Prion de levedura Sup35 e proteína humana
transtirretina: Bioquímica, biologia estrutural e
celular de duas proteínas amiloidogênicas
Fernando Lucas Palhano Soares
Tese de Doutorado em Química Biológica.
Instituto de Bioquímica Médica
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Rio de Janeiro, março de 2009.
Prion de levedura Sup35 e proteína humana
transtirretina: Bioquímica, biologia estrutural e
celular de duas proteínas amiloidogênicas
Fernando Lucas Palhano Soares
Tese realizada no Laboratório de
Agregação Protéica e Amiloidoses
IBqM/UFRJ sob a orientação da
Professora
Dra
Débora
Foguel,
submetida ao Programa de Pós
Graduação em Química Biológica da
Universidade Federal do Rio de Janeiro
como requisito parcial para a obtenção do
Grau de Doutor em Química Biológica.
Instituto de Bioquímica Médica
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Rio de Janeiro, março de 2009.
Palhano, Fernando Lucas Soares, 1979
Prion de levedura Sup35 e proteína humana transtirretina: Bioquímica, biologia estrutural e
celular de duas proteínas amiloidogênicas. [Rio de Janeiro] 2009
XVIII, 211 p., 29,7 cm (UFRJ, D. Sc., Química Biológica, 2009)
Orientador: Profa Dra Débora Foguel.
Tese, Universidade Federal do Rio de Janeiro, PPGQB.
1- Prion de levedura; 2 – Choque térmico; 3 – Fibras amilóides; 4 - amiloidoses; 5 microglia.
I. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Química Biológica.
II. TÍTULO
Fernando Lucas Palhano Soares
Prion de levedura Sup35 e proteína humana transtirretina: Bioquímica,
biologia estrutural e celular de duas proteínas amiloidogênicas
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica da Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Doutor em Química Biológica.
25 de março de 2009.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Carlos Henrique Inácio Ramos.
Professor Associado do Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química da UNICAMP, SP.
Prof.. Richard Charles Garratt.
Professor Titular do Instituto de Física de São Carlos, Departamento de Física e Informática da
Universidade de São Paulo Campus São Carlos, SP.
Prof. Sérgio Teixeira Ferreira.
Professor Titular do Instituto de Bioquímica Médica, CCS – UFRJ.
Prof. José Ricardo Murari Pires.
Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, CCS – UFRJ. Suplente interno.
Prof. José Daniel Figueroa Villar.
Professor Associado do Instituto Militar de Engenharia, IME – RJ. Suplente externo.
Profa. Margaret Haiganouch Magdesian.
Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, CCS – UFRJ. Revisora.
Profa. Débora Foguel.
Professor Associado do Instituto de Bioquímica Médica, CCS – UFRJ. Orientadora.
Profa. Patrícia Machado Bueno Fernandes.
Professor Associado do Núcleo de Biotecnologia da Universidade Federal do Espírito Santo, CCS –
UFES. Co-orientadora.
Dedico este trabalho a meus pais, Jorge e Inêz,
meus grandes incentivadores, que me deram tudo o
que eles podiam para que eu pudesse me dedicar
inteiramente a este trabalho.
AGRADECIMENTOS
A toda minha família, em especial: minha mãe Inêz, meu pai Jorge (Eustácio I), minha irmã
Patrícia meu sobrinho Pedro Henrique (Pedroca), e meu cunhado Giovani pela paciência,
colaboração e pelo amor e carinho em todos os momentos.
A minha querida esposa Tatiana, que compartilhou muito perto de mim toda a confecção desta
tese. Sua ajuda veio através de discussões científicas, sugestão de experimentos,
companheirismo, “docilidade” e muito amor.
A minha orientadora Profa Débora Foguel. Obrigado pela oportunidade, generosa hospitalidade,
orientação segura, carinho, paciência e todas as cartas brancas que recebi.
A Profa Patricia M. B. Fernandes, por ter me orientado no mestrado e co-orientado agora no
doutorado. Agradeço todos os aprendizados que foram determinantes em minha vida científica.
As minhas alunas de IC Estefânia, Liliani e Roberta pela convivência diária e grande dedicação.
Aos colegas de Laboratório de Agregação Protéica e Amiloidoses: Aline, Carlos, Carol,
Cristiane, Elias, Emerson (Eustacio II), Gisele, Juliana, Léo, Lívia, Márcia, Marisa, Nathália,
Priscila, Ricardo, Rogério, Roseany, Dona Silvia, pela convivência harmônica e feliz durante
esses 4 anos.
Aos colegas do LTPV: Adrielly, Ana Cristina, Ana Paula e seu IC Pablo, Carlos, Daniel,
Daniely, Flávia, Guilherme, Ivan, Marcos, Mari, Nathalia, Patrícia, Samir, Sebastian, Shana,
Susanna, Theo, Tuane, Yanina e Ygara, pela grande interação durante meu doutorado.
A professora Margaret por sua minuciosa revisão.
Aos professores Andréa, André, Jerson e Yraima por todo o apoio e constante aprendizado.
Aos professores Cláudio, Mônica e Marcus pela disponibilidade em me ajudar quanto as minhas
dúvidas.
A todos os professores e laboratórios do IBqM quiçá do CCS pela utilização dos mais diversos
equipamentos.
Aos professores Vivaldo, Flávia (e sua aluna Anna), Marcelo (e seu aluno Fabiano), Maurício
(seu meio aluno Léo), Moisés (e sua aluna Ingrid) pelo apoio e colaboração no trabalho com a
proteína A25T.
Ao professor Gilberto e seus alunos Alexandre e Gustavo pela utilização do AFM.
Aos professores Ana Paula, Andréa Cheble, Andréa Da Poian, Daniel (aluno), Denise, Fernanda,
Gabriela, Marcos, Mariana, Margaret, Martha, Pedro e Roberto (aluno) pela reuniões
intermináveis da CPG que me ajudaram a olhar a Pós de uma maneira nova.
Aos secretários da Pós Leandro, Patrícia e Teresa por todo serviço e paciência.
Aos colegas da Pós Graduação, pelos mais variados momentos como reuniões, aulas, seminários,
churrascos, festas até o futebol de sábado.
Ao CNPq, CAPES e FAPERJ que financiaram minha bolsa e os projetos que minha tese está
inserida.
