UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
MARIA DE FÁTIMA MATOS DE FREITAS
PRODUÇÃO DE β-GALACTOSIDASE POR Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 EM
SORO DE LEITE E IMOBILIZAÇÃO EM QUITOSANA
FORTALEZA – CE
2013
MARIA DE FÁTIMA MATOS DE FREITAS
PRODUÇÃO DE β-GALACTOSIDASE POR Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 EM
SORO DE LEITE E IMOBILIZAÇÃO EM QUITOSANA
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química da Universidade Federal do Ceará,
como requisito parcial para a obtenção do
Título de Mestre em Engenharia Química.
Área de concentração: Processos Químicos e
Bioquímicos.
FORTALEZA – CE
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências e Tecnologia
F934p
Freitas, Maria de Fátima Matos de.
Produção de β-galactosidase por Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 em soro de leite e
imobilização em quitosana / Maria de Fátima Matos de Freitas. – 2013.
99 f. : il. color., enc.; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia, Departamento de
Engenharia Química, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Fortaleza, 2013.
Área de Concentração: Processos Químicos e Bioquímicos.
Orientação: Profa. Dra. Luciana Rocha Barros Gonçalves.
Coorientação: Profa. Dra. Maria Valderez Ponte Rocha.
1. Fermentação. 2. Lactose. 3. Enzimas. 4. Íons. 5. Reator. I. Título.
CDD 660
Dedico este trabalho a minha mãe Aurenice,
ao meu irmão Charles, a minha irmã Fabiana
e ao meu esposo Domingos Sales.
AGRADECIMENTOS
Gratidão eterna a Deus que me protege, acompanha e ilumina cada dia de minha vida.
À minha família, ao meu pai Luiz (In Memoriam), minha mãe Aurenice, minha irmã Fabiana,
e meu irmão Charles que muito se sacrificaram para me ajudar, família que em nenhum
momento mediu esforços para que eu chegasse até o fim.
À profª Drª Luciana Rocha Barros, pela sua orientação e amizade, por toda sua dedicação
fundamental para o meu crescimento. Agradeço muito por ter novamente me acolhido e
acreditado neste trabalho, pelo o incentivo e todo apoio dado quando precisei.
À profª Drª Valderez Ponte Rocha pela orientação, paciência e dedicação. Agradeço pelas as
palavras amigas e por toda a ajuda quando as soluções pareciam não ter saída.
Ao meu esposo Domingos em especial, por todos os momentos ausentes, pelo carinho e apoio
incondicional, por almejar esse objetivo tanto quanto eu.
Aos meus príncipes Luiz e Lucas que são a razão do meu viver, desculpa por tanto trabalho,
pelas vezes que não pude levá-los para passear. Sei que em algumas ocasiões não entenderam
direito, mas com o passar do tempo chegarão a essa experiência.
A todos os professores da Engenharia Química, em especial ao Prof. Dr. Ivanildo José da
Silva Júnior e ao Prof. Dr. Hosiberto Batista de Sant’Ana pelo incentivo, sugestões e
confiança que sempre me passaram.
Ao grupo de pesquisa da Bioquímica da UFC, em especial ao Prof. José Tadeu Abreu de
Oliveira pelos ensaios de eletroforese.
A Drª Ana Iraidy Santa Brígida, pesquisadora da Embrapa, pela importante participação na
banca e contribuições.
Ao Dr. James Almada da Silva, professor da UFS, por toda a contribuição na Qualificação e
importante participação na banca.
Aos estagiários Lucas e Sandy que batalharam sempre atentos, dispostos e alegres na
execução de suas tarefas.
A todos integrantes do grupo GPBIO, pelo acolhimento no laboratório, pela troca de
conhecimento a cada dia de trabalho e principalmente pela amizade conquistada. Em especial,
as amigas Camilla, Cris, Mary, Ticiane, Diana, Jéssyca, Kamilly, Tigressa e Bete, que sempre
me apoiaram, obrigada por tudo.
A todos os amigos da turma do Mestrado, em especial a Adriana, Cívita, Ana Alice, Carol,
Helranyo, Regiane e Diego pela a convivência e grande amizade.
A todos os meus familiares, tios, primos e cunhados que também sempre torceram por mim.
À CAPES pelo apoio financeiro.
“Aprender é a única coisa de que a
mente nunca se cansa, nunca tem medo
e nunca se arrepende”.
Leonardo da Vinci
RESUMO
Neste trabalho, a enzima β-galactosidase, que catalisa a hidrólise da lactose em glicose e
galactose, foi produzida pelo cultivo do micro-organismo Kluyveromyces lactis NRRL Y1564
em soro de leite suplementado com extrato de levedura. A enzima é um metabólito
intracelular, sendo a liberação da enzima para o meio uma condição essencial, por isso
estudaram-se diferentes métodos químicos e mecânicos de extração como, agitação com
pérolas de vidro, ruptura em ultrassom com pérolas de vidro, adição de etanol e tolueno,
observando também, seus efeitos na atividade enzimática. Posteriormente, realizaram-se
ensaios para estudar a influência da temperatura (30, 34, 37 e 40 °C) na produção da enzima a
partir do soro de queijo. Na extração da enzima, o uso de esferas de vidro em vórtex foi o
método mais eficiente quando comparado com os outros avaliados. A enzima, não sofreu
inibição ou desnaturação quando incubadas com etanol, tolueno ou etanol-tolueno. A
temperatura ótima de produção da enzima por K. lactis NRRL Y1564 foi 30 °C, com
atividade enzimática de 4418,37 U/g de células em 12 h de fermentação. A enzima produzida
foi imobilizada em quitosana 2,0% m/v. Diferentes protocolos de ativação usando
glutaraldeído, epicloridrina ou glicidol foram avaliados. Estudou-se também, o tempo de
contato enzima-suporte (3, 5 e 10 horas) a fim de se obter um biocatalisador que apresentasse
alto rendimento, atividade recuperada e tempo de meia-vida, visando a hidrólise da lactose em
reator batelada e leito fixo. A influência da temperatura e do pH na hidrólise da lactose foi
avaliada, usando como substrato uma solução sintética (lactose 5,0% (m/v) e leite desnatado,
contendo 4,3% m/v de lactose. O suporte que apresentou melhores resultados nos parâmetros
de imobilização foi a quitosana 2% reticulada com glutaraldeído no tempo de imobilização de
5 horas. O biocatalisador produzido nesse estudo apresentou um fator de estabilidade de 17,37
vezes maior que a enzima solúvel, com uma estabilidade de armazenamento de 100% quando
armazenada a 4 °C por 90 dias. A temperatura ótima de hidrólise da lactose foi de 40 °C e o
pH ótimo foi 7,0 . A conversão da lactose a 40 °C para este derivado (3,0 U/g) foi em média
53% em 10 ciclos (bateladas consecutivas). Em reator batelada, a conversão em glicose a
partir da hidrólise da lactose, usando solução sintética, foi aproximadamente 86 % para a
enzima solúvel (3,8 U/mL) e 83 % para a enzima imobilizada (3,8 U/g). A conversão obtida
na hidrólise do leite desnatado foi de 17 % para a enzima solúvel e 20 % para a enzima
imobilizada.
Palavras chave: Soro de leite. Kluyveromyces lactis. Enzima β-galactosidase. Imobilização.
Hidrólise da lactose.
ABSTRACT
In this work, the enzyme β-galactosidase which catalyzes the hydrolysis of lactose to glucose
and galactose, was produced by cultivating the micro-organism Kluyveromyces lactis NRRL
Y1564 in whey supplemented with yeast extract. The enzyme is an intracellular metabolite,
the release enzyme is very important, therefore were studied various chemical and mechanical
methods of extraction and stirring with glass beads, sonication, addition of ethanol and
toluene, noting also their effects on enzymatic activity. Subsequently, trials were carried out
to study the influence of temperature (30, 34, 37 and 40 ° C) in the production of the enzyme
from the cheese whey. In the enzyme extraction, using glass beads by a vórtex was more
efficient method compared to others evaluated. The enzyme not presented inhibited or
denatured when incubated with ethanol, toluene or ethanol-toluene. The optimum temperature
for enzyme production by K. lactis NRRL Y1564 was 30 °C with enzymatic activity of
4418.37 U/g of cells at 12 h of fermentation. The enzyme produced was immobilized on
chitosan 2.0% w/v. Different activation protocols using glutaraldehyde, epichlorohydrin or
glycidol were evaluated. Was also studied, the contact time the enzyme-carrier (3, 5, and 10
hours) to obtain a biocatalyst to produce high yield, recovered activity and half-life in order to
hydrolysis of lactose in batch reactor and fixed bed. The influence of temperature and pH on
the hydrolysis of lactose was evaluated using as substrate a synthetic solution (lactose 5.0%
(w/v) in potassium phosphate buffer 100 mM with 0.1 mM MnCl2) and skimmed milk
containing 4.3% w/v lactose. The support shows better results in the parameters of
immobilization was chitosan 2% actived with glutaraldehyde and contact time of 5 hours.
The biocatalyst produced in this study showed a stability factor of 17.37 and a storage
stability of 100% when stored at 4 °C for 90 days. Temperature optimum hydrolysis of lactose
was 40 °C and the optimal pH 7.0. The conversion of lactose to 40 °C for this derivative (3.0
U/g) was on average 53% in 10 cycles (consecutive batches). In batch reactor, the conversion
to glucose by the hydrolysis of lactose using synthetic solution was approximately 86% for
the soluble enzyme (3.8 U/mL) and 83% of the immobilized enzyme (3.8 U/g). The
conversion obtained in the hydrolysis of skim milk was 17% for the soluble enzyme and 20%
for the immobilized enzyme.
Keywords: Whey, Kluyveromyces lactis, β-galactosidase, immobilization, hydrolysis of
lactose.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Reação de hidrólise enzimática de lactose através do uso de β-galactosidase ......... 22
Figura 2 - Estrutura do substrato ONPG (a) e hidrólise do ONPG em galactose e O-NP
(Nichele et al., 2011). ............................................................................................................... 27
Figura 3 - Métodos para imobilização de enzimas (Dalla-Vecchia, 2004). ............................. 30
Figura 4- Figura da ligação covalente unipontual mostrando a pouca estabilidade da
enzima (Mateo et al., 2007). ..................................................................................................... 31
Figura 5 - Estrutura dos biopolímeros quitina, quitosana e celulose (BERGER et al.,
2004) ......................................................................................................................................... 34
Figura 6- Fluxograma da permeabilização com solvente. ........................................................ 44
Figura 7 - Fluxograma mostrando a seqüência das atividades para preparação das
partículas de quitosana 2,0% (m/v) seguida de ativação com glutaraldeído 0,8%,
epicloridrina e glicidol, ambos 3,2%, (vativador/vreator). (Budriene et al., 2005; Vieira,
2009). ........................................................................................................................................ 48
Figura 8 - Atividade enzimática obtida por diferentes métodos de extração da enzima βgalactosidase produzida por K. lactis NRRL Y1564 em soro de leite a 30 °C e 180 rpm. ...... 55
Figura 9 - Efeito dos solventes (etanol e tolueno) na atividade enzimática da βgalactosidase produzida por K. lactis NRRL Y1564 em soro de leite a 30 °C e 180 rpm. ...... 57
Figura 10- Perfil do crescimento celular, consumo de lactose e produção da enzima βgalactosidase por K. lactis NRRL Y1564 em soro de queijo a 30 °C e 180 rpm. ()
Biomassa (g/L); (●) Atividade enzimática específica (U/g) e (▲) Lactose (g/L). .................. 59
Figura 11- Produtividade da enzima β-galactosidase por K. lactis NRRL Y-1564
cultivada em soro de leite a 30 °C e 180 rpm. .......................................................................... 60
Figura 12- Influência dos íons Mn2+; Ca2+; Mg2+ e Zn2+ na atividade enzimática da βgalactosidase solúvel usando o substrato ONPG a 25 °C......................................................... 62
Figura 13 - Perfil eletroforético da β-galactosidase em gel de agarose. (M) Marcador de
baixo peso molecular na concentração de 0,9 mg/mL, sendo M-Marcador, bandas 1- 6
amostras de β-galactosidase produzidas neste trabalho, bandas 7-9 amostras de βgalactosidase. ............................................................................................................................ 64
Figura 14 - Estabilidade térmica a 60 °C da β-galactosidase solúvel e imobilizada em
quitosana 2% m/v reticulada com três diferentes substâncias variando o tempo de
imobilização: 3 h (A), 5 h (B) e 10 h (C). () enzima solúvel; () enzima imobilizada
em quitosana reticulada com glicidol 3,2% v/v; (
) enzima imobilizada em quitosana
reticulada com epicloridrina 3,2% v/v; (
) enzima imobilizada em quitosana reticulada
com glutaraldeído 0,8 % v/v. As curvas apresentam a aproximação do modelo de
desativação de primeira ordem. ................................................................................................ 69
Figura 15 - Influência da temperatura sobre a atividade de hidrólise de lactose catalisada
por β-galactosidase solúvel e imobilizada. Hidrólise de uma solução sintética (lactose
5,0% (m/v) em tampão de fosfato de potássio 100 mM com 0,1 mM de MnCl2.
) enzima solúvel; (
) enzima imobilizada. ........................................................ 71
Legenda: (
Figura 16 - Influência do pH sobre a atividade hidrolítica da β-galactosidase solúvel e
imobilizada na hidrólise de lactose em tampão fosfato de potássio 100 mM adicionado
de 0,1 mM MnCl2 a temperatura de 40° C. () enzima solúvel e () enzima
imobilizada em gel de quitosana 2,0% reticulada com glutraldeído 0,8%. .............................. 72
Figura 17 - Conversão da lactose PA (5% m/v) em glicose em reator batelada a 40 °C
por 8 h catalisada pela enzima β-galactosidase solúvel () e imobilizada ()...................... 74
Figura 18 -Influência da temperatura na hidrólise do leite desnatado com 4,3% (m/v) de
lactose pela enzima β-galactosidase solúvel () e imobilizada ()....................................... 76
Figura 19 - Conversão da lactose (4,36 % m/v) em glicose pela a β-galactosidase em
reator batelada a 40°C por 8 h. () solúvel e () imobilizada............................................... 77
Figura 20- Conversão da lactose (2,00 % m/v) em glicose pela a β-galactosidase em
reator batelada a 40 °C por 8 h. () solúvel; () imobilizada......................................78
Figura 21- Estabilidade operacional da β-galactosidase imobilizada na hidrólise da
lactose (5,0%) a 40°C e pH 7,0. ............................................................................................... 79
Figura 22 - Conversão da glicose na reação de hidrólise utilizando uma solução sintética
(lactose 2,0% (m/v) em tampão de fosfato de potássio 100 mM com 0,1 mM de MnCl2)
a 40 °C por 14 h com carga de enzima () e 1,1 U/g (A);( ) 3,3U/g (B). ........................... 80
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Composição do Leite Desnatado utilizado no estudo de hidrólise. .......................... 53
Tabela 2 – Influência da temperatura na produção da enzima β-galactosidase por K.
lactis NRRL1564 em soro de leite. .......................................................................................... 58
Tabela 3 - Atividade enzimática e atividade específica antes e após o método de prépurificação da enzima β-galactosidase produzida por K. lactis NRRL Y1564 em soro de
leite a 30 °C e 180 rpm e 14h. .................................................................................................. 61
Tabela 4 - Imobilização da enzima β-galactosidase em quitosana com o mesmo
protocolo de ativação com diferentes ativadores e tempos de imobilização. ........................... 66
Tabela 5 - Valores estimados para as constantes de desativação térmica Kd, tempo de
mia vida e o fator de estabilização em função do tipo de ativação da enzima
imobilizada, aplicando o modelo de primeira ordem. .............................................................. 69
Tabela 6– Produtividade em função da carga enzimática usada na hidrólise de lactose
em leito fixo. ............................................................................................................................. 80
ANEXOS
Tabela A. 1 - Análise de Variância para o estudo de inibição dos solventes na atividade
da enzima β-galactosidase. ..................................................................................................... 100
Tabela A. 2 - Teste de Tukey para a avaliação do teste de inibição dos solventes na
atividade da enzima β-galactosidase ...................................................................................... 100
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
At0
Atresidual
Atrecuperada
Atderivado
Atteórica
AtR
Coferecida
FE
ε
Gli
Kd
Km
Kp
mDERIVADO
L
P
Pt
t
TH
Vt
Ve
Atividade oferecida no inicio da imobilização diluída em tampão (U/g)
Atividade residual presente no sobrenadante (U/g)
Atividade recuperada (U/g)
Atividade do derivado (U/g)
Atividade teórica (U/g)
Atividade relativa; carga oferecida (U/g)
Carga oferecida (mg/g)
Fator de estabilização
Coeficiente de extinção (mol/cm)
Concentração de glicose (mg/mL)
Constante de inativação térmica de primeira ordem (mol/L)
Constante de Michaelis-Menten (mol/L)
Constante de inibição pelo produto galactose (mol/L)
Massa de gel (g)
Caminho óptico (cm)
Concentração de galactose
Concentração de proteínas no extrato ( mg/mL)
Tempo de reação (min)
Tempo de reação de hidrólise (min)
Volume total (mL)
Volume de enzima (mL)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 21
2.1 Soro de leite ........................................................................................................................ 21
2.2 Lactose ................................................................................................................................ 21
2.3 Hidrólise da lactose ............................................................................................................ 22
2.4 Cultivo Submerso ............................................................................................................... 23
2.5 Micro-organismos Kluyveromyces lactis............................................................................ 24
2.6 Enzimas .............................................................................................................................. 24
2.7 Recuperação de enzimas intracelulares .............................................................................. 25
2.8 As enzimas β-galactosidase ................................................................................................ 26
2.9 Produção da enzima β-galactosidase .................................................................................. 27
2.10 Efeito de Íons na atividade enzimática da β-Galactosidase .............................................. 28
2.11 Imobilização de enzimas .................................................................................................. 29
2.12 Métodos de Imobilização ................................................................................................. 30
2.13 Suportes de imobilização .................................................................................................. 32
2.14 Quitosana .......................................................................................................................... 33
2.15 Modificação química na estrutura da quitosana ............................................................... 35
2.16 Biorreatores para a hidrólise ............................................................................................. 35
3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 37
3.1 Materiais ............................................................................................................................. 37
3.1.1 Reagentes e materiais utilizados ...................................................................................... 37
3.1.2 Micro-organismo ............................................................................................................. 37
3.1.3 Soro de leite ..................................................................................................................... 38
3.1.4 Reagentes para análise de proteínas e glicose ................................................................. 38
3.1.5 Reagentes para a eletroforese .......................................................................................... 38
3.2 Métodos .............................................................................................................................. 36
3.2.1 Métodos analíticos ........................................................................................................... 38
3.2.1.1 Determinação da concentração celular ......................................................................... 38
3.2.1.2 Determinação do pH ..................................................................................................... 39
3.2.1.3 Determinação da concentração de lactose .................................................................... 39
3.2.1.4 Determinação da concentração de proteínas ................................................................ 39
3.2.1.5 Determinação da concentração de glicose .................................................................... 39
3.2.1.6 Determinação da atividade da enzima β-galactosidase solúvel e imobilizada
através do substrato ONPG ................................................................................................... 40
3.2.1 6.1 Determinação da atividade hidrolítica da β-galactosidase solúvel ............................ 40
3.2.1.7. Determinação da atividade hidrolítica da enzima solúvel e imobilizada .................... 41
3.2.2 Estudo da produção da enzima β-galactosidase por Kluyveromyces lactis NRRL
Y1564.................................................................................................................................... 42
3.2.2.1 Pré-Tratamento ácido do soro de leite .......................................................................... 42
3.2.2.2 Preparo do inóculo ........................................................................................................ 43
3.2.2.3 Condições de cultivo para a produção de β-galactosidase ........................................... 43
3.2.2.4 Extração da enzima β-galactosidase de K. lactis NRRL Y-1564 ................................ 43
3.2.2.4.1 Permeabilização com solvente................................................................................... 44
3.2.2.4.2 Ruptura celular .......................................................................................................... 44
