Ministério da Saúde
FIOCRUZ
Fundação Oswaldo Cruz
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Computacional e de Sistemas
Sandro Leonardo Martins Sperandei
ESTRATÉGIAS DE INTEGRAÇÃO DE DADOS EM EXPERIMENTOS DE
MICROARRANJOS DE MRNA E DE MIRNA
Tese apresentada ao Instituto Oswaldo
Cruz como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor em Ciências
na área de Biologia Computacional e de
Sistemas.
Orientadores:
Dr. Wilson Savino
Dr. Milton Ozório Moraes
RIO DE JANEIRO
2013
Ficha Catalográfica
ii
Ministério da Saúde
FIOCRUZ
Fundação Oswaldo Cruz
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Computacional e de Sistemas
Sandro Leonardo Martins Sperandei
ESTRATÉGIAS DE INTEGRAÇÃO DE DADOS EM EXPERIMENTOS DE
MICROARRANJOS DE MRNA E DE MIRNA
Orientadores:
Prof. Dr. Wilson Savino
Prof. Dr. Milton Ozório Moraes
Aprovada em: 13/05/2013
EXAMINADORES:
Prof. Dr. Alberto Martín Rivera Dávila – Presidente
Prof. Dr. Flavio Fonseca Nobre
Prof. Dr. Christian Macagnan Probst
Rio de Janeiro, 13 de maio de 2013.
iii
Dedicatória
Este
trabalho
é
dedicado,
como
sempre,
aos
meus
maiores
patrocinadores e apoiadores: meus pais! Espero que sirva como uma pequena
retribuição por todo seu esforço ao longo de tantos anos...
Também dedico às pessoas que tanto tem me feito mudar e crescer:
Julianne Frenkiel, meu amor, e Luíza Frenkiel, meu bebê. Meu mundo só faz
sentido com vocês!
Para Apollo, meu maior amigo, que se foi cedo demais...
iv
Agradecimentos
Quebrando o protocolo, não iniciarei os agradecimentos com meus
orientadores. Acho que eles entenderão se eu começar pela pessoa mais
importante para a realização deste trabalho. Marcelo Ribeiro Alves, obrigado
por todo apoio desde sempre! Cada vez tenho mais certeza que, de fato, o
mundo seria melhor com mais pessoas como você. Jamais poderei retribuir
todo a ajuda ao longo de tantos anos.
Agora, sim! Gostaria de agradecer imensamente aos meus dois grandes
orientadores, Dr. Wilson Savino e Dr. Milton Ozorio Moraes. Acima de tudo,
agradeço a oportunidade que me deram e por terem me permitido seguir pelo
caminho da minha forma pouco usual. Tantas vezes lhes dei motivos para me
darem puxões de orelha e, surpreendentemente, exatamente nestes momentos
foi que encontrei mais compreensão e até elogios que nem acho que merecia...
A trajetória dos dois e o carinho que todos seus alunos demonstram por vocês
fala mais alto que qualquer agradecimento meu, mas junto minha voz à deles,
mesmo assim!
Agradeço à Dra. Eliane Corrêa-de-Santana, não só pelos dados do
experimento de mioblastos humanos que compõem parte deste trabalho (que
eu jamais seria capaz de coletar), mas também pelos momentos em que
dividimos todos as nossas reclamações na sala de pós-doc (onde eu estava de
intrometido que sou).
Dra. Leandrinha Lacerda, obrigado também pelos dados de células
epiteliais (que eu tampouco seria capaz de obter). Mas obrigado mesmo pelo
companheirismo ao longo de anos e anos! Obrigado pelas risadas divididas
nas caronas, que serviram para aliviar a alma nos momentos mais difíceis.
Obrigado a todos os pesquisadores e milhares de alunos do LPT. Não
sei bem porquê, mas sempre fui tão bem recebido (nas poucas vezes em que
aparecia)... Sid, lindona! Você também merece um agradecimento todo
especial! Sempre sorridente e prestativa, resolvendo meus problemas sempre
deixados para a última hora... Que você e seu pequeno recebam de volta muito
mais!
v
Fora do mundo acadêmico, tenho que agradecer aos heróis que
permanecem perto de mim, me aturando por tanto tempo, participando de
viagens, momentos incríveis e grandes “roubadas”. Prof. Marcelo Vieira e
Roberta Vieira, os chatinhos que eu adoro! Obrigado por sempre estarem por
perto! Prof. Bruno de Andrade e Renatinha Araújo, nossa amizade é fogo!
Literalmente! Prof. Marcelo Cabral, meu irmão escolhido, de quem nada
preciso falar! Profa. ariAnne Reis, que do outro lado do mundo, permanece
mais perto do que muitos. Obrigado a todos vocês por me ajudarem a manter a
pouca sanidade que me resta...
O maior agradecimento de todos, de novo, tem que ir para as minhas
meninas, os amores da minha vida... Vocês são minha maior razão para seguir
em frente. Nunca vou conseguir explicar o quanto amo as duas e quanto vocês
são importantes para mim...
vi
“And more, much more than this
I did it my way”
Paul Anka
vii
Lista de Figuras
Figura 1.1. Formação das fibras musculares estriadas. As células precursoras originam
diferentes populações de mioblastos (a, b e c). Alguns mioblastos (a) se alinham e fundem-se
formando os miotubos primários, que apresentam núcleos na região central e, iniciam a
síntese de miofibrilas que ocupam a região periférica no sarcoplasma do miotubo. Os
miotubos primários fornecem o suporte para a subseqüente formação dos miotubos
secundários, a partir de outra população de mioblastos (c). Posteriormente ocorre a separação
dos miotubos primários e secundários e a diferenciação em fibras primárias e secundárias. Os
núcleos das fibras migram para a região periférica da fibra e as miofibrilas passam a ocupar
todo o sarcoplasma. Alguns mioblastos (b), denominados de células satélites, não se fundem e
permanecem quiescentes entre a membrana plasmática da fibra e a lâmina basal. Extraído de
Silva e Carvalho(4). ........................................................................................................................ 4
Figura 1.2. Modelo simplificado da migração da migração do timócito, mostrando a entrada
das células precursoras, a migração e a saída do timócito maduro. Extraído de Savino e
Dardenne(19). ............................................................................................................................... 6
Figura 1.3. Esquema geral de construção de um experimento de microarranjo de cDNA. As
amostras extraídas de células de condições distintas são marcadas diferentemente,
combinadas e hibridizadas com um arranjo contendo sondas de DNA impressas em sua
superfície. Após a leitura da lâmina em um escâner confocal, é gerada uma imagem com o
grau de hibridização (fluorescência) de cada amostra em cada sonda. ....................................... 7
Figura 1.4. Exemplo de imagem gerada a partir de um experimento de microarranjo de cDNA já
colorida.......................................................................................................................................... 9
Figura 1.5. Processo de segmentação por morfologia matemática e localização dos spots em
microarranjos. A figura apresenta a imagem original do arranjo (a) e três diferentes métodos
de segmentação por morfologia matemática (b, c e d). Adaptado de Angulo e Serra(29). ....... 10
Figura 1.6. Exemplo de erro sistemático em experimento de microarranjo. Uma vez que
espera-se que a maioria dos genes não apresente expressão diferencial entre as condições, a
linha média da nuvem de pontos (em vermelho) deveria se localizar sobre o zero (linha preta).
A imagem mostra uma dominância sistemática em favor de uma das condições. .................... 12
Figura 3.1. Esquema ilustrativo da técnica de dye-swap. ........................................................... 22
Figura 3.2. Representação esquemática dos experimentos de microarranjos ........................... 23
Figura 3.3. Desenho experimental da análise de microarranjos no modelo de células epiteliais
tímicas de camundongos. Cada seta indica uma hibridização. Setas em sentidos opostos na
mesma comparação indicam experimento em dye-swap. ......................................................... 24
Figura 3.4. Substituição do nome das amostras pelos fatores representados no processo de
modelagem. Os efeitos estimados em cada comparação estão representados sobre a s setas.25
Figura 3.5. Fluxograma da análise de enriquecimento de mRNAs para detecção de miRNAs com
potencial expressão diferenciada. .............................................................................................. 30
Figura 4.1. Imagem representativa do resultado bruto de um experimento, identificando os
controles de hibridização. O eixo “M” apresenta a razão entre as condições, enquanto o eixo
“A” representa a média do sinal nas duas condições. Valores em escala log2. .......................... 33
Figura 4.2. Densidade da intensidade dos sinais obtidos das lâminas de microarranjo antes
(esquerda) e após (direita) a etapa de normalização entre arranjos, ou escalonamento, pelo
método quantile. Cada linha verde ou vermelha representa a distribuição de intensidades dos
viii
canais R e G de uma lâmina, independente da condição experimental, ou grupo experimental.
..................................................................................................................................................... 34
Figura 4.3. Relação dos 50 processos biológicos sobrerepresentados na comparação do perfil
de expressão gênica de mRNAs entre células musculares diferenciadas (miotubos) e nãodiferenciadas (mioblastos) com menor p-valor. A barra escura representa o número de genes
esperados por chance e a barra clara (por trás da escura) indica o número de genes
diferencialmente expressos observados em cada processo biológico enriquecido. O valor ao
final da barra indica o p-valor pelo teste hipergeométrico. ....................................................... 36
Figura 4.4. Processos biológicos destacados na comparação entre células musculares
diferenciadas (miotubo) e células musculares indiferenciadas (mioblastos). ............................ 37
Figura 4.5. Vias de expressão gênicas sobrerepresentadas na comparação entre células
musculares diferenciadas (miotubos) e não-diferenciadas (mioblastos). A barra escura
representa o número de genes esperados por chance e a barra clara (por trás da escura) indica
o número de genes diferencialmente expressos observados. O valor ao final da barra indica o
p-valor pelo teste hipergeométrico. ........................................................................................... 37
Figura 4.6. Distribuição das intensidades dos sinais das lâminas de miRNA antes (esquerda) e
após (direita) a etapa de pré-processamento. ............................................................................ 38
Figura 4.7. Rede de integrações miRNA-alvos para o hsa-miR-29b. Na figura da esquerda estão
representados todos os genes observados como DE no experimento de microarranjo e que são
alvos preditos do hsa-miR-29b segundo o miRBase Targets Release Version v5 para H. sapiens.
Na direita, representados apenas os genes DE associados a processos biológicos de interesse
(fig. 5.4). A escala de cores dos nós indica os valores de log fold-change (base 2) da expressão
desses genes entre as condições miotubo e mioblastos, enquanto o tamanho desses nós é
inversamente proporcional ao p-valor ou razão de falsa descoberta (FDR) dessa expressão
diferencial.................................................................................................................................... 40
Figura 4.8. Processos biológicos enriquecidos para o efeito da linhagem. A barra escura
representa o número de genes esperados ao acaso, enquanto a barra clara representa o
número de genes observados. O valor ao final da barra é o p-valor do teste hipergeométrico.42
Figura 4.9. Processos biológicos enriquecidos associados ao contato com o timócito. A barra
escura representa o número de genes esperados ao acaso, enquanto a barra clara representa
o número de genes observados. O valor ao final da barra é o p-valor do teste hipergeométrico.
..................................................................................................................................................... 43
Figura 4.10. Vias metabólicas enriquecidas pelo efeito do contato com o timócito. ................. 44
Figura 4.11. Processos biológicos enriquecidos na interação entre linhagem e timócito. A barra
escura representa o número de genes esperados ao acaso, enquanto a barra clara representa
o número de genes observados. O valor ao final da barra é o p-valor do teste hipergeométrico.
..................................................................................................................................................... 44
Figura 4.12. Rede de interações miRNA-mRNA, com os miRNAs preditos a partir da lista de
mRNAs subexpressos no efeito Linhagem. A escala de cores dos nós indica os valores de log
fold-change (base 2) entre a expressão desses genes entre células epiteliais tímicas corticais e
medulares, enquanto o tamanho desses nós é inversamente proporcional ao p-valor ou razão
de falsa descoberta (FDR) dessa expressão diferencial. ............................................................. 47
Figura 4.13. Interação entre o mmu-miR-196a e os seus alvos subexpressos no experimento de
mRNA. A escala de cores dos nós indica os valores de log fold-change (base 2) entre a
expressão desses genes entre células epiteliais tímicas corticais e medulares, enquanto o
ix
tamanho desses nós é inversamente proporcional ao p-valor ou razão de falsa descoberta
(FDR) dessa expressão diferencial............................................................................................... 48
Figura 4.14. miRNAs sobrexpressos enriquecidos no efeito da linhagem e selecionados para
confirmação por RT-PCR. A barra preta indica o número de alvos esperado para cada miRNA,
enquanto a barra cinza indica o número de alvos diferencialmente expressos no experimento
de mRNA. O valor ao final da barra representa o p-valor obtido pelo teste hipergeométrico. . 49
Figura 4.15. miRNAs subexpressos enriquecidos no efeito da linhagem e selecionados para
confirmação por RT-PCR. A barra preta indica o número de alvos esperado para cada miRNA,
enquanto a barra cinza indica o número de alvos diferencialmente expressos no experimento
de mRNA. O valor ao final da barra representa o p-valor obtido pelo teste hipergeométrico. . 50
Figura 4.16. miRNAs subexpressos enriquecidos no efeito do contato com o timócito. Abaixo,
miRNAs sobrexpressos. Acima, miRNAs subexpressos. Os cinco primeiros miRNAs de cada
conjunto foram selecionados para confirmação por RT-PCR. .................................................... 51
Figura 4.17. miRNAs subexpressos enriquecidos na interação linhagem x timócito e
selecionados para confirmação por RT-PCR. Abaixo, miRNAs sobrexpressos. Os quatro
primeiros sobrexpressos e os três primeiros subexpressos foram selecionados para
confirmação por RT-PCR. ............................................................................................................ 52
Figura 4.18. miRNAs selecionados no experimento com mioblastos com expressão confirmada
por RT-PCR. * - p<0,05; ** - p<0,01. “0d” – células CHQ não-diferenciadas. “7d” – células CHQ
após sete dias de diferenciação. ................................................................................................. 55
Figura 4.19. miRNAs selecionados no experimento com células epiteliais com expressão
confirmada por RT-PCR. “a” indica efeito de linhagem significativo; “b” indica efeito de contato
com o timócito significativo; “ab” indica efeito significativo de interação entre linhagem e
timócito. ...................................................................................................................................... 57
Figura 4.20. (Continuação) miRNAs selecionados no experimento com células epiteliais com
expressão confirmada por RT-PCR. “a” indica efeito de linhagem significativo; “b” indica efeito
de contato com o timócito significativo; “ab” indica efeito significativo de interação entre
linhagem e timócito. ................................................................................................................... 58
x
Lista de Tabelas
Tabela 4.1. miRNAs sobrerepresentados obtidos pelo processo de enriquecimento de miRNAs
para seus alvos preditos segundo o miRBase Targets Release Version v5 para H. sapiens
diferencialmente expressos no experimento de microarranjo. “Total” indica o total de alvos
preditos para o miRNA. “Esp” e “Obs” são, respectivamente, os números esperado e
observado de alvos preditos dentro da lista de genes DE. O p-valor apresentado foi obtido pelo
teste hipergeométrico................................................................................................................. 39
Tabela 4.2. Número de genes diferencialmente expressos. Genes sobrexpressos:
significativamente maior na primeira condição. Genes subexpressos: significativamente
menores na primeira condição. .................................................................................................. 41
Tabela 4.3. Número de miRNAs diferencialmente expressos. miRNAs sobrexpressos:
significativamente maior na primeira condição. miRNAs subexpressos: significativamente
menores na primeira condição. .................................................................................................. 45
Tabela 4.4. Número de miRNAs apontados como possíveis diferencialmente expressos pelo
processo de enriquecimento e grau de sobreposição em relação à lista de miRNAs obtida por
microarranjos. ............................................................................................................................. 45
Tabela 4.5. Listas dos miRNAs selecionados para validação de expressão por RT-PCR em tempo
real por expressão diferenciada no experimento de microarranjos de miRNA (Lâmina), por
meio da análise de enriquecimento ou pelos dois métodos simultaneamente. Os miRNAs
iniciados pelas letras “hsa” são provenientes do experimento com mioblastos, enquanto
aqueles iniciados por “mmu” são provenientes dos experimentos com células epiteliais. ....... 53
xi
Sumário
DEDICATÓRIA ...................................................................................................................................... IV
AGRADECIMENTOS ............................................................................................................................... V
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................................. VIII
LISTA DE TABELAS .................................................................................................................................XI
SUMÁRIO .............................................................................................................................................XII
RESUMO ................................................................................................................................................ 1
ABSTRACT .............................................................................................................................................. 2
1.
INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 3
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
1.6.
2.
OBJETIVOS ................................................................................................................................... 19
2.1.
2.2.
3.
DIFERENCIAÇÃO DE MIOBLASTOS HUMANOS......................................................................................... 3
O MICROAMBIENTE TÍMICO ............................................................................................................... 5
MICROARRANJOS DE CDNA ............................................................................................................... 6
INTEGRAÇÃO DE DADOS .................................................................................................................. 13
MICRORNAS ................................................................................................................................ 15
PREDIÇÃO DE EXPRESSÃO DE MIRNAS ............................................................................................... 17
GERAL ......................................................................................................................................... 19
ESPECÍFICOS .................................................................................................................................. 19
MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................................... 20
3.1.
AMOSTRAS ................................................................................................................................... 20
3.1.1.
Diferenciação de Mioblastos Humanos ............................................................................ 20
3.1.2.
Células Epiteliais Tímicas .................................................................................................. 21
3.2.
DESENHO EXPERIMENTAL DE MICROARRANJOS .................................................................................... 21
3.3.
ANÁLISE ESTATÍSTICA DE MICROARRANJOS ......................................................................................... 26
3.3.1.
Pré-Processamento e Detecção de Genes Diferencialmente Expressos ........................... 26
3.3.2.
Análise de Enriquecimento ............................................................................................... 27
3.4.
PREDIÇÃO E SELEÇÃO DE MIRNAS CANDIDATOS .................................................................................. 28
3.5.
CONFIRMAÇÃO POR RT-PCR EM TEMPO REAL .................................................................................... 31
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................................... 32
4.1.
DIFERENCIAÇÃO DE MIOBLASTOS HUMANOS....................................................................................... 32
4.1.1.
Microarranjos de mRNA ................................................................................................... 32
4.1.2.
Microarranjos de miRNA .................................................................................................. 38
4.1.3.
Seleção de miRNAs Candidatos ........................................................................................ 39
4.2.
CÉLULAS EPITELIAIS TÍMICAS ............................................................................................................ 41
4.2.1.
Microarranjos de mRNA ................................................................................................... 41
4.2.2.
Microarranjos de miRNA .................................................................................................. 45
4.2.3.
Seleção de miRNAs Candidatos ........................................................................................ 45
4.3.
COMPROVAÇÃO DE MIRNAS-CANDIDATOS POR RT-PCR EM TEMPO REAL ............................................... 52
5.
CONCLUSÃO ................................................................................................................................ 61
6.
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................... 62
7.
ANEXO 1 ...................................................................................................................................... 70
xii
LISTA DE GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS ................................................................................ 70
NO MODELO DE MIOBLASTOS HUMANOS. .......................................................................................... 70
8.
ANEXO 2 ...................................................................................................................................... 79
LISTA COMPLETA DE PROCESSOS BIOLÓGICOS E VIAS DE REGULAÇÃO GÊNICA DIFERENCIALMENTE
EXPRESSAS NO MODELO DE MIOBLASTOS HUMANOS ......................................................................... 79
9.
ANEXO 3 ...................................................................................................................................... 83
10.
ANEXO 4 .................................................................................................................................. 98
11.
ANEXO 5 ................................................................................................................................ 101
xiii
Resumo
OBJETIVO: Explorar as possibilidades analíticas de determinação da expressão
diferencial gênica, e de seu controle via miRNAs, a partir de dados de expressão
global, via microarranjos de DNA, e de experimentos comprovatórios, via RT-PCR
em tempo real, em modelo humano de diferenciação muscular in vitro, de mioblastos
a miotubos, e modelo murino in vitro/ex vivo de apresentação tímica de antígenos
via timócitos às células epiteliais corticais e/ou medulares. MÉTODOS: Inicialmente,
foram realizados experimentos de microarranjo de mRNA e miRNA em amostras de
mioblastos humanos e de células epiteliais tímicas de camundongo. Após análise
dos experimentos, em busca de mRNAs e miRNAs diferencialmente expressos (DE),
foram realizadas análises de enriquecimento dos mRNAs em busca dos processos
biológicos e vias de regulação gênica sobrerepresentados. A seguir, procedeu-se a
análise de enriquecimento em busca de miRNAs-candidatos à expressão
diferenciada a partir dos resultados dos experimentos de mRNA. Foi realizada uma
seleção de miRNAs-candidatos apontados pelos experimentos de microarranjos de
miRNA e do enriquecimento de miRNAs a partir dos microarranjos de mRNA e estes
foram submetidos à comprovação de expressão por RT-PCR em tempo real. O
número de miRNAs confirmados nas duas listas foi comparado. RESULTADOS: no
experimento comparando células musculares diferenciadas (miotubos) e nãodiferenciadas (mioblastos), foram encontrados 2029 mRNAs DE e 29 miRNAs DE.
