QO423
Espectrometria de Massas
O que é a massa de um átomo ?
M=5
1H
(1p, 1e) = 1.0079
2H (1p, 1n, 1e) = 2.0141
4He (2p
(2p, 2n
2n, 2e) = 4
4.0026
0026
4He/ 2H
= 1.98 !!
Como é um átomo ?
Como o núcleo
não
ã explode
l d ?!!
Modelo de Bohr
Forças Fundamentais
E = m . c2
Qual é a massa de um átomo ?
Massa
=
Soma das massas das partículas
–
Energia liberada na formação do átomo (núcleo)
Defeito de massa
• Nenhum átomo (c/ excessão do 12C) tem
massa inteira
• Diferença é chamada de Defeito de Massa
Defeito de Massa
Energia de Ligação do Núcleo e
Defeito de Massa
0,02
De
efeito de M
Massa
0,00
-0,02
-0,04
-0,06
H He Li Be B
C
N
O
F Ne Na Mg Al Si
Elemento
P
S
Cl
Unidade de massa atômica (u)
u = 1.6605 x 10-27 kg ( 1/12 12C)
Proton: 1.6726×10-27 kg (1.0073 u)
Nêutron:1.6749 x 10-27 kg (1.0086 u)
Elétron: 9.1093 × 10-31 kg (0.0005u)
Tipos de massas atômicas
• Nominal:
– Massa aredondada em 1 u:
H = 1, C = 12, Cl = 35
• Média:
– Massa média dos isótopos:
H = 1.0079, C = 12.0107, Cl = 35,4532
• Monoisotópica:
M
i ó i
– Massa do isótopo
p mais abundante:
H = 1.0078, C = 12.0000, Cl = 34.9688
Massas Moleculares Exatas
• Consiste na soma das massas atômicas
É única para cada fórmula
N2 = 28.0061
C2H4 = 28.0313
CO = 27.9949
27 9949
B2H6 = 28.0656
Isótopos Naturais
• Substâncias Orgânicas:
• 1H (99
(99.98%),
98%) 2H (0
(0.01%)
01%)
• 12C (98.93%), 13C (1.07%)
• 14N (99.63%), 15N (0.37%)
• 16O (99.80%),
(99 80%) 18O (0.20%)
(0 20%)
• 32S (94.93%), 34S (4.29%)
• 35Cl (75.78%), 37Cl (24.22%)
• 79Br (50
(50.69%),
69%) 81Br (49
(49.31%)
31%)
MS e Padrão Isotópico
• MS mede isótopos individuais e não
massas médias
• Substâncias apresentam várias massas
dependendo da composição isotópica
• Composição isotópica varia de acordo
com a composição química
Padrão Isotópico
p
9.88e12
16.0313
100
%
CH4
0
mass
14
15
16
17
18
19
20
9.35e12
78.0470
100
%
C6H6
79.0470
0
mass
76
77
[[M+1]] = 6%
78
79
80
81
82
Benzo[a]Pireno: C20H12
[M+1]
[M
1] = 22.5%
22 5%
[M+2] = 2.3%
7.84e12
368.1372
100
%
C20H20N2O5
369.1372
370.1450
0
mass
367
368
369
370
[M+1] = 23.4%
23 4%
[M+2] = 3.6%
371
372
373
374
375
7.49e12
49.9923
%
100
51 9923
51.9923
0
45
mass
46
47
48
CH3Cl
49
50
51
52
53
54
55
56
57
5.68e12
83.9534
100
85.9534
%
CH2Cl2
87.9455
0
mass
79
80
81
82
83
[M+1] = 1%
[M+2] = 64%
[M+3] = 0%
[M+4] = 10%
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
5.13e12
204.0473
100
%
206.0473
C10H14Cl2
205.0473
208.0394
207.0473
0
mass
203
204
205
206
207
208
209
[M+1] = 11%
[M+2] = 64%
[M+3] = 7%
[M+4] = 10%
[M+5] = 1%
210
211
(
)
(
);
(
,
)
228.0150
4.52e12
230.0150
%
100
C10H13BrO
229.0150
231.0150
0
mass
226
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
Padrão Isotópico
1295
1000
2095
2000
2465
3000
3655
4000
3660
5730
5000
6000
Regra do Nitrogênio
• Uma molécula orgânica neutra só terá
