido
Non superato
NEG.
NEG.
anche tale test non è valido, prelevare e testare
un'altra aliquota dello stesso campione, oppure
prelevare e testare un altro campione.
*Il controllo di processo non richiede alcun valore per riferire un'indicazione positiva.
** Infezioni doppie sono rare. Ripetere il test utilizzando lo stesso campione purificato. Se il risultato viene
confermato, raccogliere e testare un nuovo campione. Contattare Quidel se più campioni forniscono lo stesso
risultato.
Codice errore 3079: l'Avvertenza/Codice errore 3079 è possibile con campioni positivi all'RSV e/o all'hMPV.
L'Avvertenza/Codice errore 3079 è presente quando il segnale di fluorescenza (RFU) è troppo elevato. In
questo caso, tutti i risultati del campione vengono refertati dal software Dx come ND (Non determinato). Se
viene refertato un valore Ct ≥ 5 per ciascuno dei due virus, i risultati del campione possono essere registrati
come Positivi per il virus corrispondente. Se il valore Ct è <5, il virus corrispondente viene refertato come
Negativo.
Interpretazione dei risultati con lo strumento ABI 7500 Fast Dx
Interpretazione dei risultati del dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV sul termociclatore 7500 Fast Dx
Rilevatore:
Risultato
Rilevatore:
Rilevatore:
Controllo di
Interpretazione dei risultati
dosaggio
Risultato
hMPV
processo
Indeterminat
Indeterminat
5,0 ≤ Ct ≤
Non rilevato RNA virale né di RSV né di
Negativo
o
o
35,0
hMPV; rilevato PRC
Positivo
5,0 ≤ Ct ≤
Indeterminat
Rilevato RNA virale di RSV
N.A.*
all'RSV
35,0
o
Positivo
Indeterminat
5,0 ≤ Ct ≤
N.A.*
Rilevato RNA virale di hMPV
all'hMPV
o
35,0
5,0 ≤ Ct ≤
5,0 ≤ Ct ≤
RSV e hMPV
N.A.*
Rilevato RNA virale di RSV e di hMPV**
35,0
35,0
Non rilevato RNA virale né di RSV né di
hMPV, e non rilevato PRC; test non
valido.
Indeterminat
Indeterminat
Indeterminat Ripetere il test sullo stesso campione
Non valido
o
o
o
purificato. Se anche tale test non è
valido, prelevare e testare un'altra
aliquota dello stesso campione, oppure
prelevare e testare un altro campione.
*Il controllo di processo non richiede alcun valore Ct per riferire un’indicazione positiva.
** Infezioni doppie sono rare. Ripetere il test utilizzando lo stesso campione purificato. Se il risultato viene
confermato, raccogliere e testare un nuovo campione. Contattare Quidel se più campioni forniscono lo stesso
risultato.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 18 di 28
Interpretazione dei risultati con lo strumento QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale
Interpretazione dei risultati del dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV sullo
strumento Life Technologies QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale
Rilevatore:
Rilevatore:
Risultato
Rilevatore:
Interpretazione dei
Risultato
Controllo di
dosaggio
hMPV
risultati
processo
Non rilevato RNA virale né
Nessun valore Ct
Nessun valore Ct
Valore Ct
Negativo
di RSV né di hMPV; rilevato
refertato
refertato
refertato
PRC
Positivo
Nessun valore Ct
Rilevato RNA virale di RSV
Valore Ct refertato
N.A.*
all'RSV
refertato
Positivo
Nessun valore Ct
Rilevato RNA virale di
Valore Ct refertato
N.A.*
all'hMPV
refertato
hMPV
RSV e
Rilevato RNA virale di RSV e
Valore Ct refertato
Valore Ct refertato
N.A.*
hMPV
di hMPV**
Non rilevato RNA virale né
di RSV né di hMPV, e non
rilevato PRC; test non
valido.
Ripetere il test sullo stesso
Nessun valore Ct
Nessun valore Ct
Nessun valore Ct campione purificato. Se
Non valido
refertato
refertato
refertato
anche tale test è
non valido, prelevare e
testare un'altra aliquota
dello stesso campione,
oppure prelevare e testare
un altro campione.
*Il controllo di processo non richiede alcun valore Ct per riferire un’indicazione positiva.
**Infezioni doppie sono rare. Ripetere il test utilizzando lo stesso campione purificato. Se il risultato viene
confermato, raccogliere e testare un nuovo campione. Contattare Quidel se più campioni forniscono lo stesso
risultato.
Controllo di qualità
Il dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV incorpora numerosi controlli per monitorare le prestazioni del
dosaggio.
1. Il controllo di processo deve essere utilizzato durante l'estrazione e l'amplificazione nel dosaggio. Questo
controllo va aggiunto a ciascuna aliquota di campione prima dell'estrazione.
2. I controlli positivi esterni per RSV/hMPV disponibili in commercio possono essere trattati come campioni
del paziente e utilizzati conformemente agli standard del laboratorio. Al posto di controlli RSV o hMPV
disponibili in commercio è possibile usare campioni precedentemente caratterizzati come positivi
all'RSV/hMPV.
3. Come controllo negativo esterno si possono utilizzare terreni di trasporto per colture virali o campioni
precedentemente caratterizzati come negativi. Essi vanno trattati come campioni del paziente e
conformemente agli attuali standard del laboratorio.
Limitazioni
Questo test non è destinato alla differenziazione dei sottotipi di RSV o di hMPV. La differenziazione dei
sottotipi richiede ulteriori test.
I risultati negativi non escludono l'infezione da RSV o hMPV e non devono essere utilizzati come sola base
per una decisione di trattamento.
Come accade per altri dosaggi di questo tipo, esiste un rischio di risultati falsi negativi a causa della
presenza di varianti di sequenza nel target virale.
Il prelievo, la conservazione o il trasporto impropri possono causare risultati falsi negativi.
Gli inibitori presenti nel campione e/o gli errori nel seguire la procedura del dosaggio possono portare a
risultati falsi negativi.
Un operatore sanitario addestrato deve interpretare i risultati del dosaggio facendo riferimento
all'anamnesi del paziente, a segni e sintomi clinici e ai risultati di altri test diagnostici.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 19 di 28
Le prestazioni del dosaggio non sono state definite nei soggetti ai quali sono stati somministrati
corticosteroidi per via nasale.
Le prestazioni del dosaggio non sono state definite nei soggetti ai quali è stato somministrato il vaccino
influenzale per via nasale.
I risultati degli studi analitici mostrano che a 2x LoD, il sottotipo B2 dell'hMPV è stato inibito dall'RSV ad un
livello di 10.000 al di sopra dell'RSV LoD sullo strumento ABI 7500 Fast Dx. Lo stesso studio eseguito sullo
strumento Cepheid SmartCycler II ha dimostrato che a 2x LoD, il sottotipo B2 dell'hMPV è stato inibito
dall'RSV ad un livello di 3 log al di sopra dell'RSV LoD refertato. L'incidenza della co-infezione con l'RSV e
l'hMPV nell'attuale sperimentazione clinica per il dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV è risultata pari
allo 0,1% (1/949). Questa bassa prevalenza può variare in base alla prevalenza e alla popolazione
sottoposta a test.
Valori previsti
Sono stati eseguiti studi clinici con il dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV con la piattaforma Cepheid
SmartCycler® II e lo strumento Applied Biosystems® 7500 Fast Dx. Il test è stato eseguito con campioni
prospettici ricevuti da tutti gli Stati Uniti nell'inverno 2012 (da gennaio 2012 a marzo 2012). La tabella riportata
di seguito indica il valore previsto per ciascun virus sui due strumenti.
Valori previsti per l'inverno 2012
Strumento
Cepheid SmartCycler® II
Applied Biosystems® 7500 Fast Dx
Risultato
15,6% (158/1014)
16,4% (166/1012)
hMPV
14,6% (148/1014)
15,5% (157/1012)
Uno studio clinico più limitato è stato eseguito con il dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV utilizzando lo
strumento Life Technologies QuantStudio Dx per PCR in tempo reale. Il test è stato eseguito con campioni
prospettici ricevuti da tutti gli Stati Uniti nell'inverno 2013 (da gennaio 2013 a marzo 2013). La tabella riportata
di seguito indica il valore previsto per ciascun virus sui due strumenti.
Valori previsti per l'inverno 2013
Strumento
strumento Life Technologies
QuantStudio Dx per la reazione PCR in
tempo reale
Risultato
18,6% (59/317)
hMPV
14,4% (45/317)
Prestazioni cliniche
Le caratteristiche di performance del dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV con lo strumento Cepheid
SmartCycler® II e la piattaforma Applied Biosystems® 7500 Fast Dx state stabilite attraverso uno studio
prospettico svoltosi durante la stagione dei virus respiratori 2012 (da gennaio a marzo). I campioni utilizzati
per questo studio erano campioni di tamponi freschi (414) e congelati (600) raccolti per eseguire il test di
routine dei virus respiratori in quattro siti negli Stati Uniti. È stato raccolto e testato un singolo campione per
paziente (DFA di campione diretto e coltura con DFA). I campioni residui sono stati estratti con il sistema
bioMériuex easyMAG e testati con il dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV utilizzando gli strumenti ABI 7500
Fast Dx Cepheid SmartCycler II. Le aliquote di ciascun campione sono state inviate a una sede centrale per il
test con un test molecolare dll'hMPV approvato dalla FDA.
Informazioni demografiche
Applied BioSystem 7500 Fast Dx
Età del
gruppo
(anni)
Cepheid SmartCycler II
N.
Positivo
totale
all'hMPV Prevalenza testato
N.
Positivo
Positivo
totale
all'RSV Prevalenza all'hMPV Prevalenza testato
Positivo
all'RSV
Prevalenza
<1
72
28,3%
38
15,0%
254
71
27,5%
35
13,6%
258
Da 1 a 5
da 6 a
10
da 11 a
15
da 16 a
21
72
19,9%
76
21,5%
354
67
19,0%
73
20,7%
352
6
4,5%
17
12,7%
134
6
4,5%
16
11,9%
134
3
4,8%
7
11,3%
62
3
4,8%
6
9,7%
62
3
9,1%
1
3,0%
33
3
9,1%
1
3,0%
33
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 20 di 28
Applied BioSystem 7500 Fast Dx
Età del
gruppo
(anni)
>21
Positivo
all'RSV
Prevalenza
10
5,7%
Cepheid SmartCycler II
N.
Positivo
totale
all'hMPV Prevalenza testato
N.
Positivo
Positivo
totale
all'RSV Prevalenza all'hMPV Prevalenza testato
18
10,3%
175
8
4,6%
17
9,7%
175
Totale
166
16,4%
157
* Due campioni non erano validi.
15,5%
1012*
158
15,6%
148
14,6%
1014
Studio clinico prospettico – Cepheid SmartCycler® II
Millequattordici (1014) campioni sono stati testati sia dal soggetto che dai metodi comparativi per l'RSV. Un (1)
campione è stato contaminato e tre (3) erano tossici nella coltura cellulare (0,4%). Questi quattro (4) campioni
sono stati esclusi dall'analisi. I risultati per i milledieci (1010) campioni restanti sono descritti nei dettagli nella
tabella riportata di seguito.
Sito combinato _ Virus sinciziale respiratorio
DSFA & coltura cellulare con
DFA
95% CI
POS.
NEG.
Totale
Sensibilità
97,9% 93,9%
99,3%
POS.
137
21*
158
Specificità
97,6%
96,3%
98,4%
Quidel Molecular
RSV + hMPV
NEG.
3
849
852
Totale
140
870
1010
* Tutti i campioni discordanti in origine sono risultati positivi all'RSV con un dosaggio PCR in tempo reale
approvato dalla FDA.
Novecentosessanta (960) campioni sono stati testati sia dal dispositivo in questione sia dal dispositivo
comparativo per l'hMPV (il dispositivo di confronto non era disponibile per completare il test del confronto per
cinquantaquattro (54) campioni). Nove (9) campioni non erano validi nel dispositivo comparativo (0,9%).
Questi nove (9) campioni sono stati esclusi dall'analisi. I risultati dei novecentocinquantuno (951) campioni
restanti sono descritti nei dettagli nella tabella riportata di seguito.
Sito combinato - Metapneumovirus umano
Test molecolare hMPV approvato
dalla FDA
POS.
NEG.
Totale
Quidel Molecular
POS.
RSV + hMPV
NEG.
Totale
145
5
150
3
798
801
148
803
951
Accordo percentuale positivo
Accordo percentuale
negativo
96,7%
95% CI
92,4% 98,6%
99,6%
98,9%
99,9%
Studio clinico prospettico - Applied Biosystems® 7500 Fast Dx
Millequattordici (1014) campioni sono stati testati sia dal soggetto che dai metodi comparativi per l'RSV. Un (1)
campione è stato contaminato e tre (3) erano tossici nella coltura cellulare (0,4%). Due (2) campioni non erano
validi nei metodi in questione (0,2%). Questi sei (6) campioni sono stati esclusi dall'analisi. I risultati per i
milleotto (1008) campioni restanti sono descritti nei dettagli nella tabella riportata di seguito.
Sito combinato _ Virus sinciziale respiratorio
DSFA & coltura cellulare con
DFA
95% CI
POS.
NEG.
Totale
Sensibilità
98,6% 94,9%
99,6%
POS.
138
28*
166
Specificità
96,8% 95,4%
97,8%
Quidel Molecular
RSV + hMPV
NEG.
2
840
842
Totale
140
868
1008
* 25 su 28 campioni discordanti in origine sono risultati positivi all'RSV con un dosaggio PCR in tempo reale
approvato dalla FDA.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 21 di 28
Novecentosessanta (960) campioni sono stati testati sia dal dispositivo in questione sia dal dispositivo
comparativo per l'hMPV (il dispositivo di confronto non era disponibile per completare il test del confronto per
cinquantaquattro (54) campioni). Nove (9) campioni non erano validi nel dispositivo comparativo (0,9%). Due
(2) campioni non erano validi nei metodi in questione (0,2%). Questi undici (11) campioni sono stati esclusi
dall'analisi. I risultati dei novecentoquarantanove (949) campioni restanti sono descritti nei dettagli nella
tabella riportata di seguito.
Sito combinato - Metapneumovirus umano
Test molecolare hMPV approvato
dalla FDA
POS.
NEG.
Totale Accordo percentuale positivo
147
9
156 Accordo percentuale negativo
Quidel Molecular POS.
RSV + hMPV
NEG.
3
790
793
Totale
150
799
949
98,0%
98,9%
95% CI
94,3% 99,3%
97,9% 99,4%
Studio clinico prospettico – Life Technologies QuantStudio Dx
Le caratteristiche di performance del dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV con lo strumento Life
Technologies QuantStudio Dx per il PCR in tempo reale sono state definite in uno studio prospettico durante la
stagione dei virus respiratori 2013 (da gennaio a febbraio). I campioni utilizzati per questo studio erano
campioni di tamponi freschi (317) raccolti per il test di routine dei virus respiratori negli Stati Uniti. È stato
raccolto e testato un singolo campione per paziente (DFA di campione diretto e coltura con DFA) per l'RSV
subito dopo il prelievo. I campioni sono stati estratti con il sistema bioMériuex easyMAG e testati con il
dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV. Le aliquote di ciascun campione sono state inviate a una sede centrale
per il test con un test molecolare dall'hMPV approvato dalla FDA.
Virus sinciziale respiratorio
DSFA & coltura cellulare con
DFA
95% CI
POS.
NEG.
Totale
Sensibilità
100%
92%
100%
POS.
45
14*
59
Specificità
95%
92%
97%
Quidel Molecular
RSV + hMPV
NEG.
0
258
258
Totale
45
272
317
* Dei quattordici (14) campioni RSV falsi positivi dal dosaggio QM RSV + hMPV, nove (9) sono risultati positivi
per l'RSV utilizzando un dosaggio marcato CE.
Metapneumovirus umano
Test molecolare hMPV approvato
dalla FDA
95% CI
POS.
NEG.
Totale Accordo percentuale positivo
100% 92%
100%
43
2
45
Accordo percentuale negativo
99% 97%
100%
Quidel Molecular POS.
RSV + hMPV
NEG.
0
268
268
Totale
43
270
313
* Quattro campioni sono risultati NON VALIDI sul comparatore e non sono inclusi in questa tabella
Prestazioni analitiche
Livello di rilevamento
La sensibilità analitica (limite di rilevamento o LoD) del dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV è stata stabilita
usando colture quantificate (TCID50/mL) di 2 ceppi di RSV e 4 ceppi di hMPV (1 A1, 1 A2, 1 B1, 1B2), diluiti
serialmente in una matrice rinofaringea negativa. Ogni diluizione è stata estratta in repliche di 20 per ciascuna
concentrazione di virus usando il sistema NucliSENS easyMAG ed è stata testata sulle tre piattaforme (solo i
sottotipi A2 e B2 dell'hMPV sono stati testati sullo strumento QuantStudio). La sensibilità analitica (LoD) è
definita come la concentrazione più bassa in corrispondenza della quale il 95% di tutti i duplicati risulta
positivo al test.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 22 di 28
Riepilogo del valore LoD
Virus
RSV A
RSV B
hMPV-A1
hMPV-A2
hMPV-B1
hMPV-B2
LoD TCID50/mL
7500 Fast Dx
6.29E-01
7.5E-01
1.7E+01
4.17E+00
1.05E+00
3.21E+00
LoD TCID50/mL
SmartCycler
1.89E+00
2.25E+00
2.65E+01
4.17E+00
7.88E+00
9.63E+00
LoD TCID50/mL
QuantStudio
6.29E-01
2.25E-01
2.91E+00
2.25E+00
Reattività analitica (Inclusività)
La reattività del dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV è stata valutata in relazione a molteplici ceppi di RSV e
di hMPV. Il panel di reattività analitica era costituito da 5 ceppi di RSV e da 11 ceppi di hMPV (2 A-1, 2 A-2, 2 B1, 4 B-2 e 1 non tipizzato). Ogni membro del panel è stato estratto con lo strumento NucliSens easyMAG e
testato tre volte su entrambe le piattaforme Cepheid SmartCycler II e ABI 7500 Fast Dx.
Panel di inclusività RSV
Sottotipo
Ceppo
TCID50/mL
A (NIBSC)
A
B
B
B
A-2
A-2
Washington
9320
CH9318(1B)
N/D
5.67E+00
2.25E+00
2.25E+00
2.25E+00
Quidel Molecular
Dosaggio RSV + hMPV
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Panel di inclusività hMPV
Sottotipo
Ceppo
TCID50/mL
A1
A1
A2
A2
B1
B1
B2
B2
B2
B2
hMPV (NIBSC)
IA3-2002 G Gene
IA10-2003
IA14-2003 G Gene
Isolato clinico
Peru2-2002 G Gene
Peru3-2003 G Gene
Peru1-2002 G Gene
Peru6-2003
IA18-2003 G Gene
IA18-2003 G Gene
N/D
7.95E+01
7.95E+01
1.25E+1
1.25E+1
2.36E+01
2.36E+01
9.63E+00
9.63E+00
9.63E+00
9.63E+00
N/D
Quidel Molecular
Dosaggio RSV + hMPV
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Il dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV ha rilevato il 100% dei ceppi RSV e hMPV su entrambe le piattaforme
7500 Fast Dx e Cepheid SmartCycler® II.
Studio sulla riproducibilità
La riproducibilità del dosaggio Quidel Molecular Influenza RSV + hMPV è stata valutata in 3 siti di laboratorio.
La riproducibilità è stata analizzata usando un panel di 4 campioni simulati comprendente campioni medi
positivi e bassi positivi, alti negativi all'RSV e all'hMPV e campioni negativi. I panel e i controlli sono stati testati
in ciascun sito da 2 operatori per 5 giorni (test triplice x 2 operatori x 5 giorni x 3 siti = 90 risultati per livello per
ciascun virus). I valori LoD si basano sui valori ottenuti nello studio LoD. I panel e i controlli sono stati estratti
usando il sistema bioMérieux easyMAG e testati sugli strumenti Cepheid SmartCycler II e Applied Biosystems
7500 Fast DX.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 23 di 28
Risultati di riproducibilità – Cepheid SmartCycler II
ID del componente
del panel
RSV alto negativo
0,05x LoD
RSV basso positivo
2x LoD
RSV medio positivo 5x
LoD
Sito 1
Risultati
AVE Ct*
positivi
Sito 2
%CV
Risultati
positivi
AVE Ct*
%CV
Sito 3
Risultati
AVE Ct*
positivi
%CV
Risultati
positivi
totali
8/30
44.3
9.3
6/30
47.4
5.4
1/30
48.7
N/D
15/90
30/30
31.2
7.3
30/30
31.4
4.1
30/30
30.9
1.5
90/90
30/30
29.6
5.7
30/30
29.7
3.1
30/30
29.5
2.0
90/90
RSV negativo
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/90
RSV controllo negativo
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/90
RSV controllo positivo
30/30
30.0
1.8
30/30
31.0
3.3
30/30
30.6
1.2
90/90
34.3
8.3
6/30
41.8
6.3
8/30
34.9
6.4
26/90
31.1
6.7
30/30
32.2
6.2
30/30
31.1
3.3
90/90
29.3
2.0
30/30
29.9
3.2
30/30
29.8
3.4
90/90
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/90
hMPV controllo negativo 0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/90
30.3
1.4
30/30
30.9
1.9
30/30
30.8
2.5
90/90
hMPV alto negativo 0.15x
12/30
LoD
hMPV basso positivo
30/30
2x LoD
hMPV medio positivo 5x
30/30
LoD
hMPV negativo
hMPV controllo positivo
30/30
* Ct medio in base alla media dei soli risultati positivi. I valori Ct pari a 0 sono stati esclusi dal calcolo.
Risultati di riproducibilità – Applied Biosystems 7500 Fast Dx
ID del componente
del panel
Sito 1
AVE Ct*
14/30
Sito 2
Sito 3
Risultati
AVE Ct*
positivi
Risultati
positivi
totali
%CV
Risultati
positivi
AVE Ct*
%CV
30.7
8.3
3/30
33.8
2.4
9/30
32.3
4.0
26/90
30/30
23.7
7.4
30/30
23.8
3.1
30/30
23.4
4.5
90/90
30/30
20.5
4.0
30/30
21.8
2.2
29/29
21.1
2.2
89/89
RSV negativo
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/90
RSV controllo negativo
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/90
RSV controllo positivo
30/30
19.7
6.5
30/30
20.0
8.5
30/30
19.6
1.9
90/90
24.9
19.5
6/30
29.1
10.2
10/30
25.1
16.9
30/90
21.0
8.7
30/30
21.5
4.1
30/30
21.6
5.8
90/90
18.9
3.3
30/30
19.6
3.0
29/29
19.2
2.6
89/89
RSV alto negativo
0,05x LoD
RSV basso positivo
2x LoD
RSV medio positivo 5x
LoD
Risultati
positivi
hMPV alto negativo
14/30
0.15x LoD
hMPV basso positivo
30/30
2x LoD
hMPV medio positivo 5x
30/30
LoD
%CV
hMPV negativo
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/90
hMPV controllo
negativo
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
N/D
0/90
19.7
3.9
30/30
20.0
1.7
30/30
19.9
1.4
90/90
hMPV controllo positivo 30/30
* Ct medio in base alla media dei soli risultati positivi. I valori Ct pari a 0 sono stati esclusi dal calcolo.