SUMÁRIO
Introdução
19
1-Mecanismos fundamentais no enovelamento protéico............................................................... 19
2-Enovelamento e desenovelamento protéico na célula…………………………………………. 22
3-Amiloidoses e proteínas amiloidogênicas................................................................................... 27
3.1-Definição.................................................................................................................................. 27
3.2-Estrutura das fibras amilóides.................................................................................................. 29
3.3-Agregação protéica e formação de fibras amilóides................................................................ 32
3.4-Como agregados amilóides causam disfunção celular?........................................................... 34
4-Prions.......................................................................................................................................... 35
4.1-Conceito................................................................................................................................... 35
4.2-Prions em fungos...................................................................................................................... 37
4.3- Hipótese da “proteína-somente”............................................................................................. 38
4.4- Variantes priônicos, informação estrutural e barreira entre espécies...................................... 39
5- A evolução criou mecanismos para evitar a formação de agregados amilóides........................ 41
6- Amilóides Funcionais………………………………………………………………………… 45
PARTE I
48
Introdução
48
1-Sup35.......................................................................................................................................... 48
2-Função de Sup35………………………………………………………………………………. 50
3-Relação entre chaperonas e prions de leveduras......................................................................... 51
4-[PSI+] é uma doença ou uma escolha evolutiva?........................................................................ 52
5-Resposta de Saccharomyces cerevisiae ao estresse.................................................................... 54
6-Regulação da transcrição de genes responsivos ao estresse....................................................... 55
Objetivos
59
Material e Métodos
60
1-Microorganismos e condição de crescimento............................................................................. 60
2-Oligonucleotídeos……………………………………………………………………………
60
3-Construção das cepas Δmsn2/ msn4, HSE-βGal e STRE-βGal.................................................. 60
4-Medidas de atividade especifica de β-galactosidase................................................................... 61
5-Viabilidade cellular……………………………………………………………………………. 61
6-Extração de RNAm, RT-PCR e análise densitométrica.............................................................. 61
7-Extração e dosagem de trealose.................................................................................................. 62
8-Marcação e quantificação das proteínas totais com a sonda bis-ANS........................................ 62
9-Análises estatísticas……………………………………………………………………………. 63
Resultados
64
1-Células contendo o prion [PSI+] são mais tolerantes ao choque térmico que células [psi-]........ 64
2-A síntese de trealose durante o choque térmico é mais rápida em células [PSI+]....................... 64
3-A rápida resposta transcripcional das células [PSI+] não é exclusiva para o gene TPS1 ........... 65
4-Os fatores Msn2/4 são essenciais na maior termo-tolerância observada para as células [PSI+]. 67
5-Células [PSI+] acumulam mais proteínas mal enoveladas que células [psi-].............................. 69
Discussão
71
Conclusões e Perspectivas
76
PARTE II
77
Manuscrito aceito para publicação no periódico Biochemistry
Conclusões e Perspectivas
77
122
PARTE III
123
Introdução
124
1-Transtirretina............................................................................................................................... 124
2-Amiloidoses causadas por transtirretina..................................................................................... 124
3-Amiloidoses Leptomeningeais (AL)........................................................................................... 126
4-Fatores que influenciam na patologia......................................................................................... 128
5-Estrutura da TTR e mudanças conformacionais associadas à agregação................................... 131
6-A mutação A25T......................................................................................................................... 134
7-Fisiopatologia das Amiloidoses Leptomeningeais...................................................................... 134
Objetivos
136
Material e Métodos
137
1-Expressão e Purificação da proteína A25T................................................................................. 137
2-Caracterização do perfil de desnaturação e dissociação da proteína A25T utilizando Alta
Pressão Hidrostática (APH)............................................................................................................ 137
3-Cristalização, determinação e refinamento da estrutura da variante A25T................................ 138
4-Marcação da variante A25T com a sonda fluorescente Acrilodan............................................. 138
5-Taxa de Agregação por gel filtração........................................................................................... 138
6-Caracterização do perfil de agregação da variante A25T e L55P marcadas com acrilodan em
plasma humano utilizando PAGE nativo....................................................................................... 139
7-Análise de ligação de vermelho do Congo e fluorescência de tioflavina T................................ 139
8-Perfil de digestão por proteinase K............................................................................................. 139
9-Microscopia de Força Atômica (AFM), Microscopia de campo claro e Microscopia de
fluorescência................................................................................................................................... 140
10-Preparo das amostras da A25T para as culturas celulares........................................................ 140
11-Análise da viabilidade de células neuronais na presença de agregados da A25T..................... 141
12-Cultura primária de microglia................................................................................................... 142
13-Ensaios de Viabilidade Celular: MTT, incorporação de timidina tritiada e Live/Dead........... 142
14-Dosagem de óxido nítrico (NO) e IL- 1β em cultura primária de microglia............................ 143
15-Ensaio de fagocitose dos agregados de A25T por células de microglia................................... 143
Resultados
144
1-Estrutura cristalográfica da proteína A25T................................................................................. 144
2-Efeito de ligantes na estrutura de A25T...................................................................................... 145
3-Análise da estabilidade da variante A25T frente à Alta Pressão Hidrostática (APH)................ 152
4-Comparação da estabilidade das variantes A25T e L55P frente à APH..................................... 153
5-Agregação da TTR em pH 7,3 monitorado por gel filtração...................................................... 154
6-Caracterização dos agregados amilóides através da ligação a corantes específicos................... 155
7-Caracterização morfológica dos agregados por microscopia de força atômica (AFM).............. 156
8-Análise do perfil de digestão por proteinase K dos diferentes agregados de A25T................... 157
9-Agregação da variante A25T em plasma humano...................................................................... 158
10-Agregados formados no plasma são constituídos de diversas proteínas................................... 159
11-Avaliação da toxicidade dos agregados de A25T..................................................................... 161
12-Agregados de A25T ativam células de microglia..................................................................... 162
13-Fagocitose dos agregados de A25T.......................................................................................... 165
14-Os agregados de A25T não são tóxicos para as células microgliais......................................... 165
Discussão
168
Conclusões e Perspectivas
172
PARTE IV
173
Manuscrito publicado no periódico The Journal of Biological Chemistry em 2009……………. 174
Conclusões e Perspectivas
185
Referências
186
Curriculum Vitae
211
Lista de Tabelas e Ilustrações
Introdução
Tabela 1. Doenças amiloidogênicas……………………………………………………………... 28
Tabela 2. Prions descritos em fungos............................................................................................. 38
Figura 1. Ilustração do funil de energia do enovelamento e agregação protéicos.......................... 22
Figura 2. Esquema ilustrando uma levedura com seus dois compartimentos de proteínas
agregadas, JUNQ e IPOD............................................................................................................... 25
Figura 3. Representação esquemática dos fatores que influenciam o enovelamento protéico e
agregação in vivo............................................................................................................................ 26
Figura 4. Características estruturais das fibras amilóides.............................................................. 30
Figura 5 Estrutura das fibras amilóides do peptídeo GNNQQNY................................................. 31
Figura 6. Polimerização dependente de nucleação......................................................................... 33
Figura 7. Fibras amilóides maduras formadas por números diferentes de protofibras.................. 34
Figura 8. Modelo proposto para a agregação de prions................................................................. 36
Figura 9. Herança epigenética com mecanismo não-Mendeliano, onde todas as células filhas
do cruzamento [PSI+] x [psi-], por exemplo, são células [PSI+].................................................... 38
Figura 10. Sementes obtidas de fibras amilóides propagam sua informação estrutural para as
fibras filhas..................................................................................................................................... 40
Figura 11. Estruturas representativas de proteínas envolvidas em doenças amilóides.................. 43
PARTE I
Tabela 1. Oligonucleotídeos usados nesta tese………………………………………………….. 60
Figura 1. Esquema representando os diferentes domínios de Sup35, suas propriedades e
funções............................................................................................................................................ 48
Figura 2. Função de Sup35………………………………………………………………………. 50
Figura 3. Visão geral das vias de sinalização em resposta ao estresse em S. cerevisiae................ 56
Figura 4. Sensibilidade ao estresse térmico de células [PSI+] e [psi-]............................................ 64
Figura 5. Cinética de síntese e degradação de trealose durante a exposição de S. cerevisiae a 37
ºC.................................................................................................................................................... 65
Figura 6. Perfil de expressão gênica de células [PSI+] e [psi-] expostas ao choque térmico de 37
ºC.................................................................................................................................................... 66
Figura 7. Atividade dos fatores de transcrição Msn2/4 e Hsf1 em células [PSI+] e [psi-]
submetidas ao choque térmico....................................................................................................... 67
