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DIVERSIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE Bufo schneideri, BASEADA EM
MARCADORES DE MICROSSATÉLITE.
1,5
2,5
Alessandra Alves de Oliveira ; Valdermar de Paula Carvalho ; Juciene Bertoldo da
3,5
4,5
4,5
Silva ; Marcos Aparecido Martins dos Santos ; Carolina Prudente Marques ; Elvis
4,5
4,5
4,5
Souza Nascimento ; Aline Lara Bueno Nogueira ; José Luis de Souza ; Cristino
Renato da Silva 3,6
1
2
3
4
5
6
Bolsista PBIC/UEG
Pesquisador – Orientados
Pesquisador – Colaborador
Voluntário Iniciação Científica
Curso de Biologia, Unidade Unive rsitária de Quirinópolis
Pós-graduação em Biologia, Unidade Universitária de Quirinópolis
RESUMO. Este trabalho tem como objetivo analisar a diversidade genética, com base em
marcadores moleculares de microssatélites, de anfíbios anuros da espécie Bufo schneideri,
pertencentes a herpetofauna dos municípios de Caçu, Gouvelândia e Quirinópolis, região
sudoeste do Estado de Goiás e Município de Ipiaçu, Sudoeste do Estado de Minas Gerais.
Foram coletados, até o presente momento, 45 indivíduos. As coletas foram realizadas durante
o período de setembro e outubro do ano de 2004. Imediatamente após a captura, os indivíduos
foram transportados até o laboratório de Biologia da Unidade Universitária de Quirinópolis,
submetidos à procedimentos biométricos, sacrifício, coleta de amostras de fígado, fixação e
conservação. Após a coleta, as amostras de fígado foram devidamente embaladas,
identificadas e armazenadas a -20 ºC. Destas amostras será extraído o DNA a ser utilizado nas
reações de amplificação para obtenção dos marcadores moleculares.
Palavras chave: Marcadores moleculares; estrutura genética; anfíbios anuros.
Introdução
O estudo da diversidade biológica representa atualmente uma fonte de conhecimentos na área
de ecologia e sistemática de organismos e ecossistemas e serve como suporte para o
desenvolvimento de projetos ligados à conservação ou ao uso sustentado de ecossistemas
2
(Scott et al.,1987). Devido a capacidade de revelar polimorfismos diretamente do DNA dos
indivíduos, marcadores moleculares tem sido muito utilizados em estudos relacionados com a
diversidade genética de populações. Dentre várias técnicas de obtenção de marcadores
moleculares, atualmente disponíveis, marcadores baseados na PCR (Polymerase Chain
Reaction) ou reação de polimerase em cadeia, concebida por Kary Mullis (Mullis & Faloona,
1987; Saiki et al., 1985), tem sido os mais utilizados.
Microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats), são seqüências simples repetidas
existentes em grande quantidade no genoma de eucariontes (Tautz and Renz, 1984), são
amplificadas via PCR e geralmente apresentam locos multialélicos de grande conteúdo
informativo para estudos de diversidade genética. Estudos genéticos envolvendo populações de
anfíbios tem sido descritos para várias espécies como Bufo canorus, (Shaffer and Fellers,
2000), populações de anfíbios da espécie de rã de pântano Rana ridibunda (Zeisset and
Beebee, 2003), populações da espécie Rana luteiventris (Bos and Sites Jr., 2001).
Bufo schneideri Werner, 1894 é uma espécie que pertence ao grupo marinus, que
composta por animais popularmente denominados de sapo-cururu ou sapo-boi com ampla
distribuição (Bastos et al., 2003; Frost, 1985). Entretanto, apesar de ser uma espécie com
ampla distribuição na América do Sul, sua ecologia é pouco conhecida (Guix, 1993).
A fragmentação de habitats devido a ação antrópica, introduz uma série de novos
fatores na história evolutiva de populações naturais de plantas e animais. Analisar a
diversidade genética em espécies pertencentes ao ecossistema é o primeiro passo para adoção
de medidas de conservação e uso racional do ambiente. O presente projeto tem como
finalidade acessar a diversidade genética e a estrutura genética de populaçòes da espécie Bufo
schneideri, pertencentes a herpetofauna dos municípios de Caçu, Gouvelândia e Quirinópolis,
regiào sudoeste do Estado de Goiás e do Município de Ipiaçu, Sudoeste do Estado de Minas
Gerais, a partir de marcadores moleculares de microssatélites.
