UBA III – Biologia Molecular
Aula Laboratorial 1
2012/2013
Maria José Correia
[email protected]
Sumário L1

Apresentação sucinta do programa das aulas
laboratoriais;

Segurança no laboratório

Introdução às técnicas básicas para o estudo
dos ácidos nucleicos

Isolamento e purificação de DNA

Digestão de DNA:
• Digestão de DNA do bacteriófago λ com enzimas de
restrição.
UBA-III Biologia Molecular 2012/2013
Programa
Aula Data
Tema
1
27/9
Introdução às técnicas básicas para o
estudo dos ácidos nucleicos. Digestão
de DNA genómico com enzimas de
restrição
2
11/10
Separação dos fragmentos de DNA
em gel de agarose e análise dos
resultados.
Ficha de avaliação
UBA-III Biologia Molecular 2012/2013
Segurança no laboratório
 Regras
gerais:
 Nunca
trabalhar sozinho!
 Nunca
COMER, BEBER, FUMAR, aplicar lentes
de contato ou cosméticos!
 Nunca
cheirar soluções ou reagentes
 Nunca
pipetar com a boca
 Lavar
imediatamente a pele após contato
com culturas/químicos
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Segurança no laboratório

Atitudes:

Usar o senso comum (a maioria dos acidentes de
laboratório começa com algo simples);

Estar consciente – conhecer os reagentes antes
de os usar (ler os rótulos, etc.)

Estar protegido – conhecer as práticas e
equipamentos que podem aumentar a proteção
(máscaras, luvas, etc.)
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Segurança no laboratório

Bancada:




As bancadas de trabalho devem ser mantidas
organizadas e limpas
Identificar todo o material utilizando para isso
marcadores de vidro apropriados
Os lixos devem ser perfeitamente identificados
O material de vidro estalado ou partido deve ser
imediatamente rejeitado
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Segurança no laboratório

Protecção pessoal:



Usar bata e manter os cabelos compridos
apanhados;
Usar a hotte sempre que necessário;
Antes de abandonar o laboratório , limpar a
bancada, retirar a bata e lavar as mãos.
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Instruções gerais



Ler os protocolos antes de cada aula prática
Seguir atentamente as instruções fornecidas
pelo docente antes de executar o trabalho
proposto
Depois de terminar o trabalho de cada aula
arrumar a bancada. Colocar o lixo e o
material contaminado nos locais apropriados.
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Introdução às técnicas para
estudar os ácidos nucleicos

Manipulação de moléculas de DNA




Isolamento e purificação de DNA genómico
Enzimas de restrição
Separação em gel de agarose
Aplicações biotecnológicas
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Técnicas de extração de DNA
genómico

DNA




lise celular
libertação de todo o material
intracelular
precipitação de proteínas e
detritos celulares
purificação do DNA
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Lise celular



Lise mecânica/física

Homogenizador

Ultra-sonicador

French pressure cell press

Fervura e pressão osmótica
Lise alcalina

soluções fortemente alcalinas (de hidróxido de sódio)

SDS (dodecil sulfato de sódio)
Lise enzimática

Proteases

Rnases
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Precipitação diferencial

Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico




Fenol e clorofórmio desnaturam as proteínas
Fase fenólica (proteínas em solução) separa-se da fase
aquosa (DNA)
Precipitação com etanol absoluto (ou
isopropanol)

Insolubilidade do DNA em etanol

Presença de catiões monovalentes
Lavagem com 70% etanol

Dissolução dos catiões

DNA puro no precipitado
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Extração de ácidos nucleicos
amostras diversas
lise celular
Precipitação de proteínas
Lavagem e precipitação
de DNA
Ressuspensão do DNA em TE
(pH8.0) ou em água estéril
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Determinação da concentração e
grau de pureza

Método espetrofotométrico

A absorvância a 260nm é proporcional à quantidade
de ácidos nucleicos
Absorvância Equivalência
260nm


~50μg/ml dsDNA
~37μg/ml ssDNA
~40μg/ml ssRNA
~20μg/ml oligonucleótidos (ss)
A absorvância a 280nm que é proporcional à
quantidade de proteínas e fenol
O grau de pureza é frequentemente estimado através
da razão A260/A280 que deve ser entre 1,8 e 2,0
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Eletroforese em gel de agarose

Separação de diferentes fragmentos de DNA
em função da sua mobilidade num campo
eléctrico
http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php
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Endonucleases ou enzimas de
restrição

Enzimas que reconhecem pequenas sequências de DNA
(4 a 8 nucleótidos)

Cortam o DNA de cadeia dupla no interior dessa
sequência ou num local adjacente a ela.

Catalisam a quebra de uma ligação fosfodiéster entre
dois nucleótidos consecutivos.

Geram dois fragmentos cujos terminais podem ser:
• coesivos
• cegos
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Enzimas de restrição
Isosquisómeros
◦ reconhecem e cortam a mesma
sequência
MboI
GATC
NdeII
GATC
Neosquisómeros
◦ reconhecem a mesma sequência
mas cortam ligações distintas.
SacI
GAGCTC
EcoICRI
GAGCTC
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Neste trabalho…
• Bacteriófago λ
(≈ 48,5 pb)
• Enzimas de restrição
Célula bacteriana
DNA E. coli
(Produzem terminais
coesivos)
Entrada do DNA λ
Ciclo lisogénico
Ciclo lítico
Replicação do DNA λ
Fago λ
DNA λ
activação
DNA λ integrado no
genoma bacteriano
Lise bacteriana e
libertação do DNA λ
análise dos padrões
de restrição
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Preparação das amostras
• Colocar as amostras em gelo:
Enzimas de restrição
• Identificar os tubos para as reacções de digestão
Amarelo
Violeta
Verde
Laranja
L = DNA λ
P = PstI (Digestão do DNA λ)
E = EcoRI (Digestão do DNA λ)
H = HindIII (Digestão do DNA λ)
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Preparação das amostras
• Pipetar os reagentes de acordo com a tabela :
Micropipetas!!!
Tubo DNA RB
PstI
EcoRI HindIII
• Misturar os reagentes e incubar a 37ºC, durante 30 minutos
37ºC
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Biologia
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