p se ela tiver número ímpar
p de
massa impar
nitrogênio
– C2H4O: 44
– CH3CONH2: 59
– C6H4(NH2)2: 108
– C10H22O: 158
Tabela de Isótopos
Elemento Isótopo
H
C
N
O
S
Cl
Br
1
H
2
H
12
C
13
C
14
N
15
N
16
O
18
O
32
S
34
S
35
Cl
37
Cl
79
Br
81
Br
Massa (u)
1.00782
1
00782
2.01410
12.00000
13.00335
14.00307
15.00010
15.99491
17 99916
17.99916
31.97207
33.96786
33
96 86
34.96885
36.96590
78.91833
80.91628
Abundância
(%)
100
0.02
100
1.07
100
0.37
100
0 20
0.20
100
4.52
5
100
31.96
100
97.27
Instrumentação
Introdução
de
amostras
Fonte de
Ionização
Analizador
de m/z
Detector
Vácuo
Direto
GC
HPLC
CE
EI
CI
APCI
APPI
ESI
MALDI
FAB
DESI
DART …
B
Multiplicador eQ
MCP
Tof
IT
LIT
ICR
Orbitrap …
J J. Thomson recebeu o
Prêmio Nobel de Física em
1906
J. J. Thomson
Descoberta do elétron e medida da sua razão
massa/carga (m/z) !!
Ionização por Elétrons (EI)
EI
 Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorção
térmica) a uma pressão típica de 10-5 torr,
térmica),
torr são
bombardeadas por elétrons, com energia típica de 70
eV. Ocorre principalmente a retirada ou captura de
um elétron formando íons M+. ou M-.. Íons positivos
são predominantes. M-. se tornam importantes para
moléculas
lé l com alta
lt EA.
EA
M + e- (70 eV)  M+. (~ 5-10 eV) + 2e- (~6065 eV))
Fonte de EI
EI: Características
Processo unimolecular. Os íons formados são rapidamente extraídos
da fonte de ionização pelo eletrodo de repulsão ("repeller“).
Íons moleculares são formados com excesso de energia interna e se
f
fragmentam
t
t t l ou parcialmente.
total
i l
t
EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) como
também fragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas de
espectros de EI a 70 eV; estável; fácil de operar; alta sensibilidade.
Aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso
molecular (~500u), voláteis e termo-estáveis: moléculas orgânicas
relativamente pequenas.
Quando
Q
d o íon
í
molecular
l
l
não é observado
b
d (devido
(d id a dissociação
di
i
excessiva), existe um processo dissociativo exotérmico e portanto M+.
é uma espécie instável.
 EI ocorre em ~10-16 s. Uma em cada 103-105 moléculas que entram
na fonte de EI é ionizada.
Energia das Moléculas
Exemplos
Acetofenona
m = 120
Exemplos
Progesterone
m = 314
Exemplos
C7H16 m = 100
Energia dos Elétrons
Energia x Fragmentação
Dissociação de Íons Radicalares
M + e-  M+. + 2e-
F+. + mol0
F+ + Rad.
F+ + mol0
+ + mol0
F+.
F+ + Rad.
F+ + moll0
F+. + mol0
F+ + Rad.
F+ + mol0
Regra do Elétron Par
• ÍÍons positivos radicalares (camada aberta)
p
podem:
– Perder radical e formar fragmentos positivos
(camada fechada)
– Perder molécula neutra e ficar
positivo/radicalar (camada aberta)
• Íons positivos (camada fechada) podem:
– Perder moléculas neutras e ficar positivo
((camada fechada))
Definições
• Íon
Í Molecular: íon correspondente à
.
