FABIO DA SILVA DE AZEVEDO FORTES
JUNÇÕES COMUNICANTES E RECEPTORES
P2X7 EM MACRÓFAGOS
Tese submetida à Universidade do Brasil – UFRJ visando à obtenção do grau
de Doutor em Ciências Biológicas (Fisiologia)
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Centro de Ciências da Saúde
Universidade do Brasil – UFRJ
Maio / 2007
FABIO DA SILVA DE AZEVEDO FORTES
JUNÇÕES COMUNICANTES E RECEPTORES
P2X7 EM MACRÓFAGOS
Tese de Doutorado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
(Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Doutor em Ciências
biológicas (Fisiologia).
Orientadores: Prof Regina Coeli dos Santos Goldenberg
Prof Antônio Carlos Campos de Carvalho
Rio de Janeiro
Maio / 2007
FABIO DA SILVA DE AZEVEDO FORTES
JUNÇÕES COMUNICANTES E RECEPTORES
P2X7 EM MACRÓFAGOS
Rio de Janeiro, 29 de Maio de 2007.
______________________________________________________________
(Prof Regina Coeli dos Santos Goldenberg, Doutor, Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho - UFRJ)
______________________________________________________________
(Prof Antônio Carlos Campos de Carvalho, Doutor, Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho - UFRJ)
______________________________________________________________
(Prof Márcia Alves Marques Capella, Doutor, Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho - UFRJ)
______________________________________________________________
(Prof Wamberto Antônio Varanda, Doutor, Universidade de São Paulo - USP)
______________________________________________________________
(Prof Wilson Savino, Doutor, Fundação e Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ))
______________________________________________________________
(Prof Robson Coutinho Silva, Doutor, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
- UFRJ)
FORTES, Fabio da Silva de Azevedo
JUNÇÕES COMUNICANTES EM MACRÓFAGOS:
POSSÍVEIS CORRELAÇÕES COM RECEPTORES P2
xii, 1 155 fls.
Tese: Doutorado em Ciências Biológicas (Fisiologia)
1. Junções comunicantes. 2. Macrófagos
I. Universidade do Brasil - UFRJ
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
II. Título
3. Conexina43
4. Receptor P2X7
Este trabalho foi realizado no Laboratório de CARDIOLOGIA CELULAR
e MOLECULAR do INSTITUTO de BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO da
UNIVERSIDADE do BRASIL – UFRJ sob orientação dos Profs Regina Coeli
dos Santos Goldenberg e Antônio Carlos Campos de Carvalho, contando com
o apoio financeiro das entidades: Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior (CAPES), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP),
Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB), PRONEX e Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
RESUMO
As Junções Comunicantes (JC) desempenham um importante papel na
comunicação entre células nos diferentes sistemas do corpo humano. No
sistema imune, particularmente em Macrófagos, a presença e a funcionalidade
das JC, e a sua interação com Receptores P2X 7 (R-P2X7), estrutura
responsável pelo fenômeno de permeabilização, ainda é uma questão
controversa. Em função disto, resolvemos estudar estas questões. Para tanto,
foram utilizados Macrófagos Peritoneais de camundongos selvagens e
“knockout” para o receptor P2X7 (Mφ e Mφ-P2X7), e Células da linhagem
macrofágica J774-G8 (G8 e G8 ATP-resistentes [ATPr]) e J774-A1 (A1). A fim
de avaliar a funcionalidade das JC nestas células realizamos injeções de
corante com Lucifer yellow (457.2 Da). Os dados demonstraram que 70% dos
Mφ estavam acoplados, enquanto que apenas 5% das células A1 estavam
acopladas, diferentemente das células G8, que estavam acopladas a 84% das
células injetadas. No entanto, as células ATPr (que não sofrem
permeabilização) apresentavam apenas 9% das células acopladas, o que foi
confirmado ao utilizarmos os Mφ-P2X7. Devido as diferenças funcionais, foram
feitos ensaios de RT-PCR, que demonstraram a mensagem para conexina43
(Cx43) em Mφ, células G8 e células ATPr. Ensaios de imunoeletrotransferência
foram feitos para verificar uma possível modificação na expressão da Cx43 e
do R-P2X7. Os Mφ e as células G8 expressaram a Cx43 e o receptor P2X 7,
enquanto que as células ATPr expressaram a Cx43, mas não o R-P2X 7. Para
verificar a localização da Cx43 nas células G8 e ATPr, que apesar de não
estarem acopladas expressavam quantidades de Cx43 similares as das células
G8, foram realizados experimentos de imunofluorescência. A imunoreatividade
para Cx43 nas G8 se encontrava essencialmente na membrana plasmática.
Entretanto, nas ATPr a imunoreatividade estava presente majoritariamente no
citoplasma da célula, justificando os dados funcionais obtidos, e sugerindo uma
possível interação entre a Cx43 e o R-P2X7, haja visto que esta célula não
expressa o R-P2X7, e não apresenta acoplamento. Para verifcar esta
suposição, foram feitos ensaios de microscopia confocal e coimunoprecipitação, que demonstraram, respectivamente, a presença da Cx43 e
do R-P2X7 no mesmo volume confocal em Mφ e em células G8, e interação
bioquímica das 2 proteínas nestas células, o que não foi observado nos MφP2X7, através da microscopia confocal. No entanto, ao fazer os mesmos
experimentos para as células A1, observamos as duas proteínas presentes,
mas sem a interação ótica ou bioquímica. Com base neste resultado, as células
G8 e A1 foram utilizadas em Microarranjos de DNA, a fim de estudar as
interações moleculares demonstradas anteriormente. Os resultados
demonstraram que dos 1193 genes alterados nas células A1, 44% estavam
regulados negativamente, e deste total, 30% dos genes estão envolvidos com
proteínas que regulam a inserção ou funções das Cxs e dos R-P2. Portanto,
concluímos que as JC estão presentes e funcionais em Mφ e células G8, e
estão interagindo com R-P2X7, o que pode estar sendo regulado por proteínas
que interagem com a Cx43 e R-P2X7 ao mesmo tempo, como observado nos
ensaios moleculares.
ABSTRACT
Gap junctions (GJ) play an important role in communication between
cells in different systems. In immune system, specifically in macrophages, the
presence and functionality of the GJ, and your interaction with P2X7 Receptors
(P2X7-R), structure responsible for permeabilization phenomenon, is still a
controversial issue. Thus, we did decide to investigate this issue. We utilized
wildtype and knockout Peritoneal Macrophages for P2X7-R (Mφ and Mφ-P2X7),
and the macrophage cell line J774-G8 (G8 and ATP-resistant [ATPr]) and J774A1 (A1). In order to evaluate the functionality of the GJ in these cells we
assayed dye injections with Lucifer yellow (457.2 Da). The results demonstrated
that 70% of Mφ were coupled, while only 5% of the A1 cells was dye coupled,
differently of G8 cells, that were coupled to 84% injected cells. However, the
ATPr cells, which not shows presence of permeabilization phenomenon, were
coupled only 9% of the cells, confirmed in experiments using Mφ-P2X7. Due to
the functional differences we performed RT-PCR assays, which demonstrate
molecular expression of Cx43 in Mφ, G8 and ATPr cells. Western blot assays
were performed to verify a possible modification in the expression of
connexin43 (Cx43) and P2X7-R proteins. The Mφ and G8 cells expressed Cx43
and P2X7-R, whereas that ATP-r expressed Cx43 but did not express P2X 7-R.
To verify the cellular localization of Cx43 in G8 and ATPr that although not
coupled, expressed similar quantities of the Cx43 in comparation with G8 cells
we performed immunofluorescence experiments. The immunoreactivity for
Cx43 in G8 cells was present essentiality in the surface membrane. However, in
ATPr cells, the immunoreactivity was present in the citoplasm of the cell,
justifying functional data, and suggesting a possible interaction between Cx43
and P2X7-R, because this cell not expresses P2X7-R, and not coupled. For to
verify this suppose, we did confocal microscopy and co-immunoprecipitation
assays that demonstrated, respectively, the presence of the Cx43 and P2X7-R
in same confocal volume of the Mφ and G8 cells, and biochemistry interaction of
these 2 proteins in these cells (we not observe in Mφ-P2X7 using confocal
microscopy). However, using A1 cells we observe that this two proteins were
present, but without optic and biochemistry interaction. For to study this
molecular interactions demonstrated, we did Microarray experiments using G8
and A1 cells. The results demonstrated that 1193 were altered in A1 cells, and
44% these genes was downregulated. This total, 30% of these genes were
involved with proteins that regulate insertion and functions of the Cx43 and P2R. Thus, we conclude that GJ are present and functional in Mφ and G8 cells,
and were interacting with P2X7-R. This interaction may be regulated by proteins
that interact with Cx43 and P2X7-R in same time, demonstrated in molecular
assays.
Aos meus pais, Luiz Pedro e Diva, e ao meu irmão Felipe, pelo amor,
apoio, carinho e compreensão que sempre me deram.
À minha tia Cezira, por ter me ajudado, junto com meus pais, a chegar
no nível em que cheguei.
À Giselle, minha namorada, amiga e companheira de muitas felicidades
e tristezas, que soube mudar e esperar por mudanças ao longo de sua vida e
da minha também.
À minha amiga Regina Goldenberg, que sempre esteve presente em
cada pedacinho da minha vida, de alguns anos atrás até os dias de hoje. Este
trabalho é seu também!!!!! E repeti esta mesma frase, pois o empenho não
mudou!!!!!!!
AGRADECIMENTOS
Primeiramente gostaria de agradecer a Deus e a Jesus Cristo por terem
me dado a oportunidade de viver com saúde e paz, que se transformaram em
força para vencer as dificuldades.
As Forças que sempre estiveram presentes em minha vida, e me
guiaram para um caminho de paz e tranquilidade.
Aos meus pais, por sempre terem lutado para me dar um futuro próspero
e digno. Ao meu irmão Felipe que sempre me ajudou quando mais precisei. À
minha tia Cezira, que ajudou a mim e aos meus pais nos momentos de
dificuldades.
À Giselle, minha querida, que ao meu lado caminhou e enfrentou
obstáculos. Esteve direta e indiretamente comigo em inúmeros momentos, com
o seu amor e afeto incondicionais que até hoje alimentam o nosso amor.
À Profa Regina Goldenberg, que não foi apenas minha orientadora, mas
foi um exemplo de perseverança, garra, seriedade e honestidade em um
mundo tão complicado como o nosso: o da Pesquisa, e me ensinou o lado
docente de minha vida.
Ao Prof Antônio Carlos, por ter sempre mantido as portas abertas para
que eu pudesse pesquisar e aprender, além de ter me orientado com tamanha
sabedoria, me ensinando o que é ser um pesquisador de verdade.
À tia Daisy, que me ensinou grande parte de tudo que sei, por ter me
dado segurança e as palavras certas nas horas certas. Valeu !!!!!!!!!!
Aos membros do laboratório de Imunobiofísica, e particularmente aos
Profs Robson e Pedro, que sempre me aconselharam de forma científica, de
um ponto de vista que aprendi a enxergar.
À Profa Elaine, que com um “olho clínico” enxergou que eu poderia ser
feliz fazendo ciência.
À toda galera do Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular. Não
vou citar os nomes, pois posso esquecer de alguém, mas saibam que vocês
são D+!!!!!
Aos Profs José Hamilton e Masako Masuda, e a todos os membros do
Laboratório de Eletrofisiologia Cardíaca. Vocês também são o máximo !!!!!!!!
À Sandrinha e ao Diogo, que sempre estavam prontos a me prestar o
auxílio em qualquer momento. Não sei o que seria da minha vida e de todos
estes alunos de pós-graduação sem vocês dois.
Aos membros do CEGIB, que sempre foram solícitos aos nossos
pedidos e problemas. Muito Obrigado!!!!!
Aos membros do IBCCF, que sempre se fizeram presentes nos
momentos em que mais precisei: professores, alunos e funcionários.
Às pessoas que me ajudaram em momentos de imensa dificuldade e
contribuiram para o meu crescimento: Carlos Valvano, Camila e Viviane.
Aos amigos que conquistei: Rodrigo Bouier, Leonardo, Lilian e vários
outros que saberão que estão nesta frase ao lê-la.
Aos amigos Lucas e Cátia: não tenho palavras para agradecer o que
vocês vêm fazendo por mim neste momento. Pela confiança, honestidade,
ensinamento, competência em fazer e saber fazer, e companheirismo. Muito
obrigado e estamos juntos para o que der e vier.
Ao Rafael, Cláudio, Carlinhos, Luciana, Sérgio, Jorge, Caiado, Ronaldo,
Nuno e todos os outros amigos que fazem parte de uma família que vem
crescendo e que me acolheu de bom coração.
À Dalva, Jorge Bezerra e a Paula Ribeiro, que ultimamente também têm
se demonstrado grandes e verdadeiros amigos.
À Fabíola, Viviane, Prof Luiz Augusto, Lívia, Armando, Daniela Barbosa,
Jocimara, Éricka, Danizinha, Fernanda, Igor, Carla, Ana Costa, Mariana,
Amanda, Flávio, Rafael Canela, Wilton, André e a todos os outros amigos que
vêm contribuindo para o meu crescimento como pessoa e profissional.
À Prof Deyse Santoro e a Prof Maria Antonieta Rubio Tyrrel, por terem
aberto as portas da Escola de Enfermagem Anna Nery da UFRJ para que eu
possa aplicar o que aprendi durante estes anos: CIÊNCIA. O meu sincero
MUITO OBRIGADO!!!!!
Aos Profs David Spray e Eliana Scemes, e a todos os membros dos
seus laboratórios pelos ensinamentos, pelo carinho e pelo afeto que me
prestaram no tempo em que estive no Albert Einstein College of Medicine em
Nova Iorque. E neste tempo em que estive lá, não poderia esquecer da
Cristiane: você é 100000.... minha irmã.
À todos aqueles que contribuiram de uma forma direta ou indireta para
que este trabalho fosse realizado: Muito Obrigado!!!!!!!
ÍNDICE
I - INTRODUÇÃO --------------------------------------------------------------------------- 01
1- JUNÇÕES COMUNICANTES -------------------------------------------------------- 02
1.1- CONEXINAS --------------------------------------------------------------------------- 04
1.2- ESTRUTURA DAS JUNÇÕES COMUNICANTES --------------------------- 08
1.3- FORMAÇÃO DAS JUNÇÕES COMUNICANTES ---------------------------- 10
1.4- FUNÇÕES DAS JUNÇÕES COMUNICANTES ------------------------------- 12
1.5- PROPRIEDADES DAS JUNÇÕES COMUNICANTES ---------------------- 14
2- MACRÓFAGOS -------------------------------------------------------------------------- 18
2.1- FUNÇÕES & INTERAÇÃO CELULAR ------------------------------------------- 19
2.2- MACRÓFAGOS: RECEPTOR P2X7 E ATP ------------------------------------ 23
3- MACRÓFAGOS X JUNÇÕES COMUNICANTES ------------------------------- 25
4- JUNÇÕES COMUNICANTES X PORO INDUZIDO POR ATP: Uma
possível correlação em Macrófagos? ---------------------------------------------- 29
II- OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------ 33
III- MATERIAIS & MÉTODOS------------------------------------------------------------ 35
1- CULTURA DE CÉLULAS -------------------------------------------------------------- 36
1.1- CÉLULAS DA LINHAGEM J774 --------------------------------------------------
36
1.2- CÉLULAS DA LINHAGEM J774 ATP-RESISTENTES ---------------------- 36
1.3- MACRÓFAGOS PERITONEAIS --------------------------------------------------
37
2- PCR (Polimerase Chain Reaction) -------------------------------------------------- 38
3- MICROARRANJO DE DNA ----------------------------------------------------------- 39
4- DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA ------------------- 42
5- IMUNOELETROTRANSFERÊNCIA------------------------------------------------- 42
6- CO-IMUNOPRECIPITAÇÃO ---------------------------------------------------------- 44
7- IMUNOFLUORESCÊNCIA ------------------------------------------------------------ 46
8- INJEÇÃO DE CORANTE -------------------------------------------------------------- 48
IV- RESULTADOS -------------------------------------------------------------------------- 49
1- INJEÇÃO DE CORANTES ------------------------------------------------------------ 50
2- PCR (Polimerase Chain Reaction) ------------------------------------------------
54
3- IMUNOELETROTRANSFERÊNCIA------------------------------------------------- 55
4- IMUNOFLUORESCÊNCIA -----------------------------------------------------------
56
5- IMUNOPRECIPITAÇÃO --------------------------------------------------------------- 59
6- MICROARRANJO DE DNA ----------------------------------------------------------- 60
FIGURAS ------------------------------------------------------------------------------
63--104
V- DISCUSSÃO ---------------------------------------------------------------------------- 105
VI- CONCLUSÃO -------------------------------------------------------------------------
135
VII- BIBLIOGRAFIA---------------------------------------------------------------------
138
ÍNDICE DE FIGURAS
INTRODUÇÃO
Figura 1 ------------------------------------------------------------------------------------------ 03
Figura 2 ------------------------------------------------------------------------------------------ 04
Figura 3 ------------------------------------------------------------------------------------------ 06
Figura 4 ------------------------------------------------------------------------------------------ 09
Figura 5 ------------------------------------------------------------------------------------------ 09
Figura 6 ------------------------------------------------------------------------------------------ 11
Figura 7 ------------------------------------------------------------------------------------------ 19
MATERIAIS & MÉTODOS
Figura 8 ------------------------------------------------------------------------------------------ 43
RESULTADOS
Figura 9 ------------------------------------------------------------------------------------------ 65
Figura 10 ---------------------------------------------------------------------------------------- 67
Figura 11 ---------------------------------------------------------------------------------------- 69
Figura 12 ---------------------------------------------------------------------------------------- 71
Figura 13 ---------------------------------------------------------------------------------------- 73
Figura 14 ---------------------------------------------------------------------------------------- 75
Figura 15 ---------------------------------------------------------------------------------------- 77
Figura 16 ---------------------------------------------------------------------------------------- 79
Figura 17 ---------------------------------------------------------------------------------------- 81
Figura 18 ---------------------------------------------------------------------------------------- 83
Figura 19 ---------------------------------------------------------------------------------------- 85
Figura 20 ---------------------------------------------------------------------------------------- 87
Figura 21 ---------------------------------------------------------------------------------------- 89
Figura 22 ---------------------------------------------------------------------------------------- 91
Figura 23 ---------------------------------------------------------------------------------------- 93
Figura 24 ---------------------------------------------------------------------------------------- 95
Figura 25 --------------------------------------------------------------------------------------- 97
Figura 26 ---------------------------------------------------------------------------------------- 99
Figura 27 -------------------------------------------------------------------------------------- 101
Figura28 -------------------------------------------------------------------------------------- 103
Figura29 -------------------------------------------------------------------------------------- 105
DISCUSSÃO
Figura30 -------------------------------------------------------------------------------------- 125
Figura 31 -------------------------------------------------------------------------------------- 127
Figura 32 -------------------------------------------------------------------------------------- 131
I- INTRODUÇÃO
1- JUNÇÕES COMUNICANTES
O estudo da comunicação intercelular, ao longo dos anos, vem se
tornando alvo de pesquisas e descobertas importantes para um melhor
entendimento tanto de funções orgânicas imprescindíveis à sobrevivência,
quanto para compreensão de doenças que possam vir a interromper a
homeostase em que o organismo humano se encontra.
Diante das várias formas de comunicação intercelular merece destaque
a que ocorre através da Junção Comunicante ou “Gap Junction”,
caracterizada por canais transmembrana que permitem a comunicação direta
nos tecidos (Dhein, 1998).
No final da década de 50 os primeiros indícios de comunicação
intercelular começavam a se tornar evidentes, com os dados de Furshpan &
Potter (1959) que demonstraram o acoplamento elétrico em neurônios de
lagostim. No início da década de 60 outros trabalhos vieram a demonstrar o
acoplamento elétrico anteriormente descrito, inclusive em outros tipos
celulares, porém sem conseguir evidenciar que estrutura seria responsável por
tais fenômenos. No final dos anos 60, experimentos de microscopia eletrônica
de transmissão em amostras tratadas previamente com nitrato de lantânio
permitiram a visualização de estruturas heptalaminares, apresentando um
padrão hexagonal de subunidades de 7 a 8nm de diâmetro, e com espaços de
aproximadamente 2nm entre as membranas das células adjacentes (Revel &
Karnovsky, 1967).
Utilizando técnicas de difração de raios X, a estrutura juncional
conseguiu ser melhor elucidada. As observações demonstraram que o canal
era formado por seis monômeros que formam um poro de diâmetro de 1.5nm,
permitindo que através do alinhamento dos hemicanais na membrana se tenha
a comunicação entre as membranas das células adjacentes, como proposto na
Figura 1 (Makovski et al., 1977) e observado através da micrografia eletrônica
na Figura 2 (Hertzberg & Gilula, 1979).
Os hemicanais alinhados adquirem um formato tubular atingindo um
comprimento total de 100 – 150 Å, estando as membranas das células a uma
distância de aproximadamente 20 Å (Dhein, 1998).