Nos experimentos com células epiteliais de timo de camundongo, obtivemos 3026
mRNAs DE no efeito da linhagem (cTEC x mTEC), 70 mRNAs DE no efeito do
contato TEC x timócito, e 128 mRNAs DE como resultado da interação entre os
efeitos da linhagem e do contato com o timócito. Em relação aos miRNAs, foram
encontrados 30 miRNAs DE como efeito da linhagem, três miRNAs DE como efeito
do contato com o timócito e dois miRNAs DE como efeito da interação. Um total de
104 miRNAs foram selecionados para a comprovação, sendo 51 confirmados. A
comparação demonstrou que os miRNAs selecionados a partir das lâminas de
miRNA apresentam maior probabilidade de serem confirmados. CONCLUSÃO:
Apesar da seleção de miRNAs a partir do enriquecimento de mRNAs DE não ser tão
poderosa quanto aquela realizada a partir das lâminas de miRNA, esta mostra um
potencial interessante de agregar informação, apresentado a vantagem de não
possuir nenhum custo adicional.
1
Abstract
PURPOSE: To explore the analytical possibilities of gene differential expression
determination, and their control via miRNAs, from global expression data, via cDNA
microarrays and verification experiments, via real time RT-PCR, in a human model of
muscle in vitro differentiation of myoblasts to myotubes and murine model in vitro / ex
vivo antigen presentation via cortical and/or medullar thymic epithelial cells to
thymocytes. METHODS: Initially, microarray experiments of mRNA and miRNA were
performed in samples of human myoblasts and thymic epithelial cells of mice. After
analysis of experiments looking for mRNAs and miRNAs differentially expressed
(DE), enrichment analyses of mRNAs were performed looking for biological
processes and gene regulation pathways overrepresented. Then we proceeded to
the another enrichment analysis, to select candidate miRNAs for differential
expression from the results of the mRNA experiments. We performed a selection of
candidate miRNAs pointed by miRNA microarray experiments and enrichment of the
mRNA microarray and these were subjected to confirmation of expression by real
time RT-PCR. The number of confirmed miRNAs was compared in the two lists.
RESULTS: In experiment comparing differentiated (myotubes) and undifferentiated
(myoblasts) muscle cells, we found 2029 mRNAs and 29 miRNAs DE. In experiments
with thymic epithelial cells of mice, we obtained 3026 DE mRNAs related to the
lineage effect (CTEC vs. MTEC), 70 DE mRNAs related to the effect on thymocyte
contact, and 128 mRNAs as a result of the interaction between the effects of lineage
and thymocyte contact. Regarding miRNAs, 30 DE miRNAs were found to be related
to lineage effect, three DE miRNAs in the effect of contact with the thymocyte and
two DE miRNAs in the interaction of the effects. A total of 104 miRNAs were selected
for verification, with 51 confirmed. The comparison showed that miRNAs selected
from the miRNA microarray experiments are most likely to be confirmed.
CONCLUSION: Although the selection of miRNAs from the enrichment of DE mRNAs
was not as powerful as that made from the miRNA microarrays, the former shows an
interesting potential of aggregating information, since it has the advantage of no
additional cost.
2
1. Introdução
Para
investigar
a
possível
contribuição
do
uso
da
estratégia
de
enriquecimento de miRNAs à partir da informação de mRNA-alvos, disponível em
bancos de dados, e da expressão desses mRNA-alvos observada por experimento
de microarranjos de cDNA, sobre a expressão global observada de miRNAs,
também por experimento de microarranjos de cDNA, foram utilizadas informações de
expressão global de mRNA e de miRNA em dois modelos biológicos distintos. O
primeiro deles, diferenciação muscular em humanos, é um modelo em linhagem
muscular com grande modulação de expressão gênica esperada entre as condições,
mioblastos, células indiferenciadas, e miotubos, células diferenciadas in vitro. No
segundo modelo, epitelial tímico murino, esperam-se também grandes modulações
de expressão entre as linhagens celulares de fenótipos corticais e medulares, assim
como modulações mais sutis na modulação de expressão desses fenótipos
induzidas pelo contato com timócitos ex vivo. Ao fim, a confirmação da expressão de
alvos gênicos selecionados foi avaliada por meio de ensaios de RT-PCR em tempo
real.
1.1.
Diferenciação de Mioblastos Humanos
O músculo esquelético de mamíferos adultos é composto por um conjunto de
células musculares diferenciadas, fibras musculares, e um conjunto de célulassatélites, células progenitoras ainda não-diferenciadas(1,2). Quando estimuladas,
como após um trauma muscular, estas células satélites são ativadas, se proliferam e
se diferenciam em mioblastos, passando a se fusionar e se ligar às células
musculares maduras no seu entorno(1,3). Esse processo é ilustrado na Figura 1.1,
extraída de Silva e Carvalho(4).
A capacidade de proliferação e diferenciação das células-satélites as colocam
como uma interessante possibilidade na terapia de distrofias musculares(5,6) e já foi
demonstrada em modelos animais(7,8), mas não tem obtido o mesmo resultado em
humanos, provavelmente devido a fatores como a baixa capacidade proliferativa, a
alta taxa de morte e a indução de resposta imune no hospedeiro causada por este
tipo de célula(5).
3
Figura 1.1. Formação das fibras musculares estriadas. As células precursoras originam diferentes
populações de mioblastos (a, b e c). Alguns mioblastos (a) se alinham e fundem-se formando os
miotubos primários, que apresentam núcleos na região central e, iniciam a síntese de miofibrilas que
ocupam a região periférica no sarcoplasma do miotubo. Os miotubos primários fornecem o suporte para
a subseqüente formação dos miotubos secundários, a partir de outra população de mioblastos (c).
Posteriormente ocorre a separação dos miotubos primários e secundários e a diferenciação em fibras
primárias e secundárias. Os núcleos das fibras migram para a região periférica da fibra e as miofibrilas
passam a ocupar todo o sarcoplasma. Alguns mioblastos (b), denominados de células satélites, não se
fundem e permanecem quiescentes entre a membrana plasmática da fibra e a lâmina basal. Extraído de
Silva e Carvalho(4).
Um conhecimento ampliado da biologia deste processo de proliferação e
diferenciação celular pode otimizar a eficácia da terapia de transplante de
precursores miogênicos e um dos pontos importantes deste conhecimento é o
controle pós-transcricional promovido pelos miRNAs.
Diversos trabalhos têm demonstrado a ação de miRNAs no controle de
diferenciação de células musculares(9–11). O miR-206, por exemplo, é descrito
como desempenhando papel na estimulação da diferenciação de mioblastos
cultivados de camundongos e o seu nocaute impede a diferenciação destes
mioblastos(12–14). Também os miRNAs miR-1 e miR-133 se mostraram
diferencialmente expressos em camundongos, com o primeiro induzindo a
diferenciação e o segundo induzindo a proliferação celular(13). O miR-181 mostrouse muito expresso durante a fase final do processo de diferenciação(15), enquanto o
miR-27 se mostrou associado à regulação do equilíbrio entre proliferação e
diferenciação(16). Também mRNAs associados à codificação de proteínas de matriz
extracelular, envolvidas em inúmeros processos de proliferação e diferenciação
celular(17), são influenciados pela ação de miRNAs(18).
4
Assim, observa-se que o conhecimento sobre a expressão de diferentes
miRNAs em modelo de diferenciação de mioblastos humanos apresenta grande
importância, especialmente para a terapia de distrofias musculares.
1.2.
O Microambiente Tímico
O timo é um órgão linfóide responsável por um complexo processo de
diferenciação dos precursores de células T, os timócitos(19). Este processo envolve
a expressão sequencial de proteínas de membrana, assim como o rearranjo dos
genes que codificam o receptor de célula T, com seu produto final interagindo com
as proteínas do complexo principal de histocompatibilidade, expressas pelas células
do microambiente tímico(19–21).
Constituído como uma rede tridimensional com tipos celulares distintos, o
microambiente tímico tem no epitélio tímico o seu maior componente com a
capacidade única de determinar a geração de um repertório de células T diverso e
funcional(21–23). As células do epitélio tímico podem ser separadas em células
epiteliais tímicas corticais (cTEC) e células epiteliais tímicas medulares (mTEC),
cada uma reconhecida através de anticorpos monoclonais específicos(23).
O precursor de células T entra no timo através de vasos venosos, na junção
córtico-medular, desenvolvendo um intrincado percurso (Figura 1.2), passando pela
região cortical e medular, até voltar à circulação venosa já como timócito
maduro(19,21). Durante essa migração, o contato do timócito com as células do
microambiente tímico, especialmente com as células epiteliais, leva a célula
precursora à maturação com um de dois fenótipos: CD4 +CD8- ou CD4CD8+(19,21,22).
No entanto, a função de cada tipo celular no processo de diferenciação das
células T após sua entrada no timo e o efeito que a interação com o timócito
acarreta em cada tipo de célula epitelial são praticamente desconhecidos.
5
Figura 1.2. Modelo simplificado da migração da migração do timócito, mostrando a entrada das células
precursoras, a migração e a saída do timócito maduro. Extraído de Savino e Dardenne(19).
1.3.
Microarranjos de cDNA
O uso de microarranjos de cDNA na análise de expressão gênica de larga
escala remonta à década de 1990(24) e permite a comparação dos níveis de
expressão de milhares de genes simultaneamente em dois ou mais fenótipos
distintos no mesmo experimento(25). Ao contrário de técnicas de sequenciamento,
um microarranjo fornece a quantificação relativa da expressão dos genes, resultando
sempre da comparação entre duas condições de interesse ou entre uma condição
de interesse e uma condição controle.
Uma desvantagem do microarranjo está na necessidade de desenvolvimento
prévio de bibliotecas de cDNA ou oligonucleotídeos sintéticos, para serem usados
como sondas na confecção dos arranjos(26). Tal necessidade impede a descoberta
de novos miRNAs ou a exploração em organismos com o genoma não mapeado.
Entretanto, o custo de experimentos de microarranjo vem diminuindo ano após ano,
possibilitando um aumento no tamanho das amostras e maior poder estatístico(26).
Adicionalmente, alguns autores(27,28) sugerem que os resultados de microarranjos
são tão ou mais confiáveis que os de técnicas de sequenciamento, o que parece ser
reflexo de problemas nas etapas de preparação desta última técnica(27).
6
Figura 1.3. Esquema geral de construção de um experimento de microarranjo de cDNA. As amostras
extraídas de células de condições distintas são marcadas diferentemente, combinadas e hibridizadas
com um arranjo contendo sondas de DNA impressas em sua superfície. Após a leitura da lâmina em um
escâner confocal, é gerada uma imagem com o grau de hibridização (fluorescência) de cada amostra em
cada sonda.
Um experimento de microarranjo (Figura 1.3) inicia-se a partir da preparação
independente da lâmina, onde são fixadas as sondas, e das amostras de RNA
extraídas das células com as condições de interesse.
Em uma lâmina de vidro, dezenas de milhares de sondas são fixadas em um
arranjo matricial conhecido, de modo que cada ponto (spot) contenha sondas
referentes a um, e apenas um, gene de interesse. Este processo é automatizado e
exige grande precisão, de forma a otimizar o número de sondas por experimento. As
sondas são sequências genéticas de fita simples referentes aos genes.
Paralelamente, amostras de RNA total são extraídas de tecidos contendo uma
condição de interesse. Esse RNA passa por um processo de transcrição reversa,
passando a cDNA, de modo que possa se hibridizar com as sondas presentes na
lâmina de microarranjo. Esta amostra é marcada de maneira específica em relação à
condição. Os marcadores mais comuns são a cyanina-3 (Cy3) e a cyanina-5 (Cy5) e,
em geral, a primeira é utilizada para a condição controle, embora não haja
obrigatoriedade nessa associação e ela não tenha impacto na análise dos
resultados.
7
Uma segunda amostra, proveniente de uma condição com característica
diferente, é também preparada de maneira similar, mas marcada com o outro
marcador, de forma que o marcador passa a identificar cada condição. As duas
amostras são combinadas e a lâmina contendo as sondas é exposta a esta solução
para hibridização.
O microarranjo é um experimento de hibridização competitiva(29), onde as
fitas de cDNA das duas amostras vão competir pelas sondas que sejam
complementares a elas. Havendo complementaridade, as sequências marcadas são
fixadas à lâmina por meio das sondas. Após a hibridização e lavagem, somente as
sequências hibridizadas se mantêm fixas.
A lâmina é, então, lida em um escâner confocal a laser que bombardeia a
superfície com luz e lê a intensidade de cada marcador na superfície. A leitura é feita
de forma independente para cada marcador, de acordo com o comprimento de onda
da luz emitida.
O resultado é uma imagem da lâmina independente para cada condição
experimental, contendo a intensidade de luz em cada ponto, em diferentes tons de
cinza, dependendo da quantidade de hibridização daquela amostra em cada ponto.
As duas imagens são combinadas digitalmente e coloridas, sendo associada à Cy3
a cor verde e à Cy5 a cor vermelha. Assim, pontos contendo sondas de um gene
com expressão relativa predominante na condição marcada com Cy3 irão aparecer
com predominância da cor verde e a intensidade da cor indica o nível de expressão.
De forma inversa, pontos com predominância da condição Cy5 aparecerão na cor
vermelha. Naqueles pontos onde haja equilíbrio entre as condições, a cor amarela
será predominante e a cor preta identifica as sondas sem hibridização em nenhuma
das amostras. A Figura 1.4 mostra um exemplo de imagem resultante do processo.
8
Figura 1.4. Exemplo de imagem gerada a partir de um experimento de microarranjo de cDNA já colorida.
A imagem é, então, submetida a um processo de segmentação matemática
para identificação dos spots (Figura 1.5) e quantificação da intensidade do sinal
gerado (foreground). Este sinal está diretamente relacionado ao nível de expressão
do gene representado pela sonda presente no spot. O processo de segmentação
também permite a quantificação do ruído de fundo (background) gerado pelo efeito
da irradiação do escâner sobre a própria lâmina de vidro. Esta informação é
fundamental para a correção do sinal de cada ponto na etapa de pré-processamento
dos dados.
9
Figura 1.5. Processo de segmentação por morfologia matemática e localização dos spots em
microarranjos. A figura apresenta a imagem original do arranjo (a) e três diferentes métodos de
segmentação por morfologia matemática (b, c e d). Adaptado de Angulo e Serra(30).
Quantificado o sinal em cada spot, inicia-se o pré-processamento dos dados.
A primeira etapa do pré-processamento consiste na filtragem dos spots de baixa
qualidade. Embora o termo “qualidade” em microarranjo tenha um significado
bastante amplo, consideraremos aqui duas variáveis principais que apresentam
importante impacto no resultado do experimento: a uniformidade do spot e a relação
sinal-ruído (signal-to-noise ratio). A uniformidade do spot está associada à
distribuição dos pixels em sua superfície e pode ser afetada por problemas durante a
impressão da lâmina. Está uniformidade é fundamental para facilitar o processo de
análise da imagem e aumentar a acurácia da medida(31). A relação sinal-ruído diz
respeito a razão entre o sinal de hibridização detectado no spot (foreground) e o
ruído de fundo (background) obtido nas áreas ao redor do spot. A relação sinal-ruído
10
é usualmente calculada de duas formas diferentes. Na primeira, a diferença entre o
sinal de hibridização e o ruído de fundo é dividido pelo desvio-padrão do ruído de
fundo. Na segunda, a mediana do sinal de hibridização é dividido pela mediana do
ruído de fundo(32). Baixos valores para a relação sinal-ruído indicam spots de baixa
qualidade que devem ser excluídos da análise(33).
Após esta etapa do pré-processamento, com a retirada dos spots de baixa
qualidade, o nível de expressão será expresso como uma razão do sinal obtido em
cada condição. Na verdade, o valor utilizado será o logaritmo desta razão, de modo
a obtermos uma distribuição de intensidades simétrica e aproximadamente Normal.
Métodos de transformação adicionais devem ser aplicados aos dados como
forma de corrigir erros sistemáticos característicos de experimentos de microarranjo.
Como exemplo, é sabido que o escâner pode apresentar sensibilidade diferenciada
para cada um dos marcadores utilizados, ocasionando um viés artificial de
dominância de uma condição em relação à outra(34) (Figura 1.6). Esse efeito
também pode surgir por diferença na incorporação dos marcadores às amostras(35–
37). O método de transformação a ser aplicado irá depender das características dos
dados(38–40).
Após todas estas etapas, inicia-se a análise estatística dos resultados obtidos.
Embora a redução do custo de cada experimento tenha proporcionado um relativo
aumento no tamanho das amostras nos últimos dez anos (de uma a três amostras
para uma ou duas dezenas), os experimentos de microarranjos ainda têm a peculiar
característica de apresentarem um número de variáveis investigadas (genes) muito
superior ao número de amostras disponíveis(41).
11
Figura 1.6. Exemplo de erro sistemático em experimento de microarranjo. Uma vez que espera-se que a
maioria dos genes não apresente expressão diferencial entre as condições, a linha média da nuvem de
pontos (em vermelho) deveria se localizar sobre o zero (linha preta). A imagem mostra uma dominância
sistemática em favor de uma das condições.
Esta característica coloca uma grande limitação dos métodos estatísticos
tradicionais e novas abordagens, mais poderosas, são necessárias. Neste sentido, a
principal abordagem que tem sido utilizada é a Bayesiana Empírica (Empirical
Bayes), na qual a informação contida na lâmina, proveniente de todos ou de parte
dos genes, é utilizada na inferência de cada gene individualmente. Sperandei(42)
comparou a abordagem clássica com uma forma de inferência Bayesiana e mostrou
a superioridade da última, especialmente quando o número de amostras disponíveis
era limitado. Outros autores(43–45) demonstraram resultados semelhantes.
Por último, mas não menos importante, cabe lembrar que a grande vantagem
do experimento de microarranjo, que é a possibilidade de análise simultânea de
milhares de genes em diferentes condições, não vem sem um preço. A técnica de
microarranjos deve ser utilizada como uma técnica de screening, sendo necessária a
utilização posterior de métodos mais sensíveis para a comprovação dos seus
resultados. Uma das técnicas utilizadas com esse propósito é a técnica de RT-PCR
em tempo real. No entanto, a análise por microarranjo deve ainda ser sensível o
suficiente para não permitir a perda de informação, descartando um gene
12
importante, e específica o suficiente para reduzir o desperdício de se testar uma
grande quantidade de falso-positivos em experimentos de comprovação. Encontrar o
equilíbrio entre estas duas características é a parte mais difícil da análise.
1.4.
Integração de Dados
Com a solução para a análise estatística dos dados de microarranjos
oferecida pelos métodos de inferência Bayesiana, o atual desafio da técnica é a
interpretação dos resultados obtidos, extraindo informação de qualidade sobre as
condições experimentais analisadas em quantidade compatível com a quantidade de
resultados gerados.
A complexidade da regulação gênica dificulta a extração de informação a
partir da lista simples de genes diferencialmente expressos que é resultado de um
experimento de microarranjos(46). Um mesmo gene pode atuar em diferentes
processos biológicos e vias metabólicas, de modo que a ação que ele está
efetivamente desempenhando dependerá da sua interação com outros genes. De
forma inversa, um processo biológico é resultado da ação simultânea ou encadeada
de diversos genes, onde a ausência de expressão de um gene individual pode não
indicar o estado real deste processo. Ao se deparar com uma longa lista, contendo
algumas centenas, ou até alguns milhares, de genes diferencialmente expressos, o
pesquisador terá grande dificuldade de interpretar cada gene individualmente e
perderá, por certo, o papel das relações entre eles.
A partir da associação dos genes a todos os processos biológicos nos quais
ele toma parte, por exemplo, é possível tentar obter, de uma lista de genes
diferencialmente expressos oriunda de um experimento de microarranjo, os
processos biológicos possivelmente alterados na comparação entre as condições.
De forma geral, quanto maior o número de genes diferencialmente expressos
associados a um mesmo processo biológico, possivelmente, maior será a
importância daquele processo nas condições analisadas(46).
Esta abordagem funcional dos resultados de um microarranjo é conhecida
como análise de enriquecimento (gene set enrichment analysis) e se baseia na
sobrerepresentação de classes funcionais genéticas levando em conta a lista de
genes diferencialmente expressos observada(46,47).
13
Para este processo, bases de dados sobre informação genética como o
banco de ontologia genética (Gene Ontology – GO)(48) e a base KEGG (Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes)(49) são fundamentais, pois é de onde são
retiradas as informações sobre as relações entre os genes e os processos biológicos
dos quais tomam parte, as vias de regulação gênica em que atuam, suas funções
moleculares, etc.
A partir das relações funcionais dos genes, a busca será por processos
biológicos sobrerepresentados na lista de resultados. Por exemplo, se um processo
biológico está associado a, digamos, 10% dos genes do genoma humano, espera-se
que, na lista de genes diferencialmente expressos em um microarranjo, cerca de
10% da lista esteja também associada a este processo. Quando o número de genes
presentes na lista de diferencialmente expressos associados a um processo é
significativamente maior do que aquele esperado por chance, consideramos este
processo sobrerepresentado e dizemos que o processo está enriquecido na
comparação entre as condições consideradas. O princípio básico por trás da técnica
de integração de dados está no fato de que nenhum processo biológico ocorre pela
ação isolada de um único gene, mas sim de um conjunto de genes atuando de forma
combinada. De modo semelhante, nenhum gene atua em um processo biológico
apenas, mas em vários. A análise conjunta de todos os genes pode proporcionar
uma visão mais clara do que está ocorrendo em um organismo em uma determinada
condição ou instante.
A determinação de quando o número de genes associados é superior ao
esperado é realizada a partir do teste hipergeométrico, representado na Equação
1.1, onde N é o número total de genes no genoma, K é o número de genes
associados a um processo particular de interesse no genoma completo, n é o
número de genes na lista de genes diferencialmente expressos e x é o número de
genes da lista associados ao processo de interesse. O binômio
a
 
b
indica o número
de combinações possíveis de a elementos em grupos de b elementos.