+
molécula ionizada: M
• Pico base: íon mais intenso no espectro
p
Fragmentações em EI
• Localizar Íon
Í Molecular
• Observar característica do espectro
• Analisar as fragmentações
Íon Molecular
• ÍÍon de mais alta massa (descontado 13C)
• Se tem alta exatidão
exatidão, calcular DBI
• Verificar fragmentações lógicas
Exemplo
152
195
Exemplo
166
180
Exemplos
p
Progesterone
m = 314
Exemplos
C7H16 m = 100
Mecanismos de Fragmentação
• 4 clivagens principais:
– Dissociação
ç sigma
g
– Clivagem alfa
– Clivagem indutiva
– Fragmentação remota
• Rearranjos
– Mclafferty
Fragmentação de Hidrocabonetos
• Dissociação Sigma seguida de perda de
alcenos
• Íons moleculares pouco intensos
• Ramificação
R ifi
ã di
dirige
i a ffragmentação
t ã
• Íons
o s ca
característicos:
acte st cos 15,
5, 29,
9, 43,
3, 5
57,, 71
Exemplos
p
Exemplos
Exemplos
Alcenos
• Dissociação Sigma
• Formação de íon alílico
• Forma série C2H2n-1 (2 u menor que
Al
Alcano)
)
Exemplos
Álcoois
Exemplos
Aromáticos
•
•
•
•
Formam gerlamente, m/z 77, 78 e/ou 79
m/z 91 / 92 para alquil-aromáticos
alquil aromáticos
Íons característicos de m/z 39, 51 e 65
Íons moleculares mais intensos que HC
Aromáticos
Aromáticos
Álcoois
Álcoois
Álcoois
154
156
EI
• Gera M+. e fragmentos
• Pode não gerar íon molécular
Ionização Química (CI)
Munson and Field - 1966
• EI:
EI
– Simples
– Produz extensa fragmentação
– Muitas vezes tem M+.
– Quando não tem M+.
Controle da Exotermicidade da
R
Reação:
ã E
Extensão
t
ã d
de F
Fragmentação
t ã
CH4
Exemplos
Iso-C4H10
NH3
Exemplos
Exemplos
GC/MS
GC/MS
Mass Analyzer
GC/MS
Estrutura dos dados
GC/MS
GC/MS
Mass Analyzer
GC/MS
Estrutura dos dados
Modos de aquisição
• Varredura
– Análises qualitativas
q
– Análises quantitativas (menor sensibilidade)
• SIM (S
(Selected
l t d IIon M
Monitoring)
it i )
– Análises quantitativas (maior sensibilidade)
Eletrospray
p y
John Fenn – 1989
Prêmio Nobel em Química 2002
!
Yamashita, M.; Fenn, J.B., J. Phys. Chem. 88 (1984) 4451.
Whitehouse, C.M.; Dreyer, R.N.; Yamashita, M.; Fenn, J.B., Anal. Chem. 57 (1985) 675.
Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F.; Whitehouse, C.M., Science 246 (1989) 64.
"Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules,“
ESI: Princípio Geral
ESI: Princípio Geral
 Uma solução da amostra em pH ácido ou básico (ou
(
“neutra” de um sal) é submetida a um spray
eletrolítico sob pressão atmosférica
atmosférica. Um fino spray
(aerosol) se forma (cone de taylor) na presença de
um a
u
alto
to ca
campo
po e
elétrico
ét co de +4000V
000V (ou – 4000V).
000V). O
contra-íon é oxidado (ou reduzido) e formam-se
gôtas com excesso de carga positiva (ou negativa).
O solvente evapora, e o volume das gôtas é
reduzido, e as gôtas se subdividem. Eventualmente,
devido a alta repulsão entre os íons de mesma carga
carga,
ou se formam gôtas contendo apenas um íon
((modelo CRM)) ou íons evaporam
p
((são “ejetados”)
j
)
das gôtas para a fase gasosa (modelo IEM de
evaporação de íons).
