Cinética Enzimática
Biologia Celular I
Curso de Bioquímica
FCUP
Dezembro de 2004
Introdução
Teórica
Enzimas
„
Proteínas que funcionam como
catalizadores biológicos das reacções.
aceleram a reacção
MAS
não reagem
Cinética Enzimática
„
Estudo da velocidade da reacção
enzimática.
„ Quantidade
de substrato consumido por
unidade de tempo.
„ Quantidade
de tempo.
de produto formado por unidade
Cinética Enzimática
„
Vai permitir analisar os factores que
influenciam essa mesma velocidade.
Concentração de Substrato
[S]
„
„
O aumento da concentração de
substrato – [S] – faz com que a
velocidade da reacção aumente até
certo ponto.
Há uma [S] a partir da qual todas as
enzimas estão ocupadas.
Velocidade Máxima
Gráfico de Michaelis-Menten
Velocidade Máxima e Km
„
„
Para determinar a velocidade máxima
utilizamos o gráfico de Michaelis-Menten.
É também através deste gráfico que
determinamos Km (abcissa do ponto com
ordenada ½Vmax).
– Traduz a afinidade entre enzima e o substrato:
quanto menor for Km, maior a afinidade.
Gráfico de Michaelis-Menten
„
Velocidade inicial em função da
concentração de substrato.
Declive das rectas tangentes aos
vários gráficos de absorvância em
função do tempo.
Variação da absorvância em função do
tempo para diferentes [S]
1,2
1
Abs
0,8
0,0417mM
0,0833mM
0,125mM
0,167mM
0,6
0,4
0,2
0
0
20
40
60
Tempo (s)
80
100
Gráfico de Lineweaver-Burk
„
„
„
Permite uma leitura fácil da velocidade
enzimática.
Obtém-se através da relação entre o inverso
da velocidade inicial e o inverso da
concentração de substrato.
A recta de Lineweaver-Burk tem ordenada
na origem igual a 1/Vmáx e abcissa na
origem igual a -1/Km.
Gráfico de Lineweaver-Burk
Trabalho
Prático
CH3CH2OH + NAD+ Ù CH3COH + NADH + H+
DA
„
A enzima desidrogenasse alcoólica
cataliza a reacção de oxidação do
etanol em acetaldeído removendo 2 eque são transferidos juntamente com
1H+ para o co-factor NAD+.
Composição das Amostras
Tampão
Pirofosfato
100 mM (mL)
mL)
NAD+
5 mM
(µL)
DA
0,3 mg/mL
mg/mL
(µL)
Etanol
10 M
(µL)
Água
(µL)
Volume
Final
( mL )
Tubo 1
0,5
25
100
100
2275
3,0
Tubo 2
0,5
50
100
100
2250
3,0
Tubo 3
0,5
75
100
100
2225
3,0
Tubo 4
0,5
100
100
100
2200
3,0
Os tubos brancos eram cada um dos tubos antes
de serem acrescentados 100 µL de etanol.
Procedimento
„
„
„
„
Pipetou-se cada uma destas soluções para uma
cuvete de 3 ml de capacidade.
Calibrou-se o espectrofotometro para um
comprimento de onda de 340 nm com os tubos
brancos.
Adicionou-se 100 µl de etanol 10M a cada uma das
soluções. Homogeneizou-se e colocou-se
rapidamente no espectrofotometro. Após 10
segundos da adição de etanol e de 5 em 5
segundos realizamos as leituras de absorvância.
Através dos resultados obtidos podemos calcular a
constante Km e a Vmáx.
Variação da absorvância em função do
tempo para diferentes [NAD+]
1,2
1
Abs
0,8
0,0417mM
0,0833mM
0,125mM
0,167mM
0,6
0,4
0,2
0
0
20
40
60
Tempo (s)
80
100
Exemplo de cálculos para o Tubo 1
„
V0 é o declive da tangente ao gráfico
da absorvância por tempo na origem.
V0 = (0,300 - 0) / ((20/60) - 0) = 0,900
Exemplo de cálculos para o Tubo 1
„
Cálculo da [NAD+]final
[NAD+] = n / V Ù 5 = n / 0,025 Ù
n = 0,125 mol
[NAD+]final = n / V = 0,125 / 3,0 Ù
[NAD+]final = 0,0417 mM
Gráfico de Michaelis-Menten para DA
4
3,5
Vo
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
0,05
0,1
[S]
0,15
0,2
Exemplo de cálculos para o Tubo 1
Sabemos que Abs = ε x l x c
ε 340nm NADH = 6200 L.mol-1.cm-1
l = Espessura da cuvete = 1 cm
Assim 0,900 = 6200 x 1 x c Ù
Ù c = 1,452 x 10-4 mol.L-1.min-1
c = n / V Ù n = 1,452 x 10-4 x 0,00300 =
4,36 x 10-7 mol.min-1
Exemplo de cálculos para o Tubo 1
„
„
„
„
„
Precisamos de determinar a massa da
enzima DA sabendo que c = 0,2 mg/mL e V
= 100 µL
C = m/V Ù m = 0,2 x 0,1 = 0,02 mg
V0(µmol.min-1.mg-1 da enzima) = 4,36 x 10-7
x 106 / 0.02 = 21,8
1/V0(µmol-1.min.mg) = 1/21,8 = 0,0459
1/[S](mM-1) = 1/0,0417 = 24,0
Valores necessários para a construção do
gráfico de Lineweaver-Burk
1/[S]
(mM-1)
(µmol-1min.mg)
24,0
0,0459
12,0
0,0353
8,00
0,0164
6,00
0,0120
1/v0
Sabendo que Km=0,1, -1/Km=-10
Vmáx=3,429 Abs.min-1 Ù
Ù Vmáx=83,0 µmol.min-1.mg-1
Assim 1/Vmáx=0,0120 µmol-1.min.mg
Gráfico de Lineweaver-Burk para DA
1/Vo (umol-1.min.mg)
0,045
0,04
0,035
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
-20
-10
0
10
1/[S] (mM-1)
20
30
Autoria
André Manuel Alves de Sousa
Miguel Peixoto de Almeida
Pedro Nuno de Moura Mendes
Bioquímica
FCUP
Dezembro de 2004