Construção de ferramentas moleculares para o estudo das
proteínas arabinogalactânicas AGP6 e AGP11 de Arabidopsis
thaliana
Construction of molecular tools for the study of the
arabinogalactan proteins AGP6 and AGP11 of Arabidopsis
thaliana
Margarida Sofia Pinto Salvador Nobre
Orientadores:
Prof. Doutor Luís Gustavo Pereira
Departamento de Biologia da Universidade do Porto
Prof. Doutora Sílvia Coimbra
Departamento de Biologia da Universidade do Porto
Mestrado em Fisiologia Molecular de Plantas
Resumo
Um dos mais significativos marcos na evolução das plantas vasculares é o surgimento de plantas com
flor, que trouxe consigo estratégias evolutivamente favoráveis: o óvulo protegido por dois tegumentos e
encerrado num pistilo que atrai, retém e direcciona os gâmetas masculinos. No entanto, a reprodução
sexuada das Angiospérmicas apresenta ainda alguns mistérios que só recentemente começaram a ser
desvendados. O grão de pólen, ao longo do seu desenvolvimento, apresenta notáveis diferenças no
transcriptoma das diferentes fases. No estado maduro, o transcriptoma do grão de pólen apresenta
elevada expressão maioritariamente dos genes envolvidos em sinalização e alongamento celular, genes
que serão importantes na germinação e desenvolvimento do tubo polínico, e direccionamento para o
gametófito feminino.
As proteínas arabinogalactânicas (AGPs) são glicoproteínas ricas em hidroxiprolina altamente
glicosiladas por cadeias de arabinogalactano tipo II implicadas em vários estudos realizados ao longo
das últimas duas décadas em vários processos importantes do desenvolvimento vegetal. Têm suscitado
particular interesse pela sua presença marcante e específica nos tecidos dos órgãos florais, observada
em estudos de imunocitoquímica e análise de transcriptomas, levantando suspeitas sobre um possível
papel relevante na reprodução sexuada.
Neste estudo pretendeu-se colocar em foco as proteínas arabinogalactânicas clássicas AGP6 e AGP11,
expressas exclusivamente no grão de pólen, introduzindo em cada uma destas proteínas uma sequência
c-myc que permita efectuar a sua localização específica nas células em plantas de Arabidopsis thaliana
selvagem e mutante nulo agp6agp11, para futuramente proceder a estudos de análise fenotípica e
funcional. Pretendeu-se também fundir cada uma das AGPs com o promotor CaMV 35S para obter uma
sobrexpressão de tal ordem que seja possível obter proteína em quantidades manipuláveis para estudos
bioquímicos.
O estudo destas linhas de plantas transgénicas ajudará a compreender a função destas duas proteínas
no grão de pólen, e a sua importância no processo de dupla fecundação. A capacidade de purificar
individualmente cada proteina será igualmente um importante avanço para o estudo bioquímico não só
da AGP6 e da AGP11, mas também de outros membros da família das proteínas arabinogalactânicas.
Abstract
One of the most significant achievements in tracheophyte evolution is the development of flowers, which
brought along several beneficial evolutionary strategies: the ovule is protected by two integuments and
enclosed in a pistil that attracts, retains and directs the male gametes. However, the sexual reproduction
of Angiosperms still presents a few enigmas that to this day are being slowly uncovered. The pollen
grain, throughout its development, shows significant differences in the transcriptome of the different
stages. In the mature state of the pollen grain, the transcriptome shows an outstanding up-regulation of
the genes associated with signaling and cell elongation, genes which will be important later on, for the
germination of the pollen tube and guidance into the female gametophyte.
Arabinogalactan proteins (AGPs) are hydroxiproline-rich glycoproteins highly glycosylated by chains of
type II arabinogalactan, which have been implicated in several studies performed in the past two
decades as participants of numerous major processes of plant development. They are intriguingly
present in a very specific manner during the development of floral tissues, both in immunocytochemistry
assays and transcriptome analysis, having thus given rise to suspicions about a putative relevant role in
sexual reproduction.
The present work intended to put in to focus the classic arabinogalactan proteins AGP6 and AGP11,
exclusively expressed in the pollen grain, introducing in each one a c-myc tag that will allow for its
specific subcellular localization in wild type Arabidopsis thaliana, as well as in double null agp6agp11
mutants, for studies of phenotype and function. It was also proposed to fuse each of these AGPs with the
CaMV 35S promoter in order to obtain overexpression in such a way that the amount of extractable
protein will allow further biochemical assays.
Future study of these transgenic lines will aid in understanding the role of these proteins in the pollen
grain, and their importance in the double fertilization process. The ability to purify each individually will
also be an important advancement for the biochemical study of not only AGP6 and AGP11, but also of
the other members of the AGP family.