UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Estudo da imobilização de proteases para a síntese de oligopeptídeos
Fábio Pereira Fagundes
_______________________________________
Tese de Doutorado
Natal/RN, setembro de 2011
Fabio Pereira Fagundes
Estudo da imobilização de proteases para a síntese de oligolisinas
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduaçãoo em
Química da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como requisito para a obtenção do título de
Doutor em Química.
Orientadora: Profa. Dra Marta Costa
Co-Orientador: Prof. Dr Richard Gross
Natal, RN
2011
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Instituto de Química
Fagundes, Fabio Pereira.
Estudo da imobilização de proteases para a síntese de oligolisinas / Fabio Pereira
Fagundes. Natal, RN, 2011.
142 f.
Orientadora: Marta Costa
Co-Oreintador: Ricard Gross
Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química.
1. Síntese enzimática - Tese. 2. Imobilização por ligação covalente - Tese. 3.
Aprisionamento em géis de PVA – Tese. 4. Proteases – Tese. 5. Oligopeptídeos Tese. I.
Costa, Marta. II. Gross, Richard. III. Universidade Federal do Rio Grande
do Norte. IV. Título.
RN/UFRN/BSE- Química
CDU 577.151.5(043)
Dedico...
À minha família, Carmélia, Vitória, Pedro e meu pai-avô Sebastião (todos in memorian), meu tio
Geraldo, minha irmã Izabel Vitória e especialmente a minha mãe Concebida e minha tia Graça
pelo incansável apoio em todas as etapas da minha vida, pelo exemplo de dedicação, confiança,
dignidade, amor, enfim, a vocês que tanto se doaram para que eu atingisse meus objetivos de
vida, minha gratidão e respeito.
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos...
A Deus, pelo milagre da vida, por amanhecer, pela tua companhia, pelas dores,
dificuldades e derrotas, pois com elas aprendi o significado das palavras perseverança e fé.
Obrigado senhor, pela oportunidade de dizer OBRIGADO!
À profa Dra Marta Costa pela paciência, confiança, apoio e orientação.
À profa Dra Rosangela Balaban, que tenho o privilégio de fazer parte do seu grupo de
pesquisa, pela sua compreensão, paciência, dedicação e exemplo de ética e profissionalismo.
Além do incentivo constante, quando por algumas vezes quis desistir, meu reconhecimento.
Ao pesquisador Hélder Girão, pelo apoio, incentivo e confiança em todos esses anos de
trabalho.
A toda família LAPET, especialmente a equipe de fluidos de perfuração pela dedicação e
profissionalismo e à Keila Alves e Rosa Vidal por todo carinho e apoio dispensados a mim
durante esses anos de convívio.
Aos integrantes do LAQOA, especialmente à Suzan Ialy pelo apoio, confiança e amizade.
I would like to take this opportunity to express my deep gratitude to my adviser Prof. Dr.
Richard Gross (NYU-POLY) for offering me the opportunity to conduct this research and
providing invaluable guidance and support. I am grateful to my colleagues who helped a lot at
Laboratory of bioprocessing and biocatalysis (NYU-POLY), especially Xu Qin, Viswanathan
Kodanda Raman, Wenhua Lu, Chunxiao Han and Fei Liu for all the helpful and support.
I would like to say thanks to my friends Shuopeng Yuan, Hem Joshi and Manoj Ganesh
for encouraging me to continue my research and helped me to show NY City another way. My
friends, thanks a lot!!!
Aos amigos Gregory Zamora, Paulo Marcelo e Ian de Albuquerque, pela pronta
disponibilidade em ajudar e por me proporcionarem momentos de descontração e alegria.
À minha namorada Keila Regina, por estar a tão pouco tempo em minha vida e se revelar
uma pessoa tão especial, capaz de me fazer entender que 1 minuto não representa
necessariamente 60 segundos.
À amiga Alexsandra de Souza Silva por ter sido uma excelente parceira todos esses anos,
por todo incentivo, atenção, carinho e apoio nas horas difíceis.
Ao amigo Maurício Borges, pelo exemplo de inteligência, companheirismo e por
proporcionar tantos momentos de intercâmbio profissional e descontração.
Fabio Pereira Fagundes
À família Vitor, em especial à Dona Júlia por representar um exemplo ímpar de pessoa,
pela atenção, carinho e respeito para comigo.
Ao amigo Gláucio Morais por toda a sua lealdade, cumplicidade e amizade em todos
esses anos.
À professora Lisa Burger pelo apoio circunstancial na preparação para o TOEFL.
À amiga Edna, por toda cumplicidade, amizade e compreensão.
Aos amigos Roberto José, Céliton Fernandes e Gilberto Júnior pela compreensão,
respeito, incentivo e companheirismo durante esses 26 anos de amizade.
Aos parceiros Adriano Valentim, Cleuton Marcelino, Ederson da Silva Rocha e Emanuel
Fausto por fazerem parte da minha vida em quaisquer que sejam os momentos vividos.
Ao inesquecível amigo Ricardo Verdille (in memorian), pelo apoio, amizade e
oportunidade.
Ao Cnpq pela bolsa concedida através do Programa de Recursos Humanos.
Fabio Pereira Fagundes
Aprendi que..
“...devemos planejar menos e viver mais! A cada dia que vivo, mais me convenço de que o
desperdício da vida está no amor que não damos, nos beijos não correspondidos, nas conversas
não compartilhadas, nas forças que não usamos, na prudência egoísta que nada arrisca, e que
esquivando-se do sofrimento, faz perder também a felicidade”.
“...infelizmente, nem sempre há tempo. A vida é feita de desencontros, descompassos, como
passageiros numa estação de trem, chegadas e partidas podem ser decisivas para nossos destinos.
A vida não espera”.
Fabio Pereira Fagundes
RESUMO
Síntese enzimática de peptídeos usando proteases tem atraído uma enorme atenção nos
últimos anos. Um desafio chave na síntese de peptídeos é encontrar suportes para imobilização de
proteases capazes de apresentar um alto desempenho em meio aquoso, produzindo oligopeptídeos
solúveis em água, já que até o presente momento, pouco tem sido descrito usando essa estratégia.
Dessa forma, o objetivo dessa tese foi imobilizar proteases usando diferentes métodos
(imobilização por ligação covalente, aprisionamento em géis poliméricos de PVA e imobilização
em nanopartículas magnéticas de Glicidil) para a produção de oligopeptídeos derivados da lisina.
Três proteases foram utilizadas: tripsina, α-quimotripsina e bromelaína. De acordo com as
estratégias de imobilização associadas ao tipo de protease empregada, foi provado que os
sistemas tripsina-resinas mostraram os melhores desempenhos em termos de atividade hidrolítica
e síntese de oligopeptídeos. A atividade hidrolítica das enzimas livres e imobilizadas foi
determinada por espectrofotometria com base na mudança de absorbância em 660 nm à
temperatura de 25 °C (Casein method). O rendimento de oligolisina e o cálculo do grau de
polimerização médio foram monitorados por RMN H. A protease tripsina foi covalentemente
imobilizada em quatro diferentes resinas (Amberzyme, Eupergit C, Eupergit CM and Grace 192).
O máximo rendimento de proteína imobilizada foi 92, 82, 60, e 71 mg/g de suporte para cada
resina, respectivamente. A eficiência desses sistemas (Tripsina-resinas) foi avaliada pela hidrólise
do substrato caseína e a síntese de oligolisina em meio aquoso. A maioria dos sistemas foram
capazes de catalisar a síntese de oligopeptídeos, entretanto com diferentes eficiências, tais como:
40, 37 e 35% para os suportes Amberzyme, Eupergit C e Eupergit CM, respectivamente, em
comparação com a enzima livre. Esses sistemas produziram oligômeros em somente 1 hora com
grau de polimerização médio mais alto que a enzima livre. Dentre esses sistemas, Eupergit CTripsina mostrou ser mais eficiente que os outros sistemas em termos de atividade hidrolítica e
estabilidade térmica, ao passo que não exibiu a mesma eficiência como era esperado para a
síntese de oligolisina. Tripsina-amberzyme provou ser mais eficiente para a síntese de
oligopeptídeos, além de exibir um excelente reuso, mantendo 90% de sua atividade hidrolítica e
sintética após sete reusos. As interações hidrofóbicas da tripsina com o suporte Amberzyme são
responsáveis por proteger a enzima contra as fortes mudanças conformacionais no meio
reacional. Além disso, a alta concentração de grupos oxiranos na superfície da resina promoveu
ligações covalentes multipontuais e, consequentemente, preveniu a enzima imobilizada do
Fabio Pereira Fagundes
processo de desorção (Leaching process). Os resultados acima mencionados sugerem que a
tripsina imobilizada nesses suportes pode ser eficientemente usada para a síntese de
oligopeptídeos em meio aquoso.
Palavras-chave: Síntese enzimática. Imobilização por ligação covalente. Aprisionamento em géis
de PVA. Nanopartículas magnéticas de glicidila. Proteases. Oligopeptídeos.
Fabio Pereira Fagundes
ABSTRACT
Enzymatic synthesis of peptides using proteases has attracted a great deal of attention in
recent years. One key challenge in peptide synthesis is to find supports for protease
immobilization capable of working in aqueous medium at high performance, producing watersoluble oligopeptides. At present, few reports have been described using this strategy. Therefore,
the aim of this thesis was to immobilize proteases applying different methods (Immobilization by
covalent bound, entrapment onto polymeric gels of PVA and immobilization on glycidil
metacrylate magnetic nanoparticles) in order to produce water-soluble oligopeptides derived from
lysine. Three different proteases were used: trypsin, α-chymotrypsin and bromelain. According to
immobilization strategies associated to the type of protease employed, trypsin-resin systems
showed the best performance in terms of hydrolytic activity and oligopeptides synthesis.
Hydrolytic
activities
of
the
free
and
immobilized
enzymes
were
determined
spectrophotometrically based on the absorbance change at 660 nm at 25 °C (Casein method).
Calculations of oligolysine yield and average degree of polymerization (DPavg) were monitored
by
1
H-NMR analysis. Trypsin was covalently immobilized onto four different resins
(Amberzyme, Eupergit C, Eupergit CM and Grace 192). Maximum yield of bound protein was 92
mg/g, 82 mg/g and 60 mg/g support for each resin respectively. The effectiveness of these
systems (Trypsin-resins) was evaluated by hydrolysis of casein and synthesis of water-soluble
oligolysine. Most systems were capable of catalyzing oligopeptide synthesis in aqueous medium,
albeit at different efficiencies, namely: 40, 37 and 35% for Amberzyme, Eupergit C and Eupergit
CM, respectively, in comparison with free enzyme. These systems produced oligomers in only 1
hour with DPavg higher than free enzyme. Among these systems, the Eupergit C-Trypsin system
showed greater efficiency than others in terms of hydrolytic activity and thermal stability.
However, this did not occur for oligolysine synthesis. Trypsin-Amberzyme proved to be more
successful in oligopeptide synthesis, and exhibited excellent reusability, since it retained 90% of
its initial hydrolytic and synthetic activity after 7 reuses. Trypsin hydrophobic interactions with
Amberzyme support are responsible for protecting against strong enzyme conformational
changes in the medium. In addition, the high concentration of oxirane groups on the surface
promoted multi-covalent linking and, consequently, prevented the immobilized enzyme from
Fabio Pereira Fagundes
leaching. The aforementioned results suggest that immobilized Trypsin on the supports evaluated
can be efficiently used for oligopeptides synthesis in aqueous media.
Key words: Enzymatic synthesis. Covalent immobilization. PVA gels entrapment. Glycidil
magnetic nanoparticles. Proteases. Oligopeptides.
Fabio Pereira Fagundes
SUMARIO
1
INTRODUÇÃO GERAL....................................................................
1.1
INTRODUÇÃO..................................................................................... 20
1.2
OBJETIVOS………………………………………………………….. 22
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA……………………………………... 24
2.1
CINÉTICA DE REAÇÃO- EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN 24
2.2
PROTEASIS.......................................................................................... 25
2.2.1
Degradação das proteases pelo mecanismo de autólise...................
26
2.2.2
Imobilização de enzimas: proteases....................................................
30
2.2.2.1
Estabilização das enzimas via imobilização por ligação covalente......
31
2.2.2.1.1 Seleção de suportes adequados para imobilização...........................
31
2.2.2.1.2 Condições ideais para a imobilização por ligação covalente...........
32
2.2.2.1.3 Fatores que influenciam a retenção da atividade catalítica............
34
2.2.2.2
41
Imobilização de enzimas em géis poliméricos (Entrapment)...............
20
2.2.2.2.1 Criogéis poliméricos – Diagrama conceitual de sua formação........ 45
2.2.2.2.2 Criogéis poliméricos de PVA.............................................................. 46
2.2.2.3
Imobilização de enzimas em nanopartículas magnéticas......................
48
2.3
ENZIMAS: AMINOÁCIDOS PARA LIGAÇÃO COVALENTE.......
51
2.4
SÍNTESE DE PEPTÍDEOS USANDO PROTEASES.........................
53
3
MATERIAL E MÉTODOS................................................................ 58
3.1
MATERIAL..........................................................................................
3.2
EQUIPAMENTOS................................................................................ 59
3.3
FLUXOGRAMA GERAL....................................................................
59
3.4
SELEÇÃO DAS ENZIMAS.................................................................
60
3.5
ENSAIO DE ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
– SDS – PAGE GEL.............................................................................
58
61
3.6
IMOBILIZAÇÃO DAS ENZIMAS...................................................... 61
3.6.1
Imobilização das enzimas por ligação covalente..............................
3.6.1.1
Determinação da quantidade de enzima aprisionada na matriz –
61
Método de BCA..................................................................................... 62
Fabio Pereira Fagundes
3.6.1.2
Determinação da atividade hidrolítica da protease livre e imobilizada. 63
3.6.1.3
Determinação do processo de autólise das proteases............................
65
3.6.1.4
Reusabilidade dos sistemas...................................................................
65
3.6.1.5
Avaliação da termoestabilidade dos suportes........................................ 65
3.6.2
Imobilização das enzimas por aprisionamento em géis de poli
álcool vinílico (PVA)............................................................................ 65
3.6.2.1
Obtenção dos criogéis de PVA.............................................................. 65
3.6.2.2
Imobilização da protease bromelaína em criogéis................................
3.6.2.3
Influência do número de f-t ciclos nas propriedades estruturais dos
66
sistemas PVA-enzima............................................................................ 66
3.6.3
Imobilização de enzimas em nanopartículas magnéticas (MNPs –
Magnetic nanoparticles)...................................................................... 68
3.7
SÍNTESE DE OLIGOPEPTÍDEOS SOLÚVEIS EM ÁGUA
USANDO AS PROTEASES IMOBILIZADAS................................... 69
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................
71
4.1
AVALIAÇÃO DA PUREZA DAS PROTEASES POR SDS-PAGE..
71
4.2
DETERMINAÇÃO DO PERCENTUAL DE ENZIMA PRESENTE
NA PROTEÍNA....................................................................................
4.3
73
INFLUÊNCIA DO PROCESSO DE AUTÓLISE NA ATIVIDADE
RESIDUAL DAS PROTEASES........................................................... 75
4.4
IMOBILIZAÇÃO DAS PROTEASES POR LIGAÇÃO
COVALENTE.......................................................................................
78
4.4.1
Determinação do percentual de protease imobilizada na matriz.... 78
4.4.2
Imobilização da protease tripsina por ligação covalente em
suportes epóxi ativados......................................................................
79
4.4.3
Reusabilidade dos sistemas................................................................. 82
4.4.4
Termoestabilidade dos sistemas.........................................................
4.4.5
Imobilização da protease α-quimotripsina por ligação covalente
84
em suportes epóxi-ativados................................................................. 87
4.4.6
Imobilização de bromelaína em suportes epóxi................................ 89
4.4.7
Determinação da atividade sintética dos sistemas............................ 92
Fabio Pereira Fagundes
4.4.7.1
Cálculo do rendimento de oligolisina por RMN 1H..............................
4.4.7.2
Efeito do pH no rendimento e no grau de polimerização dos produtos
obtidos...................................................................................................
4.5
98
IMOBILIZAÇÃO DA PROTEASE BROMELAÍNA POR
APRISIONAMENTO EM GEL DE PVA – CRIOGÉIS......................
4.5.1
95
106
Influência da concentração polimérica e do tempo de
congelamento na formação dos poros................................................ 109
4.5.2
Influência da concentração da enzima na formação de poros dos
criogéis.................................................................................................. 112
4.5.3
Influência do número de ciclos f-t na morfologia interna dos
poros nos criogéis................................................................................. 114
4.6
IMOBILIZAÇÃO DA Α-QUIMOTRIPSINA EM
NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE METACRILATO DE
GLICIDILA........................................................................................... 116
5
CONCLUSÕES...................................................................................
6
PERSPECTIVAS FUTURAS............................................................. 123
REFERÊNCIAS.................................................................................
Fabio Pereira Fagundes
120
125
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Teorema de Michaelis-Menten aplicado à velocidade inicial da reação (V0) em
função da concentração do substrato([S]).................................................................. 25
Figura 2
Imobilização da protease tripsina em diferentes polissacarídeos (CMC e
alginato).....................................................................................................................
29
Figura 3
Autólise da tripsina livre e imobilizada.....................................................................
30
Figura 4
Relação entre a posição da enzima e o tempo necessário para difundí-la dentro do
poro............................................................................................................................
Figura 5
Relação entre o tamanho de poro do suporte e a eficiência de ocupação da
enzima........................................................................................................................
Figura 6
38
Atividade específica em função do tamanho de poro do suporte (sílica) e da
quantidade de tripsina imobilizada............................................................................
Figura 8
37
Modelo ilustrativo do tamanho de poro mínimo necessário para a eliminação dos
limites de difusão.......................................................................................................
Figura 7
34
39
Influência da densidade dos grupos funcionais no processo de imobilização e
estabilização da enzima.............................................................................................. 40
Figura 9
Ilustração do processo de gelificação física do polímero com a enzima aprisionada
na matrix....................................................................................................................
Figura 10
43
Modelo ilustrativo da reticulação do alginato de sódio em presenca de íons cálcio
para aprisionamento da enzima.................................................................................. 44
Figura 11
Diagrama de formação de criogéis poliméricos......................................................... 46
Figura 12
Interações intra e intermoleculares das moléculas de PVA.......................................
47
Figura 13
Superfície de nanopartículas de ferro revestidas com sílica......................................
49
Figura 14
Ilustração esquemática da combinação dos modelos clássicos para o surgimento
de uma nova técnica aplicada para a imobilização de enzimas – SEN’s (SENs –
Single enzyme nanoparticles)..................................................................................... 51
Figura 15
Figura 16
Resíduos de aminoácidos presentes nas enzimas no processo de
imobilização...............................................................................................................
53
Ilustração esquemática de uma reação catalisada por protease...............
55
Fabio Pereira Fagundes
Figura 17
Procedimentos empregados para a imobilização das enzimas e sua aplicação para
a determinação da atividade hidrolítica e síntese de oligopeptídeos.........................
Figura 18
Ilustração do procedimento adotado na preparação de géis de PVA para
imobilização de enzimas............................................................................................
Figura 19
60
66
Ilustração do procedimento adotado na imobilização da protease α-quimotripsina
em nanopartículas magnéticas de metacrilato de glicidila......................................... 68
Figura 20
Eletroforese em gel de poliacriliamida - SDS-PAGE das bandas referentes às
proteases..................................................................................................................... 72
Figura 21
Área das bandas de BSA em função de suas respectivas concentrações...................
Figura 22
Atividade residual das proteases (tripsina, α-quimotripsina e bromelaína) em
função do tempo.........................................................................................................
Figura 23
73
76
Absorbância em função das diferentes concentrações (mgmL) de BSA e das
proteases utilizadas....................................................................................................
78
Figura 24
Percentual de imobilização da protease tripsina em função do tempo......................
79
Figura 25
Ciclos de reuso da tripsina imobilizada nos suportes Amberzyme, Grace, Eupergit
C e Eupergit CM........................................................................................................
83
Figura 26
Atividade hidrolítica da tripsina livre e imobilizada em função da temperatura......
85
Figura 27
Modelo ilustrativo da evolução da conformação da hélice da enzima ao longo do
tempo.........................................................................................................................
86
Figura 28
Percentual de imobilização da protease α-quimotripsina em função do tempo.........
87
Figura 29
Percentual de imobilização da protease bromelaína em função do tempo em
diferentes suportes.....................................................................................................
90
Figura 30
Mecanismo de ação da protease α-quimotripsina na hidrólise da lisina....................
93
Figura 31
Mecanismo de ação da protease α-quimotripsina na síntese de oligopeptídeos........
94
Figura 32
Espectros de RMN 1H correspondentes aos dímeros, trímeros, tetrâmeros e
oligômeros derivados da lisina...................................................................................
96
Figura 33
Percentual de rendimento de oligolisina na reação em função do pH do meio.........
98
Figura 34
Grau de polimerização médio dos monômeros de lisina em função do pH para as
diferentes proteases utilizadas....................................................................................
Figura 35
99
Influência do pH no percentual de conversão do monômero de lisina em
oligolisinas.................................................................................................................
Fabio Pereira Fagundes
100
Figura 36
Percentual de rendimento dos sistemas em função do número de reusos.................. 101
Figura 37
Grau de polimerização dos sistemas (suporte-tripsina) e tripsina livre em função
do pH.......................................................................................................................... 103
Figura 38
Grau de polimerização em função do número de ciclos para cada sistema
utilizado.....................................................................................................................
Figura 39
105
Modelo ilustrativo da determinação do rendimento e do grau de polimerização
para uma mesma molécula......................................................................................... 106
Figura 40
Micrografias obtidas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) da área
transversal dos criogéis de PVA formados em meio aquoso.....................................
Figura 41
110
Representação esquemática da rede polimérica de PVA em diferentes
concentrações, evidenciando o maior grau de entrelaçamentos físicos e interações
físico-químicas entre as cadeias poliméricas com o aumento da concentração de
polímero e, consequentemente, diminuição do tamanho de poros e porosidade
(conectividade entre os poros)...................................................................................
Figura 42
Micrografias obtidas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) dos
criogéis de PVA 8% contendo diferentes concentrações de bromelaína...................
Figura 43
111
113
Micrografias obtidas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
evidenciando as mudanças na estrutura interna dos criogéis de PVA 8% durante o
