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X Salão de
Iniciação Científica
PUCRS
Isolamento de cepas petite a partir de cepas ambientais de
leveduras e análise do seu potencial para a produção de etanol
a partir de fontes de carbono alternativas
Oliveira, A.S.1; Einloft, T.C.1; Medina-Silva, R.1 (orientador)
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Faculdade de Biociências, PUCRS
Introdução
O microorganismo mais comumente utilizado para fermentação alcoólica na produção
de etanol industrial é a levedura Saccharomyces cerevisiae. Esta levedura apresenta
metabolismo anaeróbio facultativo, mas pode sobreviver dependendo exclusivamente de
seu metabolismo fermentativo, na condição celular chamada de petite (CONTAMINE, V.;
PICARD, M., 2000).
As cepas utilizadas em processos de fermentação alcoólica industrial
devem apresentar algumas características importantes, dentre elas: alta taxa de produção
de etanol, baixa concentração de relativa de biomassa e resistência aos produtos da
fermentação. As células petite, em relação às respirantes, costumam ser mais resistentes
a químicos, além de apresentar taxas de produção de etanol mais elevadas (HUTTER, A.,
1998) Além disso, petites não precisam ser confinadas em ambientes anóxicos para
fermentar e não consomem o produto final, o etanol. Dentro deste contexto, os objetivos
deste trabalho foram: 1. Isolar leveduras petite a partir de diferentes cepas, laboratoriais
e ambientais (a partir de frutas); 2. Investigar características de interesse para a
produção de etanol de tais isolados, como eficiência de fermentação alcoólica,
resistência aos produtos de fermentação e estabilidade da sua condição petite. Na
primeira etapa do trabalho, realizada com cepas laboratoriais de S. cerevisiae,
obtivemos como resultados seis isolados petites, dois dos quais se mostraram estáveis
nesta condição, bem como bastante eficientes em termos de fermentação alcoólica e
resistentes ao etanol. Além disso, um deles mostrou-se capaz de realizar fermentação
alcoólica a partir de uma fonte de carbono originada a partir de refugos agrícolas do
cultivo do arroz, dentro de uma colaboração com a Faculdade de Química (PUCRS).
Nesta nova etapa do trabalho, iniciamos as mesmas análises utilizando cepas ambientais
de leveduras, isoladas a partir de frutas.
Metodologia
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Leveduras coletadas a partir de casca de uva (Vitis sp.) foram utilizadas para o
isolamento de colônias petites. Para tal, coletou-se, com o uso de um suabe estéril,
material da casca da uva, que foi semeado em meio fermentável sólido YPD (2% de
glicose, 2% de peptona e 1% de extrato de levedura, adicionado de ágar a 2%) com
cloranfenicol na concentração de 0,1 mg/ml, de forma a se obter colônias isoladas, após
cultivo a 30oC. A partir desta, um pré-inóculo em 5 ml de YPD líquido foi cultivado a
30oC até fase exponencial (~107UFC/ml), diluído e semeado nos meios sólidos YPD e
YPG (2% de glicerol,. 2% de peptona e 1% de extrato de levedura, adicionado de ágar a
2%). Estes cultivos em placa de petri foram submetidos à coloração de colônias com
top-ágar (0,7%) contendo 0,05% de cloreto de trifenil-tetrazólio (TTC) (OGUR, M.;
ST.JOHN, R.; NAGAI, S., 1957)
, com o objetivo de identificar e isolar colônias petite
(brancas) dentre as respirantes (vermelhas). Escolheu-se oito colônias como prováveis
petites, que foram e semeadas novamente em YPD e YPG sólidos e analisadas
microscopicamente, após coloração simples. Para analisar a produção de gás (eficiência
de fermentação alcoólica) foram feitos oito inóculos a partir das colônias isoladas da
cepa de uva, uma cepa laboratorial selvagem (FF18733), uma laboratorial mutante
(MM101) e uma cepa petite isolada a partir de MM101 (MMρ1). 100 µl destes inóculos
foram inoculados em tubos contendo YPD líquido e tubos de Durhan e cultivados
durante um dia a 30oC em estufa. Após, mediu-se as colunas de ar produzidas para se ter
uma noção da capacidade fermentativa das cepas. As cepas laboratoriais selvagem
FF18733, mutante MM101 e petite MMρ1 foram usadas como controle.
Resultados e Discussão
Somente o pré-inóculo diluído e semeado em YPD teve crescimento significativo de
colônias isoladas, enquanto o meio não-fermentável YPG ficou ausente de crescimento.
No teste de coloração de colônias com top-ágar TTC, colônias grandes, médias ou
pequenas mostraram-se fracamente coradas, algumas com e outras sem auréola
vermelha. De qualquer forma, oito colônias pequenas foram escolhidas como prováveis
petites, condição celular que o que não foi confirmada em um segundo cultivo em meio
YPG, pois nem as colônias-controle grandes (prováveis respirantes) cresceram neste
meio. Este dado indicou que a levedura coletada não apresentou capacidade de
aproveitar o glicerol como fonte de carbono. Após a observação microscópica das oito
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colônias escolhidas como prováveis petites, foi confirmado, através da análise da sua
morfologia, que a levedura não se tratava de S. cerevisiae. Entretanto, nos testes de
eficiência de fermentação alcoólica, os inóculos feitos com os isolados Uva A.II e Uva
A.VI desta levedura produziram uma grande quantidade de gás, que mostrou-se
semelhante nos dois experimentos realizados. Uva A.I, Uva A.III, Uva A.IV e Uva A.V
mostraram-se instáveis, produzindo quantidades muito diferentes de gás nos dois
experimentos. Uva A.VII e Uva A.VIII foram analisados somente uma vez, o primeiro
não apresentando produção de gás e o segundo apresentando muita produção de gás. As
cepas laboratoriais usadas como controle, selvagem FF18733, mutante MM101 e petite
MMρ1 apresentaram os níveis de produção de gás observados nos experimentos da
primeira etapa do trabalho.
Conclusão
Nesta segunda etapa do trabalho, as análises iniciais da levedura coletada a partir da uva
mostraram que não se trata da espécie S. cerevisiae, pois além apresentar morfologia
distinta desta espécie, não se mostrou capaz de crescer em meio de cultura com glicerol
como única fonte de carbono, além de suas colônias não se corarem muito bem com o
TTC. Entretanto, dados preliminares indicaram que esta levedura mostra-se bastante
eficiente para realizar fermentação alcoólica, o que tem nos levado a continuar
realizando testes para avaliar a sua condição fermentativa, bem como de resistência ao
etanol. Ainda como perspectivas, em primeiro lugar serão realizadas provas bioquímicas
para a identificação desta levedura pelo menos em nível de gênero. Além disso, novas
coletas a partir de uva e outras frutas também serão realizadas para se obter pelo menos
uma levedura ambiental (de preferência S. cerevisiae) que seja capaz de induzir a
condição celular petite, a qual será avaliada, como realizado na primeira etapa do
trabalho, em relação à sua adequação para fermentações alcoólicas industriais.
Referências
CONTAMINE, V.; PICARD, M. Maintenance and integrity of the mitochondrial genome: a plethora of
nuclear genes in the budding yeast. Microbiol Mol Biol Rev v. 64(2), p. 281-315, 2000.
HUTTER, A. Ethanol production using nuclear petite yeast mutants. Appl Microbiol Biotechnol 49, p.
511-6, 1998.
OGUR, M.; ST.JOHN, R.; NAGAI, S. Tetrazolium overlay technique for population studies of
respiration deficiency in yeast. Science v. 125 (3254), p. 928-9, 1957.
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