Equação 1.1:
 K  N  K 
 

x  n  x 

P  X  x | N , K , n 
N
 
n
14
Um ponto importante a ressaltar é que o teste hipergeométrico acima leva em
conta tanto os genes sobrexpressos quanto os subexpressos, indicando alteração
no processo como um todo. Adicionalmente, ele é aplicado de forma unilateral, ou
seja, apenas os processos sobrerepresentados serão considerados, mas não
aqueles sub-representados. O motivo disso é que nem todos os processos
biológicos
e
vias
metabólicas
estarão
representados
na
lista
de
genes
diferencialmente expressos.
1.5.
MicroRNAs
A descoberta dos miRNAs abriu um mundo de novas possibilidades para a
análise de expressão de larga escala. A antiga estrada única que ia de um gene até
a proteína, passando pelo mRNA, possui agora múltiplas vias secundárias e
transversais. Os miRNAs, embora não sejam codificantes para proteínas, podem
causar profundo impacto na expressão destas, através da repressão póstranscricional dos mRNAs. Desconhecidos até há pouco mais de uma década, a
busca pela compreensão dos mecanismos de ação destas pequenas sequências de
nucleotídeos tem crescido ano após ano.
MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs com comprimento aproximado
entre 20 e 25 nucleotídeos(50). Apresentam a característica de não serem
codificantes para proteínas e atuarem de forma bastante singular, na regulação póstranscricional da expressão gênica. A expressão incorreta de miRNAs é capaz de
mimetizar fenótipos de perda de função dos mRNAs-alvos(51) e os miRNAs já foram
relacionados à ocorrência de diversos processos biológicos e patogênicos, como
diabetes(52) e câncer(53).
Conhecidos desde o início da década de 1990, apenas há menos de dez anos
é que se tornaram foco de atenção maior na biologia molecular. Inicialmente, apenas
dois miRNAs estavam descritos na literatura (lin-4 e let-7) e acreditava-se que eram
exemplos únicos específicos de C. elegans, único organismo para o qual haviam
sido descritos(51). Esta posição mudou apenas em 2001, quando três grupos de
pesquisadores(54–56) descreveram, independentemente, cerca de 100 novos
miRNAs, sendo alguns conservados em organismos filogeneticamente distantes
como moscas e humanos. Atualmente, mais de 10.000 miRNAs estão descritos, e
destes, mais de 600 descritos em mamíferos, com um grande número ainda
15
esperado como resultado da utilização de técnicas cada vez mais avançadas de
biologia molecular e bioinformática.
Não obstante o grande desenvolvimento que tem sido observado no
conhecimento dos miRNAs, ainda restam importantes e desafiadoras tarefas a
serem completadas. Embora seja certo que os miRNAs atuem na repressão de seus
mRNAs-alvo(57), há relatos de sua atuação na ativação de alvos(58). Há também
um grande debate sobre a forma de sua atuação na regulação pós-transcricional da
célula. O entendimento inicial era de que eles agiriam em animais através do
bloqueio da tradução do mRNA, enquanto em plantas a ação seria através da
degradação do mRNA(51). No entanto, evidências mais recentes têm demonstrado,
especialmente em animais, que ambas as formas podem ocorrer num mesmo
organismo(59). Por exemplo, o miRNA lin-4 pode inibir a ação de seus alvos lin-14 e
lin-28 sem provocar alteração na abundância destes mRNAs na célula(60). Porém, o
resultado esperado é a associação inversa entre a abundância de miRNAs e de
seus mRNAs-alvos(61). Complicando ainda mais, o mRNA-alvo pode agir inibindo a
transcrição do miRNA, gerando um processo de biofeedback negativo(51), ou seja, a
abundância do mRNA-alvo atua reprimindo a maturação do miRNA, impedindo que
este bloqueie a expressão do mRNA-alvo.
Além de toda a dificuldade apresentada na relação entre cada miRNA e cada
alvo, os miRNAs ainda reservam uma peculiaridade que adiciona enorme grau de
complexidade para a sua análise. Diferente do usual, a paridade das bases
nitrogenadas entre um miRNA e seu alvo não precisa ser perfeita para que sua
função seja desempenhada(60). Existem pelo menos três locais principais nas
extremidades do miRNA onde o pareamento com o mRNA-alvo deve ser perfeito,
chamadas de regiões sementes, independentemente do pareamento do resto da
sequência(62,63). Desta forma, um miRNA pode ter ação sobre um número grande
de alvos e um mRNA-alvo pode sofrer a ação de diferentes miRNAs, proporcionando
grande flexibilidade na ação sobre o organismo. Porém, esta flexibilidade põe
grande dificuldade na definição de alvos para os miRNAs, assim como no estudo do
efeito da expressão de um miRNA sobre seu alvo, pois a função de um miRNA pode
estar sendo desempenhada por outro que aja sobre o mesmo alvo.
Alguns autores defendem que o grau de pareamento miRNA–mRNA é
determinante na ação do miRNA(51). Assim, quando o pareamento se dá exclusiva
16
ou quase exclusivamente na região semente, o miRNA atuaria no bloqueio da
tradução do mRNA. Por outro lado, quando a complementaridade é perfeita ou
quase perfeita, a ligação do miRNA culminaria na degradação do mRNA-alvo. No
entanto, existem evidências de que esta relação não é universal(59), sendo possível
que mesmo o pareamento perfeito não resulte na degradação do mRNA, sugerindo
que o principal mecanismo de ação seja o bloqueio da tradução, independente do
grau de complementaridade. Este bloqueio pode ocorrer tanto antes como após o
início da tradução(59).
1.6.
Predição de Expressão de miRNAs
A análise funcional de miRNAs oferece desafio maior, quando comparada à
análise dos mRNAs, pois o efeito dos miRNAs se dá de forma indireta, como visto, a
partir de sua ação sobre os mRNAs. Adicionalmente, uma vez que um miRNA pode
ter diversos mRNAs como alvo e um mRNA pode sofrer a ação de um grande
número de miRNAs, a simples análise dos resultados de expressão em um
experimento de miRNA acaba gerando mais dúvidas do que informação. Por outro
lado, mesmo a análise de experimentos simultâneos de miRNA e mRNA pode ser
insuficiente para extrair toda a riqueza de informação disponível, uma vez que
diferenças temporais na expressão dos genes podem ainda ocultar processos
importantes. Assim, torna-se necessária, além da análise dos dois tipos de
expressão, a utilização combinada de técnicas estatísticas aplicadas diretamente
aos resultados e de técnicas de bioinformática para o enriquecimento da análise.
Outra utilização da bioinformática é a inferência sobre miRNAs a partir dos
resultados de mRNAs. Experimentos de análise de expressão de larga escala, como
os microarranjos, são experimentos de varredura global, que apresentam uma alta
taxa de falsos-positivos. Posteriormente à sua realização, os resultados precisam ser
comprovados por técnicas mais sensíveis, como a RT-PCR em tempo real. No
entanto, seriam os miRNAs apontados por um microarranjo os únicos candidatos a
uma expressão diferenciada? A abordagem que foi avaliada neste trabalho se
baseia na utilização da análise de enriquecimento para predição de miRNAs
diferencialmente expressos que não foram localizados nos experimentos de
microarranjos de miRNA e que podem ser apontados a partir dos resultados dos
arranjos de mRNA. Desta forma, seria possível obter informação sobre o
comportamento dos miRNAs apenas realizando experimentos de mRNA ou
17
acrescentar informação aos experimentos de miRNA realizados. Embora esta
abordagem já tenha sido utilizada com outros fins, até o momento, não se tem
conhecimento de investigações sobre a quantidade de informação que pode ser
obtida por uma ou outra abordagem.
Este procedimento de predição seguiu, em linhas gerais, a mesma ideia
central da análise de enriquecimento. Entretanto, ao invés de listar, para cada
mRNA diferencialmente expresso encontrado, por exemplo, os processos biológicos
ou vias de regulação gênicas associadas, foram definidos quais miRNAs que
apresentavam aquele mRNA em especial descrito como alvo. Um miRNA que
apresenta uma proporção de seus alvos alterados maior do que o esperado ao
acaso seria assim, possivelmente, um miRNA que teria também seu nível de
expressão alterado e no sentido oposto do mRNA.
18
2. Objetivos
2.1.
Geral
Explorar as possibilidades analíticas de determinação da expressão
diferencial gênica, e de seu controle via miRNAs, a partir de dados de expressão
global, via microarranjos de DNA, e de experimentos comprovatórios, via RT-PCR
em tempo real, em modelo humano de diferenciação muscular in vitro, de mioblastos
a miotubos, e modelo murino in vitro/ex vivo de apresentação tímica de antígenos
via timócitos às células epiteliais corticais e/ou medulares.
2.2.

Específicos
Comparar o perfil de expressão gênica (miRNA e mRNA) de células corticais
e medulares do epitélio tímico de camundongos, expostas ou não ao contato
com timócitos;

Comparar o perfil de expressão gênica (miRNA e mRNA) entre mioblastos
humanos diferenciados e indiferenciados;

Comparar a capacidade da integração de detectar miRNAs diferencialmente
expressos nos modelos testados;

Investigar a quantidade de informação que pode ser acrescentada aos
resultados das lâminas de miRNA pelo procedimento de integração de
dados.
19
3. Materiais e Métodos
Foram selecionados dois modelos biológicos bastante distintos para a
aplicação das abordagens aqui utilizadas. O objetivo desta diversidade é
proporcionar uma maior extrapolação dos resultados obtidos, de modo que eles
possam ser aplicados a diferentes modelos biológicos. Assim, utilizamos linhagens
humanas de mioblastos diferenciados in vitro (miotubos) e não-diferenciados e
células murinas tímicas de linhagem corticais e medulares. Temos aqui modelos
biológicos em diferentes espécies (Homo sapiens e Mus musculus), com alteração
de expressão entre condições variando entre grandes magnitudes (ex. entre
miotubos e mioblastos), médias magnitudes (ex. entre células tímicas corticais e
medulares) e pequenas magnitudes (ex. entre células tímicas expostas e não
expostas ao contato com timócitos).
3.1.
Amostras
3.1.1. Diferenciação de Mioblastos Humanos
Foram utilizados cultivos de linhagens de mioblastos humanos, CHQ,
primariamente isolados por Edom et al.(64) do músculo quadríceps normal. A origem
das células foi determinada a partir de células satélites de tecido muscular
esquelético, além do fato de poderem se diferenciar in vitro formando fibras
musculares
(miotubos).
Trabalhos
conjuntos
com
nosso
laboratório(65–67)
determinaram a possibilidade de utilização destas células como precursores
miogênicos, sendo capazes de formar fibras musculares após transplante em
camundongos. Também o fenótipo destas células foi recentemente determinado em
nosso Laboratório, em termos de expressão de marcadores de mioblastos e de
expressão de receptores de matriz extracelular, assim como de expressão de cmet(66), tratando-se uma preparação de células-tronco humanas tecido-específicas,
e cujas características morfofuncionais básicas estão bem estabelecidas.
Culturas de células CHQ diferenciadas (miotubos), foram obtidas após o
cultivo de precursores de mioblastos humanos (cultura de células CHQ
indiferenciadas) com meio DMEM sem SBF após 7 dias de cultivo. Tais preparações
foram utilizadas para a detecção da expressão de RNAs mensageiros (mRNA) e
miRNAs, antes e depois da diferenciação de mioblastos humanos em miotubos.
20
A extração de mRNAs e dos miRNAs foi feita com kit “mirVana TM miRNA
Isolation” (Ambion), e a qualidade das amostras foi analisada através do 2100
Bioanalyzer (Agilent) utilizando dois chips: RNA nano chip e Small RNA chip.
3.1.2. Células Epiteliais Tímicas
Utilizamos as seguintes linhagens de células epiteliais tímicas (TEC) murinas:
1.4C18, com fenótipo de TEC cortical, e 3.10, com fenótipo de TEC medular,
originalmente geradas por Mizuochi et al.(68). Estas células apresentam marcadores
típicos de córtex e medula, respectivamente, incluindo expressão diferencial de
citoqueratinas, conforme visto em nosso próprio Laboratório(69). Além disso, foi
evidenciado que ambas são capazes de interagir com linfócitos(70), mas apenas as
células medulares estariam relacionadas com a diferenciação de células CD4
simples positivas antígeno-específicas(68). Vale dizer ainda, que estas células
medulares expressam constitutivamente o gene Aire(71), principal responsável pela
transcrição promíscua de antígenos no timo, a qual está relacionada com o controle
de geração de timócitos com potencial auto-reativo.
Por conseguinte, as linhagens acima descritas podem ser consideradas como
representativas de TEC corticais e medulares do timo de camundongos, conforme
revisado pelos autores que as produziram(72).
Ambas as linhagens foram cultivadas com RPMI 1640 (Mediatech, Herndon,
VA) acrescido de 10% de soro bovino fetal (Cultilab, Campinas, SP) a 37° C e em
atmosfera com 5% de CO2.
O RNA das duas linhagens foi extraído utilizando o kit “mirVana miRNA
Isolation” (Ambion) e as amostras foram analisadas utilizando o 2100 Bioanalyzer
(Agilent) para comprovação da qualidade, utilizando os chips do tipo RNA Nano Chip
e Small RNA Chip.
3.2.
Desenho Experimental de Microarranjos
Nos experimentos de microarranjos de mRNA foram utilizadas lâminas Agilent
4 x 44k, contendo quatro arranjos de 44 mil pontos cada. Dentre as 44 mil sondas de
cada um dos quatro arranjos, encontramos replicatas técnicas de sondas referentes
a genes e também controles de hibridização. Estas duas características são de
grande importância para assegurar a qualidade do resultado do experimento, pois as
21
replicatas técnicas garantem que a expressão de um determinado gene não seja tão
afetada por ruídos que podem ocorrer durante o experimento, como problemas
localizados de hibridização. Por outro lado, os controles de hibridização são
sequências que não apresentam qualquer relação com o genoma avaliado e que
são incorporadas às amostras de modo a observar a qualidade do processo de
hibridização. Os controles negativos permitem uma melhor avaliação do ruído de
fundo da lâmina (background), associado à hibridização não-específica, enquanto os
controles positivos permitem avaliar a qualidade da hibridização ao longo do
espectro de intensidade de sinal e em diferentes razões de expressão.
Cada arranjo das lâminas do experimento de mRNA foi hibridizado com a
combinação dois-a-dois dos tipos celulares descritos (mioblastos não diferenciados,
miotubos, cTEC, mTEC, cTEC+Ty, mTEC+Ty). Os desenhos experimentais foram
equilibrados, utilizando a estratégia de dye-swapping para contrabalançar o efeito de
incorporação do marcador nas amostras, pois esta nem sempre se dá de maneira
uniforme(35–37,73), além de a sensibilidade do scanner a cada marcador não ser
sempre a mesma(34). Uma ilustração desta estratégia pode ser vista na Figura 3.1,
para melhor entendimento. De forma simples, em cada lâmina, cada amostra recebe
um ou outro marcador, de maneira alternada. Foram realizadas seis comparações,
com três replicatas biológicas em dye-swap.
Figura 3.1. Esquema ilustrativo da técnica de dye-swap.
Os experimentos de miRNA foram realizados em lâminas Agilent MicroRNA
Microarrays, cada uma contendo oito arranjos idênticos com 740 sequências de
miRNA. Nos experimentos de miRNA, as lâminas utilizadas eram monocromáticas e
cada um dos oito arranjos de cada lâmina recebeu amostra de uma condição.
Assim, foram hibridizadas três replicatas biológicas de cada condição e uma
22
replicata adicional de cada, contendo o pool das três anteriores, num total de quatro
amostras por condição.
Tanto para os experimentos de mRNA, quanto para os experimentos de
miRNA, foi utilizada uma abordagem de modelagem linear dos efeitos dos fatores.
Assim, iniciando pela comparação de mioblastos humanos, a expressão observada
em cada spot é dada pela combinação linear da média da expressão desse spot
entre as diferentes condições (efeito médio) mais o (in)decremento de expressão
atribuído à condição de referência (mioblasto) ou à condição “diferenciado” (efeito da
diferenciação), de acordo com a equação abaixo
log 2  yij   0  1Dif  eij
Equação 3.1:
, onde log2(yij) é o valor normalizado, log-transformado, da expressão do gene i na
condição j, para j igual a 0 ou 1, respectivamente para as condições de referência
(mioblasto) e “diferenciado” (miotubo), β0 é o intercepto da função linear, β1 é o
coeficiente angular da função linear, e eij é o erro aleatório de log2(Yij).
Esquematicamente, o experimento pode ser representado como na Figura
3.2, onde cada retângulo representa uma amostra e cada seta representa uma
lâmina. A orientação da seta representa o marcador da amostra. As setas em
sentidos opostos ilustram o efeito da abordagem em dye-swap.
CHQ x CHQ Dif
CHQ
CHQ Dif
CHQ Dif x CHQ
Figura 3.2. Representação esquemática dos experimentos de microarranjos
Com este desenho em mente, podemos representar o experimento, de forma
matemática, com a Equação 3.2 e Equação 3.3.
Equação 3.2:
CHQ xCHQDif  0   0  1Dif    1Dif
Equação 3.3:
CHQDif xCHQ  0  1Dif   0   1Dif
As equações acima apresentam resultados de módulo igual, embora os sinais
sejam diferentes, resultado do uso da técnica de dye-swap. A diferença no sinal não
tem implicação para a avaliação do efeito e é corrigida durante o processo de
análise.
23
Para os experimentos de miRNA, o mesmo padrão acima foi seguido,
conforme dito anteriormente. Uma diferença fundamental é que os experimentos de
miRNA foram realizados utilizando lâminas monocromáticas. Assim, cada condição
foi hibridizada em um arranjo independente e a comparação entre condições foi feita
utilizando o modelo de comparação indireta, que tende a reduzir o poder estatístico
devido ao aumento da variabilidade(73).
O desenho dos experimentos de microarranjos de mRNA e miRNA do modelo
de células epiteliais tímicas se deu de forma bastante similar àquela utilizada nos
experimentos de mioblastos humanos. A maior diferença, além da óbvia utilização
de genomas diferentes, está no desenho experimental. O modelo utilizando células
epiteliais tímicas é mais complexo, pois envolve dois fatores principais (Linhagem e
Contato com timócito) e a possível interação entre esses. Cada uma das
comparações analisadas fornece informação para um ou mais fatores. O desenho
experimental pode ser visto na Figura 3.3.
mTEC x mTEC+Ty
mTEC
mTEC+Ty
cTEC x mTEC
mTEC+Ty x cTEC+Ty
mTEC x cTEC
cTEC+Ty x mTEC+Ty
mTEC+Ty x mTEC
cTEC x cTEC+Ty
cTEC
cTEC+Ty
cTEC+Ty x cTEC
Figura 3.3. Desenho experimental da análise de microarranjos no modelo de células epiteliais tímicas de
camundongos. Cada seta indica uma hibridização. Setas em sentidos opostos na mesma comparação
indicam experimento em dye-swap.
Novamente, tanto para os experimentos de mRNA, quanto para os
experimentos de miRNA, foi utilizada uma abordagem de modelagem linear.
Diferente do modelo de reta empregado na comparação de mioblastos humanos (ver
Equação 3.1), temos agora um modelo dado por um hiperplano de dimensão igual a
3, onde a expressão observada em cada spot é dada pela combinação linear da
média da expressão desse spot entre as diferentes condições (efeito médio) mais o
(in)decremento de expressão atribuído ao efeito da linhagem, mais o (in)decremento
de expressão atribuído ao efeito do contato com o linfócito, mais o (in)decremento
24
de expressão atribuído à interação dos efeitos principais linhagem e contato com o
linfócito, de acordo com a equação abaixo:
log 2  yijk   0  1a j  2bk  3ab jk  eijk
Equação 3.4:
, onde, à semelhança da Equação 3.1, log2(yijk) é o valor normalizado, logtransformado, da expressão do gene i na condição jk, para j igual a 0 ou 1,
respectivamente para as condições de referência (mTEC) e cTEC, para o efeito da
linhagem a, e k igual a 0 ou 1, respectivamente para a ausência ou presença de
contato da célula epitelial tímica com o linfócito, para o efeito do contato com o
timócito b. β0 é o intercepto da função linear, dada pela expressão média de mTEC
sem contato com o timócito, β1 é o coeficiente angular da dimensão do efeito a, β2 é
o coeficiente angular da dimensão do efeito b, e β3 é o coeficiente angular da
dimensão do efeito de interação entre os efeitos principais a e b, enquanto eijk é o
erro aleatório de log2(yijk).
Para facilitar a compreensão, na Figura 3.4 substituímos os nomes indicativos
da origem das amostras pelo seu significado no processo de modelagem linear
(Equação 3.4), partindo da utilização das amostras mTEC como amostras de
referência.
Fator b
β0 + β2b
β0 + β1a
β0 + β1a + β2b+
β3ab
Fator a
Interação
β0
Fator b + Interação
Figura 3.4. Substituição do nome das amostras pelos fatores representados no processo de modelagem.
Os efeitos estimados em cada comparação estão representados sobre a s setas.
Aqui, a análise pela modelagem linear dos efeitos traz a vantagem do
aumento do tamanho das amostras ao estimar cada efeito principal, possibilitando
maior poder estatístico na detecção de mRNAs ou miRNAs diferencialmente
25
expressos (DE). Fica claro, pois, que as diferentes hibridizações representadas na
figura 4.4 equivalem, com menor rigor matemático para maior simplicidade, às
equações a seguir:
Equação 3.5:
cTEC x mTEC  0  1a  0  1a
Equação 3.6:
mTEC  Ty x mTEC  0  2b  0  2b
Equação 3.7:
cTEC  Ty x cTEC  0  1a  2b  3ab   0  1a   2b  3ab
Equação 3.8:
cTEC  Ty x mTEC  Ty  0  1a  2b  3ab   0  2b   1a  3ab
, ou de sinal contrário para as hibridizações correspondentes em dye-swap.