Após os achados morfológicos, a correlação das junções com o
acoplamento elétrico se tornou mais evidente (Gilula et al., 1972). Além de
representar uma via de baixa resistência de propagação de impulsos elétricos
em mamíferos, o canal juncional permite o tráfego de moléculas com peso de
até 1kDa (Flagg et al., 1979), possibilitando o intercâmbio de íons e várias
substâncias
orgânicas
extremamente
importantes,
como
aminoácidos,
nucleotídeos, AMPc e Inositol (Saez & Spray, 1991; Dhein, 1998; Hervé, 2004).
Figura 1- Esquema da organização dos canais juncionais na membrana
plasmática (Makovski et al., 1977 adaptado por Alberts et al., 1994).
Figura 2- Micrografia eletrônica de uma perspectiva tangencial de membranas
plasmáticas justapostas que estão ligadas por junções comunicantes
(Hertzberg & Gilula, 1979).
1.1- CONEXINAS
As junções comunicantes são formadas por uma família multigênica de
proteínas transmembranares denominadas Conexinas. Tais proteínas podem
ser divididas em nove domínios estruturais: 4 domínios transmembrana,
apresentando uma estrutura em α-hélice (TM1, TM2, TM3 e TM4); uma porção
C-terminal; uma porção N-terminal; 2 alças extracelulares (E1 e E2); 1 alça
intracelular ou citoplasmática entre as regiões transmembrana 2 e 3,
caracterizada por representar a região de menor similaridade e menor
conservação entre as conexinas (AC) (Figura 3) (Kumar & Gilula, 1996; Hervé
et al, 2004). Os domínios transmembranares e as alças extracelulares são as
regiões que apresentam maior conservação filogenética entre os integrantes da
família das conexinas, enquanto que o domínio carboxi-terminal e os demais
apresentam pouca conservação filogenética (Bennett et al., 1991; Dhein, 1998).
Por ser a região mais anfipática, supõe-se que o domínio transmembrana 3
constitua a região central do canal juncional, aquele que forma as paredes do
canal.
As pesquisas sobre a multigenicidade da família das conexinas tiveram
início com a comparação de sequências de aminoácidos de diferentes
proteínas (Gros et al., 1983). Um grande impulso aos estudos foi dado com a
clonagem das conexinas, sendo a conexina 32 a primeira delas a ser clonada
(Paul, 1986).
Para diferenciar os componentes da família das conexinas, foi utilizado
como um dos parâmetros os pesos moleculares, em kDa, advindos das
sequências de cDNA, onde o total do número de conexinas está dividido em
dois ramos filogenéticos: Grupo I, formado por conexinas com um peso
molecular menor que 32 kDa; Grupo II, constituído por conexinas com peso
molecular igual ou maior que 32 kDa (Bennett et al. 1995; Dhein, 1998;
Sosinsky and Nicholson, 2005). As conexinas também podem ser classificadas
nos subgrupos α e β de acordo com a similaridade entre determinadas regiões
da sequência protéica primária da conexina (Gimlich et al., 1990; Willecke et al,
2002; Segretain & Falk, 2004).
Meio Extracelular
Meio
Intracelular
Figura 3- Organização topológica da proteína juncional (conexina) na
membrana plasmática (Kumar & Gilula, 1996).
Atualmente fazem parte da família destas proteínas 21 conexinas em
humanos e 20 conexinas em roedores (Tabela 1.1) (Sohl & Willecke, 2003;
Hérve, 2005).
TABELA 1.1 – Família Multigênica das Conexinas (Sohl & Willecke, 2003)
Homem
Conexina
Peso Molecular
hCx25
hCx26
hCx30
hCx30.2
hCx30.3
hCx31
hCx31.1
hCx31.3
hCx31.9
hCx32
hCx36
hCx37
hCx40
hCx40.1
hCx43
hCx45
hCx46
hCx47
hCx50
hCx59
hCx62
(kDa)
25,892
26,200
30,096
30,213
30,419
30,817
31,088
31,347
31,933
32,024
36,248
37,413
40,140
40,438
43,008
45,482
46,655
47,427
48,173
58,842
61,871
Camundongo
Conexina
Peso Molecular
mCx23
mCx26
mCx29
mCx30
mCx30.2
mCx30.3
mCx31
mCx31.1
mCx32
mCx33
mCx36
mCx37
mCx39
mCx40
mCx43
mCx45
mCx46
mCx47
mCx50
mCx57
(kDa)
23,013
26,411
28,981
30,366
30,219
30,388
30,901
31,194
32,003
32,860
36,085
37,696
39,996
40,413
43,003
45,665
46,302
46,603
49,597
57,114
1.2- ESTRUTURA DAS JUNÇÕES COMUNICANTES
As conexinas estão organizadas na membrana plasmática sob forma de
hexâmeros, constituindo o hemicanal juncional, comumente chamado de
conexon. Cada conexon é constituído por seis proteínas, arranjadas em forma
hexagonal,
e
possuindo
uma
organização
topológica
de
membrana
característica e semelhante para todas as conexinas (Makovski et al., 1977;
Dermietzel & Spray, 1993; Kumar & Gilula, 1996; White et al., 1999; Unger et
al., 1999; Segretain & Falk, 2004). Quando interagindo de forma não covalente
com o conexon da célula adjacente, forma-se um canal juncional completo
(Bennett et al., 1991).
Ao se formarem, os conexons podem ser constituídos de conexinas
iguais, por exemplo, todas formadas pela conexina 43 (Cx43), sendo chamados
de hemicanais homoméricos, ou caso sejam formados por conexinas
diferentes são chamados de hemicanais heteroméricos (Wang & Peracchia,
1998). Em relação ao canal juncional completo, podemos
classificá-lo das
seguintes formas: (1) homomérico – homotípico, onde o canal é formado por
dois hemicanais idênticos e formados pela mesma conexina; (2) homomérico
– heterotípico, o canal é formado por dois conexons diferentes, sendo que os
conexons em si são formados pela mesma conexina, por exemplo um conexon
é formado pela conexina 43 e o outro é constituído pela conexina 37; (3)
heteromérico – homotípico, onde o canal é formado por dois conexons
iguais, sendo que estes são formados por conexinas diferentes, estando as
conexinas de um conexon alinhadas com conexinas de mesmo tipo no outro
conexon, por exemplo Cx43 com Cx43, Cx37 com Cx37; (4) heteromérico –
heterotípico ou biheteromérico, onde o canal é formado por dois conexons
diferentes, e estes também são formados por conexinas diferentes, estando as
conexinas de um conexon alinhadas com conexinas diferentes no outro
conexon
(Figura 4) (Kumar & Gilula, 1996); (5) monoheteromérico, onde
apenas um dos conexons é heteromérico (Figura 5) (Sosinsky in Peracchia,
2000).
ou
biheteromérico
Figura 4- Tipos de conexons e canais juncionais formados por associação de
conexinas iguais ou diferentes (Kumar & Gilula, 1996).
Canal Monoheteromérico
Figura 5- Tipo de canal juncional formado pela associação das conexinas em
esquema proposto por Sosinsky in Peracchia, 2000.
1.3- FORMAÇÃO DAS JUNÇÕES COMUNICANTES
As
conexinas
são
sintetizadas
pelos
ribossomos
no
retículo
endoplasmático, sendo co-traduzidas integralmente na membrana do retículo
endoplasmático rugoso (Loewenstein, 1981; Segretain & Falk, 2004). Após esta
etapa a conexina é fosforilada, podendo ser oligomerizada sob forma de
conexons ainda no retículo endoplasmático rugoso e transportada para o
complexo de Golgi (Cx26 e Cx32), ou primeiramente transportada e só depois
oligomerizada no complexo de Golgi (Cx43) (Das Sarma et al, 2001; Segretain
& Falk, 2004).
Após a oligomerização, o conexon (dentro de vesículas exocíticas) é
transportado do complexo de Golgi até a membrana plasmática da célula,
através de microtúbulos (Figura 6) (Musil & Goodenough, 1993; Dhein, 1998,
Gaietta et al., 2002; Segretain & Falk, 2004).
Através de ensaios com a proteína recombinante Cx43, utilizando
técnicas de microscopia confocal e microscopia eletrônica de transmissão
(Imunoeletromicroscopia), Gaietta et al. (2002) observaram que as proteínas
pré-formadas são inseridas nas bordas das placas de junções comunicantes
localizadas na membrana plasmática. Enquanto a placa é repovoada com
conexinas novas, as conexinas antigas centralizam-se, até deixarem a placa
dentro de vesículas endocíticas (Gaietta et al. 2002).
Ao longo deste processo acredita-se que a integridade da conexina e do
estado oligomerizado do conexon sejam mantidos por pontes não covalentes,
sugerindo-se a existência de pontes dissulfeto intramoleculares e não
intermoleculares (John & Revel, 1991). Estudos vêm demonstrando que a
estrutura multimérica do conexon que se encontra na membrana plasmática,
parece já existir nesta conformação desde o retículo endoplasmático rugoso
(Yeager et al., 1998).
= Cx26
Membrana Plasmática
Lisossomo
= Cx32
= Cx43
= Conexon
= Junção Comunicante
Proteossomo
Envelope
Nuclear
1= Sintese da conexina
2= Oligomerização
3= Passagem RE-Golgi
4= Armazenamento Intracelular
5= Tráfego através de microtúbulos
Núcleo
Microtúbulos
6= Inserção na membrana plasmática
7= Difusão lateral na membrana citoplasmática
8= Formação da placa de junções comunicantes
Retículo
Endoplasmático
Cis
Trans
Complexo
de Golgi
9= Estabilização dos microtúbulos
10= Liberação das junções comunicantes da membrana
11= Degradação final
Figura 6- Esquema demonstrando a síntese, montagem e degradação das
junções comunicantes dentro da célula (adaptado de Segretain & Falk, 2004).
RE = Retículo Endoplasmático.
O tempo para início de formação da junção varia de 3 à 30 minutos, com
uma velocidade de formação de 1.3 canais por minuto (Dhein, 1998). O canal
juncional forma-se através da interação das alças extracelulares E1 e E2,
sendo este processo facilitado por proteínas de adesão, como as caderinas,
pois estas mantém as células em contato (Musil & Goodenough, 1993).
Após o tempo de permanência da conexina na membrana plasmática, o
dodecâmero é internalizado e eliminado por vias que envolvem vesículas
endocíticas, que irão se fundir com lisossomos e proteossomos (Yeager et al.,
1998; Gaietta et al. 2002; Segretain & Falk, 2004).
1.4- FUNÇÕES DAS JUNÇÕES COMUNICANTES
Como comentado anteriormente, as junções comunicantes possuem
como característica e função principal permitir que citoplasmas de células
adjacentes,
troquem
metabólitos
e
informações
necessárias
para
a
manutenção dos tecidos e de suas respectivas funções (Flagg-Newton et al.,
1979; Hervé et al, 2004) .
Em alguns tipos celulares, como por exemplo em miócitos cardíacos,
músculo liso ou neurônios, tal forma de comunicação intercelular possui um
papel funcional bem descrito e evidente (Severs et al., 2004). No tecido
cardíaco esta estrutura é de extrema importância, pois representa uma via de
baixa resistência elétrica, facilitando a propagação do impulso elétrico e
permitindo
o
sincronismo
de
contração
cardíaca
essencial
para
o
bombeamento de sangue (Weidmann, 1972). Alterações na quantidade e na
distribuição das junções comunicantes podem estar associadas a patologias
cardíacas graves. Evidências experimentais demonstraram que na fibrilação
atrial crônica, a conexina40 está presente em quantidades maiores e com
distribuição diferente do normal, tanto em ratos quanto em humanos
(Polontchouk et al., 2001).
Dados de Green & Severs (1993) demonstraram alterações na
distribuição da proteína Cx43 em corações de pacientes que desenvolveram o
quadro de doença cardíaca isquêmica após o infarto do miocárdio. Com base
nestes estudos, a conexina43 estava em maior quantidade na borda lateral dos
cardiomiócitos e não nos discos intercalares, como encontrado em corações
normais.
Ao longo do estudo das conexinas, descobertas relacionadas a
mutações destas proteínas vêm sendo de extrema importância para o
entendimento de várias patologias. Mutações na conexina 43 podem levar ao
surgimento de malformações cardíacas que levam a diminuição da sobrevida
do animal, como vem sendo demonstrado em camundongos “Knockout” para
Cx43 (Severs et al., 2004). Em humanos, os portadores de mutações na Cx43
desenvolvem defeitos, como por exemplo o da síndrome de heterotaxia
visceroatrial caracterizada pela lateralidade e transposição de grandes artérias
(Britz-Cunninghan et al., 1995; Casey et al., 1995; Bruzzone et al., 1996-a).
Outra doença, como a de Charcot-Marie-Tooth (CMTX), afeta nervos
periféricos por demielinização e por conseguinte as funções de nervos
sensoriais e motores. Segundo Bergoffen et al (1993), esta doença está
associada à mutações no gene codificante da conexina 32, formadora do canal
juncional que permite a comunicação citoplasmática da célula de Schwann e
nas incisuras de Schmidt-Lanterman (White & Paul, 1999).
No cristalino a expressão adequada das conexinas é essencial, pois por
ser um tecido pouco vascularizado, ele precisa realizar trocas metabólicas com
o humor aquoso mantendo o sincício celular nutrido, funcionante e
principalmente sem opacicidade. Neste tecido estão presentes as conexinas 46
e 50, responsáveis pelas trocas metabólicas e pela comunicação entre as
células, e que ao apresentarem mutações levam ao desenvolvimento da
catarata, respectivamente congênita e senil (Goodenough, 1992; Gong et al.,
1997; White & Paul, 1999; White & Bruzzone, 2000; Evans & Martin, 2002).
1.5- PROPRIEDADES DAS JUNÇÕES COMUNICANTES
Os canais juncionais, como todos os canais iônicos, alternam entre dois
estados: aberto e fechado (Unwin & Zampighi, 1980).
Para um maior entendimento dos fenômenos de abertura e fechamento
do canal, começaram a ser empregadas técnicas de eletrofisiologia, mais
precisamente ensaios de “patch clamp”, fazendo uso da configuração de
“double whole cell”, onde pares de células são analisados (White et al.,1985).
De acordo com o protocolo de realização do experimento, uma das células tem
seu potencial de membrana mantido em um valor fixo que se chama potencial
de “holding” (V1), que por exemplo pode estar em -40mV, enquanto a outra
célula do par tem seu potencial modificado ao longo do experimento, variando
de -90mV a +10mV (V2). Ao variar a voltagem de uma das células do par
mede-se o fluxo de corrente da célula de voltagem modificada para a célula de
voltagem fixa através do amplificador de “patch clamp”, que injeta corrente
suficiente para que não haja variação de voltagem na célula que tem seu
potencial mantido fixo. Esta corrente medida é igual e contrária a que passa
através das junções comunicantes, chamada de corrente juncional ou Ij (Dhein,
1998).
Através do “double whole cell patch clamp” em células pouco acopladas
ou desacopladas transientemente por tratamento farmacológico, pode se
caracterizar a condutância unitária dos canais juncionais, dada por G j = Ij / V, e
que varia em torno de 30 à 300 pS dependendo da conexina que forma o
canal. Gj representa a condutância, Ij representa a intensidade de corrente que
passa pelo canal juncional e Vj a voltagem transjuncional (Veenstra, 2000).
Vários fatores podem influenciar a condutância (Gj) das junções
comunicantes. Um destes fatores seria a dependência de voltagem
transjuncional, onde variações podem ser responsáveis pela abertura ou pelo
fechamento do canal. Em canais homotípicos esta dependência de voltagem é
simétrica, sendo a condutância juncional modificada quando se altera a
voltagem em qualquer uma das 2 células que estão sendo analisadas (Spray et
al., 1991). Já em canais heterotípicos a mudança da condutância juncional
depende de qual das duas células do par analisado terá a voltagem alterada
(Werner et al.,1989).
A dependência de voltagem das junções comunicantes varia de acordo
com a conexina que forma o canal juncional. Por exemplo, as conexinas 40 e
45 são mais sensíveis a variações de voltagem transjuncional do que outras
conexinas como a Cx43 (Jongsma et al., 1993; Dhein, 1998).
Além dos fatores biofísicos, vários fatores bioquímicos podem modular a
condutância juncional, dependendo em que conexina ou tecido estão atuando.
Vias relacionadas a proteína quinase C (PKC), proteína quinase A (PKA),
proteína quinase G (PKG), MAP-quinase e tirosina quinases estão intimamente
ligadas a regulação das junções comunicantes (Dhein,1998).
Em miócitos cardíacos, estudos utilizando um ativador da via da PKC,
denominado TPA (ester de 12-tetradecanoilforbol-13-acetato), demonstraram
que o acoplamento elétrico entre as células aumentou, mas a passagem de
corante para as células adjacentes utilizando a técnica de injeção de corantes
sofreu decréscimo (Spray & Burt, 1990). Tal resultado foi explicado por Kwak et
al. (1995), demonstrando que ao ser ativada a via da PKC, a frequência de
ocorrência das condutâncias de canal unitário de 90 pS era diminuída, mas
aumentava muito a frequência de condutâncias menores, por conseguinte
aumentando o acoplamento elétrico, mas com estreitamento da luz do canal,
diminuindo a passagem de moléculas maiores.
Ainda em cardiomiócitos, foram utilizados o cGMP e seus análogos afim
de estudar qual a influência da via da PKG na Gj. Através de técnicas
eletrofisiológicas foram observadas a diminuição do acoplamento elétrico e
modificações na frequência de distribuição das condutâncias de canais
unitários nas células (Peracchia, 2004).
Com relação a via da PKA, muitos estudos têm observado que a
estimulação desta via pode aumentar o acoplamento de junções
comunicantes formadas por conexina43 em cardiomiócitos (Burt & Spray,
1988). Já em células HeLa transfectadas com a conexina45, ao se utilizar 8bromo-cAMP, ocorreu uma sensível diminuição do acoplamento elétrico e
por corante (van Veen et al., 2000).
Outros
fatores
podem
influenciar
a
condutância
das
junções
comunicantes além destes já citados, como por exemplo alguns íons : Ca2+,
Mg2+e H+. Concentrações elevadas de Ca2+ em cardiomiócitos proporcionam a
diminuição do acoplamento elétrico celular (Loewenstein, 1966), mas se o pH
intracelular for mantido constante tal resposta não é encontrada, acreditandose em uma ação sinérgica entre H+ e o Ca2+ (Noma & Tsuboi, 1987). O
aumento das concentrações intracelulares de Mg2+,em torno de 0,5 mM,
também leva ao desacoplamento celular, sendo que as concentrações para
que isto ocorra são bem maiores do que os níveis fisiologicamente toleráveis
(Noma & Tsuboi, 1987; Peracchia, 2004).
Outro fator importante, descrito na regulação das junções comunicantes, é o
pH, que interfere na condutância juncional (diminuição) através da acidificação
intracelular. Ao realizar técnicas de eletrofisiologia, analisando canais formados
pela conexina43, Delmar et al. (2000) demonstraram que a interação da porção
carboxi-terminal com uma região em separado da conexina é responsável pela
sensibilidade do canal juncional à diminuição do pH celular. Ratificando os
dados anteriores, neste mesmo trabalho, foi utilizada uma proteína Cx43 com a
ausência da região carboxi-terminal, o que resultou na formação de canais
juncionais funcionais em microambientes com baixo pH, demonstrando a
diminuição da sensibilidade da conexina à diminuição do pH.
Associadas à formas ainda desconhecidas de atuação nas junções
comunicantes, algumas drogas podem regular o acoplamento celular,
diminuindo o grau de acoplamento, ou seja a comunicação entre as células.
Estudos in vitro, utilizando por exemplo: octanol, heptanol, ácido aracdônico,
carbenoxolone e ácido 18  glicirretínico entre outras drogas lipofílicas (Dhein,
1998; Xia & Nawy, 2003), demonstraram que o acoplamento via junções
comunicantes era reduzido drasticamente. Ao serem utilizados, o heptanol e o
octanol incorporam-se a bicamada lipídica celular, diminuindo a fluidez dos
domínios ricos em colesterol da membrana plasmática em que a junção
comunicante está inserida e a probabilidade de abertura do canal (Dhein,
1998), reduzindo assim o grau de acoplamento e a comunicação celular.
2- MACRÓFAGOS
O sistema imune tem como uma de suas características marcantes
possuir um sistema de células responsáveis pela fagocitose e pela
apresentação de antígenos que irão dar origem a resposta orgânica a vários
tipos de situações de invasão sistêmica por microorganismos (Jawetz et
al.,1995).
O conjunto de células fagocitárias do sistema imune é originado na
medúla óssea, na qual as “stem cells” ou células tronco se diferenciam em
monoblastos, que dão origem aos monócitos, que já presentes na circulação
sanguínea diferenciam-se em macrófagos (Jawetz et al.,1995; Abbas, 2001).
Estruturalmente os macrófagos estão organizados da seguinte maneira:
(1) o núcleo detém um aspecto ovóide ou em forma de rim, apresentando sua
cromatina condensada; (2) membrana plasmática pregueada, formando
reentrâncias e saliências, conferindo um aspecto superficial irregular; (3)
lisossomas primários que derramam o seu conteúdo dentro de vacúolos que
contém o material englobado pela célula, formando agora o que se chama de
lisossomas secundários ou fagossomas, nos quais se processa a digestão
(Figura 7) (Junqueira & Carneiro, 1998).
Ao longo do seu desenvolvimento o macrófago pode assumir diferentes
morfologias,
dependendo
da
sua
necessidade
de
atuação.