3.2.3 Testes de inibição da enzima β-galactosidase por solventes ........................................... 45
3.2.4 Estudo da influência da temperatura na produção da enzima β-galactosidase por K.
lactis NRRL Y1564 .............................................................................................................. 45
3.2.5 Pré-purificação da enzima β-galactosidase em Concentrador Específico ....................... 43
3.2.6 Influência de íons na atividade enzimática de β-galactosidase ....................................... 46
3.2.7 Eletroforese SDS-PAGE ................................................................................................. 46
3.2.8 Estudo da Imobilização da enzima β-galactosidase produzida por K. lactis
NRRL1564 usando soro de leite como fonte de carbono. .................................................... 47
3.2.8.1 Preparação das partículas de quitosana e ativação ....................................................... 47
3.2.8.2 Imobilização da enzima β-galactosidase ...................................................................... 48
3.2.8.3 Determinação dos parâmetros de imobilização ............................................................ 49
3.2.8.3.1 Determinação do rendimento de imobilização .......................................................... 49
3.2.8.3.2 Atividade recuperada ................................................................................................. 49
3.2.9 Estudo da estabilidade térmica da enzima β-galactosidase a 60 °C β-galactosidase
solúvel e imobilizada ............................................................................................................ 50
3.2.10 Estabilidade de estocagem da enzima β-galactosidase solúvel e imobilizada .............. 51
3.2.11 Caracterização da enzima β-galactosidade solúvel e imobilizada ................................. 51
3.2.11.1 Determinação do pH ótimo da β-galactosidase solúvel e imobilizada ....................... 51
3.2.11.2 Determinação da temperatura ótima da β-galactosidase solúvel e imobilizada ......... 51
3.2.11.3. Influência da temperatura na hidrólise da lactose presente no leite pela enzima
β-galactosidase solúvel e imobilizada em leite puro ............................................................ 52
3.2.12 Estabilidade Operacional ............................................................................................... 52
3.2.13 Avaliação do desempenho do biocatalisador em reatores batelada e contínuo ............. 52
3.2.13.1 Hidrólise de lactose catalisada por β-galactosidase solúvel e imobilizada em
reator batelada ....................................................................................................................... 52
3.2.13.2 Hidrólise da lactose pela enzima β-galactosidase imobilizada em leito fixo ............. 53
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 54
4.1 Estudo da produção da enzima β-galactosidase por Kluyveromyces lactis
NRRL1564 usando soro de leite como substrato .................................................................. 54
4.1.1 Estudo da extração da enzima β-galactosidase produzida por K. lactis NRRL1564 ...... 54
4.1.2 Influência da temperatura na produção da enzima β-galactosidase por K. lactis
NRRL Y1564 em soro de leite ............................................................................................. 58
4.1.3. Pré-purificação da enzima β-galactosidase produzida por K. lactis NRRL Y1564 ....... 61
4.2 Influência da presença de íons metais na atividade enzimática de β-galactosidase ........... 62
4.3 Eletroferese SDS-PAGE ..................................................................................................... 63
4.4 Imobilização da β-galactosidase produzida por K. lactis NRRL Y1564 em quitosana ..... 64
4.5. Estabilidade térmica da enzima β-galactosidase solúvel e imobilizada ............................ 67
4.6 Influência da temperatura na atividade de hidrólise sintética............................................. 70
4.7 Influência do pH na hidrólise de uma solução sintética de lactose 5% .............................. 71
4.8 Estabilidade de armazenamento da enzima β-galactosidase solúvel diluída em
tampão fosfato ....................................................................................................................... 73
4.9. Hidrólise de lactose catalisada por β-galactosidase:ensaios em reator batelada ............... 74
4.10 Influência da temperatura na hidrólise do leite desnatado catalisada por βgalactosidase solúvel e imobilizada ...................................................................................... 75
4.11 Hidrólise enzimática da lactose do leite desnatado .......................................................... 76
4.12 Estudo de Hidrólise enzimática da β-galactosidase para a conversão de lactose a
partir do leite diluído em solução tampão (concentração de lactose 2,00% m/v): .............. 78
4.13 Estabilidade operacional da β-galactosidase imobilizada em quitosana e reticulada
com glutaraldeído 0,8%. ....................................................................................................... 78
4.14 Hidrólise da lactose sintética da enzima imobilizada em leito fixo ................................. 79
5. CONCLUSÕES................................................................................................................... 82
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................................ 83
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 84
Freitas, M. F. M
18
1- INTRODUÇÃO
A enzima β-galactosidase (lactase, EC 3.2.1.23) é muito aplicada na indústria de
alimentos uma vez que hidrolisa a lactose em monossacarídeos mais doces, solúveis e
com menor tendência a cristalização segundo Barbosa e Araújo (2007). A βgalactosidase ou lactase podem ser produzidas por grande quantidade de microorganismos tais como, fungos filamentosos, bactérias e leveduras, mas para fins
alimentícios estão restritas ao gênero Aspergillus sp. e Kluyveromyces sp. (Husain et al.,
2010), porque os produtos obtidos a partir destes organismos são geralmente
reconhecidos como seguros (status GRAS) para consumo humano (Kosseva et al.,
2009).
Devido ao alto custo para a obtenção da enzima β-galactosidase, é preciso
utilizar meios de cultura mais baratos para sua produção. Diferentes fontes de carbono
são utilizados na produção de β-galactosidase, por exemplo, o soro de leite que é um
subproduto da indústria de lacticínios, em particular a porção aquosa que é formado
durante a coagulação da caseína do leite na fabricação de queijos ou na fabricação de
caseína. Soro de leite é produzido em grandes quantidades e tem uma alta carga
poluidora, representando, portanto um problema ambiental significativo (Pedro et al.,
2010). O soro representa uma faixa de 85 a 95% do volume de leite e retém 55% de
seus nutrientes (Guimarães et al., 2010). De acordo com Lima (2012), o soro de leite
desproteinizado e suplementado com extrato de levedura serviu como fonte de carbono
alternativa para Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 para produzir a enzima βgalactosidase.
No estudo da produção de β-galactosidase, é importante determinar o efeito da
temperatura nos parâmetros cinéticos que quantificam a reprodução e a morte celular, o
consumo de substrato e a produção da enzima também são informações relevantes para
a elaboração de estratégias de controles mais eficientes nas indústrias (Schmidell et al.,
2001).
Uma das principais aplicações da enzima β-galactosidase é a hidrólise da
lactose, que pode ser realizada também por catálise ácida sendo exigido alta
concentração de ácido e altas temperaturas, além de promover reações paralelas
complexas (Hatzinicolau et al., 2005), no entanto na hidrólise enzimática as condições
de operação são mais suaves com relação à temperatura e pH (Tostes, 2006).
A enzima β-galactosidase é um produto intracelular, portanto após a fermentação
se faz necessário obter extratos da enzima livre da célula obtido através do rompimento
Freitas, M. F. M
19
celular para poder extraí-la. Diferentes métodos podem ser empregados para extração de
proteínas intracelulares, os quais dependem da força física da parede celular dos microorganismos, localização dentro da célula, estabilidade e do uso desejado para o
composto de interesse. Métodos mecânicos, físicos, químicos, enzimáticos e a
combinação destes podem ser aplicados (Padit, 2005).
As enzimas na forma livre são, normalmente, menos estáveis que os
catalisadores químicos e não podem ser usadas em condições severas, pela possível
desnaturação e conseqüente perda de atividade. Quando estocadas ou durante o uso,
estão sujeitas à inativação por fatores químicos, físicos ou biológicos (Carneiro, 2008).
Assim, as β-galactosidases imobilizadas estão se tornando cada vez mais úteis para os
processamentos biotecnológicos. A imobilização assegura o aumento da concentração
de biocatalisador sendo também possível variar a natureza dos derivados imobilizados, a
fim de melhorar a atividade enzimática e estabilidade facilitando o manuseio e
armazenamento da enzima (Tardioli et al., 2003).
Um grande número de suportes tem sido usado para a imobilização da βgalactosidase. Esses devem ser inertes e possuir características desejadas de acordo com
a aplicação da imobilização (Di Serio et al., 2003, Fitchorov et al., 2010; Lima, 2012;
Salviano, 2012;).
A quitosana é a forma desacetilada da quitina, segundo polímero mais abundante
na natureza. Por ser um produto natural, de baixo custo, renovável e biodegradável
(Mendes et al., 2011) ela foi utilizada como suporte para imobilização da enzima βgalactosidase neste trabalho.
A modificação química da estrutura do suporte quitosana permite a sua melhor
estabilidade química devido a formação de ligações covalentes irreversíveis. Existem
diferentes de métodos de modificação sendo empregados (Rodrigues et al., 2008,
Adriano et al., 2008; Mendes et al., 2011). As principais modificações são realizadas
empregando agentes bifuncionais, tais como: epicloridrina, glutaraldeído, glioxal e
outros (Rodrigues et al., 2008).
Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi estudar a obtenção de um
biocatalisador ativo e estável, visando a hidrólise de lactose em reatores bateladas e
contínuos. Para tal fim, a enzima β-galactosidade foi produzida pela levedura
Kluyveromyces lactis NRRLY1564 usando o soro de leite, suplementado com extrato de
levedura, como substrato. Avaliou-se inicialmente a influência da temperatura na
produção da enzima, bem como a sua extração e pré-purificação do caldo fermentado.
Freitas, M. F. M
20
Verificou-se ainda a influência de íons metálicos na atividade enzimática de βgalactosidase. Posteriormente, estudou-se a imobilização utilizando a quitosana como
suporte e diferentes protocolos de ativação. Visando a caracterização do catalisador,
determinaram-se as estabilidades térmica e frente a pH, a temperatura ótima, bem como
a estabilidade térmica a 60 ºC da enzima β-galactosidase solúvel e imobilizada.
Finalmente, avaliou-se o desempenho do biocatalisador na hidrólise da lactose em reator
batelada e leito fixo.
Freitas, M. F. M
21
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Soro de leite
É o mais importante dos subprodutos provenientes da produção de queijo,
representa aproximadamente 90 % do volume do leite empregado, retendo cerca de 55
% dos seus nutrientes, incluindo proteínas funcionais e peptídeos, lipídios, lactose, sais
minerais e vitaminas, portanto, desafiando a indústria a enfrentar excedentes de soro de
leite como um recurso (Pedro, et al., 2010).
Segundo Athanasiadis et al., 2004, o soro de leite contém em média de 4.8% a
5.3% de lactose, possuindo uma elevada carga orgânica de 40-70 g/L representando um
importante problema ambiental. Cerca de 9 Kg de soro de leite são gerados durante a
produção de 1 kg de queijo, totalizando mais de 160 milhões de toneladas de soro de
leite produzidos no mundo a cada ano (Guimarães et al., 2010).
De acordo com Zacarchenco et al. (2008), o soro de leite na forma fluida, em pó,
concentrado ou seus ingredientes fracionados são utilizados no mundo inteiro em
bebidas, barras energéticas e outros alimentos processados.
Uma vez que a lactose é o principal componente do soro de leite, além de
vitaminas solúveis em água, minerais e proteínas, utilizando vários processos
biotecnológicos por diferentes micro-organismos, as enzimas têm sido desenvolvidas
para utilizar soro de leite para a produção de alguns produtos úteis de importância
industrial, tais como o álcool etílico, ácido láctico, ácido cítrico, proteínas unicelulares,
biogás, vitaminas e bebidas fermentadas, etc. (Kosseva et al., 2009).
A hidrólise da lactose agrega valor ao soro de leite, resolvendo uma parte dos
problemas causados pela lactose, ampliando a sua gama de aplicação.
2.2 Lactose
É um dissacarídeo redutor constituído por um radical D-glicose e outro Dgalactose, unidos por uma ligação glicosídica β -1,4. Pelo fato de ambas as moléculas
que compõem a lactose se apresentarem na forma de anel piranosídico, a lactose deve
ser denominada propriamente de 4-0-β-D-galactopiranosil-D-glucopiranose (Campbell,
2000; Santos, 2011).
Freitas, M. F. M
22
Este açúcar pode ser encontrado tanto no leite como no soro de leite. Visando
ampliar a gama de sua utilização, emprega-se a hidrólise deste dissacarídeo redutor
obtendo um açúcar mais adocicado, solúvel e digerível. Favorecendo assim as pessoas
com problemas ligados à intolerância à lactose. De fato, estima-se que mais de 70% da
população adulta do mundo têm problemas em digerir lactose (Adam et al., 2004
Husain, 2010), resultantes da ausência ou redução da atividade da β-galactosidase no
intestino delgado. Esta intolerância promove a existência de um mercado considerável
para produtos sem lactose do leite e produtos lácteos, que pode ser obtido por hidrólise
enzimática utilizando β-galactosidases (Guimarães et al., 2010).
2.3 Hidrólise da lactose
A hidrólise da lactose (4-O-β-D-galactopyranosyl-D-glucose) pode ser feita por
tratamento ácido ou por catálise enzimática através da β-galactosidase. Quando essa
hidrólise é feita utilizando ácidos como catalisadores, a reação é muito rápida, a
temperatura da reação é muito alta (em torno de 150 °C) e os produtos adquirem cor e
odor que impedem sua utilização direta em alimentos (Carminatti, 2001). O método
enzimático de hidrólise da lactose emprega a enzima β-galactosidase, a qual hidrolisa o
referido dissacarídeo nos seus monossacarídeos constituintes, β-D-galactose e α-Dglicose (Ordonez, 2005). A Figura 1 mostra o mecanismo de hidrólise da lactose pela
enzima β-galactosidase,
Figura 1- Reação de hidrólise enzimática de lactose através do uso de β-galactosidase
(Vieira, 2009).
Freitas, M. F. M
23
A hidrólise enzimática da lactose é um dos mais importantes processos
biotecnológicos na indústria de alimentos, ela tem vários efeitos potencialmente
benéficos sobre a assimilação dos alimentos que contenham lactose e com vantagens
também ambientais na aplicação industrial, incluindo (Jurado et al., 2002):
• Eliminação de intolerância à lactose, 3-70%, dependendo do grupo populacional,
incentivando a utilizaçãode lactose como fonte de energia;
• Formação de galacto-oligossacáridos durante a hidrólise de lactose para
favorecer o crescimento de microflora bacteriana intestinal;
• Melhoria das características tecnológicas e sensoriais de alimentos contendo
lactose hidrolisada de leite ou soro de leite, formação de monossacarídeos, que
são mais fáceis de fermentar;
• Maior biodegradabilidade do soro de leite em que a lactose foi hidrolisada.
2.4 Cultivo Submerso
A produção de enzimas em escala industrial se faz majoritariamente por
fermentação submersa, embora também haja a utilização da fermentação no estado
sólido para esse fim em menor escala. Existem várias desvantagens para a fermentação
em estado sólido com a finalidade de se produzir enzimas dentre elas: maiores riscos de
contaminação; necessidade de espaço e menores rendimentos dentre outros. No caso do
uso de produtos de descarte que apresentam grande quantidade de água, como efluentes,
na produção de enzimas a fermentação submersa é a mais adequada (Lima et al., 2001).
As fermentações requerem em primeiro lugar um substrato ou nutriente, estes
nutrientes podem ser utilizados puros ou fazendo parte da composição de certas
misturas complexas, como efluentes. O uso de produtos de descarte proporciona um
nutriente potencialmente mais econômico que o uso de substratos puros. Em segundo
lugar necessita-se de uma fonte de nitrogênio e finalmente nutrientes em menor
quantidade e vitaminas (Wainwright, 1995).
Diversos autores citam subprodutos como fornecedores potenciais de nutrientes,
dentre eles: o soro de leite, o melaço de cana e a água de maceração do milho. O uso
dessas matérias pode reduzir substancialmente o custo na produção de bioprodutos
(Furlan et al., 2000; Santiago et al., 2004; Aktas et al., 2006).
Freitas, M. F. M
24
2.5 Micro-organismos Kluyveromyces lactis
Muitos organismos são capazes de sintetizar a enzima β-galactosidase, incluindo
animais, plantas e micro-organismos, no entanto, tem se estudado vários microorganismos que produzam a enzima β-galactosidases com maior rendimento para a
produção industrial. Embora as bactérias ofereçam mais versatilidade, o estado GRAS
(Geralmente Reconhecido como Seguro) de leveduras como Kluyveromyces lactis e
Kluyveromyces marxianus, e de fungos como Aspergillus niger e Aspergillus oryzae,
estão entre as fontes favoritas da enzima β-galactosidase na biotecnologia de alimentos
e indústria farmacêutica (Rubio-Teixeira, 2006).
O micro-organismo Kluyveromyces lactis é a fonte de β-galactosidases (β-Dgalactohidrolase, EC 3.2.1.23) (Tello-Solis et al., 2005), ela é uma das espécies de
levedura mais estudadas e tornou-se um sistema modelo para estudos sobre a fisiologia
molecular (Breunig et al., 2000).
O interesse em torno de K. lactis é deve-se ao seu metabolismo pela a lactose
que foi inicialmente motivada por questões acadêmicas enquanto interesse
biotecnológico veio muito mais tarde (Fukuhara, 2006). A K. lactis não é comumente
usado para produção de etanol, embora tenha sido explorada para outras aplicações
biotecnológicas, como a produção de proteínas heterólogas (Van Ooye et al., 2006)
usando soro de queijo como meio de cultura (Maullu et al., 1999). A capacidade desta
levedura para metabolizar a lactose resulta da presença de uma permease de lactose
(codificada pelo gene LAC12) e uma enzima β-galactosidase (LAC4 gene) (RubioTexeira, 2006).