Figura 8. Sensibilidade ao estresse térmico de células [PSI+] e [psi-] desprovidas dos genes
MSN2 e MSN4................................................................................................................................ 68
Figura 9. Análise de proteínas totais mal enoveladas através de marcação com a sonda BisANS................................................................................................................................................ 70
Figura 10. Modelo esquemático da sinalização celular em resposta ao estresse em leveduras
[PSI+].............................................................................................................................................. 73
PARTE III
Tabela 1. Dados cristalográficos e refinamento de dados da difração da TTR selvagem e A25T
na forma apo e na presença de ligantes.......................................................................................... 146
Tabela 2. Parâmetros termodinâmicos da dissociação de A25T e L55P........................................ 154
Figura 1. Figura ilustrativa da proteína transtirretina..................................................................... 125
Figura 2. Estruturas anatômicas envolvidas na circulação do líquor no sistema nervoso central.. 127
Figura 3. Monômero da transtirretina, onde estão assinalados a posição de algumas mutações
descritas.......................................................................................................................................... 129
Figura 4. Esquema mostrando a formação de agregados amilóides de transtirretina.................... 130
Figura 5. Estrutura tridimensional da TTR.................................................................................... 131
Figura 6. Modelo esquemático da organização da TTR em fibras................................................. 133
Figura 7. Metodologia empregada para o preparo das amostras de A25T usadas nas culturas
celulares.......................................................................................................................................... 141
Figura 8. Mudanças estruturais causadas pela mutação A25T....................................................... 147
Figura 9. Sobreposição da TTR selvagem com a variante A25T................................................... 148
Figura 10. Sobreposição da estrutura da proteína selvagem (cinza) e A25T (verde).................... 149
Figura 11. Histograma das distâncias entre os contatos entre diferentes sub-unidades da TTR.... 150
Figura 12. Efeito da ligação das moléculas T4, 1,8 ANS e ácido flufenâmico na conformação
da variante A25T............................................................................................................................ 151
Figura 13. Conseqüência da ligação de ligantes na conformação e amiloidogenecidade de
A25T............................................................................................................................................... 152
Figura 14. Dissociação-desnaturação da variante A25T submetida à alta pressão hidrostática.... 153
Figura 15. Comparação entre a estabilidade à alta pressão hidrostática entre as variantes A25T
e L55P............................................................................................................................................. 154
Figura 16. Cinética de agregação da proteína wt, A25T e L55P em pH 7,3 monitorada por gel
filtração........................................................................................................................................... 155
Figura 17. Caracterização dos agregados de A25T........................................................................ 156
Figura 18. Microscopia de força atômica dos agregados de A25T................................................ 157
Figura 19. Digestão dos agregados de A25T com proteinase K.................................................... 158
Figura 20. Monitorando a agregação da TTR em plasma humano................................................ 160
Figura 21. Análise dos agregados de A25T formados em plasma................................................. 161
Figura 22. Viabilidade celular aos agregados de A25T................................................................. 162
Figura 23. Ativação das células de microglia incubadas com agregados de A25T....................... 164
Figura 24. Fagocitose de agregados de A25T por células de microglia......................................... 166
Figura 25. Viabilidade das células de microglia incubadas com agregados de A25T................... 167
Lista de abreviaturas e siglas
1,8 ANS
Ácido 1-anilinonaftaleno 8-sulfônico
Aβ
Peptídeo beta amilóide
AFM
Microscopia de Força Atômica
AINES
Antiinflamatórios não esteroidais
AL
Amiloidose Leptomeningeal
AMPc
Adenosina 3’, 5’ – monofosfato cíclico
APH
Alta Pressão Hidrostática
APP
Proteína precursora amilóide
ASS
Amiloidose Sistêmica Senil
ATP
Adenosina trifosfato
βGal
Beta galactosidase
BCIP
Sal de 5-bromo 4-cloro 3’-indol fosfato toluidina
Bis-ANS
4,4 Bis (1-anilinonaftaleno 8-sulfonato)
cDNA
Ácido desoxirribonucléico complementar
CPEB
Cytoplasmic polyadenylation element-binding protein
DCJ
doença de Creutzfeldt-Jakob
DMSO
Dimetil sulfóxido
dNTP
Desoxiribonucleosídeos trifosfatados
DO
Densidade optica
DTT
Ditiotreitol
EDTA
Ácido etilenodiaminotetracético
EET
Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis
ERAD
endoplasmic reticulum associated degradation
ESR
Resposta ao estresse ambiental
HEPES
Ácido N-2-Hidroxietilpiperazina-N'-2'-Etanossulfônico
HPLC
Cromatografia em alto desempenho
HSE
Elemento de choque térmico
HSPs
Proteínas de choque térmico
IL1β
Interleucina 1 beta
IPOD
insoluble protein deposit
JUNQ
juxta-nuclear quality control
LPS
lipopolissacarídeo
MATa
Tipo sexual α
MES
Ácido 4-morfolinoetanosulfônico
NBT
Cloreto de tetrazólio Nitro-blue
NO
Óxido nítrico
PAF
Polineuropatia Amiloidótica Familiar
PBS
Tampão fosfato
PMSF
Fenil-metil sulfonil fluoreto
PCR
Reação em cadeia da polimerase
PK
Proteinase K
PKA
Proteína quinase dependente de AMPc
PrP
Proteína do prion
PVDF
Polifluoreto de Vinilideno
RAGE
Receptor de produtos finais avançados de glicação
RBP
Proteína transportadora de retinol
RE
Retículo Endoplasmático
RMN
Ressonância magnética nuclear
RMSD
Desvio médio quadrático
RNAm
RNA Mensageiro
RT-PCR
PCR precedido por reação com transcriptase reversa
SDS
Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE
Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS
STRE
Elemento responsivo ao estresse
T4
Tiroxina
Taq
Thermus aquaticus
TTR
Transtirretina
UV
Ultra violeta
VC
Vermelho do Congo
YPD
Extrato de lêvedo petona dextrose
wt
Tipo selvagem
Resumo
Agregados protéicos têm sido relacionados a diversas doenças humanas e animais como,
Alzheimer, Parkinson e doença do prion. Em Saccharomyces cerevisiae, a proteína Sup35 é o
fator de terminação da tradução (eRF3) responsável pela supressão de códons nonsense. Sup35 é
considerado um prion de leveduras e tem sido utilizada como modelo para compreensão da
biologia do prion. Em células [PSI+], Sup35 se encontra agregada e muitos códons de finalização
são pulados mudando o repertório de proteínas expressas pelas células. Nós observamos que
células [PSI+] são mais termotolerantes quando comparadas às células normais [psi-]. Essa maior
resistência foi determinada pelos fatores de transcrição Msn2/4 que quando ativados levaram ao
uma ativação mais rápida de genes relacionados ao estresse como, por exemplo, HSP12 e TPS1,
em células contendo o prion [PSI+]. Nós também construímos um mutante de Sup35 através da
introdução de um triptofano na posição 117. Esse mutante foi usado para monitorar o processo de
agregação dessa proteína in vitro. O mutante F117W nos mostrou que a nucleação de Sup35 não
é sensível à temperatura, ao contrário da extensão das fibras. Pequenas quantidades dos núcleos
produzidos a 4 ou a 25 ºC adicionados a solução contendo a proteína Sup35 solúvel aceleraram a
cinética de agregação, mas ao contrário das sementes, eles não foram capazes de propagar
qualquer informação estrutural. A transtirretina (TTR) é uma proteína homotetramérica com 127
resíduos rica em folhas beta que transporta tiroxina no sangue e no líquor. Existem mais de 80
mutações diferentes na TTR que são associadas com amiloidoses. Entre todos variantes descritos,
A25T é o tetrâmero mais instável e está relacionado à amiloidose leptomeningeal (AL). Nós
resolvemos à estrutura da TTR selvagem e A25T e análises comparativas de suas estruturas nos
revelaram importantes diferenças estruturais. Nós também investigamos se a AL leva a uma
resposta inflamatória no SNC. Para isso, usamos culturas primárias de microglia como modelo. A
exposição da microglia com os agregados de A25T levou a fagocitose, e liberação de óxido
nítrico. Esses resultados sugerem que a inflamação tem um importante papel na etiologia das AL.
Ao contrário de A25T, a variante T119M é muito estável e não amiloidogênica. A combinação de
alta pressão hidrostática, 4M de uréia, 1 ºC e pH 5,0 leva a dissociação de T119M em
monômeros desenovelados. Nós produzimos heterotetrâmeros através da mistura dos monômeros
de T119M com variantes amiloidogênicas. Esses heterotetrâmeros apresentaram uma menor
agregação em tampão e em plasma humano, sugerindo que a inserção de subunidades de T119M
dentro de tetrâmeros de TTR é uma estratégia interessante na prevenção da agregação da TTR.
Abstract
Protein aggregation has been implicated in the etiology of several human and animal diseases
such as Alzheimer’s, Parkinson’s and prions’ diseases. In Saccharomyces cerevisiae, the protein
Sup35 is translation release factor (eRF3) acting on the suppression of nonsense codons. Sup35
has been considered a yeast prion and has been used as model to understand prion biology. In
[PSI+] cells, Sup35 is aggregated and several stop codons are read-through changing the
repertoire of proteins expressed by the cells. Here we showed that [PSI+] cells display an
enhanced thermo-tolerance when compared to normal [psi-] cells Our data showed that the
expression of HSP12 and TSP1 (controlled by Msn2/4) was increased in [PSI+] cells, supporting
that the presence of the prion changes the expression and/or the activity of Msn2/4. We also
constructed a mutant of Sup35 by introducing a tryptophan at position 117. This mutant was used
to probe the aggregation process of this protein in vitro. This mutant shown that nucleation is not
sensitive to temperature, whereas fibril extension is. Small amounts of the nuclei produced at 4 or
25oC added to a solution containing the soluble Sup35 accelerated the aggregation kinetics, but
unlike seeds, they were not able to propagate any structural information, which seems to be
formed at a later stage of aggregation. Transthyretin (TTR) is a 127-residue homotetrameric βsheet-rich protein that transports thyroxine in the blood and cerebral spinal fluid. There are more
than 80 different variants of TTR, which are associated with amyloidosis. Among all TTR
variants, A25T is the most unstable tetramer being related to leptomeningeal amyloidosis (LA).
We solved the crystal structure of the wt and A25T and the comparative analysis of their
structures shed light into the mechanism behind the high amyloidogenic potential of A25T. We
also investigated whether LA involves an inflammatory response in the CNS. To take this,
microglia primary cultures was used as model. Here we showed that these cells were activated
showing phagocytosis and nitric oxide secretion. These results suggest that inflammation plays an
important role in etiology of LA. In contrast with A25T, T119M is very stable and nonamyloidogenic variant. At pH 5.0, the combination of high hydrostatic pressure, 4M urea and 1°C
led to T119M dissociation into unfolded monomers. We thought to produce heterotetramers by
mixing the monomers of T119M with the amyloidogenic variants of TTR. These heterotetramers
displayed a decreased yield of fibril formation either in buffer or in the human plasma, suggesting
that the insertion of T119M subunits within the tetramer is an interesting strategy to prevent
aggregation of TTR.