Specificità analitica – Reattività crociata
La specificità analitica del dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV è stata valutata testando un panel formato da
34 ceppi virali, 26 ceppi batterici e 1 ceppo di lieviti che sono patogeni respiratori comuni o flora
comunemente presente nella rinofaringe. I campioni sono stati estratti con lo strumento NucliSens easyMAG e
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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testati tre volte sugli Applied Biosystems 7500 Fast Dx e Cepheid SmartCycler II. La specificità analitica del
dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV è stata del 100%.
Gli organismi utilizzati per lo studio erano i seguenti:
Virus
Influenza A/Mexico/4108/2009, Influenza B/Florida/04/2006, Adenovirus 1/Adenoid 71, Adenovirus 2,
Adenovirus 3, Adenovirus 4, Adenovirus 5, Adenovirus 7, Adenovirus 11, Adenovirus 14, Adenovirus 31,
Coronavirus NL63, Coronavirus 229E, Coronavirus OC43, Coxsackievirus B4, Coxsackievirus B5/10/2006,
Citomegalovirsu, Ecovirus 7, Ecovirus 9, Ecovirus 6, Ecovirus 11, Enterovirus 71, Enterovirus 70, Virus di Epstein
Barr, HSV Tipo 1, ceppo Maclnytre, Rhinovirus umano, HSV Tipo 2, ceppo G, Virus del morbillo, Parotite,
Parainfluenza Tipo 1, Parainfluenza Tipo 2, Parainfluenza Tipo 3, Parainfluenza Tipoe 4, Varicella Zoster Virus
Batteri
Bordetella pertussis, , Bordetella bronchiseptica, Chlamydophila pneumonia, Chlamydia trachomatis, Legionella
pneumophila, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycoplasma
pneumoniae, Haemophilus influenza, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, Neisseria mucosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Moraxella
catarrhalis, Corynebacterium diptheriae, Lactobacillus plantarum, Streptococcus pneumonia, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus salivarius, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus.
Lieviti
Candida albicans
Specificità analitica – Sostanze interferenti
Le prestazioni del dosaggio Quidel Molecular RSV + hMPV sono state valutate con sostanze potenzialmente
interferenti che potrebbero essere presenti nei campioni rinofaringei. Le sostanze potenzialmente interferenti
sono state valutate usando RSV B e hMPV B1 a una concentrazione di 3x e 10x LoD. Non è stato rilevato alcun
segno di interferenza da parte delle sostanze testate a 3x o 10x LoD.
Nome della sostanza
Mucina (ghiandola sottomascellare
bovina, tipo I-S)
Sangue (umano), EDTA anticoagulante
Neo-sinefrina
Spray nasale Afrin
Concentrazione testata
60 µg/mL
2% (vol/vol)
15% (vol/vol)
15% (vol/vol)
Zicam Allergy Relief Nasal Gel
5% (vol/vol)
Spray nasale salino
15% (vol/vol) della dose
Pastiglie per la gola
Zanamivir
Tobramicina
Mupirocina
Oseltamivir fosfato
0,68g/mL; 1/18 sbriciolato; ingredienti
attivi: 1,7 mg/mL di mentolo
3,3–5 mg/mL
4,0 µg/mL
6,6–10 mg/mL
7,5–25 mg/mL
Carry-over e contaminazione crociata
Uno studio interno non ha evidenziato alcuna prova di carry-over/contaminazione crociata con il dosaggio
Quidel Molecular RSV + hMPV usando lo strumento di estrazione degli acidi nucleici automatizzata NucliSens
easyMAG e le tre piattaforme del termociclatore. Applied Biosystems 7500 Fast Dx o Cepheid SmartCycler.
Servizio clienti e assistenza tecnica
Per ordini o assistenza tecnica, contattare un rappresentante Quidel al numero (800) 874-1517 (gratuito negli
Stati Uniti), oppure al numero +1 (858) 552-1100 (al di fuori degli Stati Uniti), dal lunedì al venerdì, dalle 8:00
alle 17:00, ora della costa orientale. Gli ordini possono essere effettuati anche via fax al numero +1 (740) 5929820. Per assistenza via e-mail, contattare [email protected] o [email protected].
Per servizi al di fuori degli Stati Uniti, contattare il distributore di zona. Maggiori informazioni su Quidel, i nostri
prodotti e i nostri distributori sono disponibili sul sito web quidel.com.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Proprietà intellettuale
Marchi di fabbrica
Smartcycler® è un marchio depositato di Cepheid Corporation. Applied Biosystems® è un marchio depositato
di Life Technologies. NucliSENS® ed easyMAG® sono marchi depositati di bioMerieux, Inc. TaqMan® è un
marchio depositato di Roche. CAL Flour® Red 610 e Quasar®670 sono marchi depositati di BioSearch
Technologies, Inc.
Brevetti
I composti coloranti in questo prodotto sono venduti su licenza di BioSearch Technologies, Inc. e sono tutelati
da brevetti statunitensi e internazionali, già rilasciati o in attesa di rilascio.
L’acquisto di questo prodotto concede all’acquirente i diritti previsti da determinati brevetti di Roche, per l’uso
esclusivamente nell’ambito di servizi diagnostici in vitro per esseri umani. Al di là di questo specifico diritto
all’uso, con l’acquisto non vengono concessi brevetti generali o altre licenze di alcun tipo.
Questo prodotto è coperto dai brevetti statunitensi n. 7,531,342 e 7,449,374 e dai corrispettivi internazionali;
altri brevetti statunitensi e internazionali sono in attesa di rilascio.
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Glossario
Contenuto / Contiene
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Uso previsto
96
Contenuto sufficiente per 96 determinazioni
Rischi biologici
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Bibliografia
1
2
3
4
5
6
7
8
Glezen et. Al. 1986. American journal of diseases of children (1960) 140(6): 543–6.
Hall, Caroline Breese. et al. 2009. New England Journal of Medicine 360(6): 588–98
Papadopoulos, N. G. et. al. 2004. Respiratory Med. 98 :879-882.
van den Hoogen B.G., et. al. Nat Med 2001;7:719 –24.
Sloots T.P. et al. 2006 EID. 12:1236-66.
Ebihara, T. et al. 2004 J Med Virol 70:281-283.
van den Hoogen, B. G. et al. 2004. EID. 10:658-666.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Viral Culture; Approved Guidelines. CLSI document M41-A [ISBN
1562386239] Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
Pennsylvania 19087-1898, USA 2006.
M103 – Kit per dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV
MDSS GmBH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Germania
Quidel Corporation
Sede internazionale
10165 McKellar Court
San Diego, CA 92121, Stati Uniti
quidel.com
M103it v2013MAR13
Dosaggio Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Pagina 28 di 28
Ensaio de VSR + MPVh
Instruções de utilização
Para a deteção e identificação qualitativa do vírus sincicial respiratório e ARN viral do
metapneumovírus humano extraído de amostras de esfregaço nasofaríngeo e esfregaço
nasal.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
Página 1 de 28
Índice
Utilização prevista ................................................................................................................................... 3
Resumo e explicação ............................................................................................................................... 3
Princípio do procedimento ..................................................................................................................... 3
Materiais fornecidos ............................................................................................................................... 4
Materiais opcionais ................................................................................................................................. 4
Materiais necessários mas não fornecidos ............................................................................................. 5
Aviso e precauções ................................................................................................................................. 5
Armazenamento e manuseamento de reagentes do kit ........................................................................ 6
Recolha, armazenamento e manuseamento de amostras ..................................................................... 6
Armazenamento de extratos de ácido nucleico ..................................................................................... 6
Instruções de programação da extração de ácido nucleico ................................................................... 6
Programação inicial do termociclador .................................................................................................... 9
Instruções de programação do SmartCycler II .................................................................................... 9
Instruções de programação do Applied Biosystems 7500 Fast DX ...................................................11
Instruções de programação do instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx .....................14
Procedimento de ensaio .......................................................................................................................14
Protocolo de amplificação no SmartCycler II da Cepheid .................................................................15
Protocolo de amplificação no termociclador Applied Biosystem 7500 Fast Dx ...............................16
Protocolo de amplificação do instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx .......................16
Interpretação de resultados .................................................................................................................17
Interpretação de resultados através do SmartCycler II da Cepheid .................................................17
Interpretação dos resultados utilizando o ABI 7500 Fast Dx ............................................................18
Interpretação dos resultados utilizando o instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx ...19
Controlo de qualidade ..........................................................................................................................19
Limitações .............................................................................................................................................19
Valores previstos ...................................................................................................................................20
Desempenho clínico ..............................................................................................................................20
Desempenho analítico ..........................................................................................................................22
Nível de deteção ...............................................................................................................................22
Reatividade analítica (Inclusividade) ................................................................................................22
Estudo de reprodutibilidade .............................................................................................................23
Especificidade analítica - Reatividade cruzada .................................................................................24
Especificidade analítica - Substâncias interferentes .........................................................................25
Estudos de transferência e contaminação cruzada ..........................................................................25
Assistência técnica e ao cliente.............................................................................................................25
Propriedade intelectual ........................................................................................................................25
Marcas registadas .............................................................................................................................25
Patentes ............................................................................................................................................26
Glossário ...............................................................................................................................................27
Referências............................................................................................................................................28
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Utilização prevista
O ensaio molecular de VSR + MPVh da Quidel é um ensaio multiplex de RT-PCR em tempo real para a deteção
e identificação qualitativa do vírus sincicial respiratório e ARN viral do metapneumovírus humano extraído de
amostras de esfregaço nasofaríngeo e esfregaço nasal de doentes com sinais ou sintomas de infeção
respiratória. Este teste de diagnóstico in vitro destina-se a ajudar no diagnóstico diferencial de infeções
causadas pelo metapneumovírus humano e vírus sincicial respiratório em humanos em conjunto com fatores
de risco clínico e epidemiológicos. Este teste não se destina a diferenciar os dois subtipos de VSR ou as quatro
sublinhagens genéricas do MPVh.
Resultados negativos não excluem infeções causadas pelo VSR e/ou MPVh e não devem ser utilizados como
base única para o diagnóstico, tratamento ou outras decisões relativas à gestão de doentes.
Resumo e explicação
VSR: O vírus sincicial respiratório (VSR) humano é um vírus ARN negativo de cadeia única da família
Paramyxoviridae. VSR é a principal causa de infeção do trato respiratório inferior e de consultas no hospital
durante os primeiros meses de vida e a infância. Nos Estados Unidos, 60% dos bebés são infetados durante o
seu primeiro estágio do VSR, e quase todas as crianças terão sido infetadas com o vírus aos 2–3 anos de idade.
1
2
Das infetadas com VSR, 2–3% irão desenvolver bronquiolite, necessitando de hospitalização. A infeção
natural com VSR induz a imunidade protetora que enfraquece ao longo do tempo - possivelmente muito mais
do que outras infeções virais respiratórias - portanto, as pessoas podem ser infetadas várias vezes. Por vezes,
um bebé pode ficar sintomaticamente infetado mais de uma vez, mesmo no espaço de um único estágio do
VSR. Têm sido detetadas cada vez mais infeções graves com VSR em doentes idosos.
Estão presentes subtipos A e B do VSR simultaneamente ou alternadamente durante epidemias anuais e
existem vários estudos de apoio que indicam que a bronquiolite induzida pelo VSR-A é mais grave do que uma
3
induzida pelo VSR-B.
MPVh: O metapneumovírus humano (MPVh) é um vírus ARN negativo de cadeia única da família
4
Paramyxoviridae isolado pela primeira vez em 2001 na Holanda. O MPVh pode ser a segunda causa mais
comum (a seguir ao VSR) de infeção do sistema respiratório inferior em crianças jovens. Comparado com o
VSR, a infecção com MPVh tende a ocorrer em crianças ligeiramente mais velhas e a doença produzida é
menos grave. Pode ocorrer co-infeção com ambos os vírus e está geralmente associada a doenças mais graves.
5
O MPVh representa aproximadamente 7,1% das infeções do trato respiratório. O vírus parece estar
distribuído a nível mundial e ter uma distribuição sazonal, sendo a sua incidência comparável à dos vírus da
gripe durante o inverno. Estudos serológicos demonstraram que, aos cinco anos de idade, praticamente todas
6
as crianças foram expostas ao vírus. O MPVh geralmente provoca infeções ligeiras do trato respiratório.
Contudo, as crianças pequenas, os idosos e indivíduos imunocomprometidos estão em risco de doença grave e
hospitalização.
Análises da sequência do genoma do MPVh demonstraram que as estirpes do MPVh que circulam em todo o
mundo podem ser divididas em duas linhagens genéticas principais (A e B) que representam dois serotipos,
7
cada um compreendendo duas sublinhagens (A1, A2, B1 e B2).
Princípio do procedimento
O ensaio deteta ácidos nucleicos virais extraídos a partir de uma amostra do doente. É realizada uma reação
multiplex de RT-PCR em tempo real sob condições otimizadas num único tubo, produzindo produtos de
amplificação para o VSR, MPVh e o Controlo do processo (PRC). A identificação do VSR, MPVh e do PRC ocorre
através da utilização de iniciadores de alvos específicos e sondas etiquetadas com fluorescência que hibridam
para regiões conservadas no NS2 e genes da polimerase do VSR e gene da polimerase de MPVh e PRC.
Etiquetas de sondas moleculares da Quidel
Alvo
VSR
MPVh
PRC
Corante
FAM
CAL Fluor® Red 610
Quasar® 670
O seguinte é um resumo do procedimento:
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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1.
Recolha de amostras: Obtenha amostras de esfregaços nasais ou nasofaríngeos utilizando técnicas padrão
em doentes sintomáticos. Deve transportar, armazenar, e processar estas amostras de acordo com os
8
procedimentos laboratoriais estabelecidos.
2.
Extração de ácido nucleico: Extraia os ácidos nucleicos a partir de amostras com o Sistema NucliSENS®
easyMAG® de acordo com as instruções do fabricante e utilizando os reagentes adequados (consulte a
secção Materiais necessários mas não fornecidos). A utilização de outros sistemas de extração com o
ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel não foi validada. A validação destes outros sistemas é da
responsabilidade do utilizador final.
Antes do procedimento de extração, adicione 20 µL do Controlo do processo (PRC) a cada alíquota de 180
µL da amostra. O PRC serve para monitorizar inibidores na amostra extraída, assegura que ocorreu a
amplificação adequada, e confirma que a extração de ácido nucleico foi suficiente.
3.
Reidratação da mistura principal: Reidrate a mistura principal liofilizada utilizando a Solução de
reidratação. A mistura principal contém sondas etiquetadas com supressores, fluoróforo e iniciadores
oligonucleótidos que visam regiões conservadas do VSR e MPVh, bem como a sequência de Controlo do
processo.
4.
Deteção e amplificação de ácido nucleico: Adicione 15 µL da mistura principal reidratada a cada tubo de
reação ou poço da placa. Em seguida, adicione 5 µL de ácidos nucleicos extraídos (amostra com PRC) ao
poço da placa ou tubo de reação adequadamente etiquetado. Coloque a placa ou tubo no instrumento de
PCR em tempo real QuantStudio™ Dx ou Applied Biosystems® (ABI) 7500 Fast Dx da Life Technologies ou
no SmartCycler II da Cepheid®, respetivamente.
Uma vez adicionada a placa ou o tubo de reação ao instrumento, inicie o protocolo de ensaio. Este
protocolo inicia a transcrição reversa dos alvos de ARN que produzem ADN complementar, e ocorre a
subsequente amplificação das sequências alvo. O ensaio molecular de VSR + MPVh da Quidel baseia-se na
química TaqMan® e utiliza uma enzima com transcriptase reversa, polimerase de ADN, e atividade de
exonuclease 5’-3’. Durante a amplificação de ADN, esta enzima divide a sonda ligada à sequência de ADN
complementar, separando o corante supressor do corante marcador. Este passo produz um aumento no
sinal fluorescente em consequência da estimulação por uma fonte de luz do comprimento de onda
adequado. Em cada ciclo, moléculas adicionais de corante são separadas dos seus supressores, causando
um sinal adicional. Se for obtida fluorescência suficiente, a amostra é indicada como positiva para a
sequência alvo detetada.
Materiais fornecidos
SKU # M103
Kit de deteção (96 reações) - Armazenar entre 2 °C e 8 °C
#
Componente
Quantidade


Solução de reidratação Item M5003
1 frasco/kit de 1,9 mL
Mistura principal molecular de VSR + MPVh da Quidel Item M5035
12 frascos/kit,
8 reações/frasco
Conteúdo liofilizado:
Enzima polimerase de ADN com atividade da transcriptase reversa
Iniciadores e sondas
dNTP
Estabilizadores
Controlo do processo Item M5005
1 frasco/kit de 2,0 ml
Materiais opcionais
Controlos externos para VSR e MPVh (i.e. Conjunto #M107 de controlo molecular de VSR + MPVh da Quidel
que funciona como controlo de extração e processamento externo)
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Materiais necessários mas não fornecidos
Micropipetadores (volume entre 1 a 10 μL e 100 a 1000 μL)
Pontas de pipetas não aerossol
Instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx ou instrumento Applied Biosystems 7500 Fast Dx da
Life Technologies
Placa de PCR de 96 poços
Películas de placas óticas
Centrifugadora para placa de 96 poços ABI
Versão 2.0 do software NucliSENS easyMAG da bioMerieux
Tampões 1, 2, 3 do NucliSENS easyMAG da bioMerieux
Tampão de lise do NucliSENS easyMAG da bioMerieux
Partículas magnéticas de sílica do NucliSENS easyMAG da bioMerieux
Produtos descartáveis do NucliSENS easyMAG da bioMerieux
Ou
Micropipetadores (volume entre 1 a 10 μL e 100 a 1000 μL)
Pontas de pipetas não aerossol
SmartCycler II da Cepheid
Produtos descartáveis de SmartCycler
Centrifugadora SmartCycler
Versão 2.0 do software NucliSENS easyMAG da bioMerieux
Tampões 1, 2, 3 do NucliSENS easyMAG da bioMerieux
Tampão de lise do NucliSENS easyMAG da bioMerieux
Partículas magnéticas de sílica do NucliSENS easyMAG da bioMerieux
Produtos descartáveis do NucliSENS easyMAG da bioMerieux
Aviso e precauções
Para utilização em diagnóstico In Vitro
Foram estabelecidas características de desempenho deste teste com os tipos de amostras indicados na
secção Utilização prevista apenas. O desempenho deste ensaio com outras amostras ou tipos de amostras
não foi avaliado.
A utilização de sistemas de extração que não os do Sistema NucliSENS easyMAG não foi validada. A
validação deste sistema é da responsabilidade do utilizador final.
A utilização de condições cíclicas diferentes das indicadas na secção Instruções de programação do
termociclador pode produzir resultados erróneos.
A utilização deste produto deve ser limitada ao pessoal com formação suficiente em técnicas de RT-PCR e
PCR.
Tratar todas as amostras como potencialmente infecciosas. Seguir as precauções universais ao manusear
amostras, este kit, e o seu conteúdo.
A recolha, armazenamento e transporte adequados de amostras são essenciais para obter resultados
corretos.
Armazenar os reagentes do ensaio conforme indicado nos seus rótulos individuais.
Utilizar proteção facial e ocular, luvas e vestuário de proteção adequado ao utilizar este kit.
Para obter resultados precisos, pipetar cuidadosamente utilizando apenas equipamentos calibrados.
Limpar e desinfetar bem todas as superfícies com uma solução de lixívia a 10% e, em seguida, água de
grau molecular.
Utilizar micropipetas com uma barreira de aerossol ou pontas de deslocamento positivo para todos os
procedimentos.
Evitar contaminação cruzada e microbiana dos reagentes do kit. Seguir bons procedimentos laboratoriais.
Não misturar reagentes de kits com números de lote diferentes.
Não utilizar reagentes de outros fabricantes com este kit.
Não utilizar o produto após a sua data de validade.
Um planeamento correto do fluxo de trabalho é essencial para minimizar o risco de contaminação.
Planear sempre o fluxo de trabalho laboratorial de forma unidirecional, começando com a préamplificação e avançando para a amplificação e deteção.
Utilizar o equipamento e materiais dedicados em áreas de pré-amplificação e amplificação.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Não permitir o cruzamento de pessoas ou equipamentos entre as áreas.
Manter sempre os materiais de amplificação separados dos materiais de pré-amplificação.
Não abrir tubos de amostras ou quebrar o selo de placas na fase de pós-amplificação.
Eliminar material amplificado cuidadosamente e de acordo com as leis e regulamentos locais, de modo a
minimizar o risco de contaminação com produtos de amplificação.
Não utilizar materiais dedicados à preparação de amostras ou reagentes para o processamento de ácido
nucleico alvo.
Está disponível uma FDS mediante pedido ou pode ser acedida no site Web do produto.
Armazenamento e manuseamento de reagentes do kit
Armazenar o kit fechado entre 2 °C e 8 °C até à data de validade indicada na caixa exterior do kit.
A mistura principal reidratada pode ser armazenada à temperatura ambiente durante até 24 horas ou
entre 2 °C e 8 °C ou a ≤–20 °C durante até 2 dias. Deve colocar novamente a tampa na mistura principal
reidratada, vedá-la com parafilme e armazenar numa posição vertical. Proteger a mistura principal da luz
durante o armazenamento.
Indicações de instabilidade ou deterioração de reagentes
A nebulosidade da Solução de reidratação pode ser indicativa da deterioração do reagente. Contacte a
assistência técnica da Quidel para uma substituição.
Recolha, armazenamento e manuseamento de amostras
As amostras utilizadas para a validação do ensaio molecular VSR+MPVh da Quidel foram obtidas utilizando
técnicas padrão em doentes com sintomas de infeção do trato respiratório superior. Estas amostras foram
recolhidas, transportadas, armazenadas e processadas de acordo com a norma CLSI M41-A. Em suma, as
amostram devem ser transportadas refrigeradas a uma temperatura entre 2 C e 8 C e armazenadas
refrigeradas (2 C a 8 C) durante 72 horas antes do processamento. Qualquer amostra adicional restante deve
ser armazenada a ≤ -70 C.