Quando
estimulados, sendo agora denominados macrófagos ativados, os macrófagos
passam a ter uma maior capacidade de secretar diversas substâncias que
participam do processo de defesa, o que faz com que o número de vacúolos,
de lisossomas e de outras estruturas internas aumente, modificando sua
morfologia, ou até mesmo se fusionem com outros macrófagos formando as
denominadas células gigantes multinucleadas (Jawetz et al., 1995; Junqueira &
Carneiro, 1998).
Figura 7- Micrografia eletrônica de um macrófago, apresentando a membrana
pregueda e núcleo ovóide. L= Lisossomas, N= Núcleo, Nu= Nucléolo,  =
Vacúolo fagocítico (Junqueira & Carneiro, 1998).
2.1-
FUNÇÕES & INTERAÇÃO CELULAR
Os macrófagos, ou células acessórias, detém como funções principais:
(1) a capacidade de eliminar microorganismos através de fagocitose; (2)
apresentar ao sistema imune os antígenos que devem ser combatidos, portanto
caracterizadas como células apresentadoras de antígenos (APCs), utilizando o
complexo de histocompatibilidade principal (MHC) e ativar os outros tipos
celulares envolvidos com a resposta imune celular. Os macrófagos no sistema
imune estão envolvidos com as respostas imune inata e adaptativa (Abbas,
2001).
Na resposta imune inata estão presentes os mecanismos de defesa
primários do organismo, ou seja, a primeira linha de defesa, constituída de
mecanismos de eliminação imediata de microorganismos. Neste tipo de
resposta
os
macrófagos
têm
como
principais
funções
fagocitar
os
microorganismos presentes na invasão do organismo e ativar mecanismos de
resposta a estes microorganismos (Abbas, 2001).
A fagocitose tem início com o reconhecimento dos microorganismos
pelos macrófagos ou pela interação com o interferon- (IFN-), produzido por
células “natural killer”, ocorrendo pelo estímulo de receptores presentes na
membrana desta célula, desencadeando reações intracelulares. Dentre os
receptores de membrana presentes nos macrófagos estão: (1) os receptores
com sete domínios transmembrana em -hélice (Aderem & Underhill, 1999);
(2) os receptores de manose; (3) a proteína ligante de LPS (LBP), presente no
plasma e que conduz o LPS (lipolissacarídeo), até o receptor de membrana
CD14 presente no macrófago (Abbas, 2001).
Após esta fase é iniciada a eliminação do microorganismo, com a junção
do fagossoma e dos lisossomas presentes no citoplasma contendo enzimas
proteolíticas que irão digerir as bactérias presentes neste fagolisossoma. Outro
mecanismo de eliminação microbiana está ligado a conversão catalítica do
oxigênio molecular, onde os fagolisossomas contendo microorganismos
englobados associam-se a intermediários reativos do oxigênio (ROIs) e óxido
nítrico, fazendo com que o pH dentro deste local se torne ácido, eliminando o
microorganismo capturado (MacMicking et al., 1997).
Na resposta imune adaptativa estão presentes os mecanismos de
defesa secundários, ou seja, existe uma resposta direcionada e intensa para a
infecção presente no organismo através da atividade celular ou humoral,
devido a existência de um contato prévio do sistema imune com a infecção em
andamento (Abbas, 2001).
Após o reconhecimento dos antígenos pelos linfócitos-T, e a migração
destas células para sítios de inflamação, é produzido pelos linfócitos-T CD4 + o
interferon- (IFN-), que interagindo com os macrófagos faz com que estes
produzam a interleucina-12 (IL-12). Além da ativação pela produção de IFN-,
a ligação da molécula CD-40L, presente na membrana dos linfócitos-T CD4 +,
em moléculas CD-40 na membrana dos macrófagos também aumenta a
produção de IL-12 (Boehm et al., 1997).
Em resposta à ativação dos macrófagos por estes fatores, várias
funções passam a se tornar constantes no sistema imune infectado. Através da
ativação, os macrófagos aumentam sensivelmente sua capacidade de
eliminação de microorganismos através da fagocitose, onde consequentemente
os fagolisossomas associados a enzimas ou a reações com intermediários
reativos do oxigênio (ROIs) e óxido nítrico também estarão aumentados
destruindo os microorganismos com maior avidez (Abbas, 2001).
Paralelamente aos eventos que envolvem a fagocitose, a produção de
citocinas ou coestimuladores do tipo B7, que irão desencadear respostas
celulares imediatas, também se encontra aumentada, e substâncias como o
TNF- e interleucinas-1 e 12, irão estimular a proliferação e diferenciação de
linfócitos-T, amplificando a resposta imune (Schaible et al.,1999).
Em ambos os casos de resposta imune, os macrófagos além de
produzirem citocinas ou fagocitar microorganismos, eliminando-os do sistema,
possuem mais uma função importantíssima no sistema imune: a de ser uma
célula apresentadora de antígenos (APC).
Para que o macrófago possa apresentar ao sistema imune os antígenos
responsáveis pela infecção, este deverá expressar o que se chama de
complexo de histocompatibilidade principal ou MHC caracterizado por
moléculas protéicas que se associam a peptídeos antigênicos advindos da
fagocitose de microorganismos e que serão demonstrados à células de defesa.
As moléculas de MHC estão divididas em 2 classes, as de classe I e as de
classe II, onde as últimas estão presentes nas células apresentadoras de
antígenos, entre elas nos macrófagos (Abbas, 2001).
Inicialmente
macrófagos,
os
sendo
antígenos
expostos
extracelulares
à
enzimas
são
fagocitados
presentes
nas
pelos
vesículas
endo/lisossomais intracelulares, denominadas catepsinas. Ao mesmo tempo,
no retículo endoplasmático as moléculas de MHC II (porções  e , e cadeia
invariante) são sintetizadas, passando ao complexo de Golgi onde serão
empacotadas.
As
vesículas
originadas
no
Golgi
fundem-se
com
os
endo/lisossomas, onde ocorre a degradação proteolítica da cadeia invariante
(proteína que está ligada ao MHC, e que impede que esta se ligue a outros
sítios diferentes dos peptídeos advindos dos microorganismos fagocitados),
liberando um sítio para ligação do peptídeo antigênico. Após o acoplamento do
peptídeo, o MHCII completo é transportado e expresso na membrana
plasmática do macrófago, entrando em contato com o receptor da célula de
defesa (linfócito-T CD4+), apresentando o antígeno (Abbas,2001).
2.2- MACRÓFAGOS: RECEPTOR P2X7 e ATP
Os receptores P2, anteriormente denominados receptores purinérgicos
(Fredholm et al., 1997), são divididos em 2 grandes grupos: receptores P2Y,
associados à proteína G, e receptores P2X, sendo estes canais iônicos
(Burnstock, 1998).
Os receptores P2X são compostos por 2 domínios transmembrana, uma
porção carboxi-terminal e uma porção amino-terminal intracelulares e uma alça
extracelular central com 280 aminoácidos (Chiozzi et al., 1997; Erb et al., 2006;
Abbrancchio et al., 2006). Vale ressaltar que os receptores P2X 7 diferem dos
integrantes da família de receptores P2X, por apresentarem uma porção
carboxi-terminal alongada, que é extremamente importante para a atividade de
formação do poro (Surprenant et al., 1996).
A ativação dos receptores P2X, P2Y e P1, estes últimos associados à
adenosina, está ligada a cascata purinérgica onde: (1) o ATP liberado no
espaço extracelular sofre a ação de enzimas chamadas ecto-nucleotidases,
dando origem a moléculas de ADP, AMP e adenosina; (2) as moléculas de ATP
agem nos receptores P2X, P2Y e a adenosina age nos receptores P1;(3)
depois de ativados, os receptores P1 agem através de um feedback negativo
nas células que liberam ATP, diminuindo sua concentração extracelular; (4)
com a diminuição do ATP, consequentemente ocorrerá a diminuição da
ativação dos receptores P2X e P2Y (Williams & Jarvis, 2000).
Os receptores purinérgicos encontram-se presentes em vários tipos
celulares, de diversos sistemas, a exemplo dos sistemas gastrointestinal,
nervoso,
cardiovascular
e
células
musculares.
Eles
são
encontrados
particularmente em neurônios e células musculares atuando na mediação da
neurotransmissão em sinapses neuro-musculares (Illes & Norenberg, 1993-47;
Burnstock, 1999; Burnstock and Knight, 2004).
Com relação ao sistema imune, linfócitos, mastócitos e macrófagos
expressam o receptor P2X, que age como um poro não seletivo para íons
(Dubyak & El Moatassim, 1993; ). Em especial pode se dar destaque para a
expressão dos receptores P2X7 em macrófagos, que sofrem o fenômeno de
permeabilização da membrana plasmática à moléculas de até 900Da quando
expostos à concentrações maiores que 100M de ATP extracelular (Steinberg
et al.,1987-1, Alves et al., 1996, Persechini et al., 1998). Recentemente,
Pelegrin e Surprenant (2006) demonstraram que os poros relacionados com o
receptor P2X7, envolvidos com o fenômeno de permeabilização, são
constituídos por proteínas denominadas Panexinas.
Além do fenômeno da permeabilização e da indução de correntes
iônicas pelo ATP, efeitos biológicos em macrófagos também são observados
quando estes são expostos ao ATP, onde: (1) através da ação do ATP nos
poros, ocorre o aumento na liberação e maturação da interleucina-1
(Perregaux & Gabel, 1998; Burnstock & Williams, 2000); (2) macrófagos
infectados com micobactérias sofrem citólise, via P2X7, quando são tratados
com ATP-extracelular (Lammas et al., 1997; Coutinho-Silva et al., 2007). Além
disso, IFN- e LPS através da regulação positiva da expressão do P2X7,
estimulam a formação de células gigantes multinucleadas, sensíveis à ação do
ATP extracelular (Humphreys & Dubyak, 1996).
3- MACRÓFAGOS X JUNÇÕES COMUNICANTES
Os estudos acerca da presença de junções comunicantes em
macrófagos tiveram início na década de 70, quando macrófagos advindos de
explantes de timo, rim e fígado foram avaliados experimentalmente por ensaios
de fagocitose e apresentação de antígenos, eletrofisiologia, microscopia
eletrônica de transmissão e de varredura. Na microscopia eletrônica de
transmissão foi observada uma orientação em cadeia linear dos macrófagos,
onde haviam regiões de grande contato entre as células, sendo denominadas
“close junctions”. Com relação aos dados eletrofisiológicos, foi registrado o
acoplamento elétrico entre os macrófagos que estavam orientados de forma
linear (Levy et al., 1976).
No final da década de 70, estudos utilizando microscopia eletrônica de
transmissão em células progenitoras de macrófagos, advindas da medula
óssea de cães, permitiram a análise e a identificação de regiões com a
presença de junções comunicantes (Porvaznisk & MacVittie, 1979). Entretanto,
no início da década de 80, questionamentos acerca da existência de junções
comunicantes em macrófagos começaram a surgir. Estudos utilizando ensaios
de cooperação metabólica em macrófagos peritoneais ativados, tanto in vitro
quanto in vivo, não observaram a transferência de partículas marcadas
radioativamente de uma célula para outra, tanto entre macrófagos como entre
macrófagos e outros tipos celulares (Kane & Bols, 1980). Contudo, mesmo com
tais resultados, não foi descartada a presença de comunicação através de
macrófagos.
Corroborando
estes
resultados,
Dean
et
al.,
em
1988,
demonstraram através de injeções do corante Lucifer yellow a ausência de
acoplamento entre macrófagos peritoneais elicitados de camundongos ou entre
co-culturas de fibroblastos com macrófagos. Neste mesmo trabalho foi
observada a passagem de corante FITC-dextran entre células adjacentes, e
que segundo argumento dos autores se deve a formação de vacúolos
exocíticos e endocíticos nas membranas dos macrófagos.
Em 1991 e em 1993, Beyer & Steinberg demonstraram que macrófagos
elicitados de camundongo e células da linhagem macrofágica J774 possuíam
mensagem e expressão para conexina43, utilizando respectivamente técnicas
de “Northen blot” e “Western blot” (transferência eletroforética de ácidos
nucléicos e de proteínas, respectivamente).
Ainda em 1993 Polacek et al. demonstraram através de ensaios de
“Northern blot” a expressão da conexina43 em células endoteliais, mas não em
macrófagos peritoneais de camundongos e macrófagos humanos periféricos. O
acoplamento entre as células foi avaliado através de injeções de corante,
resultando em não acoplamento entre células endoteliais e macrófagos em cocultura, vindo a ocorrer apenas entre células endoteliais adjacentes. Contudo,
macrófagos espumosos advindos de lesões arterioescleróticas humanas
apresentavam mRNA para conexina43 em experimentos de hibridização in situ
(Polacek et al.,1993).
Em 1996, Alves et al. estudaram a presença e a funcionalidade deste
tipo de comunicação celular em macrófagos peritoneais de camundongos e
células de linhagem macrofágica J774-A1. De acordo com os dados obtidos
tanto os macrófagos quanto as células J774-A1 expressavam conexina43,
porém ao serem realizados experimentos de injeção de corantes não foi
observada a passagem de corante para as células adjacentes. Com o uso de
técnicas de eletrofisiologia também não foi detectada a passagem de corrente
entre as células. Este trabalho concluiu que a proteína do complexo juncional
estava presente, mas caso estivesse formando um canal, este não seria
funcional.
Entretanto, em 1998 dados divergentes surgiram quando Martin et al.
demonstraram que linhagens macrofágicas P388D1 e J774-A1, quando cocultivadas com células epiteliais intestinais, se apresentavam acopladas entre
si ou com as próprias células epiteliais, sugerindo que alguns fatores desta cocultura poderiam determinar a formação de junções comunicantes funcionais.
Em concordância com os dados acima mencionados, Saéz et al. (2000),
utilizando a linhagem macrofágica J774-A1 observaram o acoplamento celular
através de injeção de corantes. No entanto, este efeito só foi observado após
um tratamento prévio com um meio de cultura condicionado, sugerindo que
este meio, obtido da cultura de células endoteliais da microcirculação de
cérebro de rato, deveria conter fatores que modulariam a comunicação
juncional em macrófagos.
No ano seguinte, Eugenín et al (2001), através das técnicas de western
blot, imunofluorescência e injeção intracelular de corantes, demonstraram que
culturas de microglia advinda de cérebros de ratos apresentavam junções
comunicantes funcionais, apenas quando estas culturas eram incubadas com
interferon- + TNF- (Fator de Necrose Tumoral - ) e interferon- +
lipopolissacarídeo (LPS).
Recentemente, Fortes (2002) demonstrou através de ensaios de RTPCR, western blot, imunofluorescência e injeção de corantes, que células da
linhagem macrofágica J774-G8 e macrófagos peritoneais advindos de
camundongos suíços expressam junções comunicantes funcionais formadas
pela proteína conexina43, sem a necessidade de qualquer tratamento com
citocinas.
No
entanto,
Eugenín
et
al.
(2003)
observaram
que
monócitos/macrófagos oriundos do sangue de humano, apresentam junções
comunicantes funcionais após 24 horas de incubações com interferon- +
TNF- e interferon- + lipopolissacarídeo (LPS), igualmente aos dados
encontrados por este mesmo grupo em experimentos semelhantes com
microglia, em 2001.
Entretanto, podemos inferir que estes dados conflitantes demonstrados
até o presente momento podem estar relacionados ao fato dos macrófagos
utilizados nos experimentos de diferentes grupos de pesquisa terem sido
obtidos de fontes diferentes (peritôneo, sangue, cérebro).
4- JUNÇÕES COMUNICANTES X PORO INDUZIDO POR ATP:
Uma possível correlação em Macrófagos?
O ATP extracelular induz alterações fisiológicas em diversos tecidos,
levando a despolarização e ao aumento da permeabilidade da membrana
plasmática em diferentes tipos celulares incluindo mastócitos, hepatócitos,
células mono e polinucleares e linhagens celulares transformadas (Dahlquist &
Diamant, 1974; Gomperts, 1985; Charest et al., 1985; Becker & Henson, 1974;
Weisman et al., 1984; Dubyak & De Young, 1985).
Os mecanismos moleculares pelos quais o ATP extracelular causa esta
alteração na permeabilidade estão associados a receptores para purinas P2
(Fredholm et al., 1997), ligados à canais iônicos (Burnstock, 1998), como
observado anteriormente.
No final da década de 80, Steinberg et al. (1987-a) realizaram ensaios
de permeabilização em macrófagos de camundongos e células de linhagem
macrofágica J774. Quando as células foram expostas a concentrações maiores
que 100M de ATP4-, se observou que a membrana plasmática das mesmas
se tornava permeável a moléculas de até 900 Daltons. No entanto, algumas
células não eram responsivas ao tratamento com ATP o que permitiu o
estabelecimento de uma linhagem J774 variante, ATP-resistente (Steinberg et
al. 1987-a).
No início dos anos 90, com objetivo de elucidar que estrutura poderia vir
a ser este poro induzido por ATP e quais seriam suas funções, alguns grupos
começaram a traçar correlações entre estes poros e as conexinas, que além de
formar as junções comunicantes podem formar hemicanais na membrana
plasmática (Jiang & Gu, 2005).
Em 1991, Beyer & Steinberg, que haviam demonstrado a expressão de
mRNA e a presença da proteína Cx43 tanto na linhagem celular macrofágica
selvagem (J774), quanto em macrófagos de camundongos, não detectaram
Cx43 na linhagem macrofágica variante (ATPR clone B2) caracterizada pela
resistência a exposição prolongada ao ATP. Baseados nestes dados, e nas
semelhanças de propriedades seletivas de ambos os canais (ambos permitem
a passsagem de moléculas de 900Da), esses autores concluíram que a Cx43
seria a proteína que forma os poros na membrana plasmática em resposta ao
ATP extracelular, e que além disso, poderia funcionar como um receptor
suicida em macrófagos e células J774, fato este também demonstrado por três
grupos independentes que mostraram evidências de que o ATP pode agir
como mediador da morte celular programada (Zanovello et al., 1990; Filippini et
al., 1990; Zheing et al., 1991).
Com o objetivo de aprofundar estes resultados, em 1993, este mesmo
grupo demonstrou a ausência de Cx43 por “Northen blot” nos clones B2, D5 e
G6 da linhagem ATPR sob as mesmas condições, e a presença de RNA para
Cx43 na linhagem J774 selvagem. Por “Western blot”, utilizando ensaios com
fosfatase alcalina, foi sugerido que os macrófagos apresentavam uma forma
não fosforilada da Cx43 e por isto não funcional (Musil et al., 1990).
Entretanto
camundongos
Alves
et
“knockout”
al.
para
(1996),
ao
conexina43
utilizarem
em
macrófagos
experimentos
de
de
permeabilização, observaram que o corante do meio extracelular entrava nas
células quando estas eram expostas ao ATP, afastando a hipótese de que o
hemicanal formado pela Cx43 seria um poro sensível ao ATP.
No ano seguinte, tendo como meta principal investigar a função do
receptor P2X7, Chiozzi et al.(1997) produziram linhagens de células
macrofágicas J774 que expressavam altos ou baixos níveis deste receptor.
Através de experimentos de permeabilização, utilizando concentrações de 3
mM de ATP, e de “Western blot” o grupo demonstrou que vários clones para os
tipos celulares desejados foram obtidos com sucesso. Interessantemente as
células que apresentavam altos níveis do receptor realizavam contatos
espontâneos de membrana plasmática, fusionando-se e em seguida formando
células
gigantes
multinucleadas
(MGCs),
enquanto
as
células
que
apresentavam baixos níveis do receptor P2X7 não se fusionavam e
estabeleciam poucos contatos de membrana. Ao utilizar a técnica de
microscopia eletrônica de transmissão foram observados sítios com interações
celulares entre as células com altos níveis de receptor P2X7, levando-os a
concluir que estes receptores poderiam estar envolvidos com a comunicação
intercelular, estabelecendo estruturas com formatos similares ao de junções
comunicantes (Chiozzi et al.1997; Lemaire et al., 2006).
Recentemente, alguns estudos vem demonstrando que a propagação de
ondas de cálcio intercelular envolve interações entre as conexinas e os
receptores P2 em vários tipos celulares. Particularmente em astrócitos,
Scemes et al (2000) observaram que a modulação da comunicação juncional
através do uso de citocinas ou modificações genéticas, altera a expressão de
receptores do tipo P2. Outros trabalhos, utilizando células epiteliais de vias
aéreas e células de Hensen também tem demonstrado a correlação entre estas
duas estruturas (Homolya et al., 2000; Lagostena et al., 2001)
Corroborando estes achados, Fortes (2002) observaram que células da
linhagem macrofágica J774-G8 sem a expressão do receptor P2X7 (células
denominadas J774 ATP-resistentes), não apresentavam junções comunicantes
funcionais, devido a retenção citoplasmática da proteína Cx43, ausente na
membrana plasmática destas células.
II- OBJETIVOS
OBJETIVOS
Em função: (1) dos dados controversos na literatura a respeito da
presença e da funcionalidade de junções comunicantes em macrófagos e
células de linhagem macrofágica; (2) de uma possível correlação entre as
conexinas e os receptores P2X7; e (3) da importância deste tipo celular na
resposta imune, resolvemos investigar estas questões traçando como
objetivos:
1) Aprofundar os estudos acerca da presença de junções comunicantes
em macrófagos peritoneais e células de linhagem macrofágica J774-G8
(células controle e células ATP-resistentes).