processo de congelamento-descongelamento............................................................
Figura 44
115
Percentual de imobilização da quimotripsina em função do tempo........................... 116
Fabio Pereira Fagundes
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Especificidade de várias proteases........................................................................
Tabela 2
Características físicas das resinas.......................................................................... 58
Tabela 3
Dados comparativos de área, concentração estimada (mgmL) e percentual de
pureza das proteases usadas..................................................................................
Tabela 4
54
74
Dados relativos aos parâmetros estruturais dos suportes e os resultados
referentes à Carga Teoricamente Imobilizada (CTI) da protease tripsina,
Eficiência de imobilização (EI), Atividade hidrolítica e relativa dos sistemas
usados (suporte-tripsina).......................................................................................
Tabela 5
80
Dados relativos à quantidade de tripsina imobilizada/500 mg de suporte,
tripsina desorvida (mg) e o seu percentual em relação aos diferentes suportes
utilizados nesse trabalho........................................................................................ 84
Tabela 6
Dados relativos à Carga teoricamente imobilizada da protease α-quimotripsina
(%), Eficiência de imobilização (%), Atividade hidrolítica (Unitsg de enzima)
e Atividade relativa (%) dos sistemas usados.......................................................
Tabela 7
88
Dados relativos à quantidade de α-quimotripsina imobilizada/500 mg de
suporte, tripsina desorvida (mg) e o seu percentual em relação aos diferentes
suportes utilizados nesse trabalho.........................................................................
Tabela 8
89
Dados relativos à Carga Teoricamente Imobilizada da Bromelaína (%),
Eficiência de imobilização (%), Atividade hidrolítica (Unitsg de enzima) e
Atividade relativa (%) dos sistemas usados..........................................................
Tabela 9
91
Fórmulas empíricas atribuídas aos picos referentes a dímeros, trímeros,
tetrâmeros e oligômeros........................................................................................
98
Tabela 10 Efeito da concentração de PVA na aparência, forma e estabilidade dos géis
formados...............................................................................................................
107
Tabela 11 Influência da concentração de PVA (diferentes massas molares) na estabilidade
operacional, atividade hidrolítica e reusabilidade dos criogéis obtidos sob o
formato de filme....................................................................................................
108
Tabela 12 Dados comparativos referentes à CTI, EI, AH (Unitsg de enzima) e AR (%)
dos sistemas usados...............................................................................................
Fabio Pereira Fagundes
117
LISTA DE ABREVIATURAS E SIMBOLOGIAS
re – Raio da enzima
rp – Raio de poro
SENs – Single enzyme nanoparticles
N f-t ciclos – Número de ciclos de congelamento e descongelamento
SDS-PAGE – Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida
BSA – Bovine Serum Albumin (Albumina Serínica Bovina)
Tpartícula – Tamanho de partícula
Dporo – Diâmetro de poro
DGF – Densidade do grupo funcional
CTI – Carga Teoricamente Imobilizada
EI – Eficiência de imobilização
GP – Grau de polimerização
P – Taxa de conversão
PVA – Poli(alcoolvinílico)
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
RMN 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
AH – Atividade Hidrolítica
AR – Atividade Residual
MNPs – Nanopartículas magnéticas
Fabio Pereira Fagundes
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO GERAL
Capítulo I: Introdução
1
19
INTRODUÇÃO GERAL
1.1 INTRODUÇÃO
Peptídeos representam uma importante classe de moléculas biologicamente ativas com
extrema diversificação funcional (TAGUCHI et al., 2008). Essa versatilidade é atribuída às
inúmeras reações e processos biológicos onde eles atuam. Dentre os inúmeros processos, pode-se
destacar o tripeptídeo Glutationa, o qual constitui o principal sistema celular redox e desempenha
uma variedade de funcões, desde a desintoxicação a proteção contra danos oxidativos
(CHAKRAVARTHI et al., 2006). Outro exemplo refere-se a um peptídeo de 36 resíduos de
aminoácidos, conhecido comercialmente como Eufuvirtide (Fuzeon), usado como inibidor de
fusão do vírus HIV em pacientes infectados com HIV multi-resistente, sendo o primeiro
representante de uma nova classe de drogas anti-retrovirais (MATHEWS et al., 2004). Além
desses, pode-se ainda destacar, a ação diurética do hormônio vasopressina (peptídeo) no aumento
da pressão sanguínea, sendo o responsável pela absorção da água pelo rim (ALI et al., 2007).
Diante dessa diversidade funcional, um enorme interesse por essa classe de compostos e por
metodologias para sua produção, isolamento, purificação e quantificação vêm sendo
desenvolvidas. Os peptídeos constituem biomacromoléculas promissoras na busca por novos
fármacos, além de representar um desafio terapêutico no tratamento de inúmeras de doenças
(MATHARU et al., 2010; YAZBECK et al. 2009; STEVEN et al., 2004).
A síntese de polipeptídeos derivados de lisina para uso em sistemas de liberação
controlada de fármacos vem constituindo uma das principais aplicações desse aminoácido (SHIH
et al., 2006). A lisina apresenta uma alta hidrofilicidade e uma cadeia lateral maior que os
demais, fatores esses, que torna os produtos derivados desse substrato com enorme
potencialidade para aplicação in vivo (BANKAR; SINGHAL, 2010).
Em paralelo, as proteases, enzimas responsáveis pela quebra da ligação peptídica in vivo,
são consideradas o mais importante grupo de enzimas produzidas comercialmente para fins
industriais, onde uma de suas aplicações mais promissoras inclui a síntese de peptídeos sintéticos
(NOROTOMI et al., 2009; BORDUSA, 2002).
A obtenção de peptídeos via síntese enzimática tem atraído muita atenção devido a
inúmeras vantagens comparadas a síntese química convencional, tais como: Alta atividade
catalítica, especificidade e/ou regioespecifidade ao substrato, ausência de racemização e de outras
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo I: Introdução
20
reações secundárias típicas da síntese química, além de apresentar uma considerável viabilidade
econômica (SUN, et al., 2006; KUMAR; BALLA, 2005; BORDUZA, 2002; GILL; VULFSON,
1993). Por outro lado, o fato de não existir uma protease universal faz com que não haja uma
metodologia geral, aplicável a qualquer sequência peptídica, sendo assim, objeto contínuo de
pesquisa e desenvolvimento (MACHADO et al., 2004).
Outro fator importante a ser considerado refere-se à estabilidade das proteases. Essas
enzimas sofrem o processo de autólise ou autodegradacão, ou seja, a atividade catalítica no meio
reacional é negativamente influenciada pela inativação dos seus centros ativos. Dessa forma, um
catalisador “ideal” deve ser estável sob condições extremas de temperatura, pH, pressão e tempo
de estocagem (IYER, ANANTHANARAYAN, 2008). Diante disso, a literatura relata inúmeros
processos empregados para a estabilização das proteases, dentre os quais, o processo de
imobilização é considerado um dos mais eficientes, sendo considerado uma das estratégias mais
promissoras na aplicação de enzimas em reações de síntese, que além de oferecer vantagens em
relação a estabilidade e a reusabilidade (QIU et al., 2010), protege os sítios ativos da protease
frente ao processo de auto-degradação (PURCENA et al., 2009). De acordo com a literatura, os
processos de imobilização podem ser divididos em 5 grupos: (a) Ligação covalente da enzima no
suporte sólido, (b) adsorção, (c) aprisionamento em géis polimericos, (d) reticulação com
reagentes bifuncionais e (e) encapsulação (KUMAR; BALLA, 2005).
Recentemente, enorme atenção tem sido dada a investigação de proteases imobilizadas,
devido à ampla faixa de aplicações e a possibilidade de reuso, minimizando assim, os custos
operacionais (LI-SHENG et al., 2007). As proteases podem ser imobilizadas com baixa perda de
atividade e o seu potencial proteolítico para a síntese de peptídeos tem sido demonstrado.
Normalmente, essas reações ocorrem em presença de solvente orgânico (QUIROGA et al. 2008;
FILIPOVA et al., 2001), em virtude do deslocamento no equilíbrio da reação em favor da síntese
de oligopeptídeos. Por outro lado, os efeitos desse tipo de solvente em reações enzimáticas são
responsáveis pelo efeito competitivo com as enzimas, as interações eletrostáticas dos grupos
polares na enzima devem ser diferentes quando comparadas às aquelas em soluções aquosas e as
enzimas podem sofrer mudanças conformacionais extremas pelo contato com o solvente
orgânico, interferindo, portanto, em sua eficiência catalítica (BORDUSA, 2002).
As características físicas e químicas do suporte, o método de imobilização empregado e a
escolha da enzima são parâmetros cruciais na obtenção de um sistema cataliticamente eficaz.
Dentre os inúmeros suportes disponíveis comercialmente, os que apresentam grupos funcionais
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo I: Introdução
21
epoxi em sua estrutura têm sido amplamente usados e vêm recebendo grande atenção para
aplicações em larga escala, em virtude da fácil imobilização de proteínas e enzimas
(PRAMPARO et al., 2010). Adicionalmente, fatores como hidrofilicidadehidrofobicidade, área
superficial, diâmetro do poro, grupos reativos, rota de síntese e a viabilidade econômica devem
ser levados em conta para a escolha de um sistema ideal (CARAMORI et al., 2010).
1.2 OBJETIVOS
O desafio chave no uso de proteases na síntese de peptídeos é encontrar suportes e
estratégias de imobilização capazes de apresentar uma alta eficiencia enzimática em meio aquoso,
conforme reportados nos poucos trabalhos utilizando essa estratégia. Considerando o exposto e
buscando preencher a lacuna de informações existente, esse trabalho tem por objetivos principais:
(1) Imobilizar as proteases usando diferentes estratégias (Imobilização por ligação covalente
em resinas e em partículas nanomagnéticas de metacrilato de glicidila, além do aprisionamento
em géis poliméricos), com o intuito de avaliar a eficiência de imobilizacao e a atividade
hidrolítica de cada sistema obtido, além da termoestabilidade e reusabilidade dos sistemas que
apresentaram uma melhor eficiência catalítica.
(2) Sintetizar oligopeptídeos em meio aquoso com unidades de lisina usando os sistemas de
imobilização obtidos na etapa anterior.
Fabio Pereira Fagundes
CAPÍTULO II:
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
2
23
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 CINÉTICA DE REAÇÃO – EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
As enzimas desempenham um papel fundamental na cinética de reações bioquímicas. O
mecanismo de cinética de Michaelis-Menten é frequentemente usado para explicar as atividades
catalíticas de várias enzimas. De acordo com esse mecanismo, o substrato (S) se liga
reversivelmente a uma enzima (E) para formar um complexo intermediário (ES). Em seguida, ES
sofre uma decomposição unimolecular para formar um produto (P), e (E) é regenerado para o
próximo ciclo (YI; LIU, 2010). A Equação 1 descreve esse comportamento cinético.
(1)
A taxa de velocidade de formação do produto (V) apresenta uma dependência hiperbólica
com a concentração do substrato [S] (Figura 1). De acordo com a equação de velocidade (V)
temos: V = d[P]dt = k2[ET] [S] , onde kM= (k-1 + k2)k1 e representa a constante de MichaelisMenten. [ET] é a concentração total da enzima. Essa expressão de taxa de velocidade é conhecida
como equação de Michaelis-Menten, que fornece uma descrição do comportamento da cinética
de uma reação enzimática. Ao longo dos anos, esse teorema tem representado um dos pilares da
enzimologia e tem encontrado aplicações em diferentes sistemas de reações enzimáticas (YI;
LIU, 2010; CALDER; SIEGEL, 2008).
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
24
Figura 2 - Teorema de Michaelis-Menten aplicado à velocidade inicial da reação (V0) em função da concentração do
substrato ([S]).
Fonte: CALDER; SIEGEL, 2008
A relação entre a velocidade de reação de formação do produto e a concentração do
substrato pode ser descrita através de parâmetros cinéticos obtidos a partir da Equação de
Michaelis-Menten. Devido ao importante papel das enzimas na cinética de reações bioquímicas,
essa equação é uma ferramenta frequentemente usada para o entendimento da atividade catalítica
das mesmas (Fernandes et al., 2004).
2.2 PROTEASES
De acordo com a literatura, tem havido um crescente interesse no uso de proteases como
catalisadores industriais (GUPTA et al., 2006). As proteases constituem um dos mais importantes
grupos de enzimas industriais, sendo responsáveis por 60% da venda da produção de enzimas no
mundo (TRIPATHI et al., 2011). Essas enzimas pertencem à classe das hidrolases (*NC-IUB
peptidases), sendo ativas diretamente na cadeia de polipeptídeos. Atualmente, centenas delas são
utilizadas na hidrólise de ligações peptídicas. Devido ao fato de serem altamente estereo- e
regioespecíficas, agirem sob condições suaves de reação (pH, temperatura), apresentarem fácil
manuseio, não necessitarem de cofatores de alto custo e apresentarem uma arquitetura molecular
relativamente simples na maioria dos casos (BORDUSA, 2002), as proteases tornaram-se
ferramentas promissoras na síntese dirigida a clivagens de peptídeos. Esse tópico será discutido
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
25
ao fim desse capítulo, em virtude de requerer um maior aprofundamento no mecanismo de
catálise da protease em acelerar o reverso da reação de hidrólise, que representa atualmente um
desafio no campo de aplicação dessas enzimas em sínteses (KUMAR; BALLA, 2005;
BONGERS; HEIMER, 1994).
As proteases são classificadas em dois grupos principais: exopeptidases e endopeptidases.
As exopeptidases iniciam o processo de degradação a partir das extremidades amino ou carboxiterminal das proteínas, produzindo pequenos peptídeos ou até mesmo aminoácidos. As
endopeptidades clivam a proteína alvo na sua parte interna, distante das extremidades amino e
carboxi-terminal, gerando, dessa forma, peptídeos maiores. Além disso, há uma subclassificação
baseada em condições às quais elas são ativas (meio ácido, neutro ou alcalino) e nos grupos dos
sítios ativos de cada enzima (CARVALHO, 2007).
Proteases alcalinas são definidas como enzimas que atuam em uma faixa de pH alcalino,
apresentando um resíduo de serina ou metalo. Proteases serínicas alcalinas têm sido consideradas
o mais importante grupo de enzimas explorado comercialmente (TRIPATHI et al., 2011;
ABDEL-NABY et al., 1998). As proteases serínicas são de grande interesse industrial, tendo em
vista sua atividade catalítica e estabilidade em pH alcalino. Elas apresentam um resíduo de serina
como nucleófilo no seu sítio ativo, além de resíduos de aspartato e histidina que, juntamente com
a serina, formam sua tríade catalítica. Normalmente, essa tríade é ativada na faixa de pH 7 – 11
(GUPTA; LORENZ, 2002), muito embora a protease alcalina de Bacilus sp apresente um pH
ótimo na faixa de 10 – 12,5 (SHIMOGAKI et al., 1991).
2.2.1 Degradação das proteases pelo mecanismo de autólise
A estabilização da enzima é um requisito fundamental para sua aplicação em diversos
setores da indústria. Normalmente, uma série de reações paralelas associadas à sua desnaturação
ocorre
durante
o
processo
de
produção,
armazenamento
e
aplicação
(IYER;
ANANTHÁNARAYAN, 2008; HÁN et al., 1997). A desnaturação é um fenômeno atribuído às
mudanças conformacionais da estrutura terciária das enzimas.
Vários fatores podem promover as mudanças conformacionais na configuração espacial,
dentre os quais se destacam: temperatura (CHEISON et al., 2010; LADERO et al., 2006;
SOMERO, 2004), pH (LADERO et al., 2005), agentes químicos e autólise (proteases)
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
26
(CHÁTTERJEE; HOSUR, 2006; WANG et al., 2008; SHÁMIM et al., 2008; JURADO et al.,
2004).
Um dos principais problemas associados ao uso das proteases refere-se ao processo de
autólise. Esse processo é um mecanismo regulador que controla, principalmente, a atividade de
proteases serínicas (CHEN et al., 2003), ou seja, a atividade catalítica dessas proteases no meio
reacional é negativamente influenciada pela inativação dos seus centros ativos por autoclivagem.
De acordo com Chátterjee & Hosur (2006), a maioria das proteases que possuem múltiplos sítios
de clivagem, a sequência de autoclivagens tem sido difícil de identificar, fato esse que dificulta
ainda mais estabelecer um controle durante seu uso no meio reacional.
Kumura e colaboradores (1999) reportaram que a incubação da protease de Pseudomas
fluorescence, à temperatura de 50 C, por 2 min, resultou uma perda de atividade proteolítica
superior a 90% e uma forte mudança na sua estrutura conformacional, comprovada através de
ensaios de eletroforese.
Várias estratégias têm sido utilizadas para minimizar os efeitos causados pelo processo de
autólise. Kotormán e colaboradores (2003) relataram o uso de íons cálcio para prevenir a autólise
das proteases tripsina e α-quimotripsina em presença de diferentes concentrações de etanol. De
acordo com os resultados obtidos, ficou evidenciada a forte influência desses íons na preservação
da estrutura intrínseca das enzimas estudadas. A protease α-quimotripsina perdeu quase que o
total de sua atividade em 60 % de etanol, após 10 minutos. O mesmo comportamento ocorreu
com a tripsina em 85 % de etanol. Por outro lado, foi constatado que na presença de íons cálcio,
1,2 M e 0,6 M de cloreto de cálcio, respectivamente, a estrutura secundária e terciária das
enzimas foram restauradas, provocando, assim, o aumento da atividade enzimática.
A utilização de íons cálcio para inibição das mudanças estruturais causadas pela autólise
já vem sendo muito estudada. Estudos comprovaram que os íons cálcio promovem a formação de
um complexo derivado do tripsinogênio (precursor da tripsina), o qual induz uma mudança
conformacional que protege a molécula contra a formação de proteínas inertes. Bier & Nord
(1951) mostraram que os íons Ca2+, além de estabilizarem a molécula de enzima, são
responsáveis também pelo aumento da atividade enzimática (SIPOST; MERKELT, 1970).
Outra estratégia que vem sendo muito utilizada para minimizar os efeitos da autólise,
refere-se ao processo de imobilização da protease, que além de oferecer vantagens em relação à
estabilidade e a reusabilidade, protege os sítios ativos da protease frente ao processo de autodegradação. Entretanto, a preparação de uma enzima imobilizada com sucesso está diretamente
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
27
associada ao método empregado e as características químicas do suporte. Uma condição essencial
é que os grupos da cadeia lateral da enzima, os quais são responsáveis pela ligação com o
suporte, devem estar distantes suficientemente do sítio ativo para evitar o impedimento estérico
ao substrato (PURCENA et al., 2009).
Garcia e colaboradores (2009) imobilizaram a protease tripsina através da reticulação de
polissacarídeos (carboximetilcelulose e alginato de sódio) em presença de formaldeído e t-butil
isocianida (Figura 2). De acordo com os resultados, foi verificado que a protease livre apresentou
uma estabilidade térmica menor do que quando imobilizada nos diferentes suportes poliméricos.
Dados experimentais confirmam a redução de atividade da tripsina livre em mais de 90% após 60
minutos, ao passo que em relação aos sistemas CMC-tripsina e Alginato-tripsina, os mesmos
apresentaram uma retenção de atividade de 90% e 83%, respectivamente. Dessa forma, devido ao
processo de imobilização, foi conferida aos sistemas uma maior resistência aos processos de
autólise. Esse fato, provavelmente, está associado à formação de estruturas isopeptídicas
envolvendo resíduos de lisina, evitando, portanto, o favorecimento de reações com outras
moléculas de tripsina. Adicionalmente, a estrutura rígida provocada pela reticulação com os
polímeros, assim como, os impedimentos estéricos causados por essas macromoléculas, devem
resultar em uma contribuição para a estabilização da molécula da enzima contra a degradação
autolítica.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
28
Figura 2 – Imobilização da protease tripsina em diferentes polissacarídeos (CMC e alginato)
Tripsina
CMC
Tripsina
Tripsina
ALG
Fonte: Garcia et al. (2009).
Resultados similares foram obtidos por Kumar & Gupta (1998) quando imobilizaram
covalentemente a protease tripsina no suporte de Eudragit S-100, utilizando o método de
carbodiamida. A enzima imobilizada mostrou uma excelente estabilidade à autólise à temperatura
de 45 C. A Figura 3 mostra a atividade residual do sistema em comparação com a da protease
livre em diferentes temperaturas, ambas em função do tempo e sob as mesmas condições
reacionais.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
29
Figura 3 – Autólise da tripsina livre e imobilizada
() – Tripsina livre a 45 C
() – Tripsina imobilizada a 45  C
( ᴑ ) – Tripsina imobilizada a 50  C
() - Tripsina imobilizada a 60 C
Fonte: Adaptada de Kumar & Gupta (2008)
De acordo com os resultados obtidos, a imobilização da enzima resultou em um sistema
estabilizado à temperatura de 45C na faixa de tempo estudada. Os resultados mostraram que a
enzima livre perdeu, no intervalo de 20 minutos, mais de 90% de sua atividade catalítica, ao
passo que a tripsina conjugada à Eudragit S-100 não apresentou perdas consideráveis de
atividade. Dessa forma, o processo de imobilização utilizado apresentou-se como o principal
responsável por manter a estabilidade da enzima, sugerindo, portanto, uma proteção maior aos
sítios de clivagens da protease.
2.2.2 Imobilização de enzimas: proteases
A imobilização de enzimas e proteínas em suportes sólidos insolúveis em meio aquoso,
certamente, representa um dos grandes avanços na área da Biotecnologia. Essa tecnologia tem
por finalidade facilitar a separação entre a enzima e os produtos, além de melhorar a estabilidade
do biocatalisador para seu reuso em aplicações contínuas, com efeito positivo no processo
econômico (QIU et al., 2010; JÁRZEBSKI et al., 2007). Um suporte ideal deve imobilizar a
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
30
enzima de modo eficiente, de forma que seja mantida sua estrutura secundária e terciária, além de
apresentar um mínimo de desorção das biomoléculas durante a reação (HENZLER et al., 2008).
Um aspecto importante refere-se às fortes mudanças conformacionais que algumas
enzimas apresentam durante o processo de catálise, ou seja, quando imobilizadas podem
apresentar enormes distorções em seu centro ativo, alterando, portanto, sua atividade catalítica
(MATEO et al., 2007). A eficiência da enzima imobilizada depende fortemente da estratégia de
imobilização e do material utilizado como suporte. Nesse contexto, há um crescente interesse no
entendimento e controle das estratégias de imobilização (ABBAS et al., 2009).
Inúmeros métodos de imobilização têm sido reportados na literatura, dentre os quais se
destacam: adsorção (KILONZO et al., 2011), imobilização por ligação covalente (KANNOUJIA
et al., 2009), aprisionamento em géis poliméricos (NICHELE et al., 2011; QUIROGA et al.,
2011) e utilização de nanopartículas magnéticas como matrizes (SONG et al., 2011). Dentre
esses, o método por adsorção tem sido considerado um dos mais simples e econômicos para a
imobilização de enzimas. Além disso, a imobilização de uma enzima por adsorção oferece uma
faixa enorme de aplicabilidade em virtude de haver um mínimo de perturbação na estrutura
nativa da enzima (KUMAR et al., 2009). Por outro lado, a literatura relata inúmeros problemas
associados à estabilidade da enzima no suporte, que em virtude de diferentes condições do meio
(pH), temperatura e força iônica, o processo de desorção ocorre desordenadamente, provocando
uma diminuição na eficiência catalítica do sistema (suporte-enzima), sendo necessário, portanto,
o uso de ligações mais fortes entre o suporte e a enzima, por exemplo: ligação covalente
(ROLLETT et al., 2010).
2.2.2.1 Estabilização das enzimas via imobilização por ligação covalente
2.2.2.1.1 Seleção de suportes adequados para imobilização
Dentre os métodos empregados de imobilização de enzimas, a técnica de imobilização
por ligação covalente tem sido uma das mais promissoras, devido, principalmente, a maior
estabilidade da enzima provocada pelas fortes interações com o suporte utilizado (ABBAS et al.,
2009). Por outro lado, esse efeito provoca sérias mudanças conformacionais na estrutura da
enzima (sítios ativos), as quais podem afetar de forma negativa a atividade enzimática no meio
reacional (PRAMPARO et al., 2010; MARQUES; YAMANAKA, 2008; HONG et al., 2007).
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
31
Para alcançar um alto percentual de imobilização e uma alta retenção de atividade, duas
condições essenciais são necessárias: (1) - os grupos funcionais presentes no suporte e na enzima,
devem ser estericamente acessíveis uns aos outros, de acordo com as condições de imobilização a
serem utilizadas; (2) – Deve haver uma afinidade química entre os grupos funcionais do suporte e
da enzima escolhida em um meio aquoso ou orgânico, de forma a se obter um sistema
(enzima/suporte) com alta estabilidade e reatividade (MATEO et al., 2007).
De acordo com Mateo e colaboradores (2007), um suporte adequado para uma
imobilização multipontual deve obedecer às seguintes exigências:

