PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL (QPCR) PARA
DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO VÍRUS DA NECROSE HIPODERMAL E
HEMATOPOIÉTICA INFECCIOSA (IHHNV) EM CAMARÕES LITOPENAEUS
VANNAMEI.
STANDARDIZATION OF REAL-TIME PCR (QPCR) FOR DETECTION AND
QUANTIFICATION OF INFECTIOUS HEMATOPOIETIC NECROSIS
HIPODERMAL VIRUS (IHHNV) IN LITOPENAEUS VANNAMEI.
Tatiana Milani Cordeiro1 *; Shayla Fernanda Barbieri1; Juliana Righetto Moser2; Ana Paula de
Medeiros Fraga3; Pedro Alexandre Valentim Neto4 & Maria Risoleta Freire Marques5
Resumo:
As doenças de etiologia viral têm causado grande impacto na carcinicultura, ocasionando
perdas econômicas significativas para os produtores. Buscando técnicas mais rápidas e
sensíveis na detecção de patógenos as condições de a PCR em Tempo Real (qPCR) foram
padronizadas para a detecção de IHHNV. Para os testes foram extraídos pleópodes de
Litopenaeus vannamei. Após o diagnóstico inicial, através de PCR semi-quantitativa, as
amostras foram submetidas aos ensaios de qPCR com diferentes iniciadores. Dentre estes, o
RT1 mostrou-se mais sensível e específico para a quantificação do IHHNV, tanto em fases
iniciais, quanto tardias da infecção, sendo considerado um método eficaz e sensível para o
diagnóstico.
Palavras chave: PCR em Tempo Real (qPCR), IHHNV, Litopenaeus vannamei.
A aquicultura é um dos setores de alimento que mais cresce no mundo. Entre seus
diversos segmentos a carcinicultura passou dos cultivos experimentais para uma indústria com
ingresso de bilhões de dólares, empregando milhares de pessoas (PANTOJA; LIGHTNER,
2008). Porém, com a expansão das áreas de cultivo e o aumento da produção aquícola
também aumentaram as perdas ocasionadas por enfermidades, principalmente virais, que
apesar de inofensivas aos seres humanos, frequentemente acarretam mortalidades elevadas,
muitas vezes, ocasionando a completa perda na produção (MACIEL, 2002; HERNANDÉZ,
2000).
Dentre as principais enfermidades virais detectadas em Peneídeos está aquela causada
pelo vírus da Necrose Hipodermal Hematopoiética Infecciosa - IHHNV, classificado como
parvovírus que infecta tanto camarões cultivados, dentre estas Litopenaeus vannamei e
Litopenaeus stylirostris, como algumas populações selvagens (MOTTE et al., 2003). O
IHHNV não provoca uma infecção letal em L. vannamei, apesar de causar redução no
crescimento e uma variedade de deformações cuticulares no rostro, antenas e nas regiões
torácicas e abdominais (DHAR et al., 2003).
Visando um método rápido e mais sensível para o auxílio no diagnóstico de
enfermidades virais buscou-se a padronização da técnica de PCR em Tempo Real (qPCR)
para a detecção e quantificação do vírus IHHNV. Foram utilizados, como amostras, pleópodes
_______________________
1
Bióloga. UFSC, LABCAI. 2 – Bióloga. MsC Biotecnologia. UFSC, LABCAI. 3 – Engenheira de Aquicultura.
MsC Aquicultura. UFSC, LABCAI. 4 – Biólogo. MsC Ciências Marinhas e Tropicais. UFSC, LABCAI. 5 Bióloga. Dra. Genética e Biologia Molecular. UFSC, LABCAI.
* Servidão Caminho do Porto, s/n. Itacorubi. CEP: 88034-257. Florianópolis/Santa Catarina.
tatiana_milani@yahoo.com.br
de camarões adultos provenientes de fazendas de cultivo de Santa Catarina, a partir das quais
foi extraído DNA genômico total, de acordo com o protocolo de Maciel (2002), modificado
por Moser (2005) e pelo kit de extração de DNA High Pure PCR Template Preparation Kit da
Roche, seguindo recomendações do fabricante. A concentração de DNA e a qualidade das
amostras foram determinadas por espectrofotômetro pela razão das absorbâncias a 260 e 280
nm. A integridade do DNA foi visualizada em eletroforese com gel de agarose 2%, corado
com brometo de etídio.
O IHHNV foi inicialmente detectado nas amostras através de PCR semi-quantitativa,
sendo os iniciadores (Tabela 1) desenhados por Moser (2005) a partir de sequências
específicas do genoma viral depositadas em bancos de dados conhecidos, gerando um produto
de 512 pares de base.