Novamente,
o
mesmo
desenho
experimental
foi
seguido
para
os
experimentos de miRNA com células epiteliais tímicas, ainda que também estas
sejam monocromáticas, assim como na comparação de mioblastos.
3.3.
Análise Estatística de Microarranjos
3.3.1. Pré-Processamento e Detecção de Genes Diferencialmente
Expressos
Toda a etapa de análise estatística, desde o pré-processamento até a análise
de enriquecimento, foi realizada utilizando o programa R(74), versão 2.15.2. Na
etapa de pré-processamento e análise estatística foram utilizados ainda os pacotes
“Agi4x44PreProcess”(75), “hgug4112a.db”(76), “mgug4122a.db”(77) e “limma”(78).
O primeiro é um pacote de funções de pré-processamento típicas para laminas da
Agilent de 4 x 44 k sondas, que permite, entre outros, a eliminação de sondas
correspondentes à controles de hibridização, o resumo das intensidades de sondas
replicadas nos arranjos pela média aritmética dessas, a análise de qualidade dos
arranjos por meio de estatísticas e gráficos. Os dois seguintes dizem respeito às
anotações sobre o genoma humano e murinho à partir da identificação das sondas
Agilent impressas nos respectivos arranjos. O quarto pacote de funções contem
funções específicas para análise de dados de microarranjos via modelos lineares.
A análise dos experimentos de microarranjo foi iniciada pela filtragem do sinal
obtido pelo escaneamento das lâminas. Foram considerados a uniformidade dos
poços, saturação do sinal e relação sinal-ruído, de modo a selecionar apenas as
sondas com boa qualidade de sinal. Após a análise exploratória das sondas
26
selecionadas, optou-se por não fazer a correção do sinal de background(79), a
normalização dentro de cada arranjo pelo método global lowess (locally estimated
weighted sum of squares)(80), e entre os arranjos, pelo método quantile(81).
O método lowess ajusta curvas de regressão linear locais, utilizando uma
janela móvel, para corrigir erros aditivos ou multiplicativos que possam estar
presentes no sinal. Estes erros podem surgir por defeitos locais no arranjo
ocasionados por partículas em suspensão, por exemplo, ou por problemas de
incorporação dos marcadores pelas amostras, entre outros fatores. Para uma
revisão sobre métodos de normalização e seus impactos nos resultados de um
experimento de microarranjo, ver Sperandei(42).
Uma vez que em cada arranjo existia mais de uma sonda (poço) para cada
gene, o passo seguinte foi a união do sinal das sondas replicadas para um mesmo
gene, através da média aritmética do sinal entre réplicas. Para a comparação das
condições, foi utilizado o teste t modificado proposto inicialmente por Loennstedt e
Speed(82) e aprimorado posteriormente(83,84). Este teste utiliza uma abordagem
Bayesiana empírica (empirical Bayes) para combinar a informação obtida de outros
genes na inferência feita para cada gene, corrigindo a variância dos genes e
aumentando sua capacidade de detecção de genes diferencialmente expressos.
Devido ao grande número de genes analisados simultaneamente, foi feita
uma correção para testes múltiplos em cada comparação, através do controle da
taxa de falsa descoberta (false discovery rate - FDR)(85), menos conservadora que
as técnicas de correção do erro total (family wise error) e, por isso, mais poderosa.
Foram considerados diferencialmente expressos aqueles mRNAs ou miRNAs que
apresentaram FDR igual ou inferior a 0,05. Esta abordagem é similar,
qualitativamente, a dizer que o gene era considerado diferencialmente expresso
quando o p-valor corrigido era menor ou igual a 0,05.
3.3.2. Análise de Enriquecimento
Após a determinação dos mRNAs diferencialmente expressos, foi realizada a
análise de enriquecimento de ontologias, mais especificamente de processos
biológicos e vias de regulação gênicas, a fim de reconhecer processos e vias
sobrerepresentados na lista de mRNAs diferencialmente expressos em relação aos
genes observados nas lâminas, usando para esse fim as bibliotecas de anotação
27
relacionando os identificadores das sondas aos identificadores Entrez, e esses aos
processos biológicos descritos no The Gene Ontology database(48) (GO, disponível
em http://www.geneontology.org/) e às vias de regulação gênicas descritas no Kyoto
Encyclopedia
of
Genes
and
Genomes(49)
(KEGG,
disponível
em
www.genome.jp/kegg/). Nesta etapa, utilizamos o teste hipergeométrico para
determinar os processos biológicos e vias de regulação gênicas mais representados
na lista de genes diferencialmente expressos encontrada em cada efeito(46). Os
pacotes “GOstats”(47), “annaffy”(86), “genefilter”(87) e “Category”(88), além do
próprio “limma”(78) também foram incluídos nesta etapa. Esses trazem as funções
de manipulação e anotação necessárias ao processamento dos dados.
Inicialmente, é feita uma busca no banco relacional no formato SQLite contido
no pacote de anotação da lâmina para os processos biológicos associados a cada
mRNA. Posteriormente, é determinada a probabilidade de sobrerepresentação ou
enriquecimento, ao acaso, do total de vezes que um dado processo surgiu
associado
aos
mRNAs
diferencialmente
expressos
(geneset)
levando
em
consideração o total de vezes que esse mesmo processo estava associado a todos
os genes observados no arranjo (universo). Sempre que o p-valor é menor que 0,01,
este processo é considerado como “enriquecido”. Por isso, essa análise é também
comumente referida como Geneset Enrichment Analysis (GSEA)(47).
O p-valor mais baixo para esta etapa se deve ao fato de que aqui não será
realizada correção para testes múltiplos.
3.4.
Predição e Seleção de miRNAs Candidatos
Seguindo a ideia descrita na seção “Predição de Expressão de miRNAs”, a
análise
de
enriquecimento,
similar
à
apresentada
no
item
“Análise
de
Enriquecimento” para processos biológicos no conjunto de genes diferencialmente
expressos em cada efeito de interesse, foi também utilizada na predição dos
miRNAs que apresentariam, possivelmente, uma alteração de expressão.
A partir da lista de mRNAs DE obtida para cada efeito ajustado à partir dos
experimentos de microarranjo, para cada miRNA foi importada do miRBase Targets
Release Version v5 (disponível em http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgibin/targets/v5/download.pl), para os organismos H. sapiens e M. musculus, e
geradas a partir do algoritmo miRAnda(89). Após mapeamento de ambos os
28
identificadores dos mRNAs observados nos experimentos de microarranjo e os
identificadores dos alvos de regulação por miRNAs do banco miRBAse para o
identificador Entrez, via pacotes de anotação, e usando como geneset a lista de
mRNAs DE em cada efeito de interesse ajustado, realizamos análises de
enriquecimentos de miRNAs que, segundo o banco miRBase, tinham como alvo de
regulação os mRNAs DE sobre ou subexpressos, em análises independentes,
levando em consideração a informação de regulação de todos os miRNAs com
todos os mRNAs observados nas lâminas de microarranjo. A partir dessa análise de
enriquecimento, realizada através do pacote CORNA(90), foi determinada a
probabilidade de que, ao acaso, uma tal quantidade de alvos para um miRNA
estivesse presente na lista de mRNAs diferencialmente expressos considerando-se
a informação de regulação de todos os miRNAs com todos os mRNAs observados
nas lâminas de microarranjo. Um miRNA foi considerado como potencialmente
diferencialmente expresso sempre que essa probabilidade era inferior a 0,05. Cabe
salientar aqui que a opção pela utilização da informação de predição de regulação
miRNA-mRNA do banco miRBase Targets Release Version v5 nessa etapa, e não
de outro banco de predição de regulação miRNA-mRNA, ou ainda da interseção da
informação de dois ou mais bancos de predição de regulação miRNA-mRNA, se deu
pela maior sensibilidade de predição desse, e consequentemente pela maior
interseção do universo de busca, dado pela lista de todos os mRNAs observados
nas lâminas de microarranjo, com a lista de alvos de regulação por miRNAs
presentes nesse banco. Assumimos pois, que a baixa especificidade esperada da
utilização desse banco, ou de bancos individuais de predição de regulação miRNAmRNA, qualquer que fosse esse, se dá de forma aleatória para os diferentes
miRNAs e, portanto, não interferiria na seleção efetuada.
A análise foi realizada de forma independente para mRNAs sobrexpressos na
busca de miRNA enriquecidos potencialmente subexpressos, e vice versa,
resultando em listas de miRNAs preditos como subexpressos (regulando mRNAs DE
sobrexpressos)
e
miRNAs
preditos
subexpressos
(regulando
mRNAs
DE
subexpressos). Esta divisão foi feita com base na ação de bloqueio póstranscricional dos miRNAs, geralmente aceita(57). Desta forma, foram criadas duas
listas de miRNAs preditos para cada efeito avaliado.
29
Devido ao excessivo número de miRNAs diferencialmente expressos
encontrado, tanto por meio dos arranjos de miRNA, quanto pela análise de
enriquecimento, se tornou economicamente necessária a seleção de um subgrupo
de miRNAs para serem submetidos à confirmação de expressão por RT-PCR em
tempo real. Esta seleção foi realizada por dois especialistas, um em cada
experimento, com base no conhecimento sobre o funcionamento dos sistemas e nos
processos biológicos e vias metabólicas associados aos mRNAs e miRNAs. O
fluxograma desta análise está representada na Figura 3.5.
Lista de mRNAs
Subexpressos
Lista de miRNAs
Sobrexpressos
Enriquecimento
(pacote CORNA)
miRNAs Enriquecidos
Sobrexpressos
Seleção de
Candidatos
Seleção de
Candidatos
Lista de Candidatos
para Confirmação
Confirmação por
RT-PCR em tempo
real
Figura 3.5. Fluxograma da análise de enriquecimento de mRNAs para detecção de miRNAs com potencial
expressão diferenciada.
Embora este procedimento de seleção de subgrupos para confirmação por
RT-PCR em tempo real possa representar uma limitação metodológica na análise
30
dos resultados obtidos pelas duas formas de seleção, ele foi necessário para
viabilizar o experimento.
3.5.
Confirmação por RT-PCR em Tempo Real
A expressão dos microRNAs foi observada através de RT-PCR em tempo real
utilizando placas de PCR array customizadas (SABiosciencie, Qiagen), contendo 96
poços ocupados, de acordo com o experimento, por microRNAs de interesse e
pequenos RNAs controles. A síntese do DNA complementar (cDNA) e a amplificação
por PCR foi feita utilizando o kit RT2 miRNA First Strand e RT2 SYBR Green qPCR
Master Mix (SABioscience, Qiagen), que contém todos os reagentes para a reação
de transcriptase reversa, de acordo com as instruções dos fabricantes. O aparelho
utilizado foi o StepONE Plus (Applied Biosystems) para as reações de amplificação
em tempo real.
31
4. Resultados e Discussão
4.1.
Diferenciação de Mioblastos Humanos
4.1.1. Microarranjos de mRNA
Inicialmente, torna-se necessária a análise da qualidade do processo de
hibridização realizado. A Figura 4.1 mostra um exemplo representativo do resultado
de hibridização obtido. Como pode ser observado, os controles positivos apresentam
expressão diferenciada, enquanto os negativos encontram-se localizados próximos
ao extremo esquerdo do eixo de intensidades (eixo A), pois estes controles são, na
verdade, pontos sem DNA e sua expressão é resultado, apenas, do sinal de
background da lâmina. Cabe destacar ainda os spots marcados como “darkcorner” e
“brightcorner”, que são controles de intensidade do sinal, sem variação no nível de
expressão diferencial. Assim, a posição esperada para estes controle é próxima ao
valor zero do eixo M, mas afastados entre eles no eixo A.
32
Figura 4.1. Imagem representativa do resultado bruto de um experimento, identificando os controles de
hibridização. O eixo “M” apresenta a razão entre as condições, enquanto o eixo “A” representa a média
do sinal nas duas condições. Valores em escala log2.
A partir dos dados brutos gerados pelos experimentos de microarranjos de
mRNA, foi iniciada a etapa de pré-processamento dos dados. Esta etapa incluiu a
filtragem e normalização dos dados, visando a retirada dos spots incluídos como
controle de qualidade na lâmina de microarranjo, os spots de baixa qualidade (baixa
relação sinal-ruído) e correção de ruídos inerentes ao experimento (e.g.,
sensibilidade diferenciada do scanner ao marcador, que pode ser vista como
curvaturas na Figura 4.1 acima). O resultado final global desta etapa pode ser visto
na Figura 4.2. A etapa de pré-processamento é fundamental para a qualidade dos
resultados obtidos em experimentos de microarranjos, de modo a controlar as fontes
de variabilidade presentes em um experimento de microarranjo, como efeitos de
33
saturação, flutuações na quantidade de sonda, hibridação não específica e outras,
que dão origem a erros de medida(38,81,91).
Figura 4.2. Densidade da intensidade dos sinais obtidos das lâminas de microarranjo antes (esquerda) e
após (direita) a etapa de normalização entre arranjos, ou escalonamento, pelo método quantile. Cada
linha verde ou vermelha representa a distribuição de intensidades dos canais R e G de uma lâmina,
independente da condição experimental, ou grupo experimental.
Uma vez que o esperado em um experimento de microarranjos é que a
maioria absoluta dos genes não apresente expressão diferenciada, ao analisarmos a
expressão em conjunto de todos os genes, espera-se que sua distribuição seja
semelhante, independentemente da condição analisada (Figura 4.2). O que
podemos notar na imagem da esquerda é que, mesmo após a etapa de
normalização dentro de cada arranjo, nesse caso obtida após a normalização global
lowess(92), existe ainda uma variação entre lâminas, relacionada às características
do experimento (quantidade de marcador incorporado às amostras, hibridização não
específica, etc). Após a etapa de normalização entre arranjos (imagem da direita),
nesse caso obtida pelo método
quantile(93), observamos uma excelente
concordância ente as distribuições globais das intensidades normalizadas e
34
escalonadas de todos os arranjos do experimento, permitindo assim a comparação
entre arranjos de diferentes condições experimentais de interesse.
Passada a etapa de pré-processamento, e atestada a boa qualidade dos
dados gerados, foi dado início à análise estatística dos dados de expressão nas
condições de interesse. Foram observados, na comparação entre células
musculares diferenciadas (miotubos) e não-diferenciadas (mioblastos), um total de
2029 genes diferencialmente expressos, sendo 948 genes subexpressos e 1081
genes sobrexpressos em miotubos. A lista completa dos genes diferencialmente
expressos nesta comparação se encontra no Anexo 1. Entre estes genes
encontramos alguns altamente modulados, como actinina alfa 2 (log 2 foldchange=5,84; p<0,001), já descrita como fundamental no processo de diferenciação
do mioblasto(94). Também o gene para a titina, a maior proteína humana e com
expressão restrita ao músculo estriado(95) mostrou elevada expressão nos nossos
resultados (log2 fold-change=5,54; p<0,001). Entre os genes diferencialmente
expressos encontramos diversos membros da família das lamininas e da família das
integrinas, famílias já descritas como importantes na regulação do processo de
diferenciação de mioblastos(66,96). A análise destes resultados do ponto de vista
biológico é tarefa árdua, devido à sua grande quantidade e não é o foco principal
deste trabalho.
De posse da lista de genes diferencialmente expressos, procedeu-se a
análise de enriquecimento funcional, observando a possível sobrerepresentação de
processos biológicos e vias de regulação gênicas no conjunto de genes
selecionados.
Foram observados 106 processos biológicos sobrerepresentados (a Figura
4.3 apresenta os 50 com menor p-valor e o Anexo 2 apresenta a lista completa). Foi
selecionado um subgrupo de processos associados à diferenciação de mioblastos,
entre eles os processos cell adhesion, cell-matrix adhesion, signaling, regulation of
cell adhesion e integrin-mediated signaling pathway (Figura 4.4). Já em relação às
vias de regulação gênicas, foram observadas 12 vias sobrerepresentadas,
apresentadas na Figura 4.5.
35
Figura 4.3. Relação dos 50 processos biológicos sobrerepresentados na comparação do perfil de
expressão gênica de mRNAs entre células musculares diferenciadas (miotubos) e não-diferenciadas
(mioblastos) com menor p-valor. A barra escura representa o número de genes esperados por chance e a
barra clara (por trás da escura) indica o número de genes diferencialmente expressos observados em
cada processo biológico enriquecido. O valor ao final da barra indica o p-valor pelo teste
hipergeométrico.
36
Figura 4.4. Processos biológicos destacados na comparação entre células musculares diferenciadas
(miotubo) e células musculares indiferenciadas (mioblastos).
Figura 4.5. Vias de expressão gênicas sobrerepresentadas na comparação entre células musculares
diferenciadas (miotubos) e não-diferenciadas (mioblastos). A barra escura representa o número de genes
esperados por chance e a barra clara (por trás da escura) indica o número de genes diferencialmente
expressos observados. O valor ao final da barra indica o p-valor pelo teste hipergeométrico.
37
4.1.2. Microarranjos de miRNA
O mesmo efeito do pré-processamento observado nas lâminas de mRNA
também pode ser observado nos experimentos de miRNA, garantindo a boa
qualidade dos resultados obtidos. Este sucesso fica demonstrado na Figura 4.6
onde, a exemplo do ocorrido nos experimentos de mRNA, o processo de
normalização foi capaz de corrigir distorções entre as lâminas.
Figura 4.6. Distribuição das intensidades dos sinais das lâminas de miRNA antes (esquerda) e após
(direita) a etapa de pré-processamento.
É importante lembrar que, neste caso, as lâminas foram monocromáticas.
Assim, cada linha representa um arranjo independente.
Foram observados 11 miRNAs sobrexpressos neste experimento e 18
miRNAs subexpressos em miotubos. Entre estes, destacam-se os hsa-miR-206,
hsa-miR-1 e hsa-miR-133b como miRNAs com alta diferença de expressão no
processo de diferenciação (log fold change > 4). Estes três miRNAs já foram
38
descritos como relacionados ao processo de diferenciação de mioblastos, sendo
denominados de MyoMirs(12–14,97–99).
4.1.3. Seleção de miRNAs Candidatos
A partir dos mRNAs diferencialmente expressos, utilizando a abordagem de
enriquecimento de miRNAs em relação aos alvos preditos, segundo o miRBase
Targets Release Version v5 para H. sapiens, foi possível apontar um grande número
de miRNAs que, a julgar pelo comportamento do conjunto dos seus alvos preditos,
poderiam apresentar modulação de expressão durante a diferenciação de
mioblastos. Embora alguns destes miRNAs já tivessem aparecido nos experimentos
de microarranjo, outros não apresentaram expressão diferencial, o que pode ter
ocorrido por limitações técnicas do primeiro experimento (reduzido poder estatístico,
por exemplo) ou por motivos biológicos (observação da redução na abundância do
mRNA-alvo, mas não mais na do miRNA, por exemplo).
Através do processo de enriquecimento de miRNAs para seus alvos preditos
diferencialmente expressos foram apontados 52 miRNAs candidatos, sendo 24
sobrexpressos e 28 subexpressos. A lista completa dos miRNAs apontados como
sobrerepresentados são mostrados na Tabela 4.1.
Tabela 4.1. miRNAs sobrerepresentados obtidos pelo processo de enriquecimento de miRNAs para seus
alvos preditos segundo o miRBase Targets Release Version v5 para H. sapiens diferencialmente
expressos no experimento de microarranjo. “Total” indica o total de alvos preditos para o miRNA. “Esp”
e “Obs” são, respectivamente, os números esperado e observado de alvos preditos dentro da lista de
genes DE. O p-valor apresentado foi obtido pelo teste hipergeométrico.
Sobrexpressos
miRNA
Total Esp
hsa-miR-877
425
49
hsa-miR-124
517
60
hsa-miR-197
225
26
hsa-miR-521
280
32
hsa-miR-339-3p
311
36
hsa-miR-629
425
49
hsa-miR-511
242
28
hsa-miR-602
296
34
hsa-miR-604
268
31
hsa-miR-376c
306
35
hsa-miR-93
551
64
hsa-miR-375
269
31
hsa-miR-328
261
30
hsa-miR-129-5p
270
31
hsa-miR-512-5p
263
30
Obs
69
81
40
46
50
65
40
47
43
48
80
43
41
42
41
p
0,002
0,002
0,003
0,008
0,009
0,010
0,011
0,013
0,015
0,016
0,016
0,016
0,024
0,026
0,026
miRNA
hsa-miR-499-5p
hsa-miR-29b
hsa-miR-29c
hsa-miR-196ª
hsa-miR-369-3p
hsa-miR-590-5p
hsa-miR-891ª
hsa-miR-628-5p
hsa-miR-187
hsa-miR-433
hsa-miR-299-5p
hsa-miR-629
hsa-miR-582-5p
hsa-miR-338-5p
hsa-miR-208b
Subexpressos
Total Esp
251
25
329
33
617
61
509
50
258
26
328
32
316
31
293
29
459
45
251
25
252
25
428
42
263
26
330
33
254
25
Obs
43
51
84
69
39
46
44
41
60
36
36
56
37
44
35
p
0,000
0,001
0,001
0,004
0,004
0,009
0,012
0,014
0,014
0,014
0,015
0,017
0,017
0,024
0,026
39
hsa-miR-886-5p
hsa-miR-28-5p
hsa-miR-423-3p
hsa-miR-525-3p
hsa-miR-127-5p
hsa-miR-615-5p
hsa-miR-647
hsa-miR-518a-3p
hsa-miR-363
296
306
314
339
255
324
287
388
478
34
35
36
39
29
37
33
45
55
45
46
47
50
39
48
43
56
67
0,031
0,035
0,035
0,039
0,039
0,039
0,042
0,043
0,049
hsa-miR-876-5p
hsa-miR-137
hsa-miR-519c-3p
hsa-miR-10ª
hsa-miR-135ª
hsa-miR-496
hsa-miR-376b
hsa-miR-374ª
hsa-miR-147b
hsa-miR-218
hsa-miR-607
hsa-miR-586
hsa-miR-549
264
291
371
461
525
224
286
349
305
254
220
238
282
26
29
37
46
52
22
28
35
30
25
22
24
28
36
39
48
58
65
31
38
45
40
34
30
32
37
0,028
0,030
0,030
0,031
0,031
0,033
0,035
0,037
0,038
0,041
0,043
0,044
0,044
Após o processo de seleção de candidatos, os miRNAs sobrerepresentados
e seus alvos preditos foram graficamente representados na forma de redes de
interações miRNA-alvos. Exemplos de redes de interações miRNA-alvos podem ser
observadas na Figura 4.7, representando diferentes redes de interações para o
miRNA hsa-miR-29b. Na figura da esquerda, estão representados todos os alvos
diferencialmente expressos no experimento de microarranjo para o miRNA,
enquanto na
figura da direita, foram mantidos apenas aqueles associados aos
processos de interesse biológico para a comparação em questão.