O suporte deve apresentar uma superfície interna ampla para ter uma adequada
congruência geométrica com a superfície da enzima. Se o suporte é formado por fibras de
diâmetros menores que os da enzima, será dificil obter uma ótima interação fisica e química entre
os mesmos.

O suporte deve apresentar uma alta densidade de grupos reativos. Dessa forma, seria
possível obter um sistema com um elevado número de ligações covalentes multipontuais com a
enzima.

Os grupos reativos presentes na enzima e no suporte devem apresentar o mínimo de
impedimento estérico na reação, já que após a etapa inicial de imobilização, ligações covalentes
multipontuais exigem o contato entre os grupos ligados à estrutura rígida.

Os grupos reativos envolvidos no processo de imobilização devem ser estáveis o
suficiente para permitir períodos longos de tempo de reação entre o suporte e a enzima.
2.2.2.1.2 Condições ideais para a imobilização por ligação covalente
Embora uma ligação covalente multipontual (“multipoint covalent attachment” – MCA)
deva ser esperada usando um suporte ativado com um grupo funcional adequado, a seleção das
condições de imobilização é um ponto crítico para maximizar esse processo. As condições de
imobilização devem favorecer a reação entre os grupos funcionais da enzima e do suporte
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
32
(MATEO et al., 2007; MATEO et al., 2006; BLANCO et al., 1989). Algumas dessas variáveis
críticas são:

Tempo de reação – Normalmente, a imobilização ocorre em espaço curto de tempo.
Entretanto, as interações multipontuais entre o suporte e a enzima devem requerer um
maior tempo devido à necessidade de alinhamento dos grupos já imobilizados e os
parcialmente imobilizados, presentes na enzima e no suporte;

pH – Embora a imobilização ocorra em pH neutro, o pH alcalino normalmente é utilizado
devido à reatividade dos nucleófilos da enzima (usualmente lisina);

Temperatura - Temperaturas moderadamente altas devem favorecer a energia vibracional
das enzimas e dos suportes, aumentando a possibilidade de um maior percentual de
imobilização;

Solução tampão – A escolha do tampão no processo de imobilização é de fundamental
importância. O tampão não deve interferir na reação. Por exemplo, o borato pode
interferir nas reações de aminas/aldeídos. Compostos derivados de aminas devem
modificar os suportes que contenham o grupo funcional epóxi, ou competir com o sítio
ativo das enzimas pelos grupos aldeído.
Alptekin e colaboradores (2010) imobilizaram covalentemente catalase no suporte
Eupergit C e avaliaram a otimização das condições de imobilização em função da determinação
da atividade hidrolítica do sistema suporte-enzima. Parâmetros como pH, concentração da
solução tampão, temperatura, tempo de imobilização e a quantidade de enzima imobilizada no
suporte foram avaliados nesse trabalho. De acordo com os resultados obtidos, ficou comprovada
uma forte dependência da atividade hidrolítica com as diferentes condições estudadas,
especialmente, o pH e a quantidade de enzima imobilizada na matriz. Dessa forma, as condições
ideais de imobilização foram as seguintes: pH 7,5 e 1 M de solução tampão, temperatura de 25
o
C, 24 horas de imobilização e 40 mg de enzimag de suporte.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
33
2.2.2.1.3 Fatores que influenciam a retenção da atividade catalítica
A retenção de atividade das enzimas é fortemente dependente de vários fatores: tamanho
de partícula (BIRÓ et al., 2008; YANG; ZHU, 2006), porosidade (AHN et al., 2011; LI et al.,
2010), morfologia (KUMAR et al., 2009; LATHOUDER et al., 2004), hidrofilicidade,
hidrofobicidade (Afrin et al., 2000), capacidade de retenção de água (CHAE et al., 2000),
microambiente, natureza química dos suportes e espaçadores (ZHANG et al., 2011, NOUAIMI et
al., 2001). Abaixo serão discutidos os principais fatores.
 Porosidade
A imobilização das moléculas da enzima no interior dos poros ocorre em processo de
difusão lenta. Em outras palavras, a ligação das enzimas nos poros dos suportes é fortemente
influenciada pela transferência de massa e governada pelas restrições de difusão. A Figura 4
mostra a relação entre a posição da enzima e o tempo requerido pra difundi-la no interior do poro.
Figura 4 – Relação entre a posição da enzima e o tempo necessário para difundí-la dentro do poro
Tempo para a
T4
>
T3
>
T2
>
T1
>
T0
enzima difundir
dentro dos poros
Enzima
Grupos funcionais
Fonte: adaptada de Cao, 2005a.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
34
De acordo com a Figura 4, as moléculas da enzima mais próximas da superfície do
suporte são mais rapidamente ligadas. Em contrapartida, quanto mais profundo o poro, maior
tempo será requerido para as moléculas difundirem dentro do mesmo. Dessa forma, espera-se que
a atividade de uma enzima esteja diretamente associada a sua capacidade de retenção na matriz,
ou seja, teoricamente, quanto maior esse percentual de enzima imobilizada em uma matriz, maior
profundidade do poro foi alcançada pelas moléculas. Entretanto, isso não significa que quanto
maior o percentual de enzima imobilizada, maior atividade hidrolítica do sistema (suporteenzima) será alcançada. Esse fato pode ser atribuído à difusão do substrato e à rigidez da matriz.
Li e colaboradores (2010) imobilizaram a lipase de Burkholderia cepacia em microesferas
de poliestireno com diferentes tamanhos de poro (14,7; 104 e 314 nm). De acordo com os
resultados obtidos, o aumento do tamanho do poro resultou no aumento da atividade catalítica e
em uma melhoria na estabilidade térmica dos sistemas. Os autores justificaram esses resultados
com base na maior acessibilidade do substrato ao centro ativo da enzima e ao confinamento da
enzima em regiões mais profundas das microesferas, propiciando maior proteção em altas
temperaturas.
 A superfície dos suportes
A superfície interna e externa de um suporte deve ser considerada. Em suportes não
porosos a superfície interna é zero, ao passo que suportes altamente porosos possuem superfície
externa praticamente insignificante. A superfície interna é geralmente 100 a 1000 vezes a
superfície externa para um suporte macroporoso, obviamente dependendo do diâmetro das
partículas. Dessa forma, para alguns suportes, o carregamento da enzima na superfície externa
pode ser desprezível (CAO, 2005b).
Partindo do pressuposto que se deseja obter um suporte com um alto percentual de
imobilização, é concebível que o mesmo apresente uma alta superfície interna, com áreas
acessíveis para a ocupação da enzima. Essa propriedade é responsável por ditar a cinética de
difusão do substrato na matriz.
Em geral, o carregamento da enzima na matriz (protein loading), definido como a razão
entre as massas de enzima e de suporte, assim como a retenção da atividade enzimática, estão
mais relacionadas com o tamanho de poro do que propriamente com a superfície. Por exemplo,
Chaijitrsakool e colaboradores (2008) imobilizaram a protease serínica de Bacillus licheniformis
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
35
em géis de carbono derivados de formaldeído e resorcinol com diferentes tamanhos de poro. Os
resultados obtidos mostram que o tamanho e o volume de poro são parâmetros chave no
percentual de imobilização, atividade específica e estabilidade. Foi constatado que o maior
tamanho e volume de poro foram responsáveis pelo aumento de atividade hidrolítica e
carregamento da enzima no gel.
Ferreira e colaboradores (2003) imobilizaram a protease Alcalase 2T (Protease comercial)
em dois suportes de sílica (S300 e S500), com diferentes tamanhos de poro, 550 e 1200 Å,
respectivamente. De acordo com os resultados de atividade hidrolítica, S500 apresentou o dobro
da atividade quando comparado com o S300, sugerindo, portanto, uma maior influência dos
efeitos de impedimento estérico e restrições espaciais ao suporte com menor tamanho de poro.
A literatura mostra que a penicilina G acilase foi imobilizada em um suporte acrílico
(KALLENBERG et al., 2005; BOLLER et al., 2002). Os resultados obtidos indicaram baixos
índices de imobilização da enzima no suporte, aproximadamente 10 vezes menor, quando
comparados com Eupergit C, que possui uma área superficial similar, porém um tamanho de poro
aproximadamente 4 vezes maior (15 a 20 nm). Claramente, se observa que, no primeiro caso, o
sistema apresentou problemas relativos à difusão da enzima no interior dos poros, sugerindo,
assim, que a enzima foi, aparentemente, imobilizada na superfície externa do suporte,
diferentemente do que aconteceu com o segundo sistema (Eupergit/penicilina G acilase).
O efeito do diâmetro de poro de um suporte não está somente relacionado à superfície
acessível do mesmo, mas também a problemas de difusão e a mobilidade das moléculas das
enzimas. A Figura 5 mostra um modelo ilustrativo que simula a eficiência de ocupação dam
enzima na superfície dos poros das resinas Eupergit C e Eupergit C 250, que são resinas
comerciais
macroporosas,
obtidas
através
da
copolimerização
de
N,N-metileno-bis-
metacrilamida, metacrilato de glicidila, glicidil éter e metacrilamida. Devido à alta densidade de
grupos oxirano na superfície (600 mmol/g) e excelente estabilidade térmica, esses suportes
representam um enorme potencial para imobilização de enzimas. O tamanho do poro de Eupergit
C 250 é, aproximadamente, 10 vezes maior que o do Eupergit C. Embora o percentual de enzima
imobilizada em ambos os suportes seja próximo (KNEZEVIC et al.2006; SIGMA, 2011).
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
36
Figura 5 - Relação entre o tamanho de poro do suporte e a eficiência de ocupação da enzima.
Hernaiz & Crout (2000) mostraram que as enzimas β-galalactosidase e α-galactosidase
derivadas de B. circulans e Aspergillus oryzae, respectivamente, apresentaram diferentes
percentuais de imobilização e de eficiência catalítica quando imobilizadas nos suportes de
Eupergit C e Eupergit 250. Esses resultados sugerem que o tamanho de poro é responsável não só
pela eficiência de ocupação da enzima e performance do sistema, mas também, pela retenção de
sua atividade. Alguns estudos têm revelado que o tamanho de poro necessário da resina deve ser
muito maior (cerca de 6 - 8 vezes) que o diâmetro médio da enzima, para superar os problemas
acima mencionados (CHAIJITRSAKOOL et al., 2008; BESHAY, MOREIRA, 2003).
A literatura tem mostrado que a maioria dos suportes usados para a imobilização possui
uma ampla variação de tamanhos de poro (LI et al., 2010; FERREIRA et al., 2003). Esse fato é
responsável por um alto percentual de imobilização e uma redução de problemas associados à
difusão. Entretanto, outro problema pode surgir: a diminuição da atividade da enzima, devido à
menor acessibilidade do substrato ao sítio ativo da enzima imobilizada que se encontra situada
nas posições mais internas do poro.
Cada enzima difere em suas dimensões, assim, o mínimo requerido para cada uma deve
ser diferente. No entanto, em geral, existem algumas exigências para superar esses
inconvenientes. Partindo do pressuposto que as propriedades de difusão do substrato nos poros
são ditadas pela camada de partição, que se encontra em torno de 20 nm, a literatura tem proposto
uma inequação matemática que descreve o tamanho de poro mínimo para superar os problemas
relacionados aos limites de difusão (CAO, 2005c). A Figura 6 mostra ilustrativamente o tamanho
de poro mínimo necessário para superar os problemas associados a esse efeito.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
37
Figura 6 – Modelo ilustrativo do tamanho de poro mínimo necessário para a eliminação dos limites de difusão
Raio da enzima, re
Enzima
Raio do poro, rp
Adaptada de Cao, 2005c.
A distância da camada da enzima na parede do poro deve ser superior a 20 nm, portanto,
rp – de > 20 nm. Consequentemente, rp > (20 + de). Rearranjando a equação teremos: 2rp > (40 +
2de). Por exemplo, se o diâmetro mínimo da enzima é aproximadamente 5 nm, o mínimo de poro
exigido deve ser 50 nm. Esse valor é muito próximo do reportado na literatura para penicilina G
acilase imobilizada em sílica de porosidade controlada. Esse valor é aproximadamente 8 a 10
vezes o tamanho da enzima (penicilina G acilase). Resultados similares têm sido reportados em
outros tipos de enzima, tais como: lipases, isomerases e proteases (tripsina). Dessa forma,
limitações no processo de difusão podem ser parcialmente superadas através do uso de suportes
com alta porosidade (CAO, 2005c).
Embora a atividade catalítica diminua com a redução do tamanho do poro na maioria dos
casos (LI et al., 2010b; SERRA et al., 2008), Cao (2005c) mostrou que quando o diâmetro do
poro se aproxima das dimensões da enzima, ocorre o efeito inverso, ou seja, a atividade
específica da enzima imobilizada aumenta (Figura 7). Nesse trabalho foi avaliada a influência do
tamanho de poro da sílica em função do processo de imobilização da tripsina e de sua atividade
específica. Os resultados mostraram, inicialmente, que houve um aumento de atividade específica
para o tamanho de poro próximo às dimensões da enzima, mas que, à medida que houve o
aumento no tamanho dos poros, as moléculas das enzimas foram capazes de se difundirem nas
cavidades internas dos mesmos, provocando um aumento no percentual de imobilização e na
atividade enzimática.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
38
Figura 7 – Atividade específica em função do tamanho de poro do suporte (sílica) e da quantidade de
tripsina imobilizada
Tamanho de poro
Enzima
Fonte: Adaptada de Cao, 2005d.
 Densidade dos grupos funcionais
A densidade dos grupos funcionais refere-se ao número de grupos funcionais ativos por
unidade de área na superfície do suporte. Dessa forma, é concebível que a imobilização da
enzima e o número de ligações entre a enzima e o suporte estejam estritamente relacionados com
as densidades dos grupos funcionais. Além disso, a natureza do microambiente na superfície do
suporte é também largamente dependente desse fator. Assim, parâmetros como: retenção de
atividade, estabilidade da enzima e seletividade podem ser fortemente influenciados pela
concentração desses grupos.
Normalmente, uma alta densidade de grupos funcionais promove um aumento no número
de ligações entre a enzima e o suporte, como pode ser visto ilustrativamente na Figura 8.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
39
Figura 8 – Influência da densidade dos grupos funcionais no processo de imobilização e estabilização da enzima
Suporte
Grupos ativos
Enzima
FORMAÇÃO DE LIGAÇÕES
MULTIPONTUAIS –
Multiple-point attachment
AUMENTO DA DENSIDADE
Fonte: Adaptada de Mateo e colaboradores, 2007
À medida que se aumenta a quantidade de ligações entre o suporte e a enzima, observa-se
uma maior estabilidade da enzima na matriz, devido às ligações multipontuais (“multiple-point
attachment”) (ALPTEKIN et al., 2010; KATCHÁLSKI-KATZIR; KRAEMMER, 2000). Por
outro lado, a atividade pode ser reversivelmente proporcional ao número de ligações, fato esse
atribuído, provavelmente, a um enrijecimento da cadeia molecular. Em outras palavras, quando o
suporte e a enzima apresentam uma alta densidade de ligações, dois efeitos podem ser
observados: aumento da estabilidade da enzima no suporte e a diminuição de sua atividade
devido à falta de mobilidade molecular (MATEO et al., 2007).
Com o intuito de superar esse inconveniente, vários trabalhos têm mostrado o uso de
espaçadores como forma de aumentar a mobilidade da enzima e, por conseguinte, aumentar a
atividade enzimática, devido a uma maior exposição do sítio ativo da enzima ao substrato.
Nouaimi e colaboradores (2001) imobilizaram a protease tripsina em poliésteres com
diferentes espaçadores e avaliaram a eficiência desses sistemas (suporte-espaçador-enzima) em
reações de hidrólise, usando caseína e BAPNA (N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide
hydrochlorid) como substratos. De acordo com os resultados obtidos, os sistemas que usavam
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
40
espaçadores mostraram uma atividade hidrolítica superior àquela em que a protease estava ligada
diretamente à matriz. Dentre os diversos sistemas usados nesse trabalho, o que utilizava BSA
(Bovine Serum Albumin) como espaçador foi o que apresentou maior retenção de atividade em
ambos os substratos.
Yamamoto e colaboradores (2005) imobilizaram a protease tripsina em um suporte de
celulose com espaçadores de diferentes tamanhos de cadeia (H2N-(CH2)n-NH2, onde n= 0, 2, 4,
6, 8 e 12). Os resultados mostraram que a atividade hidrolítica para o BAPNA (N-benzoyl-DLarginine-p-nitroanilide hydrochlorid) aumentou de acordo com o tamanho da cadeia do
espaçador diamino, atingindo um máximo com 6 carbonos. A partir desse ponto, houve um
decréscimo na atividade hidrolítica. Tal fato foi atribuído ao surgimento de novos impedimentos
estéricos, ou seja, em uma cadeia hidrocarbônica com número de átomos de carbono superior a 6,
haverá uma maior dificuldade do substrato em reconhecer o sítio ativo da enzima. Resultados
similares foram obtidos por Seo e colaboradores (1998).
2.2.2.2 Imobilização de enzimas em géis poliméricos (Entrapment)
A técnica de imobilização por aprisionamento em uma matrix polimérica (entrapment)
representa um dos métodos mais simples para imobilização de enzimas (PLIEVA et al., 2008).
Por definição, esse método baseia-se em processos nos quais a enzima é embebida em uma
matrix formada por ligações físicas ou químicas. Em geral, o processo de entrapment é formado
durante a imobilização. Desde que Bernfeld & Wan (1963) reportaram o aprisonamento de
enzimas em géis de poliacrilamida, diferentes biocatalisadores têm sido imobilizados por esse
método. Em um procedimento típico, acrylamida e N,N-metileno-bis-acrilamida (agente
reticulante) são misturados com a enzima e polimerizados em presença de um iniciador
(persulfato de potássio). Embora essa técnica de imobilização venha sendo utilizada
frequentemente, vale ressaltar que a literatura relata a inativação da enzima quando se usa
monômeros de acrilamida e seus derivados (AEHLE, 2007).
Um grande número de géis tem sido utilizados como suportes para imobilização.
Polissacarídeos (alginato, carragenana, goma aguar, etc) e polímeros sinteticos (poliacrilatos,
poliuretanas e poliéteres) vêm sendo utilizados com muita freqüência em diversos setores da
indústria como agentes formadores de géis.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
41
Em 1980, foi desenvolvida uma tecnologia baseada no fato de que as enzimas poderiam
ser ligadas covalentemente à matriz. Ao invés de um monômero inerte, seria utilizado um
monômero com grupos funcionais passíveis de reação com as moléculas das enzimas durante a
polimerização. Dessa forma, a imobilização ocorreria, concomitantimente, por ligação covalente
e aprisionamento na rede tridimensional.
Pollak e colaboradores (1980) foram pioneiros no uso da técnica de aprisionamento de
enzimas por ligações covalentes em matriz reticulada. Os autores imobilizaram as peroxidases
adenylate kinase, acetate kinase e horseradish em um copolímero de acrilamida, N, N’ –
metileno-bis-acrilamida e N-acriloxisuccinamida, com retenção de atividade variando de 20 a
80%.
Geralmente, polímeros em solução sofrem forte influência do pH, temperatura, salinidade,
força iônica e de solventes no processo de gelificação (NONO et al., 2011). Dessa forma, é
possível se obter uma matriz insolúvel no meio.
Se a enzima encontra-se presente na solução ou ligada à cadeia polimérica durante o
processo de formação do gel, isso significa que a mesma poderá estar conectada à matriz por
interações físico-químicas ou covalentemente aprisionada na matriz, como ilustrado na Figura 9.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
42
Figura 9 – Ilustração do processo de gelificação física do polímero com a enzima aprisionada na matrix.
Gelificação
física
Gelificação química
Cadeia
polimérica
Enzima
Ligação covalente enzima-polímero
Hidrogéis híbridos derivados de compósitos macroporosos de Poli(N-vinil-caprolactama)alginato de cálcio podem ser usados para aprisionar células animais e enzimas. Inúmeras
proteases vêm sendo imobilizadas em matrizes de hidrogéis (LEE; HUANG, 2008; KATO et al.,
2000),. De acordo com os resultados referentes a esses estudos, tem sido possível melhorar a
estabilidade térmica das proteases aprisionadas na matriz, visto que as proteases livres
apresentaram inatividade em temperaturas em torno de 45 – 50 °C, ao passo que os sistemas
(protease-matriz) puderam ser usados em uma faixa de temperatura superior com maior
estabilidade térmica. Essa melhoria só pôde ser alcançada devido ao efeito de mudança da
mobilidade molecular pelo confinamento da enzima na estrutura do hidrogel.
De acordo com a literatura, vários polissacarídeos têm sido empregados como material
gelificante e usados frequentemente como matrizes para aprisionamento de biocatalisadores. O
alginato (Figura 10) é um polissacarídeo linear constituído por unidades de ácido manurônico
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Capítulo II: Revisão Bibliográfica
43
unidas por ligações glicosídicas do tipo β(1→4) e, também, por unidades de ácido glucurônico,
unidas por ligações do tipo α(1→4) (XU et al., 2010). Esse polissacarídeo é solúvel em água e
tem sido utilizado como matriz para imobilização de inúmeras enzimas (MATO; HUSSAIN,
2006; WON et al., 2005).
Figura 10 – Modelo ilustrativo da reticulação do alginato de sódio em presenca de íons cálcio para aprisionamento da
enzima – ( ) Enzima
Fonte: Mato; Hussain, 2006
2+
Os íons Ca
promovem a formação de ligações iônicas, que resultam na formação de um
gel consistente e insolúvel, que imobiliza a enzima. O tamanho da barreira de contenção formada
em torno das enzimas irá depender da velocidade de fluxo, da densidade da solução polimérica e
da concentração da solução iônica, na qual o gel será formado (WANG et al., 2008). Porém, os
géis de alginato de cálcio são quimicamente instáveis na presença de alguns componentes, tais
como íons fosfato e citrato, podendo sofrer rupturas ou até mesmo dissolução no meio. Para
superar esse inconveniente, têm sido utilizados sais de bário, ao invés de cálcio, ou pelo
tratamento com quitosana, para aumentar a resistência (PARASCANDOLA et al., 2006; YOO et
al., 2006).
Abdel-Naby e colaboradores (1998) imobilizaram uma protease alcalina B. mycoides em
matriz de poliacrilamida 5%. Diferentes concentrações de reticulador foram utilizadas (1, 2, 4, 6
e 8%). Os resultados indicaram que a concentração de reticulante em torno de 2% foi suficiente
para se obter o máximo de aprisionamento da enzima na matriz. A diminuição do rendimento de
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Capítulo II: Revisão Bibliográfica
44
imobilização com o aumento da concentração do reticulador foi atribuída à diminuição no
tamanho dos poros na matriz do gel, o que causou limitação de difusão do substrato.
2.2.2.2.1 Criogéis poliméricos – Diagrama conceitual de sua formação
Géis poliméricos apresentam inúmeras aplicações em diferentes áreas da biotecnologia,
incluindo o uso em materiais cromatográficos, matrizes para eletroforese/imuno-difusão e como
suportes de imobilização de moléculas e células. Criogéis são matrizes de géis formados a partir
de soluções de polímeros que foram submetidas a baixas temperaturas, gerando macroporos
interconectados que permitem que não ocorra problemas de difusão de solutos de qualquer
tamanho, como a transferência de massa de nano e micropartículas. Lozinsky e colaboradores
(2003) propuseram um diagrama conceitual do processo de gelificação criotrópica, baseado em
várias etapas de formação:
Etapa1 – A mistura reacional, contendo os agentes formadores do gel, é submetida a
temperaturas abaixo do ponto de cristalização do solvente. O sistema congelado, apesar de
aparentar um bloco sólido único, permanece essencialmente heterogêneo e contendo microfases
líquidas não congeladas (unfrozen liquid microphase - UFLMP) juntamente com os cristais do
solvente congelado. O papel do solvente imobilizado na rede polimérica nos géis tem uma
importância crucial, em virtude do impedimento de uma formação compacta da massa do
polímero, prevenindo o colapso do sistema.
Etapa 2 – Os reagentes responsáveis pela formação do gel são concentrados nas UFLMP,
ou seja, essa etapa leva à formação de uma área criogênica. Como UFLMP apresenta um
percentual mínimo do volume total inicial, a concentração de precursores aumenta drasticamente
para promover a formação de gel. Na verdade, devido a essa zona criogênica, a formação de gel
ocorre muito mais rapidamente que em meio líquido, quando se utiliza a mesma concentração
inicial dos precursores.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
45
Etapa 3 – Os cristais do solvente congelado atuam como agentes de formação de poros.
Ao sofrer o processo de fusão, durante o descongelamento (retorno à temperatura ambiente), os
cristais deixam espaços vazios, que são os macroporos preenchidos com o solvente.
Etapa 4 - Quando submetido ao congelamento, os cristais do solvente crescem até
encontrar as faces dos outros cristais formados. Dessa forma, após a fusão, um sistema de poros
interconectados é formado dentro do gel. As dimensões e forma dos poros dependem de muitos
fatores, dentre os quais se destacam: a concentração dos precursores e os regimes de tratamento
criogênico.
Etapa final – A fase do polímero no criogel apresenta microporos entre as cadeias
poliméricas. Assim, os criogéis obtidos apresentam estruturas heterogêneas e homogêneas. A
Figura 11 mostra ilustrativamente as etapas descritas anteriormente durante esse processo.
Figura 11 – Diagrama de formação de criogéis poliméricos: (1) macromoléculas em solução; (2) solvente;
(3) solutos de baixa massa molar; (4) policristais; (5) microfase do líquido não congelado; (6) rede polimérica de um
criogel; (7) macroporos e (8) solvente
congelamento
descongelamento
Fonte: Adaptação de Lozinsky et al., 2003.
2.2.2.2.2 Criogéis poliméricos de PVA
Polímeros sintéticos vêm sendo muito utilizados no processo de aprisionamento de
biocatalisadores (LI-SHENG et al., 2007; WANG et al., 2008). Dentre os polímeros utilizados
com esse objetivo, o poli (álcool vinílico) representa uma alternativa promissora para o
desenvolvimento de matrizes sob a forma de gel para imobilização de enzimas, principalmente,
devido a sua não toxicidade, hidrofilicidade, biocompatibilidade e o seu alto número de grupos
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Capítulo II: Revisão Bibliográfica
46
hidroxila, que são os responsáveis pelas interações intermoleculares e intramoleculares por
ligações de hidrogênio nas cadeias poliméricas do PVA (WANG; HSIEH, 2008; FRAY et al.,
2007; SZCZESNA, et al. 2001).
Os sítios sindiotáticos dessas cadeias são responsáveis pela formação de pontes de
hidrogênio, ao passo que os sítios isotáticos participam principalmente em interações
intramoleculares (LOZINSKI; PLIEVA, 1998), como ilustrado esquematicamente na Figura 12.
Figura 12 – Interações intra e intermoleculares das moléculas de PVA.
Sítio isotático
Sítio sindiotático
Fonte: LOZINSKI; PLIEVA, 1998
Em temperaturas positivas (0 < t < 20 oC), normalmente, os hidrogéis não apresentam
condições favoráveis para matrizes de imobilização, devido, principalmente, aos problemas
associados à estabilidade de uso. No entanto, quando uma solução de PVA é submetida a
condições de congelamento e descongelamento (Método Freezing-thawing), esse método
criogênico facilita o processo de gelificação, ou seja, aumenta a concentração de macromoléculas
dissolvidas em regiões onde não ocorreu o congelamento (LOZINSKY et al., 2003).
De acordo com a literatura, a utilização de criogéis de poli (álcool vinílico) pelo método
freezing-thawing com altas concentrações do polímero em meio aquoso constitui uma das
principais alternativas para o processo de imobilização de enzimas. Esses suportes apresentam
algumas vantagens quando comparados a outros hidrogéis comumente usados para o mesmo
propósito, dentre as quais, destacam-se: (i) condições favoráveis de transferência de massa com
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
47
um mínimo de impedimento estérico; (ii) excelente estabilidade das propriedades reológicas da
matriz de PVA, que permite que a matriz seja usada em diferentes tipos de reatores; (iii)
termoestabilidade superior aos demais géis termoreversíveis; (iv) resistência à degradação
biológica; (v) biocompatibilidade, não toxicidade e baixo custo (LOZINSKY et al., 2003).
2.2.2.3 Imobilização de enzimas em nanopartículas magnéticas
Atualmente, nanopartículas vem sendo empregadas como suportes de enzimas
(HEGEDUS; NAGY, 2009; JIA et al., 2003). O uso de nanobiocatalisadores, com a combinação
de nanotecnologia e biotecnologia, vem sendo considerado uma das áreas promissoras nos
diferentes campos da ciência. Nanopartículas magnéticas (MNPs – “magnetic nanoparticles”)
representam uma classe de nanopartículas (< 100 nm) que podem ser manipuladas sob a
influência de um campo externo magnético. MNPs são comumente compostas de elementos
magnéticos, tais como: ferro, níquel, cobalto e seus óxidos (SHUBAYEV et al., 2009).
Dentre as nanopartículas magnéticas estudadas, as constituídas por óxidos de ferro (Fe2O3
e Fe3O4) têm atraído maior interesse tecnológico, especialmente em aplicações onde se requer
nanopartículas estáveis com tamanhos e formas uniformes, além de bem dispersas quimicamente
(MEDEIROS et al., 2011).
A forma e a estrutura das MNPs variam consideravelmente com o método utilizado.
Atualmente, algumas pesquisas vêm avaliando a influência da forma das MNPs em sistemas
biológicos. Por exemplo, Park e colaboradores (2008) utilizaram nanopartículas de formato
alongado de dextrana recobertas com óxido de ferro em sistemas in vivo (tempo de circulação dos
MNPs = 48 horas). De acordo com os resultados obtidos, o tumor alvo reduziu de tamanho
consideravelmente com o uso desse sistema. Quando utilizado outro tipo de formato e sob as
mesmas condições, não foi observada a mesma eficiência. A química de superfície é outro fator
determinante crítico que regula as propriedades físico-químicas das MNPs, incluindo o tamanho,
solubilidade, estado de dispersão e valores de magnetização. Além disso, é de fundamental
importância o entendimento dos mecanismos de reconhecimento celular, biodistribuição e
“resposta imune” (GUPTA, et al., 2007). A avaliação desses parâmetros representa um avanço
em encontrar estratégias para diminuir o potencial de nanotoxicidade.
Xin e colaboradores (2010) propuseram o uso de nanopartículas magnéticas de óxido de
ferro (γ-Fe2O3/Fe3O4) como suporte de imobilização para proteases (papaína e termolisina), com
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Capítulo II: Revisão Bibliográfica
48
o intuito de obter oligopeptídeos em meio orgânico. Os resultados comprovaram a eficiência
desse sistema, com altos de índices de conversão após 5 reusos. Além disso, as enzimas
imobilizadas nesse tipo de suporte apresentaram excelente estabilidade em diferentes pHs e
temperaturas. Esse tipo de sistema tem chamado bastante atenção devido a algumas
particularidades, tais como: tamanho de partícula e superfície controlável, larga área superficial,
fácil recuperação e por não apresentar problemas de difusão.
Nos últimos 20 anos, nanopartículas revestidas de sílica têm atraído bastante atenção para
aplicação em catálise, separação, biosensores e adsorção. A sílica é frequentemente empregada
como material de revestimento da superfície de nanopartículas. Existem várias propriedades que
as tornam materiais especiais para a nanotecnonolgia, como, por exemplo, o tamanho da
partícula, que pode ser ajustado de 5 a 30 nm, assim como sua porosidade, que pode variar entre
2 e 10 nm, apresentando uma excelente estabilidade e rigidez, propriedades que permitem a
resistência ao estresse mecânico e à degradação. Além disso, a sílica é responsável pelo aumento
da hidrofilicidade das nanopartículas magnéticas, fato esse, que a torna um importante material
para uso na imobilização de enzimas. De acordo com a Figura 13, pode-se observar uma
superfície de nanopartículas revestidas com sílica usada para imobilização.
Figura 13 – Superfície de nanopartículas de ferro revestidas com sílica
Fonte: Dios; Díaz-García, 2010
A Figura 13 mostra os grupos hidroxila das nanopartículas magnéticas de ferro reagindo
com os grupos alcóxi das moléculas de silano levando à formação de ligações Si-O e permitindo
a imobilização de outras moléculas ligadas aos grupos funcionais terminais.
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Capítulo II: Revisão Bibliográfica
49
Sustrova e colaboradores (2009) usaram nanopartículas magnéticas modificadas com o
polissacarídeo agarose para a imobilização da quimotripsina no uso da clivagem proteolítica da
pepsina porcine A. Essa imobilização resultou em um aumento da atividade catalítica em
diferentes pHs (7,2 – 8,7) e maior estabilidade térmica em diferentes temperaturas (25 – 70 oC),
quando comparados à protease livre, além de um alto número de ciclos de reutilização (> 12).
Resultados similares foram descritos previamente por Hong e colaboradores (2007).
Jin e colaboradores (2010) sintetizaram um suporte para imobilização de um tipo de
protease alcalina baseado em nanopartículas magnéticas modificadas com trietoxisilano, com
diâmetro médio em torno de 25 nm. Esse sistema protease/suporte foi utilizado na hidrólise do
óleo de canola. De acordo com os resultados obtidos nesse trabalho, esse sistema apresentou uma
retenção de atividade catalítica superior a 98% em 60 dias de estocagem. Também foram
observados índices relevantes de atividade hidrolítica usando caseína como substrato (48%),
quando comparados à enzima livre.
Hong e colaboradores (2007) imobilizaram covalentemente α-quimotripsina em nanogéis
de poliacrilamida recobertos em sua superfície com Fe3O4, com diâmetro médio em torno de 10
nm. De acordo com os resultados de atividade hidrolítica, usando N-benzoyl-L-arginine ethyl
ester (BAEE) como substrato, concluiu-se que esse sistema apresentou resultados satisfatórios de
termoestabilidade, tempo de estocagem e reusabilidade.
Ming e colaboradores (2006) encapsularam a enzima horseradish-peroxidase em nanogel.
A enzima encapsulada manteve 80 % de sua atividade mesmo após 90 minutos de incubação à
temperatura de 65 ºC, enquanto o tempo de meia vida da enzima livre foi em torno de 10 minutos
sob as mesmas condições. A enzima imobilizada na rede polimérica (nanogel) representa uma
nova e promissora técnica para uso nas áreas de farmacologia e medicina (Kabanov &
Vinogradov, 2008).
Hegedus & Nagy (2009) imobilizaram a protease α-quimotripsina utilizando uma das
mais recentes técnicas de imobilização em sistemas nanoparticulados (SENs – Single enzyme
nanoparticles), com tamanho da nanopartícula variando na faixa de 10 a 40 nm. Essa técnica é
baseada no fato que cada molécula de enzima é revestida utilizando uma nano-rede polimérica,
formada por uma monocamada fina e bastante porosa. Essa estrutura resulta em uma maior
estabilidade da enzima sem qualquer limitação significante de transferência de massa do
substrato da solução para o sítio ativo da enzima. Os resultados obtidos nesse trabalho indicaram
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
50
que a α-quimotripsina imobilizada apresentou uma maior estabilidade em relação a sua forma
livre em toda faixa de temperatura e pH avaliada (Figura 14).
Figura 14 – Ilustração esquemática da combinação dos modelos clássicos para o surgimento de uma nova
técnica aplicada para a imobilização de enzimas – SEN’s (SENs – Single enzyme nanoparticles). (a) – Suportes
metálicos; (a1) – Partículas nanomagnéticas; (b) – Reticulação de polímeros para a formação de nanogéis; (b1)
Dendrímeros e (c) Single enzyme nanoparticle
(a)
Nanopartículas metálicas
(b)
Nanopartículas metálicas
(b1)
(a1)
Dendrímeros
(c)
Nanopartículas magnéticas
SENs – Single enzyme nanoparticles
Fonte: Adaptada de Hegedus & Nagy, 2009
2.3 ENZIMAS: AMINOÁCIDOS PARA LIGAÇÃO COVALENTE
Normalmente, as enzimas contêm inúmeros aminoácidos em sua estrutura química.
Entretanto, somente parte dos grupos funcionais presentes na estrutura molecular pode ser usada
para imobilização
de uma enzima por ligação covalente (Ciaran, 1995), dentre os quais
destacam-se:
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
51