Foram realizados diversos estudos para avaliar vários meios de transporte viral habitualmente utilizados a um
volume de 2 mL: M4, M4-RT, M5, M6 e UTM. Não foi observada qualquer diferença significativa no
desempenho do ensaio entre os cinco tipos diferentes de meios de transporte viral.
Armazenamento de extratos de ácido nucleico
Os eluatos podem ser armazenados à temperatura ambiente (entre 20 C e 25 C) durante até 4 horas, entre 2
C e 8 C durante 6 horas e a –20 °C durante 1 mês. O ARN extraído é estável durante até três ciclos de
congelação/descongelação quando armazenado a -20 °C.
Instruções de programação da extração de ácido nucleico
Nota: Cada execução de extração deve incluir um controlo de processamento/extração positivo de VSR/MPVh
(i.e. Conjunto #M107 de controlo molecular de VSR + MPVh da Quidel ou amostra de VSR ou MPVh
anteriormente caracterizada como positiva) e um controlo de processo negativo (i.e., meio de transporte viral
ou amostra de VSR e MPVh anteriormente caracterizada como negativa).
1. Ligue o instrumento e espere que a luz do mesmo apareça laranja. Em seguida, ligue o computador/inicie
o software easyMAG.
2.
Efetue a leitura do código de barras dos reagentes após pressionar os botões "Instrumento"
"Inventário de reagentes"
3.
.
Para introduzir amostras, pressione o botão "Utilização diária"
pedido"
a.
b.
c.
d.
e.
e
, que apresentará o ecrã "Definir
como predefinição. Selecione as seguintes definições:
ID da amostra: Introduza o nome da amostra utilizando o teclado.
Matriz:
Selecione Outra a partir do menu pendente.
Pedido:
Selecione Genérico a partir do menu pendente.
Volume (mL):
Selecione 0,200 a partir do menu pendente.
Eluato (µL):
Selecione 50 a partir do menu pendente.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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f.
g.
4.
Tipo:
Prioridade:
Primário
Normal
Ao pressionar o botão "Guardar"
, a amostra será apresentada na janela "Amostra não atribuída"
no lado esquerdo do ecrã. Pressione o botão "Introduzir novo pedido de extração"
, e repita o
processo para amostras adicionais. Em alternativa, podem ser introduzidas múltiplas amostras
pressionando o botão "Criar automaticamente novos pedidos de extração"
5.
.
Uma vez criadas todas as amostras, avance para "Organizar execuções", clicando no ícone
parte superior da página. Crie uma execução pressionado o botão "Criar execução"
nome de uma execução, ou utilize o predefinido.
6.
junto à
. Introduza o
Adicione amostras à execução utilizando o botão "Preencher automaticamente execução"
(preenche automaticamente até 24 amostras da "Lista de amostras não atribuídas" no lado esquerdo do
ecrã). Em alternativa, as amostras individuais podem ser movidas para dentro e fora da execução
utilizando os "Ícones de posicionamento"
à esquerda e à direita após a seleção da amostra
adequada. A ordem da amostra na execução pode ser alterada utilizando os botões "Mover pedido de
7.
8.
extração para cima/baixo"
.
Deve obter entre 1 e 3 recipiente(s) (para 8 a 24 amostras, respetivamente) e adicionar 20 µl de Controlo
do processo a cada poço de amostra utilizado.
Adicione 180 µl de cada amostra ao poço adequado conforme designado.
9.
Avance para para "Carregar execução", pressionando o botão
junto à parte superior do ecrã.
Introduza as pontas e o(s) recipiente(s) de amostra no instrumento
10. Introduza o(s) código(s) de barras do(s) recipiente(s) de amostra
11. Introduza o(s) código(s) de barras das partículas de sílica a serem utilizadas
12. Atribua partículas de sílica às amostras da seguinte forma:
a. Clique no símbolo dos reagentes por baixo do número 1 na imagem a seguir. O número de lote
das partículas de sílica deverá aparecer por baixo do separador Sílica no número 2 na imagem a
seguir.
b. Destaque e selecione as amostras na execução às quais é necessário atribuir partículas (na caixa
que contém o número 3 na imagem a seguir).
c.
d.
Clique no
ícone de posicionamento (por baixo do número 4 na imagem a seguir) para
atribuir o número do lote de sílica às amostras selecionadas.
Se o símbolo das partículas à direita do número 5 na imagem a seguir estiver selecionado, deverá
ser apresentado o número do lote de partículas de sílica para cada amostra.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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3
13. Imprima a lista de trabalho tocando no ícone "Carregar execução", pressionando em seguida o ícone
"Imprimir lista de trabalhos"
.
14. Pressione o botão "Distribuir lise"
. O processo de lise integrada demorará aproximadamente 12
minutos a terminar.
15. Por cada recipiente de amostra, prepare partículas magnéticas utilizando as pontas e o pipetador Biohit
para até oito reações, da seguinte forma:
a. Utilizando 1 ponta e o Programa 1, efetue a aspiração de 550 µl de água isenta de nuclease e
distribua para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml isento de DNase/RNase.
b. Agite por movimento rotacional a sílica magnética. Utilizando 1 ponta e o Programa 1, efetue a
aspiração de 550 µl de sílica magnética, distribua na água e misture com movimento rotacional
(vórtex).
c. Utilizando 1 ponta e o Programa 2, efetue a aspiração de 1050 µl da mistura de sílica magnética e
distribua novamente 25 µl para o mesmo tubo.
d. Distribua 125 µl da mistura de sílica magnética 8 vezes para 8 poços de uma placa de tiras ELISA.
Elimine a ponta.
e. Após a conclusão do processo de Lise (NB: o "Estado do instrumento" na parte inferior do ecrã
deve indicar "INATIVO"!), utilizando 8 pontas e o Programa 3, efetue a aspiração de 100 µl da
mistura de sílica magnética em poços de tiras, distribua 100 µl da mistura de sílica magnética em
poços de tiras, e efetue a aspiração de 100 µl da mistura de sílica magnética em poços de tiras.
f. Introduza as pontas no líquido contido nos recipientes da amostra. Efetue a aspiração de 800 µl
e, em seguida, distribua 900 µl da mistura de sílica magnética novamente para o recipiente.
Efetue a aspiração de 1000 µl da mistura de sílica magnética do recipiente, e distribua 1000 µl da
sílica magnética novamente para o recipiente. Repita mais duas vezes a aspiração/distribuição de
1000 µl.
16. Feche o instrumento, e pressione o botão "Iniciar"
para iniciar a execução.
17. Após a conclusão da execução, transfira o ácido nucleico purificado para tubos isentos de nuclease. Os
eluatos podem ser armazenados à temperatura ambiente (20 °C a 25 C) durante até 4 horas, entre 2 ºC e
8 ºC durante 6 horas e a –20 °C durante 1 mês. O ARN extraído é estável durante até três ciclos de
congelação/descongelação quando armazenado a -20 °C.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Programação inicial do termociclador
Instruções de programação do SmartCycler II
1.
2.
Inicie o pacote de software SmartCycler Dx Versão 3.0b da Cepheid.
Criar o ensaio molecular de VSR + MPVh da Quidel
a. Selecione o botão Definir ensaios na parte superior do ecrã
b. Atribua um nome ao ensaio:
i. Selecione o botão Novo no canto inferior esquerdo do ecrã.
ii. Digite "Molecular VSR + MPVh da Quidel" e selecione OK .
iii. "Molecular de VSR + MPVh da Quidel" será adicionado à parte superior da lista Nome de
ensaio localizada na parte superior esquerda do ecrã.
c. Defina os valores da análise: Na secção Tipo de ensaio: Investigar, selecione o separador Definições
de análise, e verifique se estão definidas as seguintes especificações:
i. Selecione FCTC25 a partir do menu pendente Conjunto de corantes.
ii. O menu pendente Tipo de análise deve estar definido como Qualitativo (predefinição).
iii. Na coluna Nome de canais, introduza "VSR" para o Canal 1, "MPVh" para o Canal 3 e "PRC"
para o Canal 4.
iv. Na coluna Utilização, selecione Alvo a partir dos menus pendentes para VSR e MPVh, e
selecione Controlo interno para PRC. Ao selecionar Controlo interno, será apresentada a janela
emergente a seguir. Selecione o botão Sim.
v. Na coluna Análise de curvas, introduza Curva primária para cada canal (VSR, MPVh, PRC)
(predefinição).
vi. Na coluna Definição de limiar, introduza Limiar manual para cada canal (VSR, MPVh, PRC)
(predefinição).
vii. Na coluna Unidades de fluorescência, limiar manual, introduza os seguintes limiares:
a. VSR: 20,0
b. MPVh: 10,0
c. PRC: 10,0
viii. Na coluna Ciclo mín. válido (percorra o ecrã para a direita caso não esteja imediatamente
visível), introduza 5 para cada canal (VSR, MPVh, PRC).
ix. Na coluna Ciclo máx. válido (percorra o ecrã para a direita caso não esteja imediatamente
visível), introduza 50 para cada canal (VSR, MPVh, PRC).
x. Na coluna Sub. segundo plano, utilize “ATIVADO” para cada canal (VSR, MPVh, PRC)
(predefinição).
xi. Na coluna Ciclo mín. em segundo plano, introduza 5 para cada canal (VSR, MPVh, PRC).
xii. Na coluna Ciclo máx. em segundo plano, introduza 35 para cada canal (VSR, MPVh, PRC).
xiii. Na coluna Ciclos méd. Boxcar, mantenha 0 para cada canal (VSR, MPVh, PRC) (predefinição).
xiv. Na coluna Limiar de parâmetro, introduza 20, 10, 10 para cada canal (VSR, MPVh, PRC)
(predefinição).
xv. Na coluna NC IC%, mantenha “NA” para cada canal (PRC) (predefinição).
xvi. Na coluna IC Delta, mantenha “NA” para cada canal (RSV, hMPV (predefinição)
xvii. Na secção Personalizar texto de resultado (a seguir à tabela), selecione Texto de resultado
baseado no organismo a partir do menu pendente. Será apresentada a janela emergente de
aviso a seguir. Selecione Sim.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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xviii. Selecione o botão Personalizar para abrir a janela de diálogo Texto de resultado baseado no
organismo. Selecione o botão Adicionar, introduza "VSR" na coluna Nome do organismo e
assinale a caixa RSV. Selecione novamente o botão Adicionar, introduza "MPVh" na coluna
Nome do organismo e assinale a caixa hMPV.
Clique em OK na parte inferior da janela emergente.
Defina as temperaturas e número de ciclos de RT-PCR da seguinte forma:
i. Fase 1
1. Fixação
2. Temperatura:
55,0
3. Segundos:
300
4. Ótica:
DESLIGADO
ii. Fase 2
1. Fixação
2. Temperatura:
60,0
3. Segundos:
300
4. Ótica:
DESLIGADO
iii. Fase 3
1. Fixação
2. Temperatura:
65,0
3. Segundos:
300
4. Ótica:
DESLIGADO
iv. Fase 4
1. Ciclo de 2 temperaturas
2. N.º de repetições:
50
3. Linha da primeira temperatura:
a. Temperatura:
92,0
b. Segundos:
5
c. Ótica:
DESLIGADO
4. Linha da segunda temperatura
a. Temperatura:
57,0
b. Segundos:
40
c. Ótica:
LIGADO
Guarde o protocolo selecionando o botão Guardar situado na parte inferior do ecrã.
d.
3.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
Página 10 de 28
Figura do Procolo molecular de VSR + MPVh da Quidel completo:
Instruções de programação do Applied Biosystems 7500 Fast DX
1.
2.
Inicie o pacote de software do ABI 7500 Fast Dx.
A janela de diálogo do documento de Iniciação rápida irá abrir-se. Selecione o botão Criar novo
documento para iniciar o Assistente de novo documento. Siga todos os passos para executar o protocolo
Molecular VSR + MPVh da Quidel.
a. Definir um documento: A maior parte das opções a seguir apresentadas devem ser
predefinições. Se não for este o caso, altere de forma adequada.
i. Confirme ou introduza a seguinte informação:
Ensaio: Curva padrão (Quantificação absoluta)
Recipiente: Transparente com 96 poços
Modelo: Documento em branco
Modo de
Fast 7500
execução:
Operador: o seu nome de operador
Comentários: SDS v1.4
Nome da placa: "Molecular de VSR + MPVh da Quidel"
ii. Selecione o botão Seguinte.
iii. Selecionar detetores: É necessário adicionar novos detetores para MPVh, VSR, bem
como o controlo do processo (PRC). Para cada alvo, selecione o botão Novo detetor
para abrir a janela emergente Novo detetor. Como alternativa, utilize o botão Criar
outro na janela emergente Novo detetor para os últimos dois detetores. Introduza
a seguinte informação para cada detetor:
Corante
Corante
Cor
Nome
marcador
supressor
VSR
FAM
(nenhum)
(Selecione)
MPVh Texas Red
(nenhum)
(Selecione)
PRC
Cy5
(nenhum)
(Selecione)
iv. Selecione uma cor única para representar cada detetor.
v. Realce os novos detetores e adicione a coluna Detetores no documento utilizando o
botão Adicionar.
vi. Selecione (nenhum) no menu pendente Referência passiva.
vii. Selecione o botão Seguinte.
viii. Selecione o botão Concluir sem definir quaisquer poços.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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b.
c.
O assistente irá fechar-se e o software irá abrir-se, apresentando o separador Configurar.
Esta operação irá apresentar a placa da amostra que foi configurada durante a iniciação
rápida. Não é necessário alterar qualquer informação aqui para a configuração inicial.
Defina o Protocolo do termociclador:
i. Selecione o separador Instrumento para configurar o número de ciclos e
temperaturas de RT-PCR do ensaio molecular de VSR + MPVh da Quidel.
ii. Em Perfil térmico deverá existir um protocolo de 2 fases predefinido. Cada fase terá
3 caixas de texto editáveis pelo utilizador. O valor da caixa superior representa o
número de repetições ou ciclos para essa fase. O valor da caixa do meio representa
a temperatura (˚C), e o valor da caixa inferior representa o tempo (minutos:
segundos).
iii. Efetue as seguintes alterações no Protocolo do termociclador predefinido:
1. Fase 1
a. Repetições:
1
b. Temperatura:
55
c. Tempo:
5:00
2. Selecione a barra entre Fase 1 e Fase 2. Selecione o botão Adicionar
fixação para adicionar outra fase.
3. Fase 2
a. Repetições:
1
b. Temperatura:
60
c. Tempo:
5:00
4. Selecione a barra entre Fase 2 e Fase 3. Selecione o botão Adicionar
fixação para adicionar outra fase.
5. Fase 3
a. Repetições:
1
b. Temperatura:
65
c. Tempo:
5:00
6.
7.
Fase 4 (Fase de amplificação de 2 passos)
a. Repetições: 10
b. Passo 1
i. Temperatura:
92
ii. Tempo:
0:05
c. Passo 2
i. Temperatura:
57
ii. Tempo:
0:40
Selecione a barra que se encontra do lado direito de Fase 4. Selecione o
botão Adicionar ciclo para adicionar outra fase.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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8.
Fase 5 (Fase de amplificação de 2 passos)
a. Repetições: 35
b. Passo 1
i. Temperatura:
92
ii. Tempo:
0:05
c. Passo 2
i. Temperatura:
57
ii. Tempo:
0:40
9. Se for adicionada uma fase incorreta, poderá removê-la pressionando o
botão Apagar após realçar a fase entre as linhas verticais.
iv. Em Definições, introduza os seguintes dados:
Volume da amostra
20 (predefinição)
(μL):
Modo de execução: 7500 Fast (predefinição)
Recolha de dados: (Fase 5, Passo 2 (57,0 durante 0:40)
NOTA: Não selecione a caixa de verificação junto de "Modo especialista".
v. Protocolo final
d.
Defina o limiar para cada analito da seguinte forma:
i. Selecione o separador Resultados.
ii. Selecione o separador Gráfico de amplificação.
iii. Selecione VSR no separador Detetor no canto superior direito.
iv. No bloco Definições de análise, defina Limiar como 8.0e4.
v. Selecione o botão de rádio Linha de referência automática.
vi. Repita iii-v para MPVh definindo Limiar como 5.4e4.
vii. Repita iii-v para PRC definindo Limiar como 2.7e4.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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viii. Repita iii-v para PRC definindo Limiar como 2.7e4.
e.
f.
Guarde o novo protocolo como modelo para utilizações futuras.
i. Na parte superior do ecrã, selecione Ficheiro e, em seguida, Guardar como.
ii. Guardar em: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\.
iii. Nome do ficheiro: "Ensaio molecular de VSR + MPVh da Quidel)".
iv. Guardar como tipo: "SDS Templates (*.sdt)".
Saia do software.
Instruções de programação do instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx
O ensaio Molecular da Quidel fornece um modelo predefinido para o ensaio num CD que tem de ser carregado
para o instrumento QuantStudio™ Dx. Contacte um representante da Quidel através do (800) 874-1517 (n.º de
telefone gratuito nos EUA) ou (858) 552-1100, de segunda a sexta-feira, entre as 8:00 e as 17:00 (hora da costa
leste dos EUA) para obter este CD. Estes modelos contêm os parâmetros de execução, pelo que não é
necessário programar o instrumento para começar a utilizar. Para instalar um documento de definição de
teste:
1. No separador QuantStudio™ Dx Software Home, clique em Gerir teste no painel Ferramentas.
2. No Menu de teste, clique em Instalar.
3. Navegue até ao ficheiro do seu documento de definição de teste (.tdd), selecione-o e clique em Abrir.
O Software QuantStudio™ Dx adiciona automaticamente o teste selecionado ao Menu de teste.
4. Clique em Fechar para fechar o Menu de teste e guardar as suas alterações.
Procedimento de ensaio
Execute os seguintes procedimentos a uma temperatura ambiente controlada entre 20 C e 25 C.
Procedimento de extração de ácido nucleico
Consulte as Instruções de programação do sistema NucliSENS easyMAG da bioMerieux a seguir.
1. Adicione 20 µL do Controlo do processo ao poço de extração de amostra.
2. Adicione 180 µL da amostra do doente ou controlo externo a um poço de extração de amostra.
3. Siga o procedimento de extração de acordo com as instruções do fabricante.
4. Os eluatos podem ser armazenados à temperatura ambiente (entre 20 C e 25 C) durante até 4
horas, entre 2 C e 8 C durante 6 horas e a -20 C durante 1 mês. O ARN extraído é estável durante
até três ciclos de congelação/descongelação quando armazenado -20 C.
Procedimento de reidratação da mistura principal
1. Determine o número de amostras a testar e obtenha o número correto de oito frascos de teste da
mistura principal liofilizada para efetuar o teste.
2. Guarde novamente os reagentes não utilizados em condições de armazenamento apropriadas.
3. Abra cuidadosamente a mistura principal para evitar a perturbação do grânulo.
4. Adicione 135 µL da Solução de reidratação à Mistura principal.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
Página 14 de 28
5.
6.
Coloque o frasco à temperatura ambiente durante 1-2 minutos para permitir a reidratação do
grânulo.
Mova suavemente a pipeta para cima e para baixo 2-3 vezes (evitando a formação de bolhas) antes
de colocar no primeiro tubo PCR ou poço da placa.
Nota: A mistura principal reidratada é suficiente para oito reações.
Nota: A mistura principal reidratada pode ser conservada à temperatura ambiente durante até 24
horas ou entre 2 C e 8 C ou a ≤–20 C durante até 2 dias. (Consulte a secção “Armazenamento e
manuseamento de reagentes do kit” para opções de armazenamento adicionais).
Procedimento de configuração de RT-PCR:
1.
2.
3.
4.
5.
Adicione 15 µL da mistura principal reidratada a cada tubo de reação ou poço da placa.
Adicione 5 µL do ácido nucleico extraído (amostra com o controlo de processo) aos tubos de reação
ou poços da placa. A mistura dos reagentes não é necessária.
Nota: Utilize um micropipetador com uma nova ponta não aerossol com cada amostra extraída.
Feche os tubos de reação ou vede a placa.
Nota: A Quidel sugere que cada execução do termociclador deve incluir um tubo de reação ou poço
da placa com um Controlo positivo externo de MPVh e VSR. (i.e., Conjunto #M107 de controlo
molecular de VSR + MPVh da Quidel ou amostra de VSR ou MPVh anteriormente caracterizada como
positiva) e um tubo de reação ou poço da placa com um Controlo negativo de acordo com as suas
políticas e práticas laboratoriais das entidades credenciadoras locais, estatais ou federais, conforme
aplicável.
Centrifugue os tubos de reação ou a placa durante pelo menos 15 segundos. Certifique-se de que a
totalidade do líquido se encontra na parte inferior do tubo.
Introduza os tubos ou a placa no termociclador.
Protocolo de amplificação no SmartCycler II da Cepheid
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Ligue o(s) bloco(s) do SmartCycler.
Inicie o pacote de software SmartCycler Dx Versão 3.0b.
Selecione o botão Criar execução na parte superior do ecrã para configurar a execução.
Em Nome da execução, introduza um nome para a execução atual (ex., AAMMDD-Quidel Molecular
RSV + hMPV).
Em Notas, introduza quaisquer notas sobre a execução para referência futura.
Em Ensaio, selecione o ensaio "Molecular de VSR + MPVh da Quidel" a partir do menu pendente.
Em Informações relativas ao ensaio, introduza o número do lote e data de validade do kit.
Para selecionar os poços que serão utilizados, proceda de uma das seguintes formas:
a. Para atribuir poços automaticamente, proceda da seguinte forma:
i. Em Número de amostras, introduza o número de amostras na caixa de texto fornecida.
ii. Selecione o botão Aplicar. O número de linhas introduzido será apresentado em Tabela de
localizações.
b. Para selecionar poços manualmente nos blocos do SmartCycler, proceda da seguinte forma:
i. Selecione o botão Adicionar/Remover localizações na parte inferior do ecrã.
ii. Esta operação irá abrir a janela emergente Selecionar localizações com duas colunas. A
coluna do lado esquerdo (Localizações) apresenta todas as localizações disponíveis e a
coluna do lado direito (Seleções) fixa todas as localizações selecionadas.
iii. Para selecionar todas as localizações, clique no botão Selecionar todas as localizações.
iv. Para selecionar localizações específicas, realce uma ou mais localizações e selecione a seta
para a direita para adicionar a(s) localização(ões) à coluna Seleções.
v. Selecione o botão OK para fechar a janela. As localizações selecionadas serão apresentadas
em Tabela de localizações.