2.6 Enzimas
As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações biológicas. Elas
estão entre as biomoléculas mais notáveis devido a sua extraordinária especificidade e
poder catalítico, que são muito superiores aos dos catalisadores químicos (Lehninger,
1997). Catalisadores são compostos capazes de aumentar a velocidade da reação sem
alterar a proporção entre reagentes e produtos encontrada no final da reação e sem
serem efetivamente consumidos durante o processo (Borzani et al., 2005a). As enzimas
possuem a vantagem de serem facilmente encontradas na natureza e apresentarem maior
atividade catalítica e alta especificidade, além de uma maior sensibilidade ao controle
catalítico (Oliveira, 2007).
Freitas, M. F. M
25
A especificidade inerente da enzima reside em uma cavidade ou fenda de ligação
do substrato, que está situada na superfície da proteína enzimática. A cavidade,
denominada sítio ativo, é um arranjo de grupos presentes em cadeias laterais de certos
aminoácidos que ligam o substrato por ligações não-covalentes. Muitas vezes, os
resíduos de aminoácidos que formam o sítio ativo ficam em regiões distantes, na
seqüência primária e mais próximos pelo enovelamento de cadeia polipeptídica
(estrutura terciária). Algumas enzimas têm outra região na molécula, o sítio alostérico,
afastada do sítio ativo. No sítio alostérico as moléculas pequenas específicas se ligam e
causam alterações na conformação protéica que afetam o sítio ativo, aumentando ou
reduzindo a atividade enzimática. (Tostes, 2006).
2.7 Recuperação de enzimas intracelulares
Cada micro-organismo possui características individuais quanto a localização
das enzimas intracelulares produzidas, o que significa que uma enzima de interesse
pode estar no citoplasma, no periplasma ou, ainda, armazenada no interior de alguma
organela celular, tal como mitocôndria. Desse modo o protocolo de extração pode variar
em função da enzima desejada (Asenjo et al., 1991)
A enzima β-galactosidase obtida por leveduras, é produzida intracelularmente,
por isso há a necessidade do rompimento celular ou a permeabilização da membrana da
célula sem causar desnaturação da enzima (Santiago et al., 2004).
Dependendo do caso a parede poderá ser totalmente rompida ou parcialmente
permeabilizada para permitir que a molécula-alvo seja liberada para o meio extracelular
sem formações de fragmentos celulares (Pessoa Júnior, 2005).
O método mais comum de autólise celular para β-galactosidase de leveduras é o
tratamento de uma suspensão de células com agentes químicos capazes de desorganizar
a membrana plasmática, como solventes orgânicos, surfactantes, policátions, proteínas
básicas, ou soluções com alto poder iônico (Flores et al., 1994).
Embora exista uma grande variedades de agitadores, não é possível uma
correlação direta entre o tipo de agitador e a eficiência do rompimento.
A carga de pérolas utilizada nos métodos de extração não pode ser pequena, pois
não haverá uma boa desintegração das células, também se for muito grande elas se
chocarão e diminuirão a eficiência do processo, além de aumentarem a temperatura e o
consumo de energia (Pessoa Júnior, 2005).
Freitas, M. F. M
26
Diferentes métodos podem ser empregados para extração de proteínas
intracelulares, os quais dependem da força física da parede celular dos microorganismos, localização dentro da célula, estabilidade e do uso desejado para o
composto de interesse. Métodos mecânicos, físicos, químicos, enzimáticos e a
combinação destes podem ser aplicados (Pandit, 2005).
2.8 As enzimas β-galactosidase
As β-galactosidases (EC 3.2.1.23) podem ser encontradas na natureza,
distribuídas em vegetais, particularmente em amêndoas, pêssego, damasco, maçã- em
órgãos de animais como intestino, cérebro, testículos, placenta e também produzidas por
uma grande quantidade de micro-organismos tais como fungos filamentosos, bactérias e
leveduras, sendo as leveduras e fungos as fontes preferidas para aplicações comerciais
(Santiago et al., 2004). A legislação brasileira específica, por meio da resolução RDC
nº205/2006, ressalta que a enzima lactase utilizada na indústria de alimentos deve ser de
origem microbiana, proveniente dos seguintes micro-organismos: Aspergillus Níger,
Aspergillus orzae, Candida pseudotropicalis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces
flagilis, Kluyveromyces, marxianus, Saccharomyces sp (Brasil, 2006) tais espécies são
classificadas como GRAS (Generally Recognized As Safe) pela Food and Drug
Administration (FDA), sendo esse um importante critério para aplicações alimentícias.
As β-galactosidases constituem uma grande família de proteínas que são
conhecidas por catalisar reações hidrolíticas e de transgalactosilação. A atividade
hidrolítica é aplicado na indústria alimentar durante décadas para reduzir o teor de
lactose no leite, enquanto que a atividade transgalactosilação tem sido utilizado para
sintetizar galacto-oligossacarídeos (Oliveira et al., 2007).
As enzimas β-galactosidases, diferem bastante de acordo com a fonte. Em
particular, as enzimas obtidas a partir de fungos pH ótimo é 3,5 a 4,5, ao passo que as βgalactosidases de leveduras têm o seu pH ótimo entre 6,5 e 7,0 (Panesar, 2006).
A Figura 2a mostra a reação de hidrólise da enzima β-galactosidase com o
substrato (ONPG) que é uma das formas de medir a atividade dessa enzima, pois essa
reação é um teste colorimétrico; o-NPG é líquido incolor e após a hidrólise produz a
galactose (incolor) e o-NP que tem coloração amarela (Nichele et al., 2011).
Freitas, M. F. M
27
.
Figura 2 - Estrutura do substrato ONPG (a) e hidrólise do ONPG em galactose e O-NP
(Nichele et al., 2011).
2.9 Produção da enzima β-galactosidase
A literatura apresenta diversos trabalhos sobre produção de β-galactosidase de
vários micro-organismos, porém sobre otimização das condições de produção desta
enzima poucos trabalhos são relatados. O efeito da temperatura nos parâmetros cinéticos
que quantificam a reprodução e morte celular, o consumo de substrato e a produção da
enzima são informações importantes para a elaboração de estratégias de controles mais
eficientes nas indústrias (Schmidell et al., 2001).
A produção da enzima β-galactosidase de Kluyveromyces lactis empregando
soro lácteo desproteinizado foi otimizada através do emprego da metodologia de
superfície de resposta (Matheus e Rivas, 2003) .As melhores condições operacionais
foram: temperatura de 30,3ºC, pH 4,68, velocidade de agitação de 191rpm e tempo de
fermentação de 18,5h, tendo uma produção da enzima de 8,3U/mL.
Rajoka e colaboradores em 2004 produziram β-galactosidase na presença de
lactose, ou galactose, ou celobiose, ou xilose, ou arabinose, ou sacarose e ou glicose em
frascos agitados utilizando a levedura K. marxianus. O tipo de substrato e a temperatura
foram as variáveis que diretamente influenciaram no crescimento específico e na taxa de
produção da enzima. A Lactose (2%) apresentou maior rendimento na produtividade
específica, seguida por galactose, sacarose, celobiose, xilose, arabinose e glicose. As
Freitas, M. F. M
28
temperaturas testadas estavam entre 22 e 45ºC, os valores máximos para a
produtividade foram encontrados na temperatura de 35ºC.
Em Lima et al., 2011, o soro de leite desproteinizado e suplementado serviu
como fonte de carbono alternativa para Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 para
produzir a enzima β-galactosidase e obteve-se uma atividade de 3,5 U/mL com 12 h de
fermentação.
2.10 Efeito de Íons na atividade enzimática da β-Galactosidase
Um número de estudos na literatura descrevem a interação da β-galactosidase
(fonte E. coli e rectivirgula Saccharopolyspora) com íons divalentes (Harada et al.,
1994; Jacobson et al., 1994; Martinez-Bilbao et al., 1995). No entanto, os estudos sobre
β-galactosidase com alguns íons isolada de Kluyveromyces, aqui relatados são escassos(
Adalberto, 2010)
Para a maioria das β -galactosidases estudadas, os íons metálicos divalentes são
importantes na obtenção da eficiência catalítica máxima da enzima. O íon Mg2+ é
considerado o íon fisiológico (Huber et al., 1979;. Martinez-Bilbao et al., 1995; Craig
et al., 2000; Sutendra et al., 2007). Quando o potencial de magnésio (pMg =-log [Mg2+]
livre) é inferior a 7, a enzima torna-se mais eficiente (aumentos da velocidade) e tem
uma maior afinidade para o substrato (Km reduziu) (Hoyoux et al., 2001;. Sutendra et
al., 2007). Sabe-se também que o esqueleto da proteína forma um complexo com o
metal e deve ter um segundo local de ligação de Mg2+, a qual é cataliticamente
importante. Embora este fenômeno não esteja ainda totalmente compreendido, é
razoável assumir que o íon metálico participa na catálise enzimática, atuando como um
ácido de Lewis. O local secundário, localizado perto do resíduo Glu-794, é
aparentemente responsável pela estabilização entrópica do estado de transição (Sutendra
et al., 2007; Martinez-Bilbao et al., 1995).
Há estudos que demonstram que os cations monovalentes, tais como Na+ e K+
são ativadores da enzima, ao passo que Hg2+, Cu2+ e Zn2+ são inibidores da atividade de
β-galactosidase isolada de Pseudoalteromonas (Harada et al., 1994;. Roth e Huber,
1996; Fernandes et al., 2002). Na verdade, os efeitos desses íons depende de suas
concentrações. Por exemplo, o aumento de concentração de Ca2+ causa a desativação da
enzima, ao passo que o aumento das concentrações de Mg2+ e Mn2+ causada ativação.
De modo semelhante, aumentando a concentração de Fe2+ de 1,0 a 10 mM resultou em
Freitas, M. F. M
29
3,72 vezes a reduções das actividades β-gactosidase das enzimas obtido a partir
Streptococcus thermophilus 95/2 (St 95/2) e Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus 77
(Lb 77), e cultura mista (Lb 77 e St 95/2), respectivamente. Em vários estudos
reportados na literatura, resultados diferentes foram obtidos dependendo do tipo do íon,
o substrato utilizado e o fonte de β-gactosidase (Ustok et al., 2010).
Em alguns estudos a presença ou ausênciade Mg2+ mostrou efeitos diferentes.
Nos estudos realizado por Bhowmik et al., (1987), β-galactosidase a partir de
Lactobacillus acidophilus foi estimulada com Mg2+, enquanto em outro estudo, não teve
nenhum efeito no caso de Lactobacillus kefiranofaciens (Itoh et al., 1992).
Em Vieira 2009, o efeito do sódio no tampáo de fosfato sódio comparado com o
fosfato de potássio foi negativo para a hidrólise da lactose, enquanto que com ONPG o
efeito do sódio foi favorável.
.
2.11 Imobilização de enzimas
É bem conhecido que a imobilização de enzimas em matrizes adequadas podem
impedir a sua degradação química e biológica e aumentar estabilidade (Hanefeld, et al.,
2009)
As vantagens da enzima imobilizada em relação a enzima solúvel ou livre, inclui
maior estabilidade a variações de pH, agentes orgânicos de desnaturação, temperatura,
etc. Agora recentemente, estudos mostraram o avanço da utilização da enzima
imobilizada em vários campos de multidicisplinariedade, como por exemplo análises de
amostras clínicas, industriais e ambientais. Nesses estudos as enzimas estão presentes
no campo da medicina, na produção de antibióticos, no metabolismo de drogas, na
produção de biodiesel, etc. (Alzohairy, 2010)
O processo de imobilização deve ser em condições amenas, o suficiente para
que, durante a imobilização da enzima ela não desnature. A imobilização tem um
grande potencial em alimentos de bioprocessamento e tem sido amplamente utilizada
para a hidrólise de lactose, em leite, produtos lácteos e soro (Haider e Hunsai, 2008).
2.12 Métodos de Imobilização
Várias técnicas de imobilização vem sendo estudadas, pois a tecnologia de
imobilização tem muitas vantagens, uma delas é permitir a maior densidade de células
em bioreatores, melhorando a estabilidade da enzima, tornando possível a reutilização
Freitas, M. F. M
30
contínua e, facilitando também a separação da enzima com os produtos formados
(Kosseva et al., 2009).
Os métodos básico de imobilização estão demonstrados na Figura 3 abaixo:
Figura 3 - Métodos para imobilização de enzimas (Dalla-Vecchia, 2004).
O método de adsorção é o método mais simples e antigo de imobilização de
enzimas em suportes. É baseada em ligações fracas entre o biocatalisador e o suporte
(Van der Waal e ponte de hidrogênio). Esse método é limitado pela a tendência de
dessorção da enzima do suporte e por ser sensível às condições ambientes, como a
temperatura e a concentração de íons (Tanaka, Kawamoto, 1999 citado por Grosová et
al., 2008)
O método de ligação covalente é o método mais utilizado para imobilização de
enzimas. Neste método a enzima é retida no suporte através da ligação covalente entre
os grupos funcionais reativos do suporte e os grupos reativos terminais da enzima. O
procedimento envolve a modificação química de um resíduo de aminoácido, através da
formação de uma ligação covalente da enzima com um material insolúvel em água, pela
fixação da enzima em matriz por ligação covalente ou pela formação de ligações
Freitas, M. F. M
31
cruzadas numa matriz, contendo a enzima e usando vários agentes bifuncionais (Guisán,
1988, Fernández-Lafuente et al., 1993 e Cárdias, 1996, Carneiro, 2008).
A ligação covalente na imobilização de enzimas tem as seguintes vantagens: a
enzima não se desprende do suporte, a força dessa ligação é elevada e envolve vários
resíduos da enzima, proporcionando uma grande rigidez. Esta rigidez propicia que a
estrutura da enzima se mantenha inalterada perante agentes desnaturantes como calor,
solventes orgânicos, pH extremos e outros (Mateo et al., 2007; Macário et al., 2009;
Miletic et al., 2009, Rodrigues, 2009). Por outro lado a desvantagem são altos custos e
baixo rendimento de atividade devido a exposição da enzima a reagentes tóxicos ou a
condições de reação severas (Tanaka, Kawamoto, 1999 citado por Grosová et al., 2008,
Bezerra, 2012).
A ligação covalente da enzima ao suporte pode ser feita de duas formas: a
ligação covalente multipontual, onde o pH está acima de 10,5 e os grupos da lisina estão
expostos e a ligação covalente unipontual, onde o pH está entre 7 e 8 e somente os
grupos aminos terminais da proteína estarão prontos para reagir (Mateo et al., 2007).
Ver Figura 4.
enzima
Figura 4- Figura da ligação covalente unipontual mostrando a pouca estabilidade da
enzima (Mateo et al., 2007).
No método de inclusão ou microencapsulação as enzimas podem ser
aprisionadas dentro da estrutura interna de alguns materiais (geralmente polímeros) na
forma de géis, microcápsulas, filmes ou membranas. Um procedimento comum é
preparar a solução contendo a enzima e o material polimérico e na seqüência utilizar
uma técnica (secagem, polimerização) para coagular o material polimérico contendo a
enzima na forma desejada. Em alguns casos, uma etapa de entrecruzamento é necessária
para garantir a imobilização (Gekas e Lópes-Leiva, 1985; Klein, 2010). Esse método é
mais aplicado quando os substratos são de baixa massa molecular para permitir a livre
Freitas, M. F. M
32
difusão entre estes e os produtos. A maior desvantagem desta técnica é a possível perda
da enzima, devido às suas pequenas dimensões moleculares, através da difusão durante
repetidos usos, mesmo que a matriz possua pequenos poros (Grosová, et. al., 2008).
A imobilização por ligação cruzada é livre de suporte, e as enzimas estão ligadas
umas às outras, ou a proteínas inativas (gelatina, albumina), formando uma estrutura
tridimensional complexa. Pode ser obtida via métodos físicos ou químicos. Quando
obtidas por métodos químicos são resultantes das ligações covalentes entre as enzimas e
são favorecidas pelo uso de agentes bi ou multifuncionais. Como desvantagens do
método estão a baixa retenção da atividade e a baixa estabilidade mecânica, que
dificulta sua aplicação industrial, além de pouca reprodutiblidade (Sheldon, et. al.,
2007)
O método escolhido para a imobilização depende da enzima a ser imobilizada, o
tipo de suporte, as condições de reação, o tipo de reator também devem ser analisados.
2.13 Suportes de imobilização
Um grande número de suportes tem sido usado para a imobilização da lactase,
esses devem ser inertes e possuir características desejadas de acordo com a aplicação da
imobilização (Gekas, et al. 1985, Di Serio et al., 2003, Fitchorov, et al., 2010);
A enzima é normalmente ligada a um suporte por ligações químicas, porque, isto
torna muito estável o biocatalisador diminuindo a desativação da enzima (Carpio et al.,
2000).
Apesar do grande interesse na imobilização da galactosidase, é difícil a obtenção
de um catalisador mostrando simultaneamente alta atividade, alta estabilidades e
propriedades mecânicas ótimas (Di Serio et al., 2003):
Na seleção de um suporte para uma determinada aplicação, devem ser analisadas
suas propriedades físicas e químicas, bem como a possibilidade de regeneração do
material. As principais características a serem observadas na seleção de um suporte para
uma determinada aplicação são (Mendes et al., 2011):
• Área superficial;
• Permeabilidade;
• Insolubilidade, capacidade de regeneração;
• Morfologia e composição;
• Natureza hidrofílica ou hidrofóbica;
Freitas, M. F. M
33
• Resistência ao ataque microbiano;
• Resistência mecânica;
• Custo.
Esses suportes podem ser classificados como orgânicos e inorgânicos, e
conforme sua morfologia em materiais porosos, não porosos e de estrutura de gel.
(Dalla-Vecchia, 2004, Jegannathan, 2008, Cardoso, 2009, Mateo, 2007, Freitas, 2007)
Os materiais porosos tem grande área superficial interna disponível para a
imobilização, mas como a maior parte dessa área está em difícil acesso, deve se atentar
para que o diâmetro do poro seja suficientemente grande para acomodar a enzima e
permitir o acesso do substrato (Dalla-Vecchia, 2004).
Os materiais não-porosos eliminam a resistência de massa interna, mas
apresentam baixa área superficial disponível a ligação da enzima. Este problema pode
ser parcialmente superado pela utilização de partículas finas ou fibras, porém outras
dificuldades surgem quando se utilizam partículas muito finas ou fibras, como por
exemplo, queda de pressão e baixas vazões para operação em reatores contínuos(
Mendes, 2009).