2) Avaliar uma possível interação entre as junções comunicantes e os
receptores P2.
3) Compreender as diferenças no acoplamento juncional entre as células
de linhagem macrofágica J774-A1 e J774-G8.
III- MATERIAIS & MÉTODOS
1- CULTURA DE CÉLULAS
1.1- CÉLULAS DA LINHAGEM J774
A linhagem de células macrofágicas J774-G8 controle (Unkeless et al,
1979),
derivada
da
linhagem
americana
original
J774-A1
obtida
de
camundongo (American Type Culture Collection - ATCC, Rockville, MD), foi
cedida pelo Laboratório de Imunobiofísica (IBCCF – UFRJ). As células
macrofágicas J774-A1 foram cedidas pelo Dr David C. Spray (Albert Einstein
College of Medicine, Yeshiva University, NY, USA). As células foram
plaqueadas, com uma densidade inicial de 1x106 células/ml, em garrafas de
plástico de 25 cm2 (CORNING / USA), em lamínulas de vidro número 1
(Fisherbrand / Fisher Scientific) ou em placas de cultura de plástico de 35mm
de diâmetro.
As culturas foram crescidas em meio DMEM, suplementado com 10% de
Soro Fetal Bovino (V/V) (GIBCO), penicilina 1000UI/ml e estreptomicina
100UI/ml e bicarbonato de sódio (2 g/L) (MERCK). As células foram mantidas à
370C em atmosfera úmida à 5% de CO2.
1.2- CÉLULAS DA LINHAGEM J774-G8 ATP RESISTENTES:
A linhagem variante ATP-resistente de células J774 foi cedida pelo
laboratório de Imunobiofísica (IBCCF-UFRJ). Para obtenção das células ATPresistentes foram utilizadas as células J774-G8 confluentes seguindo-se o
seguinte protocolo: (1) as culturas de células J774-G8 foram expostas à ATP
extracelular (SIGMA) (1mM) por 10 minutos, e em seguida lavadas e colocadas
em um meio de cultura recém preparado (a lavagem e a troca de meio de
cultura ocorreram em todos os experimentos seguintes); (2) 72 horas após, as
células sobreviventes foram incubadas com 2mM de ATP por 10 minutos; (3)
após 72 horas, as células sobreviventes foram incubadas com 4mM de ATP
por 10 minutos; (4) após 72 horas, repetia-se a dose de 4mM de ATP agora
durante 20 minutos; (5) passadas 72 horas foi repetida a dose de 4mM de ATP
durante 30 minutos; (6) mais 72 horas eram aguardadas, e eram repetidas as
incubações com 4mM sendo que agora dobrando o tempo de exposição (1hora
de incubação). Depois destes passos as etapas 3, 4, 5 e 6 foram repetidas
utilizando concentrações de 5mM e 10mM de ATP extracelular. A cultura foi
mantida em 10mM de ATP.
Os intervalos de 72 horas foram escolhidos para repetição das doses de
ATP, pois são o limite de tempo para que esta célula comece a reverter o
fenômeno de resistência, se mostrando susceptível a ação do ATP extracelular
através do método de fluorescência com brometo de etídeo (SIGMA)
(Permeabilização). O período necessário para obtenção das células com este
fenótipo foi de 6 meses. Após este período foi obtida a linhagem macrofágica
variante ATP-resistente, que não é permeabilizada e não morre em exposições
à concentrações elevadas de ATP extracelular.
A manutenção e o plaqueamento das células foi idêntico ao das células
J774-G8 controle, sendo que o meio de cultura das células resistentes possuia
10mM de ATP.
1.3- MACRÓFAGOS PERITONEAIS
As culturas foram preparadas a partir de macrófagos peritoneais de
camundongos C57/Bl6 com aproximadamente 4 semanas de idade e tratados
com injeções intraperitoneais de tioglicolato (28,8g/L) 72 horas antes do
experimento.
Após 72 horas, os camundongos foram anestesiados (éter), sacrificados
por deslocamento cervical, e de seus peritôneos retirados os macrófagos em
meio RPMI (SIGMA), sendo centrifugados à 450 g por 10 minutos. As células
eram contadas em câmara de Neubauer (Hausser Scientific, Honshem, Pa.
19044), e plaqueadas com uma densidade inicial de 1x106 células/ml, em
garrafas plástico de 25 cm2 (CORNING / USA), em lamínulas de vidro número
1 (Fisherbrand Fisher Scientific), ou em placas de cultura de plástico de 35mm
de diâmetro. Passados 30 minutos de plaqueamento, as culturas eram lavadas
e era colocado o meio de cultura RPMI suplementado com 10% de soro fetal
bovino.
Além dos animais selvagens, utilizamos animais “knockout” para o
receptor purinérgico P2X7, e que foram cedidos pelo Laboratório de
Imunobiofísica (IBCCF – UFRJ), que obtiveram estes animais dos laboratórios
Pfizer (PFIZER / USA). Os métodos de obtenção e cultivo dos macrófagos
peritoneais
provenientes
do
animal
“knockout”
foram
idênticos
aos
procedimentos utilizados acima com o animal normal (selvagem).
2- REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)
O mRNA total das células J774-G8, controle e ATP-resistentes, e dos
macrófagos peritoneais, na concentração de 106 células/ml, foi extraído
utilizando TRIZOL (GIBCO), seguindo o protocolo do fabricante. 5µg de RNA
total foram utilizados para a síntese do cDNA. Aos 5µg de RNA total foi
adicionado 1µl de Oligo dT primer e a mistura foi aquecida à 65°C por 10
minutos. Posteriormente, foram adicionados 1µl de dNTPs, 1µl de DTT, 1µl de
água, 4µl de tampão e 1µl de Super Script e a mistura mantida à 37°C por uma
hora. Após completar uma hora, foram adicionados 80µl de água fria.
O PCR foi realizado colocando-se 2,5µl do cDNA , 2,5µl de tampão
(MgCl2 15 mM), 2,5µl de primer (2µM), 16,5µl de água, 0,5µl de dNTPs, 1µl de
Taq Polimerase (0,5 U/µl). A amplificação foi feita através de 40 ciclos, onde
cada ciclo foi constituído das seguintes etapas: a mistura foi aquecida à 94°C
por 30 segundos, 58°C por 60 segundos e 72°C por 90 segundos durante cada
ciclo, sendo que o ciclo final foi de 7 min à 72°C.
Nas reações de PCR foram utilizados “primers” específicos para
conexina
43
(sense:
5’-ATCCAGTGGTACATCTATGG-3’;
antisense:
5’-CTGCTGGCTCTGCTGGAAGG-3’), e para o controle positivo GAPDH
(sense,
5’-CTTGTCATCAATGGGAAG-3’;
antisense,
5’-GTCATGGATGACCTTGGCCG-3’). Os controles negativos, utilizando as
amostras e água nas reações, não apresentaram amplificação.
Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de
agarose (2%), revelados com brometo de etídeo e observados em um
transiluminador (PHARMACIA).
3- MICROARRANJO DE DNA (MICROARRAY)
Amostras de RNA extraídas de células da linhagem macrofágica J774A1 e J774-G8 foram comparadas e analisadas por hibridização com lâminas
contendo 26.000 pontos (poços), detentores cada um de sequências de cDNA
de camundongo. As lâminas ou “chips”, como também são chamadas, foram
produzidas pelo Centro de “Microarrays” do Albert Einstein College of Medicine
(para mais informações técnicas: http://129.98.70.229).
O RNA das células foi extraído como descrito acima. Foram utilizados 4
grupos de cada tipo celular, sendo as células J774-A1 nomeadas em: A1, A2,
A3 e A4; e as células J774-G8 nomeadas em: C1, C2, C3 e C4, para que se
assegurasse a relevância estatística. Para cada grupo de células J774-A1 ou
J774-G8, 60µg de RNA foram transcritos reversamente em cDNA, utilizando
dUTPs fluorescentes (Cy3-dUTP (vermelho; r “red”) or Cy5-dUTP(verde; g
“green”) ). Foram hibridizadas 4 lâminas de “microarray” utilizando a seguinte
combinação:
A1(r)C1(g),
A2(r)C2(g),
A3(r)C3(g),
A4(r)C4(g)
(desenho
experimental no formato “referência simples”).
Os cDNAs marcados foram hibridizados por 12 horas à 50°C. Após a
hibridização, as lâminas foram lavadas à temperatura ambiente com soluções
contendo 0,1% de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) e 1% de SSC (3M de Cloreto
de Sódio + 0,3M de Citrato de Sódio), para remover os cDNAs que não foram
hibridizados. Após esta etapa, as lâminas foram escaneadas utilizando as
mesmas voltagens em aceleração em dois canais distintos: 760V (r) e 670V
(g).
As images foram adquiridas e analisadas inicialmente pelo programa
GenePix Pro 4.1. Os resultados foram normalizados com o desenvolvimento de
algorítimos. Sinais advindos de imperfeições nos poços com os cDNAs, de
saturação de luz ou de ruídos, foram eliminados da análise sendo utilizados
poços que apresentavam sinais perfeitos apenas nos dois canais de vermelho
ou verde para que pudesse ser mantido um nível uniforme de significância.
A normalização entre as lâminas foi determinada pela razão entre a
intensidade de fluorescência corrigida de cada poço válido e a média entre da
intensidade de fluorescência de todos os poços válidos das células J774-A1
(A1, A2, A3 e A4) e das células J774-G8 (C1, C2, C3 e C4).
A expressão da razão de um gene de uma célula J774-G8 comparado
com um gene presente na célula J774-A1 foi computada através da média
geométrica da razão da fluorescência normalizada detectada por cada canal de
todos os poços marcados com o mesmo gene.
O valor de P das razões de intensidade de fluorescência nas
comparações entre amostras das células J774-G8 e das células J774-A1 foi
obtido através do test-t Student, utilizando as médias das duas distribuições. A
instrigência máxima para análise considerada estatisticamente significante foi
de P < 0.05.
Figura 8 - Micrografia de um lote de poços (pontos) de uma das lâminas, ou “chips”, utilizada no
experimento de microarray (microarranjo) utilizando as células J774-G8 Controle e as células
J774-A1. Os pontos coloridos indicam os poços com genes que hibridizaram com os cDNAs
das células.
4-
DETERMINAÇÃO
DA
CONCENTRAÇÃO
DE
PROTEÍNA
A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford
(1976), que detecta concentrações da ordem de g/ml de proteína. Cinco
mililitros de reagente de Bradford, composto por Comassie Brilliant Blue G-250
10% (P/V), etanol 5%, ácido fosfórico 10% e água, foram adicionados a
amostra a ser dosada. As alíquotas foram homogeinizadas e comparadas a
uma curva padrão obtida com albumina bovina sérica (1mg/ml). As leituras da
densidade ótica foram realizadas em comprimento de onda () de 595nm em
espectrofotômetro (INCIBRÁS UV –1201, São Paulo).
5- IMUNOELETROTRANSFERÊNCIA
As células estudadas pela técnica de transferência imunoeletroforética
ou “Western Blot” foram lavadas e raspadas em uma solução de bicarbonato
de sódio, pH: 8.3, contendo PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride) (SIGMA),
na concentração de 1 mM, e armazenadas em um coquetel de inibidores de
proteases (Inibidores de protease: PMSF – 50 mM em etanol; Leupeptina - 5
mg/ml; EDTA - 200 mM; Aprotinina – 10 mg/ml; E-64 – 1 mM; Pepstatina – 1
mg/ml; Antipaina – 10 mM; 0-fenantrolina – 200 mM). . Após a raspagem as
células foram centrifugadas a 10000 g durante 10 minutos em uma centrífuga
EPPENDORF (modelo 5415C, Netheler, Hinz Gmbh). Os sobrenadantes foram
descartados e o material precipitado foi ressuspenso na mesma solução, sendo
em seguida sonicado por 5 minutos (Branson Sonifier 450, BRANSON
ULTRASONICS CORPORATION) e congelado à -20oC.
A separação das proteínas presentes em macrófagos e células J774
(controle e ATP-resistentes) foi feita através da técnica de eletroforese em gel
desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). Os géis foram
preparados em duplicatas, em placas de 1.5mm de espessura. O gel de
empacotamento (stacking gel) foi feito numa concentração à 4% e o gel de
corrida (running gel) foi feito numa concentração à 10% em todos os tipos
celulares estudados. As amostras foram solubilizadas em tampão de amostra
(Tris-Cl, 125 mM; SDS, 4%; glicerol, 20%; β-mercaptoetanol, 10%; azul de
bromofenol, 0,4%; pH 6,8) e mantida à temperatura ambiente por cerca de 60
minutos antes de sua aplicação no gel. A corrida eletroforética foi realizada à
voltagem constante de 100 mV por 2 horas. Após a corrida um dos géis foi
corado com Coomassie Blue R 0.3% (P/V), por 30 minutos, e descorado com
metanol 40% (V/V). A duplicata do gel foi utilizada na transferência para a
detecção da proteína de interesse por “imunoblot”.
Após a corrida eletroforética o gel foi colocado em contato com um papel
de nitrocelulose em solução tampão (Tris-OH, 25mM; glicina, 192mM; metanol,
20%; pH 8,3) e a transferência realizada sob uma corrente constante de 300
mA por 2 horas (sistema BIO-RAD). Após a transferência o gel foi corado para
se avaliar o grau de transferência e a nitrocelulose foi incubada em tampão
TBS (Tris Buffer Saline) contendo leite em pó desnatado MolicoR à 5%, e
Tween 20 à 0.5% por 1 hora, seguindo-se de lavagens com TBS contendo
Tween 20 à 0.5% (TBS-T) por 3 vezes durante 10 minutos por vez. Em seguida
a nitrocelulose foi incubada por 2 horas com anticorpo policlonal produzido em
coelho imunizado com peptídeo sintético correspondente a sequência de
aminoácidos 346-360 da região carboxi-terminal da conexina43, cedido pelo Dr
Elliot Hertzberg (Albert Einstein College of Medicine, New York, USA), diluído
na proporção de 1:1000 em TBS contendo leite em pó desnatado Molico R à
3%. Após a incubação a nitrocelulose foi lavada com TBS-T como descrito
anteriormente, sendo logo depois a nitrocelulose incubada com anticorpo
secundário ligado à fosfatase alcalina (SIGMA), por 1 hora. Após nova lavagem
com TBS-T, a nitrocelulose foi incubada com uma solução de revelação
(solução alcalina, BCI-P e NBT) até que ocorresse a revelação, em torno de 20
minutos.
Um papel de nitrocelulose contendo amostras idênticas as utilizadas no
experimento anterior foi incubado em tampão TBS (Tris Buffer Saline) contendo
leite em pó desnatado MolicoR à 5%, e Tween 20 à 0.5% por 1 hora, seguindose de lavagens com TBS contendo Tween 20 à 0.5% (TBS-T) por 3 vezes
durante 10 minutos cada. Em seguida, a nitrocelulose foi incubada por 2 horas
com anticorpo policlonal produzido em coelho contra a proteína P2X7 em
diluição 1:300 (ALOMONE LABS, Jerusalém, Israel). Após esta etapa, o
procedimento seguiu a metodologia descrita anteriormente.
6- CO-IMUNOPRECIPITAÇÃO
Os macrófagos peritoneais, as células da linhagem macrofágica J774G8 e as células da linhagem macrofágica J774-A1 foram cultivadas como
descrito anteriormente. Após o cultivo as células foram tripsinizadas, coletadas
e centrífugadas à 1500 g por 5 minutos. Após está etapa, as células foram
lavadas por 3 vezes com PBS, e lisadas com um coquetel contendo
substâncias que provocam a lise celular (tampão de lise: NaCl – 150 mM;
EDTA - 5 mM; NaF – 50 mM; Nonidet P40 – 1%; Tris-HCl – 50 mM; SDS –
0,1%) e a inibição de proteases celulares (Inibidores de protease: PMSF – 50
mM em etanol; Leupeptina - 5 mg/ml; EDTA - 200 mM; Aprotinina – 10 mg/ml;
E-64 – 1 mM; Pepstatina – 1 mg/ml; Antipaina – 10 mM; 0-fenantrolina – 200
mM). As amostras foram armazenadas a -20oC para evitar a degradação. Após
este passo, o extrato protéico foi dosado pelo método de Bradford, já descrito
anteriormente.
Paralelamente, 50µl da resina constituída de proteína G com agarose
(SIGMA), utilizada na co-imunoprecipitação, foi pré-incubada com 5µg do
anticorpo monoclonal anti-conexina 43 (CHEMICON INTERNATIONAL, USA)
diluído em TBS-T durante à noite a -4 oC, sob agitação constante. Antes da
incubação a proteína G foi lavada com TBS-T por 3 vezes.
Após a incubação, o conteúdo dos tubos com proteína G e anticorpos foi
centrifugado a 10.000 g por 10 segundos e o sobrenadante foi desprezado. O
pellet contendo a resina e o anticorpo foi acrescido de 1 ml de tampão (TBS-T)
e lavado por mais 3 vezes, em centrifugações com velocidade e tempo iguais
aos anteriores. Após a última lavagem, incubamos 100µg da amostra contendo
macrófagos peritoneais, células J774-G8 e células J774-A1 com a solução
contendo a proteína G e o anticorpo monoclonal anti-Cx43 (Chemicon
International, USA), por 4 horas a -4 oC agitando periodicamente.
Após a incubação, a solução contendo a amostra celular, a proteína G e
o anticorpo foi lavada por 3 vezes com TBS-T, utilizando centrifugações
de10.000 g por 10 segundos. Após a última lavagem, o “pellet” contendo
restante da última lavagem foi solubilizado em tampão de amostra 1x
concentrado, e fervido por 5 minutos. Após a fervura, o conteúdo do tubo foi
mais uma vez centrifugado a 10.000 g por 10 segundos, e o sobrenadante
contendo apenas a proteína G foi desprezado, com o “pellet” sendo
ressuspendido mais uma vez em tampão de amostra 1x concentrado.
Após esta etapa, foi feita a transferência imunoeletroforética como
descrito no tópico anterior, em que a nitrocelulose contendo as proteínas foi
incubada por 2 horas com anticorpo policlonal produzido em coelho contra a
proteína P2X7 em diluição 1:300 (ALOMONE LABS, Jerusalém, Israel). Após a
incubação a nitrocelulose foi lavada com TBS-T como descrito anteriormente,
sendo logo depois a nitrocelulose incubada com anticorpo secundário ligado à
fosfatase alcalina (SIGMA), por 1 hora. Após nova lavagem com TBS-T, a
nitrocelulose foi incubada com uma solução de revelação (solução alcalina,
BCI-P e NBT) até que ocorresse a revelação, em torno de 20 minutos.
7- IMUNOFLUORESCÊNCIA
As células foram fixadas com etanol à 70%, durante 20 minutos à -20oC.
Após esta etapa, as células foram lavadas com PBS-TRITON X-100R em uma
concentração de 0,3%, 3 vezes durante 30 minutos, e logo em seguida
incubadas com albumina sérica bovina (BSA-Bovine Serum Albumin, SIGMA)
isenta de imunoglobulinas, diluída em PBS à 2% por 30 minutos. Após o
bloqueio as células foram incubadas com o anticorpo policlonal anti-Cx43
descrito na seção de transferência imunoeletroforética, em uma diluição de
1:1000. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS, 3 vezes por 30
minutos, e incubadas com anticorpo secundário conjugado com isotiocianato
de fluoresceína na diluição de 1:400 (SIGMA). Após a lavagem com PBS, como
descrito anteriormente, as lâminulas foram montadas sobre lâminas que
continham uma solução à 1% de PPD (p-Phenylene Diamine, SIGMA), em
glicerol à 90% e PBS à 10%, para que não ocorresse o decaimento da
fluorescência.
Nos macrófagos peritoneais também foram utilizados anticorpos
primários MAC-1 contra integrinas presentes nas membranas de macrófagos,
buscando avaliar o enriquecimento das culturas primárias de macrófagos
peritoneais, sendo as etapas de execução do experimento idênticas as
anteriores, onde foi desnecessária a incubação com o anticorpo secundário,
pois o anticorpo primário está conjugado com isotiocianato de fluoresceína.
As marcações nas lâminas foram observadas em um microscópio de
epifluorescência AXIOVERT 100 Carl ZEISS (Photo microscope), excitadas
com iluminação por lâmpada de mercúrio de alta pressão, HBO 50W, ( =
490nm) sendo a emissão monitorada utilizando um conjunto de filtros de
emissão para fluorescência de fluoresceína ( = 525nm). A especificidade da
imunoreatividade foi avaliada na ausência do anticorpo primário.
Em um outro conjunto de experimentos, os macrófagos peritoneais, as
células J774-G8, células J774-A1 e os macrófagos peritoneais dos animais
knockout para o P2X7 foram duplamente marcadas com o anticorpo monoclonal
anti-Cx43 em uma diluição de 1:200 (Chemicon International, USA), e com o
anticorpo policlonal anti-P2X7 em diluição 1:300 (ALOMONE LABS, Jerusalém,
Israel). Um anticorpo secundário anti-camundongo conjugado com isotiocianato
de fluoresceína em diluição de 1:400 (SIGMA) e um anticorpo secundário anticoelho conjugado com Cy3 diluído 1:800 (JACKSON LAB, West Grove, PA)
formam utilizados para marcar respectivamente os anticorpos para Cx43 e
P2X7. O núcleo das células foram marcados com TOPRO3 (1:1000;
MOLECULAR PROBES, USA). Os experimentos foram submetidos à
observação, e análise simples ou de secções no plano Z (reconstrução
tridimensional) utilizando o microscópio confocal LSM 510 Meta (Carl ZEISS,
Oberkochen, Germany).