19
INTRODUÇÃO
Nesta tese foram estudadas duas proteínas amiloidogênicas, Sup35 e transtirretina. Desta
forma, para facilita a compreensão dos resultados obtidos, a parte escrita foi dividida em
quatro sessões, a saber: a primeira aborda aspectos da sinalização celular envolvida na
resposta ao estresse de choque térmico na levedura Saccharomyces cerevisiae contendo ou
não o prion da proteína Sup35; a segunda consiste na caracterização in vitro do processo de
agregação do domínio NM da proteína Sup35, através de ensaios biofísicos e do uso do
mutante F117W; a terceira sessão trata da caracterização biofísica, bioquímica e celular do
mutante amiloidogênico A25T da proteína humana transtirretina; a quarta sessão aborda o uso
do variante não amiloidogênico T119M da proteína transtirretina, como uma alternativa
terapêutica para a patologia causada por mutações amiloidogênicas da transtirretina. Esta
Introdução aborda aspectos gerais sobre o tema “proteínas amilodogênicas”, importantes para
a compreensão do trabalho como um todo. Além disso, cada sessão é precedida por uma
Introdução mais específica, a fim de facilitar a melhor compreensão dos diferentes modelos
abordados nesta tese.
1- Mecanismos fundamentais no enovelamento protéico
As proteínas são polímeros formados por uma seqüência definida de aminoácidos.
Entretanto, esta seqüência unidimensional de aminoácidos necessita sofrer arranjos se
dobrando sobre si mesma. Quando este processo é bem sucedido, ao final, forma-se uma
proteína com estrutura tridimensional definida e dotada de função biológica. Este processo é
conhecido como enovelamento protéico e a proteína final enovelada é dita nativa, onde as
estruturas secundárias (alfa hélices, folhas beta e voltas), terciária (arranjo tridimensional) e
quaternária (presente nas proteínas com mais de uma subunidade) já se encontram
completamente definidas.
A habilidade das proteínas de se enovelarem de novo para seu estado nativo e funcional é
um dos fenômenos mais fundamentais da natureza. A partir do trabalho pioneiro de Christian
Anfinsen, postulou-se que a estrutura nativa de uma proteína seria a estrutura
termodinamicamente mais estável e de menor energia, e que seu enovelamento depende
apenas da seqüência primaria de aminoácidos e das condições da solução onde a proteína se
encontra (ANFISEN, 1973). O número de possíveis conformações que uma dada cadeia
polipeptídica pode alcançar é tão grande, que a busca sistemática aleatória por uma estrutura
20
em particular poderia levar um tempo astronômico (LEVINTHAL, 1968, 1969; revisto em
DOBSON, 2003). A enorme diferença entre o tempo calculado, assumindo essa busca
randômica pela conformação nativa, (∼ 1077 anos) e o tempo real, observado
experimentalmente, (ms a s) do enovelamento protéico é chamada de paradoxo de Levinthal.
O modelo didático mais aceito atualmente para explicar o enovelamento protéico é o do
funil de enovelamento no qual o polipeptídio desenovelado que ocupa o topo do funil, ao
enovelar, busca por sua conformação nativa em um funil de energia com a superfície em geral
rugosa conhecido como landscape (Figura 1). No topo do funil, a proteína no estado
desenovelado possui grande quantidade de energia livre e entropia. O enovelamento leva à
proteína a conformação com menor energia livre e diminuição da sua entropia (Figura 1). A
rugosidade do funil indica que para alcançar a conformação nativa, a proteína passa por
estados intermediários. Em alguns casos, podem ser formados intermediários com energia
livre tão baixa que a proteína fica presa neste estado não sendo capaz de atingir seu estado
nativo (estados metaestáveis) (DILL & CHAN, 1997; DILL et al., 2008). Flutuações
randômicas em estados desenovelados ou parcialmente enovelados dirigem esta reação, onde
diferentes contatos tanto nativos quanto não nativos são experimentados (JAHN &
RADFORD, 2005). Em geral, interações nativas entre resíduos são mais estáveis que contatos
não nativos, e quando essas interações são formadas, o número de conformações disponíveis é
reduzido, direcionando a cadeia polipeptídica a assumir sua conformação nativa (DILL et al.,
2008).
Proteínas globulares pequenas (< 100 amino ácidos) desprovidas de pontes dissulfeto, em
geral, enovelam/desenovelam de maneira cooperativa onde apenas o estado nativo e
desnaturado podem ser evidenciados. Estes estados são distinguíveis por técnicas
espectroscópicas tais como fluorescência, infravermelho, ressonância magnética nuclear,
dentre outras. Para proteínas mais complexas, estados parcialmente enovelados ou
intermediários de enovelamento podem estar presentes durante a via de enovelamento e, de
fato, estes estados têm sido demonstrados em diversos casos (PTITSYN, 1992). Os
intermediários (Figura 1) podem evoluir e prosseguir na rota de enovelamento gerando a
proteína nativa, conforme mencionado. Entretanto, esses mesmos intermediários podem
desviar da rota produtiva e levar ao aparecimento de agregados protéicos e, neste caso, o
enovelamento é dito não produtivo (Figura 1). Ainda não se sabe se os intermediários
auxiliam o enovelamento por limitar o número de processos de busca, ou se eles são
armadilhas que inibem o rápido enovelamento (VENDRUSCOLO et al., 2003). Sendo assim,
21
os intermediários de enovelamento representam verdadeiras encruzilhadas: se tudo proceder
conforme o esperado, tem-se, ao final do processo, a proteína nativa e funcional; caso
contrário, dá-se o aparecimento de agregados indesejados. Esses agregados podem apresentar
as mais diversas características (Figura 1): em geral são tóxicos para as células ou tecidos;
podem ser encontrados dentro ou fora da célula; podem ser amorfos, como os corpos de
inclusão encontrados em bactérias, ou podem se organizar como fibras amilóides (agregados
encontrados em diversas doenças humanas discutidos posteriormente no tópico “Proteínas
amilóides e amiloidoses”). Cabe ressaltar que essas últimas são estruturas altamente estáveis
representando, na visão do funil apresentada anteriormente, um novo mínimo de energia.
22
Figura 1. Ilustração do funil de energia do enovelamento e agregação protéicos. A figura
ilustra a rugosidade da superfície do funil (landscape) que representa a multiplicidade de estados
conformacionais que a cadeia polipeptídica pode assumir, seja através de formação de contatos
intra-moleculares que levam à formação da estrutura nativa, ou de contatos inter-moleculares que
geram diferentes formas de agregados. Adaptado de JAHN & RADFORD, 2008.
2- Enovelamento e desenovelamento protéico na célula
Dentro da célula, as proteínas são sintetizadas nos ribossomos a partir da informação
codificada no DNA celular. O enovelamento in vivo é algumas vezes co-traducional, tendo
seu início ainda antes da completa síntese da proteína (HARDESTY & KRAMER, 2001).
Algumas proteínas se enovelam no citoplasma após a tradução ser concluída, enquanto outras
se enovelam em compartimentos especiais como a mitocôndria ou o retículo endoplasmático
(RE), após o tráfego e translocação através das membranas. Muitas peculiaridades do
23
enovelamento protéico dependem do ambiente onde este se dá, apesar dos princípios
fundamentais discutidos acima serem universais. Proteínas não enoveladas ou parcialmente
enoveladas inevitavelmente expõem ao solvente resíduos que no estado nativo estariam
internalizados ficando susceptíveis a interações inapropriadas com outras moléculas presentes
no complexo ambiente celular, incluído outras proteínas muitas vezes idênticas a ela própria.
As células desenvolveram uma variedade de estratégias para prevenir que esses contatos
espúrios ocorram (ELLIS, 2001). Nesse contexto, destacam-se as chaperonas moleculares,
proteínas presentes em todos os tipos de células e compartimentos celulares, que auxiliam o
enovelamento ou previnem o desenovelamento protéico. Algumas chaperonas interagem com
cadeias recém liberadas dos ribossomos enquanto outras estão envolvidas em guiar estágios
tardios do enovelamento de proteínas (HARTL & HAYER-HARTL, 2002). As chaperonas
moleculares geralmente trabalham em seqüência para garantir que os vários estágios do
processo de enovelamento sejam realizados com eficiência. Um exemplo é o sistema
Hsp40/Hsp70, onde a Hsp40 estabiliza peptídeos desenovelados, prevenindo sua agregação.