Os polímeros naturais e sintéticos são uma classe de suportes muito importantes
no campo de imobilização de biocatalisadores (Mateo et al., 2006; Mateo et al., 2007).
Os naturais apresentam a vantagem acima do sintético devido ao baixo custo e são
facilmente degradáveis não causando danos ao ambiente
2.14 Quitosana
Dentre os diferentes suportes orgânicos naturais empregados na imobilização de
enzimas, destaca-se a quitosana. A aplicação de quitosana como suporte para a
imobilização de enzimas se deve às suas diferentes fontes como pó, escamas, hidrogéis,
membranas, fibras e outras, além da presença de diferentes grupos funcionais, como
hidroxila e amino, que permitem a utilização de diferentes métodos de imobilização
(Kumar et al., 2000 e Berger et al., 2004).
A quitosana (1c) é a forma desacetilada da quitina (1b) o segundo polímero mais
abundante na natureza, depois da celulose (1a) (Tsigos et al., 2000 e Mendes et al.,
2011). É um produto natural, de baixo custo, renovável e biodegradável e de grande
importância econômica e ambiental.
Freitas, M. F. M
34
(A)
(B)
(C)
Figura 5 - Estrutura dos biopolímeros celulose, quitina e quitosana (BERGER et al.,
2004)
A quitosana pode ser definida como quitina suficientemente desacetilada para
formar sais de amina solúveis, sendo o grau de desacetilação necessário para obter um
produto solúvel 80-85% ou maior. Basicamente o processo de obtenção consiste na
desproteinização do material de casca e esqueletos de crustáceos com solução de NaOH
e descalcificação com solução de HCl diluída. Como suporte para imobilização da
enzima, materiais a base de quitina e quitosana são utilizados sobre a forma de pó,
flocos e géis de diferentes configurações geométricas (Krajewska, 2004).
Tharanathan e Prashanth (2007) realizaram uma ampla pesquisa sobre a quitina e
a quitosana, investigando suas modificações e aplicações. Neste estudo ficou
comprovado que as áreas de aplicações da quitina ou quitosana, bem como seus
derivados são ilimitados. São mencionadas aplicações na área de alimentos e nutrição,
ciência dos materiais, ciências médicas e farmacêuticas, microbiologia, imunologia
dentre outras.
Diferentes configurações de quitosana podem ser obtidas no processo de
desacetilação da quitina e estas configurações podem ser empregadas no processo de
imobilização de enzimas.
Os materiais quitina e quitosana oferecem um conjunto único de características:
biocompatibilidade, biodegradabilidade de produtos inofensivos, não toxicidade, inércia
fisiológica, propriedades antibacterianas, agentes quelantes de metais pesados, ions com
propriedades de formação de gel e de hidrofilicidade, e afinidade notável para as
proteínas (Krajewska, 2004). Devido a estas características, os materiais de quitina e
quitosana ou a base deles estão previstos para ser amplamente explorados no futuro
próximo, especialmente em muitas aplicações, entre outros, como suportes de
imobilização de enzimas.
Freitas, M. F. M
35
2.15 Modificação química na estrutura da quitosana
No intuito de aumentar a estabilidade química e física da quitosana e seus
derivados (complexos polieletrolíticos e matrizes híbridas), têm sido empregadas
alternativas como a modificação química, também denominada de reticulação,
empregando diferentes agentes de ativação (Gupta, 2006; Tsigos, 2000; Gonçalves,
2005, Muzzarelli, 2009). No caso específico da quitosana a modificação de sua estrutura
química é necessária para a obtenção de um suporte quimicamente resistente ao meio
ácido e a redução de sua capacidade de retenção de água. As reações envolvidas na
reticulação ocorrem entre os grupos aminos e hidroxilas da quitosana.
As principais modificações químicas são feitas com agentes bifuncionais como o
glutaraldeído ou funcionais como a epicloridrina e glicidol (Adriano et al., 2008,
Rodrigues et al., 2008 e Mendes et al., 2008).
Derivados de glutaraldeído exibem melhores as propriedades térmicas e de
estabilidade o que os tornam mais adequados para biocatálise. O que destaca a
relevância da imobilização química para aplicação direcionada em biocatalisadores
(Giacomini et al., 2001).
O glutaraldeído é uma molécula de alta reatividade promovendo ligação estável
entre os grupos de amina de suportes e resíduo de amina de proteínas (Elkaoutit, 2011).
A ligação covalente entre os grupos amino do polímero e aldeído terminal é irreversível
e resiste a valores extremos de pH e temperatura (Berger et al., 2004e Mendes et al.,
2011).
É importante caracterizar as condições de reticulação, pois a sua eficiência é
diretamente proporcional à concentração e o tipo de agente de reticulação, tempo de
contato, temperatura, pH, massa molecular e grau de desacetilação da quitosana.
2.16 Biorreatores para a hidrólise
Os reatores de membrana produzem uma atividade enzimática mais baixa, em
comparação aos reatores descontínuos para a utilização de enzimas solúveis (Jurado,
2005), mas em muitos desses casos, o resultado tem sido considerável na atividade da
enzima, bem como a redução na capacidade de ligação.
Freitas, M. F. M
36
A utilização de reatores de leito fixo, em processos biológicos permite a
aplicação de novas metodologias a problemas ambientais, tais como a eliminação do
soro de indústrias de lacticínios, em um caso comercial (Mammarela et al., 2006)
A escolha de hidrólise da lactose em lote e modo contínuo depende
principalmente das características enzimáticas e novos aspectos econômicos abrangendo
a produção, armazenamento e reutilização (Haider e Hunsai, 2008).
O tempo de meia vida da enzima imobilizada é um parâmetro importante para
processos industriais, pois permite que o derivado mantenha sua atividade por um longo
período quando aplicados em reatores descontínuos (Lima, 2012) e contínuos (Bezerra,
2012).
Freitas, M. F. M
37
3-MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
3.1.1 Reagentes e materiais utilizados
Os reagentes utilizados (lactose, fosfato de potássio monobásico, fosfato de
potássio dibásico, sulfato de amônio, sulfato de manganês, dextrose) foram de
diferentes marcas comerciais. O ácido acético e KOH utilizados na preparação do gel de
quitosana foram de padrão analítico. A quitosana em pó, com grau de desacetilação de
85,2 %, foi adquirida junto a Polymar Ind. Ltda (Fortaleza, Ceará, Brasil). O
glutaraldeído 25% (v/v), epicloridrina (1-cloro-2,3-epóxido) e o glicidol (2,3-epóxi-1propanol) e o substrato sintético o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) foram
adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO). Para os ensaios de
extração e ruptura da levedura foram utilizados etanol 99% P.A. e tolueno 99% P.A. e
pérolas de vidro com uma faixa de diâmetro 1,4 - 2,0 mm fornecido pela SP Labor.
3.1.2 Micro-organismo
Lima (2011) em seu trabalho estudou a cepa Kluyveromyces lactis NRRL
Y1564, entres outras para a produção da enzima β-galactosidase, sendo esta a que
obteve o maior consumo de lactose em meio sintético, por isso essa cepa foi a escolhida
para a obtenção da β-galactosidase nesse trabalho.
A espécie Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 foi doada pelo USDA (United
States Department of Agriculture) pertencentes à coleção de cultura da ARS
(Agricultural Research Service). A cultura estoque foi mantida em meio ágar YEPD
(contendo: extrato de levedura 10 g/L; peptona 20 g/L; glicose 20 g/L e ágar 20 g/L)
sob refrigeração.
Freitas, M. F. M
38
3.1.3 Soro de leite
O soro de leite em pó foi fornecido pela Indústria Alibra Ingredientes Ltda
(Campinas-SP) e utilizado para como fonte de carbono no cultivo para a produção da
enzima β-galactosidase. Segundo as especificações técnicas do fabricante, o soro
continha a seguinte composição (por 100 g): carboidratos 74 g; proteínas 11 g; gorduras
totais 1 g; gorduras saturadas 0,5 g; colesterol 6,0 mg; cálcio 796 mg, ferro 0,90 mg e
sódio 1080 mg, pH variando de 6,0 a 7,0 e acidez titulável (% ácido lático) máxima de
2,5%, se tratando de soro doce.
3.1.4 Reagentes para análise de proteínas e glicose
Azul brilhante de Cromassie G 250 da marca Vetec/SP e kit enzimático de
determinação de glicose da marca Labtest Diagnóstica S. A..
3.1.5 Reagentes para a eletroforese
A acrilamida, bis-acrilamida, dodecil sulfato de sódio (SDS), albumina de soro
bovino (BSA), persulfato de amônio, N, N, N’, N’- tetra-metilenodiamina (TEMED),
glicerol e ditiotrietol foram adquiridos da Sigma-Aldrich (EUA).
Marcador de baixa massa molecular contendo as seguintes proteínas: fosforilase
b, albumina, ovoalbumina, anidrase carbônica, inibidor de tripsina e alfalactoalbumina
que foi adquirido da GE healthcare (EUA). Utilizou-se água ultrapura Mili-Q (MiliporeEUA) para a preparação de todas as soluções.
3.2 Métodos
3.2.1 Métodos analíticos
Freitas, M. F. M
39
3.2.1.1 Determinação da concentração celular
Após o crescimento do inóculo em meio de cultivo apropriado, retirou-se uma
alíquota e transferiu-se para a uma cuba de vidro e a leitura da concentração celular que
foi determinada da densidade ótica (DO) a 620 nm, em espectrofotômetro (Spectronic
Modelo Genesys, Série 20) e convertida em gramas por litro conforme curva padrão do
microorganismo.
3.2.1.2 Determinação do pH
O pH foi determinado em pHmetro da TECNAL.
3.2.1.3 Determinação da concentração de lactose
A concentração de lactose foi determinada através de Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência, CLAE (Waters, Milford, MA, EUA), equipado com detector de índice
de refração Waters (Modelo 2414) e uma coluna Aminex HPX-87H, mantida a 65 °C. O
eluente foi uma solução aquosa de H2SO4 a 5 mmoL/L e vazão de 0,5 mL/min. O
volume de injeção das amostras foi de 20 µL e o tempo de análise foi de 30 minutos. As
injeções foram realizadas em duplicata.
3.2.1.4 Determinação da concentração de proteínas
A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Bradford (1976).
Utilizou-se curva de calibração com padrão soro albumina bovina (BSA), adquirida da
Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO), válida numa faixa de concentração de 0 a
0,6 mg/mL. Os resultados foram calculados através da curva padrão do reagente de
Bradford e obtidos em mg/mL.
3.2.1.5 Determinação da concentração de glicose
Depois da conversão da lactose em glicose e galactose determinou-se a
quantidade de glicose formada a partir do Kit Glicose Pap Liquiform (Labtest).
Freitas, M. F. M
40
A análise consistiu em colocar 2 mL do reagente (Kit glicose PAP Liquiform)
em tubos de ensaios, que foram mantidos a 37 °C em banho-maria. Em seguida,
adicionram-se 40 µL da amostra e aguardou-se 10 minutos para ocorrer a reação.
3.2.1.6 Determinação da atividade da enzima β-galactosidase através da hidrólise
substrato ONPG
Para a determinação da atividade hidrolítica da enzima, utilizou-se o substrato
sintético o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) adquirido da Sigma-Aldrich
Chemical Co. (St. Louis, MO), segundo metodologia descrita por Lima (2012). A
atividade hidrolítica da β-galactosidase frente a ONPG foi determinada a 37ºC e pH 6,6.
O coeficiente de extinção molar do produto o-nitrofenol (O-NP) foi determinado
experimentalmente segundo metodologia do CODEX CHEMICALS (1981), o resultado
obtido foi de 4,53 mol/cm. O produto da reação de hidrólise foi determinado
espectrofotometricamente a 420 nm em cuba de vidro. Uma unidade (U) de βgalactosidase é definida como a quantidade de enzima que libera 1µmol de o-nitrofenol
por min sob as condições do ensaio.
Para a enzima solúvel, 2 mL de ONPG 1,25 mM, em tampão fosfato de potássio
50 mM com MnCl2. 4H2O 0,1 mM a pH 6,6, foram colocados em tubos de ensaios. Em
seguida os tubos foram colocados no banho-maria a 37 °C para equilibrar a temperatura
e adicionou-se uma amostra de 50 µL do extrato enzimático contendo β-galactosidase.
Após 5 minutos, parou-se a reação pela adição de 0,5 mL de carbonato de sódio 1M. A
atividade foi determinada espectrofotometricamente a 420 nm. A atividade enzimática
foi calculada de acordo a Equação 1:
At(U/mL) =
A × Vt
ε × L × Ve × t
(1)
Sendo: A - absorbância lida; Vt - volume total = 2,55 mL; Ve - volume de enzima = 0,05
mL; t - tempo de reação = 5 min; L - caminho óptico = 1 cm; ε - coeficiente de extinção
= 4,53 cm2/µmol.
Freitas, M. F. M
41
A atividade da β-galactosidase imobilizada foi realizada colocando-se 0,1g do
derivado imobilizado em um reator a 37 °C, contendo 5 mL de solução de ONPG 1,25
mM em tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,6 suplementado com 0,1 mM de
MnCl2.4H2O mantido sob agitação. Após cinco minutos de hidrólise, retirou-se 2 mL
dessa solução com um filtro e adicionou-se 0,5 mL de carbonato de sódio 1 M. A
atividade do derivado pode ser calculada de acordo com Equação 2.
At derivado (U/g) =
A × Vt
ε × L × m DERIVADO × t
(2)
Sendo: A - absorbância lida; Vt - volume total = 2,55 mL; t - tempo de reação = 5 min;
L - caminho óptico = 1cm; ε - coeficiente de extinção = 4,53 L/mol.cm; mDERIVADO =
massa de gel em g.
3.2.1.7. Determinação da atividade de hidrólise de lactose pela enzima solúvel e
imobilizada
A atividade β-galactosidase também foi determinada pela a hidrólise da lactose
PA, que foi conduzida em tubos de ensaios de 10 mL contendo 5 mL solução sintética
(lactose 5,0% (m/v) em tampão de fosfato de potássio 100mM pH 7,0 com 0,1 mM de
MnCl2 e 0,2 mM de MgCl2), a temperatura de 37 °C por 10 min. A glicose produzida foi
quantificada pelo o método GOD-PAP utilizando um kit enzimático para a dosagem de
glicose (Trinder, 1969), conforme item 3.2.1.7.5. Uma unidade de β-galactosidase (U)
nesta reação, foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar um micromol
de glicose por minuto nas condições descritas acima.
Para a enzima solúvel, adicionaram-se 80 microlitros da enzima solúvel
previamente diluída. Após 10 min, retiraram-se as amostras (150 µL), interrompeu-se a
reação pela adição de 150 µL de 0,1 M NaOH. A atividade foi calculada de acordo a
Equação 3:
Freitas, M. F. M
42
At(U/mL) =
A × Vt × 5,5
t H × Ve
(3)
Sendo: A - absorbância lida (mg/mL); Vt - volume total = 5mL; tH - tempo da reação de
hidrólise = 10 min; Ve - volume de enzima = 0,08 mL;
A atividade da β-galactosidase imobilizada foi determinada em reator batelada
mantida a 37 °C contendo a solução de substrato, sob agitação mecânica suave.
Amostras foram retiradas do sobrenadante e a glicose produzida foi quantificada. A
atividade do derivado foi calculada de acordo a equação 4:
At derivado (U/g) =
A × Vt × 5,5
t H × m enzima
(4)
Sendo: A - absorbância lida (mg/mL); Vt - volume total = 5mL; tH - tempo da reação de
hidrólise = 10 min; menzima = massa de gel em g.
3.2.2 Estudo da produção da enzima β-galactosidase por Kluyveromyces lactis
NRRL Y1564
3.2.2.1 Pré-Tratamento ácido do soro de leite
O primeiro pré-tratamento ácido do soro de leite foi realizado de acordo com
Santiago et al., (2004) e Lima (2011), precipitando as proteínas por aquecimento e
acidificação até pH 4,8 com ácido lático comercial, sob suave agitação. Inicialmente
diluiu-se o soro numa concentração de 50 g/L de lactose em água destilada e colocou-se
essa solução em Becker para aquecer em chapa aquecedora sob agitação a 85 °C. Ao
atingir-se essa temperatura, adicionou-se ácido lático comercial até pH 4,8 e continuouse aquecendo até 90 °C, a temperatura foi controlada com auxílio de um termômetro.
Freitas, M. F. M
43
Ao atingir 90 °C, o aquecimento e a agitação foram então interrompidos e a solução foi
mantida em repouso por 15 minutos, para sedimentação das proteínas, que se
encontravam precipitadas. Finalmente, o soro de leite pré-tratado era então filtrado em
papel de filtro qualitativo. Ao soro de leite pré-tratado e filtrado, adicionava-se 1 g/L de
extrato de levedura para servir como fonte de nitrogênio e corrigia-se o pH para 6,0 com
KOH 4M.
3.2.2.2 Preparo do inóculo
A cepa de Kluyveromyces lactis utilizada nesse estudo foi repicada em meio ágar
YEPD (contendo: ágar 20 g/L; dextrose 20 g/L; extrato de levedura 10 g/L e peptona 20
g/L) e incubada em estufa bacteriológica a 30 °C por 24h, para ativação. Após esse
período, três alçadas das colônias de leveduras eram transferidas para os respectivos
meios de propagação de inóculo, incubado a 30 °C, sob agitação de 180 rpm por 24 h.
Após as 24 h, a densidade ótica (DO) do mesmo foi lida a 620 nm em
espectrofotômetro, estando a leitura da DO na faixa de 1,0 ± 0,1, prosseguia-se para o
ensaio do cultivo do micro-organismo inoculando 10% (v/v) do volume desse inóculo
em 50 mL de meio de cultivo.
3.2.2.3 Condições de cultivo para a produção de β-galactosidase
50 mL de soro pré-tratado foi distribuído em frascos Erlermeyers de 250 mL e
esterilizado a 115 °C por 10 min. Depois de esterilizados, esse soro serviu como fonte
de substrato na fermentação da levedura Kluyveromyces lactis.As condições do ensaio
foram as mesmas condições da propagação do inóculo: 30 °C, 180 rpm com o tempo de
14 h. Após o término da fermentação, as amostras foram retiradas para análise de
biomassa, pH e determinação da atividade enzimática.
3.2.2.4 Extração da enzima β-galactosidase de K. lactis NRRL Y-1564
A amostra do caldo fermentado foi centrifugado a 10.000g por 15 minutos a 4
°C para obtenção da massa celular, que foi lavada uma vez com 20 mL de água
Freitas, M. F. M
44
destilada gelada e centrifugado novamente. Após a lavagem as células foram
ressuspendidas em tampão fostato de potássio pH 6,6 e 0,1 mM de MnCl2.4H2O para
uma concentração celular de 2,9 mg/mL. Em seguida foram estudados os métodos de
permeabilização com solventes e ruptura celular, descritos a seguir. Todos os ensaios
foram conduzidos em triplicata.