Figura 4.7. Rede de integrações miRNA-alvos para o hsa-miR-29b. Na figura da esquerda estão
representados todos os genes observados como DE no experimento de microarranjo e que são alvos
preditos do hsa-miR-29b segundo o miRBase Targets Release Version v5 para H. sapiens. Na direita,
representados apenas os genes DE associados a processos biológicos de interesse (fig. 5.4). A escala de
cores dos nós indica os valores de log fold-change (base 2) da expressão desses genes entre as
condições miotubo e mioblastos, enquanto o tamanho desses nós é inversamente proporcional ao pvalor ou razão de falsa descoberta (FDR) dessa expressão diferencial.
Entre os 27 miRNAs selecionados para confirmação por RT-PCR em tempo
real, 16 estavam presentes na lista de miRNAs DE dos experimentos de
40
microarranjos, nove são oriundos da lista de miRNAs sobrerepresentados, um
estava presente nas duas listas e outro se mostrou enriquecido como miRNA
sobrexpresso e subexpresso.
4.2.
Células Epiteliais Tímicas
4.2.1. Microarranjos de mRNA
Assim como no experimento de diferenciação de mioblastos humanos, o
experimento com células epiteliais tímicas mostrou excelente qualidade, com os
pequenos ruídos inerentes à técnica sendo satisfatoriamente corrigidos na etapa de
pré-processamento dos dados de microarranjos.
Em resumo, foram observados 3224 genes DE nos três efeitos de interesse,
ou seja, efeito da linhagem, efeito do contato com timócitos e interação entre os dois
efeitos primários, utilizando linhagens de células epiteliais tímicas murinas (1.4C18,
com fenótipo de TEC cortical, e 3.10, com fenótipo de TEC medular). A Tabela 4.2
apresenta os números de genes de acordo com os efeitos de interesse. A lista
completa dos genes diferencialmente expressos no arranjo pode ser observada no
Anexo 3 e Anexo 4.
Tabela 4.2. Número de genes diferencialmente expressos. Genes sobrexpressos: significativamente
maior na primeira condição. Genes subexpressos: significativamente menores na primeira condição.
Efeito
Linhagem
Timócito
Interação
Linhagem x Timócito
Significado
Efeito de cTEC em relação a mTEC
Efeito do contato com timócito
Interação do efeito de cTEC com o
efeito do timócito
Sobrexpressos
1701
66
103
Subexpressos
1325
4
25
Conforme esperado, o efeito da linhagem foi o que gerou um maior número
de genes diferencialmente expressos. No total, de 21 processos biológicos se
mostraram sobrerepresentados no conjunto de genes diferencialmente expressos
observados (Figura 4.8). Isso indica que, para estes processos biológicos, havia
uma proporção maior de genes no conjunto de genes diferencialmente expressos do
que o esperado ao acaso quando consideramos a proporção de genes pertencentes
a estes processos no conjunto de genes presente no arranjo. Dentre os processos
41
enriquecidos, destacamos a adesão celular (cell adhesion) e a morfogênese de
estrutura anatômica (anatomical structure morphogenesis).
Figura 4.8. Processos biológicos enriquecidos para o efeito da linhagem. A barra escura representa o
número de genes esperados ao acaso, enquanto a barra clara representa o número de genes
observados. O valor ao final da barra é o p-valor do teste hipergeométrico.
Em relação às vias de regulação gênicas, obtidas da base de dados KEGG,
apenas uma via se mostrou enriquecida (metabolic pathways).
O efeito global do contato das células epiteliais tímicas com timócitos
observado foi o de aumento no nível de expressão dos genes modulados (Anexo 4).
A análise de enriquecimento apontou alteração de 39 processos biológicos (Figura
4.9). Aqui, é interessante notar que, apesar de apresentar uma quantidade
relativamente menor de genes modulados em consequência do efeito da linhagem,
estes genes estão mais concentrados em torno dos mesmos processos biológicos, o
que é evidenciado pelo maior número de processos enriquecidos. Foram ainda
observadas seis vias de regulação gênicas enriquecidas, apresentadas na Figura
4.10, donde destacamos o enriquecimento da via de regulação gênica relativa ao
processamento e apresentação de antígenos (antigen processing and presentation).
42
Figura 4.9. Processos biológicos enriquecidos associados ao contato com o timócito. A barra escura
representa o número de genes esperados ao acaso, enquanto a barra clara representa o número de
genes observados. O valor ao final da barra é o p-valor do teste hipergeométrico.
43
Figura 4.10. Vias de regulação gênica enriquecidas pelo efeito do contato com o timócito.
A interação entre os efeitos da linhagem e do contato com o timócito
apresentou genes diferencialmente expressos concentrados em um número menor
de processos biológicos e vias de regulação gênicas. Foram observados 15
processos biológicos enriquecidos (Figura 4.11) e apenas duas vias de regulação
gênicas, a via de lúpus eritematoso sistêmico (systemic lupus erythematosus) e de
leishmaniose (leishmaniasis).
Figura 4.11. Processos biológicos enriquecidos na interação entre linhagem e timócito. A barra escura
representa o número de genes esperados ao acaso, enquanto a barra clara representa o número de
genes observados. O valor ao final da barra é o p-valor do teste hipergeométrico.
44
4.2.2. Microarranjos de miRNA
Assim como no experimento de diferenciação de mioblastos humanos, o
experimento de microarranjos de miRNA com células epiteliais tímicas demonstrou
excelente qualidade, como evidenciado pelos dados obtidos após a etapa de préprocessamento.
O número de miRNAs diferencialmente expressos para cada efeito encontrase descrito na Tabela 4.3. A lista completa dos miRNAs diferencialmente expressos
no arranjo encontra-se no Anexo 5.
Tabela 4.3. Número de miRNAs diferencialmente expressos. miRNAs sobrexpressos: significativamente
maior na primeira condição. miRNAs subexpressos: significativamente menores na primeira condição.
Efeito
Linhagem
Timócito
Interação
Significado
Efeito de cTEC em relação a mTEC
Efeito do contato com o timócito
Efeito da interação entre cTEC e o
contato com o timócito
Sobrexpressos
15
2
0
Subexpressos
15
1
2
4.2.3. Seleção de miRNAs Candidatos
Através do processo de enriquecimento de miRNAs para seus alvos preditos,
segundo o miRBase Targets Release Version v5 para M. musculus, diferencialmente
expressos foram apontados 332 miRNAs (Tabela 4.4), dos quais 68 tinham alvos
envolvidos com os processos biológicos destacados. Ainda na Tabela 4.4,
encontramos o grau de sobreposição entre os miRNAs encontrados nos
experimentos
de
microarranjos
e
aqueles
apontados
pelo
processo
de
enriquecimento a partir das listas de mRNAs diferencialmente expressos.
Tabela 4.4. Número de miRNAs apontados como possíveis diferencialmente expressos pelo processo de
enriquecimento e grau de sobreposição em relação à lista de miRNAs obtida por microarranjos. Os
micros apontados como “Ambos” não são contados nas categorias “Lâmina” ou “Predito”.
Efeito
Linhagem
Timócito
Interação
Lâmina
14
3
2
miRNAs DE
Predito Ambos
217
19
19
0
16
0
miRNAs Selecionados
Lâmina Predito Ambos
9
49
19
0
10
0
0
7
0
A Figura 4.12 representa a rede de interação entre os mRNAs subexpressos
na comparação das linhagens e os miRNAs preditos pelo processo de
enriquecimento de miRNAs para seus alvos preditos diferencialmente expressos.
45
Devido ao grande número de mRNAs encontrados nesta comparação, como
esperado, tivemos também um grande número de miRNAs preditos, de modo que a
visualização da imagem por completo se torna pouco informativa. Uma simplificação
da Figura 4.12, isolando apenas o miRNA mmu-miR-196a, é apresentada na Figura
4.13, onde vemos o mmu-miR-196a, predito por enriquecimento a partir da lista de
mRNAs significativamente sobrexpressos, e seus alvos preditos segundo o miRBase
Targets Release Version v5 para M. musculus. Uma vez que tantos alvos para um
mesmo miRNA tenham sido observados com expressão elevada, espera-se que a
expressão deste miRNA esteja reduzida, ainda que tenhamos uma alta razão de
falsos positivos
As Figuras Figura 4.14 e Figura 4.15 apresentam a lista completa dos
miRNAs enriquecidos a partir da lista de mRNAs significativamente subexpressos e
sobrexpressos, respectivamente, segundo o miRBase Targets Release Version v5
para M. musculus, associados ao efeito da linhagem.
.
46
Figura 4.12. Rede de interações miRNA-mRNA, com os miRNAs preditos a partir da lista de mRNAs subexpressos no efeito Linhagem. A escala de cores dos nós indica
os valores de log fold-change (base 2) entre a expressão desses genes entre células epiteliais tímicas corticais e medulares, enquanto o tamanho desses nós é
inversamente proporcional ao p-valor ou razão de falsa descoberta (FDR) dessa expressão diferencial.
47
Figura 4.13. Interação entre o mmu-miR-196a e os seus alvos subexpressos no experimento de mRNA. A
escala de cores dos nós indica os valores de log fold-change (base 2) entre a expressão desses genes
entre células epiteliais tímicas corticais e medulares, enquanto o tamanho desses nós é inversamente
proporcional ao p-valor ou razão de falsa descoberta (FDR) dessa expressão diferencial.
48
Figura 4.14. miRNAs sobrexpressos enriquecidos no efeito da linhagem e selecionados para confirmação
por RT-PCR. A barra preta indica o número de alvos esperado para cada miRNA, enquanto a barra cinza
indica o número de alvos diferencialmente expressos no experimento de mRNA. O valor ao final da barra
representa o p-valor obtido pelo teste hipergeométrico.
49
Figura 4.15. miRNAs subexpressos enriquecidos no efeito da linhagem e selecionados para confirmação
por RT-PCR. A barra preta indica o número de alvos esperado para cada miRNA, enquanto a barra cinza
indica o número de alvos diferencialmente expressos no experimento de mRNA. O valor ao final da barra
representa o p-valor obtido pelo teste hipergeométrico.
50
De modo semelhante, a Figura 4.16 mostra todos os miRNA enriquecidos em
relação ao efeito do contato com o timócito. A figura seguinte (Figura 4.17)
apresenta a mesma informação para a interação entre linhagem e timócito.
Figura 4.16. miRNAs subexpressos enriquecidos no efeito do contato com o timócito. Abaixo, miRNAs
sobrexpressos. Acima, miRNAs subexpressos. Os cinco primeiros miRNAs de cada conjunto foram
selecionados para confirmação por RT-PCR.
51
Figura 4.17. miRNAs subexpressos enriquecidos na interação linhagem x timócito e selecionados para
confirmação por RT-PCR. Abaixo, miRNAs sobrexpressos. Os quatro primeiros sobrexpressos e os três
primeiros subexpressos foram selecionados para confirmação por RT-PCR.
4.3.
Comprovação de miRNAs-Candidatos por RT-PCR em Tempo
Real
Foram selecionados 27 miRNAs do experimento de diferenciação de
mioblastos humanos e 77 miRNAs dos experimentos com células epiteliais tímicas
murinas para comprovação de expressão por RT-PCR em tempo real. A aparente
discrepância em relação ao somatório das listas apresentadas anteriormente se dá
porque alguns miRNAs aparecem em mais de um efeito ou aparecem no
enriquecimento duas vezes (sobrexpresso e subexpresso). Do total de 104 miRNAs
candidatos, 26 foram selecionados a partir dos resultados das lâminas de
microarranjo de miRNA, 58 foram selecionados a partir do enriquecimento dos
resultados dos microarranjos de mRNA e 20 foram selecionados em comum nas
duas estratégias. A Tabela 4.5 apresenta a lista dos miRNA candidatos à
comprovação, identificando a estratégia pela qual ele foi selecionado (Lâmina,
Integração, Ambos). Todos os miRNAs iniciados por “hsa” são oriundos do
52
experimentos com mioblastos humanos e aqueles iniciados por “mmu” são
provenientes dos experimentos com células epiteliais tímicas.
Tabela 4.5. Listas dos miRNAs selecionados para validação de expressão por RT-PCR em tempo real por
expressão diferenciada no experimento de microarranjos de miRNA (Lâmina), por meio da análise de
enriquecimento ou pelos dois métodos simultaneamente. Os miRNAs iniciados pelas letras “hsa” são
provenientes do experimento com mioblastos, enquanto aqueles iniciados por “mmu” são provenientes
dos experimentos com células epiteliais.
Lâmina
Enriquecimento
Ambos
hsa-miR-1
hsa-miR-124
hsa-miR-29b
hsa-miR-133ª
hsa-miR-196a
mmu-let-7d
hsa-miR-133b
hsa-miR-29c
mmu-let-7i
hsa-miR-155
hsa-miR-499-5p
mmu-miR-107
hsa-miR-15ª
hsa-miR-521
mmu-miR-10ª
hsa-miR-15b
hsa-miR-525-3p
mmu-miR-139-5p
hsa-miR-199a-3p
hsa-miR-602
mmu-miR-148b
hsa-miR-206
hsa-miR-629
mmu-miR-193
hsa-miR-210
hsa-miR-877
mmu-miR-221
hsa-miR-221
mmu-miR-222
hsa-miR-27ª
hsa-miR-891a
mmu-let-7ª
hsa-miR-29ª
mmu-let-7g
mmu-miR-27b
hsa-miR-362-5p
mmu-miR-101a
mmu-miR-301ª
hsa-miR-455-3p
mmu-miR-129-3p
mmu-miR-30ª
hsa-miR-532-5p
mmu-miR-142-3p
mmu-miR-30b
hsa-miR-660
mmu-miR-143
mmu-miR-324-5p
mmu-miR-103
mmu-miR-148a
mmu-miR-335-5p
mmu-miR-130a
mmu-miR-181a
mmu-miR-350
mmu-miR-183
mmu-miR-18a
mmu-miR-9
mmu-miR-202-3p
mmu-miR-191
mmu-miR-96
mmu-miR-365
mmu-miR-196a
mmu-miR-467b
mmu-miR-19b
mmu-miR-669a
mmu-miR-200b
mmu-miR-697
mmu-miR-203
mmu-miR-878-3p
mmu-miR-206
mmu-miR-9*
mmu-miR-208b
mmu-miR-23b
mmu-miR-20a
mmu-miR-20b
mmu-miR-218
mmu-miR-220
mmu-miR-24
mmu-miR-25
mmu-miR-27a
mmu-miR-295
mmu-miR-302a
mmu-miR-31
mmu-miR-32
mmu-miR-322
53
mmu-miR-323-3p
mmu-miR-33
mmu-miR-341
mmu-miR-34b-5p
mmu-miR-411
mmu-miR-449c
mmu-miR-455
mmu-miR-463
mmu-miR-464
mmu-miR-466f-3p
mmu-miR-568
mmu-miR-654-3p
mmu-miR-675-5p
mmu-miR-683
mmu-miR-684
mmu-miR-694
mmu-miR-715
mmu-miR-761
mmu-miR-802
mmu-miR-92b
A Figura 4.18 apresenta os resultados do experimento de confirmação de
expressão por RT-PCR em tempo real para os miRNAs candidatos selecionados no
experimento de mioblastos humanos. Observamos que 15 dos 16 miRNAs
selecionados a partir dos resultados dos microarranjos de miRNA (Lâmina) foram
confirmados, enquanto apenas quatro dos dez candidatos que haviam sido preditos
(enriquecimento) se confirmaram. O hsa-miR-629, que havia sido predito tanto como
sobrexpresso, quanto como subexpresso mostrou-se, afinal, como subexpresso. O
hsa-miR-29b, que havia sido indicado para confirmação pelos dois processos
(lâmina e enriquecimento) não foi confirmado por PCR.
54
Figura 4.18. miRNAs selecionados no experimento com mioblastos com expressão confirmada por RTPCR. * - p<0,05; ** - p<0,01. “0d” – células CHQ não-diferenciadas. “7d” – células CHQ após sete dias de
diferenciação.
55
É importante ressaltar nestes resultados que todos os miRNAs confirmados
foram confirmados na direção correta de expressão, ou seja, miRNAs sobrexpressos
na lâmina ou no enriquecimento se mostraram sobrexpressos também no
experimento de PCR, exceto para o hsa-miR-521, que havia sido predito como
subexpressos e se mostrou sobrexpresso no experimento de PCR e vice-versa.
Esse fato reforça a qualidade dos resultados obtidos. O miRNA hsa-miR-629 que foi
apontado como sobrexpresso e subexpresso pelo enriquecimento, só se confirmou
como subexpresso. Outro resultado que nos chama atenção é que o hsa-miR-29b,
que havia sido apontado por ambos os métodos, não se confirmou no PCR. Tal fato
pode estar relacionado a ele ter sido apontado em direções diferentes por cada
método (sobrexpresso no enriquecimento, subexpresso na lâmina), sendo um
possível falso-positivo.
Por sua vez, as Figura 4.19 e Figura 4.20 apresentam os resultados por RTPCR em tempo real para os efeitos de interesse do experimento com células
epiteliais tímicas murinas. A interpretação destes resultados não é tão direta quanto
a da Figura 4.18, já que, por questões práticas, todos os efeitos foram observados
para todos os miRNAs candidatos à comprovação no experimento de RT-PCR em
tempo real, independente do(s) efeito(s) que havia(m) originado a seleção desses
miRNAs.
Dezesseis das 58 confirmações de miRNAs sugeridas exclusivamente pelo
processo de enriquecimento se mostraram verdadeiras nos experimentos de RTPCR em tempo real, enquanto dois dos dez sugeridos pelas lâminas de miRNA se
confirmaram. Em relação aos miRNAs sugeridos pelas duas estratégias, dez dos 19
se confirmaram.
Ao juntarmos os resultados dos dois experimentos (mioblastos e células
epiteliais), observamos uma associação entre o processo de seleção de miRNAscandidatos e a confirmação destes

2
 11,89; p  0,004  . Entretanto, dois pontos
devem ser considerados. O primeiro é que existe um claro viés nos resultados em
relação ao experimento realizado. A “força” de predição das lâminas de miRNA está
mais presente no experimento com mioblastos do que no experimento de células
epiteliais, por exemplo. Uma análise mais aprofundada deste e de outros vieses se
faz necessária no futuro.
56
Figura 4.19. miRNAs selecionados no experimento com células epiteliais com expressão confirmada por
RT-PCR. “a” indica efeito de linhagem significativo; “b” indica efeito de contato com o timócito
significativo; “ab” indica efeito significativo de interação entre linhagem e timócito.
57
Figura 4.20. (Continuação) miRNAs selecionados no experimento com células epiteliais com expressão
confirmada por RT-PCR. “a” indica efeito de linhagem significativo; “b” indica efeito de contato com o
timócito significativo; “ab” indica efeito significativo de interação entre linhagem e timócito.
Por outro lado, é interessante observar que a estratégia de seleção de
candidatos a partir dos dados já disponíveis nos arranjos de mRNA foi capaz de
acrescentar informação aos experimentos, sendo que parte desta informação não foi
obtida nem mesmo com os arranjos de miRNA. Adicionalmente, o método é sem
custo adicional, uma vez que já se tenha os resultado de mRNA.
A principal limitação deste trabalho pode, mesmo, ser parcial ou totalmente
solucionada a partir da utilização exclusiva da seleção por enriquecimento. Ao
dispensar a realização de microarranjos de miRNA, o pesquisador pode concentrar
seus recursos na confirmação de mais candidatos.
58
Diversos trabalhos têm surgido com o objetivo de estudar as relações entre os
miRNAs e seus mRNAs-alvos(100–102). A maioria tem focado na identificação de
alvos para os miRNAs, uma vez que um miRNA pode agir sobre diversos mRNAs e
um mRNA pode ser alvo para vários miRNAs. O nosso conhecimento sobre estas
relações, armazenado em bancos como o miRBase(103), por exemplo, advém deste
esforço.
Com a formação dos bancos de dados sobre miRNAs, iniciou-se a busca
pelas relações miRNA-mRNA de interesse biológico para processos específicos.
Diversas ferramentas tem sido desenvolvidas, no campo da bioinformática, para
tentar extrair informação a respeito função dos miRNAs sobre o organismo. Uma
abordagem que tem se tornado bastante comum é estabelecer as possíveis ações
de um determinado miRNA sobre o organismo a partir do enriquecimento dos seus
alvos(104). De forma simples, a ideia é que se um miRNA atua sobre um
determinado grupo de genes e estes genes, em conjunto, atuam sobre um
determinado processo biológico, então o miRNA em questão tem, provavelmente,
ação sobre este processo biológico.