Em seguida, esses peptídeos são transferidos para a Hsp70, que facilita seu enovelamento
através de sua atividade dependente de ATP (MAYER & BUKAU, 2005). As chaperonas
moleculares não têm a capacidade de aumentar a taxa de enovelamento de passos individuais
do enovelamento protéico; ao contrário, elas aumentam a eficiência do processo como um
todo, reduzindo a probabilidade de reações de competição não produtivas, particularmente a
agregação (DOBSON, 2003). Além de auxiliarem no enovelamento correto de proteínas, as
chaperonas moleculares também são importantes na prevenção do desenovelamento protéico.
As concentrações de algumas chaperonas aumentam muito quando as células são submetidas
a algum tipo de estresse. Como os primeiros estudos foram feitos usando choque térmico,
essas proteínas passaram a ser chamadas de proteínas de choque térmico (HSPs).
Existe ainda outra classe de chaperonas capaz de solubilizar agregados e até mesmo
possibilitar uma nova chance de enovelamento para proteínas já agregadas. Nesse contexto,
destaca-se HSPs de alto peso molecular como Hsp104 de leveduras (BÖSL et al., 2006). Uma
intervenção ativa no processo de enovelamento requer energia, e o ATP é usado pela maioria
das chaperonas para seu funcionamento eficiente.
Em células eucariotas, muitas das proteínas que são sintetizadas são secretadas. Essas
proteínas são primeiramente translocadas para o interior do RE, onde o enovelamento
acontece antes da secreção pelo complexo de Golgi. O RE possui uma grande variedade de
chaperonas moleculares e processos de catálise de enovelamento. Além disso, as proteínas
24
passam por um rígido processo de controle de qualidade antes de serem secretadas. Esse
processo é particularmente importante, pois, após a secreção, as proteínas encontrarão poucas
chaperonas e em geral um ambiente extracelular mais hostil (SCHRÖDER & KAUFMAN,
2005). Mesmo com o rígido controle, as proteínas que usam a via secretória para se
enovelarem estão super-representadas entre as doenças do mau enovelamento protéico
(COHEN & KELLY, 2003). O controle de qualidade do RE envolve diversas reações de
glicosilação e de de-glicosilção que permitem que proteínas enoveladas corretamente sejam
distinguidas das mal-enoveladas (HELENIUS & AEBI, 2004). Similar à resposta ao choque
térmico no citoplasma, a resposta às proteínas mal enoveladas (UPR) no RE também é
estimulada durante condições de estresse. Esse fenômeno está diretamente envolvido na
tentativa celular em evitar o acúmulo de proteínas mal enoveladas (MARCINIAK & RON,
2006).
Apesar dos diversos mecanismos descritos acima, grande quantidade de proteínas recém
sintetizadas (até 30%) não atinge o enovelamento correto e são rapidamente degradadas
(SCHUBERT et al., 2000). Mesmo que a proteína atinja sua conformação nativa, cada
proteína possui um tempo de vida que pode variar de minutos até quase meses, como a
hemoglobina, por exemplo (GOLDBERG, 2003). O principal sistema de degradação de
proteínas tanto no citoplasma quanto no RE de eucariotos, é o sistema ubiquitinaproteassomo. Nesse sistema, proteínas mal enoveladas ou danificadas, incluindo proteínas
desnaturadas ou “envelhecidas”, são ligadas via ubiquitinas ligases e ATP à proteína
ubiquitina. A adição de ubiquitina às proteínas direciona esse complexo a organela 26S
proteassomo, composta de 50 subunidades protéicas (∼ 2,4 MDa), que degrada vários tipos de
substratos (GOLDBERG, 2003). Está claro que a falha do proteassomo em prevenir o
acúmulo de proteínas mal enoveladas está relacionada a muitas doenças, incluindo as doenças
amilodogênicas (HERSHKO & CIECHANOVER, 1998). Mesmo que o sistema de
degradação de proteínas celular como proteassomo, lisossomos e autofagossomos funcionem
corretamente, em algumas patologias a quantidade de proteínas agregadas é tão grande que
fica inviável para a célula se livrar dos agregados formados.
Uma outra estratégia adotada pelas células é compartimentalizar esses agregados a fim de
diminuir sua toxicidade. Recentemente, foi mostrado em leveduras e em células de
mamíferos, que essas células possuem ao menos dois compartimentos distintos de
armazenamento de proteínas agregadas e/ou mal enoveladas (KAGANOVICH et al., 2008). O
primeiro compartimento descrito situa-se próximo ao núcleo e contem uma grande quantidade
25
de proteassomos e proteínas ubiquitinadas, tendo sido, dessa forma, denominado JUNQ
(juxta-nuclear quality control) (Figura 2). Em outras palavras, JUNQ é um grande
aglomerado protéico, circundado por proteassomos, situados junto ao RE estando próximo ao
núcleo das células. O segundo compartimento descrito situa-se no citoplasma na periferia das
células e contém proteínas que agregaram de maneira tão intricada que se torna difícil sua
solubilização para posterior degradação pelas células. Por esse motivo, esse compartimento
foi denominado IPOD (insoluble protein deposit). Proteínas amiloidogênicas acumulam-se
preferencialmente nesse compartimento (Figura 2). Nesse compartimento são encontradas
grandes quantidades de Hsp104 e moléculas relacionadas a autofagossomos como Atg8. A
presença de Atg8 é reflexo da tentativa da célula de solubilizar esses grandes agregados
protéicos, como alternativa ao proteassomo.
Figura 2. Esquema ilustrando uma célula de levedura com seus dois compartimentos de
proteínas agregadas, JUNQ e IPOD. Proteínas que não conseguem atingir seu estado nativo
podem ser poli-ubiquitinadas pela enzima E3 e levadas para degradação em um aglomerado de
proteassomos localizados no lado externo do reticulo endoplasmático (ER) denominado (JUNQ).
Agregados mais insolúveis como fibras amilóides se concentram no compartimento IPOD. Esse
compartimento possui grandes quantidades da proteína Hsp104, responsável pela solubilização de
proteínas agregadas. Também co-localizam com IPOD proteínas relacionadas com autofagossoma
como a proteína Atg8. Provavelmente, depois de solubilizadas por Hsp104, as proteínas devem ser
degradadas no interior dos auto-fagossomos. IPOD é o principal destino de agregados
amiloidogênicos. Adaptado de KAGANOVICH et al., 2008.
26
Qualquer desbalanço no controle de qualidade celular, seja por situações de estresse,
envelhecimento, mutações, ou sobrecarga celular, pode levar à alteração no equilíbrio entre a
síntese, o enovelamento correto e a degradação protéica (Figura 3). Esse desequilíbrio
favorece a formação de agregados protéicos que podem ou não ser amiloidogênicos levando,
em geral, ao desenvolvimento de várias patologias humanas.
Figura 3. Representação esquemática dos fatores que influenciam o enovelamento protéico e
agregação in vivo. Chaperonas moleculares (Hsp) auxiliam o enovelamento protéico, previnem a
agregação e dissolvem alguns agregados. Os proteassomos eliminam as proteínas mal enoveladas
via ubiquitinação (Ub). Juntos, esses mecanismos operam para manter as funções normais da
célula. Um aumento na população de proteínas mal enoveladas, resultado de fatores genéticos ou
extracelulares, pode levar à saturação destes mecanismos de defesa e, subsequentemente, ao
aumento na agregação protéica. Nesse caso, proteínas parcialmente enoveladas associam-se umas
com as outras formando pequenos oligômeros solúveis que podem, durante a agregação, dar
origem à protofibras, oligômeros amorfos ou com formato de poros ou ainda às fibras amilóides.
A formação de fibras amilóides não passa necessariamente por intermediários oligoméricos, sendo
inclusive demonstrado que monômeros podem se associar diretamente a fibras amilóides
(COLLINS, et al., 2004). A toxicidade dessas diferentes espécies, assim como seu papel no
desenvolvimento das doenças, ainda é um tema muito debatido na literatura. Adaptado de JAHN
& RADFORD, 2005.