Introduza os identificadores de amostra na coluna ID de amostra em Tabela de localizações (isto
pode também ser efetuado depois da execução ser iniciada).
Introduza quaisquer notas na coluna Notas e deixe as entradas da coluna Tipo de amostra como
"SPEC".
Selecione o botão Iniciar execução na parte inferior do ecrã.
Selecione o botão Ver resultados para ver o progresso da execução.
Guarde a execução depois desta ter terminado e antes de sair do software.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Protocolo de amplificação no termociclador Applied Biosystem 7500 Fast Dx
1.
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Ligue o 7500 Fast Dx.
Inicie o pacote de software do 7500 Fast Dx.
A janela de diálogo do Documento de Iniciação rápida irá abrir-se.
Clique em Criar um novo documento.
A maior parte das opções a seguir apresentadas devem ser predefinições. Se não for este o caso,
altere de forma adequada.
Ensaio:
Recipiente:
Modelo:
8.
Molecular de VSR + MPVh da Quidel
Fast 7500
Operador:
o seu nome de operador
Nome da placa:
7.
Transparente com 96 poços
Modo de
execução:
Comentários:
6.
Curva padrão (Quantificação absoluta)
SDS v1.4 (adicione mais se necessário)
AAMMDD-Quidel Molecular RSV + hMPV
Configurar a placa da amostra:
a. Nos separadores Configurar e Placa será apresentada a configuração da placa.
b. Selecione todos os poços que irão conter a amostra, clique no botão direito do rato e selecione
Inspetor de poços no menu pendente. Quando a janela emergente Inspetor de poços abrir,
selecione os detetores para VSR, MPVh e PRC.
c. Utilize a janela Inspetor de poços para introduzir o nome das amostras. É possível introduzir as ID
dos doentes na janela Inspetor de poços; contudo, recomenda-se que sejam introduzidas antes
da ressuspensão da mistura principal liofilizada, pós-execução ou utilização da função de
importação para minimizar o tempo que as reações de PCR ficarão à temperatura ambiente antes
da execução ser iniciada.
d. Guarde a execução como AAMMDD-Quidel Molecular RSV + hMPV.sds.
e. Irá abrir-se uma janela a solicitar o “Motivo de alteração da entrada”. Introduza “Configurar” e
quaisquer outros comentários relevantes para a execução.
Iniciar a PCR:
a. Selecione o separador Instrumento.
b. Introduza a placa de PCR de 96 poços na máquina.
c. Em Controlo do instrumento, selecione o botão Iniciar para dar início à execução.
Pós-PCR:
a. IMPORTANTE: Quando a execução terminar, pressione OK. Analise os dados pressionando o
botão “Analisar” no menu superior e guarde o ficheiro.
b. Guarde o ficheiro pressionando Guardar documento na barra de tarefas. Irá abrir-se uma janela a
solicitar o “Motivo de alteração da entrada”. Introduza “Análise de dados pós-execução” e
quaisquer outros comentários relevantes para a execução.
Protocolo de amplificação do instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx
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Ligue o QuantStudio Dx.
Escolha o modo IVD (diagnóstico in vitro) no instrumento.
Execute o conjunto de software IVD do QuantStudio Dx.
Introduza o nome de utilizador incluído em cada extração e a palavra-passe do sistema quando lhe
forem solicitados.
A janela Ecrã inicial irá abrir-se.
Na caixa Configurar, realce o nome do teste carregado anteriormente “Quidel Molecular RSV +
hMPV”
Clique no botão Configurar para iniciar uma execução de RT-PCR.
O ecrã Configurar, propriedades de teste será apresentado. Introduza a informação de execução
adequada.
a. Introduza o Nome da experiência (a predefinição inicia a execução com um carimbo de data e
hora).
b. Introduza a informação Código de barras da placa.
c. Registe os números de lote do material em Informações do reagente.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Guarde a execução com um identificador único como um ficheiro “.sds” (por exemplo,
AAMMDD-runID#-Quidel Molecular C difficile.sds).
e. Irá abrir-se uma janela a solicitar o “Motivo de alteração da entrada”. Introduza “Configurar” e
quaisquer outros comentários relevantes para a execução.
Na barra de menus esquerda, selecione Definir.
Edite as informações da amostra.
a. Introduza as informações da amostra específicas para cada poço apagando o identificador
predefinido (Doente 1, Doente 2, etc.) e introduzindo novas informações OU
b. Selecione Importar de ficheiro na parte superior do ecrã para carregar um mapa de placas
predefinido de um ficheiro de texto (delimitado por tabulações).
Na barra de menus esquerda, selecione Atribuir para se certificar da configuração adequada da placa.
Carregar a placa de amostra.
a. Ejete o tabuleiro de instrumentos.
b. Introduza a placa de PCR de 96 poços na máquina com o poço A1 convenientemente posicionado
no canto superior esquerdo.
c. Coloque o tabuleiro de instrumentos para dentro.
Iniciar a execução.
a. Na barra de menus esquerda, selecione Execução.
b. Clique no botão Iniciar execução verde na parte superior do ecrã.
i. Se lhe for solicitado, selecione o número de série específico do instrumento utilizado.
Quando a execução estiver completa, selecione Análise na barra de menus esquerda.
a. Guarde o ficheiro pressionando Guardar na barra de tarefas. Irá abrir-se uma janela a solicitar o
“Motivo de alteração da entrada”. Introduza “Análise de dados pós-execução” e quaisquer
outros comentários relevantes para a execução.
b. O Gráfico de amplificação será apresentado por predefinição. Para ver outros tipos de gráficos,
selecione-os a partir da barra de menus esquerda.
c. Para ver as informações de execução com valores Ct, selecione o separador Tabela de poços no
lado direito do ecrã.
Imprimir um relatório.
a. Na barra de menus superior, selecione Imprimir relatório. Personalize o conteúdo do relatório
selecionando ou retirando a seleção de caixas na janela do relatório.
b. Selecione o botão “Imprimir relatório” na parte inferior da caixa de diálogo.
Exportar ficheiros de dados.
a. Na barra de menus esquerda, selecione Exportar.
b. Introduza Localização do ficheiro a exportar OU clique em Pesquisar para encontrar o caminho
pretendido.
c. O Nome do ficheiro a exportar será, por predefinição, o nome da execução guardada.
d. Selecione Excel como o tipo de ficheiro.
e. Personalize o relatório de dados exportados alternando entre os separadores fornecidos e
selecionado ou retirando a seleção de opções.
Selecione Iniciar exportação na parte inferior do ecrã.
Interpretação de resultados
Interpretação de resultados através do SmartCycler II da Cepheid
1. Selecione o separador Ver resultados depois da execução ter terminado.
2. Selecione o separador Resultados das amostras.
3. O software do SmartCycler II irá comunicar automaticamente se ARN viral do MPVh e/ou VSR foi detetado
nas amostras ou se a execução era inválida (inconclusiva).
4. Pode encontrar mais informações nos respetivos separadores de cada analito na mesma janela. Em caso
de identificação positiva de VSR ou MPVh (ou ambos), o resultado de PRC não é aplicável. A PRC só é
necessária para identificações negativas.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Interpretação dos resultados do ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel no SmartCycler II da Cepheid
Processo
Resultado do
Resultado do
VSR
MPVh
Interpretação de resultados
ensaio
controlo
Ácido nucleico do MPVh e VSR não detetado; PRC
Negativo
Aprovado
NEG
NEG
detetado
VSR positivo
NA*
POS
NEG
Ácido nucleico do VSR detetado
MPVh positivo
NA*
NEG
POS
Ácido nucleico do MPVh detetado
VSR e MPVh
NA*
POS
POS
Ácido nucleico do MPVh e VSR detetado**
positivos
Inconclusivos - inibição de PCR ou falha do
reagente.
Teste novamente a mesma amostra purificada. Se
Inválido
Reprovado
NEG
NEG
este teste também for inválido, extraia e teste
novamente outra alíquota da mesma amostra ou
obtenha uma nova amostra e teste novamente.
*Não é necessário qualquer valor para o Controlo de processo para fazer uma identificação positiva.
** Infeções duplas são raras. Repita o teste utilizando a mesma amostra purificada. Se a repetição do teste
confirmar este resultado, recolha e teste uma nova amostra. Contacte a Quidel se múltiplas amostras
fornecerem este resultado.
Código de erro 3079: O código de erro/aviso 3079 pode ser observado com as amostras positivas de VSR e/ou
MPVh. O código de erro/aviso 3079 ocorre quando o sinal de fluorescência (RFU) é demasiado elevado. Neste
caso, todos os resultados para essa amostra são comunicados pelo software Dx como ND (Não determinado).
Se um valor Ct ≥ 5 for comunicado para qualquer um dos vírus, os resultados da amostra podem ser registados
como Positivos para o vírus correspondente. Se o valor Ct for <5 o vírus correspondente é comunicado como
Negativo.
Interpretação dos resultados utilizando o ABI 7500 Fast Dx
Interpretação do resultados do Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel no termociclador 7500 Fast Dx
Detetor:
Resultado
Detetor:
Detetor:
Controlo do
Interpretação de resultados
do ensaio
VSR
MPVh
processo
Não
Não
Nenhum ARN viral do MPVh ou VSR
Negativo
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
determinado
determinado
detetado; PRC detetada
VSR
Não
ARN viral do VSR detetado
5,0≤ Ct ≤35,0
NA*
positivo
determinado
MPVh
Não
5,0 ≤ Ct ≤
NA*
ARN viral do MPVh detetado
positivo
determinado
35,0
VSR e MPVh 5,0≤ Ct ≤35,0
5,0≤ Ct ≤35,0
NA*
ARN viral do VSR e MPVh detetados**
Nenhum ARN viral do MPVh ou VSR
detetado e nenhuma PRC detetada;
teste inválido.
Teste novamente a mesma amostra
Não
Não
Não
Inválido
purificada. Se este teste também for
determinado
determinado
determinado
inválido, extraia e teste novamente
outra alíquota da mesma amostra ou
obtenha uma nova amostra e teste
novamente.
*Não é necessário qualquer valor Ct para fazer uma identificação positiva.
** Infeções duplas são raras. Repita o teste utilizando a mesma amostra purificada. Se a repetição do teste
confirmar este resultado, recolha e teste uma nova amostra. Contacte a Quidel se múltiplas amostras
fornecerem este resultado.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Interpretação dos resultados utilizando o instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx
Interpretação dos resultados do ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel no
Instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx da Life Technologies
Detetor:
Detetor:
Resultado
Detetor:
Interpretação de
VSR
Controlo do
do ensaio
MPVh
resultados
processo
Nenhum ARN viral do
Nenhum valor Ct
Nenhum valor Ct
Valor Ct
Negativo
MPVh ou VSR detetado;
comunicado
comunicado
comunicado
PRC detetada
VSR
Valor Ct
Nenhum valor Ct
ARN viral do VSR detetado
NA*
positivo
comunicado
comunicado
MPVh
Nenhum valor Ct
ARN viral do MPVh
Valor Ct comunicado
NA*
positivo
comunicado
detetado
VSR e
Valor Ct
ARN viral do VSR e MPVh
Valor Ct comunicado
NA*
MPVh
comunicado
detetados**
Nenhum ARN viral do
MPVh ou VSR detetado e
nenhuma PRC detetada;
teste inválido.
Teste novamente a mesma
Nenhum valor Ct
Nenhum valor Ct
Nenhum valor Ct amostra purificada. Se este
Inválido
comunicado
comunicado
comunicado
teste também for
inválido, extraia e teste
novamente outra alíquota
da mesma amostra ou
obtenha uma nova amostra
e teste novamente.
*Não é necessário qualquer valor Ct para fazer uma identificação positiva.
** Infeções duplas são raras. Repita o teste utilizando a mesma amostra purificada. Se a repetição do teste
confirmar este resultado, recolha e teste uma nova amostra. Contacte a Quidel se múltiplas amostras
fornecerem este resultado.
Controlo de qualidade
O ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel inclui vários controlos para monitorizar o desempenho do ensaio.
1. O Controlo do processo deve ser utilizado durante a extração e amplificação no ensaio. Este controlo deve
ser adicionado a cada alíquota da amostra antes da extração.
2. Os controlos de VSR/MPVh positivos externos à venda no mercado podem ser tratados como uma
amostra do doente e devem ser utilizados de acordo com as normas do seu laboratório. Podem ser
utilizadas amostras de VSR ou MPVh anteriormente caracterizadas como positivas em vez de um controlo
de VSR/MPVh à venda no mercado.
3. Os meios de transporte de vírus ou amostras anteriormente caracterizadas como negativas podem ser
utilizados como controlo negativo externo. Isto deve ser tratado como uma amostra do doente e deve ser
realizado de acordo com as normas atuais do laboratório.
Limitações
Este teste não se destina a diferenciar os subtipos de VSR ou MPVh. Terão de ser realizados testes
adicionais se for necessário efetuar a diferenciação de subtipos.
Os resultados negativos não excluem uma infeção com VSR ou MPVh e não devem ser a única base de
uma decisão de tratamento.
Tal como acontece com outros ensaios deste tipo, existe o risco de resultados falsos negativos devido à
presença de variantes de sequência no alvo viral.
A recolha, armazenamento ou transporte incorretos podem dar origem a resultados falsos negativos.
Os inibidores presentes na amostra e/ou erros no seguimento do procedimento de ensaio podem originar
resultados falsos negativos.
Um profissional de saúde qualificado deve interpretar os resultados do ensaio em conjunto com o historial
médico, sintomas e sinais clínicos do doente, e os resultados de outros testes de diagnóstico.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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O desempenho do ensaio não foi estabelecido em indivíduos que receberam a administração de
corticóides por via nasal.
O desempenho do ensaio não foi estabelecido em indivíduos que receberam a administração da vacina da
Influenza por via nasal.
Os resultados dos estudos analíticos mostram que a um LD de 2x, o subtipo B2 do MPVh foi inibido pelo
VSR a um nível 10.000 superior ao LD comunicado do VSR no ABI 7500 Fast Dx. O mesmo estudo realizado
no SmartCycler II da Cepheid demonstrou que a um LD de 2x, o subtipo B2 do MPVh foi inibido pelo VSR a
um log. de nível 3 superior ao LD comunicado do VSR. A incidência de co-infeção com VSR e MPVh
observada no atual ensaio clínico molecular de VSR+MPVh da Quidel foi de 0,1% (1/949). A incidência é
baixa, e pode variar em função da prevalência e população testada.
Valores previstos
Foram realizados estudos clínicos com o ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel utilizando a plataforma
SmartCycler® II da Cepheid e o Applied Biosystems® 7500 Fast Dx. Foram realizados testes com amostras
prospetivas recebidas de todo o território dos Estados Unidos no inverno de 2012 (janeiro de 2012 a março de
2012). A tabela a seguir apresenta o valor previsto para cada vírus nos dois instrumentos.
Valores previstos para o inverno de 2012
Instrumento
VSR
SmartCycler® II da Cepheid
15,6% (158/1014)
Applied Biosystems® 7500 Fast Dx
16,4% (166/1012)
MPVh
14,6% (148/1014)
15,5% (157/1012)
Foi realizado um estudo clínico com o ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel utilizando o Instrumento de
PCR em tempo real QuantStudio Dx da Life Technologies. Foram realizados testes com amostras prospetivas
recebidas de todo o território dos Estados Unidos no inverno de 2013 (janeiro de 2013 a fevereiro de 2013). A
tabela a seguir apresenta o valor previsto para cada vírus nos dois instrumentos.
Valores previstos para o inverno de 2013
Instrumento
VSR
Instrumento de PCR em tempo real
18,6% (59/317)
QuantStudio Dx da Life Technologies
MPVh
14,4% (45/317)
Desempenho clínico
As características de desempenho do ensaio molecular VSR + MPVh da Quidel utilizando o instrumento
SmartCycler® II da Cepheid e a plataforma Applied Biosystems® 7500 Fast Dx foram estabelecidas durante um
estudo prospetivo durante a época de vírus respiratório de 2012 (janeiro a março de 2012). As amostras
utilizadas para este estudo foram recolhidas no momento (414) e foram também recolhidas amostras obtidas
através de esfregaço congeladas (600) para testes de rotina do vírus respiratório em quatro localizações em
todo o território dos Estados Unidos. Foi recolhida e testada uma única amostra por doente (amostra direta e
cultura com DFA). As amostras residuais foram extraídas com o easyMAG da bioMérieux e testadas com o
ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel utilizando os instrumentos ABI 7500 Fast Dx e SmartCycler II da
Cepheid. Foram enviadas alíquotas de cada amostra para uma localização central para um teste molecular de
MPVh aprovado pela FDA.
Dados demográficos por faixa etária
Applied BioSystem 7500 Fast Dx
Grupo
etário
(idade)
VSR
positivo Prevalência
SmartCycler II da Cepheid
MPVh
total
VSR
MPVh
total
positivo Prevalência testado positivo Prevalência positivo Prevalência testado
<1
72
28,3%
38
15,0%
254
71
27,5%
35
13,6%
258
1a5
72
19,9%
76
21,5%
354
67
19,0%
73
20,7%
352
6 a 10
6
4,5%
17
12,7%
134
6
4,5%
16
11,9%
134
11 a 15
3
4,8%
7
11,3%
62
3
4,8%
6
9,7%
62
16 a 21
3
9,1%
1
3,0%
33
3
9,1%
1
3,0%
33
>21
10
5,7%
18
10,3%
175
8
4,6%
17
9,7%
175
Total
166
16,4%
* Duas amostras inválidas.
157
15,5%
1012*
158
15,6%
148
14,6%
1014
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Estudo clínico prospetivo - SmartCycler® II da Cepheid
Mil e catorze (1014) amostras foram testadas tanto pelo método comparativo como de estudo para VSR. Uma
(1) amostra estava contaminada e três (3) eram tóxicas na cultura das células (0,4%). Estas quatro (4) amostras
foram excluídas da análise. Os resultados das restantes mil e dez (1010) amostras estão detalhados na tabela a
seguir.
Localização combinada - Vírus sincicial respiratório
DSFA e cultura de células c/
IC de 95%
DFA
POS
NEG
Total
Sensibilidade
97,9% 93,9%
99,3%
Molecular de VSR + POS
137
21*
158
Especificidade
97,6% 96,3%
98,4%
MPVh da Quidel
NEG
3
849
852
Total
140
870
1010
* Todas as amostras originalmente discordantes foram positivas para VSR por um ensaio de RT-PCR aprovado
pela FDA.
Novecentas e sessenta (960) amostras foram testadas pelos dispositivos comparativos e de estudo para MPVh
(o dispositivo comparador não estava disponível para realizar testes de comparação para cinquenta e quatro
(54) amostras). Nove (9) amostras foram inválidas no dispositivo comparativo (0,9%). Estas nove (9) amostras
foram excluídas da análise. Os resultados das restantes novecentas e cinquenta e uma (951) amostras estão
detalhados na tabela a seguir.
Localização combinada - Metapneumovírus humano
Teste molecular de MPVh
aprovado pela FDA
POS
NEG
Total
145
3
148
Molecular de VSR + POS
MPVh da Quidel NEG
5
798
803
Total
150
801
951
Acordo percentual positivo
Acordo percentual negativo
96,7%
99,6%
IC de 95%
92,4% 98,6%
98,9% 99,9%
Estudo clínico prospetivo - Applied Biosystems® 7500 Fast Dx
Mil e catorze (1014) amostras foram testadas tanto pelo método comparativo como de estudo para VSR. Uma
(1) amostra estava contaminada e três (3) eram tóxicas na cultura das células (0,4%). Duas (2) amostras foram
inválidas nos métodos de estudo (0,2%). Estas seis (6) amostras foram excluídas da análise. Os resultados das
restantes mil e oito (1008) amostras estão detalhados na tabela a seguir.
Localização combinada - Vírus sincicial respiratório
DSFA e cultura de células c/
DFA
IC de 95%
POS
NEG
Total
Sensibilidade
98,6% 94,9%
99,6%
138
28*
166
Especificidade 96,8% 95,4%
97,8%
Molecular de VSR + POS
MPVh da Quidel
NEG
2
840
842
Total
140
868
1008
* 25 das 28 amostras originalmente discordantes foram positivas para VSR por um ensaio de RT-PCR aprovado
pela FDA.
Novecentas e sessenta (960) amostras foram testadas pelos dispositivos comparativos e de estudo para MPVh
(o dispositivo comparador não estava disponível para realizar testes de comparação para cinquenta e quatro
(54) amostras). Nove (9) amostras foram inválidas no dispositivo comparativo (0,9%). Duas (2) amostras foram
inválidas nos métodos de estudo (0,2%). Estas onze (11) amostras foram excluídas da análise. Os resultados
das restantes novecentas e quarenta e nove (949) amostras estão detalhados na tabela a seguir.
Localização combinada - Metapneumovírus humano
Teste molecular de MPVh
aprovado pela FDA
POS
NEG
Total
147
9
156
Molecular de VSR + POS
MPVh da Quidel NEG
3
790
793
Total
150
799
949
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
Acordo percentual positivo
Acordo percentual negativo
98,0%
98,9%
IC de 95%
94,3% 99,3%
97,9% 99,4%
Página 21 de 28
Estudo clínico prospetivo - QuantStudio Dx da Life Technologies
As características de desempenho do ensaio molecular VSR + MPVh da Quidel utilizando o instrumento de PCR
em tempo real QuantStudio Dx da Life Technologies foram estabelecidas durante um estudo prospetivo
durante a época do vírus respiratório de 2013 (janeiro a fevereiro de 2013). As amostras utilizadas para este
estudo foram amostras obtidas através de esfregaço (317) recolhidas no momento para realização de testes
de vírus respiratório nos Estados Unidos. Foi recolhida e testada uma única amostra por doente (amostra
direta e cultura com DFA) para VSR imediatamente após a colheita. As amostras foram extraídas com o
easyMAG da bioMériuex e testadas com o ensaio Molecular de VSR + MPVh da Quidel. Foram enviadas
alíquotas de cada amostra para uma localização central para serem testadas com um teste molecular de MPVh
aprovado pela FDA.
Vírus sincicial respiratório
DSFA e cultura de células c/
IC de 95%
DFA
POS
NEG
Total
Sensibilidade
100%
92%
100%
Molecular de VSR + POS
45
14*
59
Especificidade
95%
92%
97%
MPVh da Quidel
NEG
0
258
258
Total
45
272
317
* Das catorze (14) amostras de VSR falsas positivas testadas pelo ensaio QM RSV + hMPV, nove (9) obtiveram
um resultado positivo para VSR utilizando um ensaio com certificação CE.