Grupos amino dos aminoácidos Nterminais e grupos amino da lisina

Grupo guanidina da arginina

Grupo sulfidrila da cisteína

Grupo imidazol da histidina

Grupo hidroxila da tirosina

Grupo indol do triptofano

Grupos  e -carboxilas do ácido glutâmico (Glu) e aspártico, além dos grupos
carboxila terminais.
Ácido glutâmico
Como ilustrado na Figura 15, alguns resíduos
Ácido aspártico
de aminoácidos são frequentemente
usados, ao passo que outros são raramente ativados no processo de imobilização . Esse fato
atribui-se às diferenças de reatividade desses grupos funcionais presentes na estrutura molecular.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
52
Figura 15 – Resíduos de aminoácidos presentes nas enzimas no processo de imobilização: (++) alta reatividade; (+)
reativo; (-) baixa reatividade
Arginina ( - )
NH 2
HN
NH2
Cisteína ( - )
N-terminal ( + )
NH2
S
HN
Lisina (+ +)
OH
OH
Enzi
Enzima
Metionina ( - )
Carboidrato ( +)
Ácido glutâmico ( + )
ma
S
OH
O
O
C-terminal ( + )
OH
Tirosina ( - )
HO
OH
Triptofano ( - )
Ácido aspártico ( + )
O
OH
NH
Fonte: Adaptada de Cao, 2005e.
Considerando que todos os resíduos de aminoácidos são freqüentemente envolvidos na
estrutura da proteína e consequentemente no processo de catálise, a conformação e a função da
enzima após a ligação com os grupos funcionais do suporte, provavelmente, devem mudar sua
estrutura conformacional e consequentemente, sua atividade quando comparada com a enzima
livre. Normalmente, a reatividade da cadeia dos aminoácidos presente na enzima é conduzida por
diferentes fatores: pH, temperatura, composição do meio reacional, tipo de substrato, dentre
outros.
2.4 SÍNTESE DE PEPTÍDEOS USANDO PROTEASES
As proteases (Tabela 1) fazem parte de um dos principais grupos de enzimas produzidas
comercialmente para uso em diferentes segmentos da indústria.
Uma das aplicações mais
promissoras refere-se ao seu uso em síntese de peptídeos (Figura 16). A síntese enzimática de
peptídeos tem atraído muita atenção nos últimos anos. Proteases derivadas de diferentes recursos
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Capítulo II: Revisão Bibliográfica
53
naturais (animal, vegetal e microbiano), têm sido usadas com sucesso na produção de peptídeos
com baixa massa molar, principalmente, di e tripeptídeos.
Tabela 1 – Especificidade de várias proteases (Kumar & Balla, 2005)
PROTEASE
SERINICA
Tripsina
α-Quimotripsina
Catepisina
Elastase
Subtilisina
Carboxipeptidase
Prolina – protease específica
CISTEÍNA
Papaína
Bromelaína
Clostripaína
Catepsina B
METALO
Termolisina
ASPÁRTICA
Pepsina
Catepsina D
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Sítios de clivagem
-A-A`-(-A= Lis, Arg, -A`= não específico)
-A-A`-(-A= Lis, Fen, Leu, -A`= não
específico)
-A-A`-(-A= Fen, Leu, Trp, -A`= não
específico)
-A-A`-(-A= Ala, Ser, -A`= não específico)
-A-A`-(-A= Neutro, aminoácidos em meio
ácido, -A`= não específico)
-A-A`-(não específico)
-A-A`-(-A= Pro)
-A-A`-(-A= Arg, Lis, -A`= não específico)
-A-A`-(não específico)
-A-A`-(-A= Arg, -A`= Pro)
Depende do substrato
-A-A`-(-A=Leu, Fen, -A`= Leu, Fen, Val, Met,
Ala, Ile)
-A-A`-(-A= Fen, Tir, Leu, -A`= Trp, Fen, Tir)
-A-A`-(-A= Fen, Leu, -A`= Exceto Val, Ala)
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
54
Figura 16 - Ilustração esquemática de uma reação catalisada por protease
A síntese de peptídeos catalisada por proteases representa uma alternativa promissora
frente ao uso de catálise química. De acordo com a literatura, dentre as inúmeras proteases
estudadas, as proteases tripsina e quimotripsina têm se apresentado como biocatalisadores
versáteis para a síntese de uma enorme variedade de peptídeos e têm sido consideradas duas das
mais importantes proteases em potencial para a síntese de oligopeptídeos (Sekizaki et al., 2002).
Proteases para a síntese de peptídeos são selecionadas com base em algumas exigências:
(1) Especificidade quanto ao ataque sobre aminoácidos na cadeia principal ou em cadeias
laterais; (2) alta atividade catalítica em condições suaves de reação; (3) não haja necessidade da
presença de cofatores estequiométricos e (4) alto estéreo e regioespecificade com relação ao
substrato (Quiroga et al.; 2008). Nesse contexto, um enfoque maior tem sido dado à capacidade
da enzima proteolítica em catalisar a formação de ligações peptídicas para a síntese de peptídeos
biologicamente ativos. Recentemente, tentativas têm sido realizadas com o intuito de melhorar o
método de preparação de peptídeos com cadeias longas ou até mesmo pequenas proteínas (Afrin
et al., 2000). No entanto, os métodos não têm sido completamente desenvolvidos ainda para
alguns peptídeos contendo D-aminoácidos ou outros aminoácidos não usuais, devido,
principalmente, à restrição atribuída à especificidade e estereoseletividade do substrato.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
55
Como foi mencionado anteriormente, a imobilização de enzimas é uma das principais
estratégias para melhoramento da estabilidade química e operacional dos biocatalisadores.
Recentemente, Afrin e colaboradores (2000) imobilizaram a protease -quimotripsina em
partículas de politetrafluoretileno (PTFE). De acordo com os resultados obtidos, o sistema (αquimotripsina-PTFE) apresentou uma atividade catalítica superior à enzima livre para a hidrólise
de ésteres de aminoácidos (BTEE - N-benzoyl-L-tyrosine ethyl ester). Além disso, esse sistema
catalisou a síntese de peptídeos derivados de Ac-Phe-OEt (N-acetylphenyl- alanine ethyl ester) e
Ala-NH2 (alaninamide) com um rendimento de 14% e 64% para produtos derivados da hidrólise.
Com o intuito de minimizar as reações paralelas de hidrólise e aumentar o percentual de
síntese de peptídeos, Haensler e colaboradores (1999) utilizaram as proteases α-quimotripsina e
papaína em meio aquoso e temperatura de 18 °C para síntese de peptídeos. De acordo com os
resultados obtidos, os peptídeos Mal-Phe-Ala-OH, -Phlac-Arg-NH2, -Phlac-Phe-NH2, -PhlacLeu-NH2, Bz-Arg-Gly-NH2, apresentaram os seguintes rendimentos: 43, 95, 88, 75 e 70%,
respectivamente.
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CAPÍTULO III:
MATERIAL E MÉTODOS
Capítulo III: Material e Métodos
3
57
MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MATERIAL
As resinas Eupergit C e Eupergit CM foram adquiridas da SIGMA Aldrich. Todas as
outras foram cedidas gentilmente pela Room and Hass. Poli (alcool vinílico) (Mw 16000 e
86000), Caseína (P 9996), Reagente FOLIN & CIOCALTEU’S PHENOL 2 N (F 9252),
Carbonato de sódio (S 5444), fosfato de potássio mono- e dibásico trihidratado, Tyrosine (T
2950), ácido tricloroacético 2N, BCA reagent A (23225), BCA reagent B (23227) e as âmpolas de
padrões de albumina (Bovine Serum Albumin - BSA) foram adquiridos da THERMO Scientific.
A Tabela 2 mostra as principais características físicas das resinas utilizadas. O grupo
funcional comum a todas foi o epóxi.
Tabela 2 – Características físicas das resinas
Resinas
Matriz
Densidade do
Tamanho de
grupo functional
partícula (μm)
mol/g de suporte)
Polimetacrilato
Amberzyme
Polimetacrilato
Eupergit C
Polimetacrilato
Eupergit CM
Sílica
*Grace 192
Acrilato
*EC-EP 403
Acrilato
*EC 067 E902
Acrilato
*EXE 03260102
Acrilato
*EXE081 1P4989
Acrilato
*EC-EP 503
*Amostra não comercial
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1600
600
1300
-
220
150
200-300
300 - 1000
150 - 300
150 - 300
30 - 40
Capítulo III: Material e Métodos
58
3.2 EQUIPAMENTOS
Os principais equipamentos utilizados nesse trabalho foram:

Espectofotômetro de UV-visível modelo UV-1601, marca Shimadzu

Centrífuga de alta rotação modelo FLOOR, da New Brunswick

Espectrômetro de Ressonância magnética nuclear (BrukerDRX - 300)

Microscópio Eletrônico de Varredura modelo Hitachi S-570, marca Shimadzu

Sistema automático de titulação para controle de pH, modelo CH9101, da marca Metrohm