A especificidade das imunomarcações foram avaliadas utilizando o
mesmo protocolo acima, substituindo os anticorpos primários nas incubações
por soluções de PBS com albumina sérica bovina à 0,1%. Nenhuma marcação
foi observada nestas condições.
8- INJEÇÃO DE CORANTE
A permeabilidade das junções comunicantes para moléculas de baixo
peso molecular (até 1 KDa) foi avaliada quantitativa e qualitativamente através
de microinjeção intracelular nas culturas de células com o corante Lucifer
Yellow CH (PM: 457.2 Da, SIGMA) por meio de pulsos de corrente
hiperpolarizante aplicados a microeletródios com resitência em torno de 5 MΩ,
contendo solução à 5% (P/V) de Lucifer Yellow CH em 150 mM de LiCl (Cloreto
de Lítio), e com o corante Rodamina Dextran (PM: 40 KDa, SIGMA), na
concentração de 2,5% (P/V) em150 mM de LiCl (Cloreto de Lítio). Os dois
corantes estavam presentes no mesmo microeletródio. Os campos injetados
foram fotografados com uma máquina fotográfica digital Magnafire, em
exposição automática para campo claro, e exposição de 20 segundos para os
campos com fluorescência, 1 minuto e 30 segundos após a injeção intracelular
de corante. Os experimentos eram feitos em placas de Petri de 35mm, sendo
estas utilizadas por um tempo máximo de 60 minutos.
As células foram observadas em um microscópio de epifluorescência
AXIOVERT 100 Carl ZEISS (Photo microscope), excitadas com iluminação por
lâmpada de mercúrio de alta pressão, HBO 50W, (λ = 490nm) sendo a emissão
monitorada utilizando um conjunto de filtros de emissão para fluorescência de
fluoresceína (λ = 525nm) e de rodamina (λ = 580nm).
IV- RESULTADOS
1- INJEÇÃO DE CORANTES
Afim de aprofundar os estudos sobre o acoplamento intercelular através
de junções comunicantes em células macrofágicas, realizamos inicialmente
experimentos de injeções de corante em culturas primárias de macrófagos
obtidos de lavados peritoneais de camundongos elicitados com tioglicolato.
Este ensaio permite testar a funcionalidade das junções comunicantes através
de injeções intracelulares de moléculas fluorescentes de baixo peso molecular.
Especificamente em nosso estudo injetamos o corante “Lucifer Yellow” (peso
molecular: 457.2 Da) tanto em culturas de macrófagos peritoneais controle,
quanto em culturas tratadas com octanol (concentração de 1mM/l), um
bloqueador inespecífico de junções comunicantes.
A figura 9 ilustra injeções de corante realizadas em macrófagos
peritoneais controle e tratados com octanol. Os macrófagos controle, de acordo
com a figura 9 A e B encontram-se acoplados (3 células acopladas à célula
injetada), enquanto que as células tratadas com o bloqueador juncional
apresentam uma diminuição drástica dos níveis de acoplamento como
representado na figura 9 C e D (4 células desacopladas em um mesmo
campo).
A figura 9 E demonstra a análise quantitativa das injeções de corante
através de histogramas de graus de acoplamento. Como podemos observar
nestes gráficos, 70% dos macrófagos peritoneais estavam acoplados a um
número de células vizinhas que variou de 1 à 7 macrófagos acoplados ao
macrófago injetado.
Visando confirmar o resultado de acoplamento nos macrófagos
peritoneais através de junções comunicantes, a mesma cultura utilizada nos
experimentos representados na figura 1 foi injetada com uma solução que
continha tanto o corante Lucifer Yellow quanto o corante Rodamina Dextran.
Este último não permea pelas junções comunicantes devido seu elevado peso
molecular (40.000 Da). Nossos resultados da figura 10 A e B mostram que a
Rodamina em vermelho ficou restrita ao citoplasma da célula injetada
confirmando que o espalhamento de corante nos macrófagos peritoneais
ocorreu via junções comunicantes.
Para investigar mais detalhadamente os estudos sobre o acoplamento
juncional
em
macrófagos,
analisamos
tais
eventos
em
2
linhagens
macrofágicas estabelecidas. Em consonância com a literatura (Alves et al,
1996), nas células da linhagem macrofágica J774-A1 observamos o corante
confinado às células injetadas, como demonstrado na figura 11 A e B. Em 11
C a análise quantitativa mostra que a maioria absoluta das células estavam
desacopladas, enquanto que apenas 5% das células estavam acopladas à 1
célula vizinha. Apesar de ser uma linhagem macrofágica, tais células não
possuem o comportamento de acoplamento observado nos macrófagos
peritoneais.
Entretanto, ao realizar estes experimentos funcionais em células da
linhagem macrofágica J774-G8 (uma linhagem derivada das células J774-A1),
observamos um alto grau de acoplamento celular como demonstrado pela
figura 12 A e B (3 células acopladas à célula injetada). Os gráficos da figura
12 E reafirmaram as micrografias, onde 84% das células J774-G8 controle
estavam acopladas às células vizinhas.
Apesar de comportamentos de acoplamento juncional distintos, tanto os
macrófagos peritoneais quanto as linhagens celulares
J774-A1 e J774-G8
apresentam o fenômeno de permeabilização celular por ATP extracelular
(Steinberg et al, 1987). Com base nestas características funcionais, avaliamos
se a ausência da capacidade de permeabilização poderia influenciar o
acoplamento
juncional
através
de
junções
comunicantes.
Para
tanto
selecionamos uma linhagem ATP-resistente a partir das células J774-G8, após
a exposição prolongada desta linhagem G8 ao ATP extracelular. As células que
resistiam a exposição elevada ao ATP (concentrações finais de 10mM de ATP)
eram cultivadas e a comunicação juncional também era avaliada através da
injeção intracelular do corante Lucifer Yellow.
Os resultados funcionais nos demonstraram uma queda abrupta da
comunicação celular através de junções comunicantes (figura 12 C e D) (6
células desacopladas em um mesmo campo). O histograma representado na
figura 12 E demonstra este resultado, em que apenas 9% das células estavam
acopladas à 1 única célula adjacente. Estes resultados demonstram que se por
um lado as células que permeabilizam após a exposição ao ATP tem
comunicação juncional funcional, por outro lado as células que sobreviveram à
este tratamento não exibem comunicação juncional funcional sugerindo uma
possível interação entre as proteínas envolvidas na formação do canal
juncional (conexinas) e receptores que respondem ao ATP extracelular
(receptores purinégicos).
Portanto, diante destes resultados que sugeriram uma possível interação
entre as conexinas e os receptores purinérgicos, aplicamos as mesmas
técnicas de injeção intracelular de corantes em culturas primárias de
macrófagos peritoneais obtidas de camundongos “knockout” para o receptor
purinérgico P2X7. Vale ressaltar, que as células destes animais não sofreram o
fenômeno de permeabilização ao serem expostas ao ATP extracelular.
Reafirmando nossos achados e a hipótese da interação proteica entre
conexinas e receptores purinégicos, observamos que o corante fluorescente
injetado no macrófago peritoneal “knockout” permaneceu confinado no interior
desta célula, não permeando para as células adjacentes como demonstrado
anteriormente em macrófagos peritoneais de animais controle (figura 13 A e
B). Quando comparamos numericamente estes dois grupos experimentais,
observamos uma diferença abrupta no total de células injetadas que estavam
funcionalmente acopladas às células adjacentes, o que é claramente
demonstrado na figura 13 C, em que praticamente 100% das células estão
desacopladas.
As diferenças no grau de acoplamento entre os macrófagos peritoneais,
células J774-A1, células J774-G8 controle, células J774-G8 ATP-resistentes e
macrófagos peritoneais provenientes de camundongos “knockout” para o
receptor P2X7 foram avaliadas utilizando o teste qui-quadrado (χ2). O
acoplamento dos grupos de células J774-A1 e J774-G8 ATP-resistentes
estavam significantemente reduzidos em relação aos grupos de macrófagos
peritoneais e de células J774-G8 controle (p<0,01 pelo teste χ2).
Para testar se o ATP poderia provocar alguma alteração funcional no
acoplamento a curto prazo (15 minutos), as células J774-G8 controle foram
incubadas com concentrações crescentes de ATP extracelular (10µM, 100µM e
500µM). As células não sofreram permeabilização neste tempo o que não
afetou o acoplamento juncional. O gráfico da figura 14 demonstrou que não
houve alteração significativa no grau de acoplamento em relação as células
controle, onde em torno de 94% das células estão acopladas a um número que
varia entre 1 e 7 células adjacentes.
2- PCR (Polimerase Chain Reaction)
Para verificar se as células acopladas expressavam a proteína conexina,
realizamos RT-PCRs utilizando primers para a conexina43. Além disso,
analisamos a expressão desta mesma conexina na linhagem que não
apresentava acoplamento juncional (células J774-G8 ATP resistentes).
Observamos que tanto nos macrófagos peritoneais e nas células J774G8 controle, quanto nas células ATP-resistentes (figura 15 A), havia expressão
para Cx43.
Além disso, podemos constatar que o nível de mensagem era
semelhante em todos os tipos celulares analisados neste experimento, ao
observar o histograma representando a densitometria realizada através da
análise das bandas de mensagem em todas as células (figura 15 B).
Estes resultados demonstram que existe mensagem para Cx43
independentemente da presença (macrófagos peritoneais e células J774-G8
controle) ou ausência (células J774-G8 ATP resistentes) de acoplamento
juncional.
3-
TRANSFERÊNCIA
IMUNOELETROFORÉTICA
“WESTERN BLOT”
Para verificar se a mensagem observada era traduzida em proteína
analisamos a expressão da conexina43 nos tipos celulares estudados, visto
que estes apresentavam diferenças funcionais, a despeito de expressarem
mensagem para Cx43. Para tanto, foram feitos “imunoblottings de extratos
celulares de macrófagos peritoneais, células J774-G8 controle e ATPresistentes. Em cada pista do gel de SDS-PAGE à 10% colocamos
quantidades iguais (100µg) de proteína total dos extratos das células
estudadas.
Observamos que todos os tipos celulares estudados expressam a Cx43,
como destacado na figura 16 A. Sendo assim, avaliamos a presença do
receptor purinérgico P2X7 em macrófagos peritoneais e células J774-G8
controle e ATP-resistentes, já que este receptor é responsável pelo fenômeno
de permeabilização por ATP e poderia estar envolvido na modulação do canal
juncional. A figura 16 B monstra que as células que sofrem permeabilização
(macrófagos peritoneais e em células J774-G8 controle) expressam a proteína
P2X7, enquanto que as células que não são permeabilizadas pelo ATP
extracelular (células ATP-resistentes) não expressam esta proteína. Todos os
resultados obtidos nos levaram a formular a hipótese de que a ausência do
receptor P2X7 poderia estar modulando negativamente a comunicação
juncional.
4- IMUNOFLUORESCÊNCIA
Inicialmente, visando demonstrar o grau de pureza das culturas
primárias de macrófagos peritoneais utilizadas nos experimentos de “RT-PCR”,
“Western blot”, injeção de corante e imunofluorescência, foram feitos ensaios
de imunofluorescência utilizando marcadores específicos para uma integrina
de macrófagos, o MAC-1 (CD11bCD18). Os resultados da figura 17, indicam
que as culturas utilizadas para realizar os experimentos apresentavam uma
grande quantidade de macrófagos, em torno de 95%, e uma reduzida
quantidade de outros tipos celulares, garantindo controles confiáveis
principalmente para os ensaios de injeções de corante, em que uma única
célula é injetada por vez.
Para melhor entender por que apesar de expressar a proteína Cx43 as
células ATP-resistentes não estavam acopladas, fomos investigar a distribuição
desta proteína nas células J774-G8, controle e ATP-resistentes, através de
experimentos de imunofluorescência.
Como ilustrado na figura 18, a localização da Cx43 nas células J774-G8
controle (B) encontra-se essencialmente na membrana citoplasmática,
diferentemente
das
células
J774-G8
ATP-resistentes,
na
qual
a
imunoreatividade está presente majoritariamente no citoplasma da célula (D).
Estes resultados são compatíveis com a sensível diferença de grau de
acoplamento entre as células controle e as células ATP-resistentes, atestada
nos experimentos de injeção de corantes.
A constatação de que a linhagem resistente ao ATP não possui o
receptor P2X7 e apresenta uma redistribuição da Cx43 para compartimentos
intracelulares quando comparada com a linhagem J774-G8 controle nos levou
a investigar uma possível interação entre estas duas proteínas.
Para tanto, foram analisadas lâminas com dupla marcação utilizando a
técnica de microscopia confocal. Na figura 19 podemos observar que as duas
proteínas encontram-se na região da membrana plasmática das células J774G8 controle (A e B). Na figura 19 C podemos observar os núcleos das células
analisadas em A e B marcados pelo corante nuclear TOPRO-3. Ao reconstruir
tridimensionalmente o mesmo campo observado anteriormente na figura 11,
notamos que as duas proteínas ocupam o mesmo volume confocal
apresentando a fluorescência amarela, resultado do somatório colorimétrico
das cores verde da Cx43 e vermelha do receptor purinérgico (figura 20 A , B e
C).
Para verificar se este resultado estava relacionado apenas à linhagem
celular J774-G8, foi realizado o mesmo experimento com macrófagos
peritoneais. As figuras 21 e 22 ilustram o mesmo resultado encontrado na
linhagem celular anteriormente descrita não só na análise em separado dos
campos fotografados, em que as proteínas estão localizadas na membrana
celular, como também na reconstrução tridimensional, em que estão colocalizadas. Na figura 21 C podemos observar os núcleos das células
analisadas na figura 21 A e B marcados pelo corante nuclear TOPRO-3.
Visando elucidar os resultados de injeção de corantes encontrados nas
células J774-A1 descritos inicialmente, e que muito se assemelhavam com os
resultados de acoplamento celular em células J774-G8 ATP-resistentes,
submetemos as células J774-A1 à marcação com os anticorpos anti-Cx43 e
anti- P2X7, e posterior análise através da microscopia confocal.
De acordo com os resultados, as células J774-A1 apresentavam a
marcação para o receptor P2X7 na membrana plasmática (figura 22 B),
entretanto a marcação para Cx43 estava internalizada, retida na região
perinuclear (figura 22 A). A figura 22 C ilustra os núcleos das células das
figuras 22 A e B marcados pelo corante TOPRO-3. Na figura 23 (A, B e C), ao
observarmos a reconstrução tridimensional da figura anterior, notamos não só
a retenção da Cx43 no citossol, como também a ausência de co-localização
das proteínas estudadas.
Até o presente momento, as nossas evidências nas células J774-G8
ATP-resistentes
nos
indicavam
uma
possível
regulação
negativa
no
acoplamento juncional, quando o receptor P2X7 estava ausente da membrana.
Por outro lado, os resultados obtidos com as células na linhagem de células
J774-A1 não sustentavam esta hipótese já que o receptor P2X 7 estava na
membrana plasmática, enquanto a Cx43 estava internalizada desta célula. No
entanto, a linhagem celular estabelecida pode por vezes não refletir o
comportamento funcional da cultura de células primária. Portanto, este
entendimento nos levou a investigar a distribuição da Cx43 nos macrófagos
peritoneais provenientes de camundongos “knockout” para o receptor P2X7,
ainda utilizando a técnica de microscopia confocal.
Com base nos resultados obtidos, observamos que a proteína Cx43
estava internalizada nos macrófagos peritoneais de camundongos “knockout”
para o receptor P2X7 (figura 24 A), o que justifica os resultados funcionais
encontrados anteriormente, que indicavam uma sensível diminuição do
acoplamento juncional entre estas células. Além disso, reafirmamos a hipótese
de interação proteica entre as duas proteínas em questão, tendo em vista que
estas células não expressam o receptor P2X7, como podemos observar na
figura 24 B. A figura 24 C representa os núcleos das células representadas
nas figuras 24 A e B marcados com o corante nuclear TOPRO-3. Na figura 25
(A, B e C), ao observarmos a reconstrução tridimensional da figura anterior,
notamos não só a retenção da Cx43 no citossol, como também a ausência do
receptor P2X7 da membrana plasmática celular e do citossol celular.
5- IMUNOPRECIPITAÇÃO
Para consolidar os resultados obtidos nos experimentos de microscopia
confocal, em que as duas proteínas Cx43 e P2X7 estavam co-localizadas em
células J774-G8 controle e macrófagos peritoneais, foram desenvolvidos
experimentos de co-imunoprecipitação para avaliar se além de estarem em um
mesmo volume confocal, tais proteínas poderiam estar interagindo de forma
direta molecularmente.
A figura 26 (A e B) demonstrou a interação das duas moléculas
diretamente não só em células J774-G8 controle, como também em
macrófagos peritoneais, uma vez que a banda em 67kDa demonstra uma
imunoreatividade do complexo que possui uma porção da membrana com um
fragmento da Cx43 com o anticorpo anti-P2X7. Mais uma vez confirmando os
experimentos de microscopia confocal, o complexo lisado de células J774-A1
com a Cx43 não foi reconhecido pelo anticorpo anti-P2X 7, indicando que nesta
linhagem a Cx43 e o P2X7 se encontram em compartimentos celulares distintos
(figura 26 C).
6- MICROARRANJO DE DNA (MICROARRAY)
Até este ponto demonstramos que: (1) os macrófagos peritoneais
selvagens estão acoplados funcionalmente através de junções comunicantes, e
possuem a Cx43 e o receptor P2X7 interagindo na membrana plasmática, como
também observado em células J774-G8 controle; (2) as células J774-G8 ATPresistentes possuem a Cx43 internalizada sem a presença do receptor P2X 7,
diferentemente das células J774-A1 que apresentam o mesmo comportamento
para a proteína formadora das junções comunicantes, sendo que com a
expressão do receptor P2X7 na membrana celular; e (3) os macrófagos
peritoneais provenientes de camundongos “knockout” para o receptor P2X7 não
estão acoplados e a proteína Cx43 está no citossol celular.
Portanto, demonstradas todas estas diferenças entre as células J774-G8
e as células J774-A1 em ensaios funcionais, bioquímicos e de microscopia
descritos acima, observamos que podíamos elucidar como as duas proteínas
(Cx43 e P2X7) poderiam estar interagindo, haja visto que tinhamos 2 linhagens
macrofágicas que expressavam as 2 proteínas de interesse, porém
acoplamento funcional distinto.
Para tanto, realizamos os experimentos de microarranjo de DNA
(Microarray) nas duas linhagens celulares descritas anteriormente, visando
descrever possíveis diferenças moleculares que pudessem esclarecer as
diferenças funcionais e de interação demonstradas.
Após a transcrição reversa dos RNAs das células J774-G8 e J774-A1
em cDNA, utilizando dNTPs fluorescentes, foi feita a hibridização do cDNA com
os lâminas contendo os genes analisados. Dos 26.000 genes presentes na
lâmina, foram hibridizados 9521 genes, dos quais 1193 genes (13%) estavam
alterados nas células J774-A1 (figura 27 A) em comparação com as células
J774-G8. Deste percentual de genes alterados, separamos os genes
inicialmente em duas classes: genes regulados negativamente e genes
regulados positivamente. Do total de genes alterados, 669 genes estavam
regulados positivamente (56,3%), enquanto que 522 genes estavam regulados
negativamente (43,7%) (figura 27 B).
Em uma outra fase de análises, categorizamos os genes que estavam
alterados de acordo com as proteínas codificadas, levando em consideração
suas respectivas funções celulares (Iacobas et al, 2003). A figura 28 ilustra
esta
categorização
gênica,
em
que
no
grupo
de
genes
regulados
negativamente (figura 28 A) e regulados positivamente (figura 28 B),
chamamos a atenção para os grupos de genes envolvidos direta e
indiretamente com a comunicação celular. São estes grupos: (1) JAE: junções
celulares, adesão celular e proteínas de matriz extracelular; (2) CY: proteínas
de citoesqueleto; e (3) CS: sinalização celular.
No grupo de genes regulados negativamente, 30% dos genes alterados
estavam envolvidos com as vias de comunicação celular (JAE: 9%, CS: 9%,
CY: 12%) (figura 29 A), enquanto que os genes regulados positivamente
associados com estas
vias somavam 25% (JAE: 6%, CS: 9%, CY: 10%)
(figura 29 B).
Analisando estes grupos funcionais, destacamos alguns genes que
expressam proteínas e se associam com vias que poderíam explicar não só as
diferenças funcionais entre as células de linhagem J774 diferentes, como
também a correlação proposta entre a Cx43 e o receptor P2X 7. As proteínas
alteradas nos grupos de genes regulados negativamente e positivamente, e
que podem influenciar as proteínas estudadas de forma direta (interação
física), ou de forma indireta, regulando vias moleculares e bioquímicas
associadas com as funções destas proteínas sofrerão destaque na discussão
deste trabalho.