3.2.2.4.1 Permeabilização com solvente
O primeiro método avaliado foi segundo Inchaurrondo et al., (1994), no qual os
pellets de células foi incubado a 37 °C por 20 minutos sob agitação orbital (150 rpm) na
presença de 10% v/v de etanol e 2% v/v de tolueno. Avaliou-se ainda a permeabilização
utilizando apenas etanol 10% v/v, nas mesmas condições descritas. A Figura 6 mostra
um fluxograma do processo de permeabilização por solvente.
O Caldo fermentado foi
centrifugado a 10.000 g por 15
min a 4 °C para obtenção da
massa celular.
A massa foi lavada uma vez com 20
mL de água destilada gelada e
centrifugado novamente.
O sobrenadante foi filtrado em
membrana de 0,45 µm. Depois
retirados alíquotas para a medida
da atividade pelo o método de
hidrólise do ONPG.
Foi colocado em agitador rotatório a 37
°C por 20 minutos a 150 rpm. Após esse
tempo, a suspensão foi novamente
centrifugada nas mesmas condições
iniciais.
A massa de células foi
ressuspendida em tampão
fostato de potássio pH
6,6.
Foi acrescentado 10%
v/v de etanol mais 2%
v/v de tolueno ou etanol
10% v/v.
Figura 6- Fluxograma da permeabilização com solvente.
3.2.2.4.2 Ruptura celular
Os métodos de ruptura celular foram realizados segundo as metodologias
propostas por Medeiros et al., (2008). Foram avaliados dois métodos associado a
pérolas de vidro: i) a ruptura em agitador tipo vórtex e ii) ruptura por ondas
ultrassônicas. O primeiro foi realizado através de ensaios de ruptura com cargas de
pérolas de vidro de 1,10 g/mL por um período de 30 min, com intervalos de 2 min em
Freitas, M. F. M
45
banho de gelo a cada 5 min de processo. Em banho ultrassônico, o tempo total foi de 40
min, mas a cada intervalo de 10 min de sonificação substituiu-se a água do banho por
água a 25 °C, evitando que o aquecimento da água desnaturasse a enzima βgalactosidase.
Após o rompimento ou permeabilização das células, centrifugou-se a 10.000g
por 15 minutos a 4 °C e o sobrenadante foi analisado quanto a atividade enzimática. O
melhor método de extração da enzima β-galactosidase produzida por K. lactis NRRL
Y1564 obtida nessa etapa foi aplicado nas demais etapas do presente estudo.
3.2.3 Testes de inibição da enzima β-galactosidase por solventes
Avaliou-se o efeito da presença dos solventes, etanol e tolueno, na atividade
enzimática da β-galactosidase. Nesses ensaios, utilizou-se o extrato enzimático obtido
através do rompimento das células por agitação em vórtex. Um volume de 2 mL desse
extrato foi incubado a 37 °C a 150 rpm por 20 minutos em frascos contendo: i) etanol
(10% v/v); ii) tolueno (2% v/v) e etanol (10% v/v) ou iii) tolueno (2% v/v). Após,
determinou-se a atividade enzimática através da hidrólise do ONPG e essa foi expressa
em U/mLEXTRATO.
3.2.4 Estudo da influência da temperatura na produção da enzima β-galactosidase
por K. lactis NRRL Y1564
Estudou-se a influência da temperatura (30, 34, 37 e 40 °C) na produção de βgalactosidase por K. lactis NRRL Y1564. Para tal fim, os ensaios conduziu-se os
processos fermentativos em Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio sob agitação a
180 rpm por 12 horas em agitador orbital (TECNAL, TE-420). O método de ruptura que
apresentou melhores resultados foi aplicado na etapa desse estudo. Para cada processo
determinou-se a atividade enzimática específica (U/gcél), atividade enzimática
(U/mLcaldo), produtividade de biomassa (g/L. h), produtividade de enzima (U/gcel. h) e
conversão de substrato em células (YX/S). Todos os ensaios foram conduzidos em
triplicata.
Freitas, M. F. M
46
Posteriormente, para a melhor temperatura (melhor crescimento e maior
produção da enzima), acompanhou-se o crescimento celular, consumo de lactose e
produção da enzima em intervalos de tempos pré-definidos.
A temperatura e o tempo de cultivo que favoreceu a maior produção da enzima
de interesse foi aplicada na produção desta e com esse extrato produzido realizou-se a
etapa posterior.
3.2.5 Pré-purificação da enzima β-galactosidase em Concentrador Específico
Após o processo de fermentação e extração da enzima, para aumentar a
atividade catalítica, utilizou-se um concentrador
(filtro para centrífugas Milipore
Amilcon Ultra-15 de 100 KDa), que retia a enzima β-galactosidase de 135 kDa
deixando moléculas menores passarem na membrana. Os ensaios foram realizados por
centrifugação a 4 ºC a 5000g por 10 min. Nesse processo foi avaliado a porcentagem de
recuperação da enzima e a atividade específica para 3 fermentações diferentes (3
amostras de cada ensaio).
3.2.6 Influência de íons na atividade enzimática de β-galactosidase
Estudou-se a influência dos íons Mn2+, Mg2+, Ca2+ e Zn2+ na atividade da enzima
β-galactosidase livre em tampão fosfato de potássio 100 mM, sem nenhum tipo de sal
acrescentado. Estes íons foram adicionados na solução tampão na forma de sais
(MnCl2.4H2O, MgCl2.6H2O, CaCl2.4H2O e ZnSO4.6H2O), em diferentes concentrações
de 0,01; 0,001; 0,00001 e 0,00002 g/L. A atividade enzimática foi determinada pela
hidrólise do substrato comercial ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo).
3.2.7 Eletroforese SDS-PAGE
A técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições
desnaturantes e não redutora (SDS-PAGE) foi utilizada para determinação da pureza
Freitas, M. F. M
47
das frações enzimáticas das diferentes concentrações de enzima β-galactosidase (0,9;
1,5; e 1,9 mg de proteína.mL-1 de extrato enzimático). As análises foram realizadas no
equipamento Mini Protean III (Bio Rad, EUA) utilizando gel de poliacrilamida (30% de
acrilamida e 2,7% de bisacrilamida), conforme protocolo apresentado por LAEMMLI
(1970), na concentração de 7,5%. As diferentes soluções da enzima foram aquecidas a
100°C por 10 min e alíquotas de 10 a 15 µL de cada amostra foram aplicadas aos géis.
Os géis foram submetidos a uma voltagem de 180 V, em cubas verticais e a coloração
foi realizada com nitrato de prata, conforme Morrissey (1981).
3.2.8 Estudo da Imobilização da enzima β-galactosidase produzida por K. lactis
NRRL1564 usando soro de leite como fonte de carbono.
3.2.8.1 Preparação das partículas de quitosana e ativação
As partículas de quitosana foram preparadas de acordo com a metodologia
descrita por Budriene et al., (2005) e Vieira (2009). Inicialmente, 2,0% (m/v) de
quitosana em pó foi solubilizada em ácido acético 2,0% (v/v) e homogeneizada por 30
minutos em agitador mecânico sob temperatura ambiente. Posteriormente, 30 mL desta
solução preparada foi colocada em um reator a 50ºC e deixado sob agitação magnética
por 5 minutos para estabilização da solução. Em seguida, adicionaram-se 45 mL de
KOH 0,5 M como agente coagulante, mantendo a agitação por mais 30 minutos.
Seguiu-se então para ativação deste suporte, adicionando-se glutaraldeído 0,8%;
epicloridrina 3,2% ou glicidol 3,2% (v/v), sob a solução de quitosana coagulada com
KOH. Após 30 minutos de ativação a 50ºC, as partículas foram lavadas com água
destilada em excesso e secas sob vácuo. A Figura 7 mostra um fluxograma do processo
de preparação a ativação das partículas de quitosana para imobilização de βgalactosidase.
Freitas, M. F. M
48
50 mL ác. acético 2%
1 g quitosana em pó
Agitação mecânica
Gel de quitosana 2% (m/v)
Adicionar 30 mL gel
Adicionar 45 mL KOH 0,5 M
Reator a 50°C, sob agitação
30 min
Adicionar o agente ativador
Agentes: glutaraldeído 0,8%,
glicidol e epicloridrina, ambos
3,2%, (vativador/vreator).
30 min
Lavar exaustivamente e secar a bomba à vácuo
Figura 7 - Fluxograma mostrando a seqüência das atividades para preparação das
partículas de quitosana 2,0% (m/v) seguida de ativação com glutaraldeído 0,8%,
epicloridrina e glicidol, ambos 3,2%, (vativador/vreator). (Budriene et al., 2005; Vieira,
2009).
3.2.8.2 Imobilização da enzima β-galactosidase
A β-galactosidase foi imobilizada em gel de quitosana ativado com glutaraldeído
0,8%; epicloridrina ou glicidol ambos 3,2% (vativador/vreator). Utilizou-se uma carga
enzimática de 10 mg de proteína (analisada pelo o método de Bradford) por grama de
suporte. A imobilização foi realizada a pH 7,0 e 25 °C em tampão fosfato de potássio
100 mM, contendo 0,1 mM de MnCl2 e 0,2 mM de MgCl2, sob agitação suave em
agitador rotatório. Diferentes tempos de incubação (3, 5 e 10 h) foram avaliados. Em
paralelo ao processo de imobilização, correu-se um ensaio controle (enzima solúvel e
tampão de imobilização), para acompanhar a estabilidade da enzima durante todo o
processo da imobilização. Retirou-se uma amostra no tempo zero (quando se coloca a
enzima) e após a imobilização, determinou-se a atividade enzimática no sobrenadante.
O gel de quitosana foi lavado exaustivamente com água destilada e secado a vácuo.
Freitas, M. F. M
49
Depois, analisou-se a atividade e utilizou-se o substrato sintético ONPG conforme item
3.2.1.6.
3.2.8.3 Determinação dos parâmetros de imobilização
Ao término da imobilização foram retiradas alíquotas para quantificação da
atividade inicial, residual ou sobrenadante e do derivado. Com esses valores obtidos
determinaram-se os parâmetros de imobilização descritos a seguir.
3.2.8.3.1 Determinação do rendimento de imobilização
As Equações 5 e 6 foram utilizadas para o cálculo do rendimento de
imobilização (RI), atividade teórica (Atteórica), respectivamente.
RI(%) =
At 0 (U/mL) − At residual (U/mL) × 100
At 0 (U/mL)
(5)
Sendo At0: Atividade oferecida no inicio da imobilização diluída em tampão e Atresidual:
atividade residual presente no sobrenadante.
At teórica =
At 0 (U/mL) − C oferecida (mg/mg)
x RI(%)
Pt(mg/mL)
(6)
Sendo At0 - Atividade oferecida no inicio da imobilização diluída em tampão e Coferecida carga oferecida; Pt - concentração de proteínas no extrato e RI- rendimento de
imobilização, sendo 1 referente a 100% de imobilização.
3.2.8.3.2 Atividade recuperada
O atividade recuperada foi calculada pela relação entre a atividade hidrolítica do
derivado e o valor da atividade teórica (atividade inicial oferecida no início da
imobilização), conforme Equação 7.
Freitas, M. F. M
50
At recuperada (%) =
At derivado (U/g)
x100
At teorica (U/g)
(7)
3.2.9 Estudo da estabilidade térmica da enzima β-galactosidase a 60 °C βgalactosidase solúvel e imobilizada
Para se avaliar a estabilidade térmica e o tempo de meia-vida da enzima da βgalactosidase solúvel e imobilizada amostras foram incubadas a 60 °C. Periodicamente,
alíquotas foram retiradas e suas atividades residuais foram determinadas.
Após o cálculo de todas as atividades iniciais e residuais, calculou-se a atividade
relativa (Ar) que foi definida como a razão entre a atividade enzimática do estado final
(A) e a atividade enzimática do estado inicial (A0), conforme Equação 8.
Ar =
A
A0
(8)
Para estimar a constante de desativação térmica, o tempo de meia vida (t1/2) foi
calculado a partir da Equação 9, fator de estabilização (FE) a partir da equação 10,
utilizou-se o modelo de primeira ordem na equação 11.
A R = exp(− K d x t)
(9)
t1/2 =
ln(0,5)
kd
(10)
FE =
t1/2 derivado
t1/2 solúvel
(11)
Sendo: AR - Atividade relativa; Kd - constante de inativação térmica de primeira ordem
e t - tempo em que a amostra permaneceu sob a condição de temperatura.
Freitas, M. F. M
51
3.2.10 Estabilidade de estocagem da enzima β-galactosidase solúvel e imobilizada
A β-galactosidase solúvel e imobilizada foi estocada em tampão fosfato de
potássio a pH 7,0 a 10 °C (em geladeira) e a 4 °C (congelador) por 105 dias. A cada 15
dias, amostras foram retiradas e a atividade da enzima foi medida.
3.2.11 Caracterização da enzima β-galactosidase solúvel e imobilizada
3.2.11.1 Determinação do pH ótimo para a atividade da β-galactosidase solúvel e
imobilizada
O pH ótimo da enzima β-galactosidase (solúvel e imobilizada) foi determinado
através da hidrólise da lactose 5% (m/v) a 40 °C, em tampão fosfato 100 mM contendo
de MnCl2 e 0,2 mM de MgCl2. Os valores de pH do meio reacional variaram de 5,5 a
8,0. A glicose liberada foi determinada conforme descrito no item 3.2.1.5 e a atividade
foi calculada a partir das equações 3 e 4.
A atividade relativa (Ar) foi definida como a razão entre a atividade enzimática
do estado final (A) e a atividade enzimática do estado inicial (A0), conforme
apresentado na equação 8.
3.2.11.2 Determinação da temperatura ótima para a atividade da β-galactosidase
solúvel e imobilizada
A temperatura ótima de hidrólise de lactose da enzima β-galactosidase (solúvel e
imobilizada) foi determinada utilizando uma solução sintética (lactose 5,0% (m/v)) em
tampão de fosfato de potássio 100 mM com 0,1 mM de MnCl2 e 0,2 mM de MgCl2, pH
7,0. Variou-se a temperatura de incubação de 30 a 50 °C e o tempo de reação foi de 10
min. A glicose liberada foi determinada conforme descrito no item 3.2.1.5 e a atividade
foi calculada a partir das equações 3 e 4. Os experimentos foram realizados em triplicata
para a β-galactosidase solúvel e imobilizada.
Freitas, M. F. M
52
3.2.11.3. Influência da temperatura na hidrólise da lactose presente no leite pela
enzima β-galactosidase livre e imobilizada em leite desnatado sem tampão
Estudou-se a influência da temperatura na hidrólise da lactose presente no leite
desnatado usando a enzima β-galactosidase (solúvel e imobilizada). Para tal fim, 25 mL
de leite foram adicionados a Erlermeyers de 250 mL e incubados nas temperaturas de 4,
20, 25, 30, 35, 40 e 45 °C. A hidrólise foi conduzida a 150 rpm por 5 horas. Em
seguida, a glicose liberada foi determinada conforme descrito no item 3.2.1.5 e a
atividade foi calculada a partir das equações 3 e 4. Os experimentos foram realizados
em triplicata.
3.2.12 Estabilidade Operacional
A estabilidade operacional de hidrólise de lactose catalisada pela β-galactosidase
imobilizada em quitosana foi conduzida em reator batelada a 150 rpm por 5 h em mesa
agitadora orbital. Para tal fim, 25 mL de uma solução sintética (lactose 2,0% (m/v) em
tampão fosfato de potássio 100 mM com 0,1 mM de MnCl2 e 0,2 mM de MgCl2 pH
7,0), e 1,0 g de suporte contendo enzima foram adicionados a Erlermayers de 250 mL.
A carga oferecida foi de 3 U/g. Após 5h, a concentração de glicose liberada foi
determinada no sobrenadante. A massa do derivado (1,0 g) foi recolhida, lavada e seca
e um novo ciclo reacional foi iniciado. Foram realizados 10 ciclos (bateladas
consecutivas) de hidrólise. Os ensaios foram feitos em triplicatas.
3.2.13 Avaliação do desempenho do biocatalisador em reatores batelada e contínuo
3.2.13.1 Hidrólise de lactose catalisada por β-galactosidase solúvel e imobilizada
em reator batelada
Nesta etapa, estudou-se a aplicação da enzima β-galactosidase na
hidrólise da lactose. As reações foram conduzidas em reator batelada, utilizando
Erlermayers de 250 mL, contendo 50 mL de uma solução sintética (lactose 2,0% (m/v)
em tampão de fosfato de potássio 100 mM com 0,1 mM de MnCl2 e 0,2 mM de MgCl2
pH 7,0), a 150 rpm por 8 h em mesa agitadora orbital. A reação foi iniciada
adicionando-se 1,3 mL de extrato enzimático (2,9 U/mL) ou 1 g de enzima imobilizada
(3,8 U/g) ao reator. A cada tempo pré-determinado, retiraram-se amostras (150 µL),
Freitas, M. F. M
53
interrompeu-se a reação adicionando NaOH (150 µL) e determinou-se a concentração
de glicose liberada.
A hidrólise da lactose presente no leite desnatado foi também avaliada nas
condições operacionais descritas para a solução sintética. A Tabela 1 apresenta a
composição do leite desnatado. Duas condições foram estudadas, leite desnatado (4,3%
m/v de lactose) e leite desnatado diluído (2,0% de lactose). Foram utilizados
Erlermayers de 250 mL com 50 mL do leite desnatado puro ou diluído com tampão
fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0 contendo 0,1mM de MnCl2 e 0,2 mM de MgCl2.
Tabela 1- Composição do Leite Desnatado utilizado no estudo de hidrólise.
(i)
Composição i
Quantidade
Valor Energético 60 kcal=252kJ
Carboidratos
9g
Proteínas
6g
Gorduras Totais
0g
Gorduras Saturadas
0g
Gorduras Trans
0g
Colesterol
0 mg
Fibra Alimentar
0g
Sódio
90 mg
Cálcio
240 mg
Composição fornecida pela empresa Betânia para 1L de leite.