Centrífuga com filtros de peneira molecular de 3000 da Amicon, modelo Ultra-15

Equipamento de Eletroforese da THERMOTRON, modelo L1500

Incubadora da Thermo-Scientific, modelo H32.
3.3 FLUXOGRAMA GERAL
A Figura 17 mostra o fluxograma das etapas realizadas nesse trabalho.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo III: Material e Métodos
59
Figura 17 – Procedimentos empregados para a imobilização das enzimas e sua aplicação para a determinação da
atividade hidrolítica e síntese de oligopeptídeos.
Avaliação do grau de pureza das proteases – SDS PAGE e determinação da atividade
residual em função do tempo (autólise).
Tripsina
• Imobilização em
resinas epóxi por
ligação covalente
α-Quimotripsina
• Imobilização em
resinas epóxi
• Imobilização em
nanopartículas de
glicidila por ligação
covalente
Bromelaína
• Imobilização em
resinas epóxi por
ligação covalente
• Aprisionamento em
géis políméricos de
PVA
Determinação da Carga Teoricamente imobilizada (CTI), Eficiência de imobilização
(EI) e atividade hidrolítica.
Seleção dos sistemas que apresentaram melhor eficiência hidrolítica
Tripsina
• Termoestabilidade
• Determinação do
número de reusos
• Síntese de
oligopeptídeos de
lisina e determinação
do grau de
polimerização (RMN
H)
α-Quimotripsina
Bromelaína
• Síntese de
oligopetídeos de lisina
e determinação do
grau de polimerização
(RMN H)
• Determinação do
número de reusos e
avaliação por
Microscopia eletrônica
de Varreudura dos géis
de PVA.
• Síntese de
oligopeptídeos de
lisina (RMN H)
3.4 SELEÇÃO DAS ENZIMAS
Três enzimas proteolíticas foram selecionadas: Tripsina (> 7500 BAEE units/mg sólido) e
-quimotripsina, ambas derivadas do pâncreas bovino (Tipo II – 83,9 units/mg sólido), além da
bromelaína (2.290 units/mg sólido) derivada do abacaxi. Através dos ensaios de eletroforese foi
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo III: Material e Métodos
60
possível avaliar a pureza de cada uma delas. As proteases foram adquiridas através da SIGMA
ALDRICH e usadas sem tratamento prévio.
3.5 ENSAIO DE ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA – SDS – PAGE GEL
Dentre as inúmeras técnicas existentes para a análise de proteínas, a eletroforese em gel
de poliacrilamida representa uma ferramenta versátil para detecção de impurezas e determinação
de massa molar de enzimas. Essa técnica refere-se à migração de modo diferencial e próprio das
partículas eletricamente carregadas, quando submetidas a um potencial elétrico em um
determinado pH. A eletroforese em gel de poliacrilamida foi baseada no método desenvolvido
por Laemmli (1970) (CLAEYS et al., 1995).
As proteases foram solubilizadas e misturadas a um tampão LAEMMLI (contendo 62 mM
de tris-HCl pH 6.8, 2% de Dodecil sulfato de sódio, 20% de glicerol e 0.01% azul de bromofenol
e 5% de 2-mercaptoetanol ) em diferentes concentrações na proporção de 1:1 (amostra:tampão).
Em seguida, cada amostra foi aquecida por 5 minutos à temperatura de 90C. Uma alíquota de 20
L de cada amostra foi aplicado aos géis de poliacrilamida 12.5% e, posteriormente, colocados
em um sistema de eletroforese vertical com voltagem constante de 120 V. As massas molares das
enzimas foram estimadas de acordo com um padrão de proteína previamente conhecido. O
percentual de pureza foi determinado de acordo com uma curva padrão de albumina serínica
bovina (BSA - Proteina pura). Procedimento similar foi utilizado por Krishna e colaboradores
(2011) e Haider & Husain (2009). Os géis foram revelados em presença do corante coomassie
blue 10% por 2 horas e em seguida, o mesmo foi removido e adicionado o descorante coomassie
brilliant destain R-250 (40% etanol-ácido acético 10%) por 12 horas. Os resultados foram
quantificados de acordo com a intensidade e a área das bandas obtidas.
3.6 IMOBILIZAÇÃO DAS ENZIMAS
3.6.1 Imobilização das enzimas por ligação covalente
De acordo com experimentos preliminares, foi adotada a seguinte estratégia para
imobilização das enzimas por ligação covalente aos suportes: Um total de 500 mg de cada resina
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Capítulo III: Material e Métodos
61
foi submetida à 3 lavagens com uma solução etanólica 70%. Após essa etapa, foi adicionada uma
solução enzimática de 20 mL com concentração de 3 mg/L (protease em solução tampão de
fosfato de potássio – pH 7,5) em diferentes concentrações da enzima, objetivando a construção de
isotermas de sorção em função do tempo (2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 horas). O sistema foi mantido sob
agitação constante (150 rpm) em uma incubadora da marca Thermo-Scientific, modelo H32 à
temperatura ambiente. Ao longo do tempo, foram retiradas alíquotas para avaliar a quantidade de
enzima imobilizada e o monitoramento da atividade hidrolítica da enzima livre em solução. Após
o término do processo de imobilização, os suportes foram lavados exaustivamente com solução
tampão e as “águas de lavagens” foram submetidas à dosagem de proteínas pelo método de BCA.
Os sistemas obtidos após essa etapa foram utilizados para avaliar sua eficiência em função da
atividade hidrolítica (caseína) e da produção de oligopeptídeos derivados da lisina.
3.6.1.1 Determinação da quantidade de enzima aprisionada na matriz – Método de BCA
O método do ácido bicinconínico foi utilizado para a detecção e quantificação de
proteínas. Esse método combina a redução de íons Cu2+ para Cu+1 pela proteína em meio alcalino
com alta sensibilidade e uma detecção colorimétrica seletiva dos cátions de Cu1+ usando esse
ácido. O produto da reação é formado pela quelação de duas moléculas de BCA com uma de
Cu1+. Esse complexo exibe uma alta solubilidade em água e apresenta absorbância em 562 nm.
Ao passo que se aumenta a concentração desse complexo no meio, a curva de absorbância
apresenta um comportamento com característica linear na faixa de concentração de 20 – 2000
gmL.
O cálculo do percentual de proteína imobilizada na matriz foi baseado seguindo um
protocolo padrão da Thermo Haake Scientific N23225-23227 (BCA method) com algumas
adaptações. Essa metodologia foi usada indiretamente para quantificar a quantidade de proteína
imobilizada na matriz através de medidas de concentração da proteína no sobrenadante. As
concentrações das enzimas foram determinadas apartir de uma curvão padrão obtida de uma
proteína pura (BSA) e da própria enzima em diferentes concentrações.
O percentual de enzima na matriz, (%) Eimobilizada, foi calculado com base na equação 1
adaptada de Zhao e colaboradores (2011):
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Capítulo III: Material e Métodos
(%) Eimobilizada =
62
(CEinicial – CEfinal). V. FD
MS (g)
. 100
(1)
Onde: CEinicial e CEfinal representam as concentrações da enzima antes e após a imobilização em
mgmL, respectivamente; V é o volume utilizado em mL durante a imobilização; FD indica o
número de diluições requeridas para o ajuste de concentração e MS é a massa do suporte em
grama.
As análises foram realizadas em um equipamento espectofotômetro de UV-visível da
marca Shimadzu, modelo 1401. De acordo com a literatura, esse método tem sido exaustivamente
utilizado como ferramenta para detecção da proteína e sua quantificação em matrizes de
imobilização. O procedimento pode ser melhor explicado no CAPÍTULO DE ANEXOS desse
trabalho.
Esse método também foi utilizado para quantificar o processo de desorção da enzima no
suporte (GUSTAFSSON et al., 2011). Após todas as etapas descritas acima, os sistemas de
imobilização (suporte-enzima) foram incubados em tempos pré-estabelecidos (2, 4, 6 e 12 horas)
em solução tampão à temperatura ambiente sob agitação constante de 150 rpm e as proteínas
desorvidas do suporte foram quantificadas no mesmo comprimento de onda acima citado (562
nm).
3.6.1.2 Determinação da atividade hidrolítica da protease livre e imobilizada
A atividade hidrolítica das proteases foi determinada de acordo com o protocolo da
SIGMA (PC0100), usando caseína como substrato, no entanto, algumas modificações foram
requeridas. Esse método permite que a caseína sofra uma clivagem provocada pela protease e que
os peptídeos produzidos sejam solúveis em ácido tricloroacético. Os peptídeos gerados contêm
tirosina e triptofano que em presença do reagente Folin & Ciocalteu´s produz uma mudança de
coloração de amarela para azul. Dessa forma, os produtos podem ser colorimetricamente
quantificado no comprimento de onda de 660 nm. Inúmeros trabalhos na literatura têm reportado
o uso dessa metodologia para a determinação de atividade proteolítica com algumas adaptações
(BIAN et al., 2011; ROY et al., 2009; PURCENA et al., 2009).
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Capítulo III: Material e Métodos
63
e uma
solução contendo caseína (0.65% do substrato em 0.05M de solução tampão fosfato de potássio
pH 7.5). A mistura foi incubada à temperatura de 37 C por 10 minutos, com agitacão constante
tricloroacético (110 mM) e a
mistura mantida à temperatura de 37 C por 20 minutos, seguida de uma centrifugação de 10000
50 µL do sobrenadante. Posteriormente, a mistura foi mantida à 37 C por 30 minutos. Em
paralelo foi construído uma curva padrão de tyrosine em diferentes concentrações sob as mesmas
condicões acima descritas. As leituras foram avaliadas no comprimento de onda de 660 nm.
A atividade hidrolítica foi quantificada sob a forma de Unidadesg de enzima (Unitsg).
Uma Unidade de protease (Unit) foi definida como sendo a quantidade de enzima requerida para
hidrolizar a caseína a produzir a cor equivalente a 1
mol de tirosina por minuto em pH 7,5 à
temperatura de 37 C, como pode ser visto nas Equações 2 e 3 (ROY et al., 2005). Esse
procedimento tem sido utilizado para as enzimas imobilizadas em resinas, géis e nanopartículas,
no entanto, algumas modificações têm sido necessárias.
Ctyrosine (mols) . Vreação (mL)
Units/mL =
Vamostra (mL) . Treação (min.) . Vensaio (mL)
-1
-1
 Units/ml = mols .mL .min
(*Sigma – PC0100, 1999)
(2)
Units/mL de enzima
Units/g de enzima =
 Units/g de enzima = mols.min-1.g-1
Menzima (g). mL de enzima
(*Sigma – PC0100, 1999 )
(3)
Onde: Ctirosina representa a concentração molar de tirosina (mols); Vreação - volume da reação;
Vamostra – Volume da amostra (L); Treação – Tempo da reação (min.); Vensaio – Volume do ensaio
colorimétrico (L) e Menzima – Massa da enzima (g).
SIGMA ALDRICH protocol PC0100 – Protease colorimetric detection kit, SSCASE01.001 e ASC,MAM 10/05-1 (1999).
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo III: Material e Métodos
64
3.6.1.3 Determinação do processo de autólise das proteases
As proteases foram solubilizadas em solução tampão 0,05 M e mantidas sob agitação
constante de 150 rpm à temperatura ambiente. Alíquotas foram retiradas em tempos préestabelecidos e aplicada a metodologia para a determinação da atividade hidrolítica. Todas as
medidas foram tomadas como base o tempo zero de incubação, adotando assim, 0% de autólise
(POZZI et al., 2011; HAN, DAMODARAN, 1997; BHOSALE et al., 1995; VESTLING et al.,
1990).
3.6.1.4 Reusabilidade dos sistemas
A retenção de atividade das proteases imobilizadas foi avaliada após repetidos ciclos de
reuso (HONG et al., 2007). A atividade foi calculada com base no mesmo procedimento para
hidrólise da caseína (ROY et al., 2005) e síntese de oligopeptídeos. Após cada ciclo, a enzima
imobilizada foi separada por centrifugação e foram realizadas lavagens intercaladas com solução
tampão (3x) e com água destilada. Os suportes foram usados sob diferentes estratégias de uso:
molhado e seco sob pressão reduzida.
3.6.1.5 Avaliação da termoestabilidade dos suportes
Os suportes selecionados foram incubados em diferentes temperaturas (37, 45, 50, 60 e 70
C) por 1 hora em solução tampão (0,1 M and pH 7,7) e mantidos sob agitação
constante. Posteriormente, os suportes foram removidos e avaliadas suas respectivas atividades
hidrolíticas (CRESCIMBENI et al., 2010; JAOUADI et al., 2010). O mesmo procedimento foi
empregado para a protease livre.
3.6.2 Imobilização das enzimas por aprisionamento em géis de poli álcool vinílico (PVA)
3.6.2.1 Obtenção dos criogéis de PVA
O procedimento geral de preparação dos géis de PVA foi baseado na seguinte estratégia:
O polímero foi solubilizado em 50 mL de água destilada em diferentes concentrações (5, 8, 10 e
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo III: Material e Métodos
65
15%) à 80 C por 1 hora e resfriado gradualmente à temperatura ambiente. Em seguida, foram
aplicadas 3 diferentes metodologias para obtenção de matrizes criogênicas com a enzima
imobilizada.
3.6.2.2 Imobilização da protease bromelaína em criogéis
Método 1
Após a solubilização do polímero (PVA) em água destilada em diferentes concentrações,
25 mL de uma solução enzimática de bromelaína de 10 mgL em solução tampão (0,1M de
fosfato de potássio - pH 7,5) foi lentamente adicionada através de um gotejamento controlado a
essa solução polimérica. A matriz obtida (PVA-bromelaína) foi submetida a diferentes f-t ciclos
até a obtenção de uma matriz moldável (cilindros e filmes) e estável. A estabilidade foi
determinada com base no número de f-t ciclos (N), onde N representa representa o número de
vezes com que o sistema PVA-enzima foi submetido ao congelamento (freezing – “f”) a - 20 °C
(freezing) e descongelamento (thawing – “t”) à temperatura ambiente, seguidamente (Método
Freezingthawing) (SZCZESNA et al., 2001; SHAPIR; SHAPIRO, 1999; SHINDO;
KAMIMURA, 1990). A Figura 18 mostra a ilustração do procedimento adotado.
Figura 18 – Ilustração do procedimento adotado na preparação de géis de PVA para imobilização de enzimas.
Enzima
Bromelaína (10 mgL)
Congelamento seguido de
Enzim
a
descongelamento à temperatura
ambiente (f-t ciclos).
Criogéis de
PVA
Formato: Filme e
cilindros
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo III: Material e Métodos
66
Método 2
Com o objetivo de se obter géis com partículas esféricas contendo o biocatalisador, esse
método foi baseado no gotejamento controlado da solução (PVA- enzima) em solventes de baixa
polaridade e em uma fase hidrofóbica contendo óleo vegetal. As partículas esféricas de PVAenzima foram resfriadas à temperatura de -20 C, seguidas de resfriamento gradual (- 0.5 C min.1
) à temperatura ambiente e submetidas à lavagens com NaCl 0.1 M. Posteriormente, foi
determinada a atividade hidrolítica e sintética dos sistemas.
Método 3
A literatura tem reportado o uso de compostos criogênicos capazes de acelerar e modificar
a estrutura dos criogéis (SHAPIRO, SHAPIRO, 1999). Nesse contexto, 250 mg de bromelaína foi
solubilizado em 25 mL de uma solução de polietileno glicol 400 (PEG-400), posteriormente, essa
solução foi gotejada lentamente em uma solução de PVA 10%. O mesmo procedimento foi
adotado para o polietileno glicol 600 (PEG-600). Os sistemas (PVA-PEG-ENZIMA) obtidos
após essa etapa foram submetidos a inúmeros f-t ciclos, utilizando a mesma metodologia citada
anteriormente.
3.6.2.3 Influência do número de f-t ciclos nas propriedades estruturais dos sistemas PVA-enzima
Com intuito de avaliar a morfologia e a difusividade dos criogéis obtidos, foi realizado
ensaios de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). As superfícies para análise foram
retiradas a partir de um corpo de prova original (criogéis de PVA), as quais foram seccionadas e
metalizadas, utilizando “sputtering” sob às seguintes condicões: material de metalização – ouro;
0.05 mbar de argônio e tempo de deposição – 50 segundos. As amostras foram analisadas em um
microscópio eletrônico de varredura (MEV), com tensão de 20 kV e corrente de emissão 0.2 x 1010
A. As micrografias dos sistemas, PVA-Enzima, referentes aos diferentes número de f-t ciclos,
foram avaliadas as imagens de 500 e 1000 vezes de magnificação.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo III: Material e Métodos
67
3.6.3 Imobilização de enzimas em nanopartículas magnéticas (MNPs – Magnetic
nanoparticles)
A preparação do suporte foi realizada com centrifugação (10000 rpm) por 30 min seguida
de 3 etapas de lavagens com solução tampão de fosfato de potássio para o precipitado
(nanopartículas). O processo de imobilização de enzimas nesse suporte foi realizado com base na
seção 3.5.1 desse trabalho. No entanto, α-quimotripsina foi a única protease selecionada nessa
etapa. A Figura 19 mostra ilustrativamente o procedimento adotado.
Figura 19 - Ilustração do procedimento adotado na imobilização da protease α-quimotripsina em nanopartículas
magnéticas de metacrilato de glicidila
Etapa I – Preparação do suporte
Nanopartículas
Nanopartículas magnéticas de
magnéticas de
glicidila + SDS após
glicidila
centrifugação com 3 etapas de
dispersas em
lavagem
SDS
Sobrenadante após centrifugação
Etapa II – Processo de imobilização
Imobilização
Dodecil sulfato de sódio 2%
Incubação
Nanopartículas de glicidila
α-quimotripsina
Nanopartículas de Glicidila-Quimotripsina
Fonte: Adaptada de Wang e colaboradores, 2008
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo III: Material e Métodos
68
3.7 SÍNTESE DE OLIGOPEPTÍDEOS SOLÚVEIS EM ÁGUA USANDO AS PROTEASES
IMOBILIZADAS
Um total de 490 mg do substrato lisina foi solubilizado em 4 mL de solução tampão
fosfato de potássio em diferentes pHs (7, 8, 9, 10 e 11) e em seguida transferido para um
erlemeyer. Um sistema de titulação automática para o controle de pH foi acionado durante a
reação, com o intuito de manter o pH estável. A solução dosada de NaOH foi adicionada
lentamente na velocidade de 0,05-0,1 mL / min. Posteriormente, 40 mg de protease sob a forma
livre e imobilizada foi adicionada lentamente e o sistema mantido sob agitação constante e
temperatura de 40 °C por 2 horas. Ao término da reação, a protease livre foi removida do sistema
por centrifugação, utilizando peneira molecular de 3000, ao passo que as imobilizadas puderam
ser facilmente separadas por filtração e, posteriormente, utilizadas em uma nova série de
experimentos. O sistema sem a enzima foi liofilizado por 48 horas e avaliado em um
equipamento de Ressonância Magnética Nuclear em estado sólido para a determinação da
conversão e do grau de polimerização médio dos oligopeptídeos derivados de lisina.
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CAPÍTULO IV:
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Capítulo IV: Resultados e Discussão
70
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 AVALIAÇÃO DA PUREZA DAS PROTEASES POR SDS-PAGE
Um requisito crucial no processo de avaliação da atividade catalítica de uma enzima é
conhecer o seu percentual de pureza, ou seja, a real quantidade de protease presente em 100% de
proteína. O grau de pureza desempenha um importante papel no processo de imobilização da
enzima e na determinação de sua atividade catalítica, visto que, durante esse processo, proteínas
de baixa massa molar ou outros contaminantes podem se ligar ao suporte por adsorção ou por
ligação química covalente, competindo diretamente com as moléculas da protease no meio
enzimático. Em consequência desse efeito, um menor percentual de protease imobilizada e uma
diminuição da atividade catalítica do sistema serão observados (CAO, 2005). Ho e colaboradores
(2004) imobilizaram a enzima de Escherichia coli BL21 por adsorção em suporte de sepharose
com uma etapa de purificação por coluna cromatográfica. De acordo com os resultados obtidos, o
sistema tornou-se 4 vezes mais eficiente em termos de imobilização e atividade catalítica, em
relação a enzima não purificada, evidenciando, portanto, a remoção de contaminantes e o
aumento de sua especificidade.
Baseado no contexto acima, as enzimas empregadas neste trabalho foram avaliadas
qualitativamente e quantitativamente quanto à distribuição de massa molar e, consequentemente,
ao padrão de pureza. As proteases foram submetidas à migração diferencial em gel de
poliacrilamida – SDS PAGE, e as massas molares foram estimadas através da mobilidade dos
fragmentos no gel em relação a padrões previamente conhecidos.
A Figura 20 mostra o perfil eletroforético das proteases em função de padrões de massas
molares previamente conhecidas.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
71
Figura 20 – Eletroforese em gel de poliacriliamida - SDS-PAGE das bandas referentes às proteases. Bandas AT e AT2
- Diferentes concentrações da protease tripsina (0,2 e 0,1 mgmL, respectivamente). Bandas AC e AC2 – Diferentes
concentrações da protease α-quimotripsina (0,2 e 0,1 mgmL, respectivamente). Bandas BB, BB2, BB3 e BB4 Diferentes concentrações da protease bromelaína (1,0; 0,8; 0,6 e 0,4 mg/mL, respectivamente ).
AT
AT2
AC AC.2
BB
BB2 BB3 BB4
101.0 kDa
97.0 kDa
77.0 kDa
45.6 kDa
29.3 kDa
10.3 kDa
(B)
(Padrão de proteínas)
De acordo com a Figura 20, as amostras apresentaram perfis eletroforéticos bem definidos
quanto às frações (fragmentos) de massa molar. Claramente, observa-se que o fracionamento das
bandas está diretamente associado à quantidade de outras proteínas, eou simplesmente, às
impurezas presentes em cada enzima (HAYET et al., 2011), sem mencionar que a intensidade de
cada fragmento é dependente da concentração de enzima utilizada. Dessa forma, em uma escala
crescente de pureza, pode-se concluir que a protease bromelaína é a que apresenta menor
percentual de pureza, seguida da -quimotripsina e tripsina. A protease tripsina apresentou uma
única banda característica de sua massa molar em torno de 30 kDa. As proteases -quimotripsina
e bromelaína apresentaram massas molares similares às da protease tripsina (30 kDa), no entanto,
com intensidade e número de bandas diferentes, principalmente, a protease bromelaína (5
fragmentos de massas molares abaixo de 10 kDa).
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
72
4.2 DETERMINAÇÃO DO PERCENTUAL DE ENZIMA PRESENTE NA PROTEÍNA
A maioria dos trabalhos publicados na literatura mostra que a utilização da técnica de
eletroforese em gel de poliacrilamida tem sido aplicada como ferramenta qualitativa para
identificação de bandas características de um determinada proteína eou a determinação de sua
massa molar, com base em um padrão de proteínas de massas molares previamente conhecidas
(BOLIVAR et al., 2009; PURCENA et al., 2009).
Por outro lado, Claeys e colaboradores (2004) utilizaram a técnica de SDS-PAGE para a
determinação da quantidade de proteínas miofibrilares presentes na carne. O método foi baseado
no uso de um padrão interno (Bovine Serun Albumin – Albumina seríca Bovina). Resultados
indicaram uma relação linear das densidades colorimétricas das bandas com a quantidade de
proteína presente. Nesse contexto, com o intuito de quantificar o percentual de cada protease
presente na amostra enzimática, foi construída uma curva padrão com diferentes concentrações
de Bovine Serun Albumin – BSA (Padrão de pureza 100%), onde foi estimada a área de cada
banda. A migração da banda de cada protease foi comparada à da proteína padrão, através das
suas áreas. A Figura 21 mostra as áreas das bandas referentes a cada concentração de BSA
utilizada (mgmL).
Figura 21 – Área das bandas de BSA em função de suas respectivas concentrações.
y = 275.24x + 8.3827
60
Saturação