Para a padronização da metodologia de qPCR na detecção do IHHNV dois pares de
iniciadores (Tabela 1) foram desenhados utilizando-se o programa Primer Quest (Integrated
DNA Technology-IDT), baseados na sequência amplificada pelos iniciadores de Moser
(2005), utilizados na PCR semi-quantitativa. A quantificação da carga viral das amostras foi
realizada com o QuantiTect ® SYBR ® Green PCR Kit (Qiagen), seguindo orientações do
fabricante. O produto amplificado pelos iniciadores RT1 apresentaram 131pb, enquanto RT2
apresentaram 95pb.
Para comparação e validação dos dados foi feita uma curva de concentração com um
plasmídeo linearizado com Eco RI, contendo uma sequência conhecida do vírus. Este
plasmídeo foi purificado com o sistema GFX PCR DNA e Gel Band Purification (GE
Healthcare), seguindo orientações do fabricante. Em seguida, foram feitas diluições seriadas
de 106 a 10-2 para serem utilizadas nos ensaios, considerando 10-1 e 10-2 controles negativos.
A metodologia de qPCR foi padronizada para obter em um mesmo ensaio melhor
especificidade, sensibilidade e velocidade na detecção em amostras de camarões infectados
com IHHNV, bem como quantificar a carga viral em camarões Litopenaeus vannamei.
Os iniciadores, RT1 e RT2 (Tabela 1), foram testados com as mesmas condições, e
amostras, para verificar qual destes apresentaria os melhores resultados para os ensaios
posteriores. Foram utilizados três pontos da curva de concentração do plasmídeo, sendo
1,0x101, 1,0x102 e 1,0x103. O melhor perfil de amplificação foi com os iniciadores RT1, pois
apresentou sua curva de dissociação mais específica e sensível, a quantificação das amostras
no qPCR foi igual a obtida no cálculo de número de cópias virais da diluição do plasmídeo, o
valor de m, ou inclinação, foi -3.77, representando uma eficiência de 100% na duplicação do
fragmento a cada ciclo, naquela fluorescência e a linearidade (R2) foi 0.99, indicando que a
reação se mantém com eficiência semelhante nas diferentes amostras de DNA utilizados
(SIEBERT, 2010).
Para verificar a eficiência da qPCR foram testadas amostras positivas pela PCR
semi-quantitativa a 100ng/µL, assim os resultados não deveriam apresentar inibidores e
amplificariam uma sequência específica do vírus IHHNV. Os pleópodes foram extraídos
através de dois métodos, protocolo de Maciel (2002), modificado por Moser (2005) com as
amostras 6 e 9, e as amostras 7 e 8 extraídas pelo Kit Roche.
Os iniciadores apresentaram alta especificidade, representados com apenas um pico
na curva de dissociação (Figura 1). A carga viral mostrada na tabela 2 demonstra uma
sensibilidade maior na hora da detecção do vírus, pois os iniciadores amplificam desde cargas
virais elevadas (105) até baixas cópias virais (100). Para verificar se o produto final da qPCR
realmente é 131 pb, com uma fluorescência compatível com os resultados da quantificação
viral, foi feito um gel de agarose (Figura 2) que confirmou estes artifícios. Além de obter um
produto específico, sensível e quantificável, o método qPCR através do iniciador RT1 torna a
detecção do vírus mais rápida do que a PCR semi-quantitativa, podendo ser um método
2
alternativo seguro para o diagnóstico desta enfermidade viral, em particular no caso de baixa
carga viral.
Referências Bibliográficas:
DHAR, A.K.; DETTROI, A.; ROUX, M.M.; KLIMPEL, K.R.; READ, B. Identification of
differential expressed genes in shrimp (Penaeus stylirostris) infected with white spot
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HERNANDÈZ, J.Z. Manual PURINA de Bioseguridade no cultivo de camarões marinhos.
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MACIEL, M.L.T. Contribuição para o desenvolvimento de uma proposta de monitoramento e
certificação sanitária em cultivo de camarão marinho no Estado de Santa Catarina. 2002. 38f.
Dissertação (Mestrado em Aquicultura). Universidade Federal de Santa Catarina.
MOSER, J.R. Respostas bioquímicas do camarão branco, Litopenaeus vannamei (Boone,
1931), exposto ao inseticida Carbofuran e determinação da prevalência natural do Vírus da
Necrose Hipodermal e Hematopoiética – IHHNV. 2005. Dissertação (Mestrado em
Biotecnologia). Universidade Federal de Santa Catarina.
MOTTE, E. et al. Prevention of IHHNV vertical transmission in the White shrimp
Litopenaeus vannamei. Aquaculture, v.219, p. 57 – 70, 2003.
PANTOJA, C.; D.V. LIGHTNER. Enfermedades virales In: MORALES, V.; J. CUÉLLARANJEL (eds.). Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. Programa
CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. p. 55-114, 2008.
SIEBERT, M.N. Efeito de ligantes dos receptores nucleares PXR e VDR na expressão de
genes de biotransformação no fígado e intestino de peixes Danio rerio. 2010. Dissertação
(Mestrado em Bioquímica). Universidade Federal de Santa Catarina.
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