EFEITO DA RADIAÇÃO
IONIZANTE EM CÉLULAS
PARTE II
CONSIDERAÇÕES GERAIS
Agentes ou
produtos ambientais
(radiação ionizante)
REPARO
DANO
DNA
DANO NÃO
REPARADO
Letalidade celular
Envelhecimento precoce
Malformação
Câncer
TÉCNICAS (EM NÍVEL CELULAR)
Aberrações cromossômicas
Micronúcleos
Troca entre cromátides irmãs
Dosimetria biológica
Bioquímicas
Cometa
Biomonitoramento
Moleculares
Hibridização in situ
Instabilidade genômica
Citogenéticas
Genética toxicológica
IDENTIFICAÇÃO DE MANIFESTAÇÕES CELULARES OU MUTAÇÕES
INDICADORES BIOLÓGICOS
- aberrações cromossômicas
- micronúcleos
- Cometa (“single cell gel assay”)
Métodos
MÉTODO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS
Formação: quebras nos cromossomos
reparo
não reparo
(deleção)
cromossomo
normal
quebras na fita dupla do DNA
reparo errôneo
(rearranjo)
aberrações cromossômicas
estruturais
Aberração cromossômica
qualquer fase do ciclo celular
metáfase
G1- tipo cromossômico
S - cromossômico + cromatídico
G2 - tipo cromatídico
necessitam de quebras
nos cromossomos
ABERRAÇÃO TIPO CROMOSSÔMICO
ABERRAÇÃO TIPO CROMATÍDICO
ABERRAÇÕES CROMOSÔMICAS RADIOINDUZIDAS
QUEBRA EM G1
FRAGMENTO
ACÊNTRICO
ANEL COM
FRAGMENTO
ACÊNTRICO
DICÊNTRICO COM
FRAGMENTO
ACÊNTRICO
TRICÊNTRICO COM
FRAGMENTO
ACÊNTRICO
REJUNÇÃO
REPLICAÇÃO
METÁFASE
DOSIMETRIA BIOLÓGICA
ESTIMATIVA DE DOSE ABSORVIDA
frequência de aberrações
encontadas em linfócitos
de indivíduos expostos
frequência observada em
lifócitos irradiados in vitro
com doses conhecidas
Curvas dose - resposta
LINFÓCITOS
“dosímetros biológicos”
- altamente radiossensíveis
- população naturalmente sincrônica de células
- ampla distribuição corpórea
(G0
G1)
- facilmente coletadas
- in vitro = in vivo
Moorhead et al. (1960) - desenvolvimento de técnicas de cultivo de linfócitos
humanos in vitro, utilizando um mitogênico.
Linfócitos
(G0 G1)
células blásticas
MITOSE
PHA
(Phaseolus vulgaris)
Bender e Gooch (1962) - propuseram a análise de aberrações cromossômicas para a
avaliação quantitativa de dose absorvida de radiação.
CULTURA DE LINFÓCITOS (48 h)
(Construção de Curva de Calibração)
- Coleta do sangue (5 mL)
- Fracionamento de amostras sanguíneas e irradiação com várias doses (10-500 cGy)
- Cultivo a 37oC
sangue total + meio de + soro fetal + mitogênico + antibiótico
(0,5 mL)
cultura
bovino
PHA
- Adição de colchicina (2h antes da fixação)
- Adição de solução hipotônica (KCl 0,075 M)
- Fixação com metanol + ácido acético (3:1)
- Preparação de l6aminas: fixação a 65oC
- Coloração com Giemsa a 2%
1a divisão em cultura: 40
Cada laboratório
54 h -BrdU
-critérios
48h
padronização da técnica
obtenção de curva - padrão
2a divisão: 72 h
- Sensibilidade da técnica: estimativa de dose, da ordem de 5 cGy de radiação de baixa LET
- para cada dose de radiação: pelo menos 100 metáfases analisadas
CROMOSSOMOS ARLEQUIM
Trocas entre cromátides – irmãs em cromossomos mitóticos.