3.2.13.2 Hidrólise da lactose pela enzima β-galactosidase imobilizada em leito fixo
A hidrólise de lactose catalisada pela β-galactosidase imobilizada em leito fixo
foi conduzida em uma coluna de vidro de 1cm de diâmetro a 40 °C por 7,5 h, e outro
ensaio por 14 h nas mesmas condições. A massa de derivado utilizada foi de 0,85g, o
que levou a uma altura de leito de 1cm. A solução sintética de substrato (lactose 2,0%
(m/v) em tampão de fosfato de potássio 100 mM com 0,1 mM de MnCl2 e 0,2 mM de
MgCl2) foi passada pelo leito com um vazão de 0,7mL/min por 14 horas. A carga
enzimática foi de 1,1 e 3,3 U/g de suporte. Em tempos determinados, retiraram-se
amostras (150 µL), interrompeu-se a reação com NaOH (150 µL) e seguiu-se para
determinar da concentração de glicose conforme item 3.2.1.5 e a atividade foi calculada
a partir das Equações 3 e 4.
Freitas, M. F. M
54
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Estudo da produção da enzima β-galactosidase por Kluyveromyces lactis
NRRL1564 usando soro de leite como substrato
No presente estudo, a enzima β-galactosidase, que catalisa a hidrólise da lactose
em glicose e galactose, foi produzida pelo cultivo do micro-organismo Kluyveromyces
lactis NRRL Y1564 em soro de leite suplementado com extrato de levedura a 30 °C,
metodologia baseada em Lima (2011). Inicialmente, foram estudadas condições
operacionais importantes visando um aumento no rendimento do processo fermentativo.
Primeiro, avaliou-se o método de extração da enzima, a fim de se obter uma maior
atividade no extrato bruto proveniente da fermentação e, desta forma, recuperar uma
maior quantidade de enzima. Em seguida avaliou-se a influência da temperatura e do
tempo de cultivo na produção da enzima β-galactosidase. Após determinar esses
parâmetros avaliou-se o processo de concentração e pré-purificação da enzima de
interesse.
4.1.1 Estudo da extração da enzima β-galactosidase produzida por K. lactis
NRRL1564
Segundo Medeiros et al., (2008), a ruptura celular é a primeira etapa no processo
de isolamento de materiais intracelulares e constitui uma etapa essencial no processo de
“downstream”, possuindo considerável influência não somente na quantidade total da
proteína de interesse a ser recuperada, mas também na sua atividade biológica, sua
associação com outros componentes celulares e a possível presença de degradação
proteolítica e contaminantes que podem influenciar nas etapas subseqüentes. Como a
enzima β-galactosidase é um metabólito intracelular, neste trabalho, estudaram-se
diferentes métodos químicos como adição de etanol e tolueno ou mecânicos de extração
como, agitação em vórtex e ruptura em ultrassom com pérolas de vidro. A Figura 1
apresenta os resultados de atividade enzimática K. lactis NRRL Y1564 após ruptura da
parede celular pelos métodos de ruptura (vórtex e ultrassom) e permeabilização das
células (etanol 10% v/v; etanol 10% v/v e tolueno 2% v/v).
Observa-se na Figura 8, que o processo de extração mais eficiente foi o método
de ruptura celular por agitação em vórtex, uma vez que se obteve uma atividade de
Freitas, M. F. M
55
4730,38 ± 51,55 U/g de células. O método de ruptura em ultrassom com pérolas de
vidro apresentou-se em segundo lugar com uma atividade de 597,48 ± 26,05 U/g de
células. Porém essa atividade foi 87,4% inferior à obtida na extração por abrasão. No
processo de ruptura por ultrassom, o fenômeno de cavitação associado ao efeito de
abrasão gerado pelas pérolas de vidro (Medeiros et al., 2008) favoreceu a extração da
enzima, mas não foi o suficiente para ser superior ao método por agitação em vórtex.
No caso do método de ruptura por ultrassom, também se observa perda da
atividade da enzima quando a suspensão celular é submetida a muitos ciclos
consecutivos (Persike et al., 2002 e Tan et al., 2006). Esta perda de atividade pode ter
ocorrido neste estudo, uma vez que a atividade da β-galactosidase no extrato foi baixa.
Apesar de haver substituição da água do banho, ela estava a temperatura ambiente. Em
dez minutos pode ter havido o aquecimento próximo a região da enzima, causando a sua
desnaturação. Desta forma, acredita-se que um teste utilizando água gelada, em torno de
4 °C, deve ser realizado para a verificação da eficácia desse método.
1,4
Atividade especifica (U/g células)
Atividade (U/mL caldo)
3
1,2
4x10
1,0
3
3x10
0,8
0,6
3
2x10
0,4
3
1x10
0,2
0
Atividade Enzimatica (U/mL caldo)
Atividade Enzimatica Específica (U/g cél.)
3
5x10
0,0
Vortex
Etanol
Etanol e Tolueno
Ultrassom
Método de Extraçao da Enzima
Figura 8 - Atividade enzimática obtida por diferentes métodos de extração da enzima βgalactosidase produzida por K. lactis NRRL Y1564 em soro de leite a 30°C e 180 rpm.
A atividade dos extratos enzimáticos obtidos pelos métodos de permeabilização
foi baixa, aproximadamente 95% inferior à obtida na extração com vórtex. Estes
resultados mostram que os métodos de permeabilização com solvente são menos
eficientes que os métodos de ruptura celular. Entre os dois métodos de permeabilização
Freitas, M. F. M
56
avaliados, a utilização de uma combinação dos solventes etanol e tolueno (221,08 ±
6,96 U/g), foi mais eficiente que o uso de apenas etanol (137,98 ± 3,98 U/g).
O fato dos melhores resultados terem sidos obtidos quando se utilizou o método
de abrasão para ruptura celular é interessante do ponto de vista industrial, uma vez que
não existem riscos de toxicidade. A não utilização de produtos químicos para obtenção
do extrato enzimático favorece a utilização da β-galactosidase na modificação de
alimentos, sem que haja necessidade de remoção de contaminantes.
Segundo Panesar et al. (2006), apesar da necessidade da remoção de
contaminantes, a extração por método químico é a técnica mais utilizada para a extração
da enzima β-galactosidase produzida por levedura. Esse método é capaz de desorganizar
a membrana plasmática, como solventes orgânicos, surfactantes, policátions, proteínas
básicas, ou soluções com alto poder iônico. O uso de solventes orgânicos como etanol,
clorofórmio e tolueno, leva em consideração a eficácia e o custo do processo. (Flores,
1996).
Medeiros et al., (2008) observaram resultados próximos aos obtidos nesse
estudo ao estudar a extração de β-galactosidase de K. marxianus CCT 7081. Os autores
obtiveram uma atividade média de 550,39 U/g quando utilizaram o método de ruptura
em ultrassom com pérolas de vidro.
Dagbagli e Goksungur (2008) alcançaram maiores valores de atividade
enzimática específica da β-galactosidase quando rompimento celular de Kluyveromyces
lactis NRRL Y-8279 foi conduzido por meio de vórtex utilizando pérolas de vidro,
resultado semelhante ao obtido nesse estudo.
Bansal et al., (2008) avaliaram quatro métodos para extrair a enzima βgalactosidase produzida por K. marxianus. Os autores observaram que o método mais
eficiente foi o tratamento com dodecil sulfato de sódio 0,1% (SDS) - clorofórmio,
seguido dos métodos de tratamento com tolueno – acetona, ruptura em ultrassom (por
20 min, com intervalos de 5 em 5 min a 4 °C) e homogeneização com perólas de vidro
(0,45-0,50
mm de diâmetro, durante 1 minuto em vórtex). Eles obtiveram o método
químico como melhor método de extração da enzima, o qual apresenta a vantagem de
ser um método simples, mas possui riscos de contaminantes e toxicidade para a própria
enzima. Esse resultado foi diferente do encontrado neste trabalho, onde o método de
extração com pérolas de vidro em vórtex foi mais eficiente e é um método que não
apresenta toxicidade para a enzima.
Freitas, M. F. M
57
Manera et al., (2008) realizaram a extração da β-galactosidase produzida por K.
lactis CCT7082 através do método de sonicação com pérolas de vidro obtiveram uma
atividade enzimática de 10,6 U/mL, resultado inferior (29%) ao obtido pelo o método
escolhido neste trabalho (atividade enzimática 13,72 U/mL de extrato).
Para verificar se não ocorreu desnaturação ou inibição da enzima pelos métodos
de permeabilização, avaliou-se o efeito dos solventes na atividade da enzima βgalactosidase e os resultados são mostrados na Figura 9.
14
a
12
Atividade Enzimatica
(U/mL de extrato)
a
a,b
b
10
8
6
4
2
0
Sem solvente Tolueno (2 % v/v)
Etanol (10% v/v)
Tolueno
2% v/v
Etanol
10% v/v
Figura 9 - Efeito dos solventes (etanol e tolueno) na atividade enzimática da βgalactosidase produzida por K. lactis NRRL Y1564 em soro de leite a 30 °C e 180 rpm.
Observa-se na Figura 9 que a atividade da enzima não variou com a adição do
etanol 10%. Apenas, houve diferença significativa com a adição de somente tolueno e
na adição de tolueno mais etanol, nas concentrações e no tempo estudado ver Anexo A.
Isso demonstra que os solventes utilizados no método de permeabilização das células da
levedura K. lactis NRRL Y1564, não desnaturam ou inibiram a enzima β-galactosidase,
apesar disso essa rota foi menos eficiente que os métodos de ruptura. Além disso, o uso
de solventes, principalmente o tolueno, para permeabilização de células são mais
onerosos e são tóxicos.
Com base nos resultados obtidos, para as etapas seguintes, a extração da enzima
foi realizada por abrasão usando vórtex e perólas de vidro.
Freitas, M. F. M
58
4.1.2 Influência da temperatura na produção da enzima β-galactosidase por K.
lactis NRRL Y1564 em soro de leite
Avaliou-se a influência da temperatura na produção da enzima β-galactosidase
por K. lactis NRRL Y1564 em soro de leite no tempo de 14 horas de fermentação e 180
rpm de agitação (agitador rotatório). A Tabela 2 apresenta os resultados de atividade
enzimática e produtividade para as diferentes temperaturas estudadas.
Tabela 2 – Influência da temperatura na produção da enzima β-galactosidase por K.
lactis NRRL1564 em soro de leite.
Atividade
Atividade
Atividade
Enzimática
Específica
Enzimática
(U/mLEXTRATO)
(U/gCÉLULAS)
(U/mLCALDO)
30 °C
12,81 ± 0,84
4418,37 ± 288,7
34 °C
9,35 ± 1,04
37 °C
40 °C
T
Produtividade
YX/S
(U/mL.h)
(gcél/glactose)
3,81 ± 0,20
0,32 ± 0,01
0,0492 ± 0,007
3223,01 ± 346,3
2,37 ± 0,71
0,20 ± 0,05
0,0260 ± 0,009
0,64 ± 0,16
220,78 ± 55,29
0,05 ± 0,01
0,04 ± 0,00
0,0061 ± 0,000
0,62 ± 0,04
21,27 ± 15,10
0,01 ± 0,01
0,00 ± 0,00
0,0027 ± 0,002
Como pode ser observado na Tabela 2, maiores valores de atividade
(4418,37 ± 288,7 U/g) e produtividade (0,32 ± 0,01 U/mL.h) da enzima β-galactosidase,
bem como conversão de substrato em célula (0,0492 ± 0,007 g/g) foram obtidos na
temperatura de 30 ºC. Na temperatura de 34 ºC foi obtida uma atividade de
3223,01(U/gCÉLULAS), apresentando uma diminuição na produtividade da enzima (0,20
U/mL.h). Nas temperaturas de 37º e 40 ºC quase não houve produção da enzima, pois o
crescimento celular foi baixo. Como essa enzima é um metabólito primário (Lima,
2012) quanto maior o crescimento celular, maior será a produção da enzima, o que
explica o fato das maiores atividades terem sido alcançadas na temperatura de 30 ºC,
pois houve maior crescimento e conversão de substrato em células (0,0492 ± 0,007).
Estes resultados foram similares ao reportados na literatura para a produção de βgalactosidase utilizando diferentes micro-organismos.
Matheus e Rivas (2003), otimizaram a produção da enzima β-galactosidase de K.
lactis, utilizando o soro de leite desproteinizado para a obtenção de fonte de carbono.
Eles obtiveram uma melhor produção (8,3 U/mL) a 30,3ºC com 18,5 h de fermentação.
Santiago et al., (2004) estudaram a produção da β-galactosidase de K. marxianus ATCC
Freitas, M. F. M
59
46537 em soro de queijo atingiram valores de atividade enzimática de 28 UGLICOSE/mL a
temperatura de 30 ºC e 12 h de fermentação.
Após determinação da temperatura ótima (30 °C) de crescimento desse microorganismo foi feito o estudo cinético de crescimento celular e consumo do substrato.
Também se determinou a produção da enzima através da medida da atividade ao longo
do tempo. A Figura 10 apresenta o perfil de crescimento celular, consumo de substrato e
produção da enzima β-galactosidase por K. lactis NRRL Y1564 em soro de leite nessa
5
10
4
8
Biomassa (g/L)
temperatura.
3
6
2
4
10
1
2
0
0
Lactose (g/L)
40
30
20
Atividade Enzimatica (U/mL CALDO)
50
0
0
5
10
15
20
25
Tempo (h)
Figura 10- Perfil do crescimento celular, consumo de lactose e produção da enzima βgalactosidase por K. lactis NRRL Y1564 em soro de queijo a 30 °C e 180 rpm. ()
Biomassa (g/L); (●) Atividade enzimática específica (U/g) e (▲) Lactose (g/L).
A maior concentração de biomassa foi obtida com 24 h (4,28 g/L), quando
houve um grande consumo da lactose, restando aproximadamente 11 g/L no meio.
Porém não houve diferença entre a concentração obtida com 22 e 48h (dado não
apresentado no gráfico), iniciando a fase estacionária nesse período. Durante o cultivo
acompanhou-se o pH do meio de cultivo, que permaneceu constante (5,0 ± 0,5).
A máxima atividade específica (2553 U/gCÉLULA) e a maior produtividade,
conforme Figuras 10, foram obtidas as 14h. Após esse período houve uma diminuição
na produtividade da enzima como, também, na atividade enzimática.
Freitas, M. F. M
60
Ornelas (2008) em seu estudo, verificou que a maior produção da enzima foi
observada na transição entre a fase exponencial de crescimento e a fase estacionária,
como pode ser observado na Figura 10. O autor relata que as condições fisiológicas que
levam ao aumento e à queda da atividade de β-galactosidase na entrada da fase de
desaceleração do crescimento não é a ausência de lactose no meio. Eles não observaram
correlação entre o máximo da atividade e a concentração de lactose, uma vez que a
queda da atividade máxima aconteceu quando ainda havia lactose no meio de cultivo.
Esse resultado foi similar ao obtido no presente estudo em que se obteve um declínio na
atividade enzimática ainda que mais de 30 g/L de lactose estivesse presente no meio.
Outros autores (Genari, 2000) sugerem que a queda da atividade é resultado das
concentrações limitantes de lactose e concentrações crescentes de etanol, que desvia o
metabolismo para um crescimento diáuxico, diminuindo, portanto, a necessidade da
síntese da enzima. Não se estudou a produção de etanol no presente trabalho, mas
estudos preliminares (Lima, 2012) observaram a produção de etanol pela mesma cepa
de K. lactis NRRL Y1564. A figura 11 mostra a produtividade da enzima com o tempo
cinético em 24 horas.
Produtividade (U/(mLCALDO.h))
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
5
10
15
20
25
Tempo (h)
Figura 11- Produtividade da enzima β-galactosidase por K. lactis NRRL Y-1564
cultivada em soro de leite a 30 °C e 180 rpm.
Bansal et al., (2008) estudaram a produção de β-galactosidase por K. Marxianus
MTCC1389 em soro de queijo, contendo 4,4% (m/v) de lactose. A atividade da βgalactosidase foi máxima após 30h de incubação e após esse período ocorreu um
Freitas, M. F. M
61
declínio na atividade. A biomassa máxima foi de 2,54 g/L em 36h de incubação e a
concentração de lactose diminui drasticamente após 36h de incubação.
Com base nos resultados expostos, para a produção da enzima β-galactosidase
conduziu-se o processo fermentativo a 30 °C, 180 rpm por 14 h e a extração da enzima
realizada por abrasão usando vórtex e perólas de vidro.
4.1.3 Pré-purificação da enzima β-galactosidase produzida por K. lactis NRRL
Y1564
Após o processo de fermentação e extração da enzima, para aumentar a atividade
catalítica se faz necessário uma pré-purificação da enzima produzida. Nesta etapa do
presente estudo, avaliou-se esse processo utilizando um concentrador (Milipore
Amilcon Ultra-15, 100 KDa) e os resultados encontram-se expostos na Tabela 3.
Tabela 3 - Atividade enzimática e atividade específica antes e após o método de prépurificação da enzima β-galactosidase produzida por K. lactis NRRL Y1564 em soro de
leite a 30 °C e 180 rpm e 14h.
Atividade
Atividade
Condição do Extrato
Enzimática
Específica
Enzimático
(U/mlEXTRATO)
(U/mgPROTEÍNA)
Extrato bruto
8,25 ± 0,48
0,85 ± 0,27
Extrato pré-purificado
16,65 ± 1,03
1,32 ± 0,41
Observa-se na Tabela 3 que a atividade específica aumentou aproximadamente
56,14%, obtendo-se uma porcentagem média de recuperação da enzima de 92,44%. Este
aumento na atividade específica após a pré-purificação pode ser atribuído a remoção de
outras proteínas de tamanho menor e a redução do volume que estava a enzima de
interesse. Também, mediu-se a atividade enzimática do filtrado e obteve-se uma
atividade de 0,10 U/mL, indicando que não houve perda da enzima β-galactosidase.
As etapas posteriores desse estudo foram realizadas utilizando o extrato
enzimático pré-purificado.
Freitas, M. F. M
62
4.2 Influência da presença de íons metais na atividade enzimática de βgalactosidase
Vários cátions presentes na solução tampão podem ter efeitos diferentes como
ativadores ou inibidores durante o processo de hidrólise. Por conseguinte, os efeitos dos
íons metálicos foram avaliados adicionando os sais: CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O e
MnCl2.4H2O e ZnSO4.6H2O (Ustok et al., 2010), em diferentes concentrações, na
solução tampão fosfato de potássio 100 mM (sem suplementação com sais).
Na Figura 12, observa-se que os íons Ca2+ (concentrações maiores que 1x10-3
g/L) e Zn2+ (concentrações maiores que 1,1x10-5 g/L) apresentam efeito inibidor sobre a
β-galactosidase, apresentando o íon Zn2+ um efeito mais acentuado. No entanto, Mg2+ e
Mn2+ (até 1x10-3 g/L) promoveram a ativação da enzima β-galactosidase. Na verdade, os
efeitos desses íons dependem de suas concentrações. Esse efeito inibidor do íon Ca2+
poderá desfavorecer a hidrólise da lactose quando estiver presente acima das
concentrações de 1x10-2 g/L que é o caso dos produtos lácteos que são ricos em Ca2+
(concentrações 0,240 g/L).