R² = 0.9962
Área (mm2)
50
40
30
20
10
0
0
Fabio Pereira Fagundes
0,1
0,2
0,3
Concentração de BSA (mgmL)
0,4
Capítulo IV: Resultados e Discussão
73
De acordo com o perfil eletroforético das amostras apresentado na Figura 21, observa-se a
formação de duas regiões distintas. A primeira revela um aumento contínuo da intensidade
colorimétrica da banda e de sua área com o aumento da concentração de BSA, na faixa de
concentração 0,02 a 0,1 mgmL. A segunda região, na faixa de concentração 0,2 a 0,4 mgmL,
mostra um comportamento típico de saturação, ou seja, as áreas permanecem praticamente as
mesmas com o aumento de concentração, inviabilizando, portanto, seu uso como referência.
Dessa forma, considerou-se como região de referência para a construção da curva padrão aquela
observada entre 0,02 e 0,1 mgmL. O coeficiente de regressão linear da equação (R2) próximo a 1
valida a utilização dessa técnica para a quantificação do percentual de proteína específica
presente na amostra.
A Tabela 3 mostra o percentual de pureza obtida através da área das bandas para as
diferentes proteases estudadas.
Tabela 3 – Dados comparativos de área, concentração estimada (mgmL) e percentual de pureza das proteases
usadas.
Concentração real
Área
Concentração
Percentual de
(mgmL)
(mm2)
estimada (mgmL)
pureza (%)
AT
0,2
30,1
0,079
39,5
AT2
0,1
19,6
0,041
41,0
AC
0,2
24,1
0,057
28,3
AC2
0,1
16,4
0,029
29,5
BB
1,0
41,4
0,12
12,6
BB2
0,8
38,6
0,11
13,9
BB3
0,6
30,4
0,08
14,1
BB4
0,4
22,1
0,05
14,9
Protease
Tripsina
Quimotripsina
Bromelaína
De acordo com os dados mostrados na Tabela 3, as diferentes concentrações estudadas
para cada protease apresentaram uma similaridade quanto aos valores do grau de pureza, o que
corrobora com a estratégia usada. No entanto, esse referencial (grau de pureza) considerado para
cada enzima foi o obtido a menor concentração, devido, principalmente, ao melhor ajuste da área
das bandas e o enquadramento dentro do limite confiável da curva padrão utilizada (0 – 0,1
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
74
mgmL) para a tripsina e quimotripsina e 0,4 mg/mL para bromelaína. Dessa forma, considerouse que as proteases tripsina, quimotripsina e bromelaína apresentaram os seguintes valores
médios de grau de pureza: 41, 29 e 15%, respectivamente.
Diante do baixo percentual de pureza apresentado pelas proteases, o processo de
purificação por ultracentrifugação poderia ser utilizado como estratégia para aumentar esse
índice. O uso de membranas capazes de separar as frações correspondentes à faixa de massa
molar 25 – 35 kDa eliminaria totalmente a interferência de proteínas de baixa massa molar (< 10
kDa) durante a imobilização, o que resultaria no aumento da atividade catalítica.
4.3 INFLUÊNCIA DO PROCESSO DE AUTÓLISE NA ATIVIDADE RESIDUAL DAS
PROTEASES
Chen e colaboradores (2003) afirmaram que cada protease apresenta um mecanismo
intrínseco para o processo de autólise. Esse processo ocorre em sítios específicos na maioria das
proteases. De acordo com a literatura, os sítios mais vulneráveis são denominados de primários e
os produtos originários dessa clivagem são responsáveis pela quebra de outros sítios específicos
(clivagem secundária) e assim por diante (STEFANSSON et al., 2010). No entanto, essa
clivagem é feita desordenadamente, ou seja, as clivagens proteolíticas ocorrem de forma aleatória
e de difícil predição para cada enzima, sugerindo, portanto, um diferente comportamento para
cada protease estudada (SIMON, et al., 2001; KUMAR; HEIN, 1970).
Bajorath e colaboradores (1988) avaliaram comparativamente a autólise da protease K
através de dois métodos: eletroforese em gel de poliacrilamida e atividade residual em função do
tempo. Eles observaram que a relação entre a autólise e a diminuição da atividade proteolítica
ocorre em um espaco de tempo superior a 2 horas, ou seja, a protease sofre o processo de autólise
muito antes de haver uma mudança acentuada em seu sítio ativo que venha a influenciar sua
atividade catalítica. Por outro lado, a técnica de eletroforese requer um tempo superior a 2 horas
para o término da análise, sem mencionar que as concentrações das amostras não devem ser
superiores a 0.01 mgmL. Partindo desse pressuposto, decidimos adotar a medição da atividade
residual como parâmetro de avaliação para o processo autolítico das proteases.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
75
Nesse trabalho, o processo de autólise das proteases foi monitorado pelo percentual da
atividade residual ao longo do tempo. Os efeitos provocados por esse processo na atividade
residual de cada protease estudada são mostrados na Figura 22.
Figura 22 – Atividade residual das proteases (tripsina, α-quimotripsina e bromelaína) em função do tempo .
100
Tripsina
90
Atividade residual (%)
Quimotripsina
Bromelaína
80
70
60
50
40
30
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Tempo (Horas)
De acordo com a Figura 22, todas as proteases exibiram uma diminuição da atividade
residual em função do tempo, provavelmente por autólise ou desnaturação nas condições de
ensaio. A protease tripsina manteve apenas 45% de sua atividade residual após 24 horas, ao passo
que as proteases quimotripsina e bromelaina mantiveram 65% e 67% de suas atividades,
respectivamente.
As proteases tripsina e α-quimotripsina apresentam similaridades químicas e estruturais,
no entanto, exibem diferenças em suas especificidades e no processo de autólise. A protease
tripsina, mesmo apresentando uma enorme plasticidade estrutural, ou seja, diferentes
conformações ativas em sua estrutura (KOSSIAKOFF et al., 1977), é considerada uma das
enzimas mais susceptíveis ao mecanismo de autólise (PURCENA et al., 2010), devido,
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
76
principalmente, à sua conformação espacial e ao alinhamento dos seus aminoácidos, que induzem
às interações dos sítios auto-catalíticos. A preservação das interações espaciais dos grupos ativos
em cada uma dessas enzimas depende basicamente de dois requisitos: (1) que os fatores
estereoquímicos responsáveis pela clivagem de ligações peptídicas sejam específicos e bem
definidos e (2) que o substrato promova interações transientes com o sítio ativo da enzima, de
forma a estabilizar o estado de transição (DODSON; WLODAWER, 1998).
Estados de ordenação no arranjo estrutural das proteases estão associados diretamente à
atividade catalítica. Uma das primeiras transições conformacionais ordem-desordem descritas foi
a conversão do tripsinogênio à tripsina por Perkins & Wuthrich (1980). Aproximadamente 15%
das moléculas de tripsinogênio se encontram em conformação desordenada, o que faz com que o
mesmo apresente um baixo percentual de atividade, cerca de 1% comparado à atividade da tripsina. Esse composto (-tripsina) é considerado um dos principais constituintes da tripsina e é
responsável pela clivagem da ligação presente nos resíduos de aminoácidos Lys-145 e Ser-146,
resultando em outra conformação denominada -trypsina. Ambas as conformações são ativas,
embora apresentem eficiências catalíticas diferentes. A partir da formação da -tripsina, ocorre a
clivagem das ligações entre os resíduos de Lys-188 e Asp-89, ocasionando o surgimento de uma
nova conformação de menor atividade catalítica denominada -tripsina, favorecendo, portanto, a
perda de especificidade da enzima ao longo do tempo (SIMON et al., 2001; ABBOTT et al.,
1975). Por outro lado, um ajuste conformacional adequado, adquirido pela ligação de caráter
iônico entre os resíduos dos aminoácidos Ile16 e Asp194 propicia o controle da conformação no
domínio de ativação dessa enzima. A -quimotripsina e bromelaína por sua vez, apresentam
diferentes sítios de clivagem e uma taxa de velocidade autolítica inferior a da tripsina, devido,
principalmente, à distribuição conformacional e à distância dos seus resíduos de aminoácidos,
responsáveis pela autólise ao longo de sua estrutura (BODI et al., 2001).
Nesse contexto, o processo de imobilização surge como o principal fator para a
estabilização conformacional ativa da enzima, devido, principalmente, às ligacões multipontuais
dos grupos amina, presentes nas moléculas das proteases, e aos grupos epóxi dos suportes
(VILLALONGA et al., 2000).
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
77
4.4 IMOBILIZAÇÃO DAS PROTEASES POR LIGAÇÃO COVALENTE
4.4.1 Determinação do percentual de protease imobilizada na matriz
As concentrações das enzimas são, geralmente, determinadas e reportadas com referência
a padrões de proteínas com alto percentual de pureza. A proteína Albumina Sérica Bovina (BSA)
vem sendo amplamente utilizada como padrão de referência em diversos trabalhos que requerem
o percentual de enzima imobilizada na matriz. Dessa forma, nesse trabalho foram construídas
várias curvas padrão com as diferentes proteases e comparadas a da proteína BSA (Figura 23).
Figura 23 – Absorbância em função das diferentes concentrações (mgmL) de BSA e das proteases utilizadas.
2
1,8
BSA
Y = 0.9038X + 0.024
R2 = 0.9945
1,6
Absorbância
1,4
Tripsina
1,2
Y = 1.3086X + 0.0336
R2 = 0.9954
1
0,8
Quimotripsina
0,6
Y = 1.0893X + 0.0143
R2 = 0.9988
0,4
Bromelaína
0,2
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
Concentração (mgmL)
Y = 0.8186 + 0.0166
R2 = 0.9939
A Figura 23 exibe uma resposta diferente para cada curva padrão adotada, devido,
principalmente, à sequência de aminoácidos e a estrutura química de cada proteína. Esses fatores
propiciam diferentes interações na formação do complexo (proteína + Cu2+  Cu1+ + BCA 
Complexo), sendo observadas discrepâncias nos valores das concentrações de cada protease em
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
78
função da proteína padrão. Portanto, faz-se necessário a normalização das curvas padrão das
proteases em função da razão proteaseBSA.
4.4.2 Imobilização da protease tripsina por ligação covalente em suportes epóxi ativados
As resinas Amberzyme, Grace, Eupergit C e Eupergit CM foram selecionadas como
resinas macroporosas para a imobilização covalente da tripsina, devido à alta densidade de
grupos oxiranos em suas superfícies. A sorção de tripsina foi, notavelmente, dependente do
tempo de imobilização, como mostrado na Figura 24.
Figura 24 – Percentual de imobilização da protease tripsina em função do tempo.
Amberzyme
Grace 192
Eupergit CM
Eupergit C
Como observado na Figura 24, a saturação da tripsina nos suportes ocorreu em 12 horas.
No entanto, após 6 horas, mais que 50% da quantidade de enzima inicial já havia sido
imobilizada. Foi escolhido um longo tempo de imobilização (24 horas) devido ao favorecimento
de uma maior estabilidade operacional para muitos reusos da protease imobilizada, causada pela
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
79
ligação covalente dos grupos NH2 da tripsina com os grupos epóxi dos suportes (imobilização
multipontual), resultando em um sistema quimicamente estável.
Em função do baixo percentual de atividade hidrolítica apresentado pelos sistemas
suporte-enzima, após a secagem sob pressão reduzida, os mesmos foram mantidos sob a forma
“molhada”. De acordo com os resultados previamente obtidos, ficou constatada a influência da
“molhabilidade” na eficiência catalítica dos sistemas. Esse efeito foi responsável por uma maior
acessibilidade do subtrato na região interna dos poros e um favorecimento de transferência de
massa dos produtos para o meio, sugerindo, portanto, um aumento no percentual de atividade
hidrolítica e na síntese de peptídeos. Dessa forma, todos os sistemas obtidos via imobilização por
ligação covalente foram utililizados sob a forma molhada. Essa particularidade foi comprovada
por Kumar e colaboradores (2009) ao determinar a atividade catalítica da protease denominada
“AT” imobilizada em suportes de carbono ativado sob a forma “molhada”.
Do ponto de vista prático, atividade, reusabilidade e estabilidade térmica representam os
mais importantes parâmetros para se avaliar a eficiência desses sistemas na síntese de
oligopeptídeos. A Tabela 4 mostra os resultados relativos à quantidade de protease imobilizada
nos suportes e suas respectivas atividades.
Tabela 4 – Dados relativos aos parâmetros estruturais dos suportes e os resultados referentes à Carga Teoricamente
Imobilizada (CTI) da protease tripsina, Eficiência de imobilização (EI), Atividade hidrolítica e relativa dos sistemas
usados (suporte-tripsina). Condições: 60 mg de enzima, solução tampão fosfato de potássio 0.1 M, pH 7.7.
Parâmetros estruturais
Suporte
Tripsina - suporte
TPartícula
Dporo
DGF
CTI
EI
Atividade
Atividade
(μm)
(nm)
mol/g de
(%)
(%)
hidrolítica
relativa
suporte)
Amberzyme
220
100
1600
9.2
76.6
276.5
13
*Grace 192
300-
120-180
1300
7.1
62.5
295.3
13.9
200-300
Nd
Nd
6.0
50.0
217.5
10
150
20
600
8.2
68.3
358.4
17
1000
Eupergit CM
Eupergit C
* Amostra não comercial. Atividade hidrolítica (Units/g de enzima), Atividade relativa (%). Nd –
Não determinado
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
80
De acordo com os resultados mostrados na Tabela 4, a Carga Teoricamente Imobilizada
da enzima e sua eficiência de imobilização não correspondem necessariamente a mais alta
atividade. A alta densidade de carga presente no suporte Amberzyme foi, provavelmente,
responsável pelo maior índice de CTI e EI da enzima. Por outro lado, esse sistema (Amberzymetripsina) apresentou um dos menores índices de atividade relativa comparado aos demais.
Basicamente, dois fatores podem ter contribuído para esse efeito: as restrições espaciais causadas
pela quantidade de enzima imobilizada eou as mudanças conformacionais provocadas pela
imobilização multipontual da tripsina no suporte, onde ambos os fatores refletem a falta de
mobilidade da enzima no interior do suporte (ZHAO et al., 2011; PRAMPARO et al., 2010).
Peng e colaboradores (2009) usaram uma enzima modelo (lipase de Candida rugosa)
para avaliar o efeito da densidade de grupos carboxila na superfície do suporte em relação às
propriedades catalíticas. De acordo com os resultados obtidos, ficou constatado que quando a
enzima passa de um processo de imobilização pontual (single site immobilization) para multipontual (multi site immobilization), devido ao aumento de grupos carboxila, a enzima
imobilizada sofre uma redução no valor de atividade catalítica. Dessa forma, um sistema “ótimo”
de imobilização deve combinar um máximo de carga imobilizada com uma alta atividade
catalítica. Além disso, esse possível “excesso” de enzima imobilizada, provavelmente, reflete a
imobilização de proteínas contaminantes de baixa massa molar, visto que a protease tripsina
possui um grau de impureza superior a 40%, como pode ser visto na seção 4.2 desse trabalho.
Os valores de atividade relativa alcançaram um máximo de 17% com o sistema Eupergit
C-Tripsina. Esse resultado é bastante promissor em função do substrato (caseína) apresentar uma
massa molar relativamente alta para difundir na região interna dos poros (SEO et al., 1998). Os
dados mostrados na Tabela 4 indicam que o processo de imobilização foi, notavelmente, mais
efetivo nesse suporte (Eupergit C), em termos de atividade. Devido, provavelmente, a um
balanceamento da densidade de grupos oxirano em sua superfície (600 mmolg de suporte) em
relação ao m2 de área do suporte, a tripsina pôde ser imobilizada em vários sítios da estrutura
desse suporte (principalmente via grupos epóxi), provavelmente, sem haver um empacotamento
da enzima na superfície do suporte, o que facilita a acessibilidade do substrato ao centro ativo da
tripsina imobilizada, ocasionando, portanto, um maior percentual de atividade comparada aos
demais.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
81
O suporte Grace 192 apresentou uma atividade muito próxima à do sistema EupergitTripsina. Uma explicação razoável para esse comportamento seria o caráter altamente hidrofílico
do suporte, que o torna mais susceptível à entrada do substrato na região interna do poro, já que a
reação ocorre em meio aquoso. O grau de hidratação do suporte é um fenômeno de considerável
importância em função de promover a mudança de uma estrutura rígida da enzima no suporte
para uma estrutura flexível, acompanhado por mudanças significantes nas propriedades físicas e
termodinâmicas das enzimas (SIROTKIN; KHADIULLINA, 2011).
O suporte Eupergit CM obteve o menor percentual de imobilização e atividade relativa,
comparado aos demais. Mesmo apresentando uma estrutura química similar ao suporte Eupergit
C, Eupergit CM apresenta uma distribuição de tamanho de partícula 2 vezes maior e uma
distribuição de grupos funcionais não uniformes (Tabela 5). Esse fato associado, provavelmente,
a uma série de parâmetros (grau de inchamento, diâmetro de poro e outros) são responsáveis
pelos fortes problemas associados ao impedimento estérico da enzima no interior dos poros e
consequente perda de eficência catalítica em razão da dificuldade do substrato alcançar o centro
ativo da enzima.
4.4.3 Reusabilidade dos sistemas
O número de reusos dos sistemas reflete, basicamente, a estabilidade operacional. De
acordo com os resultados de reusabilidade, Eupergit C não se mostrou um suporte tão efetivo
como esperado ao longo dos 12 ciclos de reuso. A Figura 25 mostra os resultados de atividade
residual em função do número de reusos para cada sistema.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
82
Figura 25 – Ciclos de reuso da tripsina imobilizada nos suportes Amberzyme, Grace, Eupergit C e Eupergit CM
De acordo com os resultados apresentados na Figura 25, os sistemas Grace 192-, Eupergit
C- e Eupergit CM-Tripsina perderam 75%, 34% e 60% de suas atividades iniciais,
respectivamente, após 12 reusos, ao passo que o sistema Amberzyme-Tripsina perdeu somente
20%. A excelente reusabilidade desse sistema poderia ser explicada pela resistência às mudanças
conformacionais e à desnaturação causada pelas condições do meio, tais como: solução tampão,
pH e as interações entre o suporte e a enzima. Esse argumento está de acordo com os resultados
dos ensaios de desorção dos sistemas quando submetidos a um período de incubação de 6 horas e
sob a mesma agitação durante o processo de imobilização.
A Tabela 5 relaciona os dados relativos à quantidade de tripsina imobilizada nos
diferentes suportes e o seu percentual desorvido após 6 horas, sob as mesmas condições de
imobilização.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
83
Tabela 5 – Dados relativos à quantidade de tripsina imobilizada/500 mg de suporte, tripsina desorvida (mg) e o seu
percentual em relação aos diferentes suportes utilizados nesse trabalho. Condições: 60 mg de enzima, solução
tampão fosfato de potássio 0.1 M, pH 7.7.
Suporte
mg de enzima500
Enzima desorvida
mg de suporte
(mg)
46
0,598
1.3
35,5
2,44
6.9
Eupergit CM
30
1,17
3.9
Eupergit C
41
1,23
3.0
Amberzyme
Grace 192
Desorção (%)
De acordo com os dados apresentados na Tabela 5, ficou constatado que a enzima foi
ligada “fortemente” via ligação covalente ao suporte Amberzyme. Essa conclusão pode ser
atribuída ao baixo percentual de desorção da protease na matriz. Esse resultado é reflexo da alta
densidade de grupos funcionais mol de grupos epóxi/g de suporte) presentes na estrutura desse
suporte, os quais são responsáveis por uma imobilização multipontual da enzima. Além disso, foi
comprovado que repetitivos ciclos de reuso mostraram ter pouca influência nas mudanças
conformacionais da enzima nesse suporte. A estabilidade operacional da tripsina imobilizada em
Amberzyme deve indicar a aplicabilidade desse sistema para uma contínua produção de
peptídeos. Dessa forma, essa excelente reusabilidade poderia reduzir os custos operacionais em
futuras aplicações práticas (KANNOUJIA et al., 2009).
4.4.4 Termoestabilidade dos sistemas
A estabilidade térmica das enzimas é considerada um dos principais parâmetros para
aplicação industrial de biocatalisadores (ROCHA et al., 2011; ZHANG; ROCHEFORT, 2011;
HONG et al., 2007). A atividade residual da tripsina imobilizada e livre foi comparada na faixa
de temperatura de 25 a 80 C. De acordo com as condições usadas para o estudo de estabilidade
térmica, todos os sistemas apresentaram uma perda de atividade catalítica progressiva com o
tempo de incubação. No entanto, os valores de atividade em cada temperatura avaliada foram
significativamente mais estáveis para os sistemas suporte-tripsina, em virtude da atividade
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
84
hidrolítica diminuir em uma taxa de velocidade menor que a protease livre, como pode ser visto
na Figura 26.
Atividade hidrolítica (Units/g de enzima)
Figura 26 – Atividade hidrolítica da tripsina livre e imobilizada em função da temperatura
Eupergit C
Amberzyme
Eupergit CM
Enzima
livre
Temperatura (°C)
A Figura 26 mostra o efeito da temperatura na atividade residual da tripsina livre e
imobilizada. De acordo com os resultados, a tripsina livre perdeu 76% de sua atividade inicial na
temperatura de 50 C, ao passo que Eupergit C-Tripsina perdeu apenas 24%. Esse efeito pode ser
explicado através de dois aspectos. Por um lado, a tripsina sofre o processo de autólise, que é
responsável pela sua parcial ou completa inativação, como mencionado na seção 4.3. Entretanto,
a
elevação
da
temperatura
causa
mudança
conformacional
da
macromolécula
e,
consequentemente, de seus sítios ativos (SIMON, et al., 2001; ZHANG et al., 1999).
A preservação da atividade catalítica dos sistemas, à medida que a temperatura aumenta,
poderia ser justificada pela contribuição das diferentes ligações covalentes ou não covalentes
entre a estrutura da proteína e o suporte. Dentre essas, as ligações covalentes devem ser
consideradas as mais importantes na termoestabilização apresentada pelos sistemas. Altas
temperaturas afetam, provavelmente, o estado de dissociação dos grupos funcionais ionizáveis
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
85
envolvidos na atividade enzimática, assim como, as interações com o substrato, conduzindo,
portanto, à desnaturação da protease e consequentemente, sua inativação (CRESCIMBENI et al.,
2010). Como esperado, os sistemas (suporte-tripsina) foram mais resistentes à autólise e à
desnaturação térmica que a tripsina livre. A estratégia usada para imobilização associada às
características do suporte Eupergit C foi responsável pela maior estabilidade térmica comparada
aos demais (KATCHALSKI-KATZIR; KRAEMER, 2000). Esse suporte, provavelmente, deve
ser mais resistente à absorção de calor do meio externo, e essa característica deve ser responsável
por minimizar o aumento de temperatura dentro do microambiente da enzima. Além disso, a
estabilidade térmica apresentada por este sistema está diretamente associada ao mais alto número
de ligações intramoleculares de disulfito na protease nesse meio, pH 7.7 (KONKLOA et al.,
2006).
A estabilização de uma enzima para atingir uma função específica, depende, basicamente,
da manutenção de sua estrutura terciária e quaternária intactas, ou seja, desvios na faixa de 1 Å
(0.1 nanômetro) na disposição espacial dos átomos podem inviabilizar interações essenciais às