Material e Métodos
Coleta de espécimes de Bufo schneideri, amostragem de tecidos para extração de DNA,
catalogação e fixação – a captura dos indivíduos foi realizada manualmente no período
noturno. No início de cada atividade de campo, foram registradas as condições metereológicas
diárias (vento, chuva, aspecto do céu e etc.) e também medidos a temperatura do ar, da água
com termômetro de mercúrio com precisão de 0,5°C e a umidade relativa do ar com
termohigrômetro. As coletas foram realizadas na região Sudoeste do Estado de Goiás,
3
município de Caçu e Quirinópolis e no Município de Ipiaçú, Sudoeste do Estado de Minas
Gerais. Os indivíduos capturados foram medidos com paquímetro de precisão 0,05mm,
pesados com balança de precisão e sacrificados em éter. Imediatamente após o sacrifício, as
mostras de fígado, de cada indivíduo, foram removidas, identificadas e armazenados a
temperatura de -20ºC para posterior extração de DNA. Os indivíduos foram catalogados e
preservados no museu de Zoologia de Universidade Estadual de Goiás, Unidade Universitária
de Quirinópolis.
Extração e reações de amplificação de DNA - O DNA a ser utilizado nas análises será
extraído do fígado dos espécimes coletados, de acordo com protocolo descrito por Almeida et
al. (2001). Os fragmentos de SSR serão amplificados com a utilização primers mapeados em
regiões do genoma de anfíbios contendo microssatélites.
Análise dos dados - Parâmetros genéticos como freqüência alélica, calculada pela contagem
direta dos diferentes genótipos presentes nas populações, a Estatística F (FIT, FST e FIS)
entre as amostras e populações serão utilizados para verificar a estrutura genética das
populações.
Resultados e Discussão
Os anfíbios anuros vivem no entorno de corpos d’água e em lugares mais úmidos da
floresta principalmente em estação chuvosa, onde se pode ouvir grandes variedades de sons
emitidos pelos machos que coaxam (vocalizam) para atrair a fêmea e se reproduzirem. Isso
acontece mais no período noturno, pois como sua pele é permeável, haveria muita perda de
água (por evaporação) se vocalizassem durante o dia.
O procedimento de captura dos espécimes foi realizado durante os meses de julho a
setembro de 2004, época em que ocorre o período reprodutivo da espécie Bufo schneideri.
Foram coletados um total de 45 indivíduos (Tabela 1).
Os anfíbios são o grupo que enfrenta os mais graves problemas provocados pelo uso
intensivo e não sustentado dos recursos naturais. Algumas espécies de anuros parecem estar
sofrendo declínios populacionais decorrente da redução da cobertura vegetal, ocasionada por
desmatamentos. De uma maneira geral, em conseqüência dos desmatamentos, as espécies de
anuros de áreas mais abertas, como aquelas originalmente cobertas por cerrados, têm
expandido geograficamente os seus limites, em detrimento das espécies de mata. Ao mesmo
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tempo, algumas espécies de mata, que ocorrem em clareiras naturais, se adaptaram às novas
condições dos ambientes abertos. Infelizmente, no entanto, a regra não é essa, pois diversas
espécies de anuros com modos reprodutivos especializados e adaptadas a microambientes
específicos, que só ocorrem nas matas, são automaticamente eliminadas com os
desmatamentos. Isto faz dos anuros um execelente grupo de espécies bioindicadoras de
qualidade ambiental e integridade de ecossistemas.
Considerando que o conhecimento da diversidade genética tem fundamental
importância para o desenvolvimento de projetos ligados à conservação e/ou uso sustentado de
ambientes ou áreas de preservação, as informações sobre a diversidade genética da espécie de
anfíbios anuros pertencentes a área em questão, pode contrib uir muito para o desenvolvimento
de estratégias de conservação, com intuito de garantir a manutenção da diversidade genética
das espécies inseridas no ecossistema do local.