1,4
0 g/L
-5
1,1 x10 g/L
-5
2,0 x10 g/L
-3
1,0 x10 g/L
-2
1,0 x10 g/L
Atividade Relativa (A/A0)
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
MnCl2.4H2O
MgCl2.6H2O
CaCl2.2H2O
ZnSO4.6H2O
Figura 12- Influência dos íons Mn2+; Ca2+; Mg2+ e Zn2+na atividade enzimática da βgalactosidase solúvel usando o substrato ONPG a 25 °C.
Para a maioria das enzimas β-galactosidases estudadas na literatura, os íons
metálicos divalentes são importantes na obtenção de máxima eficiência catalítica e
Mg2+ é considerado o íon fisiológico (Sutendra et al., 2007). Quando o potencial de
magnésio (pMg =-log [Mg2+]LIVRE) é inferior a 7, a enzima torna-se mais eficiente
(aumenta kcat) e tem uma maior afinidade para o substrato (Km menor) (Hoyoux et al.,
2001; Sutendra et al., 2007). Segundo Adalberto et al., (2010), o esqueleto da proteína
Freitas, M. F. M
63
forma um complexo com o metal e deve ter um segundo sítio de ligação com Mg2+, o
qual é cataliticamente importante. Embora este fenômeno não seja ainda totalmente
compreendido, é razoável assumir que o íon metálico participa na catálise enzimática,
atuando como um ácido de Lewis.
Em vários estudos reportados na literatura (Greenberg e Mahoney, 1982;
Bhowmik, Johnson, e Ray, 1987; Itoh,Toba, Adachi, 1992; Vieira, 2009; Torres et al.,
2006; Santos et. al, 1998), resultados diferentes foram obtidos, dependendo do íon, do
substrato utilizado e a fonte de β-galactosidase (micro-organismo). Greenberg e
Mahoney (1982) obtiveram maior atividade na presença de Mn2+. Em um estudo
realizado por Bhowmik, Johnson, e Ray (1987), a enzima β-galactosidase produzida por
Lactobacillus acidophilus foi estimulada com Mg2+. Porém Mg2+ não teve nenhum
efeito no caso da enzima de Lactobacillus kefiranofaciens (Itoh,Toba, Adachi, 1992). A
adição de Mn2+ e Mg2+ ao tampão fosfato de potássio 100 mM a pH 7,0 levou a um
aumento no valor da atividade hidrolítica da enzima de Kluyveromyces fragilis (Vieira,
2009). Resultados semelhantes foram também relatados por Torres et al., 2006 e Santos
et. al, 1998.
4.3 Eletroferese SDS-PAGE
A Figura 13 representa a eletroforese da enzima β-galactosidase. Na primeira
linha, tem-se os marcadores de massa molar. Da segunda a sétima linha, encontram-se
as amostras da enzima β-galactosidase produzida por K. lactis NRRL Y1564. De acordo
com o eletrograma, a massa molecular é de aproximadamente 135 kDa, mesma faixa de
massa molecular da enzima β-galactosidase produzida por K. lactis no estudo realizado
Cavaille e Combes (1995). As bandas sete, oito e nove são da enzima β-galactosidase
comercial produzida pela Sigma que foi utilizada como padrão.
M
Freitas, M. F. M
64
1 2 3 4 5 6 7 8 9
135 KDa
97
fosforilase
66
45
ovoalbumina
30
20,1
alfa-lactalbumina
14,4
Figura 13 - Perfil eletroforético da β-galactosidase em gel de agarose. (M) Marcador de
baixo peso molecular na concentração de 0,9 mg/mL, sendo M-Marcador, bandas 1- 6
amostras de β-galactosidase produzidas neste trabalho, bandas 7-9 amostras de βgalactosidase.
Na literatura, valores diferentes de massas moleculares de β-galactosidase,
obtidas a partir de diferentes fontes microbianas, têm sido relatados. Muitas βgalactosidases, contendo subunidades numerosas com várias massas moleculares, têm
sido descritas (Berger et al., 1997). Entre β-galactosidases de micro-organismos
termofílicos, massas molecular de 150 kDa, 240, 440 e 700 foram relatadas por Berger
et al., (1997).
Nota-se a presença de outras proteínas (Figura 6) no extrato comercial de βgalactosidase, tais como: ovoalbumina, de massa molecular de aproximadamente 45
KDa, e a alfa-lactalbumina, de massa molecular de 14,4 KDa. Nesse extrato comercial
foi observada a presença de fosfolirase-b, de acordo com resultados obtidos por TellosSollís et al. (2005), com massa molecular de 97 KDa.
Isso não acontece no extrato enzimático produzido no presente estudo, porque
após a extração da enzima, este foi pré-purificado em um filtro específico para a enzima
requerida, no qual outras enzimas ou proteínas produzidas no processo fermentativo, de
estruturas diferentes, ficaram retidas no filtrado.
4.4 Imobilização da β-galactosidase produzida por K. lactis NRRL Y1564 em
quitosana
Inicialmente, avaliou-se a imobilização de β-galactosidase em quitosana. A
imobilização covalente em quitosana reticulada por glutaraldeído é o método muito
empregado em função dos grupos amino existentes na estrutura deste suporte. Essa
Freitas, M. F. M
65
reação ocorre em condições brandas, próximas à neutralidade (Mendes et al., 2011). No
intuito de aumentar a estabilidade química e física da quitosana, estudou-se a
modificação química, também denominada de reticulação, com diferentes agentes de
ativação: glutaraldeído, epicloridrina e glicidol. Estas reações foram realizadas pela
adição de glutaraldeído (0,8% v/v), epicloridrina (3,2% v/v) ou glicidol (3,2% v/v) à
solução de quitosana (2% m/v) segundo a metodologia descrita por Bezerra (2012).
Além disso, fizeram-se alguns ensaios de imobilização utilizando diferentes tempos de
incubação, 3, 5 e 10 horas, para se avaliar a influência do tempo de contato enzimasuporte nas características do biocatalisador.
A Tabela 4 mostra a influencia do tempo de contato e do agente usado na
reticulação da quitosana. Pode-se observar que ao aumentar o tempo de contato da
solução de enzima com o suporte de 3 para 10 h, não promoveu um aumento na
atividade do derivado quando se utilizou glutaraldeído, mas com o glicidol permaneceu
constante. Utilizando o epicloridrina, a atividade do derivado aumentou com o tempo.
Houve um aumento da atividade recuperada em função do aumento do tempo de
incubação de 3 para 5 h apenas quando se utilizou epicloridrina. No entanto, para o
tempo de imobilização de 10 horas, esse valor diminuiu sensivelmente quando se usou
epicloridrina e glutaraldeído.
Os resultados apresentados na Tabela 4 mostraram que o melhor rendimento de
imobilização foi quando o suporte quitosana foi ativado com glutaraldeído 0,8% v/v nos
tempos de 3, 5 e 10 h de imobilização, contudo a atividade recuperada foi maior para o
tempo de imobilização de 3 h. Esse resultado pode ser explicado devido as reações
envolvidas na reticulação da quitosana com o glutaraldeído ocorrerem entre os grupos
amino e hidroxilas da quitosana. Enquanto, que na reação da epicloridrina ou glicidol,
estes agentes de reticulação reagem preferencialmente com os grupos hidroxilas da
quitosana (Mendes et al., 2011).
Freitas, M. F. M
66
Tabela 4 - Imobilização da enzima β-galactosidase em quitosana com o mesmo protocolo de ativação com diferentes ativadores e tempos de
imobilização.
Atividade
Atividade
Atividade do
Rendimento de
Atividade
Atividade
Específica
Oferecida
derivado
Imobilização
Teórica
Recuperada
(U/mgextrato)
(U/g)
(U/g)
(%)
(U/g)
(%)
3h
3,42 ± 0,15
9,63 ±0,42
0,72 ± 0,11
21,65 ± 3,64
0,72 ± 0,01
33,43 ± 1,15
5h
3,39 ± 0,03
9,22±0,08
0,41 ± 0,02
32,91 ± 2,20
2,18 ± 0,12
20,18 ± 0,61
10 h
3,20 ± 0,05
8,73 ± 0,13
0,70 ± 0,02
22,87 ± 0,92
1,83± 0,21
39,84 ± 1,09
3h
2,91± 0,06
7,93 ± 0,05
0,75 ±0,23
44,69 ±0,81
2,43± 0,35
30,76 ±1,82
5h
3,51 ± 0,03
9,20± 0,08
0,76 ± 0,03
28,56 ± 2,11
2,00 ± 0,17
38,15± 2,27
10 h
3,71 ± 0,38
10,46 ±0,26
1,01 ± 0,01
74,23 ± 4,71
3,88 ± 1,04
21,66± 1,86
3h
3,70± 0,28
10,98 ±0,84
3,89 ±0,24
93,37 ±0,07
6,74± 0,95
61,78 ± 0,62
5h
3,34± 0,21
10,27 ±0,05
3,47 ± 0,34
93,31 ± 1,19
8,02 ±0,47
43,88 ± 1,62
10 h
3,48 ± 0,10
9,79 ± 0,27
3,1 ± 0,13
99,79 ± 0,33
6,78 ± 0,39
41,66 ± 0,75
Agentes de
Tempo de
reticulação
imobilização
Glicidol 3,2%
v/v
Epicloridrina
3,2% v/v
Glutaraldeído
0,8% v/v
Freitas, M. F.M
67
4.5 Estabilidade térmica da enzima β-galactosidase solúvel e imobilizada
Na literatura (Pedroche et al., 2006), há relatos da relação direta do aumento das
ligações da enzima ao suporte com o acréscimo na estabilidade térmica e operacional dos
derivados obtidos.
A Figura 14 mostra a estabilidade térmica a 60 °C da enzima solúvel e imobilizada ao
longo do tempo para três biocatalisadores analisados. A Tabela 5 mostra os valores estimados
para as constantes de desativação térmica Kd, utilizando o modelo de desativação primeira
ordem (Belver et al., 2002). A Tabela 5 mostra ainda os valores do tempo de meia vida (t1/2) e
do Fator de Estabilização (FE). A enzima imobilizada apresenta uma maior estabilidade
térmica que a enzima livre. Observa-se ainda que o biocatalisador obtido quando se utilizou o
suporte ativado com glutaraldeído 0,8%, com tempo de contato enzima-suporte de 5h,
apresentou o maior tempo de meia vida. O fator de estabilidade foi de 17,37%, enquanto que
o glicidol obteve o menor fator com o valor de 6,79%.
Freitas, M. F.M
68
(A)
Atividade relativa (A/A0)
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Tempo (min)
1,0
(B)
Atividade relativa (A/A0)
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tempo (min)
(C)
1,0
Atividade relativa (A/A0)
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (min)
16
18
20
22
Freitas, M. F.M
69
Figura 14 - Estabilidade térmica a 60 °C da β-galactosidase solúvel e imobilizada em
quitosana 2% m/v reticulada com três diferentes substâncias variando o tempo de
imobilização: 3 h (A), 5 h (B) e 10 h (C). () enzima solúvel; () enzima imobilizada em
quitosana reticulada com glicidol 3,2% v/v; () enzima imobilizada em quitosana reticulada
com epicloridrina 3,2% v/v; () enzima imobilizada em quitosana reticulada com
glutaraldeído 0,8 % v/v. As curvas apresentam a aproximação do modelo de desativação de
primeira ordem.
Tabela 5 - Valores estimados para as constantes de desativação térmica Kd, tempo de mia
vida e o fator de estabilização em função do tipo de ativação da enzima imobilizada,
aplicando o modelo de primeira ordem.
Condições da enzima
e ativadores
Enzima Solúvel
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldeído
Tempo de
imobilização
(h)
Kd
(min-1)
R2
t1/2
Fator de
(min)
Estabilização
-
0,5201±0,069
0,9333
1,33
-
3
0,0766±0,002
0,9811
9,03
6,79
5
0,0526± 0,003
0,9923
13,17
9,89
10
0,0385±0,002
0,9837
18,00
13,48
3
0,0460±0,0192 0,9842
15,00
11,32
5
0,0431± 0,001
0,9989
16,07
12,08
10
0,0329±0,001
0,9679
21,01
15,80
3
0,0461±0,015
0,9845
15,01
11,29
5
0,0300±0,003
0,9529
23,1
17,37
10
0,0330±0,002
0,9787
21,00
15,74
Dwevedi e Kayastha (2009) estudaram a imobilização da enzima β-galactosidase
produzida por Pisum ativum usando os suportes “Sephadex-PsBGAL” e quitosana reticulada
com glutaraldeído e obtiveram uma meia-vida de 22 min e 116 min a 50 ºC, respectivamente.
Os resultados obtidos por esses autores foram similares ao obtido nesse estudo, pois
demonstraram um tempo de meia vida maior para o suporte quitosana reticulada com
glutaraldeído.
Freitas, M. F.M
70
Obteve-se um tempo de meia vida maior para quitosana reticulada com glutaraldeído,
porque nessa reação ocorre o ataque nucleofílicos dos grupos amino da quitosana aos grupos
carbonilas do glutaraldeído e essa ligação covalente (grupos amino do biopolímero e o
aldeído terminal do glutaraldeído) é irreversível e resiste a valores extremos de pH e
temperatura (Mendes, et al., 2011). O mecanismo de reação da epicloridrina com quitosana é
bastante similar ao do glutaraldeído, no entanto, este agente de reticulação reage
preferencialmente com os grupos hidroxilas da quitosana (Mendes, et al., 2011), fornecendo
menos pontos de ligação enzima-suporte.
As lisinas no tampão pH 7,0 só possuem os grupos amino terminal expostos para a
reação com o suporte. Para que os grupos aminos da lisina estejam desprotonados, o pH em
torno da enzima deve ser em torno de 10,5 (Adriano, 2008). Então neste trabalho só os grupos
amino terminal estavam participando da reação, ligação dita “unipontual”, por isso o fator de
estabilidade foi só 17 vezes (agente de reticulação glutaraldeído) maior que o dá enzima
solúvel.
A menor reatividade dos grupos glioxil é decorrente do tamanho do braço espaçador
obtido, com apenas 2 átomos de carbono, que por impedimento estérico, por estarem mais
próximos do microambiente do suporte, reduz a capacidade de imobilizar concentrações
elevadas de enzimas. Neste trabalho deve ter acontecido isto já que o glicidol e a epicloridrina
obtiveram baixos rendimentos de imobilização. O glutraldeído que possui um braço espaçador
maior, favoreceu para um melhor rendimento de imobilização, porque o aumento da cadeia
carbônica do braço espaçador aumenta a sua reatividade e permite uma maior concentração de
enzima imobilizada (Adriano et al., 2008; Mendes et al., 2011).
O agente reticulador e o tempo escolhido para imobilizar foram a quitosana reticulada
com glutaraldeído para o tempo de 5h, porque com esse tempo de imobilização obteve-se um
maior tempo de meia vida, demonstrado um derivado com maior estabilidade para as
aplicações de hidrólise e leito fixo.
4.6 Influência da temperatura na atividade de hidrólise sintética
A Figura 15 mostra a influencia da temperatura na atividade de hidrólise de lactose
catalisada pela enzima β-galactosidase solúvel e imobilizada em quitosana reticulada com
glutaraldeído. Observa-se que a temperatura ótima para a enzima β-galactosidase solúvel e
imobilizada foi 40 °C. Resultado este que foi similar ao obtido por Numanoglu e Sunglur
(2004). Os autores observaram que a temperatura ótima para enzima β-galactosidase
Freitas, M. F.M
71
produzida por K. lactis (solúvel e imobilizada em sistema de gelatina que foi de 40°C tanto
solúvel como imobilizada.
Ansari e Husain (2011) imobilizaram β-galactosidase de Kluyveromyces lactis
(Lactozim 5000) em concanavalina A em camadas de nanopartículas de óxido de alumínio, e
obtiveram atividade máxima na temperatura de 50 °C tanto para a enzima solúvel quanto para
a imobilizada, esse resultado foi diferente desse estudo, porque a temperatura ótima foi 40 °C
tanto para a enzima imobilizada e solúvel.
1,2
Atividade relativa (A/A0)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
30
35
40
45
50
Temperatura (°C)
Figura 15 - Influência da temperatura sobre a atividade de hidrólise de lactose catalisada por
β-galactosidase solúvel e imobilizada. Hidrólise de uma solução sintética (lactose 5,0% (m/v)
em tampão de fosfato de potássio 100 mM com 0,1 mM de MnCl2. Legenda: () enzima
solúvel; () enzima imobilizada.
4.7 Influência do pH na hidrólise de uma solução sintética de lactose 5%
A Figura 16 mostra a influência do pH na atividade da enzima livre e imobilizada,
mostrando que a faixa de pH ótimo é entre 6,5 a 7 tanto para a enzima solúvel e imobilizada.
No pH de 5,5 a 6,5 a atividade foi um pouco menor em torno de 0,90 para a enzima solúvel e
um pouco mais para a enzima imobilizada. Depois do ponto ótimo a atividade caiu
rapidamente com o aumento do pH.
O pH ótimo da enzima depende de fatores tais como, pKa dos grupos de aminoácidos
presentes no sítio ativo da enzima, microambiente em torno do sítio ativo e a polaridade da
solução do solvente (Price e Stevens, 2000).
Freitas, M. F.M
72
A maioria dos efeitos de perturbação do pH observados em preparações de enzimas
imobilizadas podem ser explicado considerando a distribuição de prótons em todo o sistema e
analisar os fatores que levam à acumulação relativa ou depleção de prótons no microambiente
em torno do enzima (Dwevedi e Kayastha, 2009).
1,0
Atividade relativa (A/A0)
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
pH
Figura 16 - Influência do pH sobre a atividade hidrolítica da β-galactosidase solúvel e
imobilizada na hidrólise de lactose em tampão fosfato de potássio 100 mM adicionado de 0,1
mM MnCl2 a temperatura de 40° C. () enzima solúvel e () enzima imobilizada em gel de
quitosana 2,0% reticulada com glutraldeído 0,8%.
Em se tratando da mesma enzima, mas se a fonte de micro-organismo for diferentes,
pode se obter diferentes pH ótimos. Os autores Dwevedi e Kayastha (2009) estudaram o pH
ótimo da enzima β-galactosidase produzido por Pisum sativum imobilizada em quitosana (1%
m/v) reticulada com glutaraldeído nos substratos ONPG e lactose de 2,8 e 4,4,
respectivamente.