Mecanismo de Dessorção
Sonda de ESI
ESI e NanoESI
ESI: Moléculas Orgânicas
ESI: Moléculas Orgânicas
Complexos Organometálicos
O
N
913.0
100
O
Ru
O
912.0
O
911.0
910.0
O
O
O
914.0
N
Ru
N
915.0
O
O
Ru
O
909.0
O
O
%
916.0
908.0
907.0
N
O
906.0
917.0 918.0
905.0
904.0
919.1
0
903
904
905
906
907
908
913.0
100
%
0
m/z
620
640
660
680
700
720
740
760
780
800
820
840
860
880
900
920
940
909
910
911
912
913
914
915
916
917
918
919
920
921
922
m/z
923
Polímeros
C9H19
O(CH2CH2O)n
H
ESI Glu-Fibrinopeptídeo
Glu Fibrinopeptídeo (1568
(1568.9)
9)
(
)
785.46
100
204
785.46
100
234
%
%
785 97
785.97
786 47
786.47
786.95
0
m/z
785
0
50
786
787
788
m/z
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
(1568.9
(1568
9 + 2 ) / 2 = 785
785.46
46
(1569.9 + 2 ) / 2 = 785.96
750
800
850
900
Íons Multicarregados:
Padrão Isotópico
+1 = 1/1 = 1.00
+2 = 1/2 = 0.50
+3
3 = 1/3 = 0
0.33
33
+4 = 1/4 = 0.25
Íons Multicarregados
B-Gal 10 fm/uL
B-Gal 10 fm/uL
hilo08 83 (2.432)
1: TOF MS Survey ES+
302
671.41
100
hilo08 83 (2.432)
671.90
567.38
1: TOF MS Survey ES+
228
567.38
100
567.12
567.63
%
%
567.63
668.70
567.85
617.44
672.42
567.85
626.92
672.91
575.82
576.81 587.29 604.17
568.11
653.41
627.90
568 39
568.39
0
m/z
560
570
580
590
600
610
620
630
640
650
660
670
0
680
m/z
567
B-Gal 10 fm/uL
568
B-Gal 10 fm/uL
hilo08 83 (2.432)
1: TOF MS Survey ES+
103
668.37 668.70
100
hilo08 83 (2.432)
1: TOF MS Survey ES+
302
671.41
100
669.04
%
%
671.90
669.37
672.42
669.68
668.18
672.91
670 10 670.38
670.10
670 38
667 36
667.36
0
673 40
673.40
m/z
668
669
670
0
m/z
671
672
673
674
ESI de Proteínas
Mioglobina: (16881 Da) :
teste
Mioglobina 891 (16.772) Cm (889:907)
TOF MS ES+
1.48e3
804.9
100
(
(16881
+ 20)) / 20 = 845.1
(16881 + 21) / 21 = 804.9
(16881 + 22) / 22 = 768.3
%
( + x)) / x = m/z1
(M
(M + x +1) / (x +1) = m/z2
0
m/z
804
805
806
735.0 768.3
100
804.9
1.48e3
845.1
889.5
704.4
938 9
938.9
676.3
994.1
%
1056.1
1126.5
650 3
650.3
1206.9
0
m/z
650
700
750
800
850
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
ESI: Complexos
Urease da Helicobacter pylori
1.05 MDa !
ESI de Vírus
Intacto
LC MS
LC-MS
• ESI: Introdução de amostra em solução
• Possibilidade de acoplamento c/ HPLC
LC MS Urina: Metabólitos
LC-MS
Total: ~1500 peptídeos!
MALDI
Ionização e Dessorção a LASER
Auxiliada por Matriz
Koichi Tanaka
Franz Hillenkamp
Michael Karas
MALDI: Princípio
ION FORMATION IN MALDI MASS SPECTROMETRY Renato Zenobi and
Richard Knochenmuss, Mass Spectrometry Reviews, 1998, 17, 337–366
MALDI: Princípio
Nuvem de plasma (Plume)
MALDI
MALDI: Íons Monocarregados
(
100
)
(
)
(
)
(
)
12417.97
3.60e3
%
17016.75
12630.54
24042.51
17224.64
0
10000
m/z
12000
14000
16000
18000
20000
22000
24000
26000
28000
MALDI: Sensibilidade
42 Zeptomols
(25000 Moléculas)
de substância P !!!
J Am Soc Mass Spectrom 2001, 12, 1055–1063
Matrizes
Fulerenos
Polímeros
PEG 10KDa
Proteínas
?
MALDI: Características
•
•
•
•
•
Forma íons monocarregados
Sensível
Rápido para amostras individuais
Mais Tolerante a contaminantes
Problemas com massa baixa
MS: Métodos de Ionização
Mas
ssa
MALDI
EI
ESI
Polaridade