Metapneumovírus humano
Teste molecular de MPVh
aprovado pela FDA
POS
NEG
Total Acordo percentual positivo
43
2
45
Acordo percentual negativo
Molecular de VSR + POS
MPVh da Quidel NEG
0
268
268
Total
43
270
313
* Quatro amostras são INVÁLIDAS no comparador e não foram incluídas nesta tabela
100%
99%
IC de 95%
92%
100%
97%
100%
Desempenho analítico
Nível de deteção
A sensibilidade analítica (limite de detecção ou LD) do ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel foi
determinada através da utilização de culturas de 2 estirpes do VSR e 4 estirpes do MPVh (1 A1, 1 A2, 1 B1, 1
B2) quantificadas (TCID50/ml) diluídas em série em matriz nasofaríngea negativa. Cada diluição foi extraída em
réplicas de 20 por concentração de vírus utilizando o sistema NucliSENS easyMAG e testada nas três
plataformas (apenas os subtipos de MPVh A2 e B2 foram testadas no QuantStudio). A sensibilidade analítica
(LD) foi definida como a concentração mais baixa, na qual 95% de todas as réplicas obtiveram um teste com
resultado positivo.
Resumo do valor LD
Vírus
VSR A
VSR B
MPVh A2
MPVh A2
MPVh B1
MPVh B2
LD de TCID50/mL
7500 Fast Dx
6.29E-01
7.5E-01
1.7E+01
4.17E+00
1.05E+00
3.21E+00
LD de TCID50/ml
SmartCycler
1.89E+00
2.25E+00
2.65E+01
4.17E+00
7.88E+00
9.63E+00
LD de TCID50/mL
QuantStudio
6.29E-01
2.25E-01
2.91E+00
2.25E+00
Reatividade analítica (Inclusividade)
A reatividade do ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel foi avaliada em relação a estirpes do VSR e do
MPVh. O painel de reatividade analítica era composto por 5 estirpes do VSR e 11 estirpes do MPVh (2 A-1, 2 A2, 2 B-1, 4 B-2 e 1 não tipável). Cada membro do painel foi extraído utilizando o instrumento NucliSens
easyMAG e testado em triplicado nas plataformas SmartCycler II da Cepheid e 7500 Fast Dx da ABI.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
Página 22 de 28
Painel de inclusividade do VSR
Subtipo
Estirpe
TCID50/mL
A (NIBSC)
A
B
B
B
A-2
A-2
Washington
9320
CH9318(1B)
N/A
5.67E+00
2.25E+00
2.25E+00
2.25E+00
Ensaio Molecular de
VSR + MPVh da Quidel
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Painel de inclusividade do MPVh
Subtipo
Estirpe
TCID50/mL
A1
A1
A2
A2
B1
B1
B2
B2
B2
B2
MPVh (NIBSC)
IA3-2002 G Gene
IA10-2003
IA14-2003 G Gene
Clinical Isolate
Peru2-2002 G Gene
Peru3-2003 G Gene
Peru1-2002 G Gene
Peru6-2003
IA18-2003 G Gene
IA18-2003 G Gene
N/A
7.95E+01
7.95E+01
1.25E+1
1.25E+1
2.36E+01
2.36E+01
9.63E+00
9.63E+00
9.63E+00
9.63E+00
N/A
Ensaio Molecular de
VSR + MPVh da Quidel
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
O ensaio molecular de VSR + MPVh da Quidel detetou a totalidade das estirpes do VSR e MPVh testadas tanto
na plataforma 7500 Fast Dx da ABI como na plataforma SmartCycler® II da Cepheid.
Estudo de reprodutibilidade
A reprodutibilidade do ensaio molecular Influenza VSR + MPVh da Quidel foi avaliada em três laboratórios. A
reprodutibilidade foi avaliada através de um painel de quatro amostras simuladas que inclui amostras
negativas e amostras de VSR e MPVh positivas médias e positivas baixas e negativas altas. Painéis e controlos
foram testados em cada instalação por 2 operadores durante 5 dias (teste em triplicado x 2 operadores x 5
dias x 3 locais = 90 resultados por nível para cada vírus). Os valores de LD tiveram como base valores os valores
obtidos no estudo de LD. Os painéis e controlos foram extraídos com o sistema easyMAG da bioMérieux e
testados no SmartCycler II da Cepheid e no Applied Biosystems 7500 Fast DX.
Resultados de reprodutibilidade - SmartCycler II da Cepheid
Instalação 1
ID de membro do
painel
VSR negativo alto
0,05x LD
VSR positivo baixo
2x LD
VSR positivo médio 5x
LD
VSR negativo
Controlo de VSR
negativo
Controlo de VSR
positivo
MPVh negativo alto
0,15x LD
MPVh positivo baixo
2x LD
MPVh positivo médio 5x
LD
Resultados
AVE Ct*
positivos
Instalação 2
%CV
Resultado
AVE Ct*
s positivos
Instalação 3
%CV
Resultad
os
AVE Ct*
positivos
%CV
Total de
resultad
os
positivo
s
8/30
44.3
9.3
6/30
47.4
5.4
1/30
48.7
N/A
15/90
30/30
31.2
7.3
30/30
31.4
4.1
30/30
30.9
1.5
90/90
30/30
29.6
5.7
30/30
29.7
3.1
30/30
29.5
2.0
90/90
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
30/30
30.0
1.8
30/30
31.0
3.3
30/30
30.6
1.2
90/90
12/30
34.3
8.3
6/30
41.8
6.3
8/30
34.9
6.4
26/90
30/30
31.1
6.7
30/30
32.2
6.2
30/30
31.1
3.3
90/90
30/30
29.3
2.0
30/30
29.9
3.2
30/30
29.8
3.4
90/90
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
Página 23 de 28
Resultados de reprodutibilidade - SmartCycler II da Cepheid
Instalação 1
ID de membro do
painel
MPVh negativo
Controlo de MPVh
negativo
Controlo de MPVh
positivo
Resultados
AVE Ct*
positivos
Instalação 2
%CV
Resultado
AVE Ct*
s positivos
Instalação 3
%CV
Resultad
os
AVE Ct*
positivos
%CV
Total de
resultad
os
positivo
s
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
30/30
30.3
1.4
30/30
30.9
1.9
30/30
30.8
2.5
90/90
* Ct médio com base na média apenas de resultados positivos. Os valores Ct de 0 não foram incluídos neste
cálculo.
Resultados de reprodutibilidade - Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Instalação 1
ID de membro do
painel
VSR negativo alto
0,05x LD
VSR positivo baixo
2x LD
VSR positivo médio 5x
LD
VSR negativo
Controlo de VSR
negativo
Controlo de VSR
positivo
MPVh negativo alto
0,15x LD
MPVh positivo baixo
2x LD
MPVh positivo médio 5x
LD
MPVh negativo
Controlo de MPVh
negativo
Controlo de MPVh
positivo
Resultados
AVE Ct*
positivos
Instalação 2
%CV
Resultado
AVE Ct*
s positivos
Instalação 3
%CV
Resultad
os
AVE Ct*
positivos
%CV
Total de
resultad
os
positivo
s
14/30
30.7
8.3
3/30
33.8
2.4
9/30
32.3
4.0
26/90
30/30
23.7
7.4
30/30
23.8
3.1
30/30
23.4
4.5
90/90
30/30
20.5
4.0
30/30
21.8
2.2
29/29
21.1
2.2
89/89
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
30/30
19.7
6.5
30/30
20.0
8.5
30/30
19.6
1.9
90/90
14/30
24.9
19.5
6/30
29.1
10.2
10/30
25.1
16.9
30/90
30/30
21.0
8.7
30/30
21.5
4.1
30/30
21.6
5.8
90/90
30/30
18.9
3.3
30/30
19.6
3.0
29/29
19.2
2.6
89/89
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
30/30
19.7
3.9
30/30
20.0
1.7
30/30
19.9
1.4
90/90
* Ct médio com base na média apenas de resultados positivos. Os valores Ct de 0 não foram incluídos neste
cálculo.
Especificidade analítica - Reatividade cruzada
A especificidade analítica do ensaio molecular de VSR + MPVh da Quidel foi avaliada através do teste de um
painel composto por 34 vírus, 26 bactérias e 1 estirpe fúngica representativos dos patogénios respiratórios
comuns ou da flora normalmente presente na nasofaringe. As amostras foram extraídas utilizando o
instrumento NucliSENS easyMAG e testado em triplicado no Applied Biosystems 7500 Fast Dx e no SmartCycler
II da Cepheid. A especificidade analítica do ensaio molecular de VSR + MPVh da Quidel foi de 100%.
Os organismos utilizados para o estudo foram os seguintes:
Virus
Influenza A/Mexico/4108/2009, Influenza B/Florida/04/2006, Adenovírus 1/Adenóide 71, Adenovírus 2,
Adenovírus 3, Adenovírus 4, Adenovírus 5, Adenovírus 7, Adenovírus 11, Adenovírus 14, Adenovírus 31,
Coronavírus NL63, Coronavírus 229E, Coronavírus OC43, Vírus de Coxsackie B4, Vírus de Coxsackie
B5/10/2006, Citomegalovírus, Ecovírus 7, Ecovírus 9, Ecovírus 6, Ecovírus 11, Enterovírus 71, Enterovírus 70,
Vírus de Epstein-Barr, Estirpe Maclnytre do VHS de Tipo 1, Rhinovírus Humano, Estirpe G do VHS de Tipo 2,
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
Página 24 de 28
Vírus do sarampo, Vírus da papeira, Parainfluenza de Tipo 1, Parainfluenza de Tipo 2, Parainfluenza de Tipo 3,
Parainfluenza de Tipo 4, Vírus Varicela Zoster
Bactérias
Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica, Chlamydophila pneumonia, Chlamydia trachomatis, Legionella
pneumophila, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycoplasma
pneumoniae, Haemophilus influenza, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, Neisseria mucosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Moraxella
catarrhalis, Corynebacterium diptheriae, Lactobacillus plantarum, Streptococcus pneumonia, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus salivarius, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus.
Fungos
Candida albicans
Especificidade analítica - Substâncias interferentes
O desempenho do ensaio molecular de VSR + MPVh da Quidel foi avaliado com substâncias potencialmente
interferentes passíveis de estar presentes em amostras nasofaríngeas. As substâncias potencialmente
interferentes foram avaliadas utilizando VSR B e MPVh B1 a uma concentração de 3x e 10x LD. Não foi
observada interferência causada pelas substâncias testadas a 3x ou 10x LD.
Nome da substância
Mucina (Glândula submaxilar de bovino, tipo I-S)
Sangue (humano), EDTA anticoagulado
Neo-sinefrina
Spray nasal Afrin
Gel nasal líquido homeopático anti-gota que não
provoca sonolência para alívio de alergias Zicam
Concentração testada
60 µg/mL
2% (vol/vol)
15% (vol/vol)
15% (vol/vol)
Spray nasal salino
15% (vol/vol) da dose
Pastilhas para a garganta
Zanamivir
Tobramicina
Mupirocina
Fosfato de oseltamivir
5% (vol/vol)
0,68 g/mL; 1/18 de pastilha,
esmagada; ingredientes ativos:
1,7 mg/mL de mentol
3,3-5 mg/mL
4,0 µg/mL
6,6-10 mg/mL
7,5-25 mg/mL
Estudos de transferência e contaminação cruzada
Num estudo interno realizado, não foi observada transferência/contaminação cruzada com o ensaio molecular
de VSR + MPVh da Guidel utilizando o instrumento automatizado de extração de ácido nucleico NucliSENS
easyMAG e as três plataformas de termociclador. Applied Biosystems 7500 Fast Dx ou SmartCycler da Cepheid.
Assistência técnica e ao cliente
Para efetuar uma encomenda ou solicitar assistência técnica, contacte um representante da Quidel através do
(800) 874-1517 (n.º de telefone gratuito nos EUA) ou (858) 552-1100 (fora dos EUA), de segunda a sexta-feira,
entre as 8:00 e as 17:00 (hora da costa leste dos EUA). As encomendas poderão igualmente ser efetuadas por
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encontrar informações adicionais sobre a Quidel, os nossos produtos e distribuidores no site Web quidel.com.
Propriedade intelectual
Marcas registadas
Smartcycler® é uma marca comercial registada da Cepheid Corporation. Applied Biosystems® é uma marca
comercial registada da Life Technologies. NucliSENS® e easyMAG® são marcas comerciais registadas da
bioMerieux, Inc. TaqMan® é uma marca comercial registada da Roche. CAL Flour® Red 610 e Quasar®670 são
marcas comerciais registadas da BioSearch Technologies, Inc.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Patentes
Os compostos corantes deste produto são vendidos sob licença da BioSearch Technologies, Inc. e são
protegidos por patentes norte-americanas e mundiais emitidas ou pendentes de aprovação.
A aquisição deste produto concede direitos ao comprador ao abrigo de determinadas patentes da Roche de
utilização exclusiva na prestação de serviços de diagnóstico in vitro humano. Não é concedida aqui qualquer
patente geral ou outra licença de qualquer tipo para além deste direito de utilização específico resultante da
compra.
Este produto está abrangido pelas patentes norte-americanas n.º 7,531,342; 7,449,374; patentes homólogas
internacionais; outras patentes norte-americanas e internacionais pendentes de aprovação.
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Glossário
Conteúdo/Contém
Controlo
Consulte as instruções de utilização
Utilização prevista
96
Contém o suficiente para 96 determinações
Riscos biológicos
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
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Referências
1
2
3
4
5
6
7
8
Glezen et. Al. 1986. American journal of diseases of children (1960) 140(6): 543–6.
Hall, Caroline Breese. et al. 2009. New England Journal of Medicine 360(6): 588–98
Papadopoulos, N. G. et. al. 2004. Respiratory Med. 98 :879-882.
van den Hoogen B.G., et. al. Nat Med 2001;7:719 –24.
Sloots T.P. et al. 2006 EID. 12:1236-66.
Ebihara, T. et al. 2004 J Med Virol 70:281-283.
van den Hoogen, B. G. et al. 2004. EID. 10:658-666.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Viral Culture; Approved Guidelines. CLSI document M41-A [ISBN
1562386239] Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
Pennsylvania 19087-1898, USA 2006.
M103 - Kit de ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel
MDSS GmBH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Alemanha
Quidel Corporation
Worldwide Headquarters
10165 McKellar Court
San Diego, CA 92121 EUA
quidel.com
M103en v2013MAR13
Ensaio molecular de VSR+MPVh da Quidel (CE)
Página 28 de 28
Ensayo RSV+hMPV
Instrucciones de uso
Para la detección cualitativa y la identificación del virus sincicial respiratorio y el ARN viral
del metaneumovirus humano extraído del exudado nasal, muestras de exudado
nasofaríngeo.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Contenido
Indicaciones ............................................................................................................................................ 3
Resumen y explicación ............................................................................................................................ 3
Principios del procedimiento .................................................................................................................. 3
Materiales proporcionados..................................................................................................................... 4
Materiales opcionales ............................................................................................................................. 4
Materiales necesarios pero no proporcionados ..................................................................................... 5
Advertencias y precauciones .................................................................................................................. 5
Conservación y manipulación de los reactivos del kit ............................................................................ 6
Recolección, conservación y manipulación de muestras ....................................................................... 6
Conservación de los extractos de ácidos nucleicos ................................................................................ 6
Instrucciones de programación para la extracción de ácidos nucleicos ................................................. 6
Programación inicial del termociclador .................................................................................................. 9
Instrucciones de programación del SmartCycler II ............................................................................. 9
Instrucciones de programación de Applied Biosystems 7500 Fast DX .............................................11
Instrucciones de programación del instrumento QuantStudio Dx Real-Time PCR ...........................14
Procedimiento del ensayo ....................................................................................................................14
Protocolo de amplificación en el Cepheid SmartCycler II .................................................................15
Protocolo de amplificación en el termociclador Biosystem 7500 Fast Dx ........................................16
Protocolo de amplificación en el instrumento QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument............16
Interpretación de los resultados ...........................................................................................................17
Interpretación de los resultados obtenidos con el Cepheid SmartCycler II......................................17
Interpretación de los resultados obtenidos con el ABI 7500 Fast Dx ...............................................18
Interpretación de los resultados obtenidos con el instrumento QuantStudio Dx Real-Time PCR ...19
Control de calidad .................................................................................................................................19
Limitaciones ..........................................................................................................................................19
Valores esperados .................................................................................................................................20
Rendimiento clínico ..............................................................................................................................20
Rendimiento analítico ...........................................................................................................................22
Nivel de detección ............................................................................................................................22
Reactividad analítica (inclusividad) ...................................................................................................23
Estudio de reproducibilidad ..............................................................................................................23
Especificidad analítica – reactividad cruzada....................................................................................24
Especificidad analítica – sustancias interferentes ............................................................................25
Análisis de contaminación cruzada y de arrastre .............................................................................25
Atención al cliente y servicio técnico ....................................................................................................25
Propiedad intelectual ............................................................................................................................26
Marcas comerciales ..........................................................................................................................26
Patentes ............................................................................................................................................26
Glosario .................................................................................................................................................27
Referencias............................................................................................................................................28
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Página 2 de 28
Indicaciones
El ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV es un ensayo de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasatranscriptasa inversa) múltiple en tiempo real para la detección cualitativa y la identificación del virus sincicial
respiratorio y el ARN viral del metaneumovirus humano extraído de muestras de exudado nasal y nasofaríngeo
de pacientes con signos y síntomas de infección respiratoria. Esta prueba diagnóstica in vitro está indicada
como una ayuda para el diagnóstico diferencial de las infecciones causadas por el virus sincicial respiratorio y
el metaneumovirus en seres humanos junto con factores de riesgo clínicos y epidemiológicos. La prueba no
está indicada para diferenciar los dos subtipos de RSV o los cuatro sublinajes genéticos de hMPV.
Los resultados negativos no descartan la infección con RSV o hMPV y no deben ser usados como la única base
para el diagnóstico y para tomar otras decisiones terapéuticas o similares relacionadas con el manejo de
pacientes.
Resumen y explicación
RSV: El virus sincicial respiratorio humano (RSV) es un virus de ARN de simple cadena negativo de la familia del
Paramyxoviridae. El RSV es la causa principal de las infecciones de las vías respiratorias inferiores y de las
consultas hospitalarias durante la primera infancia y la niñez. En los Estados Unidos de América, el 60 % de los
niños pequeños presentan la infección durante la primera temporada de contacto con el RSV, y la mayoría de
1
los niños ya habrán sido infectados con el virus a los 2 ó 3 años. De los niños infectados con RSV, entre el 2 %
2
y el 3 % desarrollarán bronquiolitis y deberán ser hospitalizados. La infección natural con RSV induce una
inmunidad protectora que va disminuyendo con el transcurso del tiempo, posiblemente más que en otras
infecciones respiratorias virales y, por lo tanto, las personas pueden infectarse varias veces. En ocasiones, un
niño puede resultar infectado con síntomas más de una vez, incluso dentro de una misma temporada de RSV.
Se encuentran cada vez más infecciones graves con RSV en pacientes ancianos.
Durante las epidemias anuales, los subtipos A y B de RSV se presentan simultáneamente o de manera alterna,
y existen diversos estudios concordantes que señalan que la bronquiolitis generada por el RSV-A es más grave
3
que la generada por el RSV-B.
hMPV: El metaneumovirus humano (hMPV) es un virus de ARN de simple cadena negativo de la familia
4
Paramyxoviridae que fue aislado por primera vez en 2001 en Holanda. El hMPV podría ser la segunda causa
más frecuente (después del RSV) de infección de las vías respiratorias inferiores en niños pequeños.
Comparada con el RSV, la infección con hMPV tiende a ocurrir en niños un poco mayores y la enfermedad es
de menor gravedad. Puede ocurrir una infección simultánea con ambos virus y, generalmente, se asocia con
una enfermedad más grave.
5
El hMPV genera aproximadamente el 7,1 % de las infecciones respiratorias. El virus parece encontrarse en
todo el mundo y presenta una distribución estacionaria. Su incidencia es comparable a la de los virus de la
gripe durante el invierno. Los estudios serológicos han demostrado que, a los cinco años de edad,
6
prácticamente todos los niños han estado expuestos al virus. El hMPV suele causar una infección respiratoria
leve. Sin embargo, los niños pequeños, los ancianos y las personas con compromiso inmunológico están en
riesgo de padecer una enfermedad grave y de requerir hospitalización.
El análisis de la secuencia del genoma del hMPV ha mostrado que las cepas de hMPV que circulan en el mundo
pueden dividirse en dos linajes genéticos principales (A y B) que representan dos serotipos, cada uno formado
7
por dos sublinajes (A1, A2, B1 y B2).
Principios del procedimiento
El ensayo detecta ácidos nucleicos virales que se han extraído de la muestra del paciente. Se realiza una
reacción de RT-PCR múltiple en tiempo real en condiciones optimizadas en un único tubo generando
amplicones para RSV, hMPV y el control del proceso (PRC). Para la identificación de RSV, hMPV y el PRC se
usan cebadores específicos de diana y sondas marcadas con fluorescencia que se hibridizan en las regiones
conservadas de los genes NS2 y de polimerasa del RSV y el gen de polimerasa de hMPV y el PRC.
Marcado de las sondas Quidel Molecular
Diana
RSV
hMPV
PRC
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Colorante
FAM
CAL Fluor® Red 610
Quasar® 670
Página 3 de 28
A continuación, se presenta un resumen del procedimiento:
1. Recolección de muestras: Obtenga muestras de exudado nasal o exudado nasofaríngeo de pacientes con
síntomas mediante técnicas estándar. Transporte, conserve y procese estas muestras de acuerdo con los
8
procedimientos de laboratorio establecidos.
2.
Extracción de ácidos nucleicos: Extraiga ácidos nucleicos de las muestras con el sistema NucliSENS®
easyMAG® siguiendo las instrucciones del fabricante y usando los reactivos apropiados (consulte
Materiales necesarios pero no proporcionados). No se ha validado el uso de otros sistemas de extracción
con el ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV. La validación de otros sistemas es responsabilidad del usuario
final.
Antes del procedimiento de extracción, añada 20 µl de control del proceso (PRC) a cada alícuota de 180 µl
de la muestra. El PRC permite monitorear los inhibidores en las muestras extraídas, asegurar que se haya
producido la amplificación adecuada y confirmar que la extracción de ácidos nucleicos ha sido suficiente.
3.