Corados com Hoechst – 33238 e acridine orange, observados ao microscópio de fluorescência
CURVA DOSE-RESPOSTA
Todos os tipos de radiação ionizante – mesmo tipo de aberrações cromossômicas
em células expostas
Frequência de aberrações induzidas – depende da dose, depende do tipo de
radiação
LET = quantidade de E depositada na matéria por unidade de comprimento do
trajeto (keV/mm)
alto LET
baixo LET
xxxxxxxx
x
x
x
x
x
x
x
Ilustração diagramática da densidade de ionização relativa por
alvo de uma trajetória simples para radiação de alta e baixa LET
x
Energia média do neutron (MeV)
0,7 7,6 14,7
2,0
Raios X 250 kVp
a 1,0 Gy/min
Radiação g de 60Co
a 0,5 Gy/min
1,5
1,0
0,5
1
2
3
4
5
Dose (Gy)
baixa LET
(R-X, R-g)
alta LET
(n, p, a)
y = a0 + bD2
y = a0 + aD+ bD2
y = a0 + aD
a0 FA = 1 em 300 células
a0 D = 1 em 2000 células
Curva dose – resposta para dicêntricos
induzidos em linfócitos sanguíneos
humano, expostos in vitro ao 37Cs
com taxa de dose de 5 cGy.min.-1
Curva dose – resposta para dicêntricos
induzidos em linfócitos sanguíneos
humano, expostos in vitro ao 60 Co
com taxa de dose de 5 cGy.min.-1
CURVA DOSE – RESPOSTA
RADIAÇÃO DE BAIXA LET
Aberração cromossômica resultante de 2 quebras (anéis, dicêntricos)
y = a0 + aD+ bD2
aD
a=b
a/ b
termo linear
dicêntrico
única trajetória ionizante
(1 ou 2 quebras)
independe da taxa de dose
doses mais baixas da curva
termo quadrático
dicêntrico
interação de 2 trajetórias
2
ionizantes independente
bD
depende da taxa de dose: zona de rejunção < 0,1 mm
doses mais altas da curva
MÉTODO DO MICRONÚCLEO
Origem
Tamanho- 1
- fragmentos acêntricos
- cromossomos inteiros
20
a
1
5
de
do núcleo principal
Indicadores - agentes clastogênicos
- agentes aneugêncios
Schmidt (1975) – células da medula óssea de camundongos
Countryman e Heddle (1976) – relação quantitativa entre a
dose e a frequência de MN em linfócitos humanos
Ilustração esquemática do mecanismo de formação
de micronúcleos em células mononucleadas
METÁFASE
EFEITO
GENOTÓXICO
ANÁFASE
CÉLULA
NORMAL
CÉLULAS -FILHAS NORMAIS
CÉLULA
ANORMAL
CÉLULA
FILHA
NORMAL
CÉLULA
MICRONUCLEADA
Fenech & Morley (1985) – “cytokinesis block method”
Citocalasina B – Helminthosporum dematoideum
inibe a citocinese, mas não a carciocinese
célula binucleada (1 divisão nuclear)
Cultivo: adição de cito B, 44 horas após tratamento isotônico –
preservação do citoplasma
para cada dose – 500 células binucleadas
Desvantagem - não oferece toda a informação
- 10 a 12 MN / 1000 binucleadas
Vantagens
- relativamente simples e sensível
- análise mais rápida
- bom indicador de dano genético
- magnitude do dano ocorrido
Ilustração esquemática do mecanismo de formação
de micronúcleos em células binucleadas
METÁFASE
EFEITO
GENOTÓXICO
ADIÇÃO DE
CITOCALASINA B
ANÁFASE
CÉLULA
NORMAL
CÉLULA
ANORMAL
CÉLULA
NORMAL
CÉLULA
MICRONUCLEADA
Parâmetros:
-frequência de células com MN
(incidência de células afetadas)
-distribuição de MN
(extensão do dano ocorrido)
0, 1, 2, 3, 4, 5 MN por célula
>5 MN - desprezado
TESTE DO COMETA
(“SINGLE CELL GEL ASSAY”)
Ostling & Johanson (1984) – técnica eletroforética de microgel
condição neutra
quebra na dupla fita
direta visualização do dano em nível de célula individual
Singh et al. (1988) – condição alcalina
quebra na fita
simples
sítios
álcali-lábeis
Número e tipo de lesões radio – induzidas no DNA (Resnick (67),
Warters e Childers (74) e Wlodek e Hittelman (75))
Tipo de lesão
Número por gray
Quebra fita dupla (dsb)
Quebra simples fita (ssb)
Dano na base
Dano no acúcar
ligações cruzadas (crosslinks) DNA – DNA
ligações cruzadas DNA – proteínas
Sítos álcali – lábeis
40
500 – 1000
1000 – 2000
800 – 1600
30
150
200 - 300
1 Gy de radiação
de baixa LET
1 quebra na
fita dupla
25 quebras na fita
na fita simples / cromossomo
PRINCÍPIO DO MÉTODO
-DNA nuclear altamente organizado
-Molécula de DNA de células de eucarioto
-(50 – 100 cm de comprimento)
105 x
núcleo
(5-10 mm
Interpretação esquemática do padrão de migração do DNA,
formando estrutura semelhante ao do cometa
)
TÉCNICA DE ELETROFORESE DE MICROGEL
PARÂMETROS
-
Comprimento da imagem ou do Cometa
(
cabeça + cauda)
DNA do nucleóide
DNA que migrou
- Comprimento da Cauda
(distância de migração de DNA)
magnitude de dano ocorrido
-
Área do Cometa
“Tail moment” = quantidade DNA X comprimento
na cauda
da cauda
intensidade de fluorescência
VANTAGENS
-
Análise direta do dano no DNA em nível de célula individual
-
Quantidade pequena de células ( da ordem de mL)
-
Relativa facilidade na obtenção de dados
-
Análise de 50 células / dose
-
Sensibilidade: 5 cGy de radiação de baixa LET
-
Estudo de danos no DNA e reparo: danos oxidativos, dosimetria biológica,
biomonitoramento e estudos de apoptose
Radiação g de 60Co
Radiação g de 60Co
Radiação b de 90Sr