FIGURA 9
Micrografias de constraste de fase à esquerda (A & C) e fluorescência à
direita (B & D) de cultura primária de macrófagos peritoneais de camundongos
injetadas com o corante “Lucifer Yellow”. Em (B) 3 células apresentam-se
acopladas a célula injetada. O painel (D) ilustra o desacoplamento na mesma
cultura tratada com octanol. Os histogramas em (E) ilustram o grau de
acoplamento dos macrófagos. O grau de acoplamento foi quantificado em cinco
classes: (0) nenhuma célula acoplada a célula injetada; (1) 1 célula acoplada à
célula injetada com o corante; (2---3) de 2 à 3 células acopladas à célula
injetada; (4---7) 4 à 7 células acopladas à célula injetada; (>7) mais de 7
células acopladas à célula injetada. Um total de 120 células foram injetadas. Do
total, 70% das células injetadas estavam acopladas em um intervalo de 1---7
células adjacentes. * /  denotam as células injetadas. Barra de Calibração: 50
µm.
A
B
C
D
Macrófago
Células injetadas
40
30
20
10
0
0
1
2---3
4---7
Grau de Acoplamento
>7
FIGURA 10
Micrografias de constraste de fase em (A) e fluorescência em (B) de
Macrófagos Peritoneais injetados com os corantes “Lucifer Yellow” (verde) e
Rodamina Dextran (vermelho). Podemos observar 1 célula acoplada a célula
injetada, estando a Rodamina Dextran confinada a célula injetada. O inserto à
direita representa a célula injetada apenas com Rodamina Dextran. * / 
denotam as células injetadas. Barra de Calibração: 20µm.
A
B
FIGURA 11
Micrografias de constraste de fase à esquerda (A) e fluorescência à
direita (B) de uma cultura da linhagem celular macrofágica J774-A1 injetadas
com o corante “Lucifer Yellow”. Podemos observar que as células J774-A1
apresentam-se desacopladas. Em C podemos observar o histograma ilustrando
o grau de acoplamento das células J774-A1. As culturas foram injetadas com o
corante fluorescente “Lucifer yellow”. O grau de acoplamento foi quantificado
em cinco classes: (0) nenhuma célula acoplada a célula injetada; (1) 1 célula
acoplada à célula injetada com o corante; (2---3) de 2 à 3 células acopladas à
célula injetada; (4---7) 4 à 7 células acopladas à célula injetada; (>7) mais de 7
células acopladas à célula injetada. Um total de 90 células J774-A1 foi injetado,
entretanto apenas 7% das células estavam acopladas à apenas 1 célula. Vale
ressaltar que o acoplamento desta linhagem celular estava significantemente
reduzido em relação as células J774-G8 Controle (p<0,01 by X2). * / 
denotam a célula injetada. Barra de Calibração: 50µm. Total de experimentos:
4
C-
Células J774.A1
Células injetadas
100
80
60
40
20
0
0
1
2---3
4---7
Grau de Acoplamento
>7
FIGURA 12
Micrografias de constraste de fase à esquerda (A & C) e fluorescência à
direita (B & D) de Cultura da Linhagem Celular Macrofágica J774-G8 injetadas
com o corante “Lucifer Yellow”. Nas células J774-G8 Controle (B), podemos
observar que 3 células apresentam-se acopladas a célula injetada, enquanto
que as células J774-G8 ATP-resistentes (D) apresentam-se desacopladas. Os
histogramas em (E) ilustram o grau de acoplamento entre as células J774-G8
controle (ATPS) e ATP-resistente (ATPR). O grau de acoplamento foi
quantificado em cinco classes: (0) nenhuma célula acoplada a célula injetada;
(1) 1 célula acoplada à célula injetada com o corante; (2---3) de 2 à 3 células
acopladas à célula injetada; (4---7) 4 à 7 células acopladas à célula injetada;
(>7) mais de 7 células acopladas à célula injetada. Um total de 260 células
J774-G8 foi injetado (130 Controle e 130 ATP-resistentes). Das células
Controle, 84% das células injetadas estavam acopladas em um intervalo de 1--7 células, enquanto que das células ATP-resistentes apenas 9% das células
estavam acopladas à apenas 1 célula. O acoplamento deste último grupo
estava significantemente reduzido em relação ao grupo Controle (p<0,01 by
X2). * /  denotam as células injetadas. Barra de Calibração: 50µm.
A
B
C
D
E-
Células J774-G8 controle X J774-G8 ATP-resistente
140
Células injetadas
120
J774-G8 controle
100
J774-G8 ATP-resistente
80
60
40
20
0
0
1
2---3
4---7
Grau de Acoplamento
>7
FIGURA 13
Micrografias de constraste de fase à esquerda (A) e fluorescência à
direita
(B)
de
uma
cultura
macrófagos
peritoneais
provenientes
de
camundongos “knockout” para o receptor purinérgico P2X7 injetadas com o
corante
“Lucifer
Yellow”.
Podemos
observar
que
os
macrófagos
de
camundongos “knockout” apresentam-se desacoplados, quando comparados
com macrófagos peritoneais de animais normais. Em C podemos observar o
histograma ilustrando o grau de acoplamento dos macrófagos. As culturas
foram injetadas com o corante fluorescente “Lucifer yellow”. O grau de
acoplamento foi quantificado em cinco classes: (0) nenhuma célula acoplada a
célula injetada; (1) 1 célula acoplada à célula injetada com o corante; (2---3) de
2 à 3 células acopladas à célula injetada; (4---7) 4 à 7 células acopladas à
célula injetada; (>7) mais de 7 células acopladas à célula injetada. Um total de
120 macrófagos peritoneais “knockout” foi injetado, entretanto menos de 1%
das células estavam acopladas à apenas 1 célula. Vale ressaltar que o
acoplamento destas células estava significantemente reduzido em relação aos
macrófagos peritoneais normais (p<0,01 by X2). * /  denotam a célula
injetada. Barra de Calibração: 50µm. Total de experimentos: 4
A
B
*
Macrófago KO P2X7
80
Células Injetadas
Macrófago
60
Macrófago P2X7 Knockout
40
20
0
0
1
2---3
4---7
>7
Grau de Acoplamento
FIGURA 14
Histogramas ilustrando o grau de acoplamento entre as Culturas de
Linhagem Celular Macrofágica J774-G8 Controle quando tratadas com
diferentes concentrações de ATP. As culturas foram injetadas com o corante
fluorescente “Lucifer yellow”. O grau de acoplamento foi quantificado em cinco
classes: (0) nenhuma célula acoplada a célula injetada; (1) 1 célula acoplada à
célula injetada com o corante; (2---3) de 2 à 3 células acopladas à célula
injetada; (4---7) 4 à 7 células acopladas à célula injetada; (>7) mais de 7
células acopladas à célula injetada. Um total de 270 células J774-G8 foram
injetadas (90 células em 10µM de ATP, 90 células em 100µM de ATP e 90
células em 500µM de ATP). Em torno de 94% das células injetadas nos 3
grupos estavam acopladas em um intervalo de 1---7 células.
Células J774-G8 + ATP extracelular
50
10µΜ
Células injetadas
40
100µΜ
500µΜ
30
20
10
0
0
1
2---3
4---7
Grau de Acoplamento
>7
FIGURA 15
Análise do RNA de macrófagos peritoneais, células J774-G8 controle e
células J774-G8 ATP-resistentes através da técnica de RT-PCR (Polimerase
Chain Reaction). As figuras demonstram os produtos de PCR, em gel de
agarose à 2%. Os três tipos celulares expressaram a Cx43, além de
apresentarem níveis de expressão semelhantes como podemos observar nos
histogramas que representam os ensaios densitométricos (B). Total de
experimentos: 3
re
s
co
nt
fa
go
J7
74
-G
8
J7
74
-G
8
M
ac
ró
Valores densitométricos arbitrários
A
B
1,5
1
0,5
0
FIGURA 16
Em A e B, “Western blot” de culturas de linhagem celular macrofágica
J774-G8 Controle, ATP-resistente e cultura primária de macrófagos peritoneais,
utilizando os anticorpos policlonais específicos para os aminoácidos 346 - 360
da Conexina43 e para o Receptor P2X7, respectivamente. Quantidades iguais
de proteína foram carregadas no gel SDS-PAGE à 10%. Em A, o anticorpo
anti-Cx43 detectou a presença da proteína Cx43 nas células J774-G8 controle,
nas J774-G8 ATP-resistentes, nos macrófagos e no cérebro (controle positivo
para Cx43), estando ausente a marcação no fígado (controle negativo). A
marcação em 68 kDa é resultado do reconhecimento da albumina pelo
anticorpo, uma vez que o peptídeo imunogênico é conjugado à albumina antes
da inoculação no coelho. Em B, o anticorpo anti-P2X7 detectou a presença da
proteína P2X7 nas células J774-G8 controle e nos macrófagos, enquanto que
nas células J774-G8 ATP-resistentes e nas K562 a marcação estava
ausente.Total de experimentos: 5
B
J7
74
-G
8
J7
AT
74
P-G
re
8
si
Co
st
M
en
ac
nt
te
ró
ro
fa
le
go
K5
62
A
69 KDa 
FIGURA 17
Imunofluorescência mostrando a marcação para MAC-1 em macrófagos
peritoneais, onde em A está o contraste de fase e em B a fluorescência. As
micrografias evidenciam o enriquecimento da cultura primária utilizada nos
experimentos em macrófagos peritoneais. Barra de calibração: 50µm. Total de
experimentos: 10
A
B
FIGURA 18
Imunofluorescência mostrando a marcação para conexina43 em células
J774-G8 controle (micrografias superiores) e ATP-resistentes (micrografias
inferiores), onde à esquerda está o constraste de fase (A & C) e à direita a
fluorescência (B & D). A marcação específica para Cx43 na membrana das
células controle (B) está visivelmente diminuída na membrana das células ATPresistentes (D). Barra de calibração: 20µm. Total de experimentos: 10
B
A
20µ m
C
D
FIGURA 19
Imunofluorescência observada em microscopia confocal, demonstrando
a marcação para proteína conexina43 e para o receptor purinérgico P2X7 em
células J774-G8 controle. A marcação específica para Cx43 e para o P2X7 está
na membrana das células (A e B). Em C podemos observar o núcleo das
células marcadas com o corante nuclear TOPRO3. Barra de calibração: 20µm.
Total de experimentos: 10
FIGURA 20
Reconstrução tridimensional de 28 fatias óticas, de 0,8m de espessura
cada, da imagem demonstrada na figura 11. A linha verde indica uma secção
ortogonal da micrografia A, que está projetada lateralmente em B; a linha
vermelha indica uma secção ortogonal da micrografia A, que está projetada
lateralmente em C. A linha azul indica o nível da 15ª fatia ótica (B e C). A
microscopia confocal demonstrou a co-localização das proteínas Cx43 e P2X7
(amarelo) na membrana das células J774-G8 controle (setas em A, B e C).
Barra de calibração: 20m. Total de experimentos: 10
FIGURA 21
Imunofluorescência observada em microscopia confocal, demonstrando
a marcação para proteína conexina43 e para o receptor purinérgico P2X7 em
macrófagos obtidos de lavado peritoneal de camundongos suíços. A marcação
específica para Cx43 e para o P2X7 está na membrana das células (A e B). Em
C podemos observar o núcleo das células marcadas com o corante nuclear
TOPRO3. Barra de calibração: 20µm. Total de experimentos: 10
FIGURA 22
Reconstrução tridimensional de 49 fatias óticas, de 0,8µm de espessura
cada, da imagem demonstrada na figura 13. A linha verde indica uma secção
ortogonal da micrografia A, que está projetada lateralmente em B; a linha
vermelha indica uma secção ortogonal da micrografia A, que está projetada
lateralmente em C. A linha azul indica o nível da 25ª fatia ótica (B e C). A
microscopia confocal demonstrou a co-localização das proteínas Cx43 e P2X7
(amarelo) na membrana dos macrófagos peritoneais
Barra de calibração: 20µm. Total de experimentos: 10
(setas em A, B e C).
FIGURA 23
Imunofluorescência observada em microscopia confocal, demonstrando
a marcação para proteína conexina43 e para o receptor purinérgico P2X7 em
Células J774-A1. A marcação específica para o P2X7 está na membrana das
células (B), entretanto a marcação para Cx43 está presente no citossol (A). Em
C podemos observar o núcleo das células marcadas com o corante nuclear
TOPRO3. Barra de calibração: 20µm. Total de experimentos: 4
FIGURA 24
Reconstrução tridimensional de 28 fatias óticas, de 0,8µm de espessura
cada, da imagem demonstrada na figura 15. A linha verde indica uma secção
ortogonal da micrografia A, que está projetada lateralmente em B; a linha
vermelha indica uma secção ortogonal da micrografia A, que está projetada
lateralmente em C. A linha azul indica o nível da 15ª fatia ótica (B e C). A
microscopia confocal demonstrou as proteínas Cx43 e P2X7 não co-localizam
na membrana plasmática das células J774-A1 (setas em A, B e C) como ocorre
com as células J774-G8 controle ou com os macrófagos peritoneais. Barra de
calibração: 20µm. Total de experimentos: 4.
FIGURA 25
Imunofluorescência observada em microscopia confocal, demonstrando
a marcação para proteína conexina43 e para o receptor purinérgico P2X7 em
macrófagos peritoneais oriundos de camundongos “knockout” para o receptor
P2X7. Podemos observar em A e B, respectivamente, que a marcação para
Cx43 está presente no citossol da célula, enquanto que a marcação para o
receptor P2X7 está ausente não só da membrana plasmática como também do
citossol celular. Em C podemos observar o núcleo das células marcadas com o
corante nuclear TOPRO3. Barra de calibração: 20µm. Total de experimentos: 4
A
B
20µ m
C
FIGURA 26
Reconstrução tridimensional de 30 fatias óticas, de 0,8µm de espessura
cada, da imagem demonstrada na figura 17. A linha verde indica uma secção
ortogonal da micrografia A, que está projetada lateralmente em B; a linha
vermelha indica uma secção ortogonal da micrografia A, que está projetada
lateralmente em C. A linha azul indica o nível da 25ª fatia ótica (B e C). A
microscopia confocal demonstrou que a proteína Cx43 esta presente no
citossol celular (setas em A, B e C), e não co-localiza com o receptor P2X7, que
está ausente da membrana plasmática e do citossol celular destes macrófagos,
diferentemente do que ocorre com as células J774-G8 controle ou com os
macrófagos peritoneais de animais normais. Barra de calibração: 20µm. Total
de experimentos: 3.
B
C
A
FIGURA 27
Co-imunoprecipitações das proteínas Cx43 e P2X7 em macrófagos
peritoneais, células J774-G8 controle e células J774-A1, respectivamente
demonstradas em A, B e C. A linha 1 dos experimentos utilizando os
macrófagos e as células J774-G8 apresenta uma banda com peso molecular
de 69 kDa correspondente ao receptor P2X7, obtida após a imunoprecipitação
dos lisados de membrana dos macrófagos e das células J774-G8 controle com
o anticorpo anti-Cx43. Entretanto, a banda encontrada nos experimentos
anteriores está ausente nos lisados obtidos de células J774-A1. Na linha 2
observamos o controle positivo do experimento, contendo apenas o lisado de
membrana de macrófagos, células J774-G8 e células J774-A1, e que
apresenta uma banda que foi revelada com o anticorpo anti- P2X7. Total de
experimentos: 4
CIP:
Cx43
Controle
69 kDa
P2X7
1
2
FIGURA 28
Histogramas ilustrando a análise estatistica dos genes que foram
avaliados no experimento de microarranjo de DNA das célula J774-G8 e J774A1. Em A podemos observar que 13% dos genes (1193 genes) estavam
alterados nas células J774-A1. Do total de genes alterados, em torno de 56%
dos genes tiveram sua expressão regulada positivamente, enquanto que 44%
dos genes tinham sua regulação negativa (B).
A
Genes Não Alterados
8328 – 87%
B
1193 – 13%
Genes regulados
positivamente
Total Genes
Down-Up Genes
669 - 56,3%
Genes regulados
negativamente
522 - 43,7%
Down-regulated
Up-regulated
FIGURA 29
Histogramas ilustrando a categorização dos genes significativamente
alterados nas células J774-A1 quando comparadas com as células J774-G8.
Dividimos os genes em 10 categorias associadas às funções das proteínas
produzidas pelos genes codificados: (1) JAE: Junções celulares, adesão celular
e proteínas de matriz extracelular; (2) CY: proteínas de citoesqueleto; (3) T1:
proteínas associadas ao transporte do meio extracelular para o intracelular; (4)
T2: proteínas associadas ao transporte intracelular; (5) CS: sinalização celular;
(6) CSD: proteínas associadas ao ciclo de diferenciação celular; (7) TR:
transcrição; (8) EnMet: energia e metabolismo; (9) OG: genes de organelas ou
genes mitocondriais; e (10) Unk: genes sem função descrita. Podemos chamar
a atenção para uma significativa parcela de genes associados direta ou
indiretamente com mecanismos de comunicação celular que estão alterados
nas células J774-A1 não só no grupo de genes regulados negativamente (A),
como também
no grupo de genes regulados positivamente (B). Os genes
regulados negativamente totalizam 30% (JAE: 9%, CS: 9%, CY: 12%), e os
genes regulados positivamente somam 25% (JAE: 6%, CS: 9%, CY: 10%).
3%
4%
JAE
CS
OG 1%
CSD TI
A- Genes regulados negativamente :
6%
Unk
TR
9%
9%
22%
EnMet
CY
12%
19%
T2
15%
JAE
6%
OG
4%
7%
TR
Unk
22%
TI 9
%
TR
CSD 4%
BGenes
EnMet
T2 regulados
CY CS positivamente:
JAE CSD T1 OG Unknow
n
CS
9%
T2
CY
EnMet
18%
15%
10%
TR
EnMet
T2
CY
CS
CSD
T1
OG
JAE
Unknow
V- DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
As junções comunicantes são canais transmembrana que permitem o
tráfego de íons, segundos mensageiros e outras moléculas com até 1kDa entre
células adjacentes (Flagg-Newton et al., 1979). Fisiologicamente os canais
juncionais desempenham um importante papel no desenvolvimento dos
organismos multicelulares. Particularmente no sistema imune, MontecinoRodriguez et al. (2000) demonstraram que a expressão da conexina43 pode
modular a formação de células linfóides, como as células B e T.
A presença deste tipo de comunicação intercelular em macrófagos pode
ter uma grande importância fisiológica, visto que estas células estão presentes
em praticamente todos os tecidos, podendo mediar reações imuneinflamatórias através da transmissão e recepção de sinais, que podem envolver
as junções comunicantes (Alves et al, 1996; Oviedo-Orta and Howard-Evans,
2004).
Outra
estrututra
presente
nas
células
do
sistema
imune,
e
particularmente em macrófagos, é o receptor/poro P2X7, responsável pelo
fenômeno de permeabilização da membrana plasmática a moléculas de até
900Da (Steinberg et al.,1987), ou por outros eventos fisiológicos, como por
exemplo o aumento na liberação e maturação de interleucina-1β, ou eventos
relacionados à apoptose
e a morte celular (Perregaux & Gabel, 1998;
Burnstock & Williams, 2000; Adinolfi et al, 2005).
Em 1993, considerando a ausência de Cx43 em células de linhagem
J774 resistentes ao ATP extracelular, Beyer & Steinberg propuseram que os
poros P2X7 fossem formados por hemicanais de Cx43. Embora esta hipótese
não tenha sido comprovada, como demonstrado pela posterior clonagem e
expressão do receptor P2X7 pelo grupo de Surprenant (Surprenant et al.,
1996), a relação entre a ausência de Cx43 e a resistência ao ATP extracelular
(indicando ausência do receptor P2X7) nas células J774 ATP-resistentes
poderia indicar uma associação entre estas duas moléculas.
Portanto, no presente trabalho, aprofundamos os estudos relacionados a
comunicação juncional em macrófagos e células de linhagem macrofágica
J774, e que tiveram início em estudos do nosso grupo em 2002 (Fortes, FSA),
abordando a presença e a funcionalidade das junções comunicantes, e o seu
possível envolvimento com os receptores P2X7.
a) JUNÇÕES COMUNICANTES: PRESENTES, FUNCIONAIS E
MODULADAS EM MACRÓFAGOS?
Neste
trabalho,
aprofundamos
os
nossos
estudos
realizando
experimentos de injeção intracelular de corante inicialmente em culturas de
macrófagos obtidas de lavados peritoneais de camundongos elicitados com
tioglicolato.
Vale ressaltar que trabalhos relacionados à ensaios de cooperação
metabólica, tanto in vitro quanto in vivo, não demonstraram a transferência de
partículas entre culturas primárias de macrófagos peritoneais, e entre
macrófagos e outros tipos celulares (Kane & Bols, 1980). No final dos anos 80
estes dados foram confirmados em experimentos de injeção intracelular do
corante Lucifer Yellow, reforçando a ausência de acoplamento via junções
comunicantes (Dean et al., 1988).
Entretanto, nossos resultados demonstraram que culturas primárias de
macrófagos peritoneais apresentavam junções comunicantes funcionais
quando realizadas injeções de corante, uma vez que o corante de baixo peso
molecular, Lucifer Yellow, é transferido para as células adjacentes (figuras 9B)
(70% das células estão acopladas à célula adjacente – figura 9E). Tal resultado
associa-se com achados de meados dos anos 70, em que Levy et al. (1976)
demonstraram o acoplamento elétrico entre macrófagos orientados de forma
linear, e Porvaznisk & MacVittie (1979) identificaram regiões com a presença
de junções comunicantes em células progenitoras de macrófagos.