Rehidratación de la mezcla maestra: Rehidrate la mezcla maestra liofilizada con la solución de
rehidratación. La mezcla maestra contiene cebadores con oligonucleótidos, fluorocromo y sondas
marcadas con colorante de extinción cuyas dianas son regiones conservadas de RSV y hMPV, así como la
secuencia del control del proceso.
4.
Amplificación y detección de los ácidos nucleicos: Añada 15 µl de la mezcla maestra rehidratada a cada
tubo de reacción o pocillo de la placa. Luego, añada 5 µl de los ácidos nucleicos extraídos (muestra con
PRC) al pocillo de la placa o a los tubos de reacción etiquetados apropiadamente. Coloque la placa o el
tubo en los instrumentos Life Technologies QuantStudio™ Dx Real-Time PCR, Applied Biosystems® (ABI)
7500 Fast Dx o el Cepheid® SmartCycler II, respectivamente.
Cuando el tubo de reacción o la placa hayan sido introducidos al instrumento, inicie el protocolo del
ensayo. Este protocolo inicia la transcripción inversa de las dianas del ARN generando ADN
complementario y, luego, se produce la amplificación de las secuencias diana. El ensayo Quidel Molecular
RSV+hMPV está basado en el procedimiento químico TaqMan® y utiliza una enzima que tiene actividades
de transcriptasa inversa, ADN polimerasa y exonucleasa 5’-3’. Durante la amplificación de ADN, esta
enzima corta la sonda unida a la secuencia de ADN complementario, separando el colorante de extinción
del colorante de notificación. Este paso genera un aumento en la señal de fluorescencia a partir de la
excitación mediante una fuente de luz de longitud de onda apropiada. En cada ciclo, más moléculas de
colorante se separan de sus colorantes y generan una señal mayor. Si se logran señales de fluorescencia
suficientes, la muestra se informa como positiva para la secuencia diana detectada.
Materiales proporcionados
SKU N.º M103
Kit de detección (96 reacciones) – Conservar a una temperatura de 2 °C a 8 °C
#
Componente
Cantidad


Solución de rehidratación Parte M5003
1 vial/kit 1,9 ml
Mezcla maestra del Quidel Molecular RSV+hMPV Parte M5035
12 viales/kit,
8 reacciones/vial
Contenido liofilizado:
Enzima ADN polimerasa con actividad de la transcriptasa inversa
Cebadores y sondas
dNTP
Estabilizantes
Control del proceso Parte M5005
1 vial/kit 2,0 ml
Materiales opcionales
Controles externos del RSV y hMPV (es decir, el juego de control de Quidel Molecular RSV+hMPV N.º M107
que funciona como un control externo de procesamiento y extracción).
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Página 4 de 28
Materiales necesarios pero no proporcionados
Micropipetas (rango de 1 a 10 μl y de 100 a 1000 μl)
Puntas de pipetas antiaerosol
Instrumento de Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR o instrumento de Applied Biosystems
7500 Fast Dx
Placa de PCR de 96 pocillos
Film óptico para placas
Centrífuga para placas ABI de 96 pocillos
Software bioMerieux NucliSENS easyMAG versión 2.0
Tampones bioMerieux NucliSENS easyMAG 1, 2, 3
Tampón de lisis bioMerieux NucliSENS easyMAG
Microesferas de sílice magnéticas bioMerieux NucliSENS easyMAG
Materiales desechables de bioMerieux NucliSENS easyMAG
O
Micropipetas (rango de 1 a 10 μl y de 100 a 1000 μl)
Puntas de pipetas antiaerosol
Cepheid SmartCycler II
Materiales desechables del SmartCycler
Centrífuga SmartCycler
Software bioMerieux NucliSENS easyMAG versión 2.0
Tampones bioMerieux NucliSENS easyMAG 1, 2, 3
Tampón de lisis bioMerieux NucliSENS easyMAG
Microesferas de sílice magnéticas bioMerieux NucliSENS easyMAG
Materiales desechables de bioMerieux NucliSENS easyMAG
Advertencias y precauciones
Para uso diagnóstico in vitro.
Las características de rendimiento de esta prueba solo se han establecido con los tipos de muestras
indicados en el apartado Indicaciones. El rendimiento de este ensayo con otros tipos de muestras o
especímenes no ha sido evaluado.
No se ha validado el uso de sistemas de extracción distintos del sistema NucliSENS easyMAG. La validación
de estos sistemas es responsabilidad del usuario final.
El uso de otras condiciones de ciclo distintas a las indicadas en el apartado Instrucciones de programación
del termociclador puede dar lugar a resultados erróneos.
El uso de este producto debe limitarse a personal con una formación suficiente en las técnicas de PCR y
RT-PCR.
Trate todas las muestras como si fueran potencialmente infecciosas. Siga las precauciones universales al
manipular las muestras, este kit y su contenido.
La recolección, la conservación y el transporte correctos de muestras son indispensables para obtener
resultados correctos.
Conserve los reactivos del ensayo tal como se indica en las etiquetas individuales.
Utilice ropa de protección adecuada, guantes y protección facial y ocular cuando utilice este kit.
Para obtener resultados exactos, pipetee con cuidado utilizando únicamente equipo calibrado.
Limpie y desinfecte completamente todas las superficies con una solución de lejía al 10 %, seguida de agua
de calidad para biología molecular.
Utilice micropipetas con barrera antiaerosol o puntas de desplazamiento positivo para todos los
procedimientos.
Evite la contaminación y la contaminación microbiológica de los reactivos del kit. Siga las buenas prácticas
de laboratorio.
No mezcle reactivos de kits con números de lote distintos.
No utilice reactivos de otros fabricantes con este kit.
No utilice el producto después de la fecha de caducidad.
La planificación correcta del flujo de trabajo es fundamental para reducir al mínimo el riesgo de
contaminación. Planifique siempre el flujo de trabajo del laboratorio de forma unidireccional,
comenzando con la preamplificación y avanzando por los pasos de amplificación y detección.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Utilice suministros y equipos dedicados exclusivamente a las áreas de preamplificación y amplificación.
No permita el movimiento cruzado de personal o equipo entre una zona y otra.
Mantenga siempre los suministros de la zona de amplificación separados de los de la zona de
preamplificación.
No abra los tubos de muestra ni destape las placas después de la amplificación.
Deseche cuidadosamente el material amplificado, de acuerdo con las leyes y normativas locales para
minimizar el riesgo de contaminación con los amplicones.
No utilice los suministros dedicados a la preparación de reactivos o muestras para procesar el ácido
nucleico diana.
La ficha de datos sobre seguridad de materiales se puede solicitar o consultar en la página web del
producto.
Conservación y manipulación de los reactivos del kit
Conserve el kit sin abrir a una temperatura de 2 °C a 8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en la caja
exterior del kit.
La mezcla maestra rehidratada puede conservarse a temperatura ambiente durante hasta 24 horas o a
una temperatura de 2° a 8 °C o ≤ –20 °C durante hasta 2 días. Es necesario volver a tapar la mezcla
maestra rehidratada, sellarla con Parafilm y conservarla en posición vertical. Durante su conservación,
proteja la mezcla maestra de la luz.
Indicaciones de inestabilidad o deterioro de los reactivos
La turbidez en la solución de rehidratación puede indicar el deterioro de este reactivo. Llame al servicio técnico
de Quidel para cambiarla.
Recolección, conservación y manipulación de muestras
Las muestras usadas para la validación del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV se obtuvieron mediante
técnicas estándar de pacientes con síntomas de infección de las vías respiratorias superiores. Estas muestras
fueron recolectadas, transportadas, conservadas y procesadas de acuerdo con el CLSI M41-A. Brevemente, las
muestras deben ser transportadas refrigeradas a una temperatura de 2° a 8 °C y conservadas refrigeradas (de
2° a 8 °C) durante 72 horas antes del procesamiento. Cualquier muestra sobrante debe conservarse a ≤ -70 °C.
Se realizó una serie de estudios para evaluar una variedad de medios de transporte viral utilizados
rutinariamente en un volumen de 2 ml: M4, M4-RT, M5, M6 y UTM. No se observaron diferencias en el
rendimiento del ensayo entre los cinco diferentes tipos de medios de transporte viral.
Conservación de los extractos de ácidos nucleicos
Los eluidos pueden conservarse a temperatura ambiente (de 20° a 25 °C) durante hasta 4 horas, de 2° a 8 °C
durante 6 horas y a -20 °C durante 1 mes. El ARN extraído es estable durante hasta tres ciclos de
congelamiento-descongelamiento cuando se encuentra almacenado a -20 °C.
Instrucciones de programación para la extracción de ácidos nucleicos
Nota: Se debe incluir en cada extracción un control positivo de procesamiento/extracción de RSV/hMPV (es
decir, el juego de control de Quidel Molecular RSV+hMPV N.º M107 o muestras positivas para RSV o hMPV
previamente caracterizadas) y un control negativo del proceso (es decir, medio de transporte viral o muestra
negativa para RSV y hMPV previamente caracterizada).
1. Encienda el instrumento y espere a que la luz del instrumento esté de color naranja. A continuación,
encienda el ordenador y abra el software easyMAG.
2.
Lea los códigos de barras de los reactivos después de pulsar los botones "Instrumento"
"Inventario de reactivos"
3.
e
.
Para introducir las muestras, pulse el botón "Uso diario"
la pantalla "Definir solicitud"
a. ID de la muestra:
b. Matriz:
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
, que lo llevará de forma predeterminada a
. Seleccione los siguientes valores:
escriba el nombre de la muestra con el teclado.
seleccione Otro en el menú desplegable.
Página 6 de 28
c.
d.
e.
f.
g.
4.
Solicitud:
Volumen (ml):
Eluido, µl:
Tipo:
Prioridad:
Al pulsar el botón "Guardar"
seleccione Genérico en el menú desplegable.
seleccione 0,200 en el menú desplegable.
seleccione 50 en el menú desplegable.
Principa
Normal
, la muestra aparecerá en la ventana "Muestra no asignada" en el lado
izquierdo de la pantalla. Pulse el botón "Introducir nueva solicitud de extracción"
y repita el
procedimiento con las demás muestras. También es posible introducir varias muestras con el botón
"Creación automática" de nuevas solicitudes de extracción
5.
.
Una vez que haya creado todas las muestras, vaya a "Organizar análisis", haciendo clic en el icono
situado cerca de la parte superior de la página. Pulse el botón "Crear análisis"
análisis. Introduzca un nombre para el análisis o utilice el nombre predeterminado.
6.
para crear un
Utilice el botón "Rellenar análisis automáticamente"
para añadir muestras al análisis (la opción
automática rellena un máximo de 24 muestras de la "Lista de muestras no asignadas" en el lado izquierdo
de la pantalla). También es posible incluir o excluir muestras individuales del análisis utilizando los iconos
de posición izquierdo y derecho
después de seleccionar la muestra adecuada. El orden de
las muestras en el análisis puede modificarse con los botones "Subir/bajar solicitud de extracción"
7.
8.
.
Obtenga de 1 a 3 recipientes de muestra (para 8 a 24 muestras, respectivamente) y añada 20 µl de control
del proceso a cada pocillo de muestra utilizado.
Añada 180 µl de cada muestra al pocillo designado adecuado.
9.
Vaya a "Cargar análisis" pulsando el botón
situado cerca de la parte superior de la pantalla.
Introduzca las puntas y los recipientes de muestra en el instrumento.
10. Introduzca el/los código(s) de barras del/de los recipiente(s) de muestra.
11. Introduzca el/los código(s) de barras de las microesferas de sílice que va a utilizar.
12. Asigne las microesferas de sílice a las muestras de la siguiente forma:
a. Haga clic en el símbolo de los reactivos que aparece debajo del número 1 en la figura siguiente. El
número de lote de las microesferas de sílice debe aparecer debajo de la ficha Sílice, señalada con
el número 2 en la siguiente figura.
b. Resalte y seleccione las muestras del análisis a las que desea asignar las microesferas (en el
cuadro señalado con el número 3 en la figura siguiente).
c.
d.
Haga clic en el icono de colocación
(debajo del número 4 en la figura siguiente) para
asignar el número de lote de sílice a las muestras seleccionadas.
Si se selecciona el símbolo de las microesferas (a la derecha del número 5 en la figura siguiente),
se mostrará el número del lote de las microesferas de sílice para cada muestra.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Página 7 de 28
1
2
4
5
3
13. Toque el icono "Cargar análisis" y, a continuación, pulse el icono de "Imprimir lista de trabajo" para
imprimir la lista de trabajo.
14. Pulse el botón "Dispensar lisis"
. Tardará aproximadamente 12 minutos en completarse la lisis en el
instrumento.
15. Prepare partículas magnéticas para cada recipiente de muestra utilizando la pipeta Biohit y puntas para un
máximo de ocho reacciones, de la siguiente forma:
a. Con una punta y el Programa 1, aspire 550 µl de agua sin nucleasa y dispénselos en un tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml sin ADNasa y ARNasa.
b. Agite la sílice magnética en el mezclador vórtex. Con una punta y el Programa 1, aspire 550 µl de
sílice magnética, dispénselos en el agua y agite en el mezclador vórtex.
c. Con una punta y el Programa 2, aspire 1050 µl de la mezcla de sílice magnética y dispense 25 µl al
mismo tubo.
d. Dispense 125 µl de la mezcla de sílice magnética 8 veces en 8 pocillos de una placa de tiras para
ELISA. Deseche la punta.
e. Cuando finalice la lisis (Nota: El estado del instrumento indicado en la parte inferior de la pantalla
debe ser "¡EN ESPERA!"), utilice 8 puntas y el Programa 3 para aspirar 100 µl de la mezcla de
sílice magnética de los pocillos de las tiras, dispense 100 µl de la mezcla de sílice en los pocillos y
aspire de nuevo los 100 µl.
f. Introduzca las puntas en el líquido de los recipientes de muestra. Aspire 800 µl y después
dispense de nuevo 900 µl de la mezcla de sílice magnética en el recipiente. Aspire 1000 µl de la
mezcla de sílice magnética del recipiente y dispense los 1000 µl de nuevo en el recipiente. Repita
dos veces más la aspiración y dispensación de 1000 µl.
16. Cierre el instrumento y pulse el botón "Iniciar"
para comenzar el análisis.
17. Cuando finalice el análisis, transfiera el ácido nucleico purificado a los tubos sin nucleasa. Los eluidos
pueden conservarse a temperatura ambiente (de 20° a 25 °C) durante hasta 4 horas, de 2 a 8 °C durante 6
horas y a -20 °C durante 1 mes. El ARN extraído es estable durante hasta tres ciclos de congelamientodescongelamiento cuando se encuentra almacenado a -20 °C.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Programación inicial del termociclador
Instrucciones de programación del SmartCycler II
1.
2.
Inicie el paquete de software Cepheid SmartCycler Dx versión 3.0b.
Cree el ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV.
a. Seleccione el botón Definir ensayos de la parte superior de la pantalla.
b. Asigne un nombre al ensayo:
i. Seleccione el botón Nuevo en la esquina inferior izquierda de la pantalla.
ii. Escriba “Quidel Molecular RSV+hMPV” y seleccione OK.
iii. Se añadirá “Quidel Molecular RSV+hMPV” a la parte superior de la lista Nombre del ensayo,
situada en la parte superior izquierda de la pantalla.
c. Defina los valores del análisis: En el apartado Tipo de ensayo: investigación, seleccione la ficha
Configuración del análisis y asegúrese de que estén establecidas las especificaciones siguientes:
i. Seleccione FCTC25 en el menú desplegable Conjunto de colorantes.
ii. El menú desplegable Tipo de análisis debe estar configurado en el valor predeterminado
Cualitativo (Configuración predeterminada).
iii. En la columna Nombre del canal, introduzca “RSV” para el Canal 1, “hMPV” para el Canal 3 y
“PRC” para el Canal 4.
iv. En la columna Uso, seleccione Diana en los menús desplegables para RSV y hMPV, y seleccione
Control interno para PRC. Al seleccionar Control interno, aparecerá la ventana emergente que
se muestra abajo. Seleccione el botón Sí.
v. En la columna Análisis de la curva, introduzca el valor predeterminado Curva principal para
cada canal (RSV, hMPV, PRC) (Configuración predeterminada).
vi. En la columna Valor umbral, introduzca el valor predeterminado Umbral manual para cada
canal (RSV, hMPV, PRC) (Configuración predeterminada).
vii. En la columna Unidades fluoroscópicas del umbral manual, introduzca los siguientes valores:
a. RSV: 20,0
b. hMPV: 10,0
c. PRC: 10,0
viii. En la columna Ciclo mínimo válido (desplácese hacia la derecha si no se hace visible
inmediatamente), introduzca 5 para cada canal (RSV, hMPV, PrC).
ix. En la columna Ciclo máximo válido (desplácese hacia la derecha si no se hace visible
inmediatamente), introduzca 50 para cada canal (RSV, hMPV, PrC).
x. En la columna Substracción del fondo, utilice el valor predeterminado “Activado” para cada
canal (RSV, hMPV, PRC) (Configuración predeterminada).
xi. En la columna Mín. de ciclos para fondo, introduzca 5 para cada canal (RSV, hMPV, PRC).
xii. En la columna Máx. de ciclos para fondo, introduzca 35 para cada canal (RSV, hMPV, PRC).
xiii. En la columna Media de ciclos para suavizado, mantenga el valor predeterminado 0 para cada
canal (RSV, hMPV, PRC) (Configuración predeterminada).
xiv. En la columna Umbral del punto final, introduzca el valor predeterminado 20, 10, 10 para cada
canal (RSV, hMPV, PRC) (Configuración predeterminada).
xv. En la columna NC IC%, mantenga el valor predeterminado “NA” para cada canal (PRC)
(Configuración predeterminada).
xvi. En la columna IC Delta, mantenga el valor predeterminado “NA” para cada canal (RSV, hMPV)
(Configuración predeterminada).
xvii. En el apartado Personalizar el texto de los resultados (a continuación de la tabla), seleccione
Texto de resultados basado en los microorganismos en el menú desplegable. Se abrirá la
ventana emergente de advertencias que se muestra abajo. Seleccione Sí.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Página 9 de 28
xviii. Seleccione el botón Personalizar para abrir el cuadro de diálogo Texto de resultados basado
en los microorganismos. Seleccione el botón Añadir, introduzca “RSV” en la columna Nombre
del microorganismo y seleccione la casilla RSV. Seleccione nuevamente el botón Añadir,
introduzca “hMPV” en la columna Nombre del microorganismo y marque la casilla hMPV.
Haga clic en OK en la parte inferior de la ventana emergente.
Configure los tiempos y las temperaturas de los ciclos de RT-PCR de la siguiente forma:
i. Etapa 1
1. Retener
2. Temp.:
55,0
3. Segundos: 300
4. Óptica:
Desactivada
ii. Etapa 2
1. Retener
2. Temp.:
60,0
3. Segundos: 300
4. Óptica:
Desactivada
iii. Etapa 3
1. Retener
2. Temp.:
65,0
3. Segundos: 300
4. Óptica:
Desactivada
iv. Etapa 4
1. Ciclo con 2 temperaturas
2. Repetir_veces:
50
3. Fila de la primera temperatura:
a. Temp.:
92,0
b. Segundos: 5
c. Óptica:
Desactivada
4. Fila de la segunda temperatura
a. Temp.:
57,0
b. Segundos: 40
c. Óptica:
Activada
Guarde el protocolo seleccionando el botón Guardar en la parte inferior de la pantalla.
d.
3.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Página 10 de 28
Figura del protocolo Quidel Molecular RSV+hMPV finalizado:
Instrucciones de programación de Applied Biosystems 7500 Fast DX
1.
2.
Inicie el paquete de software ABI 7500 Fast Dx.
Se abrirá el cuadro de diálogo Documento de inicio rápido. Seleccione el botón Crear documento nuevo
para iniciar el Asistente para documentos nuevos. Siga cada paso para iniciar el protocolo de Quidel
Molecular RSV+hMPV.
a. Defina el documento: La mayoría de los siguientes parámetros deberían mostrar el valor
predeterminado. Si no es así, cámbielos según corresponda.
i. Confirme o introduzca la siguiente información:
Ensayo: Cuantificación absoluta
Recipiente: Placa transparente de 96 pocillos
Plantilla: Documento en blanco
Modo de análisis: Fast 7500
Usuario: el nombre del usuario
Comentarios: SDS v1.4
Nombre de la placa: “Quidel Molecular RSV+hMPV”
ii. Seleccione el botón Siguiente.
iii. Seleccione los detectores: Deben añadirse nuevos detectores para hMPV, RSV y el
control del proceso (PRC). Seleccione el botón Detector nuevo para cada diana,
para abrir la ventana emergente Detector nuevo. También puede utilizar el botón
Crear otro desde de la ventana emergente Detector nuevo para los dos últimos
detectores. Introduzca la siguiente información para cada detector:
Colorante de Colorante de Color
Nombre
notificación
extinción
RSV
FAM
(ninguno)
(seleccionar)
hMPV
Texas Red
(ninguno)
(seleccionar)
PRC
Cy5
(ninguno)
(seleccionar)
iv. Seleccione un color único que represente a cada detector.
v. Resalte los nuevos detectores y añádalos a la columna Detectores en el documento
con el botón Añadir.
vi. Seleccione (ninguno) en el menú desplegable Referencia pasiva.
vii. Seleccione el botón Siguiente.
viii. Seleccione el botón Finalizar sin definir ningún pocillo.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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b.
c.
El asistente se cerrará y se abrirá el software en la ficha Configuración. Aparecerá la placa
de muestras configurada durante el inicio rápido. Para la configuración inicial, no es
necesario realizar ningún cambio en esta ficha.
Definición del protocolo del termociclador:
i. Seleccione la ficha Instrumento para configurar las temperaturas y los tiempos de
los ciclos de RT-PCR del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV.
ii. En Perfil térmico debe aparecer un protocolo de dos etapas predeterminado. Cada
etapa tiene 3 cuadros de texto que el usuario puede modificar. El valor del cuadro
superior representa el número de repeticiones o ciclos en esa etapa. El valor del
cuadro central representa la temperatura (˚C) y el valor del cuadro inferior
representa el tiempo (minutos:segundos).
iii. Realice los cambios siguientes en el Protocolo del termociclador predeterminado:
1. Etapa 1
a. Repeticiones:
1
b. Temp.:
55
c. Tiempo:
5:00
2. Seleccione la barra que aparece entre Etapa 1 y Etapa 2. Seleccione el
botón Añadir retención para añadir otra etapa.
3. Etapa 2
a. Repeticiones:
1
b. Temp.:
60
c. Tiempo:
5:00
4. Seleccione la barra que aparece entre Etapa 2 y Etapa 3. Seleccione el
botón Añadir retención para añadir otra etapa.