O algoritmo miR2Gene(100), de forma similar, mas mais complexa, parte de
um gene, ou grupo de genes de interesse, estabelece o conjunto de miRNAs
descritos como relacionados a este(s) gene(s) e, a partir dai, realiza o
enriquecimento dos alvos destes miRNAs, estabelecendo as conexões e possíveis
ações sobre o organismo.
Embora estas abordagens sejam interessantes, o limitado número de
experimentos de microarranjos com miRNA disponíveis(105,106) indica que é
necessário o desenvolvimento de estratégias que nos possibilitem obter informações
sobre os miRNAs a partir dos abundantes dados de microarranjos de mRNA já
depositados em repositórios públicos. Com este objetivo, Stempor, Cauchi e
Wilson(106) desenvolveram dois métodos de predição da expressão de miRNAs a
partir dos resultados de microarranjos de mRNA. O pressuposto central é de que,
uma vez que a ação dos miRNAs sobre seus alvos se dá pela repressão destes,
miRNAs sobrexpressos podem ser esperados de mRNAs subexpressos.
Esta abordagem é similar à nossa, tendo sido o único trabalho com este
objetivo que encontramos, diferindo nos métodos utilizados. Enquanto o método
59
destes autores se baseia em uma função de escalonamento e um modelo linear, nós
utilizamos a análise de enriquecimento, de modo similar ao utilizado para o
enriquecimento dos processos biológicos e vias de regulação. Infelizmente, a
comparação direta dos resultados não é possível, uma vez que estes autores não
realizaram a confirmação de expressão nos seus resultados.
60
5. Conclusão
Nossos trabalho demonstrou que o experimento de microarranjo de miRNA
ainda é o que apresenta maior sensibilidade na detecção de miRNAs realmente
diferencialmente expressos. Entretanto, a estratégia de seleção a partir da análise
de enriquecimento dos resultados dos arranjos de mRNA foi capaz de acrescentar
informação importante aos resultados, sem custo adicional. Ainda mais, se utilizada
em conjunto com os arranjos de miRNA, esta estratégia parece aumentar o poder de
seleção, sem nenhum custo.
Sugerimos que novas análises do método sejam realizadas, tentando
contornar a necessidade de limitação na lista de genes submetidos à comprovação,
para que possamos observar o real poder da estratégia de seleção, uma vez que
apenas parte dos miRNAs selecionados foram submetidos à validação.
61
6. Referências
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7. Anexo 1
Lista de genes diferencialmente expressos
no modelo de mioblastos humanos.
70
Genes Sobrexpressos
A2M
ABCA1
ABCA3
ABCG1
ABI3BP
ABL2
ABLIM3
ABRA
ABTB2
ACOT11
ACSL1
ACTA1
ACTC1
ACTN2
ACTN3
ACTRT1
ACVR1
ACVR1C
ACYP2
ADAMTS14
ADAMTS9
ADCK3
ADPRM
ADRB2
AFAP1L1
AFAP1L2
AGAP1
AGPAT5
AGPAT9
AGPHD1
AGT
AHCYL2
AHNAK2
AIF1L
AIRE
AK1
AKAP1
AKAP13
AKAP6
AKAP9
AKR1C1
AKR1C3
ALDH3A1
ALDH3A2
ALPK3
AMPD1
ANGPTL1
ANK1
ANK2
ANK3
ANKRD10
ANKRD10-IT1
ANKRD2
ANKS1A
ANO2
AOC3
APOBEC2
APOC1
APOE
APOL3
APOL5
AQP3
AQP5
ARHGAP12
ARHGAP6
ARHGAP9
ARHGEF3
ARHGEF37
ARHGEF6
ARHGEF7
ARMC9
ARMCX1
ARPP21
ASAH1
ASB2
ASB5
ASPRV1
ATF3
ATP1A1
ATP1A2
ATP1A3
ATP1A4
ATP1B3
ATP1B4
ATP2A1
ATP2A2
ATP6V1C1
AXIN2
BAG2
BBC3
BBS9
BCAS1
BCL2L11
BCL6
BEST3
BEX2
BHMT2
BIN1
BMF
BRF1
BRMS1L
BTG1
BTG2
BVES
C10orf118
C12orf42
C19orf47
C1orf105
C1orf167
C1orf88
C2
C20orf166
C20orf166-AS1
C21orf88
C2CD3
C4orf17
C7orf41
CACNA1S
CACNA2D1
CACNB1
CACNG1
CACNG6
CALM1
CAND2
CANX
CAPN6
CARNS1
CASP3
CASP9
CASQ2
CASS4
CAV3
CBFA2T3
CCDC109B
CCDC141
CCDC3
CCDC48
CCDC90B
CCNG1
CCNG2
CCNO
CCNY
CD34
CD36
CD4
CDC37L1
CDC42
CDC42SE1
CDK18
CDKN1A
CDKN1C
CDKN2B
CELSR1
CEP68
CERS6
CH25H
CHCHD10
CHD7
CHI3L1
CHIT1
CHPT1
CHRD
CHRNA1
CHRNB1
CHRND
CHRNG
CKB
CKM
CKMT2
CLCN4
CLCN5
CLCN6
CLDN5
CLEC2B
CLSTN2
CMKLR1
CNIH3
COBL
COG2
COL14A1
COL16A1
COL19A1
COL20A1
COL21A1
COL3A1
COL5A3
COQ10A
CORO6
CORO7
COX6A2
COX7A1
CPEB2
CPEB4
CREBRF
CRIP1
CRIP2
CRYAB
CRYM
CSDA
CSRP3
CTDSPL
CTNNA1
CTSH
CXCL2
CYB5R1
CYBRD1
CYP1B1
CYP2J2
CYYR1
DAG1
DBNDD1
DCAF5
DCAF8
DCP2
DDIT3
DDIT4L
DEPTOR
DERL3
DESI2
DGKD
DIO2
DLG2
DLGAP1
DLL1
DMBT1
DMD
DMKN
DMPK
DNAJA4
DNAJB9
71
DNAJC12
DNAJC3-AS1
DNALI1
DNHD1
DNMT3L
DOCK11
DOCK9
DOK3
DTNA
DTWD2
DUSP13
DUSP22
DUSP26
DUSP4
DUSP5
DUSP6
DYRK1A
DYRK2
EAF2
ECM2
EEF1A2
EFNA1
EGLN3
EGR2
ENO3
ENOX1
ENPP4
EPB41L5
EPDR1
EPT1
ERBB3
ERC2
EXOC6
EXOG
F13A1
FABP3
FAM117A
FAM134B
FAM174B
FAM178A
FAM189A2
FAM196A
FAM20A
FAM212B
FAM213A
FAM214A
FAM218A
FAM222A
FAM49A
FAM65B
FAM71F1
FAM83H
FAM90A1
FBXL22
FBXO16
FBXO2
FBXO30
FBXO32
FBXW10
FBXW7
FDPS
FEM1A
FGF13
FGF9
FGFBP2
FHIT
FHOD3
FILIP1
FITM1
FLCN
FLRT2
FLVCR2
FMNL1
FNDC5
FOLR1
FOLR3
FOSB
FOXO1
FOXO4
FRAS1
FRMD4B
FRMPD1
FRY
FXR1
FXYD1
FXYD6
FZD9
GAB2
GABARAPL1
GADD45A
GADD45G
GALNTL1
GAS5
GATM
GDF15
GDPD5
GEM
GLRX
GMPR
GNAZ
GNPTAB
GPC2
GPD1L
GPM6B
GPNMB
GPR123
GPR56
GPRC5C
GRASP
GRIP2
GSTM3
GTDC1
GYG2
HEATR8
HENMT1
HERPUD1
HES1
HES2
HEY1
HEYL
HFE2
HHAT
HINT3
HIP1
HIPK3
HIST2H2BE
HMGCS1
HN1
HRASLS2
HRC
HRK
HSD11B1
HSD17B2
HSD17B7
HSPA5
HSPB2
HSPB3
HSPB8
HSPH1
IDS
IFFO1
IFIT2
IGSF22
IL34
INPP4B
INPPL1
IQCD
ITGA1
ITGA6
ITGA7
ITGB1BP2
ITGB6
ITGB8
ITM2C
ITPKB
JAG2
JAM2
JAM3
JPH2
JUNB
KANK1
KBTBD10
KBTBD5
KCNE1L
KCNH2
KCNIP3
KCNJ12
KCNJ2
KCNJ2-AS1
KCTD12
KIAA0284
KIAA0754
KIAA1549
KIF1B
KIF26B
KIF5B
KISS1
KLF15
KLF5
KLF9
KLHDC2
KLHL2
KLHL21
KLHL24
KLHL3
KLRG1
KREMEN1
KRT80
LACC1
LAD1
LAMA2
LAMA4
LAMA5
LAMB3
LBX1
LDB3
LDHD
LHFPL2
LIMCH1
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LINC00087
LINC00115
LINC00478
LMBRD2
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72
LRRC8B
LRRFIP1
LRRN1
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LYNX1
MACF1
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MAL
MAMDC2
MTTP
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MUSK
MUSTN1
MXRA5
MYBPC2
MYBPH
MYCL1
MYH2
NKAIN1
NKAIN4
NKX3-2
NOTCH3
NOXA1
NPC2
NPNT
NPPA
NPVF
PGA3
PGAM2
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PGM5
PGPEP1
PHTF1
PHYH
PID1
PIK3C2B
MANBA
MAP6D1
MAPK10
MAPRE3
MATR3
MAZ
MBP
MCC
MCF2L
MCU
ME1
MEF2C
MEGF10
METTL7A
METTL8
MFSD2A
MGC21881
MGC23284
MGC39372
MIB1
MIR22HG
MLLT3
MMP15
MOB1B
MOCS2
MOGAT3
MORC4
MOSPD1
MPI
MPP6
MRAS
MRPS6
MSI2
MSRA
MTERFD3
MTHFR
MTSS1L
MYH3
MYH6
MYH7
MYH8
MYL1
MYL2
MYL3
MYL4
MYL6B
MYLIP
MYLPF
MYO18A
MYO18B
MYO5B
MYOG
MYOM1
MYOM2
MYOM3
MYOZ2
N4BP2L1
N4BP2L2
N4BP3
NANOS1
NAT8L
NBEA
NCAM1
NCOA1
NCOA7
NDRG2
NEB
NECAB3
NEU1
NEURL
NEURL2
NEXN
NFIB
NFKBIB
NR3C2
NR4A1
NR4A2
NR4A3
NRAP
NTNG2
NUDT14
NUDT9
NUPL1
OBSCN
OLFML2A
OLFML2B
OMA1
ONECUT2
OSBPL6
OSGIN2
OSR2
OSTM1
OTUD1
P2RX6P
PACS2
PACSIN1
PALM2
PARM1
PARP9
PBXIP1
PC
PCBD1
PCBP1-AS1
PCDH7
PCDHB10
PCSK9
PDE2A
PDE4DIP
PDLIM3
PDLIM5
PDZRN3
PIK3IP1
PIPOX
PIR
PKDCC
PKHD1
PLA2G16
PLA2G3
PLA2G4C
PLCE1
PLEKHA4
PLEKHG5
PLSCR4
PLXDC1
PLXDC2
PLXNA1
PLXNB1
PMP22
PNMA3
PNMAL1
PNMT
PNPLA7
PPAP2A
PPAPDC3
PPARGC1A
PPARGC1B
PPM1E
PPM1K
PPP1R12B
PPP1R1A
PPP1R3F
PPP2R3B
PRDX6
PREPL
PRKAB2
PRKAG3
PRKAR1A
PRKG1
PRKY
PROX1
PRR5
PRUNE2
PSAP
PSEN2
PTDSS2
PTGDS
PTGER2
PTGES3LAARSD1
PTGS1
PTK6
PTPRR
PVALB
PYGL
QKI
QPRT
RAB15
RAB7L1
RAB9B
RAI2
RAPGEF1
RARRES2
RARRES3
RASD1
RASGEF1A
RASL10A
RASSF2
RASSF3
RASSF4
RBFOX1
RBM18
RBP1
RCBTB2
RCL1
RCSD1
RDH5
REEP1
RELL1
RFTN2
RGS16
RGS2
RIMS3
RIPK4
RMND5A
RNF121
73
RNF217
RRAGD
RSL1D1
RTN2
RTP1
RYR1
SCAMP2
SCD
SCG2
SCN4A
SCRIB
SCUBE2
SDF2L1
SEMA3E
SEMA6A
SEMA6B
SEMA6C
SEPP1
SEPT4
SEPW1
SERPINB9
SERPINF1
SESN1
SETBP1
SETD7
SFRP4
SFTA1P
SGCG
SGIP1
SH3BGR
SHD
SHF
SHISA2
SHISA4
SHROOM2
SIRT2
SLC12A2
SLC12A7
SLC12A8
SLC13A3
SLC16A2
SLC16A4
SLC17A5
SLC19A2
SLC22A15
SLC24A2
SLC25A23
SLC26A7
SLC29A1
SLC2A11
SLC2A5
SLC30A1
SLC40A1
SLC43A2
SLC44A3
SLC46A3
SLC47A2
SLC4A11
SLC4A2
SLC7A7
SLCO3A1
SLN
SMAD3
SMPX
SMYD1
SNCA
SNED1
SNHG15
SNPH
SNRPN
SNTB1
SNURF
SNX18
SOD3
SOHLH2
SORBS1
SOX8
SPACA3
SPATS2L
SPG20
SPIN2B
SPTB
SPTBN1
SREBF1
SRPK3
SRSF8
SSPN
ST6GAL1
ST8SIA5
STAB2
STAC3
STARD13-AS2
STARD4
STMN2
STRADB
SULF2
SUMF2
SVIL
SYNGR2
SYNPO2
SYNPO2L
TACC2
TAL2
TAS1R1
TBC1D8
TBX15
TCAP
TCEAL1
TEAD4
TEX2
TFCP2
TFF2
TFF3
TGFB3
TGIF1
THBD
THEMIS2
THSD1
TLCD1
TM7SF2
TMCC2
TMCC3
TMEM132A
TMEM135
TMEM158
TMEM169
TMEM182
TMEM192
TMEM205
TMEM25
TMEM38A
TMEM38B
TMEM51
TMEM64
TMEM86A
TMOD1
TMTC1
TNIK
TNNC1
TNNC2
TNNI1
TNNI2
TNNT1
TNNT2
TNNT3
TOB1-AS1
TOM1L1
TP53INP1
TP53INP2
TP63
TPCN1
TPD52L1
TPM1
TPM3
TPPP3
TRAF4
TRIB1
TRIM36
TRIM54
TRIM63
TSACC
TSPAN33
TSPAN7
TSPAN9
TTLL7
TTN
TUBA8
TUBB2B
TXLNB
TXNDC16
UBE2W
UBE3D
UCP2
ULK3
UNC45B
USP18
USP53
USP54
VASH2
VDR
VGLL2
VMA21
VSTM4
VWA5A
WNT10A
WWTR1
XG
XIRP1
XIRP2
YIPF7
YPEL2
ZBTB20
ZBTB47
ZDHHC11
ZDHHC21
ZDHHC8
ZEB2
ZFAND6
ZFP106
ZHX2
ZNF138
ZNF238
ZNF286A
ZNF302
ZNF331
ZNF423
ZNF462
ZNF480
ZNF555
ZNF556
ZNF561
ZNF57
ZNF589
ZNF608
ZNF614
ZNF622
ZNRF1
ZZEF1
74
Genes Subexpressos
ABRACL
ACAN
ACTB
ACTG1
ACTG1P4
ACTG2
ACTR2
ADAM9
ADAMTS1
ADAMTS6
ADAMTSL3
ADRA2C
AFAP1
AHNAK
AK4
ALCAM
ALOX5AP
ALPL
ANKFY1
ANKRD13A
ANLN
ANO4
ANP32A
ANP32E
ANPEP
ANXA1
ANXA11
ANXA2
ANXA2P1
ANXA2P3
ANXA8L2
AP2M1
APCDD1
APLN
APOBEC3B
APOBEC3D
APOLD1
APPL2
ARHGAP11A
ARHGDIA
ARHGDIB
ARID3A
ARID5B
ARL6IP1
ARNTL2
ARPC5
ARSI
ARSJ
ASF1B
ASPH
ASPM
ASTN2
ATAD2
ATAD5
ATL3
ATOH8
ATP10A
ATP2B4
ATP8B1
ATP8B3
AURKA
AURKB
AXL
BCL7C
BDKRB1
BEND5
BIRC2
BIRC5
BLID
BLM
BNIP3
BNIP3L
BORA
BRCA1
BRCA2
BRIP1
BTBD11
BUB1
BUB1B
C10orf116
C11orf82
C11orf87
C12orf75
C18orf54
C19orf33
C1orf112
C21orf58
C2orf88
C4orf21
C4orf22
C5orf30
C5orf46
CA12
CALM2
CAP1
CAPN2
CAPSL
CARHSP1
CASC5
CASP2
CAV1
CAV2
CBR3
CCBE1
CCDC150
CCDC34
CCDC85B
CCDC85C
CCDC99
CCIN
CCNA2
CCNB1
CCNB2
CCND1
CCNF
CCNJL
CD248
CD274
CD44
CDC20
CDC25A
CDC25C
CDC42EP3
CDC45
CDC6
CDCA2
CDCA3
CDCA5
CDCA7
CDCA8
CDH11
CDH2
CDH4
CDH6
CDK1
CDK2
CDK6
CDKN3
CDT1
CENPA
CENPE
CENPF
CENPH
CENPI
CENPK
CENPM
CENPN
CENPO
CENPW
CEP128
CEP135
CEP152
CEP41
CEP55
CGB
CHAF1A
CHAF1B
CHEK1
CHN1
CHSY3
CHTF18
CIT
CITED2
CKAP2L
CKAP4
CKS1B
CKS2
CLCF1
CLIC1
CLIC3
CLSPN
CNN2
CNRIP1
CNTN1
COL12A1
COL13A1
COL27A1
COL6A2
COL8A1
CORO1C
COTL1
CPA4
CPT1A
CREB5
CRIM1
CRLF1
CSPG4
CSRP1
CTDSP1
CTGF
CTNNAL1
CTPS1
CTSC
CXCL12
CYB5R2
CYBA
DBF4B
DCBLD2
DDAH1
DDX60L
DEPDC1
DEPDC1B
DHFR
DHRS2
DIAPH3
DKK1
DLC1
DLGAP5
DRAP1
DTL
DTYMK
DUSP2
E2F1
E2F2
EBF3
ECSCR
ECT2
EDARADD
EDN1
EHD4
ELL2
ELN
ELTD1
EME1
EMP1
ENAH
ENC1
ENG
ENO1
ENO2
75
ENPP1
EPB41L4B
EPHA2
ERCC2
ERCC6L
ERLIN1
ERRFI1
ESCO2
ESPL1
ETS1
EXO1
EXOSC9
EXTL1
EYA2
EZH2
EZR
FAM101B
FAM110A
FAM111A
FAM111B
FAM176A
FAM176C
FAM19A5
FAM26F
FAM54A
FAM57A
FAM64A
FAM83D
FANCA
FANCD2
FANCG
FANCI
FANCM
FBN1
FBN2
FBXO5
FER1L4
FERMT1
FGF1
FGF5
FGFR3
FHL2
FKBP11
FLNA
FLNB
FMN2
FN1
FOXD1
FOXM1
FOXP1
FPR1
FRMD4A
FRMD6
FSCN1
FSTL1
FXYD5
FZD1
GAL
GALNT6
GALNTL2
GAPDH
GAPDHP62
GAS2L3
GBP1
GBP3
GCNT1
GINS1
GINS2
GINS4
GJA1
GJC1
GLIPR1
GLT25D2
GLTP
GMNN
GNAI2
GNPNAT1
GPD2
GPER
GPR1
GREM1
GREM2
GSG2
GTSE1
H2AFX
H2AFZ
HAPLN1
HAS1
HAS2
HAUS8
HELLS
HHIP
HHIPL2
HIC1
HILPDA
HIST1H1A
HIST1H1B
HIST1H2AB
HIST1H2AG
HIST1H2AJ
HIST1H2AL
HIST1H2AM
HIST1H2BD
HIST1H3B
HIST1H3D
HIST1H3F
HIST1H3G
HIST1H3H
HIST1H4B
HIST1H4C
HIST1H4D
HIST1H4E
HIST1H4L
HIST2H2AB
HIST2H2AC
HIST3H2BB
HJURP
HK2
HMGA2
HMGB1
HMGN2
HMGN2P46
HMMR
HN1L
HNRNPA3
HNRNPD
HNRNPU
HOXA9
HOXB3
HOXB5
HPRT1
HRCT1
HSPA2
HSPB7
HYI
HYLS1
ICK
ID1
ID2
IGFBP3
IKBIP
IL11
IL4R
IL7R
INCENP
INHBA
INHBB
ITGAV
ITGB1
KATNAL1
KCNN4
KIAA0101
KIAA1524
KIAA1549L
KIAA1609
KIF11
KIF14
KIF15
KIF18A
KIF20A
KIF20B
KIF22
KIF23
KIF2C
KIF4A
KIFC1
KNTC1
KPNA2
KRAS
KRT18
KRT18P55
KRT19
KRT33A
KRT34
KRT7
KRT83
KRT86
KRTAP1-1
KRTAP1-5
KRTAP2-3
LAG3
LASP1
LBR
LCE1A
LCE1C
LDHA
LEPREL1
LGALS1
LHB
LINC00260
LINC00619
LINC00672
LMNB1
LMNB2
LOC100130417
LOC100505633
LOC148709
LOC202025
LOC254057
LOC284441
LOC338620
LOC388242
LOC440288
LOC644936
LOC729420
LOC730101
LOX
LOXL1
LOXL2
LOXL3
LRR1
LRRC59
LRRC8C
LUZP2
LY6K
MAD2L1
MARCH4
MARCKS
MB21D1
MBNL1
MCM10
MCM3
MCM4
MCM5
MEGF6
MEI1
MELK
MET
METRNL
MEX3A
76
MGAT5B
MICAL2
MICALCL
MIR137HG
MIR155HG
MIR210HG
MIS18BP1
MKI67
MMS22L
MND1
MPP3
MPP4
MRC2
MSI1
MSN
MTMR11
MUC5AC
MXRA8
MYB
MYBL1
MYBL2
MYF5
MYL6
MYLK
MYOCD
MZT2B
NCAPD2
NCAPG
NCAPG2
NCAPH
NCEH1
NDC80
NDE1
NECAP2
NEDD9
NEIL3
NEK2
NEK7
NET1
NETO2
NEURL1B
NFE2L3
NLGN1
NME4
NMU
NPFF
NPR3
NPTX1
NR2F2-AS1
NREP
NRG1
NRGN
NRIP3
NRM
NRP2
NT5E
NUDT1
NUF2
NUP205
NUP50
NUSAP1
ODF2
OIP5
OPCML
ORC6
OVOS2
OXTR
P4HA1
PAPD7
PAPSS2
PARPBP
PAWR
PBK
PCDH9
PCNA
PDE1C
PDGFC
PDK1
PFKFB4
PFKP
PGAM1
PGAM1P5
PGF
PGK1
PGM2
PHF19
PKMYT1
PKP3
PLAUR
PLD5
PLEK2
PLIN2
PLK1
PLK4
PLOD1
PLOD2
PLOD3
PLXND1
PNP
POC1A
PODXL
POLD1
POLD3
POLQ
POTEKP
PPAP2B
PPAPDC1A
PPP1R13L
PRC1
PRELID2
PRIM1
PRKCA
PRPS2
PRR11
PRR16
PRRX2
PSG3
PSG4
PSIP1
PSMC3IP
PSRC1
PTBP1
PTMA
PTN
PTPRJ
PTRF
PTTG1
PTTG2
PTTG3P
PTX3
PUS7
PXDN
PXMP2
QSOX1
RAB11FIP4
RAB3A
RAB3B
RAC2
RACGAP1
RACGAP1P
RAD18
RAD51
RAD51AP1
RAD54B
RAD54L
RAI14
RANBP1
RANGAP1
RBL1
RCAN3
RCN3
RECK
RECQL4
REEP4
RFC5
RFWD3
RGS7
RHBDL2
RHOC
RMI1
RMI2
RNASEH2A
RNF125
ROBO4
RPL13P5
RPL39L
RPS6KA4
RRM1
RRM2
S100A10
SAMD1
SAMD11
SAPCD2
SCARA3
SCUBE3
SDR42E1
SEMA7A
SERPINB7
SERPINE1
SERTAD4
SGOL1
SGOL2
SH3BGRL3
SH3BP4
SH3D21
SH3RF1
SHCBP1
SIGLEC15
SIPA1L1
SIRPA
SKA1
SKA2
SKA3
SLC16A3
SLC19A1
SLC1A1
SLC2A4RG
SLC35F2
SLC38A4
SLC8A1
SMAD9
SMAGP
SMARCD1
SMC2
SMC4
SMS
SMURF2
SOCS2
SP100
SPA17
SPAG4
SPAG5
SPATA4
SPC24
SPC25
SPINK1
SPOCD1
SRGN
SRSF9
SSTR1
STAMBPL1
STIL
STMN1
STPG1
SUSD3
SYT15
TACC3
TAF9B
TAGLN
TAGLN2
77
TAX1BP3
TBXA2R
TCF19
TCF7
TFPI2
TGFBI
TGM2
THBS2
THSD4
TICRR
TIMELESS
TK1
TLN1
TMOD3
TMSB10
TMSB15A
TMSB15B
TMSB4XP8
TNC
TNFRSF10D
TOP2A
TOR4A
TPGS2
TPI1
TPI1P2
TPM1
TPM3
TPM4
TPX2
TRAIP
TRIM59
TRIM6
TRIOBP
TRIP13
TRMT5
TROAP
TSPAN4
TTK
TUBA1B
TUBB
TUBB3
TWF1
TWIST1
TYMS
UAP1
UBE2C
UBE2S
UGDH
VANGL1
VASN
VASP
VCAN
VEGFA
VEGFC
VEPH1
VIM
WDHD1
WDR1
WDR54
WDR76
WHSC1
WNT5A
WNT7B
WWC1
XRCC2
YWHAH
YWHAQ
ZAK
ZNF185
ZNF395
ZNF536
ZWINT
78
8. Anexo 2
Lista completa de processos biológicos e vias de regulação gênica
diferencialmente expressas no modelo de mioblastos humanos
Legendas:
GOBPID: número de identificação do processo biológico no banco de
ontology genética (gene ontology).