27
3- Amiloidoses e proteínas amiloidogênicas
3.1- Definição
O termo amilóide foi cunhado em 1838 por Matthias Schleiden, um botânico alemão, ao
descrever um constituinte amiláceo de plantas. Rudolph Virchow, um médico alemão, usou o
termo amilóide em 1854 para descrever um corpo amiláceo do sistema nervoso que reagia
com iodeto (SIPE & COHEN, 2000). Em 1859, Friedreich e Kekule demonstraram que os
depósitos ditos amilóides eram formados principalmente por proteínas (KYLE, 2001) que
coravam com iodo devido à presença de carboidratos, que geralmente se associavam aos
depósitos protéicos. Dentre os carboidratos destacam-se o dermatan sulfato e cadeias de
glicosaminoglicanos (PEPYS, 2006). Somente em 1959, com o uso do microscópio
eletrônico, ficou evidente que existiam componentes fibrilares nos depósitos amilóides
(COHEN & CALKINS, 1959). Por definição, amilóide é um material protéico depositado in
vivo, caracterizado pela aparência fibrilar na microscopia eletrônica, apresentando padrão de
difração de raios-X típico, sendo capaz de ligar-se a corantes específicos como vermelho do
Congo, resultando em birrefringência verde quando excitado com luz polarizada
(WESTERMARK et al., 2007) (Figura 4). Agregados amilóides ou fibras amilóides são
encontrados em mais de 20 patologias dentre elas a doença de Alzheimer, doença de
Parkinson, doença de Huntington entre outras (CHITI & DOBSON, 2006) (Tabela 1). As
amiloidoses podem ser classificadas como sistêmicas, quando os depósitos amilóides
acometem vários órgãos, ou localizadas, quando acometem um órgão ou tecido específico
(Tabela 1). As amiloidoses podem ser esporádicas ou associadas a mutação. Quando
associadas a alguma mutação, são denominadas amiloidoses familiar hereditária. A forma
mais comum de amiloidose familiar é causada por mutações no gene que codifica para a
proteína transtirretina (TTR) (CONNORS et al., 2003).
28
Tabela 1. Doenças amiloidogênicas (Adaptada de WESTERMARK et al., 2007).
Proteína
Precursora
Sistêmica (S) ou
Síndrome ou tecidos
Amilóide
Localizada (L)
envolvidos
AL
Cadeia leve da
S, L
Primária
Associada ao mieloma
imunoglobulina
AH
Cadeia pesada da
S, L
Primária
Associada ao mieloma
imunoglobulina
S
Associada a hemodiálise
Aβ2M
β2-microglobulina
ATTR
Transtirretina
S, L
Familial
Sistêmica senil
Leptomeningeal
AA
(Apo) soro AA
S
Secundária
AApoAI
Apolipoproteina AI
S
Familiar
L
Aorta, meniscos
AApo AII Apolipoproteina AII
S
Familiar
AApo AIV Apolipoproteina AIV
S
Esporádica, associada com
envelhecimento
AGel
Gesolina
S
Familiar
Alis
Lisozima
S
Familiar
AFib
S
Familiar
Cadeia α-fibrinogênio
ACis
Cistatina
S
Familiar
Abri
ABriPP
S
Demência familiar,
Britânica
ADan
ADanPP
L
Demência familiar,
Dinamarquesa
L
Doença de Alzheimer
Aβ
AβPP
APrP
Proteína do prion
L
Encefalopatias
Espongiformes
ACal
Calcitonina
L
Tumores de tiróide
AIAPP
Amilina
L
Ilhotas de Langerhans
AANF
Fator atrial natriurético
L
Cardíaco
APro
Prolactina
L
Pituitária
Prolactinomas
AIns
Insulina
L
Iatrogênico
AMed
Lactaderina
L
Arterial
AKer
Querato-eptelina
L
Córnea
ALac
Lactoferrina
L
Córnea
AOaap
Proteína odontogênica
L
Tumores odontogênicos
associada ameloblasto
ASemI
Semenogelina
L
Vesícula seminal
ATau
Tau
L
Doença de Alzheimer
Demência fronto-temporal
Envelhecimento
Inclusões intracelulares com propriedades amilodogênicas
Inclusão
Local
Proteína
Doença associada
Corpos de Lewy Neurônios Intraalfa-sinucleina
Doença de Parkinson
citoplasmático
Corpos de
Neurônios IntraHuntintina
Doença de Huntington
Huntington
nuclear
Copos de Hirano Neurônios
Actina
Desordens
Neurodegenerativas
Sem
Neurônios
Neuroserpina
Demência familiar prédenominação
senil
29
3.2- Estrutura das fibras amilóides
As fibras amilóides são formadas pelo empilhamento de fitas beta formando uma estrutura
conhecida como cross-beta, onde as fitas beta individuais estão arranjadas de forma
perpendicular ao eixo da fibra, estando espaçadas pela distância de 4.7-4.8 Å (Figura 4).
Estudos recentes utilizando RMN e raio-X revelaram detalhes da estrutura das fibras
amilóides (CHITI & DOBSON, 2006). Em um desses estudos, utilizou-se o heptapeptídeo
derivado da proteína Sup35 (prion de levedura) com alta propensão em sofrer agregação
gerando fibras amilóides. Detalhes da estrutura dessas fibras revelaram que as cadeias laterais
dos resíduos de aminoácidos de fitas beta adjacentes se intercalam (interdigitação) gerando
uma interface “seca”, isto é, livre de água (Figuras 5C e 5D) (NELSON et al., 2005). O
principal tipo de interação entre as fitas são pontes de hidrogênio entre a cadeia principal dos
aminoácidos. Isso torna esse tipo de agregado altamente estável, sendo materiais de potencial
aplicação em diferentes ramos de nanotecnologia (SCHEIBEL et al., 2003). O mesmo grupo
de pesquisadores expandiu o número de peptídeos analisados e obteve sucesso em resolver a
estrutura de 11 peptídeos diferentes oriundos das proteínas Sup35, PrP, alfa-sinucleína,
peptídeo Aβ entre outros (SAWAIA et al., 2007). Foi possível, através dessa análise, observar
a grande similaridade estrutural entre as fibras formadas pelos diferentes fragmentos. A
principal característica comum a todas elas foi o perfeito encaixe complementar entre as
sucessivas moléculas protéicas que se sobrepõem na fibra amilóide. Quando comparado aos
contatos mais íntimos encontrados nas proteínas, como por exemplo, nos contatos existentes
entre uma enzima e seu inibidor ou entre um antígeno e seu anticorpo, as estruturas amilóides
são ainda mais unidas e complementares e próximas umas das outras (SAWAYA et al., 2007)
(Figura 5). Esses trabalhos junto com muitos outros (WESTERMARK, 2005) trouxeram duas
importantes conclusões:
i) Qualquer proteína é capaz de agregar, independente de sua estrutura secundária ou
terciária, e formar fibras amilóides com características muito similares (Figura 4). Para tal, é
necessário apenas achar a condição necessária que a leve a formar a fibra amilóide. Em geral,
essas condições são drásticas, como extremos de pH, solventes orgânicos e altas temperaturas;
ii) Fibras amilóides são estruturas muito organizadas e particularmente estáveis (Figura 5).
Isso quer dizer que agregados amilóides, em geral, possuem energia livre menor que o estado
nativo da proteína nativa que lhe dá origem (Figura 1).
30
Figura 4. Características estruturais das fibras amilóides. Proteínas com estruturas secundária
e terciária diferentes são capazes de gerar agregados fibrilares muito similares. Como mostrado no
meio do painel, todas essas proteínas convergem para uma estrutura rica em folhas beta com
assinatura característica na difração de raios X com as distâncias entre as fitas e entre as folhas de
4,7 e 10 Å, respectivamente. As fibras maduras são formadas pela associação de protofilamentos
como mostrado à direita. Essas estruturas são capazes de ligar corantes como vermelho do Congo
que quando excitado com luz polarizada apresenta birrefringência verde. Essa característica é
usada na clínica como forma de diagnóstico das amiloidoses. Adaptado de MERLINI &
BELLOTTI, 2003.
31
Figura 5. Estrutura da fibra amilóide do peptídeo GNNQQNY. A) Par de folhas beta
mostrando a cadeia principal de cada fita beta. A face sem água esta entre as duas folhas enquanto
que a fase com água fica do lado de fora da superfície da molécula. B) Steric ziper observado por
baixo do eixo a. Os contatos com e sem água são mostrados em cinza e vermelho,
respectivamente. C) Visão do cristal, onde as fitas beta correm horizontalmente e as moléculas de
água estão representadas como cruzes vermelhas. D) Detalhe do painel C mostrando o Steric
32
ziper. E) Detalhe de três fitas beta, onde são mostradas as pontes de hidrogênio intermoleculares
entre as cadeias principais (roxo) ou entre as cadeias laterais (amarelo) dos aminoácidos. Adaptado
de EISENBERG et al., 2006.
3.3- Agregação protéica e formação de fibras amilóides
Uma vez que as fibras amilóides são formadas por fitas beta, para que uma proteína forme
esse tipo de estrutura é necessário, na grande maioria dos casos, um grande rearranjo
estrutural (Figura 4). Muitas vezes, intermediários parcialmente enovelados servem de
matéria prima para a formação de fibras amilóides (KELLY, 1998). Esses intermediários
podem ocorrer na rota de enovelamento ou quando as proteínas são desenoveladas para serem
degradadas (UVERSKY, 2002).