Conclusões
A atividade de vocalização da espécie Bufo schneideri associada à atividade
reprodutiva, constitui um importante norteador para a localização e captura dos indivíduos.
Geralmente as atividades de vocalização são realizadas nos seguintes ambientes: Riacho
temporário dentro de floresta, floresta distante de corpos d'água, poças temporárias dentro de
floresta, poça permanente dentro de floresta, igarapé na borda de floresta, riacho na borda de
floresta, açude na borda de floresta, brejo na borda de floresta, poça temporária na borda de
floresta, poça temporária em pastagem, açude permanente em pastagem, pastagem distante de
corpos d'água.
As atividades de campo relacionadas à identificação através do canto, a localização e a
captura dos espécimes de anfíbios anuros da espécie Bufo schneideri, tem proporcionado
excelente treinamento para os acadêmicos participantes do projeto. Além das atividades de
campo, as atividades de análises biométricas dos indivíduos, de amostragem de tecidos
(fígado) para posterior extração de DNA, realizadas em laboratório, tem sido muito
proveitosas no fornecimento de conhecimento para acadêmicos do curso de biologia da
Unidade de Quirinópolis que participam do projeto.
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Tabela 01. Anfíbios anuros da espécie Bufo schneideri capturados nos municípios de Caçu,
Quirinópolis e Ipiaçú.
Nº de
idenficação
180
181
182
183
184
014
015
016
017
018
019
020
021
022
023
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
024
025
227
228
229
230
231
232
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
012
Sexo
Macho
Macho
Macho
Fêmea
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Macho
Fêmea
*CRA
(mm)
135,7
122,1
108,5
123,8
96,5
125
133
130
121
110
111
112
116
158
101
140
135
114
114,3
104,1
104,1
117
109
111
104,1
179,55
130,04
114
101
111,5
94
125
102
139
152
153
137
192
136
140
153
129
131
145
134
*Comprimento rostro-anal
Peso
(g)
198,5
168,7
157,7
260,2
114,8
137,06
191,81
157,32
113,44
97,86
100,13
108,84
131,06
300,0
109,66
258,4
236,1
140,7
150,8
119,3
119,3
166,1
123,1
66,1
107,9
120,89
191,64
157,8
113,3
165
86,81
167,8
102,1
201,70
310
300
175,3
300
219,63
221,81
305
149,87
164,01
248,32
214,80
Local de coleta
Fazenda Cachoeirinha
Fazenda Cachoeirinha
Fazenda Cachoeirinha
Fazenda Ribeirão do Caçu
Fazenda Ribeirão do Caçu
Fazenda Ribeirão do Caçu
Fazenda Ribeirão do Caçu
Fazenda Ribeirão do Caçu
Fazenda Ribeirão do Caçu
Fazenda Ribeirão do Caçu
Fazenda Ribeirão do Caçu
Fazenda Ribeirão do Caçu
Fazenda Ribeirão do Caçu
Fazenda Ribeirão do Caçu
Fazenda Ribeirão do Caçu
Chácara Vicentina
Chácara Vicentina
Chácara Vicentina
Chácara Vicentina
Chácara Vicentina
Chácara Vicentina
Chácara Vicentina
Chácara Vicentina
Chácara Vicentina
Chácara Vicentina
Chácara Vicentina
Chácara Vicentina
Chácara Fazendinha
Chácara Fazendinha
Chácara Fazendinha
Chácara Fazendinha
Chácara Fazendinha
Chácara Fazendinha
Lago Sol Poente
Lago Sol Poente
Lago Sol Poente
Lago Sol Poente
Lago Sol Poente
Lago Sol Poente
Lago Sol Poente
Lago Sol Poente
Lago Sol Poente
Lago Sol Poente
Lago Sol Poente
Lago Sol Poente
Município/Estad
o
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Caçu/GO
Ipiaçú/MG
Ipiaçú/MG
Ipiaçú/MG
Ipiaçú/MG
Ipiaçú/MG
Ipiaçú/MG
Ipiaçú/MG
Ipiaçú/MG
Ipiaçú/MG
Ipiaçú/MG
Ipiaçú/MG
Ipiaçú/MG
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
Quirinópolis/GO
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