suas funções (QUIRÓS et al., 2011). A Figura 27 ilustra uma alteração na estrutura terciária de
uma proteína que pode ocorrer ao longo do tempo.
Figura 27 – Modelo ilustrativo da evolução da conformação da hélice da enzima ao longo do tempo
Evolução na conformação da hélice ao longo do
Fonte: Adptada de Heineck e colaboradores, 2008.
tempo
Em termos de estrutura terciária, as proteases da família da quimotripsina são
caracterizadas pela formação de dois domínios perpendiculares, do tipo barril , cada um
formado por seis estruturas  antiparalelas e uma hélice C terminal, conforme o modelo descrito
por Pereira (2005). O sítio de especificidade da tripsina está localizado em uma “bolsa” entre os
dois domínios, com as interações entre a enzima e o substrato funcionando como conectores entre
ambos (CZAPINSKA; OTLEWSKI, 1999). Dessa forma, a alteração estrutural dessa
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
86
conformação, seja por fatores intrínsecos (autólise) eou condições externas (temperatura, pH e
outros), acarretará a parcial ou total inativação do sítio ativo presente, como foi observado nos
resultados da Figura 27.
4.4.5 Imobilização da protease α-quimotripsina por ligação covalente em suportes epóxiativados
A Figura 28 relaciona os suportes utilizados para imobilização por ligação covalente da
protease α-quimotripsina. Claramente, é observada a dependência do tempo de imobilização para
cada um dos sistemas.
Figura 28 – Percentual de imobilização da protease α-quimotripsina em função do tempo.
Amberzyme
EC-EP 403
EC-EP 503
EXE067 EP02P016
EXE O32 – SE1P 60120
Eupergit CM
Grace 192
EXE O81 – SE1P489
Eupergit C
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
87
De acordo com a Figura 29, os suportes Eupergit CM, Grace, Eupergit C e Amberzyme
apresentaram, em ordem crescente, os maiores percentuais de CTI, comparados aos demais. A
Tabela 6 mostra os dados referentes aos principais parâmetros de imobilização associado as suas
respectivas atividades (hidrolítica e sintética).
Tabela 6 – Dados relativos à Carga teoricamente imobilizada da protease α-quimotripsina (%), Eficiência de
imobilização (%), Atividade hidrolítica (Unitsg de enzima) e Atividade relativa (%) dos sistemas usados.
Condições: 60 mg de enzima, solução tampão fosfato de potássio 0.1 M, pH 7.7.
Protease α-quimotripsina
Suporte
Carga
Eficiência de
Atividade
Atividade
teoricamente
imobilização (%)
hidrolítica
relativa (%)
imobilizada (%)
- EI
(Unitsg de
após 24 horas -
enzima)
CTI
Amberzyme
8,9
74,1
141,2
7,3
*EXE 067 E902
6,8
56,6
0
0
*Grace
8,6
71,6
176,1
9,1
*EC-EP 403
4,2
35,0
0
0
*EXE 03260102
4,0
33,3
0
0
*EXE081 1P4989
4,9
40,8
0
0
*EC-EP 503
4,2
35,0
0
0
Eupergit CM
5,7
47,5
81,3
4,2
Eupergit C
7,1
59,1
94,8
4,9
*Amostra não comercial
De acordo com os dados apresentados na Tabela 6, a eficiência de imobilização não
reflete, necessariamente, um maior percentual de atividade relativa (comportamento similar ao
sistema de imobilização resina-tripsina). O suporte Grace 192 apresentou uma maior atividade
relativa comparada aos demais sistemas. Devido à complexidade dos dados estruturais de cada
suporte, torna-se difícil avaliar quais parâmetros foram responsáveis por influenciar
negativamente ou positivamente a atividade relativa. Por outro lado, do ponto de vista físicoquímico, a hidrofilicidade da sílica (principal constituinte do suporte) associada à especificidade
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
88
do substrato podem justificar o fato desse suporte apresentar um maior percentual de atividade
catalítica quando comparado com o sistema utilizando a protease tripsina, mesmo apresentando
similaridades quanto a estrutura química de ambas (tripsina e α-quimotripsina). Na αquimotripsina, a cadeia lateral aromática volumosa dos resíduos preferenciais de Phe, Trp e Tyr,
os quais contribuem com o grupo carbonila na ligação peptídica a ser clivada, encaixam-se
perfeitamente em uma região hidrofóbica em forma de fenda localizada perto dos grupos
catalíticos. Na tripsina, o resíduo correspondente à Ser 189 da α-quimotripsina, que se situa na
parte posterior do sítio de ligação, é um resíduo aniônico de Asp. As cadeias laterais catiônicas
dos resíduos preferidos pela tripsina, Arg e Lys, podem, portanto, formar pares iônicos com esse
resíduo de Asp. O restante da região de especificidade da quimotripsina é preservado na tripsina,
de forma a acomodar as cadeias laterais volumosas da Arg e Lys (Voet et al., 2005). Dessa forma,
devido à especificidade de cada protease serínica, foi possível obter diferentes resultados de
atividade relativa para um mesmo suporte.
A Tabela 7 mostra os dados relativos à quantidade de quimotripsina imobilizada/500 mg
de suporte em função do percentual de desorção ao longo de 5 horas
Tabela 7 – Dados relativos à quantidade de α-quimotripsina imobilizada/500 mg de suporte, tripsina desorvida (mg)
e o seu percentual em relação aos diferentes suportes utilizados nesse trabalho. Condições: 60 mg de enzima, solução
tampão fosfato de potássio 0.1 M, pH 7.7.
Suporte
mg de enzimag de
Enzima desorvida
Desorção (%)
suporte
(mg)
Amberzyme
44,4
0,84
1,9
*Grace 192
42,9
3,53
8,3
Eupergit CM
28,5
1,14
4,0
Eupergit C
35,4
1,02
2,9
*amostra não comercial
4.4.6 Imobilização de bromelaína em suportes epóxi
A Figura 29 mostra os resultados de sorção da protease bromelaína ao longo do tempo nos
diferentes suportes utilizados nesse trabalho.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
89
Figura 29 – Percentual de imobilização da protease bromelaína em função do tempo em diferentes suportes.
Amberzyme
EXE
067
EP02P016
Grace
192
EC-EP 403
EC-EP 503
EXE O32 – SE1P 60120
Eupergit CM
EXE O81 – SE1P489
Eupergit C
De acordo com os resultados apresentados na Figura 29, houve um maior percentual de
imobilização para os suportes Amberzyme e EXE 067 EP0216. O tempo de saturação nesses dois
suportes foi em torno de 5 horas. No entanto, foi adotado um tempo de 24 horas para garantir o
máximo de ligações químicas multipontuais da protease com os suportes. Comparativamente, o
percentual da protease bromelaína imobilizada foi inferior aos outros sistemas (tripsina e αquimotripsina). Esse fato foi atribuído à maior presença de proteínas contaminantes comparada às
outras proteases, como evidenciado pelos ensaios de eletroforese em gel de poliacrilamida.
Portanto, além de provocar sérias interferências na eficiência de imobilização, a presença desses
contaminantes deve induzir a uma perda de atividade catalítica dos sistemas. A Tabela 8
apresenta o percentual de imobilização da Bromelaína nos diferentes suportes (transcorrido o
tempo de 24 horas) e a atividade catalítica.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
90
Tabela 8 - Dados relativos à Carga Teoricamente Imobilizada da Bromelaína (%), Eficiência de imobilização (%),
Atividade hidrolítica (Unitsg de enzima) e Atividade relativa (%) dos sistemas usados.
Protease Bromelaína
Suporte
Carga
Eficiência de
Atividade
Atividade
teoricamente
imobilização (%)
hidrolítica
relativa (%)
imobilizada (%)
(Unitsg)
Amberzyme
7,9
65,9
23,6
1,5
*EXE067E902P016
7,5
62,5
0
0
*Grace
3,1
25,8
0
0
*EC-EP 403
4,0
33,3
0
0
*EXE 032 –60102
3,8
31,7
0
0
*EXE 081 1P4989
4,7
39,2
0
0
*EC-EP 503
3,5
29,2
0
0
Eupergit CM
5,1
42,5
7,9
0,5
Eupergit C
5,9
49,2
15,7
1,0
*Amostra não comercial
Os dados apresentados na Tabela 8 sugerem que a eficiência de imobilização reflete uma
maior atividade relativa dos sistemas. Por outro lado, é claramente observado o baixo percentual
ou a não detecção de atividade hidrolítica da protease imobilizada em comparação com a forma
livre (Atividade relativa).
A bromelaína imobilizada covalentemente nesses suportes deve,
provavelmente, conduzir a uma forte deformação de sua estrutura química e, consequentemente,
a fortes mudanças conformacionais em sua tríade catalítica (Cys 25, Asp 175 e His 159). Além
disso, o uso de um substrato (Caseína) com uma massa molar relativamente alta é responsável
por fortes impedimentos estéricos, o que pode dificultar a aproximação entre o substrato e o
centro ativo da Bromelaína imobilizada. Comportamento similar foi observado nos sistemas
utilizando Tripsina e α-Quimotripsina, no entanto, com índices superiores de atividade relativa.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
91
4.4.7 Determinação da atividade sintética dos sistemas
As proteases tripsina, α-quimotripsina e bromelaína são enzimas potencialmente aplicadas
na síntese de peptídeos, devido, principalmente, a esterioespecifidade de cada uma delas em
relação à obtenção desse tipo de produto. A literatura vem considerando a α-quimotripsina como
protease modelo para a síntese de novos peptídeos, devido o seu mecanismo de atuação já ter sido
elucidado em detalhes e adaptado nesse trabalho como mostra a Figura 31 (HAENSLER et al.,
1997).
As Figuras 30 e 31 mostram o mecanismo proposto para a hidrólise da lisina e a síntese de
peptídeos, respectivamente, constituídos de unidades desse aminoácido, catalisados pela protease
α-quimotripsina em meio aquoso.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
92
Figura 30 - Mecanismo de ação da protease α-quimotripsina na hidrólise da lisina. (I) Protonação do imidazol da
Histidina 157 e consequente ataque nucleofílico do oxigênio da hidroxila do resíduo serina 195 ao carbono
carbonílico do substrato lisina (Reação de esterificação). (II) Regeneração da dupla ligação da carbonila e ataque da
hidroxila da carbonila ao hidrogênio da amina quaternária. (III) Formação do intermediário Enzima-Substrato com a
restituição da amina do imidazol, seguido da liberação da molécula de água para o meio. (IV-a e IV-b) Ataque da
hidroxila da molécula de água ao carbono carbonílico da lisina e a regeneração da enzima com a liberação da
molécula de lisina hidrolisada
Mecanismo de hidrólise
(III)
(II)
(I)
Molécula de lisina
(IV-b)
(IV-a)
Fonte: Hedstrom, 2002 e Vilalonga e colaboradores, 2001.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
93
Figura 31 – Mecanismo de ação da protease α-quimotripsina na síntese de oligopeptídeos. (Ia) - Ataque nucleofílico
da amina terminal da cadeia lateral de uma molécula de lisina à carbonila de éster da molécula de lisina na fase
intermediária – (Ib) - formação de uma ligação amida. Posteriormente, regeneração da enzima com a formação de
peptídeos
Mecanismo de síntese
(I-a)
(I-b)
Dímero de lisina
Fonte: Adaptado de Hedstrom, 2002 e Vilalonga e colaboradores, 2001.
De acordo com os mecanismos propostos para cada etapa, a formação de uma ligação
éster na fase intermediária é de fundamental importância para o mecanismo de hidrólise e síntese.
Essa ligação éster é responsável pelo favorecimento ao ataque do nucleófilo da molécula da água
ou do grupo amina terminal da cadeia lateral do aminoácido lisina. Outro ponto importante
refere-se à reação de hidrólise que compete com a síntese de peptídeos. O mais alto percentual de
rendimento de oligopeptídeos foi obtido com suportes com características hidrofóbicas,
provavelmente, devido às maiores interações com os substituintes hidrofóbicos presentes na
protease α-quimiotripsina, responsáveis por “encaixar” a região apolar da lisina e manter, assim,
a molécula em posição para síntese. Provavelmente, o tamanho dessa região de encaixe e a
natureza desses substituintes conferem à protease α-quimotripsina essa especificidade.
De maneira geral, a presença de solventes orgânicos tende a deslocar o equilíbrio da
reação em favor da síntese. Por outro lado, podem causar severas modificações através das
interações hidrofóbicas e por pontes de hidrogênio, assim como, mudanças na dinâmica reacional
e na conformação da proteína pelo contato direto com esse tipo de solvente.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
94
Um desafio chave na síntese de peptídeos é encontrar suportes para imobilização de
proteases capazes de funcionar em meio aquoso apresentando uma alta performance na síntese de
oligopeptídeos solúveis em água. Essa estratégia representa um enorme avanço na química de
peptídeos.
Foram selecionados os sistemas que apresentaram o melhor desempenho em termos de
atividade hidrolítica para uso na produção de oligopeptídeos derivados da lisina. A metodologia
adotada para o cálculo do rendimento e grau de polimerização foi baseada na técnica de RMN 1H.
4.4.7.1 Cálculo do rendimento de oligolisina por RMN 1H
A quantificação dos dímeros, trímeros, tetrâmeros e oligômeros derivados da lisina foi
feita através da integração das áreas referentes aos sinais na região 4.1 – 4.4 ppm, correspondente
aos prótons metínicos do carbono  da unidade repetida de lisina na cadeia principal, e da área
referente ao próton metínico do carbono  na unidade de lisina em 3.9 ppm.
A Figura 32 mostra os espectros de RMN 1H obtidos para os diferentes oligômeros de
lisina, assim como as atribuições dos sinais utilizados no cálculo do rendimento.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
95
Figura 32 - Espectros de RMN 1H correspondentes aos dímeros, trímeros, tetrâmeros e oligômeros derivados da
lisina
Dímeros
O
O
B
H2N
CH
H
N
C
A
CH
CH 2
CH2
CH 2
CH2
CH 2
CH2
CH 2
CH2
N H2
N H2
B
Trímeros
O
CH
OH
A
O
B
H2N
C
H
N
C
C
CH
C
H
N
A
CH
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
NH2
NH2
NH2
B
Fabio Pereira Fagundes
C
A
O
C
OH
Capítulo IV: Resultados e Discussão
96
Tetrâmeros
B
H2N
CH
O
O
C
H
N
C
CH
H
N
C
C
O
CH
C
O
A
H
N
CH
C
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
NH2
NH2
NH2
NH2
B
A
C
OH
Oligômeros
O
H2N
CH
O
O
B
H
N
C
C
CH
H
N
C
A
CH
C
OH
n
C
A
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
NH2
NH2
NH2
B
As atividades de síntese para as proteases livres e imobilizadas foram investigadas através
do rendimento e do grau de polimerização dos produtos obtidos. A Tabela 9 apresenta as
equações empíricas utilizadas na determinação desses parâmetros.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
97
Tabela 9 – Fórmulas empíricas atribuídas aos picos referentes a dímeros, trímeros, tetrâmeros e oligômeros
Rendimento (%)
Grau de polimerização
médio (GP)
Dímeros
R = (B – A)/(A + B)
GP = (2A + C)/A
Trímeros
R = (B – A)/(A + B +C)
GP = (2A + C)/A
Tetrâmeros
R = (B – A)/(A + B +C)
GP = (2A + C)/A
Oligômeros
R = (B – A)/(A + B +C)
GP = (2A + C)/A
4.4.7.2 Efeito do pH no rendimento e no grau de polimerização dos produtos obtidos
A Figura 33 mostra o rendimento de oligolisina em função do pH para as diferentes
proteases livres.
Figura 33– Percentual de rendimento de oligolisina na reação em função do pH do meio.
Quimiotripsina
Tripsina
7
8 1
0
Fabio Pereira Fagundes
9
Bromelaína
10
Capítulo IV: Resultados e Discussão
98
A maioria das enzimas é ativa em uma pequena faixa de intervalo de pH. Esse efeito é
resultado de uma série de fatores, tais como: ligação do substrato à enzima, estado de ionização
dos resíduos de aminoácidos envolvidos na atividade catalítica (presentes na enzima), ionização
do substrato e a variação da estrutura da proteína. Uma série de fatores influenciam o
deslocamento da reação em favor dos produtos, dentre os quais, a variação do pH exerce um
papel crucial na síntese de peptídeos (KANG et al., 2006). De acordo com os resultados
apresentados na Figura 33, o maior rendimento foi observado no pH 7 para a protease
bromelaína, pH 8 para a α-quimotripsina e pH 10 para a tripsina. Em valores extremos de pH,
fortes interações de repulsão eletrostáticas causadas pela alta mudança de cargas no meio,
resultam em inchamento e desdobramento das moléculas de proteína, causando, portanto, severas
mudanças conformacionais em sua estrutura e consequente diminuição na atividade enzimática
(KONKLAO et al., 2006; SIMON et al., 2001).
O grau de polimerização é um crucial fator no ponto de vista prático para a determinação
das propriedades básicas dos polímeros. O número médio do grau de polimerização (GP) é
definido como o número médio de unidades estruturais repetidas por cadeia de polímero. A
Figura 34 mostra a influência do pH no grau de polimerização das reações de síntese de
oligolisinas utilizando diferentes proteases.
Figura 34 – Grau de polimerização médio dos monômeros de lisina em função do pH para as diferentes proteases
utilizadas.
Tripsina
7
Fabio Pereira Fagundes
8
Quimiotripsina
9
Bromelaína
10
Capítulo IV: Resultados e Discussão
99
De acordo com os resultados de GP apresentados na Figura 34, claramente se observa a
influência do pH na obtenção de oligômeros com diferentes massas molares. A protease
bromelaína apresentou um maior grau de polimerização ( 4) comparada às demais, seguida da
α-quimotripsina ( 3) e tripsina ( 2), respectivamente.
A Figura 35 relaciona o percentual de conversão de monômeros em oligolisinas em
função do pH para cada sistema utilizado.
Figura 35 - Influência do pH no percentual de conversão do monômero de lisina em oligolisinas.
De acordo com a Figura 35, o sistema Amberzyme-tripsina apresentou 38±8% de
conversão de monômeros em oligolisina, sendo o mais alto percentual de conversão dentre os
demais sistemas utilizados em pH 10. Por outro lado, o percentual de conversão apresentado pelo
sistema Eupergit CM em pH 8 e 9 foi superior, com valores de 21±2%
e 26%±2%,
respectivamente, indicando, portanto, que esse sistema retém atividade sintética sob uma faixa de
pH mais ampla.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
100
Devido à natureza hidrofóbica do suporte Amberzyme, a água apresenta uma tendência a
sofrer repulsão dentro dos poros desse suporte em ambos os processos de hidrólise e síntese. A
repulsão das moléculas de água, em ambos os processos, ocasiona a diminuição da taxa de
hidrólise. Esse efeito explica esse sistema apresentar um dos mais baixos percentuais de atividade
hidrolítica. Entretanto, durante a síntese de oligopeptídeos, a supressão de hidrólise, é
responsável por favorecer a síntese, através da diminuição da desacilação pela competição com as
moléculas de água. Esse comportamento nos levar a concluir que não se pôde predizer a atividade
sintética a partir da hidrólise da caseína.
A Figura 36 mostra o rendimento de peptídeos obtido em função do número de reusos
para cada sistema (suporte-tripsina).
Figura 36 – Percentual de rendimento dos sistemas em função do número de reusos.
38,1
36,3
33,8
40,1
31,7
39,0
34,3
27,3
23,9
15,1
31,3
18,2
12,7
9,7
13,0
12,7
9,1
9,3
9,4
7,5
36,7
28,8
21,8
23,6
15,1
11,3
13,2
7,8
8,5
9,5
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
101
De acordo com a Figura 36, observa-se uma ligeira discrepância entre os valores de
rendimento ao longo do número de reusos. Esse efeito pode ser explicado, provavelmente, devido
à dificuldade no controle da quantidade de água presente nos suportes. Em outras palavras, o
aumento da hidrofilicidade do meio resulta em uma maior acessibilidade do substrato ao centro
ativo da enzima imobilizada. Foi comprovado em testes preliminares que os suportes utilizados
sob a forma molhada, apresentaram um maior percentual de conversão em peptídeos quando
comparados sob a forma seca. Desde então, vem se tentando obter um maior controle em relação
à quantidade de água presente nos suportes, já que de acordo com os resultados obtidos de
reusabilidade para a determinação de atividade sintética, o percentual de água no interior dos
poros dos suportes, foi um fator crucial para o controle de atividade sintética, sendo mais
evidenciado no sistema amberzyme-tripsina.
Todos os sistemas apresentaram um percentual de perda de atividade sintética residual ao
longo de 10 reusos. O sistema amberzyme-tripsina apresentou a melhor performance em termos
de percentual residual de rendimento, seguido do suporte eupergit CM e Eupergit C. Tal fato
atribui-se a uma melhor estabilidade desse sistema frente as condições reacionais de síntese.
Outro fator importante, refere-se a inversão de performances dos suportes eupergit C e Eupergit
CM em termos de atividade hidrolítica e sintética. Os valores de atividade hidrolítica desses
sistemas não necessariamente apresentaram bons resultados de síntese, visto que, trata-se de
condições reacionais e substratos diferentes. Por outro lado, nos fornece condições de avaliarmos
se a enzima apresenta um mínimo de atividade capaz de catalizar outros sistemas reacionais.
A Figura 37 relaciona o grau de polimerização médio em função do pH para os sistemas
utilizados.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
102
Figura 37 – Grau de polimerização dos sistemas (suporte-tripsina) e tripsina livre em função do pH.
De acordo com a Figura 38, todos os sistemas produziram oligômeros em somente 1 hora
com grau de polimerização mais alto que a enzima livre. O sistema Amberzyme-tripsina
apresentou um GP superior aos demais com valores de 2.8±0.1 em pH 10. Esse sistema provou
ser o mais promissor para a síntese de oligopeptídeos em solução aquosa, em virtude do seu alto
rendimento e de sua reusabilidade em 10 ciclos de reuso.
Outro aspecto importante refere-se aos baixos valores de GP para a enzima livre e
imobilizada nos diferentes suportes. A tripsina livre apresentou um rendimento de 67% e um GP
médio de 2, ao passo que todos os sistemas de imobilização apresentaram menores rendimentos e
GP ligeiramente maiores, ou seja, não há uma correlação linear entre esses dois parâmetros.
Carothers (1936) propôs uma equação que comprova a não linearidade entre o grau de
polimerização e o rendimento para sistemas homogêneos (enzima livre), como pode ser visto na
Equação 4. Essa equação é aplicada para monômeros do tipo A-B, ou seja, monômeros em que os
grupos
funcionais
responsáveis
estequiométricas.
Fabio Pereira Fagundes
pela
polimerização
encontram-se
em
quantidade
Capítulo IV: Resultados e Discussão
103
1
GP =
1-p
(4)
Onde: GP é o número total de moléculas de monômeros e p refere-se à taxa de conversão
(ODIAN, 1991).
O emprego da Equação 4 aos valores de rendimento indica que os baixos graus de
polimerização para a enzima livre seriam esperados. Segundo Odian (1991), um alto grau de
polimerização para reações de condensação é alcançado apenas com valores de taxa de conversão
em torno de 98% com razão estequiométrica 1:1 entre os grupos reativos, e conversões abaixo de
80% (em média) apresentam um GP em torno de 4. Dessa forma, pode-se concluir que o tamanho
da molécula independe da reatividade dos grupos funcionais na faixa de conversão obtida. No
caso de sistemas heterogêneos (enzimas imobilizadas), a Equação de Carothers não deve ser
aplicada, em virtude da interferência de vários parâmetros na cinética da reação (porosidade e
tamanho de partícula do suporte, ponto isoelétrico da enzima após imobilização e outros).
Os sistemas heterogêneos (protease imobilizada) apresentaram um GP ligeiramente
superior aos sistemas homogêneos (protease livre), como foi mencionado anteriormente. Esse
efeito provavelmente está relacionado ao microambiente da enzima no interior do poro. É
possível que a síntese de oligopeptídeos em meio aquoso, usando proteases imobilizadas, seja
mecanisticamente diferente da que ocorre em enzimas livres. Os monômeros difundem para o