P: p-valor obtido no teste hipergeométrico utilizado para análise de
enriquecimento.
EC: número de genes esperado ao acaso na lista de genes DE que
estivessem associados ao processo biológico analisado.
OC: número de genes de fato observados na lista de genes DE que
estavam associados ao processo biológico analisado.
Termo: nome do processo biológico (em inglês).
79
GOBPID
0000279
0048285
0051301
0007275
0022402
0007010
0007067
0007059
0060537
0010927
0006936
0045214
0000278
0016043
0003015
0055002
0048513
0030154
0042692
0007017
0007517
0007126
0030049
0070252
0051321
0007519
0007155
0008015
0033043
0007076
0007160
0003008
0006323
0006941
0000075
0030029
0002026
0003009
0051325
0003007
0006937
0051303
0048646
0051239
0048514
P
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
EC
34
31
37
252
61
45
20
9
15
4
10
2
34
253
8
2
128
133
14
23
9
9
1
1
9
8
53
19
21
1
11
97
11
1
10
27
2
2
13
7
4
2
36
80
25
OC
95
87
97
369
126
100
59
34
45
20
34
12
70
335
28
12
188
193
36
49
26
26
9
9
26
25
89
43
45
9
28
142
29
8
26
51
9
9
30
20
15
9
61
116
47
Termo
M phase
organelle fission
cell division
multicellular organismal development
cell cycle process
cytoskeleton organization
mitosis
chromosome segregation
muscle tissue development
cellular component assembly involved in morphogenesis
muscle contraction
sarcomere organization
mitotic cell cycle
cellular component organization
heart process
striated muscle cell development
organ development
cell differentiation
muscle cell differentiation
microtubule-based process
muscle organ development
meiosis
muscle filament sliding
actin-mediated cell contraction
meiotic cell cycle
skeletal muscle tissue development
cell adhesion
blood circulation
regulation of organelle organization
mitotic chromosome condensation
cell-matrix adhesion
system process
DNA packaging
striated muscle contraction
cell cycle checkpoint
actin filament-based process
regulation of the force of heart contraction
skeletal muscle contraction
interphase
heart morphogenesis
regulation of muscle contraction
establishment of chromosome localization
anatomical structure formation involved in morphogenesis
regulation of multicellular organismal process
blood vessel morphogenesis
80
0060429
0050879
0060415
0030240
0006260
0051653
0006928
0030048
0001568
0006942
0040001
0032886
0008283
0048738
0000079
0032879
0050793
0031109
0000070
0000724
0048856
0007051
0006950
0023052
0031032
0043462
0007088
0000080
0007052
0048015
0034508
0051983
0031110
0030155
0051674
0001501
0042221
0045446
0055010
0007399
0016477
0051494
0032507
0048747
0048523
0035239
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
21
2
3
1
26
1
54
3
3
3
1
5
101
6
6
55
60
1
3
2
67
3
156
325
2
2
6
2
2
6
1
1
3
12
39
33
118
2
2
91
36
6
5
5
160
12
41
10
11
5
47
7
83
11
12
10
6
14
137
16
17
82
88
5
10
9
95
11
196
377
7
7
15
8
8
16
5
5
9
24
59
52
151
8
8
120
56
14
13
13
196
24
epithelium development
multicellular organismal movement
muscle tissue morphogenesis
skeletal muscle thin filament assembly
DNA replication
spindle localization
cellular component movement
actin filament-based movement
blood vessel development
regulation of striated muscle contraction
establishment of mitotic spindle localization
regulation of microtubule-based process
cell proliferation
cardiac muscle tissue development
regulation of cyclin-dependent protein kinase activity
regulation of localization
regulation of developmental process
microtubule polymerization or depolymerization
mitotic sister chromatid segregation
double-strand break repair via homologous recombination
anatomical structure development
spindle organization
response to stress
signaling
actomyosin structure organization
regulation of ATPase activity
regulation of mitosis
G1 phase of mitotic cell cycle
mitotic spindle organization
phosphoinositide-mediated signaling
centromere complex assembly
regulation of chromosome segregation
regulation of microtubule polymerization or depolymerization
regulation of cell adhesion
localization of cell
skeletal system development
response to chemical stimulus
endothelial cell differentiation
ventricular cardiac muscle tissue morphogenesis
nervous system development
cell migration
negative regulation of cytoskeleton organization
maintenance of protein location in cell
muscle fiber development
negative regulation of cellular process
tube morphogenesis
81
0007263
0071174
0008016
0060048
0007229
0042325
0045185
0051383
0055003
0050873
0051174
0007165
0008608
0055006
0007346
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
1
1
5
3
6
44
1
1
1
2
46
242
1
1
10
6
6
13
9
14
65
4
4
4
7
67
284
5
5
20
nitric oxide mediated signal transduction
mitotic cell cycle spindle checkpoint
regulation of heart contraction
cardiac muscle contraction
integrin-mediated signaling pathway
regulation of phosphorylation
maintenance of protein location
kinetochore organization
cardiac myofibril assembly
brown fat cell differentiation
regulation of phosphorus metabolic process
signal transduction
attachment of spindle microtubules to kinetochore
cardiac cell development
regulation of mitotic cell cycle
82
9. Anexo 3
Lista de genes diferencialmente expressos no modelo de células
epiteliais tímicas associados ao efeito da linhagem
83
Genes Sobrexpressos
0610007L01Rik
0610009B22Rik
0610010K14Rik
0610011F06Rik
0610030E20Rik
1110002N22Rik
1110021J02Rik
1110021L09Rik
1110031I02Rik
1200011I18Rik
1200014J11Rik
1300001I01Rik
1300010F03Rik
1500001M20Rik
1500011H22Rik
1600014C23Rik
1700001F09Rik
1700007K13Rik
1700016M24Rik
1700040I03Rik
1700049E17Rik1
1700125H20Rik
1810008I18Rik
1810012P15Rik
1810043G02Rik
1810049H13Rik
2010012O05Rik
2200002D01Rik
2210010C17Rik
2210021J22Rik
2210416O15Rik
2310002J15Rik
2310003H01Rik
2310007B03Rik
2310008H09Rik
2310033P09Rik
2310035K24Rik
2310035P21Rik
2310039H08Rik
2310068C19Rik
2310079F23Rik
2410003K15Rik
2410015M20Rik
2410018M08Rik
2610001J05Rik
2610002J23Rik
2610020H08Rik
2610034B18Rik
2610036A22Rik
2610044O15Rik
2610203C20Rik
2610305D13Rik
2610306M01Rik
2610507B11Rik
2610528J11Rik
2810002N01Rik
2810047C21Rik1
2810403D21Rik
2810422O20Rik
2810429I04Rik
2810453I06Rik
2900005J15Rik
2900064F13Rik
2900092E17Rik
3010026O09Rik
3100003M19Rik
3110035C09Rik
3110056O03Rik
3110062M04Rik
3110073H01Rik
3830403N18Rik
3830417A13Rik
4632415L05Rik
4833408A19Rik
4833442J19Rik
4930414L22Rik
4930420K17Rik
4930437M23Rik
4930452B06Rik
4930477O03Rik
4930503L19Rik
4930547N16Rik
4930556M19Rik
4932438A13Rik
4932439E07Rik
4933402N22Rik
4933403F05Rik
4933424B01Rik
4933427D14Rik
4933439C10Rik
4933439F18Rik
5031425E22Rik
5330421C15Rik
5730409L17Rik
5730419I09Rik
5730455P16Rik
5730494M16Rik
5730521K06Rik
5930416I19Rik
6030419C18Rik
6330409N04Rik
6330416G13Rik
8430410A17Rik
8430419L09Rik
8430427H17Rik
9230112J17Rik
9330182L06Rik
9530029O12Rik
9630023C09Rik
9930012K11Rik
9930023K05Rik
9930111J21Rik2
A030009H04Rik
A230051G13Rik
A330040F15Rik
A330076H08Rik
A430057L12Rik
A430093F15Rik
A430108G06Rik
A530040E14Rik
A630031M23Rik
A730011L01Rik
Aars2
Aarsd1
Abcb1b
Abcb4
Abcb6
Abcg2
Abhd11
Abhd14b
Abhd2
Abhd6
Abi3
Abr
Acaa1a
Acaa1b
Acad9
Acadvl
Acbd4
Accs
Acer3
Acn9
Aco2
Acox2
Acox3
Actr6
Acvr1b
Acy3
Adat2
Adck2
Adck4
Ado
AF067063
Aff4
Afp
Aftph
Agbl3
Agtrap
Agxt2l2
Ahcyl2
Ahi1
AI428936
AI462493
AI467606
AI597468
Aire
Ak1
Akap6
Akap7
Akap9
Akr1b10
Akr1b3
Akr1c12
Aldh3a2
Aldh3b1
Aldh5a1
Aldoa
Aldoart2
Aldoc
Alg12
Alg13
Alg5
Alg8
Alkbh2
Alkbh3
Alkbh5
Alkbh6
Alkbh7
Als2cl
Amacr
Amigo1
Ang4
Angptl2
Ankib1
Ankrd37
Ano9
Anxa2
Ap2a2
Ap2b1
Apbb3
Apc
Apcdd1
Apeh
Aplf
Apln
Apobec1
Apool
Appl1
Aqp1
Aqp11
Aqp5
Arf3
Arhgap12
Arhgap18
Arhgap24
Arhgap27
Arhgap8
Arhgef19
Arhgef4
Arid2
Arl6ip4
Armcx5
Arrdc4
Artn
Arxes2
Asb8
Ascc2
Asph
Atad5
Atg16l2
84
Athl1
Atox1
Atp10a
Atp11b
Atp13a2
Atp5g1
Atp5h
Atp6v0a1
Atp6v0e2
Atp6v1f
Atp6v1g1
Atpaf2
Atpbd4
Atrip
AU020206
Auh
Aurkb
Avl9
Avpi1
AW146020
Azi1
B130006D01Rik
B130024G19Rik
B130040O20Rik
B230118H07Rik
B230208H11Rik
B3galt1
B3gat3
B3gnt1
B3gntl1
B630005N14Rik
B9d1
B9d2
Baiap2
Bbs7
BC017158
BC017643
BC030336
BC030867
BC031353
BC046331
BC048355
BC061212
BC061237
Bcam
Bcap31
Dcaf11
Bckdha
Bcl2l11
Bcl2l2
Bcl3
Bcl6
Bcl7c
Bcorl1
Bend4
Bet1
Bet1l
Bfsp2
Bhlhb9
Bicd1
Bid
Bin1
Bin3
Birc5
Blvrb
Bmp7
Bmyc
Bnip3
Bod1
Bola3
Bpgm
Braf
Brcc3
Bre
Brpf1
Btbd19
Btc
Btd
C030006K11Rik
C030048B08Rik
C130022K22Rik
C1d
C1galt1
C230052I12Rik
C230094B09Rik
C3
C530014P21Rik
C920008N22Rik
Cables2
Cadm1
Cadm4
Cald1
Calr4
Dtd1
Canx
Capn5
Capn7
Capsl
Caskin2
Casp4
Cbr2
Cbx4
Cbx5
Cbx7
Cby1
Ccdc104
Ccdc107
Ccdc123
Ccdc126
Ccdc138
Ccdc17
Ccdc32
Ccdc34
Ccdc47
Ccdc55
Ccdc56
Ccdc77
Ccdc90b
Ccdc91
Ccdc93
Ccdc96
Ccna2
Ccne1
Ccng1
Ccz1
Cd109
Cd274
Cd320
Cd9
Cd99l2
Cdc14a
Cdca3
Cdh13
Cdh2
Cdh20
Cdk14
Cdk2ap2
Cdk5rap3
Cdkn1b
Cdkn3
Epdr1
Cebpb
Cecr5
Celf5
Cep290
Ces1g
Cftr
Cga
Cgrrf1
Chchd10
Chchd3
Chchd4
Chchd6
Chd1l
Chmp2a
Chpt1
Chrac1
Chtf18
Cib1
Cic
Cirbp
Cisd1
Ckap4
Ckmt1
Cldn6
Cldn7
Cldn9
Clint1
Clpb
Cltc
Cmc1
Cnbp
Cnksr3
Cnot10
Cnot4
Cnot8
Cnp
Cntfr
Cntrob
Cog1
Cog6
Col12a1
Col18a1
Col1a2
Col2a1
Col8a1
Commd1
Fbxo42
Copg
Copg2
Cops2
Cops6
Coq4
Coq7
Cox7a1
Cp
Cpeb3
Cpeb4
Cpt2
Creg1
Crem
Crot
Cryl1
Csad
Csf1r
Cst3
Cstf3
Cuta
Cutc
Cx3cl1
Cyb561
Cyb561d2
Cyb5rl
Cyc1
Cyhr1
Cyth1
D10Jhu81e
D11Wsu99e
D130076A03Rik
D2Wsu81e
D3Bwg0562e
D3Ertd751e
D5Ertd579e
D630032N06Rik
D730039F16Rik
D7Ertd715e
D930048N14Rik
Dab2
Dact2
Dagla
Daglb
Dak
Dalrd3
Dbf4
Gla
85
Dcaf7
Dclk1
Dcp1b
Dcp2
Dctpp1
Dcxr
Ddrgk1
Ddt
Ddx26b
Ddx47
Ddx50
Ddx56
Deb1
Dedd2
Defb41
Dennd2d
Dera
Derl1
Dfna5
Dgat2
Dhrs11
Dhrs13
Dhrs7b
Dhx33
Dhx34
Dhx40
Dhx57
Dlg3
Dmd
Dmpk
Dnajc15
Dnajc18
Dnajc3
Dnm1
Dnmbp
Dock8
Dok1
Dok7
Dpm1
Dppa5a
Dpy19l3
Dpy30
Dr1
Drg1
Dsn1
Gstm2
Gstm3
Dtwd1
Dtx2
Dtx4
Dusp11
Dusp2
Dut
Dync2li1
Dynll2
E130308A19Rik
E130314M14Rik
E2f2
E2f5
E2f8
E330009J07Rik
Ebag9
Ebf1
Echdc3
Eci1
Ect2
Edem1
Eefsec
Efna3
Efr3a
Egfl7
Ehbp1
Eid1
Eif1
Eif2ak2
Elac1
Elac2
Elavl4
Ell3
Elmo3
Elmod3
Emc10
Emc2
Emc3
Eme1
Emg1
Eml1
Emp1
Endog
Enho
Entpd6
Eogt
Htra2
Iars2
Ephb4
Ephx1
Eps8
Erbb2
Ergic2
Erlec1
Ero1l
Espn
Etohi1
Evi2a
Evi5l
Evpl
Ewsr1
Exoc7
Exosc4
Exosc5
Exosc8
Exosc9
Ext2
F2r
Fahd2a
Fam115a
Fam136a
Fam164c
Fam165b
Fam173b
Fam175a
Fam195a
Fam195b
Fam203a
Fam3a
Fam54a
Fam59a
Fam65c
Fam69b
Fam82b
Fam86
Fancb
Fancd2
Fanci
Fancl
Fas
Fbln2
Fbxl14
Fbxo17
Izumo4
Jagn1
Fbxw11
Fdxr
Fgf1
Fgf7
Fgfbp3
Fgfr1op2
Fh1
Figf
Fkbp11
Fkbp1b
Fkbp9
Flrt3
Fndc4
Foxa2
Foxf1
Foxk1
Foxm1
Foxred2
Frat1
Frk
Fst
Fut11
Fxc1
Fxn
G6pc3
Gabarapl1
Gale
Galk2
Galnt12
Galt
Gatad1
Gatc
Gcat
Gcc2
Gclc
Gcnt3
Gde1
Gdf15
Gdnf
Gdpd1
Gdpd5
Gemin8
Gfer
Ggct
Ggh
Lgals12
Lgals3bp
Glcci1
Glo1
Glod4
Glt28d2
Gm10021
Gm10941
Gm13152
Gm13212
Gm14325
Gm2788
Gm3002
Gm428
Gm5168
Gm5458
Gm5480
Gm5622
Gm5662
Gm5800
Gm6460
Gm6710
Gm8090
Gm88
Gmcl1
Gnal
Gnptab
Golph3
Gorab
Gosr2
Gpatch8
Gpc3
Gpc4
Gpd1l