Nosso conhecimento do processo de formação de fibra amilóides, mesmo que incompleto,
sugere que a agregação pode ser termodinamicamente favorecida devido à própria
característica
da
proteína,
mecanismo
conhecido
como
downhill
polimerization
(HURSHMAN et al., 2004) ou pode ser caracterizado por uma pronunciada fase lag
(FERRONE, 1999). Na fase lag da polimerização, há formação de um núcleo ou semente.
Esta é a fase lenta da reação (Figura 6A). Os passos que precedem a nucleação são
energeticamente desfavoráveis, pois a perda de entropia tem maior influência que o ganho
entálpico da internalização da superfície hidrofóbica e formação de pontes de hidrogênio
(WETZEL, 2006) (Figura 6B). Interações multivalentes, que ocorrem após nucleação, são
responsáveis por tornar a adição de monômeros ao núcleo energeticamente favorável. Como a
etapa limitante da reação de agregação é a formação dos núcleos, a adição de pequenos
fragmentos de fibras pré-formadas denominadas sementes é capaz de abolir a fase lag fazendo
com que a agregação ocorra rapidamente (Figura 6C). A aceleração da agregação amilóide
após adição de sementes, em geral, acontece em proteínas que já se encontram no estado
parcialmente desenovelado, pois caso contrário, a reação limitante passa a não ser a nucleação
e sim o desenovelamento parcial da proteína enovelada (HARPER & LANSBURY, 1997).
De maneira geral, a agregação protéica segue os seguintes passos: Primeiramente, a
proteína deve perder parte de sua estrutura nativa assumindo uma conformação parcialmente
desenovelada; dá-se, então, a formação dos núcleos compostos por um número limitado de
monômeros. Em seguida, pela adição de novos monômeros a este núcleo ou pela associação
dos mesmos através de associações inter-moleculares, formam-se os oligômeros solúveis.
Esses oligômeros em geral evoluem para pequenos protofilamentos. A associação entre os
protofilamentos dá origem às fibras amilóides maduras que podem ser formadas por dois,
33
quatro, seis ou mais protofilamentos (Figura 7). Essas fibras podem ser lineares ou
curvilíneas, mas, na grande maioria das vezes são não ramificadas (KODALI & WETZEL,
2007).
Figura 6. Polimerização dependente de nucleação. A) Modelo proposto para explicar a
nucleação e conseqüente agregação protéica, onde a proteína em seu estado nativo sofre alterações
conformacionais gerando espécies propensas a agregar. Essas espécies se associam formando
núcleos oligoméricos que evoluem com a adição de mais proteínas. Depois de formados, os
núcleos evoluem para agregados amilóides. B) A formação dos núcleos é um processo
termodinamicamente desfavorável que requer aumento na energia livre do sistema, que evolui
para o estado de menor energia (fibras amilóides). C) Cinética de agregação em reações
dependentes de nucleação, a fase lag é representada pela formação dos núcleos. Se pequenos
fragmentos de fibras (sementes) são adicionados ao sistema, a fase lag é encurtada (curva em
vermelho). Adaptado de BIESCHKE et al., 2006.
34
Figura 7. Fibras amilóides maduras formadas por números diferentes de protofibras.
Extraído de JAHN & RADFORD, 2008.
3.4- Como agregados amilóides causam disfunção celular?
Talvez mais complexos que os mecanismos que dirigem a agregação protéica, são os
mecanismos envolvidos na toxicidade desses agregados. Inicialmente, tendo-se descritos
diversas espécies na rota de enovelamento protéico, a dúvida decorrente foi justamente tentar
descobrir qual dessas espécies era, de fato, tóxica às células. Por muito tempo se acreditou
que as fibras amilóides eram as grandes vilãs da história. Hoje, o grande foco das atenções se
concentra na toxicidade exercida por intermediários metaestáveis do processo de agregação
(LAMBERT et al., 1998; SELKOE, 2003). Esses intermediários surgem não só durante o
processo de agregação, mas também após a formação de agregados, visto que, apesar dos
agregados amilóides serem espécies muito estáveis, estes estão em constante equilíbrio com
espécies menores de maior difusibilidade (WETZEL, 2006).
Existem diversas teorias que tentam explicar a toxicidade dos intermediários amilóides.
Algumas proteínas como a alfa-sinucleína, durante sua rota de agregação, são capazes de
formar intermediários com o formato de anel, que se ligam às membranas celulares formando
poros que causam a morte celular provavelmente por extravasamento de material
citoplasmático (CAUGHEY & LANSBURY, 2003). No caso de oligômeros de Aβ, observase que essas espécies são capazes de ligar-se a alguns tipos de receptores celulares como, por
exemplo, receptores tipo N-metil D-aspartato (DE FELICE et al., 2007), levando em geral a
alterações na homeostase de cálcio e um aumento na geração de espécies reativas de oxigênio,
resultando em danos oxidativos das membranas e proteínas (SELKOE, 2003).
A toxicidade de intermediários amiloidogênicos é considerada uma característica inerente
desse tipo de estrutura, já que intermediários amiloidogênicos obtidos de proteínas não
associadas a doenças amilóides se mostram tão tóxicos quanto aquele oriundos de proteínas
amilóides (BUCCIANTINI et al., 2002; VIEIRA et al., 2007). Muitos pesquisadores
35
consideram as fibras amilóides entidades inócuas, capazes de seqüestrar e aprisionar os
intermediários tóxicos (KELLY & BALCH, 2003). Em outros casos, entretanto, a quantidade
de agregados amilóides parece ser o fator determinante na patologia, já que em algumas
amiloidoses como as causadas pela imunoglobulina de cadeia leve e cadeia alfa do
fibrinogênio, existe o acúmulo de quilos de agregados amilóides em diversos órgãos. Nesses
casos, é a presença física de enorme massa protéica que causa disfunção do órgão acometido
(TAN & PEPYS, 1994).
4- Prions
4.1- Conceito
Apesar da primeira doença em humanos causada por prions ter sido descrita em 1921 (a
doença de Creutzfeldt-Jakob), o termo prion foi cunhado por Stanley Prusiner (prêmio Nobel
de Medicina em 1997) somente em 1982. Existem registros da doença do prion em ovelhas
(conhecida como scrapie) na Europa desde 1730 (WICKNER et al., 2007). Entretanto,
evidências históricas, sugerem que essa doença já é conhecida há mais de 2000 anos na China
(WICKNER, 2005). Este termo é derivado da expressão inglesa “proteinaceous infectious
particle” e denomina uma partícula infecciosa, de natureza protéica, que não apresenta
evidências de conter ácidos nucléicos, sendo resistente à inativação por radiação ultravioleta e
capaz de se amplificar, isto é, gerar cópias de si mesma (PRUSINER, 1998). Naquela época, a
definição de prion foi vista pelo meio acadêmico com bastante ceticismo, uma vez que
desafiava a noção de que a transmissão de uma doença infecciosa a um organismo hospedeiro
depende da disseminação de material genético (DNA ou RNA). Tendo em vista que até o
presente momento não foi identificada nenhuma molécula de RNA ou DNA implicada na
fisiopatologia ou transmissão das encefalopatias espongiformes transmissíveis, o conceito de
que uma proteína possa ser infecciosa permanece vigente. Atualmente, no meio científico
internacional, o termo prion se refere a uma nova categoria de patógenos infecciosos,
responsáveis por várias doenças neurodegenerativas em mamíferos, na qual a proteína é capaz
de assumir ao menos duas conformações, uma nativa e outra agregada, rica em folhas beta e
capaz de induzir mudança conformacional de outras proteínas nativas em proteínas agregadas
(Figura 8). A forma agregada do prion apresenta-se, em geral, sobre a forma de agregados ou
fibras amilóides. Estes agregados possuem uma peculiar resistência à degradação causada por
36
proteases, alta insolubilidade, mesmo na presença de detergentes como SDS, características
que tornam a partícula do prion altamente infecciosa (PRUSINER, 1998).
A partir de seus estudos e com base na proposta já delineada pelo pesquisador Griffith, em
1967, Stanley Prusiner propôs a hipótese “proteína-somente” (do inglês, protein-only
hypothesis). Esta hipótese considera a proteína do prion (PrP) como o único agente
responsável pelas doenças chamadas Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (EET). As
EETs humanas englobam uma série de diferentes síndromes neuropsiquiátricas associadas à
alterações histopatológicas comuns no sistema nervoso central, em que modificações
estruturais na proteína PrP são uma constante, mas que possuem mecanismos etiopatológicos
distintos.