Manera et al. (2010) caracterizaram a β-galactosidase obtida da permeabilização de
células de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 e obtiveram a atividade máxima em pH 6,6 e
temperatura de 50 °C, sendo esse resultado de pH condizente com o resultados obtido nesse
estudo para a enzima solúvel.
Freitas, M. F.M
73
As enzimas comumente utilizadas para a hidrólise da lactose são extraídas das
leveduras Kluveromyces lactis, que apresentam pH ótimo entre 6 e 7, e temperatura ótima de
35 °C ou Kluveromyces fragilis, com pH ótimo em torno de 6,5 e temperatura ótima de 40
(Zadom, 1984). Como observado nas Figuras 8 e 9, os resultados encontrados neste estudo
para pH (7,0) e temperatura ótima (40 ºC) da enzima β-galactosidase são próximos as
condições de pH e temperatura das enzimas comumente utilizadas na hidrólise da lactose
citados nas literaturas acima.
4.8 Estabilidade de armazenamento da enzima β-galactosidase solúvel diluída em
tampão fosfato
Amostras de β-galactosidase solúvel foram armazenadas na geladeira (10 °C) e no
freezer (4° C) durante 105 dias, visando avaliar a sua estabilidade à estocagem. Verificou-se
que após 105 dias a enzima solúvel perdeu 30 e 7,2% da sua atividade inicial quando
armazenada na geladeira e no freezer, respectivamente. No entanto, a enzima imobilizada
manteve 100% da sua atividade quando estocada a 4 °C por 90 dias em solução tampão
fosfato de potássio pH 7,0. Esse resultado indica que o suporte utilizado para a imobilização
da enzima (quitosana 2% m/m ativada com glutaraldeído 0,8% v/v) propiciou uma maior
estabilidade de armazenagem da enzima.
Jochems et al. (2011) armazenaram a enzima β-galactosidase produzida por K. lactis,
solúvel e imobilizada a 5 °C num tampão tris-HCl com 50 mM NaCl e 50 mM MgCl2 (pH 5–
9). No estudo desses autores, eles observaram que a enzima solúvel tinha 46% da sua
atividade depois de sete dias, enquanto que a enzima imobilizada manteve 60% após o mesmo
período de tempo de armazenamento. Após 14 dias, a enzima solúvel perdeu mais de 80% da
sua atividade inicial, enquanto que a enzima imobilizada perdeu 59% da sua atividade inicial.
Comparando estes resultados, a enzima produzida neste estudo apresentou-se mais estável a
estocagem. Além do suporte utilizado, o tampão utilizado neste trabalho foi um fator
importante para manter a enzima estável por longo tempo, por não apresentar sais de sódio em
sua composição e possuir sais que ativam a enzima (Mg2+ e Mn2+), ao contrário do tampão
utilizado pelos autores Jochems et al. (2011).
Freitas, M. F.M
74
4.9. Hidrólise de lactose catalisada por β-galactosidase:ensaios em reator batelada
Determinou-se a conversão de lactose catalisada por β-galactosidase solúvel e
imobilizada em quitosana reticulada com glutaraldeído. Para tal fim, o substrato lactose 5,0%
(m/v) foi preparado em tampão de fosfato de potássio 100 mM a pH 7,0. A Figura 16 mostra
os resultados obtidos em 8 h de reação a 40 °C utilizando a enzima solúvel e imobilizada
como catalisador. Ressalta-se que a mesma carga enzimática foi utilizada em ambos os casos
(3,98 U de enzima por g de lactose). Observando a Figura 17, nota-se um aumento da
conversão com o aumento do tempo reacional até 200 min, obtendo conversões de 86% e
83% para a enzima solúvel e imobilizada, respectivamente. Após esse período a conversão é
praticamente constante.
100
Conversão (%)
80
60
40
20
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Tempo (min)
Figura 17 - Conversão da lactose PA (5% m/v) em glicose em reator batelada a 40 °C por 8 h
catalisada pela enzima β-galactosidase solúvel () e imobilizada ().
A conversão da lactose em glicose e galactose utilizando a enzima produzida foi
superior aos resultados obtidos por Vieira (2009). Esse autor estudou a hidrólise da lactose
(5% m/v) utilizando uma enzima comercial β-galactosidase solúvel e imobilizada utilizando
uma carga enzimática de 2 U/g lactose durante 7 h a 40 °C e obtiveram uma conversão de 30
e 25%, respectivamente.
Freitas, M. F.M
75
Também, o presente estudo mostrou-se superior ao realizado por Miezeliene et al.
(2000), que atingiram uma conversão de 70% da lactose na hidrólise do leite com uma alta
carga de enzima imobilizada em DEAE –Sephadex em torno de 70 U de enzima imobilizada/
g de lactose.
4.10 Influência da temperatura na hidrólise do leite desnatado catalisada por βgalactosidase solúvel e imobilizada
A Figura 18 mostra que a temperatura ótima para a enzima β-galactosidase solúvel e
imobilizada foi 40 °C na hidrólise do leite desnatado. Este resultado foi igual ao obtido na
hidrólise da solução sintética de lactose 5% em tampão fosfato. Porém a conversão obtida foi
inferior para os dois biocatalisadores utilizados. Provavelmente ocorreu uma inibição pelos
íons Ca2+ presente em diferentes produtos lácteos (Adalberto et al., 2010), ocorrendo uma
diminuição na atividade enzimática corroborando com os resultados do estudo da influência
dos íons na atividade da enzima β-galactosidase produzida neste trabalho (item 4.2).
Também, observa-se que a enzima solúvel foi mais eficiente que a imobilizada, o que
não aconteceu na hidrólise da solução sintética de lactose, na qual o perfil de conversão era
semelhante. Provavelmente houve uma adsorção de metais presente no leite na quitosana, pois
esse suporte apresenta uma alta capacidade de adsorver metais e há diferentes estudos de
tratamento de efluentes e remoção de metais (Wibowo et al., 2007). Esse fenômeno pode ter
dificultado o acesso da lactose ao sítio ativo da enzima.
Freitas, M. F.M
76
60
Conversão (%)
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
Temperatura (°C)
Figura 18 -Influência da temperatura na hidrólise do leite desnatado com 4,3% (m/v) de
lactose pela enzima β-galactosidase solúvel () e imobilizada ()
4.11 Hidrólise enzimática da lactose do leite desnatado
Como pode ser visto na Figura 19, a conversão aumentou com o tempo, mas o
máximo atingindo para enzima solúvel foi de 16,77% e para a enzima imobilizada foi de
20,12% demonstrando uma conversão baixa. Acredita-se que este resultado se deve
principalmente a mudança do pH do meio reacional, que no início era 6,5; mas depois de 8 h
estava em torno de 4,30. A enzima solúvel por estar menos protegida começou a desnaturar já
a enzima imobilizada conseguiu ainda aumentar um pouco a conversão.
Ladero et al. (2006) utilizando a enzima β-galactosidase produzida de Thermus sp
obteve a inativação total da enzima na faixa de pH ácido de 3 a 5,5. Isso demonstra que a
faixa de pH ácida desfavorece a atividade da enzima, por isso foi obtido uma baixa conversão
da lactose no estudo acima.
A conversão do leite desnatado foi pequena comparada com leite desnatado em
solução tampão (solução sintética de lactose 2,0%) na Figura 14 (próximo item) que atingiram
atividades de 38,04% para enzima solúvel e para a enzima imobilizada em 42,84%. Isso
aconteceu, porque o leite possui íons de cálcio e sódio que não contribuem para o aumento da
atividade, pois o cálcio como foi visto na Figura 5, a sua presença diminui a atividade, e o
sódio também desvaforece a atividade como mostra o estudo de Vieira (2009), motivo pelo o
qual foi utilizado o agente (0,1 M NaOH) para interrupções da reação de hidrólise. As
Freitas, M. F.M
77
proteínas do leite também atrapalham a atividade catalítica da enzima em estudo Marriotti et.
et al. (2008).
A redução da conversão do leite pode ser explicada pela a interferência de diversos
componentes presentes no leite, como sais (sódio e cálcio) e proteínas (3,6 g), ou seja, o meio
é mais complexo que a lactose pura (Fischer, 2010). A concentração de cálcio presente no
leite, acima de 0,2 g/L, por exemplo, é maior do que a concentração que mostrou efeito
inibitório no presente estudo. Dwevedi et al. (2009) e Marriotti. et al. (2008) utilizaram soro
de leite e o leite desnatado em pó para hidrólise da lactose, respectivamente, mas fizeram
antes pré-tratamento desses substrato para a retirada de proteínas.
50
Conversão (%)
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Tempo (min)
Figura 19 - Conversão da lactose (4,36 % m/v) em glicose pela a β-galactosidase em reator
batelada a 40 °C por 8 h. () solúvel e () imobilizada.
Neri et al. (2008) realizaram-se ensaios de hidrólise da lactose (4,72% m/v) presente
no leite desnatado utilizando a enzima β-galactosidase imobilizada em mPOS-PVA (álcool
polivinílico polissiloxano-magnética) por um tempo de 2 h e obteve uma conversão de 90% a
25 °C em reator batelada.
Roy e Gupta (2003) obtiveram 90% de conversão da lactose presente no soro de leite
(foi feito um pré-processado no soro antes alimentação) em reator batelada contínuo através
β-galactosidase da imobilizada em esferas de vidro a 30 °C após 48 h.
Freitas, M. F.M
78
4.12 Estudo de Hidrólise enzimática da β-galactosidase para a conversão de lactose a
partir do leite diluído em solução tampão (concentração de lactose 2,00% m/v):
Como pode ser visto na Figura 19, a conversão aumentou com o tempo, e atingiu a
máxima conversão em 38,04% para enzima solúvel e para a enzima imobilizada em 42,84%
. Esse resultado mostrou uma conversão maior do que o leite desnatado sem tampão, isso por
que o tampão pH 7,0 conseguiu manter o pH do leite mais constante, terminando com pH 6,3,
condição que não foi tão desfavorável para a enzima.
50
Conversão (%)
40
30
20
10
0
0
100
200
300
400
500
Tempo (min)
Figura 20- Conversão da lactose (2,00 % m/v) em glicose pela a β-galactosidase em reator
batelada a 40 °C por 8 h. () solúvel; () imobilizada.
4.13 Estabilidade operacional da β-galactosidase imobilizada em quitosana e reticulada
com glutaraldeído 0,8%.
Analisou-se a viabilidade de utilização da enzima β-galactosidase imobilizada na
hidrólise da lactose após 10 ciclos de bateladas consecutivas a 40 °C. A Figura 20 mostra a
conversão da lactose que foi aproximadamente de 53 % para todos os ciclos.
Freitas, M. F.M
79
80
Conversão (%)
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Ciclos
Figura 21- Estabilidade operacional da β-galactosidase imobilizada na hidrólise da lactose
(5,0%) a 40 °C e pH 7,0.
Neri et al. (2008) utilizando a enzima β-galactosidase imobilizada em mPOS-PVA
durante 20 reciclos a 25 °C derivado obteve aproximadamente metade da sua atividade inicial.
Verma et al. (2012) utilizando a imobilizada β-galactosidase a partir de
Kluyveromyces lactis em nanopartículas de dióxido de silício ao longo de 11 ciclos, obteve a
metade da sua atividade inicial ao final do último ciclo. Esse resultado foi inferior ao
encontrado nesse estudo que ao longo de 10 ciclos manteve sua atividade aproximadamente
em 100%.
Em Vieira (2009) utilizando um derivado de quitosana ativada com glutaraldeído, em
sua pesquisa, foi obtido uma perda de 17% ao final do quarto ciclo de reutilização em
batelada o que acarretou numa boa estabilidade operacional da sua enzima.
Budriene et al., 2005, imobilizou β-galactosidase de Penicillium canescens, uma
enzima termofílica, em quitosana ativada com glutaraldeído, e obteve um resultado bom com
a redução de somente 10% da atividade hidrolítica inicial no quinto ciclo.
4.14 Hidrólise da lactose sintética da enzima imobilizada em leito fixo
A Figura 22 mostra a conversão de glicose na reação de hidrólise de lactose em leito
fixo a 40 ºC sem recirculação de substrato. Pode ser observada, que quando se utilizou a carga
Freitas, M. F.M
80
de 1,1 U/g, a maior conversão de lactose foi de 12,85 % e o estado estacionário foi atingido
em 180 min. Quando se utilizou 3,3 U/g, a maior conversão de lactose foi de 24,55% e o
estado estacionário foi atingido em 90 min. Em ambos os ensaios, após o estado estacionário
ter sido estabelecido, a conversão permaneceu constante até o tempo de 14hs. O tempo de
residência foi igual para os dois ensaios (1,12 min), mas a produtividade foi diferente, por que
a ela depende da conversão. O resultado da produtividade é mostrado na Tabela 6.
A figura 22 B, mostra a conversão do leito em um tempo bem maior que a figura 22 A,
esse estudo foi feito com o intuito de verificar a estabilidade do derivado no leito. Pode-se
observar na Figura 22 B que o reator atingiu o estado estacionário após 1h, que se manteve até
as 14h analisadas. Este resultado demonstra a estabilidade da enzima imobilizada, uma vez
que não houve perda de atividade (conversão) no período analisado.
50
50
45
40
40
Conversão (%)
Conversão (%)
35
30
20
10
30
25
20
15
10
5
0
0
0
100
200
300
400
500
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Tempo (min)
Tempo (min)
(A)
(B)
Figura 22 - Conversão da glicose na reação de hidrólise utilizando uma solução sintética
(lactose 2,0% (m/v) em tampão de fosfato de potássio 100 mM com 0,1 mM de MnCl2) a 40
°C por 7,5 h com carga de enzima de 1,1 U/g () (A); e por 14 h com carga de enzima de
3,3U/g () (B).
Tabela 6– Produtividade em função da carga enzimática usada na hidrólise de lactose em
leito fixo.
Carga (U/g)
3,3
1,1
Produtividade (g.L/min)
5,0
2,2
Haider e Husain (2009) verificaram em seus experimentos que quanto menor a vazão e
maior a carga enzimática maior a conversão do substrato em produto, eles utilizaram uma
900
Freitas, M. F.M
81
solução sintética de lactose em leito fixo, sem recirculação do substrato com altas cargas
(1525 U) de enzima sob temperatura ambiente e atingiram uma taxa de conversão de 91%.
Xuemei Li et al., 2006, estudaram a hidrólise presente no leite por β-galactosidase de
Kluyveromyces lactis imobilizada em tecido de algodão em reator de leito fixo obtendo
aproximadamente 95% de conversão após 2 h em batelada com reciclo.
Roy e Gupta (2003) trabalharam com leito fluidizado com recirculação do substrato
soro de leite (pré-processado antes da alimentação) utilizado para hidrolisar lactose através da
enzima β-galactosidase imobilizada em granulos de celulose e reticulada com epicloridrina. O
efluente foi recirculada através da coluna. Cerca de 53% de conversão da lactose no soro de
leite pode ser alcançado em cerca de 5 h.
Freitas, M. F. M
82
5- CONCLUSÕES
No estudo de extração da enzima β-galactosidase de Kluyveromyces lactis NRRL
Y1564 em soro de leite, a utilização de uma carga de 1,10 g de pérolas de vidro por mL de
suspensão celular, com diâmetro entre 1,4-2,0 mm proporcionou as melhores condições de
extração por abrasão em agitador tipo vórtex, por um período de 30 min. A temperatura ótima
de produção da enzima por K. lactis NRRL Y1564 foi 30 °C obtendo uma atividade
enzimática de 4418,37 U/g de células e o melhor tempo de cultivo foi de 14 h. Com base
nesses resultados o soro de leite apresentou-se como uma fonte alternativa para a enzima βgalactosidade.
No estudo de imobilização da enzima produzida o melhor derivado foi obtido com
quitosana (2% m/v) reticulada com glutaraldeído (0,8% v/v). A temperatura e pH ótimo
foram 40 °C e 7,0, respectivamente, para a hidrólise da lactose usando a enzima solúvel ou
imobilizada. O biocatalisador produzido nesse estudo apresentou um fator de estabilidade de
17,37%,com uma estabilidade operacional de 53% para a hidrólise da lactose em 10 ciclos de
bateladas e uma estabilidade de armazenamento de 100% quando armazenada a 4 °C por 90
dias. Este derivado demonstrou eficiência na hidrólise da lactose.
O imobilizado se mostrou viável para utilização em reator de leito fixo. Nas condições
estudadas obteve-se uma conversão de lactose de 24,55%, quando utilizado uma carga de
enzima de 3,3U/g e 12,85% de hidrólise quando utilizado uma carga de 1,1U/g.
Freitas, M.F.M
83
6- SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
- Determinação dos parâmetros cinéticos (Vmáx, km e kp) da hidrólise da solução
sintética de lactose pela a enzima solúvel e imobilizada;
- Avaliação da influência da concentração inicial de lactose na atividade de hidrólise
da β-galactosidase solúvel e imobilizada;
- Determinação da estabilidade do derivado em leito fixo e calcular sua conversão
variando a altura do leito.
- Condução de ensaios aumentando a carga no leito fixo para o aumento da conversão.
Freitas, M. F. M
84
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100
ANEXOS
Anexos A
Tabela A. 1 - Análise de Variância para o estudo de inibição dos solventes na atividade da
enzima β-galactosidase.
Grau de
Soma
Média
Valor de
Prob>F
Liberdade
Quadrática
Quadrática
F
Modelo
3
12,57352
4,19117
15,11638 0,00117
Erro
8
2,21808
0,27726
Total
11
14,7916
Coeficiente de Ajuste (R2) = 0,8500
Com um nível de 0,05, a média dos dados são significativamente diferente.
Tabela A. 2 - Teste de Tukey para a avaliação do teste de inibição dos solventes na atividade
da enzima β-galactosidase
Valor
Si
Comparações
Diferença MD
de q
Prob Erro g LCL
UCL
Tolueno + Etanol
com Sem solvente
-0,9336 0,4299 3,071 0,21067 0,05 0 2,3104 0,4432
Tolueno com
Sem solvente
-1,8461 0,4299 6,072 0,01128 0,05 1 3,2229 -0,4693
Tolueno com Tolueno +
Etanol
-0,9125 0,4299 3,002 0,2249 0,05 0 2,2893 0,4643
Etanol com
Sem sovente
0,8944 0,4299 2,942 0,23777 0,05 0 0,4824 2,2712
Etanol com
Tolueno + Etanol
1,8280 0,4299 6,013 0,01192 0,05 1 0,4512 3,2048
9,73EEtanol com Tolueno
2,7405 0,4299 9,015
04
0,05 1 1,3637 4,1173
Nota: MD: Média Quadrática.
O Sig igual a 1, significa que houve diferença significativa na tolerância de 5%.
O Sig igual a 0, significa que não houve diferença significativa na tolerância de 5%.