5. Etapa 3
a. Repeticiones:
1
b. Temp.:
65
c. Tiempo:
5:00
6.
7.
Etapa 4, (etapa de amplificación en dos pasos)
a. Repeticiones:
10
b. Paso 1
i. Temp.: 92
ii. Tiempo: 0:05
c. Paso 2
i. Temp.: 57
ii. Tiempo: 0:40
Seleccione la barra que aparece a la derecha de Etapa 4. Seleccione el
botón Añadir ciclo para añadir otra etapa.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Página 12 de 28
8.
Etapa 5, (etapa de amplificación en dos pasos)
a. Repeticiones: 35
b. Paso 1
i. Temp.: 92
ii. Tiempo: 0:05
c. Paso 2
i. Temp.: 57
ii. Tiempo: 0:40
9. Si se añade una etapa incorrecta, puede eliminarla pulsando el botón
Eliminar después de resaltar la etapa entre las líneas verticales.
iv. En Configuración, introduzca lo siguiente:
Volumen de muestra, µl: 20 (predeterminado)
Modo de análisis: 7500 Fast (predeterminado)
Recopilación de datos: Etapa 5, Paso 2 (57,0 a 0:40)
NOTA: No seleccione la casilla situada junto a "Modo experto".
v. Protocolo final
d.
Defina el umbral para cada analito como se indica a continuación:
i. Seleccione la ficha Resultados.
ii. Seleccione la ficha Gráfico de amplificación.
iii. Seleccione RSV en la esquina superior derecha de la ficha Detector.
iv. En el bloque Configuración del análisis, establezca el valor Umbral en 8.0e4.
v. Seleccione el botón de radio Línea base automática.
vi. Repita los pasos iii a v para el hMPV, estableciendo el valor Umbral en 5.4e4.
vii. Repita los pasos iii a v para establecer el valor Umbral de PRC en 2.7e4.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Página 13 de 28
viii. Repita los pasos iii a v para establecer el valor Umbral de PRC en 2.7e4.
e.
f.
Guarde el protocolo nuevo como una plantilla para usos futuros.
i. En la parte superior de la pantalla, seleccione Archivo y, a continuación, Guardar
como.
ii. Guardar en: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\.
iii. Nombre del archivo: “Quidel Molecular RSV+hMPV”.
iv. Guardar como tipo: “SDS Templates (*.sdt)”.
Salga del software.
Instrucciones de programación del instrumento QuantStudio Dx Real-Time PCR
Quidel Molecular suministra una plantilla predefinida para el ensayo en un CD que debe cargarse en el
instrumento QuantStudio™ Dx. Comuníquese con un representante de Quidel al (800) 874-1517 (teléfono
gratuito en los EE. UU.) o al (858) 552-1100, de lunes a viernes de 8:00 a. m. a 5:00 p. m. hora de la costa este
de EE. UU. para obtener este CD. Estas plantillas contienen los parámetros de análisis necesarios; es decir, no
se necesita programar el instrumento para comenzar. Para instalar un documento de definición de prueba:
1. Desde la ficha Inicio del software del QuantStudio™ Dx, haga clic en Administrar prueba en el panel
Herramientas.
2. Desde el Menú de la prueba, haga clic en Instalar.
3. Navegue hasta encontrar su documento de definición de prueba (.tdd), selecciónelo y haga clic en
Abrir. El software del QuantStudio™ añade automáticamente la prueba seleccionada al menú de la
prueba.
4. Haga clic en Cerrar para cerrar el menú de la prueba y guardar sus cambios.
Procedimiento del ensayo
Lleve a cabo los procedimientos siguientes a temperatura ambiente controlada de 20˚ a 25 ˚C.
Procedimiento de extracción de ácidos nucleicos
Consulte las instrucciones de programación del sistema bioMerieux NucliSENS easyMAG más arriba.
1. Añada 20 µl de control del proceso al pocillo de extracción de muestra.
2. Añada 180 µl de muestra de paciente o control externo a un pocillo de extracción de muestra.
3. Siga las instrucciones del fabricante para realizar la extracción.
4. Los eluidos pueden conservarse a temperatura ambiente (de 20˚ a 25 ˚C) durante hasta 4 horas, de 2˚
a 8 ˚C durante 6 horas y a -20 ˚C durante 1 mes. El ARN extraído es estable durante hasta tres ciclos
de congelamiento-descongelamiento cuando se encuentra almacenado a -20 ˚C.
Procedimiento de rehidratación de la mezcla maestra
1. Determine el número de muestras que va a analizar y obtenga el número correcto de viales de mezcla
maestra liofilizada para ocho pruebas para realizar el análisis.
2. Vuelva a poner los reactivos no utilizados en las condiciones de conservación adecuadas.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Abra con cuidado la mezcla maestra para no alterar el precipitado.
Añada 135 µl de solución de rehidratación a la mezcla maestra.
Deje el vial a temperatura ambiente durante 1-2 minutos para que se rehidrate el precipitado.
Pipetee suavemente aspirando y dispensando 2-3 veces, evitando la formación de burbujas, antes de
dispensar la solución en el primer tubo de PCR o pocillo de la placa.
Nota: La mezcla maestra rehidratada es suficiente para ocho reacciones.
Nota: La mezcla maestra rehidratada puede conservarse a temperatura ambiente durante hasta 24
horas o a una temperatura de 2˚ a 8 ˚C o ≤ –20 ˚C durante hasta 2 días. (Consulte otras opciones de
conservación en el apartado “Conservación y manipulación de los reactivos del kit”).
Procedimiento de preparación de la RT-PCR:
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Añada 15 µl de la mezcla maestra rehidratada a cada tubo de reacción o pocillo de la placa.
Añada 5 µl de ácidos nucleicos extraídos (muestra con el control del proceso) a los tubos de reacción
o los pocillos de la placa. No es necesario mezclar los reactivos.
Nota: Utilice una micropipeta nueva y una punta anti-aerosol nueva para cada muestra extraída.
Cierre los tubos de reacción o selle la placa.
Nota: Quidel recomienda incluir un tubo de reacción o pocillo de la placa en cada serie del
termociclador con un control externo positivo de RSV/hMPV extraído (es decir, el juego de control de
Quidel Molecular RSV + hMPV N.º M107 o muestras positivas para RSV o hMPV previamente
caracterizadas) y un tubo de reacción o pocillo de la placa con un control negativo en el análisis de los
controles con las prácticas y las políticas de laboratorio de acuerdo con organizaciones de
acreditación locales, estatales, federales, según corresponda.
Centrifugue los tubos de reacción o la placa durante 15 segundos como mínimo. Asegúrese de que
todo el líquido esté en el fondo del tubo.
Introduzca los tubos o la placa en el termociclador.
Protocolo de amplificación en el Cepheid SmartCycler II
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Encienda el/los bloque(s) del SmartCycler.
Inicie el paquete de software SmartCycler Dx versión 3.0b.
Seleccione el botón Crear análisis de la parte superior de la pantalla para configurar el análisis.
En Nombre de análisis, escriba el nombre del análisis en curso (p. ej., AAMMDD-Quidel Molecular
RSV+hMPV).
En Notas, escriba cualquier comentario que desee sobre el análisis para utilizarlo como referencia en
el futuro.
En Ensayo, seleccione el ensayo "Quidel Molecular RSV+hMPV" en el menú desplegable.
En Información del ensayo, introduzca el número de lote y la fecha de caducidad del kit.
Para seleccionar los pocillos que utilizarán, siga uno de estos métodos:
a. Para asignar automáticamente los pocillos:
i. En Número de muestras, introduzca el número de muestras en el cuadro de texto
suministrado.
ii. Seleccione el botón Aplicar. El número de filas introducido aparecerá en Tabla de sitios.
b. Para elegir manualmente los pocillos de los bloques del SmartCycler, siga estos pasos:
i. Seleccione el botón Añadir/quitar sitios situado hacia la parte inferior de la pantalla.
ii. Se abrirá la ventana emergente Seleccionar sitios con dos columnas. La columna de la
izquierda (Sitios) indica todos los sitios disponibles y la de la derecha (Selecciones), todos
los sitios seleccionados.
iii. Para seleccionar todos los sitios, haga clic en el botón Seleccionar todos los sitios.
iv. Para seleccionar sitios específicos, resalte uno o más sitios y seleccione la flecha derecha
para añadir los sitios a la columna Selecciones.
v. Seleccione el botón OK para cerrar la ventana. Los sitios seleccionados aparecerán en la
Tabla de sitios.
Introduzca la identificación de las muestras en la columna ID de muestra de la Tabla de sitios; esto
también puede hacerse una vez que se ha iniciado el análisis.
Introduzca comentarios en la columna Notas y deje las entradas de la columna Tipo de muestra como
"SPEC".
Seleccione el botón Iniciar análisis en la parte inferior de la pantalla.
Seleccione el botón de Ver resultados para ver el progreso del análisis.
Cuando finalice el análisis, guárdelo antes de salir del software.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Protocolo de amplificación en el termociclador Biosystem 7500 Fast Dx
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Encienda el 7500 Fast Dx.
Inicie el paquete de software 7500 Fast Dx.
Se abrirá el cuadro de diálogo Documento de inicio rápido.
Haga clic en Crear un documento nuevo.
La mayoría de los siguientes parámetros deberían mostrar el valor predeterminado. Si no es así,
cámbielos según corresponda.
Ensayo:
Recipiente:
Plantilla:
Modo de análisis:
Usuario:
Comentarios:
Nombre de la placa:
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Cuantificación absoluta
Placa transparente de 96 pocillos
Quidel Molecular RSV+hMPV
Fast 7500
el nombre del usuario
SDS v1.4 (añadir más si es necesario)
AAMMDD-Quidel Molecular RSV+hMPV
Configure la placa de muestras:
a. La configuración de la placa aparecerá en las fichas Configuración y Placa.
b. Seleccione todos los pocillos que van a contener muestra, haga clic con el botón derecho y
seleccione Inspector de pocillo en el menú desplegable. Cuando se abra la ventana emergente
Inspector de pocillo, seleccione los detectores para RSV, hMPV y PRC.
c. Utilice el Inspector de pocillo para introducir los nombres de las muestras. Las ID de paciente se
pueden introducir en la ventana Inspector de pocillo; sin embargo, se recomienda hacerlo antes
de resuspender la mezcla maestra liofilizada, posterior al análisis o mediante la función de
importación para reducir al mínimo el tiempo que las reacciones de PCR permanecerán a
temperatura ambiente antes de iniciar el análisis.
d. Guarde el análisis como AAMMDD-Quidel Molecular RSV+hMPV.sds.
e. Se abrirá una ventana “Motivo del cambio” para que el usuario indique el motivo por el que
modificó la entrada. Escriba “Configuración” y cualquier otro comentario relevante para el
análisis.
Inicie la PCR:
a. Seleccione la ficha Instrumento.
b. Introduzca la placa de PCR de 96 pocillos en el instrumento.
c. En Control del instrumento, seleccione el botón Iniciar para iniciar el análisis.
Después de la PCR:
a. IMPORTANTE: Cuando finalice el análisis, pulse OK. Para analizar los datos, pulse el botón
“Analizar” en el menú superior y guarde el archivo.
b. Para guardar el archivo, pulse Guardar archivo en la barra de tareas. Se abrirá una ventana
“Motivo del cambio” para que el usuario indique el motivo por el que modificó la entrada. Escriba
“Análisis de datos posterior al análisis” y cualquier otro comentario relevante para el análisis.
Protocolo de amplificación en el instrumento QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
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Encienda el QuantStudio Dx.
Elija el modo IVD en el instrumento.
Inicie el paquete de software QuantStudio Dx IVD.
Cuando se le solicite, ingrese la información en Nombre de usuario y Contraseña del sistema.
Se abrirá la ventana Pantalla de inicio.
En el cuadro Configuración, seleccione el nombre de la prueba previamente cargada “Quidel
Molecular RSV+hMPV”.
Haga clic en el botón Configuración para iniciar el análisis RT-PCR.
Se mostrará la pantalla Configuración, Propiedades de la prueba. Ingrese la información del análisis
según corresponda.
a. Ingrese la información en Nombre del experimento (la configuración predeterminada inicia el
análisis con un sello con la fecha y la hora).
b. Introduzca la información en Código de barras de la placa.
c. Registre los números de lote del material en Información de los reactivos.
d. Guarde el análisis con un identificador único como un archivo “.sds” (p. ej., AAMMDDN.ºIDanálisis-Quidel Molecular C difficile.sds).
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Se abrirá una ventana “Motivo del cambio de la entrada” para que se indique el motivo de la
modificación. Escriba “Configuración” y cualquier otro comentario relevante para el análisis.
En la barra de menú izquierda, seleccione Definir.
Edite la información de la muestra.
a. Introduzca información específica de la muestra para cada pocillo; para ello, borre el identificador
predeterminado (Paciente 1, Paciente 2, etc.) e ingrese información nueva.
b. O BIEN, puede seleccionar Importar desde archivo de la parte superior de la pantalla para cargar
un mapa de placa predefinido desde un archivo de texto (separado por medio de tabulaciones).
En la barra de menú izquierda, seleccione Asignar para verificar que la configuración de la placa sea
correcta.
Cargue la placa de muestras.
a. Eyecte la bandeja de instrumento.
b. Introduzca la placa de PCR de 96 pocillos en la máquina con el pocillo A1 ubicado en la esquina
superior izquierda.
c. Retraiga la bandeja de instrumento.
Inicie el análisis.
a. En la barra de menú izquierda, seleccione Analizar.
b. Haga clic en el botón verde Iniciar análisis que se encuentra en la parte superior de la pantalla.
i. Si el equipo se lo solicita, seleccione el número de serie específico del instrumento que se está
utilizando.
Cuando se haya completado el análisis, seleccione Análisis en la barra de menú izquierda.
a. Para guardar el archivo, pulse Guardar en la barra de tareas. Se abrirá una ventana “Motivo del
cambio de la entrada” para que se indique el motivo de la modificación. Escriba “Análisis de
datos posterior al análisis” y cualquier otro comentario relevante para el análisis.
b. Se mostrará la ficha Gráfico de amplificación en forma predeterminada. Para ver otro tipo de
gráficos, selecciónelos de la barra de menú izquierda.
c. Para ver información del análisis con valores de Ct, seleccione la ficha Tabla de pocillos en el
margen derecho de la pantalla.
Imprima un informe.
a. En la barra de menú superior, seleccione Imprimir informe. Personalice el contenido del informe
marcando o desmarcando casillas de la ventana de informes.
b. Seleccione el botón “Imprimir informe” en la parte inferior del recuadro de diálogo.
Exporte los archivos de datos.
a. En la barra de menú izquierda, seleccione Exportar.
b. Introduzca la Ubicación del archivo para exportar O haga clic en Examinar para ubicar la ruta
deseada.
c. El Nombre del archivo para exportar será el nombre predeterminado del análisis guardado.
d. Seleccione Excel como el tipo de archivo.
e. Personalice el informe de datos exportado activando o desactivando las fichas mostradas y
marcando o desmarcando opciones.
Seleccione Iniciar exportación en la parte inferior de la pantalla.
Interpretación de los resultados
Interpretación de los resultados obtenidos con el Cepheid SmartCycler II
1. Cuando finalice el análisis, seleccione la ficha Ver resultados.
2. Seleccione la ficha Resultados de la muestra.
3. El software del SmartCycler II indicará automáticamente si se ha detectado el ARN viral del RSV y/o hMPV
en las muestras o si el análisis no fue válido (sin resolver).
4. En la misma ventana, en las fichas correspondientes a cada analito, puede obtenerse información más
detallada. Si hay un resultado positivo para RSV o hMPV (o ambos), el resultado del PRC no se aplica. El
PRC solo es necesario para los resultados negativos.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Interpretación de los resultados del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV en el Cepheid SmartCycler II
Resultado de
Resultado del
control del
RSV
hMPV
Interpretación de los resultados
ensayo
proceso
No se detectaron ácidos nucleicos de RSV o hMPV;
Negativo
Pasa
NEG
NEG
PRC detectado
Positivo para
NA*
POS
NEG
Se detectaron ácidos nucleicos de RSV
RSV
Positivo para
NA*
NEG
POS
Se detectaron ácidos nucleicos de hMPV
hMPV
Positivo para
NA*
POS
POS
Se detectaron ácidos nucleicos de RSV y hMPV**
RSV y hMPV
Sin resolver: inhibición de la PCR o fallo del
reactivo.
Repita la prueba con la misma muestra purificada.
No válido
No pasa
NEG
NEG
Si este análisis es además no válido, vuelva a
extraer y a analizar otra alícuota de la misma
muestra u obtenga una nueva muestra y vuelva a
analizar.
*No se necesita ningún valor para que el resultado del control del proceso sea positivo.
** Las infecciones duales son poco comunes. Repita la prueba utilizando la misma muestra purificada. Si la
repetición de la prueba confirma este resultado, recolecte una nueva muestra y realice la prueba.
Comuníquese con Quidel si varias muestras arrojan este resultado.
Código de error 3079: Se puede obtener una advertencia o el código de error 3079 con las muestras positivas
para los virus RSV y/o hMPV. La advertencia o el código de error 3079 se producen cuando la señal de
fluorescencia (RFU) es demasiado alta. En este caso, el software Dx notifica todos los resultados como ND (no
determinados). Si se obtiene un valor Ct ≥ 5 para cualquiera de los virus, los resultados de la muestra pueden
registrarse como Positivos para el virus correspondiente. Si el valor Ct es < 5, el virus correspondiente se
registra como Negativo.
Interpretación de los resultados obtenidos con el ABI 7500 Fast Dx
Interpretación de los resultados del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV en el termociclador 7500 Fast Dx
Detector:
Resultado
Detector:
Detector:
Control del
Interpretación de los resultados
del ensayo
RSV
hMPV
proceso
No
No
No se detectó ARN viral de RSV o
Negativo
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
determinado
determinado
hMPV; PRC detectado
Positivo
No
Se detectó ARN viral de RSV
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
NA*
para RSV
determinado
Positivo
No
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
NA*
Se detectó ARN viral de hMPV
para hMPV
determinado
RSV y hMPV 5,0 ≤ Ct ≤ 35,0 5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
NA*
Se detectó ARN viral de RSV y hMPV**
No se detectó ARN viral de RSV o
hMPV; PRC no detectado; el análisis no
es válido.
No
No
No
Repita la prueba con la misma muestra
No válido
determinado
determinado
determinado
purificada. Si este análisis es además no
válido, vuelva a extraer y a analizar otra
alícuota de la misma muestra u obtenga
una nueva muestra y vuelva a analizar.
* No se necesita ningún valor de Ct para que el resultado del control del proceso sea positivo.
** Las infecciones duales son poco comunes. Repita la prueba utilizando la misma muestra purificada. Si la
repetición de la prueba confirma este resultado, recolecte una nueva muestra y realice la prueba.
Comuníquese con Quidel si varias muestras arrojan este resultado.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Interpretación de los resultados obtenidos con el instrumento QuantStudio Dx Real-Time PCR
Interpretación de los resultados del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV en el
instrumento Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR
Detector:
Detector:
Resultado
Detector:
Interpretación de los
RSV
Control del
del ensayo
hMPV
resultados
proceso
No se detectó ARN viral de
No se registró un
No se registró un
Se registró un
Negativo
RSV o hMPV; PRC
valor Ct
valor Ct
valor Ct
detectado
Positivo
Se registró un
No se registró un
Se detectó ARN viral de RSV
NA*
para RSV
valor Ct
valor Ct
Positivo
No se registró un
Se registró un valor
Se detectó ARN viral de
NA*
para hMPV
valor Ct
Ct
hMPV
Se registró un
Se registró un valor
Se detectó ARN viral de RSV
RSV y hMPV
NA*
valor Ct
Ct
y hMPV**
No se detectó ARN viral de
RSV o hMPV; PRC no
detectado; el análisis no es
válido.
Repita la prueba con la
No se registró un
No se registró un
No se registró un misma muestra purificada.
No válido
valor Ct
valor Ct
valor Ct
Si este análisis es además
no válido, vuelva a extraer y
a analizar otra alícuota de
la misma muestra u
obtenga una nueva
muestra y vuelva a analizar.
* No se necesita ningún valor de Ct para que el resultado del control del proceso sea positivo.
** Las infecciones duales son poco comunes. Repita la prueba utilizando la misma muestra purificada. Si la
repetición de la prueba confirma este resultado, recolecte una nueva muestra y realice la prueba.
Comuníquese con Quidel si varias muestras arrojan este resultado.
Control de calidad
El ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV incluye varios controles para monitorizar el funcionamiento del ensayo.
1. El control del proceso debe utilizarse durante los pasos de extracción y amplificación del ensayo. Este
control debe añadirse a cada alícuota de muestra antes de la extracción.
2. Los controles positivos externos para RSV/hMPV disponibles comercialmente pueden tratarse como
muestras de paciente y deben utilizarse de acuerdo con las normas del laboratorio. Pueden utilizarse
muestras positivas para RSV o hMPV previamente caracterizadas en lugar de un control positivo comercial
para RSV/hMPV.
3. Como control negativo externo, pueden utilizarse el medio de transporte de virus o una muestra negativa
previamente caracterizada. Este control debe tratarse igual que una muestra de paciente y utilizarse
según las normas vigentes del laboratorio.
Limitaciones
Esta prueba no está indicada para diferenciar subtipos de RSV o hMPV. Si es necesario diferenciar
subtipos, deben realizarse pruebas adicionales.
Los resultados negativos no descartan la infección con RSV o hMPV y no deben utilizarse como única base
para tomar decisiones terapéuticas.
Al igual que con otros ensayos de este tipo, existe el riesgo de obtener resultados falsos negativos debido
a la presencia de variantes de secuencia en la diana viral.
La recolección, la conservación o el transporte incorrectos de muestras puede dar lugar a resultados
negativos falsos.
Los inhibidores presentes en la muestra o los errores cometidos durante el procedimiento del ensayo
también pueden dar lugar a resultados falsos negativos.
Los resultados deben ser interpretados por un profesional de la salud capacitado junto con la historia
clínica del paciente, los signos y síntomas clínicos y los resultados de otras pruebas de diagnóstico.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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No se ha establecido el rendimiento del ensayo en personas que recibieron corticosteroides administrados
por vía nasal.
No se ha establecido el rendimiento del ensayo en personas que recibieron la vacuna contra la gripe por
vía nasal.