Para certificar que a passagem do corante estaria sendo feita pelas
junções comunicantes, foi utilizado o corante Rodamina Dextran (40KDa), que
se manteve confinado a célula injetada nos macrófagos peritoneais (figuras
10B) afastando a existência de pontes citoplasmáticas entre as células como
sugerido por Alves et al. (1996) ao realizar este mesmo experimento, ou a
passagem de corante (FITC-dextran) por vacúolos exocíticos e endocíticos nas
membranas dos macrófagos como proposto por Dean et al. (1988).
Ainda utilizando macrófagos peritoneais, bloqueadores usuais de
junções comunicantes (octanol) impediram que o corante Lucifer yellow se
difundisse para as células adjacentes, o que mais uma vez comprova a
presença de junções comunicantes funcionais e não de pontes citoplasmáticas
nestas células (figura 9D).
Para investigar com mais detalhes os acontecimentos funcionais
envolvidos na comunicação celular em macrófagos, utilizamos as linhagens
celulares macrofágicas J774-A1 e J774-G8. Nas células da linhagem
macrofágica J774-A1 observamos o corante confinado às células injetadas,
como demonstrado na figura 11B, o que foi confirmado na análise quantitativa
representada na figura 11C onde maioria absoluta das células estava
desacoplada. A ausência do acoplamento juncional encontrado em nossos
estudos também foi observada por Alves et al (1996), ao realizarem
experimentos de injeção de corantes nestas células obtidas da ATCC
(American Type of Cell Collection). Este acoplamento juncional encontrado em
nossos estudos também foi observado por Saez et al. (2000) através de
injeções de corante, cabendo ressaltar que suas culturas de células J774 eram
do tipo A1 e foram tratadas previamente com meio condicionado, proveniente
de células endoteliais de cérebro de rato, e por Eugenin et al. (2001), que
utilizando células de microglia (macrófagos do Sistema Nervoso Central)
procedentes de lesões, demonstraram que as junções comunicantes estavam
presentes e funcionais, porém somente quando as culturas eram incubadas
com interferon-γ + TNF-α (Tumor Necrose Factor-α) e interferon-γ +
lipopolissacarídeo (LPS).
Entretanto, utilizando as células da linhagem J774-G8 (uma linhagem
obtida das células J774-A1 – Unkeless et al, 1979), observamos que o seu
perfil funcional era o mesmo apresentado pelos macrófagos peritoneais, como
podemos observar na figura 12B, e analisar quantitativamente pelo histograma
apresentado na figura 12E, em que 84% das células estavam acopladas à
célula injetada com o corante Lucifer Yellow.
Todavia, não podemos descartar a hipótese de que alguns fatores
imune-inflamatórios possam modular o acoplamento, visto que existem várias
situações em que os macrófagos são ativados por várias substâncias
endógenas e em concentrações variáveis. Com base nisto e nos trabalhos que
fazem este tipo de tratamento (Saez et al, 2000), realizamos experimentos em
culturas de células J774-G8 tratadas com fatores pró-imune inflamatórios
combinados, ou seja interferon-γ + TNF-α e interferon-γ + lipopolissacarídeo
(LPS), e observamos que o acoplamento celular foi regulado positivamente
(dados não demonstrados).
Além das questões que envolvem a funcionalidade das junções
comunicantes em macrófagos peritoneais e células da linhagem macrofágica
J774, um estudo vinculou a existência das conexinas nestes tipos celulares à
um canal sensível à concentrações maiores que 100µM de ATP extracelular e
permeável a moléculas de até 900Da (Beyer & Steinberg, 1991). Além disso,
neste mesmo trabalho os autores descreveram células J774 que não
respondiam a altas concentrações de ATP extracelular, ou seja não sofriam o
fenômeno de permeabilização. Além disso, Beyer & Steinberg (1991)
demonstraram que estas células resistentes também não expressavam a
conexina43, tanto em “Northen blot” quanto em “Western blot”, concluindo que
as conexinas formariam o canal ativado por ATP, visto que estas proteínas
além de formar junções comunicantes podem formar hemicanais. No entanto,
Alves et al. (1996) demonstraram que macrófagos de camundongos “knockout”
para Cx43 sofriam o fenômeno de permeabilização por ATP.
Com base nestes estudos, e tendo em vista que os tipos celulares
utilizados em nosso estudo sofrem o fenômeno de permeabilização da
membrana plasmática por ATP extracelular (Steinberg et al, 1987; Adinolfi et al,
2005), desenvolvemos uma linhagem celular ATP-resistente a partir das células
J774-G8, esta última funcionalmente acoplada.
Como realizado nos macrófagos peritoneais, e nas células J774-A1 e
J774-G8 controle, as células J774-G8 ATP-resistentes foram injetadas com o
corante Lucifer yellow. Porém, diferentemente dos macrófagos peritoneais e
das células macrofágicas, esta linhagem resistente não estava acoplada (figura
12D).
Com o objetivo de reafirmar estes resultados, haja visto que utilizavamos
uma linhagem celular macrofágica, e que pode ter um comportamento
fisiológico diferente de células advindas do animal, foram feitos estes mesmos
experimentos funcionais em culturas de macrófagos peritoneais oriundos de
camundongos “knockout” para o receptor P2X7. Diante desta comparação, os
resultados foram idênticos aos obtidos com as células J774-G8 ATPresistentes, estando o corante retido apenas ao macrófago peritoneal injetado
(figura 13B), o que confirmamos através da análise estatistica demonstrada na
figura 13C.
Além das células ATP-resistentes, foram injetadas células J774-G8
controle tratadas com concentrações crescentes de ATP extracelular, o que
não modificou o perfil de acoplamento deste grupo de células em relação as
células controle sem tratamento, afastando a hipótese de que a modulação do
acoplamento estaria ligada a exposição aguda ao ATP extracelular (figura 14).
Além dos estudos funcionais, estudos da expressão da Cx43 davam
margem a conflitos acerca da presença de junções comunicantes em
macrófagos. Beyer & Steinberg (1991; 1993) demonstraram que macrófagos e
células J774 apresentavam mensagem e expressão protéica para Cx43,
respectivamente através de “Northen blot” e “Western blot”. Contudo, Polacek
et al. (1993), também utilizando “Northen blot”, não conseguiram reproduzir os
dados do grupo anterior afirmando que os macrófagos não expressavam Cx43,
a menos que sofressem algum estímulo, a exemplo de sítios de
arterioesclerose, que ativariam a transcrição do gene da Cx43. Diante destas
discrepâncias, realizamos ensaios de reação em cadeia de polimerase (RTPCR), onde encontramos mensagem para Cx43 tanto em macrófagos
peritoneais, quanto em células J774-G8 controle (figura 15A), em consonância
com os dados demonstrados por Alves et al. (1996) através de “Northen blot”, o
que depois foi ratificado nas análises densitométricas realizadas com os
resultados (figura 15B). No entanto, ao realizarmos os experimentos de RTPCR,
observamos
que
as
células
ATP-resistentes
(funcionalmente
desacopladas) possuem mensagem para Cx43 (figura 15A), nos mesmos
níveis que macrófagos e células J774-G8 (figura 15B).
Complementando nossos dados experimentais, uma vez que a presença
de mensagem não atesta a presença da proteína na célula, realizamos
experimentos de “Western blot”, no qual observamos a expressão da proteína
Cx43 tanto em macrófagos quanto em células J774 controle (figura 16A), como
encontrado por Alves et al. (1996), que afirmam que a proteína está presente,
porém em sua forma não-fosforilada. Neste contexto é interessante notar que
Musil et al. (1990) propuseram que a forma não-fosforilada da Cx43 seria
incapaz de formar junções comunicantes. No entanto, Spray et al. (1994)
demonstraram que a forma truncada da Cx43, em que todos os sítios de
fosforilação da porção carboxi-terminal de moléculas estão ausentes, forma
canais juncionais quando expressa em células com a comunicação deficiente.
Ao realizarmos os experimentos de “Western blot” nas células J774-G8
ATP resistentes, observamos que estas células expressam a proteína Cx43
(figura 16A), porém não expressam a proteína P2X7, descrita como formadora
do poro sensível ao ATP. Em contraste, as células J774-G8 controle
expressam ambas proteínas (figura 16B).
Nossos resultados, como os de Alves et al. (1996), demonstram que as
conexinas não formam os poros sensíveis ao ATP. Porém, a expressão do
poro P2X7 poderia influênciar o acoplamento das células e a funcionalidade das
junções comunicantes, visto que as células ATP-resistentes: (1) expressam a
Cx43; (2) não expressam o poro P2X7; (3) possuem a comunicação intercelular
sensívelmente reduzida.
Portanto, diante dos três pontos citados anteriormente, realizamos
experimentos de imunofluorescência que demonstraram a presença de
imunoreatividade para Cx43 na membrana plasmática das células J774-G8
controle (com expressão do poro P2X7), diferentemente das células ATPresistentes (sem expressão do poro P2X7), nas quais a marcação para Cx43 se
concentrou no citoplasma, como se a proteína estivesse localizada dentro de
vacúolos (figuras 18B e 18D), justificando a sensível redução do acoplamento
intercelular.
Vale ressaltar que em nossos estudos foram utilizadas células
resistentes obtidas a partir da linhagem J774-G8 (Unkeless et al, 1979), o que
pode ter sido um dos fatores de discrepância em relação aos trabalhos de
Beyer & Steinberg (1991; 1993). Estes autores trabalharam com células J774,
mas sem citar qual tipo haviam utilizado. Visto que existe uma outra linhagem
de células macrofágicas J774: as células J774-A1 (ATCC), e que se
comportam funcionalmente diferente das células J774-G8, produzindo óxido
nítrico e não apresentando comunicação juncional, poder-se-ia imaginar que
estas células não expressam Cx43 quando adquirem o caráter de resistência
ao ATP-extracelular.
Como citado anteriormente, os macrófagos são essenciais na resposta
imune, inata ou adaptativa, na qual interagem com os próprios macrófagos ou
com outras células migratórias do sistema imune, fazendo com que a partir daí
os microorganismos (bactérias entre outros) sejam eliminados do sistema
(Abbas, 2001). Desta forma, a expressão das junções comunicantes em
macrófagos poderia ser importante na modulação da resposta imune, por
permitir a passagem de moléculas importantes para a ativação destas células
em processos de infecção. Atualmente alguns trabalhos utilizando monócitos
ativados demonstraram que as proteínas do tipo MHC I (Fator de
Histocompatibilidade Maior I) podem ser transferidas dos citoplasmas de
células adjacentes utilizando as junções comunicantes (Neijssen et al, 2005).
Diante dos vários resultados apresentados até esta parte de nosso
trabalho, podemos afirmar que a comunicação juncional está presente e
funcional em macrófagos peritoneais e células da linhagem macrofágica J774G8 e pode ser modulada através de possíveis interações proteicas.
Com base nos resultados descritos e discutidos até o presente
momento, podemos resumir parte destes achados na tabela abaixo (tabela 1):
Tabela1: Resultados parciais obtidos com parte dos tipos celulares analisados
MØ
Células J774-G8
Controle
Células J774-G8
ATP-resistentes
Cx43
+
+
+
P2X7
+
+
-
Funcionalidade
Acoplada
Acoplada
Desacopladas
Células J774-A1
(ATCC)
Desacopladas
M
(P2X7 “K
Desac
b) CONEXINA43 & P2X7: EVIDÊNCIAS DE UMA POSSÍVEL
INTERAÇÃO
A
funcionalidade
das
junções
comunicantes
foi
constatada
e
aprofundada em nossos estudos, entretanto também observamos a modulação
deste fenômeno através de alterações na expressão da junção comunicante na
membrana plasmática, como foi demonstrado nas células ATP-resistentes.
Uma hipótese capaz de explicar esta modulação da expressão do canal
juncional na membrana plasmática das células ATP-resistentes pela ausência
do poro P2X7 poderia estar relacionada com as respostas fisiológicas
associadas à resposta imune, advindas da ativação do poro pelo ATP
extracelular, como a liberação e maturação da interleucina-1β (Perregaux &
Gabel, 1998; Burnstock & Williams, 2000). Esta interleucina pode estar
diretamente relacionada à comunicação intercelular nos macrófagos, haja visto
que as junções comunicantes são sensíveis a ação de citocinas (interleucinas 1
α, 2 e 6), hormônios e neurotransmissores (Alves et al., 2000).
Além de interações bioquímicas, interações físicas podem estar
associadas as duas proteínas destacadas em nosso estudo. Recentemente,
Kim et al (2001) demonstraram através de experimentos de imunoprecipitação
que os poros P2X7 estavam relacionados com proteínas de citoesqueleto e
proteínas de membrana, particularmente com a família de proteínas chamadas
de Guanilato Quinases Associadas a Membrana (MAGuK), sendo estas
constituídas por: domínios PDZ; domínios SH3 e regiões homólogas à
Guanilato Quinase (GK). Acredita-se que a região rica em prolinas do poro
P2X7, dependendo de sua ativação ou não pelo ATP, se ligue ao domínio SH3
das MAGuKs. Neste mesmo trabalho, foi demonstrado que outras proteínas,
formadoras de matrix extracelular como: laminina α3 e integrina β2, ou
intracelulares: α-actinina 4 e β-actina, poderiam estar envolvidas com os poros
P2X7, modificando a morfologia celular e muitas das vezes a expressão e a
localização de algumas proteínas nas células.
Da mesma forma que os poros P2X7, as junções comunicantes formadas
pela Cx43 também interagem com outras proteínas, como demonstrado por
Giepmans
&
Moolenar
(1998),
que
através
de
experimentos
de
imunoprecipitação e imunofluorescência, demonstraram que a região carboxiterminal da conexina43 pode interagir com o 2o domínio PDZ da proteína ZO1
(Zona Ocludens 1), uma proteína associada à junções do tipo Tight (Tight
Junction), e que segundo estes estudos estariam envolvidas com o
ancoramento das conexinas na membrana plasmática. Além disso, também foi
demonstrado neste mesmo estudo que as regiões ricas em prolina da Cx43
interagem com o domínio SH3 da ZO-1. A associação da Cx43 com a ZO-1
também foi demonstrada por dados do nosso laboratório, em que miócitos
cardíacos infectados com Trypanosoma cruzi apresentam a diminuição da
imunoreatividade para Cx43 e ZO-1 na membrana plasmática (Goldenberg et
al., 2001). Além desta associação com as proteínas ZO-1, Matsushita et al.
(1999) demonstraram que a Cx43 também pode estar relacionada com outras
proteínas celulares, como por exemplo: (1) integrina β1; (2) desmoplaquinas
(proteínas formadoras de desmossomos); (3) caderinas (proteínas formadoras
de junções de aderência) e (4) laminina.
Com base nestes dados, podemos especular que as proteínas Cx43 e
P2X7 poderiam estar associadas, visto que ambas interagem com várias
proteínas intracelulares. Assim, na ausência dos poros P2X7, esta interação e
possivelmente o ancoramento da junção comunicante na membrana ficariam
prejudicados, como foi demonstrado nas células ATP-resistentes (figura 18D),
que expressam grande parte da Cx43 no citoplasma.
Para elucidar tais especulações, foram feitos ensaios de microscopia
confocal utilizando primeiramente as células J774-G8 controle. As figuras 19 A
e B demonstraram claramente as duas proteínas presentes na membrana
plasmática das células, e que estão em um mesmo volume confocal quando
observamos a reconstrução tridimensional ilustrada na figura 20, não só em um
único plano (figura 20A), como também nas respectivas projeções (figuras 20B
e 20C), que levam em consideração a profundidade dos cortes ópticos.
Confirmando os achados nas células J774-G8 controle, os mesmos
experimentos foram feitos em culturas primárias de macrófagos peritoneais,
que demonstraram o mesmo perfil de marcação não só nas imagens
separadas (figuras 21A e 21B), como também na reconstrução tridimensional
que demonstra as duas proteínas no mesmo volume confocal (figuras 22A, 22B
e 22C).
Bioquimicamente, estas especulações se tornaram mais consistentes
quando experimentos de co-imunoprecipitação revelaram que as duas
proteínas estavam associadas molecularmente em macrófagos peritoneais e
células J774-G8 controle (figuras 27 A e B).
Entretanto, ao utilizar as células da linhagem macrofágica J774-A1 em
experimentos de microscopia confocal observamos que as duas proteínas,
Cx43 e P2X7, estão presentes na célula (figura 23). No entanto, a Cx43 se
apresentou internalizada enquanto o receptor P2X7 se encontrou na membrana
plasmática (figuras 23A e 23B), e ao observarmos a sobreposição das imagens
e a reconstrução tridimensional do campo, constatamos que não houve colocalização em nenhum momento (figura 24). Confirmando estes achados, os
ensaios bioquímicos nos revelaram que as duas proteínas não estavam coimunoprecipitadas nestas células como observamos nos outros tipos celulares
utilizados anteriormente (figura 27C).
No entanto, tomando por base que estavamos obtendo um resultado
proveniente de linhagens celulares, e que em alguns momentos não
reproduzem fidedignamente o comportamento molecular e fisiológico de células
de animais ou de humanos, fizemos a análise da distribuição proteica da Cx43
nos macrófagos peritoneais de camundongos “knockout” para o receptor P2X7
através de ensaios de microscopia confocal. Na figura 25 observamos,
respectivamente em A e B, a conexina43 internalizada e a ausência do
receptor P2X7 da célula, como detectado anteriormente nas células J774-G8
ATP-resistentes através de microscopia (figura 18D), e “western blot” (figura
16B). Esta mesma constatação pôde ser feita na reconstrução tridimensional
destacada na figura 26 (A, B e C), em que a Cx43 esta ocupando a região
perinuclear da célula.
Desta forma, tal resultado justifica a ausência de acoplamento que
observamos nos ensaios de injeção de corante demonstrados na figura 13B,
fortalece os resultados obtidos com as células ATP-resistentes e indiretamente
contraria a hipótese de Beyer & Steinberg (1991), de que o poro responsável
pelo fenômeno de permeabilização é formado por um hemicanal juncional.
Diante dos nossos resultados, então, podemos constatar que este receptor
pode ser importante para a inserção da conexina na membrana. A tabela
abaixo (tabela 2) representa todos os resultados discutidos e associados as
células analisadas até o presente momento em nosso estudo.
Tabela 2: Resultados obtidos com os tipos celulares analisados
MØ
Células J774-G8
Controle
Células J774-G8
ATP-resistentes
Células J774-A1
(ATCC)
MØ
(P2X7 “Knockout”)
Cx43
+
+
+
+
+
P2X7
+
+
-
+
-
Funcionalidade
Acoplada
Acoplada
Desacopladas
Desacopladas
Desacopladas
Microscopia Confocal
(co-localização)
+
+
-
-
Imunoprecipitação
+
+
-
c) INTERAÇÃO
CONEXINA43
X RECEPTOR
P2X7: UMA
POSSÍVEL EXPLICAÇÃO MOLECULAR
A associação física destas duas proteínas não foi observada apenas por
nosso grupo (Fortes et al, 2004), no qual abordamos esta interação em células
migratórias do sistema imune, como também foi demonstrada no tecido
cardíaco por outros grupos. Jiang et al (2005) mostraram que a proteína Cx43
co-localiza com o receptor purinégico P2X1 no ventrículo esquerdo do coração
de humanos. Funcionalmente a associação de receptores P2X e conexinas
também vem sendo observada, como demonstrado por Guthrie et al. (1999),
que descreveu uma possível modulação das ondas de cálcio (fenômeno de
comunicação intercelular mediado por junções comunicantes), por ATP
extracelular e utilização de bloqueadores de receptores purinérgicos.
Entretanto, analisando os resultados associados às linhagens celulares
descritos anteriormente, nos deparamos com uma grande dúvida acerca de
uma possível interação entre as conexinas e os receptores P2: será necessária
a presença do receptor P2X7 na membrana plasmática para que a Cx esteja
presente na membrana de forma funcional, como observamos nas células ATPresistentes e nos macrófagos peritoneais “knockout” para o receptor P2X7?
Poderíamos responder que não em um primeiro momento, mas de acordo com
vários trabalhos (Hérve et al, 2004), as conexinas podem estar interagindo com
várias proteínas de forma indireta e não de forma direta, através de moléculas
que façam “pontes”, estabelecendo contatos entre proteínas.
E o mesmo pode estar acontecendo em nosso modelo, em que a
ausência do receptor P2X7 na membrana das células J774-G8 ATP-resistentes,
ou de macrófagos peritoneais de animais “knockout” para o receptor P2X 7,
pode de alguma forma alterar a expressão de proteínas que possam interligar a
Cx43 com o receptor P2X7.
Portanto, agora se utilizando de um modelo celular em que: (1) a Cx43
está presente de forma internalizada, mesmo com a presença do receptor
purinégico na membrana plasmática como ocorre em células J774-G8 controle;
(2) e que não está acoplada funcionalmente, como ocorre nas células J774-G8
ATP-resistentes, buscamos respostas para uma possível interação em
experimentos de microarranjo de DNA (Microarray).