Gpi1
Gpr108
Gpr180
Gpr85
Gprc5a
Gramd4
Grasp
Grhpr
Gsg2
Gsta1
Gsta2
Gsta4
Gstm1
Maf1
Mafb
86
Gsto2
Gtf3c6
Gtpbp10
Gucy1b2
Gusb
Gyg
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Dusp14
Dync1i2
Dync1li2
Dync2h1
Dynll1
Dynlt1f
Dynlt3
Dzip3
E030011O05Rik
E2f6
E430025E21Rik
Ebp
Echdc2
Eda
Edc3
Edn1
Eef1a1
Eepd1
Efemp1
Efna1
Efnb1
Efnb2
Egfr
Eid2
Eif1ad
Eif1ax
Eif2c3
Eif4a2
Eif4e
Eif5b
Eif6
Elavl1
Ell
Emx2
Endod1
Eomes
Epb4.1l4a
Epha1
Epha4
Ephb2
Ephb3
Ept1
Erh
Erlin2
Ero1lb
Esyt2
Etl4
Ets2
Evc2
Evl
Exoc3
Exoc8
Exosc2
Eya2
Ezr
F11r
F3
F730043M19Rik
Fads3
Faf2
Faim3
Fam107b
Fam108a
Fam110b
Fam120b
Fam129c
Fam132a
Fam132b
Fam168b
Fam177a
Fam178a
Fam189b
Fam192a
Fam19a2
Fam20a
Fam20c
Fam32a
Fam38a
Fam49b
Fam63a
Fam76b
Farsa
Fastkd3
Fbxo22
Fbxo38
Fbxw7
Fcf1
Fdft1
Fdps
Fem1b
Fermt2
Fez2
Fgfbp1
Fhdc1
Fhl1
Fhl2
Fhod1
Fjx1
Flot2
Fmnl2
Fn1
Fnbp1l
Foxc1
Foxd1
Foxg1
Foxn3
93
Foxo1
Frmd4a
Frmd6
Fscn1
Ftsjd1
Fundc1
Fuom
Fzd2
Gabpa
Gabpb1
Gadd45b
Gadd45g
Gal
Galnt10
Galnt13
Galnt4
Gapvd1
Gas5
Gata6
Gatad2a
Gba2
Gcfc1
Gckr
Gcnt2
Gdi2
Gen1
Gfod1
Gimap6
Gimap9
Gins3
Gja4
Glce
Glipr2
Glt25d1
Glul
Gm10627
Gm10825
Gm129
Gm1966
Gm6787
Gmds
Gmeb1
Gmfb
Gmip
Gna14
Gnai1
Gnai3
Gnao1
Gng5
Gpr137b
Gpr64
Gpr77
Gprc5b
Gprc5c
Gpsm1
Gpt2
Gpx1
Gpx8
Grhl1
Gsn
Gspt1
Gstcd
Gstk1
Gvin1
Hax1
Hbp1
Hdac6
Hdlbp
Hecw2
Hexb
Hhex
Higd2a
Hmgcr
Hmgcs1
Hmgn1
Hmgn3
Hn1l
Hnrnpa3
Hnrnph3
Hook3
Hoxb6
Hs1bp3
Hsbp1
Hsd11b1
Hsd17b7
Hsp90aa1
Hspa13
Hspa2
Hspb11
Hspbap1
Hspe1
Htr1d
Hunk
Ick
Id3
Idh1
Ifi27l1
Ifrd1
Igf2bp1
Igf2bp3
Igfbp7
Igsf11
Igsf3
Ikzf2
Il18r1
Il1b
Il20rb
Inhba
Inhbb
Inpp4b
Ints12
Ip6k2
Ippk
Irf1
Irs1
Isl1
Itgav
Itgb1
Itgb6
Jag1
Jag2
Jdp2
Jub
Jun
Kalrn
Kansl3
Kbtbd4
Kcnb1
Kcnj4
Kcnn4
Kctd1
Kdelr3
Khdrbs2
Kif5a
Kif5c
Kin
Kirrel
Klf6
Klf7
Klhdc2
Klhdc4
Klhl18
Klhl23
Klhl26
Klhl36
Klhl38
Krt17
Krt19
Krt7
Krt78
Krtap3-2
Krtap4-6
Krtap5-1
Lamb1
Lamp1
Lamp2
Lancl3
Large
Lass6
Lce1c
Lce1e
Lce1g
Lce1h
Lce1i
Lce1j
Ldhb
Ldlr
Lef1
Lemd1
Lenep
Leo1
Leprel4
Leprot
Lgals8
Lgmn
Lhfp
Lhfpl2
Lhfpl4
Lhx2
Lhx6
Lipg
Litaf
Lman2
Lnp
Lpar1
Lpar2
Lpcat1
Lphn1
Lpp
Lrch4
Lrfn4
Lrig3
Lrrc8a
Lrrfip1
Lsm6
Ltv1
Luzp1
Lyn
Lypd6b
Magi3
Maml2
Maoa
Map1lc3a
Map1lc3b
Map2k1
Map4k4
Mapkap1
Mapkapk2
Mark2
Mars
Masp1
Max
Mboat1
Mboat2
Mcam
Mcf2l
Mcm3
Mcm4
Mcts1
Me1
Med10
Med28
Med6
Mest
Metap1
Mfap3l
Mff
Mfhas1
Mfsd6
Mgea5
94
Mgll
Mid1ip1
Mid2
Mitd1
Mki67ip
Mlc1
Mmadhc
Mmd
Mme
Mmp10
Mnat1
Mob4
Morf4l1
Mphosph6
Mpv17
Mras
Mre11a
Mrgprb2
Mrpl39
Mrps6
Msra
Msrb3
Mtap2
Mtch2
Mthfs
Mtrr
Mtss1
Mtx3
Muc16
Mvd
Myh9
Myl12b
Myo1b
Myo9b
Nabp1
Nat8l
Nbl1
Ncam1
Nck1
Ncs1
Nde1
Ndufa1
Ndufb11
Necab2
Nek6
Neo1
Neurl1a
Nexn
Nfat5
Nfe2l3
Nfia
Nfil3
Ngf
Ngfrap1
Nhlrc1
Nif3l1
Ninj2
Nip7
Nkain1
Nkain4
Nkap
Nkrf
Nmi
Nmnat3
Nnmt
Nox4
Npc2
Npnt
Npr2
Nptn
Nradd
Nras
Nrg1
Nsdhl
Nsl1
Nt5e
Ntpcr
Nuak2
Nudt17
Nudt21
Nup160
Nup214
Nup35
Nup93
Nutf2
Oaz2
Odz3
Odz4
Olfm1
Olfm2
Olfr1036
Olfr1170
Olfr139
Opa1
Orc6
Osbpl11
Osgepl1
Osgin1
Otud5
Otud7b
P2ry12
P2ry14
P4ha2
Pa2g4
Pacsin3
Pak1
Pan2
Panx1
Paqr5
Pard6g
Parp6
Pbx4
Pcdh17
Pcdhb14
Pcdhb16
Pcdhb17
Pcdhb20
Pcdhb21
Pcdhb22
Pcdhb5
Pcdhb6
Pcdhb7
Pdcl3
Pde4dip
Pde6d
Pdgfd
Pdk4
Pdlim1
Pdlim5
Pdlim7
Pdpn
Pdxdc1
Pea15a
Penk
Pet2
Pex11c
Pex16
Pfkfb3
Pgbd5
Pgrmc1
Phf16
Phf20
Phlpp2
Phyhd1
Pick1
Pik3c2a
Pik3cb
Pip4k2a
Pip4k2c
Pip5k1a
Pitrm1
Pitx1
Pkn2
Pknox1
Pkp1
Pkp2
Pkp4
Pla2g12a
Plat
Plcl1
Plekhb2
Plekhg4
Plin2
Plod2
Plp2
Plscr1
Plscr2
Pmepa1
Pmpca
Pnpla6
Podnl1
Poglut1
Polb
Polr2m
Pon2
Pou6f1
Pparg
Ppic
Ppm1f
Ppp1r14c
Ppp1r2
Ppp1r2-ps3
Ppp1r3f
Ppp2r5b
Ppp2r5e
Ppp6c
Praf2
Prdx2
Prh1
Prim2
Prkaca
Prkcdbp
Prkd3
Prl2a1
Prl2c3
Prl2c5
Prl3d1
Prl3d2
Prl7a1
Prl7a2
Pros1
Prpf3
Prps1l3
Prrc2b
Prss23
Prune2
Psma3
Psma6
Psmb7
Psmc1
Psmd14
Psmd2
Psmd7
Pstpip1
Ptbp2
Ptdss1
Ptges3
Ptp4a1
Ptpn1
Ptpn21
Ptpn22
Ptprf
Ptprk
Ptprm
Ptprz1
Pvrl3
Pxdn
Pyhin1
Qk
R3hdm2
95
Rab10
Rab11a
Rab15
Rab19
Rab21
Rab22a
Rab23
Rab31
Rab3ip
Rab6b
Rabggtb
Rac3
Rad9
Radil
Rala
Ralb
Ralgps2
Ranbp1
Ranbp10
Ranbp17
Rap1a
Rap1b
Rap1gds1
Rasal2
Rassf1
Rb1cc1
Rbm10
Rbm17
Rbm18
Rbm3
Rbm4
Rbm4b
Rbms3
Rbx1
Rdh11
Rexo2
Rfwd2
Rfwd3
Rgl3
Rhbdd1
Rhoa
Rhob
Rhoc
Rhoq
Rhou
Rilpl1
Rin3
Ripk1
Rit1
Rmi1
Rnaset2b
Rnd3
Rnf113a1
Rnf113a2
Rnf166
Rnf7
Rp2h
Rpl13
Rpl34
Rpl35a
Rpl39
Rpl4
Rpl7
Rpl7a
Rraga
Rragc
Rras
Rras2
Rsl1d1
Rtn4r
Rusc2
S100a16
S100a6
S1pr2
Sall2
Sarnp
Sars
Sc4mol
Sc5d
Scly
Scnm1-ps
Scyl2
Sdc2
Sdc3
Sdccag8
Sec22b
Sema7a
Senp8
Sep15
Sephs1
Sept2
Sept5
Sept6
Serinc5
Serp2
Serpinb1a
Serpinb1b
Serpinb1c
Serpinb2
Serpinb5
Serpinb6a
Serpinb6c
Serpinb6d
Serpinb8
Serpinb9
Serpinb9e
Serpine1
Set
Setd3
Sf3b1
Sfmbt2
Sgcb
Sgk1
Sgms2
Sgpp2
Sgsm1
Sh3bp5l
Sh3d19
Sh3glb1
Sh3rf1
Sh3tc2
Sidt2
Siglecg
Sin3b
Sipa1l2
Sirt5
Six1
Skap1
Slc20a1
Slc22a23
Slc25a25
Slc25a29
Slc25a5
Slc35e1
Slc38a2
Slc38a7
Slc39a13
Slc4a4
Slc5a4b
Slc6a4
Slc6a8
Slc7a6
Slc9a2
Slc9a7
Slco2a1
Smad1
Smad5
Smagp
Smc6
Smek1
Smndc1
Smurf1
Snai2
Snap29
Snap91
Snhg1
Snhg5
Snn
Snrpe
Snupn
Snx19
Snx25
Son
Sorbs2
Sorcs2
Sort1
Sost
Sox11
Sox13
Sox9
Sp8
Spats2l
Spcs3
Spef1
Spin1
Spire1
Spopl
Sprr2h
Spsb4
Srcin1
Srd5a1
Srek1ip1
Ssbp3
Ssr1
St14
St6galnac6
St7l
Stag2
Stau2
Stbd1
Stk17b
Stk4
Stx3
Stx6
Sugp1
Sugt1
Sulf1
Sulf2
Suox
Surf1
Surf2
Surf4
Surf6
Susd4
Suv39h1
Syncrip
Synpr
Syt12
Tacc1
Taf1d
Taf5l
Taf9
Taf9b
Tanc1
Tbc1d9
Tbrg1
Tbx1
Tbx15
Tbx18
Tceb1
Tcf7l1
Tcirg1
Tecr
Tfe3
Tg
Tgfb2
Tgfbi
Tgif2
Tgm2
Thap2
96
Tiam1
Timm17b
Tipin
Tk2
Tlr3
Tmem123
Tmem130
Tmem14a
Tmem158
Tmem161a
Tmem2
Tmem245
Tmem38a
Tmem51
Tmem66
Tnfrsf18
Tnfrsf21
Tnfrsf25
Tnnc1
Tom1
Tomm20
Tomm70a
Tor1aip2
Tpbg
Tpm1
Tpm2
Tpm3
Tpm4
Traf2
Traf5
Trdmt1
Trim3
Trim39
Trim59
Trip12
Trip13
Trip4
Trmt1
Trmt10a
Trnp1
Tsc22d3
Tsc22d4
Tshz1
Tshz3
Tsn
Tspan15
Tspan9
Ttc13
Ttc9
Ttyh3
Tuba1a
Tubb2a
Tubgcp3
Tuft1
Twist1
Txk
Txndc9
Txnl4a
U05342
Uba1
Ubash3b
Ubc
Ube2a
Ube2cbp
Ube2d3
Ube2i
Ube2l3
Ube2q2
Ube2r2
Ube2v2
Ube2w
Ube4a
Ubxn7
Uck2
Ucn2
Ucp1
Ugcg
Uhrf2
Unc13b
Upf3b
Urm1
Usp3
Usp37
Usp38
Usp54
Usp9x
Ust
Uxt
Vac14
Vash1
Vash2
Vav3
Vcam1
Vcp
Vcpip1
Vegfc
Vgll3
Vim
Vps11
Vps26b
Vps37a
Vps4a
Vps4b
Vsig10
Vwce
Wars2
Wasf2
Wbp5
Wdr1
Wdr37
Wdr4
Wdr44
Wdr45
Wdr5
Wdr53
Wdr75
Wfs1
Whsc1
Wipf1
Wisp1
Wls
Wnt10a
Wnt4
Wwc2
Wwp2
Xiap
Yap1
Ybx1
Yif1b
Yjefn3
Ypel1
Yy1
Zbtb1
Zbtb33
Zc3h18
Zcwpw1
Zdhhc15
Zdhhc2
Zdhhc7
Zdhhc8
Zeb2
Zfand3
Zfand5
Zfhx3
Zfp125
Zfp131
Zfp142
Zfp182
Zfp259
Zfp276
Zfp317
Zfp358
Zfp367
Zfp386
Zfp451
Zfp462
Zfp503
Zfp532
Zfp609
Zfp612
Zfp617
Zfp781
Zfp809
Zfp821
Zfp866
Zfp868
Zfp955a
Zfpm1
Zmynd8
Znhit6
Znrf1
Zrsr2
Zwint
Zyx
Zzz3
97
10.
Anexo 4
Lista de genes diferencialmente expressos associados aos efeitos de
contato com o timócito e de interação linhagem x timócito
98
Efeito do Contato com o Timócito
1810026B05Rik
9130008F23Rik
Aif1
Arhgdib
Arid4a
Arl5c
C1qc
Ccr9
Cd3d
Cd52
Cd74
Cd8b1
Col4a1
Coro1a
Crip1
Ctss
Cytip
Dusp6
Eif3a
Fam110c
Gcnt2
H2-Aa
H2-Ab1
Hcls1
Heatr5a
Hist1h2af
Hist1h2ai
Hist1h2ak
Hist3h2a
Hmga2
Hyou1
Ifi27l2a
Igh-VJ558
Igk
Kdm2a
Lcp1
Ltb
Ly6d
Ly86
Lyz1
Lyz2
Myo1g
Ncf4
Olfr1419
Pim3
Plac8
Plbd1
Psmb8
Ptprc
Rab14
S100a9
Scrib
Sepp1
Snhg5
Spry2
Srgn
Stambpl1
Susd3
Tcrb-J
Tex10
Thy1
Trib1
Uba6
Zfp91
Zfp955b
Zfr
Adam1a
Egr1
Nfil3
Ssbp2
Os últimos qutro genes (em destaque) são subexpressos. Os restantes são
sobrexpressos.
99
Efeito da Interação Linhagem x Timócito
1110046J04Rik
1810011O10Rik
1810026B05Rik
1810035L17Rik
2310035P21Rik
2810013P06Rik
2900052L18Rik
3010026O09Rik
4930431P19Rik
4932439E07Rik
5830408C22Rik
8030431J09Rik
9330151L19Rik
A330040F15Rik
A930033H14Rik
Agap1
Anxa2
Apool
Arid4a
Arrdc3
Asb13
Atp6v0a1
Atp6v0e
B130040O20Rik
B230303O12Rik
Bsdc1
C1qc
C230096K16Rik
C530043K16Rik
Cav2
Ccdc55
Cd52
Cd74
Cenpk
Cep78
Coq5
Coro1a
Crip1
Ctss
Dido1
Dusp6
E030011O05Rik
Eif2ak3
Fam82b
Fos
Gdap5
Gigyf2
Gm4532
Gm9975
Gsta2
H2-Ab1
H3f3b
Hist1h2ac
Hist1h2br
Ifi27l2a
Igfbp3
Igk
Ipp
Jagn1
Kremen1
Lysmd4
Lyz1
Lyz2
Maoa
Mia3
Mt1
Nfkbiz
Nfu1
Nfx1
Nr2c1
Ocrl
Parl
Pim1
Plbd1
Polb
Polr3a
Polr3g
Pyroxd1
Rab14
Rad50
Rdh14
S100a9
Sepp1
Sik1
Slc43a2
Stat1
Tanc2
Tcrb-J
Them4
Tmem216
Trib1
Trpc1
Tslp
Txnip
Ubxn2b
Uevld
Vcpip1
Vmp1
Yeats2
Zfp397
Zfp787
Zfp846
Zfyve27
A530098C11Rik
Arih1
Armc7
Atxn2
Ccnj
Cpne5
D930017J03Rik
Ddhd1
Gadd45b
Il20rb
Irf1
Mapt
Mmrn2
Nfkbia
Pex11c
Rps15a
Slc38a2
Snx5
Tcf7l2
Tmem110
Ube2i
Ubr3
Wwc2
Zmynd17
Zzz3
Os genes em destaque são subexpressos.
100
11.
Anexo 5
Lista de miRNAs diferencialmente expressos no modelo de células
epiteliais tímicas.
101
Efeito da Linhagem
logFC
0,80
0,54
0,51
0,46
0,43
0,43
0,41
0,39
0,39
0,38
0,36
0,34
0,34
0,33
0,27
-0,17
-0,20
-0,28
-0,30
-0,37
-0,38
-0,41
-0,42
-0,42
-0,48
-0,57
-0,59
-0,59
-0,66
-0,74
AveExp
r
7,71
7,59
8,42
6,70
6,95
6,88
8,92
11,29
7,37
8,68
7,48
9,65
6,81
7,84
9,65
6,57
6,51
6,49
10,85
9,83
10,11
7,50
10,80
7,68
11,11
8,99
8,89
9,63
7,86
8,74
miRNA
mghv-miR-M1-7-3p
mmu-miR-471
mmu-miR-671-3p
logFC
0,52
0,31
-1,61
Efeito do Contato com o Timócito
AveExpr
t
P.Value adj.P.Val B
odds
odds.Prob
6,84
8,33 0,00000 0,00001 9,32
11111,0
1,00
6,68
5,60 0,00001 0,00499 3,61
37,1
0,97
8,13 -12,07 0,00000 0,00000 15,25 4212571,9
1,00
miRNA
mghv-miR-M1-7-3p
mmu-miR-471
Efeito da Interação Linhagem x Timócito
logFC AveExpr
t
P.Value adj.P.Val B
-0,67
6,85
-5,82 0,00001 0,00431 3,81
-0,69
6,76
-6,50 0,00000 0,00164 5,18
miRNA
mmu-miR-202-3p
mmu-miR-365
mmu-miR-301a
mmu-miR-878-3p
mmu-miR-697
mmu-miR-139-5p
mmu-miR-30b
mmu-miR-96
mmu-miR-324-5p
mmu-miR-107
mmu-miR-148b
mmu-miR-183
mmu-miR-193
mmu-miR-10a
mmu-miR-103
mmu-miR-9
mmu-miR-9*
mmu-miR-335-5p
mmu-miR-130a
mmu-miR-30a
mmu-miR-221
mmu-miR-467b
mmu-let-7i
mmu-miR-669a
mmu-let-7d
mmu-miR-27b
mmu-miR-222
mmu-miR-23b
mmu-miR-466a-3p
mmu-miR-350
t
P.Value
6,49 0,00000
5,94 0,00000
6,35 0,00000
8,31 0,00000
5,41 0,00001
9,66 0,00000
5,58 0,00001
6,56 0,00000
5,38 0,00002
7,58 0,00000
5,67 0,00001
5,80 0,00001
6,50 0,00000
6,32 0,00000
5,61 0,00001
-6,10 0,00000
-5,60 0,00001
-8,06 0,00000
-5,39 0,00002
-5,55 0,00001
-5,51 0,00001
-5,83 0,00001
-6,63 0,00000
-7,89 0,00000
-5,79 0,00001
-9,10 0,00000
-6,71 0,00000
-9,91 0,00000
-6,44 0,00000
-8,82 0,00000
adj.P.Va
l
0,00008
0,00022
0,00010
0,00000
0,00060
0,00000
0,00043
0,00007
0,00063
0,00001
0,00038
0,00028
0,00008
0,00010
0,00042
0,00015
0,00042
0,00001
0,00063
0,00045
0,00049
0,00028
0,00006
0,00001
0,00028
0,00000
0,00005
0,00000
0,00008
0,00000
B
odds
5,69
297,0
4,38
80,0
5,36
212,9
9,80 18021,5
3,10
22,1
12,52 272397,1
3,51
33,4
5,86
350,8
3,01
20,4
8,21
3682,2
3,71
41,0
4,05
57,2
5,73
309,0
5,30
199,7
3,57
35,6
4,78
118,6
3,56
35,2
9,25 10431,4
3,04
20,8
3,44
31,0
3,33
28,0
4,11
60,6
6,03
416,2
8,89
7252,6
4,03
56,2
11,42 91153,5
6,23
506,9
12,99 438200,1
5,58
264,0
10,84 51217,3
odds.Pro
b
1,00
0,99
1,00
1,00
0,96
1,00
0,97
1,00
0,95
1,00
0,98
0,98
1,00
1,00
0,97
0,99
0,97
1,00
0,95
0,97
0,97
0,98
1,00
1,00
0,98
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
odds
odds.Prob
45,1
0,98
176,9
0,99
102