Los resultados de estudios analíticos demuestran que con 2x LoD, el subtipo B2 de hMPV fue inhibido por
RSV con un nivel 10.000 superior al RSV LoD informado en el ABI 7500 Fast Dx. El mismo estudio realizado
en el Cepheid SmartCycler II demostró que con 2x LoD, el subtipo B2 de hMPV fue inhibido por RSV con un
registro de nivel 3 superior al RSV LoD informado. La incidencia de infección simultánea con RSV y hMPV
observada en el ensayo clínico actual para el ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV fue de 0,1 % (1/949).
Esta prevalencia es baja, y puede variar dependiendo de la prevalencia y de la población analizadas.
Valores esperados
Se realizaron estudios clínicos con el ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV utilizando la plataforma Cepheid
SmartCycler® II y el Biosystems® 7500 Fast Dx. Se realizaron pruebas con muestras prospectivas recibidas de
todas partes de los Estados Unidos en el invierno de 2012 (entre enero del 2012 y marzo de 2012). La siguiente
tabla proporciona el valor esperado para cada virus en los dos instrumentos.
Valores esperados para el invierno de 2012
Instrumento
RSV
Cepheid SmartCycler® II
15,6 % (158/1014)
Applied Biosystems® 7500 Fast Dx
16,4 % (166/1012)
hMPV
14,6 % (148/1014)
15,5 % (157/1012)
Se realizó un estudio clínico más pequeño con el ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV utilizando el
instrumento Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR. Se realizaron pruebas con muestras
prospectivas recibidas de todas partes de los Estados Unidos en el invierno de 2013 (entre enero del 2013 y
febrero de 2013). La siguiente tabla proporciona el valor esperado para cada virus en los dos instrumentos.
Valores esperados para el invierno de 2013
Instrumento
RSV
instrumento Life Technologies
18,6 % (59/317)
QuantStudio Dx Real-Time PCR
hMPV
14,4 % (45/317)
Rendimiento clínico
Las características de rendimiento del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV con el instrumento Cepheid
SmartCycler® II y la plataforma Applied Biosystems® 7500 Fast Dx se establecieron en un estudio prospectivo
realizado durante la temporada de 2012 del virus respiratorio (entre enero y marzo de 2012). Las muestras
utilizadas en este estudio fueron exudados nasales recientes (414) y congelados (600) recolectados por cuatro
centros de todas partes de los Estados Unidos para realizar pruebas de rutina del virus respiratorio. Se
recolectó y analizó una sola muestra por paciente (muestra directa, DFA y cultivo con DFA). Las muestras
residuales se extrajeron con el NucliSENS easyMAG de bioMérieux y se analizaron con el ensayo Quidel
Molecular RSV+hMPV con el instrumento ABI 7500 Fast Dx y el instrumento Cepheid SmartCycler II. Se
enviaron alícuotas de cada muestra a un punto central para análisis con una prueba molecular de hMPV
autorizada por la FDA
Datos demográficos de edad
Applied BioSystem 7500 Fast Dx
Grupo
etario
(años)
<1
de 1 a
5
de 6 a
10
de 11 a
15
de 16 a
21
Cepheid SmartCycler II
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
para
para
total
para
para
total
RSV
Prevalencia hMPV Prevalencia analizadas RSV
Prevalencia hMPV Prevalencia analizadas
72
28,3 %
38
15,0 %
254
71
27,5 %
35
13,6 %
258
72
19,9 %
76
21,5 %
354
67
19,0 %
73
20,7 %
352
6
4,5 %
17
12,7 %
134
6
4,5 %
16
11,9 %
134
3
4,8 %
7
11,3 %
62
3
4,8 %
6
9,7 %
62
3
9,1 %
1
3,0 %
33
3
9,1 %
1
3,0 %
33
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Applied BioSystem 7500 Fast Dx
Grupo
etario
(años)
>21
Cepheid SmartCycler II
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
para
para
total
para
para
total
RSV
Prevalencia hMPV Prevalencia analizadas RSV
Prevalencia hMPV Prevalencia analizadas
10
5,7 %
18
10,3 %
175
8
4,6 %
17
9,7 %
175
Total
166
16,4 %
157
* Dos muestras fueron no válidas.
15,5 %
1012*
158
15,6 %
148
14,6 %
1014
Estudio clínico prospectivo – Cepheid SmartCycler® II
Se analizaron mil catorce (1014) muestras con métodos para RSV comparativos y sujeto. Una (1) muestra
estaba contaminada y tres (3) eran tóxicas en el cultivo celular (0,4 %). Estas cuatro (4) muestras fueron
excluidas del análisis. En la siguiente tabla se detallan los resultados de las mil diez (1010) muestras restantes.
Sitio combinado - Virus sincicial respiratorio
DSFA y cultivo celular con
DFA
CI 95 %
POS
NEG
Total
Sensibilidad
97,9 % 93,9 %
99,3%
POS
137
21*
158
Especificidad
97,6 % 96,3%
98,4 %
Quidel Molecular
RSV+hMPV
NEG
3
849
852
Total
140
870
1010
* Todas las muestras discordantes fueron positivas para RSV por un ensayo RT-PCR autorizado por la FDA.
Se analizaron novecientos sesenta (960) muestras con dispositivos de comparación y sujeto para hMPV (el
dispositivo comparador no estuvo disponible para completar la prueba de comparación de cincuenta y cuatro
(54) muestras). Nueve (9) muestras fueron no válidas en el dispositivo de comparación (0,9 %). Estas nueve (9)
muestras fueron excluidas del análisis. En la siguiente tabla se detallan los resultados de las novecientas
cincuenta y una (951) muestras.
Sitio combinado - Metaneumovirus humano
Prueba molecular de hMPV
autorizada por la FDA
Quidel Molecular
POS
RSV+hMPV
NEG
Total
POS
NEG
Total
145
5
150
3
798
801
148
803
951
CI 95 %
Concordancia porcentual
positiva
Concordancia porcentual
negativa
96,7 %
92,4 %
98,6 %
99,6%
98,9%
99,9 %
Estudio clínico prospectivo - Applied Biosystems® 7500 Fast Dx
Se analizaron mil catorce (1014) muestras con métodos para RSV comparativos y sujeto. Una (1) muestra
estaba contaminada y tres (3) eran tóxicas en el cultivo celular (0,4 %). Dos (2) muestras fueron no válidas con
los métodos sujeto (0,2 %). Estas seis (6) muestras fueron excluidas del análisis. En la siguiente tabla se
detallan los resultados de las mil ocho (1008) muestras restantes.
Sitio combinado - Virus sincicial respiratorio
DSFA y cultivo celular con
DFA
CI 95 %
POS
NEG
Total
Sensibilidad
98,6 % 94,9 %
99,6%
POS
138
28*
166
Especificidad
96,8 % 95,4 % 97,8 %
Quidel Molecular
RSV+hMPV
NEG
2
840
842
Total
140
868
1008
* 25 de 28 muestras originalmente discordantes fueron positivas para RSV por un ensayo RT-PCR autorizado
por la FDA.
Se analizaron novecientos sesenta (960) muestras con dispositivos de comparación y sujeto para hMPV (el
dispositivo comparador no estuvo disponible para completar la prueba de comparación de cincuenta y cuatro
(54) muestras). Nueve (9) muestras fueron no válidas en el dispositivo de comparación (0,9 %). Dos (2)
muestras fueron no válidas con los métodos sujeto (0,2 %). Estas once (11) muestras fueron excluidas del
análisis. Los resultados de las novecientas cuarenta y nueve (949) muestras se detallan en la siguiente tabla.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Sitio combinado - Metaneumovirus humano
Prueba molecular de hMPV
autorizada por la FDA
Quidel Molecular
POS
RSV+hMPV
NEG
Total
POS
NEG
Total
147
3
150
9
790
799
156
793
949
CI 95 %
Concordancia porcentual
positiva
Concordancia porcentual
negativa
98,0 %
94,3 %
99,3%
98,9%
97,9 %
99,4 %
Estudio clínico prospectivo - Life Technologies QuantStudio Dx
Las características de rendimiento del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV con el instrumento Life
Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR se establecieron en un estudio prospectivo realizado durante la
temporada de 2013 del virus respiratorio (entre enero y febrero de 2013). Las muestras utilizadas en este
estudio fueron exudados recientes (317) recolectados para realizar pruebas de rutina del virus respiratorio en
los Estados Unidos. Se recolectó y analizó una sola muestra por paciente (muestra directa, DFA y cultivo con
DFA) para RSV inmediatamente después de la recolección. Las muestras fueron extraídas con el sistema
easyMAG de bioMérieux y analizadas con el ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV. Se enviaron alícuotas de
cada muestra a un punto central para análisis con una prueba molecular de hMPV autorizada por la FDA.
Virus sincicial respiratorio
DSFA y cultivo celular con
DFA
CI 95 %
POS
NEG
Total
Sensibilidad
100 %
92 %
100 %
POS
45
14*
59
Especificidad
95 %
92 %
97 %
Quidel Molecular
RSV+hMPV
NEG
0
258
258
Total
45
272
317
* De las catorce (14) muestras de RSV falsas positivas del ensayo QM RSV+hMPV, nueve (9) fueron positivas
para RSV utilizando un ensayo con marcado CE.
Metaneumovirus humano
Prueba molecular de hMPV
autorizada por la FDA
POS
NEG
Total
CI 95 %
Concordancia porcentual
positiva
Concordancia porcentual
negativa
Quidel Molecular
POS
43
2
45
RSV+hMPV
NEG
0
268
268
Total
43
270
313
* Cuatro muestras son NO VÁLIDAS en comparación y no están incluidas en esta tabla.
100 %
92 %
100 %
99 %
97 %
100 %
Rendimiento analítico
Nivel de detección
La sensibilidad analítica (límite de detección o LoD) del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV se determinó
mediante cultivos cuantificados (TCID50/ml) de 2 cepas de RSV y 4 cepas de hMPV (1 A1, 1 A2, 1 B1, 1B2) de
las que se hicieron diluciones seriadas con matriz nasofaríngea negativa. A partir de cada dilución, se realizaron
extracciones duplicadas 20 veces por cada concentración de virus con el sistema NucliSENS easyMAG y se
analizaron en las tres plataformas (solo los subtipos A2 y B2 de RSV se analizaron en el QuantStudio). La
sensibilidad analítica (LoD) se define como la concentración más baja en la cual el 95 % de todos los duplicados
dieron positivo.
Resumen de valores de LoD
Virus
RSV A
RSV B
hMPV-A1
LoD TCID50/ml
7500 Fast Dx
6,29E-01
7,5E-01
1,7E+01
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
LoD TCID50/ml
SmartCycler
1,89E+00
2,25E+00
2,65E+01
LoD TCID50/m
QuantStudio
6,29E-01
2,25E-01
Página 22 de 28
hMPV-A2
hMPV-B1
hMPV-B2
4,17E+00
1,05E+00
3,21E+00
4,17E+00
7,88E+00
9,63E+00
2,91E+00
2,25E+00
Reactividad analítica (inclusividad)
La reactividad del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV fue evaluada en múltiples cepas de RSV y hMPV. El
panel de reactividad analítica consistió de 5 cepas de RSV y 11 cepas de hMPV (2 A-1, 2 A-2, 2 B-1, 4 B-2 y 1 sin
tipo). Cada integrante del panel se extrajo con el instrumento NucliSens easyMAG y se analizó por triplicado en
las plataformas Cepheid SmartCycler II y ABI 7500 Fast Dx.
Panel de inclusividad para RSV
Subtipo
Cepa
TCID50/ml
A (NIBSC)
A
B
B
B
A-2
A-2
Washington
9320
CH9318(1B)
N/A
5,67E+00
2,25E+00
2,25E+00
2,25E+00
Ensayo Quidel Molecular
RSV+hMPV
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Panel de inclusividad para hMPV
Subtipo
Cepa
TCID50/ml
A1
A1
A2
A2
B1
B1
B2
B2
B2
B2
hMPV (NIBSC)
IA3-2002 Gen G
IA10-2003
IA14-2003 Gen G
Aislamiento clínico
Perú2-2002 Gen G
Perú3-2003 Gen G
Perú1-2002 Gen G
Perú6-2003
IA18-2003 Gen G
IA18-2003 Gen G
N/A
7,95E+01
7,95E+01
1,25E+1
1,25E+1
2,36E+01
2,36E+01
9,63E+00
9,63E+00
9,63E+00
9,63E+00
N/A
Ensayo Quidel Molecular
RSV+hMPV
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
El ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV detectó el 100 % de las cepas de RSV y de hMPV en las plataformas ABI
7500 Fast Dx y Cepheid SmartCycler® II.
Estudio de reproducibilidad
La reproducibilidad del ensayo Quidel Molecular Influenza RSV+hMPV fue evaluada en 3 laboratorios
separados. La reproducibilidad fue evaluada mediante un panel de 4 muestras simuladas que incluyen
muestras positiva media y positiva baja, RSV negativa alta, hMPV y negativa. Los paneles y los controles fueron
analizados en cada sitio por 2 operadores durante 5 días (triplicando el análisis x 2 operadores durante 5 días x
3 sitios = 90 resultados por nivel por cada virus). Los valores de LoD se tomaron a partir de los valores
obtenidos en el estudio de LoD. Las muestras de los paneles y controles se extrajeron con el sistema easyMAG
de bioMérieux y probados en el Cepheid SmartCycler II y el Applied Biosystems 7500 Fast Dx.
Resultados de reproducibilidad – Cepheid SmartCycler II
Sitio 1
ID del integrante del
Resultados
panel
AVE Ct*
positivos
RSV negativa alta
0,05x LoD
RSV positiva baja
2x LoD
RSV positiva media 5x
LoD
RSV negativa
Sitio 2
%CV
Resultado
AVE Ct*
s positivos
Sitio 3
%CV
Resultad
os
AVE Ct*
positivos
%CV
Total de
resultad
os
positivo
s
8/30
44,3
9,3
6/30
47,4
5,4
1/30
48,7
N/A
15/90
30/30
31,2
7,3
30/30
31,4
4,1
30/30
30,9
1,5
90/90
30/30
29,6
5,7
30/30
29,7
3,1
30/30
29,5
2,0
90/90
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Página 23 de 28
Resultados de reproducibilidad – Cepheid SmartCycler II
Sitio 1
ID del integrante del
Resultados
panel
AVE Ct*
positivos
Sitio 2
%CV
Resultado
AVE Ct*
s positivos
Sitio 3
%CV
Resultad
os
AVE Ct*
positivos
%CV
Total de
resultad
os
positivo
s
RSV control negativo
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
RSV control positivo
30/30
30,0
1,8
30/30
31,0
3,3
30/30
30,6
1,2
90/90
34,3
8,3
6/30
41,8
6,3
8/30
34,9
6,4
26/90
31,1
6,7
30/30
32,2
6,2
30/30
31,1
3,3
90/90
29,3
2,0
30/30
29,9
3,2
30/30
29,8
3,4
90/90
hMPV negativa alta
12/30
0,15x LoD
hMPV positiva baja
30/30
2x LoD
hMPV positiva media 5x
30/30
LoD
hMPV negativa
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
hMPV control negativo
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
hMPV control positivo
30/30
30,3
1,4
30/30
30,9
1,9
30/30
30,8
2,5
90/90
* Ct promedio basado en el promedio de resultados positivos únicamente. Los valores 0 de Ct quedaron fuera
de este cálculo.
Resultados de reproducibilidad – Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Sitio 1
ID del integrante del
Resultados
panel
AVE Ct*
positivos
RSV negativa alta
0,05x LoD
RSV positiva baja
2x LoD
RSV positiva media 5x
LoD
Sitio 2
%CV
Resultado
AVE Ct*
s positivos
Sitio 3
%CV
Resultad
os
AVE Ct*
positivos
%CV
Total de
resultad
os
positivo
s
14/30
30,7
8,3
3/30
33,8
2,4
9/30
32,3
4,0
26/90
30/30
23,7
7,4
30/30
23,8
3,1
30/30
23,4
4,5
90/90
30/30
20,5
4,0
30/30
21,8
2,2
29/29
21,1
2,2
89/89
RSV negativa
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
RSV control negativo
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
RSV control positivo
30/30
19,7
6,5
30/30
20,0
8,5
30/30
19,6
1,9
90/90
24,9
19,5
6/30
29,1
10,2
10/30
25,1
16,9
30/90
21,0
8,7
30/30
21,5
4,1
30/30
21,6
5,8
90/90
18,9
3,3
30/30
19,6
3,0
29/29
19,2
2,6
89/89
hMPV negativa alta
14/30
0,15x LoD
hMPV positiva baja
30/30
2x LoD
hMPV positiva media 5x
30/30
LoD
hMPV negativa
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
hMPV control negativo
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
hMPV control positivo
30/30
19,7
3,9
30/30
20,0
1,7
30/30
19,9
1,4
90/90
* Ct promedio basado en el promedio de resultados positivos únicamente. Los valores 0 de Ct quedaron fuera
de este cálculo.
Especificidad analítica – reactividad cruzada
La especificidad analítica del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV fue evaluada por medio del análisis de un
panel compuesto de 34 virus, 26 bacterias y 1 cepa de levadura que representan los patógenos respiratorios
comunes o la flora que se encuentra comúnmente en la nasofaringe. Las muestras se extrajeron con el
instrumento NucliSens easyMAG y se analizaron por triplicado en las plataformas Applied Biosystems 7500
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
Página 24 de 28
Fast Dx y Cepheid SmartCycler II. La especificidad analítica del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV fue del
100 %.
Los organismos utilizados para el estudio fueron los siguientes:
Virus
Gripe A/México/4108/2009, Gripe B/Florida/04/2006, Adenovirus 1/Adenoide 71, Adenovirus 2, Adenovirus 3,
Adenovirus 4, Adenovirus 5, Adenovirus 7, Adenovirus 11, Adenovirus 14, Adenovirus 31, Coronavirus NL63,
Coronavirus 229E, Coronavirus OC43, Virus Coxsackie B4, Virus Coxsackie B5/10/2006, Citomegalovirus,
Echovirus 7, Echovirus 9, Echovirus 6, Echovirus 11, Enterovirus 71, Enterovirus 70, Virus de Epstein-Barr, HSV
Tipo 1, cepa MacIntyre, Rinovirus humano, HSV Tipo 2, cepa G, Virus del sarampión, Virus de parotiditis,
Parainfluenza Tipo 1, Parainfluenza Tipo 2, Parainfluenza Tipo 3, Parainfluenza Tipo 4, Virus varicela zóster
Bacterias
Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Legionella
pneumophila, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycoplasma
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Neisseria mucosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Moraxella
catarrhalis, Corynebacterium diphtheriae, Lactobacillus plantarum, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus salivarius, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus.
Levadura
Candida albicans
Especificidad analítica – sustancias interferentes
El rendimiento del ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV se evaluó con sustancias potencialmente interferentes
que pueden estar presentes en las muestras nasofaríngeas. Las sustancias potencialmente interferentes se
evaluaron utilizando RSV B y hMPV B1 a concentraciones de 3x y 10x LoD. No se encontró evidencia de
interferencia causada por las sustancias analizadas a 3x 10x LoD.
Nombre de la sustancia
Mucina (glándula sublingual bovina, tipo I-S)
Sangre (humana), anticoagulada con EDTA
Neo-sinefrina
Spray nasal Afrin
Zicam: gel homeopático nasal líquido para
aliviar la alergia que no provoca
somnolencia ni goteo
Concentración analizada
60 µg/ml
2 % (vol/vol)
15 % (vol/vol)
15 % (vol/vol)
Spray nasal salino
15 % (vol/vol) de la dosis
Pastillas para la garganta
Zanamivir
Tobramicina
Mupirocina
Fosfato de oseltamivir
5 % (vol/vol)
0,68 g/ml; 1/18 gotas, molidas;
ingredientes activos: 1,7 mg/ml de
mentol
3,3-5 mg/ml
4,0 µg/ml
6,6-10 mg/ml
7,5-25 mg/ml
Análisis de contaminación cruzada y de arrastre
En un estudio interno, no hubo evidencia de contaminación de arrastre/cruzada con el ensayo Quidel
Molecular RSV+hMPV utilizando el instrumento de extracción automatizada de ácidos nucleicos NucliSENS
easyMAG y las tres plataformas del termociclador. Applied Biosystems 7500 Fast Dx o el Cepheid SmartCycler.
Atención al cliente y servicio técnico
Para hacer un pedido o solicitar servicio técnico, comuníquese con un representante de Quidel al (800) 8741517 (teléfono gratuito en los EE. UU.) o al (858) 552-1100 (fuera de los EE. UU.), de lunes a viernes de
8:00 a. m. a 5:00 p. m. hora de la costa este de EE. UU. También pueden realizarse pedidos por fax al (740)
592-9820. Para solicitar asistencia por correo electrónico, envíe mensaje a [email protected] o
[email protected]. Para obtener asistencia fuera de los EE. UU., comuníquese con su distribuidor
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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local. Puede obtener información adicional sobre Quidel, nuestros productos y nuestros distribuidores en el
sitio web: quidel.com.
Propiedad intelectual
Marcas comerciales
Smartcycler® es una marca registrada de Cepheid Corporation. Applied Biosystems® es una marca registrada
de Life Technologies. NucliSENS® y easyMAG® son marcas registradas de bioMerieux, Inc. TaqMan® es una
marca registrada de Roche. CAL Flour® Red 610 y Quasar®670 son marcas registradas de BioSearch
Technologies, Inc.
Patentes
Los colorantes utilizados en este producto se venden con licencia de BioSearch Technologies, Inc., y están
protegidos por patentes estadounidenses y mundiales vigentes o en trámite.
La compra de este producto concede al comprador derechos, bajo determinadas patentes de Roche, para su
uso exclusivo en servicios de diagnóstico in vitro en humanos. La compra no da derecho a ninguna patente
general ni a ningún otro tipo de licencia aparte del derecho específico de uso especificado aquí.
Este producto está protegido por las patentes de los Estados Unidos números 7.531.342; 7.449.374; las
patentes internacionales correspondientes a las mismas; otras patentes estadounidenses e internacionales
pendientes.
Ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV (CE)
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Glosario
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Control
Consulte las instrucciones de uso
Indicaciones
96
Contiene una cantidad suficiente para 96
determinaciones
Riesgos biológicos
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Referencias
1
2
3
4
5
6
7
8
Glezen et. Al. 1986. American journal of diseases of children (1960) 140(6): 543–6.
Hall, Caroline Breese. et al. 2009. New England Journal of Medicine 360(6): 588–98
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Clinical and Laboratory Standards Institute. Viral Culture; Approved Guidelines. CLSI document M41-A [ISBN
1562386239] Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
Pennsylvania 19087-1898, EE. UU., 2006.
M103 – Kit de ensayo Quidel Molecular RSV+hMPV
MDSS GmBH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Alemania
Quidel Corporation
Oficina Central Mundial
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