interior dos poros dos sistemas e, consequentemente, ocorre a formação de um microambiente
favorável à reação desses monômeros com os terminais das cadeias em crescimento. Resultados
semelhantes têm sido obtidos em reações de polimerização interfacial (ODIAN, 1991).
A Figura 38 mostra o GP em função do número de ciclos dos diferentes sistemas suportetripsina.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
104
Figura 38 – Grau de polimerização em função do número de ciclos para cada sistema utilizado.
3.5
Grau de polimerização (GP)
3
2.5
2
Tripsina-Amberzyme
1.5
Tripsina-Eupergit C
Tripsina-Eupergit CM
1
0.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Número
dede
ciclos
Número
ciclosde reuso
De acordo com as curvas mostradas na Figura 38, fica evidenciado que todos os sistemas
são capazes de produzir oligômeros de lisina com grau de polimerização em torno de 2.5 e com
alta estabilidade operacional (10 reusos). Os valores de rendimento mais altos, apresentados na
Figura 36, não necessariamente refletem um alto grau de polimerização, como foi discutido
anteriormente através da Equação de Carothers. Além disso, o GP está intrinsicamente ligado ao
número de unidades repetidas por moléculas, ao passo que rendimento refere-se ao número total
de moléculas que reagem. Dessa forma, é possível se obter um mesmo rendimento, no entanto,
com diferentes graus de polimerização, como pode ser visto na Figura 39.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
105
Figura 39 – Modelo ilustrativo da determinação do rendimento e do grau de polimerização para uma mesma
molécula.
Grau de polimerização = 20
Rendimento =
Grau de polimerização = 4
Moléculas que reagiram
Grau de polimerização = Número de unidades repetidas por molécula
4.5 IMOBILIZAÇÃO DA PROTEASE BROMELAÍNA POR APRISIONAMENTO EM GEL
DE PVA – CRIOGÉIS
A eficiência de imobilização de enzimas depende nao somente do método e do suporte,
mas também de peculiaridades como, por exemplo, o tipo de geometria da matriz. Na prática,
formatos esféricos são frequentemente usados como suportes ideais devido às suas características
de fluxo. Entretanto, matrizes com formatos cilíndricos ou sob a forma de filmes também têm
sido usadas, devido à area superficial disponível para a imobilização (CAO, 2005).
De acordo com a seção 4.6.2.1 apresentada nesse trabalho, várias estratégias foram
utilizadas a fim de correlacionar o tipo de geometria da matriz à imobilização da enzima. Com
base na metodologia adotada, o formato esférico apresentou uma baixa estabilidade mecânica e
um baixo percentual de enzima imobilizada, além de uma enorme dificuldade relacionada à
uniformidade das esferas.
Diante disso, e devido à maior estabilidade operacional, maior
percentual de imobilização e a possibilidade de moldagem, o tipo de geometria utilizado nesse
trabalho para avaliar a eficiência catalítica da protease bromelaína foi restringido a cilindros e
filmes.
A Tabela 10 mostra alguns parâmetros referentes à formação dos criogéis de PVA obtidos
pela metodologia utilizada.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
106
Tabela 10 – Efeito da concentração de PVA na aparência, forma e estabilidade dos géis formados.
Concentração de PVA
Aparência
Forma
Estabilidade
Géis elásticos e semi-
Cilindros e filmes
-
transparentes
homogêneos
Géis elásticos e semi-
Cilindros e filmes
transparentes
homogêneos
Géis elásticos e semi-
Cilindros e filmes
transparentes
homogêneos
Géis elásticos e semi-
Cilindros e filmes
transparentes
homogêneos
Géis elásticos e semi-
Cilindros e filmes
transparentes
homogêneos
(%)
5
8
10
12
15
+
+
+
+
* (-) Instável (N > 5); (+) Estável (N = 3 f-t ciclos)
De acordo com os resultados preliminares, os géis obtidos com formato cilíndrico
apresentaram uma menor eficiência catalítica quando comparados aos obtidos com formato de
filme. Isso pode ser explicado pela menor área superficial, o que diminuiu a acessibilidade do
substrato à matriz. Dessa forma, o tipo de geometria adotada para todos os sistemas de
imobilização (Géis de PVA) foi o formato de filme.
A Tabela 11 relaciona os sistemas de imobilização obtidos a partir de duas diferentes
massas molares de PVA (16000 e 86000), a estabilidade operacional e a atividade hidrolítica
(Unitsg de enzima) de cada sistema.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
107
Tabela 11 – Influência da concentração de PVA (diferentes massas molares) na estabilidade operacional, atividade
hidrolítica e reusabilidade dos criogéis obtidos sob o formato de filme.
Concentração de
Estabilidade
Atividade
***Atividade
Atividade
PVA (%) –
operacional
hidrolítica
residual (%) – 1
residual (%) – 2
(Unitsg**)
reuso
reuso
Mw 86000
5
Instável
-
-
-
8
Estável
1.618
83
75
10
Estável
0.9978
87
80
12
Estável
0.551
90
86
15
*Estável
0
-
-
Concentração de
Estabilidade
Atividade
Atividade
Atividade
PVA (%) –
operacional
Hidrolítica
residual (%) – 1
residual (%) – 2
(Unitsg)
reuso
reuso
Mw 16000
5
Instável
-
-
-
8
Instável
-
-
-
10
Instável
-
-
-
12
Instável
-
-
-
15
Instável
-
-
-
*Solução polimérica com alta viscosidade e baixas propriedades de fluxo, tornando-se
inviável para a preparação das matrizes criogênicas.
**Unitsg – molesmin.g de Bromelaína
***A atividade residual (%) – A reusabilidade foi determinada com base na atividade
inicial do sistema, ou seja, a atividade residual 0 reuso representa 100%.
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 11, a massa molar de PVA e sua
concentração foram fatores determinantes para a estabilização dos criogéis. O criogel obtido com
8% de PVA apresentou maior atividade hidrolítica, quando comparado aos outros criogéis de
PVA. Além disso, foi observada uma diminuição na atividade hidrolítica à medida que houve
aumento da concentração do polímero em solução.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
108
Os criogéis apresentaram uma textura elástica com formato quadrangular de dimensões na
faixa de 3x3x1 mm. Uma característica fundamental dos criogéis obtidos foi a heterogeneidade
dos poros, devido ao processo criogênico (Método freezing-thawing). Isso occorreu devido aos
cristais de gelo agirem como “agentes formadores de poro” (porogen). Após o descongelamento
do solvente, houve o surgimento de macroporos com vários tamanhos e diferentes “arquiteturas”
(FRAY et al., 2007; TRIEU, QUTUBUDDIN, 1995). Dessa forma, é necessário enfatizar a
importância das dimensões do poro inerente à estrutura macromolecular dos criogéis de PVA, de
maneira a evitar problemas associados à difusão do substrato na matriz criogênica.
4.5.1 Influência da concentração polimérica e do tempo de congelamento na formação dos
poros
De acordo com a literatura, inúmeros fatores podem influenciar a porosidade dos criogéis,
dentre os quais, destacam-se: a concentração do polímero e da enzima, o tempo de congelamento
e descongelamento, a presenca de reagentes e o número de ciclos de freezing-thawing
(congelamento e descongelamento) (PATACHIA, PAPANCEA, 2006; LOZINSKY, PLIEVA,
1998).
A Figura 40 mostra a influência da concentração do polímero PVA e o tempo de
congelamento na formação de poros dos criogéis obtidos.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
109
Figura 40 – Micrografias obtidas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) da área transversal dos criogéis de
PVA formados em meio aquoso. Figuras a e b – Criogéis de PVA com concentração de polímero 12% e 8%,
respectivamente (tempo de congelamento: 12 horas, concentração de enzima 3mgmL e número de f-t: 3). Figuras a’
e b’ - Criogéis de PVA com concentração de polímero 12% e 8%, respectivamente, após o congelamento de 48 horas
(concentração de enzima 3 mgmL e número de f-t: 3).
Tempo de congelamento - 12 horas3 ciclos Tempo de congelamento - 48 horas3 ciclos
de f-t
a
de f-t
a’
b’
b
De acordo com as micrografias mostradas na Figura 40, observa-se que a diminuição na
concentração de PVA causou um aumento no diâmetro médio de poro do criogel na faixa de
concentração polimérica estudada (Figuras 40a e 40b). Esse comportamento pode ser explicado
pela menor interação inter e intramolecular por ligações de hidrogênio do polímero PVA em
menores concentrações (além do menor grau de entrelaçamentos físicos), que propiciam menor
viscosidade
à
solução
Fabio Pereira Fagundes
polimérica
e,
consequentemente,
maior
diâmetro
médio
e
Capítulo IV: Resultados e Discussão
110
interconectividade dos poros. A Figura 41 mostra esquematicamente o efeito da concentração do
polímero sobre a formação de poros no sistema.
Figura 41 – Representação esquemática da rede polimérica de PVA em diferentes concentrações, evidenciando o
maior grau de entrelaçamentos físicos e interações físico-químicas entre as cadeias poliméricas com o aumento da
concentração de polímero e, consequentemente, diminuição do tamanho de poros e porosidade (conectividade entre
os poros).
PVA em baixas concentrações
PVA em altas concentrações
Representação das interações químicas das cadeias poliméricas
Representação do diâmetro de poro das cadeias poliméricas
Zonas formadoras de poros
Outro importante fator refere-se à temperatura de congelamento, que controla não
somente a dinâmica molecular do sistema, mas, também, os equilíbrios de fase, por exemplo, a
razão entre o solvente congelado e o não congelado no meio criogênico. O regime de tratamento
criogênico tem uma acentuada influência nas propriedades intrínsecas dos criogéis, em virtude de
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
111
estar diretamente associado ao efeito sinérgico da interpenetração das cadeias poliméricas,
levando, portanto, à falta de mobilidade do polímero.
As Figuras 40a e 40a’ representam os criogéis obtidos sob diferentes tempos de
congelamento, 12 e 48 horas, respectivamente, ambos sob as mesmas condições de formação
(concentração de polímero, de enzima e o mesmo número de ciclos f-t). As micrografias mostram
que o tempo de congelamento de 48 horas nao favoreceu a formação de poros nos criogéis. Esse
fato ocorreu, provavelmente, devido a um colapso do sistema, ocasionado pelo aumento de
cristalinidade do PVA durante o congelamento. Ou seja, os domínios cristalinos do PVA crescem
desordenadamente até encontrar a face uns dos outros, provocando, assim, a diminuição no
tamanho dos poros, além de uma destruição parcial ou total na integridade da enzima. Além
disso, temperaturas extremas, por um longo período de tempo, favorecem a imiscibilidade do
polímero no meio, consequentemente, o solvente torna-se termodinamicamente “pobre” e o
empacotamento das cadeias poliméricas se intensifica, provocando, portanto, o desaparecimento
dos poros.
4.5.2 Influência da concentração da enzima na formação de poros dos criogéis
O efeito da concentração da enzima é outro fator de grande importância na formação de
zonas porógenas no criogel. No entanto, esse efeito reduzido à medida que a concentração do
polímero é aumentada. Resultados preliminares comprovaram que concentrações de PVA acima
de 12% foram responsáveis pela formação de uma estrutura rígida, estável e sem nenhuma zona
porógena. Esse fato pode ser atribuído aos intensos entrelaçamentos físicos do polímero (PVA),
além das fortes interações polímero-polímero por pontes de hidrogênio, que dificultam as
interações da enzima no meio. Dessa forma, a concentração de 8% de PVA foi adotada, por
proporcionar características morfológicas de superfície adequadas para a avaliação da influência
da quantidade de enzima na formação de poros nos criogéis.
A Figura 42 refere-se às micrografias obtidas por MEV dos criogéis sob diferentes
concentrações da bromelaína.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
112
Figura 42 – Micrografias obtidas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) dos criogéis de PVA 8% contendo
diferentes concentrações de bromelaína: (a) – Criogel de PVA sem bromelaína e (b e c) – Criogéis de PVA em
presenca da protease Bromelaína (1,5 e 3,0 mgmL, respctivamente). Condições: Número de ciclos f-t – 3 e tempo de
congelamento – 12 horas.
(a)
(b)
(c)
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
113
De acordo com as micrografias apresentadas na Figura 42, a concentração da protease no
meio é outro parâmetro que influencia não somente o tamanho do poro, mas o surgimento dele no
criogel. Claramente, observa-se o aumento do poro na medida em que a concentração da enzima
aumentou de 0 para 3.0 mgmL. Esse efeito pode ser atribuído a uma maior perturbação das
interações entre as cadeias de PVA à medida que a concentração da enzima aumenta. Em outras
palavras, em concentrações mais altas da bromelaína, ocorre uma maior interação físico-química
da enzima tanto com as moléculas do PVA quanto com as moléculas de água, reduzindo a
formacão de zonas de junção das cadeias do polímero, ou seja, aumentando a desordem do meio.
Indiretamente, esse comportamento nos levar a concluir que a interação entre os componentes do
sistema, isto é, PVA, enzima e água é um fator importante para a segregação do sistema.
4.5.3 Influência do número de ciclos f-t na morfologia interna dos poros nos criogéis
De acordo com Hassan e Peppas (1999), o número de ciclos f-t é responsável por
aumentar os domínios cristalinos dos criogéis. Esse efeito proporciona uma maior estabilidade
mecânica, devido à melhor distribuição de carga e estresse mecânico nessas regiões (FRAY et al.
2007; HASSAN; PEPPAS, 2000). Outro aspecto importante refere-se à influência do número de
ciclos f-t na morfologia interna dos poros nos criogéis. A Figura 43 mostra a influência do
número de f-t na estrutura interna dos criogéis obtidos.
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
114
Figura 43 – Micrografias obtidas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) evidenciando as mudanças na
estrutura interna dos criogéis de PVA 8% durante o processo de congelamento-descongelamento. (a) N= 1f-t, (b) N=
2f-t e (c) N= 3 f-t. Tempo de congelamento: 12 horas.
a
b
c
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
115
As micrografias mostradas na Figura 43 comprovam que o número de f-t acelera o
processo de formação de macroporos com maiores diâmetros (HATAKEYEMA, et al., 2005), o
que favorece a difusão do substrato na estrutura interna do criogel (SZCZESNA-ANTCZAK,
GALAS, 2001).
4.6 IMOBILIZAÇÃO DA Α-QUIMOTRIPSINA EM NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE
METACRILATO DE GLICIDILA
A terceira estratégia utilizada nesse trabalho para a síntese de oligopeptídeos solúveis
em água refere-se à imobilização da protease quimotripsina em nanopartículas magnéticas de
glicidil. A Figura 44 mostra a cinética de sorção da quimotripsina nesse suporte em função do
tempo. A escolha dessa protease se deu em função de apresentar um percentual de grau de pureza
próximo a da protease tripsina e um custo menos elevado comparado a anterior. Dessa forma, a
quimotripsina foi utilizada como uma protease modelo para esse tipo de estratégia de
imobilização.
Figura 44 – Percentual de imobilização da quimotripsina em função do tempo .
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
116
A Figura 44 evidencia que após 5 horas de imobilização foi alcançado um máximo de
carga teoricamente imobilizada em torno de 6%. Além disso, pôde-se verificar que 85% da
quantidade total de α-quimotripsina imobilizada foi alcançada em 1 hora de imobilização. Mesmo
diante de uma eficiência de imobilização de 50%, inferior aos demais métodos utilizados nesse
trabalho, esse sistema apresentou resultados de atividade hidrolítica superior aos demais sistemas,
como pode ser visto na Tabela 12.
Tabela 12 - Dados comparativos referentes à CTI, EI, AH (Unitsg de enzima) e AR (%) dos sistemas usados.
Condições: 60 mg de enzima, solução tampão fosfato de potássio 0.1 M, pH 7.7 e 500 mg de suporte.
Protease α-quimotripsina
Suporte
CTI (%)
EI (%)
AH
AR (%)
MNPs
6
50
1064,25
55
Amberzyme
8,9
74,1
141,2
7,3
Grace 192
8,6
71,6
176,1
9,1
Eupergit C
7,1
59,1
94,8
4,9
Eupergit CM
5,7
47,5
81,3
4,2
Protease tripsina
Amberzyme
9,2
76,6
276,5
13
Grace 192
7,1
62,5
295,3
13,9
Eupergit C
6,0
50
217,5
10
Eupergit CM
8,2
68,3
358,4
17
Protease bromelaína
Amberzyme
7,9
65,9
23,6
1,5
Eupergit C
5,9
49,2
15,7
1
Eupergit CM
5,1
42,5
7,9
0,5
De acordo com os dados apresentados na Tabela 12, o sistema MNPs-α-quimotripsina
apresentou uma atividade hidrolítica de 55%, ou seja, um valor superior aos demais sistemas
utilizados nesse trabalho. Devido a um menor tamanho de partícula (95 nm) e a ausência de
problemas associados à difusão do substrato no suporte, o ataque nucleófilo da hidroxila do
resíduo serina 195 da α-quimotripsina a caseína ocorre com maior facilidade, em virtude da
Fabio Pereira Fagundes
Capítulo IV: Resultados e Discussão
117
exposição dos grupos epóxi situados na parte externa do suporte. Essas particularidades tornam
esse sistema Por outro lado, a facilidade de agregação das nanopartículas vem sendo ainda um
enorme problema para o desenvolvimento desse sistema. Mesmo utilizando um tensoativo
aniônico (SDS) com função de dispersar as nanopartículas, uma etapa posterior de separação tem
sido requerida a fim de remover o máximo de tensoativo aderido as MNPs. Os resultados
comprovaram o potencial desse sistema na síntese de oligolisinas. Entretanto, tem sido requerida
uma estratégia para avaliar o rendimento dos oligômeros derivados da lisina por RMN, devido à
superposição dos picos causada pelas interações do SDS com as MNPs. Por essa razão, não foi
possível determinar com confiabilidade o percentual de conversão dos monômeros desse
aminoácido (lisina) em oligopeptídeos.
A aplicação de enzimas imobilizadas em nanopartículas magnéticas vem recebendo
enorme atenção, devido, principalmente, sua fácil manipulação, recuperação, maior superfície de
contato (menor tamanho de partícula) e ausência de problemas associados à difusão do substrato
na matriz do suporte. Características essas que as tornam uma ferramenta valiosa no processo de
imobilização de enzimas para diversas aplicações (SUSTROVA et al., 2009). Dentre essas, esse
trabalho tem sugerido que o uso de proteases imobilizadas nesse tipo de suporte representa uma
alternativa promissora na síntese de oligopeptídeos em meio aquoso.
Fabio Pereira Fagundes
CAPÍTULO V:
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS
Capítulo V: Conclusões e perspectivas futuras
119
5 CONCLUSÕES
Uma nova estratégia de síntese de oligopeptídeos derivados de lisina, usando proteases
imobilizadas em meio aquoso, tem sido apresentada nesse trabalho. Essa estratégia representa
uma alternativa promissora no desenvolvimento de novos peptídeos e um significativo avanço na
Química de proteínas. Dentro desse panorama, as principais conclusões foram:
 A protease tripsina livre manteve apenas 45% de sua atividade residual após 24 horas, ao
passo que as proteases α-quimotripsina e bromelaína mantiveram 65% e 67% de suas
atividades, respectivamente.
 O sistema Eupergit C-Tripsina mostrou a mais alta eficiência em termos de atividade
hidrolítica e estabilidade térmica comparado aos demais sistemas que utilizam esse tipo
de enzima. No entanto, não exibiu a mesma eficiência em termos atividade sintética.
 A alta densidade de carga presente no suporte Amberzyme foi, provavelmente,
responsável pelo maior índice de CTI e EI da enzima. Por outro lado, esse sistema
(Amberzyme-tripsina) apresentou um dos menores índices de atividade relativa
comparado aos demais.
 Os sistemas Grace 192-, Eupergit C- e Eupergit CM-Tripsina perderam 75%, 34% e 60%
de suas atividades iniciais, respectivamente, após 12 reusos, ao passo que o sistema
Amberzyme-Tripsina perdeu somente 20%.
 A protease tripsina sob à forma livre perdeu 76% de sua atividade inicial na temperatura
de 50 C, ao passo que Eupergit C-Tripsina perdeu apenas 24%.
Fabio Pereira Fagundes
119
Capítulo V: Conclusões e perspectivas futuras
120
 O sistema Grace 192/α-quimotripsina apresentou uma maior atividade relativa comparada
aos demais. A hidrofilicidade da sílica (principal constituinte do suporte) associada à
especificidade do substrato pode justificar o fato desse suporte apresentar um maior
percentual de atividade catalítica quando comparado com o sistema utilizando a protease
tripsina, mesmo apresentando similaridades quanto a estrutura química de ambas (tripsina
e α-quimotripsina).
 O tempo de congelamento, o número de ciclos f-t, a concentração de enzima e polímero
influenciaram diretamente a formação de zonas porógenas nos géis de PVA. Além disso,
problemas associados à difusão do substrato na matriz refletiram os baixos valores de
atividade hidrolítica.
 Com a diminuição da concentração de PVA (8%) e o aumento da quantidade de
bromelaína nos criogéis (3 mg/mL), foi observado um aumento no diâmetro de poro.
 O número de f-t acelera o processo de formação de macroporos com maiores diâmetros.
As micrografias comprovaram que 3 f-t apresentou criogéis de tamanho de poro superior
ao de 1 f-t.
 A tripsina livre apresentou um rendimento de 67% e um GP médio de 2, ao passo que
todos os sistemas de imobilização apresentaram menores rendimentos e GP maiores, ou
seja, não há uma correlação linear entre esses dois parâmetros.
 Todos os sistemas (suporte-protease) apresentaram um percentual de perda de atividade
sintética residual ao longo de 10 reusos. O sistema Amberzyme-tripsina apresentou a
melhor performance em termos de percentual de rendimento, seguido do suporte Eupergit
CM e Eupergit C. Tal fato atribui-se a uma melhor estabilidade desse sistema frente às
condições reacionais de síntese.
 Todos os sistemas são capazes de produzir oligômeros de lisina com grau de
polimerização em torno de 2,5 e com alta estabilidade operacional (10 reusos).
Fabio Pereira Fagundes
120
Capítulo V: Conclusões e perspectivas futuras
121
 A imobilização de enzimas em nanopartículas magnéticas de metacrilato de glicidila
representa uma alternativa promissora para a obtenção de oligômeros derivados de lisina,
apresentando uma atividade relativa à hidrólise superior aos demais sistemas utilizados
nesse trabalho (55%).
Fabio Pereira Fagundes
121
Capítulo V: Conclusões e perspectivas futuras
122
6 PERSPECTIVAS FUTURAS
 Avaliar a real quantidade de protease presente em 100% de proteína e sua atividade
proteolítica através de ensaios eletroforéticos obtidos por zimogramas.
 Utilizar os sistemas resina-enzima que apresentarem a melhor performance em termos de
atividade sintética em microcanais de fluxo contínuo para a produção de oligopeptídeos.
 Desenvolver hidrogéis de PVA com uma maior porosidade, a fim de diminuir os
problemas relacionados à difusão do substrato no interior dos poros – Uso de
polissacarídeos.
 Minimizar os efeitos causados pelas interações físico-químicas do SDS e as
nanopartículas magnéticas de glicidila com o objetivo de quantificar o rendimento de
oligolisinas por RMN 1H.
 Sintetizar nanopartículas magnéticas de glicidila com diferentes grupos funcionais
terminais (OH) e (NH2).
Fabio Pereira Fagundes
122
REFERÊNCIAS
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Fabio Pereira Fagundes
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