Nestes experimentos esperavamos observar alterações gênicas que de
alguma forma pudessem explicar a interação proteica sugerida por nosso
trabalho anterior, além de elucidar as diferenças funcionais entre as células
J774-G8 e J774-A1.
Os resultados obtidos através destes experimentos nos revelaram que
um significativo percentual de genes envolvidos com o fenômeno de
comunicação celular estavam alterados nas células J774-A1, quando
comparadas com as células J774-G8 controle. A figura 28A reflete parte destes
achados, em que 30% dos genes regulados negativamente estão envolvidos
com a expressão de proteínas que se relacionam com junções comunicantes
ou receptores purinérgicos.
Recentemente,
Giepmans
(2004)
demonstrou
um
modelo
de
organização estrutural e molecular das junções celulares envolvidas com
adesão e comunicação celular, esta última por intermédio de junções
comunicantes formadas particularmente pela Cx43. Dentre as proteínas
envolvidas neste esquema merecem destaque a α-catenina e α-actinina,
estando estas envolvidas com a formação do citoesqueleto celular e inserção
da conexina na membrana plasmática, como podemos observar na figura
abaixo e que foi modificada da revisão de Giepmans (figura 30). De acordo
com Giepmans (2004), a proteína α-catenina está presente no complexo de
proteínas que estão associadas com a proteína de adesão E-caderina, que
está co-localizada e co-imunoprecipitada com a Cx43. Segundo Fujimoto et al
(1997), as α-cateninas estão co-localizadas com a Cx43 no inicio da formação
da placa juncional na membrana plasmática celular, sendo essenciais para o
endereçamento e inserção da conexina na membrana, como foi observado em
ensaios de microscopia confocal.
De acordo com as nossas análises, as proteínas α-catenina e α-actinina
estão reguladas negativamente nas células J774-A1 quando comparadas com
as células J774-G8, o que poderia explicar a ausência de comunicação celular
entre as células J774-A1. A Cx43 neste caso estaria retida no citoplasma, pois
as proteínas responsáveis por sua ancoragem e endereçamento não estariam
presentes na constituíção celular, ou estariam em quantidades reduzidas na
célula, o que dificultaria o encaminhamento e inserção da conexina na
membrana.
ZO-3
ZO-2
ZO-1
claudins
occludin
actin
Rho
ZO-1
ZO-2
α -catenin
α -actinin
Rho
RPTPµ
RPTPµ
ZO-1
C-Src
CK1
Figura 30- Esquema demonstrando as proteínas que possivelmente estão envolvidas
com a inserção da Cx43 na membrana plasmática. Vale ressaltar que os diagramas em verde
simbolizam os genes que estariam regulados negativamente nas células J774-A1.
Consequentemente a expressão destas proteínas estaria prejudicada o que diminuiria a
presença da conexina na membrana neste tipo celular. (adaptado de Giepmans, 2004).
Além destas proteínas, foi inserida na figura uma família de proteínas
citossólicas representadas por pequenas GTPases, sendo estas chamadas de
familia de proteínas RHO. Esta famíla de proteínas é responsável por inúmeras
funções intracelulares, dentre elas a depolimerização dos polímeros de actina
que formam o citoesqueleto e os microtúbulos das células. Através da
depolimerização, novas moléculas de actina ficam disponíveis para formação
de novas cadeias de actina, o que dá origem a reorganização do citoesqueleto
(Kaibuchi et al, 1999).
A atividade das proteínas da família RHO é regulada por outras
proteínas denominadas GAPs (GTPase-Activating Proteins) (Kaibuchi et al,
1999; Royal et al, 2000), e que nas células J774-A1 estão reguladas
negativamente, o que consequentemente diminui a atividade das proteínas
RHO, e assim a depolimerização do citoesqueleto, impedindo a formação de
novos filamentos de actina. Com a redução de formação de novos filamentos, a
inserção das conexinas na membrana celular ficaria prejudicada, levando ao
confinamento da Cx43 no citossol (figuras 23A e 24).
Além
das
moléculas
discutidas
anteriormente,
está
regulada
negativamente a própria molécula de actina (que no macrófago é denominada
F-actina), e que segundo Giepmans (2004), é importante para inserção da
conexina na membrana, haja visto que as vesículas contendo a proteína
conexina, ao sairem do complexo de Golgi, utilizam os microtúbulos como via
de endereçamento proteico para membrana plasmática (Segretain & Falk,
2004).
Outros genes associados à expressão de moléculas correlacionadas
com a inserção da Cx43 na membrana plasmática estavam alteradas nas
células J774-A1. A caseína kinase 1 (CK 1), por exemplo, também estava
regulada negativamente nestas células. Esta proteína, quando expressa em
níveis normais auxilia na produção e inserção da Cx43 na membrana celular,
segundo Cooper & Lampe (2002), que através de ensaios de coimunoprecipitação observaram a associação das duas proteínas em um
mesmo complexo.
Além dos genes alterados relacionados a expressão de conexinas,
foram encontrados genes que alteram a funcionalidade dos receptores P2X 7. A
figura abaixo foi retirada e adaptada do trabalho de Kim et al (2001), e que foi
comentado anteriormente (figura 31).
Integrin β 2
P2X7
RPTPβ
Laminin α 3
Pl4K
Rho
MAGuK
Hsc71
Hsp70
α -actinin
Supervillin
Hsp90
β -actin
Figura 31- Esquema demonstrando as proteínas que possivelmente estão envolvidas
com a inserção e atividade do receptor P2X7 na membrana plasmática. Vale ressaltar que os
diagramas em verde simbolizam os genes que estariam regulados negativamente nas células
J774-A1, e os em vermelho que estariam regulados positivamente neste mesmo tipo celular.
(adaptado de Kim et al, 2001).
De acordo com a figura acima, poderíamos destacar inicialmente a
proteína β-actina, que está regulada negativamente nas células J774-A1, e
interage com a porção C-terminal da proteína α-actinina (Sampath et al, 1998).
A expressão da proteína β-actina está relacionada com o arranjo do
citoesqueleto e a inserção de diversas proteínas na membrana plasmática das
células, dentre elas as proteínas que necessitam do citoesqueleto para serem
ancoradas, tomando como exemplo as conexinas, ou segundo Kim et al (2001),
os
próprios
receptores
P2X7.
Segundo
os
experimentos
de
co-
imunoprecipitação deste grupo, as proteínas β-actina e α-actinina estariam
associadas ao receptor P2X7.
Associado à redução de expressão da proteína β-actina, podemos
chamar a atenção para o gene da proteína α-actinina, relacionada à
organização do citoesqueleto celular, e que está regulado negativamente nas
células J774-A1. Além de interagir com a β-actina, a proteína α-actinina
também interage com a proteína supervilina, que está intimamente associada à
organização de feixes formados por F-actina, presentes em leucócitos e
macrófagos
(Pestonjamasp
et
al,
1997).
Este
desequilíbrio
poderia
desencadear uma severa alteração da organização do citoesqueleto celular,
haja visto que a formação de feixes de F-actina estaria comprometida,
impedindo a inserção de determinadas proteínas na membrana plasmática das
células,
como
observamos
nas
células
J774-A1
através
de
nossos
experimentos de microscopia confocal (figura 24).
Além desta alteração, poderiamos inferir que estas proteínas (β-actina e
α-actinina) de alguma forma poderíam estar fazendo uma ponte de interação
entre a Cx43 e o receptor P2X7, haja visto que elas interagem com as duas
proteínas destacadas em nosso estudo. Com base nesta afirmativa, mesmo na
presença do receptor P2X7, as células J774-A1 não expressariam a Cx43 na
membrana.
Dos
genes
que
estavam
regulados
negativamente,
também
relacionamos o gene que regula a expressão da proteína β2-integrina, e que
está
inserida
na
membrana
plasmática
celular.
Ao
estar
regulada
negativamente, a β2-integrina pode não só alterar o ancoramento da Cx43 na
membrana, como também pode alterar a inserção e a funcionalidade do
receptor P2X7. Esta proposição pode ser especulada, haja visto que esta
proteína (β2-integrina): (1) interage diretamente com a α-actinina (Sampath et
al, 1998), que é responsável pelo endereçamento da conexina para membrana
(Segretain & Falk, 2004); e (2) está associada com o receptor P2X7
diretamente, na região intracelular (Kim et al, 2001).
Ainda analisando os genes regulados negativamente em nossos
experimentos de microarranjo de DNA, podemos dar destaque para os genes
associados as proteínas RHO, e que também estão possivelmente associadas
com os receptores P2X7. Segundo Pfeiffer et al (2004), experimentos inibindo a
ativação das vias associadas com a proteína RHO, impedem a reorganização
do citoesqueleto celular de macrófagos murinos RAW 264.7 quando utilizado o
agonista do receptor P2X7 denominado BzATP. Nas células controle (sem
bloqueio da via), foi demonstrada pelos autores a reorganização do
citoesqueleto e a formação de “blebs” de membrana após o tratamento com o
agonista, demonstrando o envolvimento dos receptores P2X7 com a
reorganização do citoesqueleto celular.
Como discutimos anteriormente, as proteínas da família RHO estão
associadas a depolimerização de cadeias de actina, para que haja a renovação
do citoesqueleto celular. Portanto, através da ausência ou da baixa expressão
das proteínas da via RHO, pode ser impedida a formação do citoesqueleto
celular, o que prejudicaria a atividade das proteínas que estariam associadas a
este evento, como por exemplo o controle da reorganização do citossol e da
membrana plasmática de macrófagos pela ativação do receptor purinérgico.
Indiretamente, a associação da Cx43 e do receptor P2X 7 ficaria alterada, já que
o receptor purinérgico não conseguiria modular a formação do citoesqueleto
celular, impedindo consequentemente o enderaçamento da proteína Cx43 para
membrana plasmática.
Entretanto, através das análises realizadas utilizando o microarranjo de
DNA, observamos também alterações associadas a uma regulação positiva de
alguns genes associados à proteínas estruturais. Dentre as proteínas
estruturais observadas, podemos destacar a proteína α3 laminina que está
associada diretamente à proteína β2-integrina em sua porção extracelular, e a
sua inserção na membrana plasmática (Colognato & Yurchenco, 2000; Kim et
al, 2001). Esta proteína pode estar regulada positivamente nas células J774A1, devido a redução da expressão de β2-integrina, o que seria uma eficiente
alternativa de manter o ancoramento das poucas proteínas expressas (caso
sejam expressas) na membrana plasmática das células.
Portanto, utilizando as informações provenientes das várias alterações
moleculares que observamos nas análises dos experimentos de microarranjo
de DNA, e diante dos conhecimentos disponibilizados pela literatura,
desenvolvemos um esquema que tem como objetivo elucidar e associar os
eventos relacionados a todas as alterações demonstradas até o presente
momento (figura 32).
Laminina
P2X7
Integrina
Cx43
na
Talina inculi
V
Pa
xili
na
SH3
E-
ca
d
-
MAGUK
er
in
a
β -catenina
SH3
-
na
+
-
+
P2X7
sf
o
Citoesqueleto
(actina)
ril
aç
ão
-
RHOA
+
-
-
+
ARHGEF1
ROCK1
Cx
43
+
ARHGEF6
-
+
PAK1
+ -
SRC
HSP90
+
RAC1
+
+
+
Fo
+
+
ARHGAP29
α ac
tini
G-ACTINA
GEF
+
+
-
α -catenina
RAS
GAP
Organização dos feixes
de Actina
LIM KINASE
-
+
-
HSP90
RAF-1
-
COFILINA
-
+
-
Depolimerização da Actina
ERK 1, 2
+ -
+ MEK 1, 2
-
Figura 32- Esquema representativo das proteínas e vias protéicas que podem estar
envolvidas com as alterações funcionais presentes nas células J774-A1, e com a possível
correlação entre a proteína Cx43 e o receptor P2X7 em células de linhagem macrofágica e
macrófagos peritoneais. As estruturas em verde representam as proteínas que estão reguladas
negativamente, e as que estão representadas em vermelho as reguladas positivamente nas
células J774-A1. As estruturas em cinza não sofreram nenhuma alteração, mas participam das
vias que tem alguma proteína alterada. Os sinais de negativo (-) ou positivo (+) que estão em
verde ou vermelho estão associados as vias que tem alguma proteína alterada, o que de
alguma forma promove a alteração das atividades biológicas celulares. Estes mesmos sinais
que não estão com sua cor alterada representam qual o efeito normal das proteínas nas vias.
Através do esquema acima, conseguimos correlacionar todas as vias
que discutimos até o momento, e assim elucidar como cada um dos genes (e
as respectivas proteínas que expressam) alteram a funcionalidade e a
interação da Cx43 e do receptor P2X7.
Entretanto, algumas vias foram destacadas apenas neste esquema da
figura 32. Dentre os genes e as suas respectivas vias, podemos chamar a
atenção inicialmente para a proteína Cofilina que está regulada negativamente
não só de forma direta, como observamos na análise do microarranjo de DNA,
como também está regulada de forma indireta, pois a via de ativação desta
proteína também está regulando-a de forma negativa. Com base nestas
informações, podemos inferir que os processos de depolimerização e
estabilização dos feixes de actina podem estar prejudicados, já que a cofilina
está associada à estas duas funções (Nicholson-Dykstra et al, 2005).
Consequentemente, a inserção e a regulação de proteínas que dependem da
organização do citoesqueleto celular ficariam prejudicadas.
Além dos genes regulados negativamente, podemos encontrar genes
regulados
positivamente
nas
células
J774-A1,
quando
analisamos
o
microarranjo de DNA. Dentre os genes regulados positivamente, chamamos a
atenção para a molécula de HSP 90 (Heat Shock Protein 90). Esta molécula é
responsável pela manutenção de cascatas de sinalização, e regulação negativa
da região com a presença de tirosina do receptor P2X7, o que diminui a
atividade
do
receptor
purinérgico,
que
está
associada
com
efeitos
proimunoinflamatórios, como a síntese e produção de citocinas que podem
mediar respostas inflamatórias (Adinolfi et al, 2003; Verhoef et al, 2003; Erb et
al, 2006).
Através da alteração desta proteína (HSP 90), agora regulada
positivamente, vias associadas com as ERK (Extracellular Signal-regulated
Kinase) sofreram alterações que estão intimamente relacionadas com a
fosforilação da Cx43 (Warn-Cramer & Lau, 2004).
Apesar de destacarmos vários genes, associados à proteínas ou vias
que são candidatas em potencial à uma possível interação molecular entre a
Cx43 e o receptor P2X7, ainda estamos contabilizando outros genes que
possam estar associados à estas especulações.
Como demonstramos na figura 29, vários genes estavam alterados nas
células J774-A1, e tiveram os seus percentuais distribuidos em grupos
funcionais que não foram completamente esgotados até a sua úlima análise.
Além disso, diante destes dados, vamos estudar quais seriam as vias e
proteínas que estariam realmente modificadas, tomando por base as alterações
genéticas que encontramos em nossas análises. Abaixo podemos observar as
tabelas relacionadas com vias associadas a genes regulados negativamente
(tabela 3) ou positivamente (tabela 4) nas células J774-A1.
Tabela 3: Vias associadas a genes regulados negativamente
IDENTIFICAÇÃO DOS GRUPOS GÊNICOS
NOME DOS GRUPOS GÊNICOS
7606
Sensory perception of chemical stimulus
7608
Perception of smell
4872
Receptor activity
4984
Olfactory receptor activity
4930
G-protein coupled receptor activity
7186
G-protein coupled receptor protein signaling pathway
7017
Microtubule-based process
8202
Steroid metabolism
4221
Ubiquitin thiolesterase activity
1584
Rhodopsin-like receptor activity
4843
Ubiquitin-specific protease activity
4888
Transmembrane receptor activity
50819
Negative regulation of coagulation
50818
Regulation of coagulation
19894
Kinesin binding
16758
Transferase activity \ Transferring hexosyl groups
8194
UDP-glycosyltransferase activity
7600
Sensory perception
6511
Ubiquitin-dependent protein catabolism
19941
Modification-dependent protein catabolism
4871
Signal transducer activity
5515
Protein binding
19899
Enzyme binding
16757
Transferase activity \ Transferring glycosyl groups
42605
Peptide antigen binding
30199
Collagen fibril organization
6869
Lipid transport
16790
Thiolester hydrolase activity
4197
Cysteine-type endopeptidase activity
9581
Detection of external stimulus
3823
Antigen binding
5544
Calcium-dependent phospholipid binding
8203
Cholesterol metabolism
139
Golgi membrane
16125
Sterol metabolism
47499
Calcium-independent phospholipase A2 activity
4622
Lysophospholipase activity
4607
Phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase activity
4807
Triose-phosphate isomerase activity
8234
Cysteine-type peptidase activity
5915
Zonula adherens
226
Microtubule cytoskeleton organization and biogenesis
30414
Protease inhibitor activity
4866
Endopeptidase inhibitor activity
5776
Autophagic vacuole
45
Autophagic vacuole formation
16236
50509
Macroautophagy
N-acetylglucosaminyl-proteoglycan 4-beta-glucuronosyltransferase
activity
8378
Galactosyltransferase activity
30496
Midbody
Tabela 4: Vias associadas a genes regulados positivamente
IDENTIFICAÇÃO DOS GRUPOS GÊNICOS
NOME DOS GRUPOS GÊNICOS
16070
RNA metabolism
6396
RNA processing
30529
Ribonucleoprotein complex
45095
Keratin filament
16478
Negative regulation of translation
375
377
RNA splicing \ Via transesterification reactions
RNA splicing \ Via transesterification reactions with bulged
adenosine as nucleophile
398
Nuclear mRNA splicing \ via spliceosome
16071
mRNA metabolism
5952
cAMP-dependent protein kinase complex
6364
rRNA processing
19867
Outer membrane
8380
RNA splicing
3723
RNA binding
43283
Biopolymer metabolism
43228
Non-membrane-bound organelle
43232
Intracellular non-membrane-bound organelle
46728
Viral capsid (sensu Retroviridae)
19013
Viral nucleocapsid
7046
Ribosome biogenesis
16072
rRNA metabolism
42254
Ribosome biogenesis and assembly
5882
Intermediate filament
45111
Intermediate filament cytoskeleton
5253
Anion channel activity
8369
Obsolete molecular function
4759
Serine esterase activity
16208
AMP binding
30552
3’\,5’-cAMP binding
8639
Small protein conjugating enzyme activity
4840
Ubiquitin conjugating enzyme activity
8603
cAMP-dependent protein kinase regulator activity
6397
mRNA processing
6596
Polyamine biosynthesis
16887
ATPase activity
43234
Protein complex
785
Chromatin
19538
Protein metabolism
7028
Cytoplasm organization and biogenesis
44267
Cellular protein metabolism
4091
Carboxylesterase activity
6821
Chloride transport
6325
Establishment and/or maintenance of chromatin architecture
6323
DNA packaging
6334
Nucleosome assembly
30551
Cyclic nucleotide binding
5198
Structural molecule activity
19028
Viral capsid
8283
Cell proliferation
19835
Cytolysis
6605
Protein targeting
9058
Biosynthesis
A realização
de experimentos de microscopia
confocal
e co-
imunoprecipitação conseguirão demonstrar com mais clareza não só a
associação das duas proteínas que estudamos em nosso trabalho, mas
também como está a associação destas duas proteínas com as proteínas que
estariam reguladas negativamente ou positivamente nas células J774-A1 em
relação as células J774-G8, e que possuem o mesmo perfil funcional que as
células provenientes de macrófagos peritoneais.
A partir deste momento, com base nestes dados, temos a certeza de
que de alguma forma conseguiremos não só esclarecer ainda mais a interação
entre estas duas proteínas em células do sistema imune, como também
conseguiremos extrapolar este conhecimento para outros sistemas, dada a
importância destas duas estruturas nas respostas fisiológicas em vários tecidos
e orgãos.
VI- CONCLUSÕES
CONCLUSÕES
Diante dos resultados obtidos em nossos estudos, podemos concluir
que:
a) Os macrófagos peritoneais e as células de linhagem macrofágica
J774-G8 Controle e ATP-resistentes apresentam níveis de mRNA para
conexina43;
b) Todos os tipos celulares estudados expressam a conexina43;
c) As células J774-G8 ATP-resistentes expressam a conexina43, mas
não expressam o receptor P2X7;
d) As células controle expressam a proteína juncional na membrana
plasmática, enquanto que as células ATP-resistentes apresentam a conexina43
majoritariamente no citoplasma;
e) Os macrófagos peritoneais e as células da linhagem macrofágica
J774-G8 controle estão acopladas, apresentando Junções Comunicantes
FUNCIONAIS, enquanto
as células
J774-G8
ATP-resistentes,
embora
expressem conexinas, não estão acopladas;
f) Os macrófagos peritoneais provenientes de animais “knockout”para o
receptor P2X7 não estão acoplados funcionalmente;
g) As proteínas Cx43 e P2X7 interagem não só em macrófagos
peritoneais, como também nas linhagens macrofágicas J774-G8, o que não
ocorre em macrófagos peritoneais provenientes de animais “knockout”para o
receptor P2X7, ou células das linhagens macrofágicas J774-G8 ATP-resistentes
e J774-A1;
h) A interação proteica proposta em nosso estudo pode envolver
diversos mecanismos de ancoramento ou atividade bioquimica de vias que
estão intimamente associadas com a regulação da Cx43 e do receptor P2X 7,
como foi demonstrado nos ensaios moleculares de microarranjo de DNA.
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