As EETs humanas podem ser didaticamente divididas de acordo com sua etiologia, sendo
categorizadas em: doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ) idiopática ou esporádica, em que
nenhuma mutação no gene que codifica a proteína PrP é identificada e a forma de transmissão
é desconhecida; EETs hereditárias, em que diversas mutações nucleotídicas pontuais no gene
PRNP (o gene que codifica a PrP em humanos) acarretam substituição de aminoácidos na
proteína PrP, resultando em síndromes como a insônia familiar fatal e a síndrome de
Gerstmann-Sträussler-Scheinker; EETs adquiridas, em que o contato com tecidos
contaminados resulta no aparecimento de diferentes doenças como a forma iatrogênica da
DCJ, do Kuru e, mais recentemente, de uma forma variante da DCJ, que parece estar
associada ao grande surto de encefalopatia espongiforme bovina (mal da vaca louca) ocorrido
na Inglaterra na década de 80 (JOHNSON, 2005).
Figura 8. Modelo proposto para a agregação de prions. Proteínas em seu estado nativo podem
vencer a barreira cinética ou termodinâmica e alterar sua conformação estrutural. Ocorre a
formação de núcleos ou sementes (nucleação). As sementes induzem na sua extremidade
mudanças conformacionais das proteínas nativas gerando fibras amilóides, que, por fragmentação,
disseminam o fenótipo priônico. Adaptado de SHORTER & LINDQUIST, 2005.
37
4.2- Prions em fungos
Em 1994, Reed Wickner estendeu o conceito de prion para explicar e herança de dois
enigmáticos elementos não-Medelianos da levedura Saccharomyces cerevisiae chamados
[URE+] e [PSI+] (WICKNER, 1994). Ao contrário dos mamíferos, os prions encontrados em
fungos não causam doença e em algumas situações podem até ser benéficos ou fisiológicos
como discutido posteriormente no tópico “Amilóides Funcionais”.
Quais são os critérios que permitem que se classifique uma proteína de levedura como um
prion? Três são esses critérios. Vamos tomar como exemplo o prion [PSI+], causado pela
agregação da proteína de leveduras Sup35. O primeiro critério é a herança epigenética, nãoMendeliana, onde todas as células filhas de um cruzamento entre uma célula priônica [PSI+]
com uma célula não priônica [psi-] originam células priônicas [PSI+] (COX, 1965) (Figura 9).
Na herança Mendeliana clássica, seria esperado como resultado deste cruzamento assumindose que [PSI+] fosse dominante, uma proporção de 3 [PSI+] para 1 [psi-] e não 4 [PSI+] para 0
[psi-], como acontece de fato (Figura 9). O segundo critério é a transferência do fenótipo entre
células por citoducção, isto é, a incorporação do citoplasma (livre de plasmídeos) de uma
célula [PSI+] para uma célula [psi-] a converte em [PSI+], o que mostra claramente a presença
de um elemento não genômico envolvido no processo (COX et al., 1988). O terceiro critério,
embora controverso, é o fato das células [PSI+] poderem ser convertidas em [psi-] pelo
tratamento com concentrações moderadas de cloreto de guanidina, um clássico agente
desnatutante de proteínas que nada afeta o material genético. Atualmente, sabe-se que a ação
do cloreto de guanidina se baseia na inibição da atividade da Hsp104. Esse mecanismo será
abordado com mais detalhes quando for discutido o papel de chaperonas na manutenção ou
cura do fenótipo priônico. Uma vez “curadas”, as células [psi-] podem, espontaneamente,
voltar a ser [PSI+], o que não seria esperado para o vetor de ácido nucléico. Sendo assim, uma
vez que [PSI+] atende a esses critérios, este pode ser considerado um prion de levedura
(TUITE et al., 1981). Atualmente são conhecidos seis prions em fungos (Tabela 2).
38
Figura 9. Herança epigenética com mecanismo não-Mendeliano onde todas as células filhas
do cruzamento [PSI+] x [psi-], por exemplo, são células [PSI+] (COX, 1965).
Tabela 2. Príons descritos em fungos
Proteína
Fenótipo
Organismo
Referência
Sup35
[PSI+]
S. cerevisiae
WICKNER, 1994
Ure2
[URE+]
S. cerevisiae
WICKNER, 1994
Rnq1
[PIN+]
S. cerevisiae
DERKATCH et al., 2001
Swi1
[SWI+]
S. cerevisiae
DU et al., 2008
Mca
[MAC]
S. cerevisiae
NEMECEK et al., 2008
HETs
[Hets]
P. anserina
COUSTOU et al., 1997
4.3- Hipótese da “proteína-somente”
Embora a maior parte dos pesquisadores aceite hoje a hipótese que uma proteína é capaz
de ser infecciosa, ainda existem pesquisadores que duvidam dessa hipótese e postulam que a
infecção causada por prions não passa de uma doença viral (MANUELIDES et al., 2007). A
prova fundamental que uma proteína na ausência de qualquer outro possível agente infeccioso
pode ser infecciosa seria a infecção de animais usando dois lotes da proteína recombinante do
prion. Um lote contendo a proteína agregada e outro contendo a proteína solúvel, onde a
infecção só ocorreria nos animais que recebessem a proteína agregada. De fato, existe um
trabalho onde isso foi feito em mamíferos (LEGNAME et al., 2004). Entretanto, este estudo é
39
muito contestado, pois o animal transgênico recipiente utilizado foi engenheirado para superexpressar a proteína do prion. Portanto, a inoculação da proteína agregada recombinante
apenas antecipou o aparecimento dos sintomas da doença. Essa dificuldade em provar a
hipótese da “proteína-somente” levou vários grupos a acreditar que, no caso dos prions de
mamíferos, a proteína do prion deve interagir com outras moléculas, como ácidos nucléicos
(SILVA et al., 2008) ou glicosaminoglicanos (SUPATTAPONE, 2004) para sofrer a mudança
conformacional necessária capaz de torná-la prion de fato. Entretanto, até hoje, ninguém
conseguiu provar experimentalmente essa teoria in vivo. Ao contrário do prion de mamíferos,
a infecção de um organismo através do uso de proteínas recombinantes agregadas já foi
provada para os prion encontrados em fungos. Isso já foi demonstrado para três prions
diferentes de S. cerevisiae, a saber, [PSI+] (KING & DIAZ-AVALOS, 2004; TANAKA et al.,
2004), [URE+] (BRACHMANN et al., 2005), [PIN+] (PATEL & LIEBMAN, 2007) e para o
fungo Podospora anserina com o prion [Hets] (MADDELEIN et al., 2002). Essa diferença
entre prions de fungos e de mamíferos deve-se, provavelmente, a maior agilidade com que são
conduzidos os experimentos em fungos, onde o tempo de geração do organismo e o tempo das
manifestações dos fenótipos são ordens de grandeza menor para os fungos.
4.4- Variantes priônicos, informação estrutural e barreira entre espécies
Uma característica marcante dos prions é a presença de cepas ou variantes distintas. As
variantes priônicas em mamíferos foram identificadas por diferenças no período de incubação,
sintomas da doença, sinais e distribuição das lesões cerebrais, apesar da seqüência da proteína
PrP do prion ser exatamente a mesma (BRUCE et al., 1991).
De maneira similar, variantes de prions de leveduras têm sido identificados baseados em
diferenças de estabilidade das fibras amilóides e intensidade dos fenótipos priônicos
observados (BRADLEY et al., 2002). [PSI+] é o prion com as variantes mais bem
caracterizadas. Essas variantes são baseadas em diferenças estruturais nas fibras amilóides
que resultam em fibras com diferentes estabilidades. Tal fato foi provado através de
experimentos muito elegantes onde a proteína Sup35 recombinante foi agregada in vitro em
condições da agregação distintas (diferentes temperaturas, por exemplo), capazes de gerar
agregados com estabilidade e estrutura diferentes. Quando leveduras sem prion foram
transfectadas com fragmentos desses agregados distintos (sementes), observou–se que
agregados mais estáveis conferiam o fenótipo mais brando, enquanto agregados menos
estáveis faziam o contrário (KING & DIAZ-AVALOS, 2004; TANAKA et al., 2004). Como
40
explicar esses incríveis resultados? Isso pode ser explicado por dois princípios: i) A adição de
sementes em soluções contendo proteínas solúveis acelera a agregação (Figura 6C). Além
disso, as sementes são capazes de armazenar informação estrutural das fibras que lhe deu
origem. Imagine uma semente formada na condição que favoreça um determinado tipo de
estrutura amilóide (A). Quando pequenas quantidades dessas sementes (tipicamente 5%) são
adicionadas à proteína solúvel, os agregados resultantes apresentaram o mesmo tipo de
estrutura impressa pelas sementes (TANAKA et al., 2004; 2005). Isso ocorre mesmo que a
reação seja feita na condição (B) que favoreceria outro tipo de conformação (TANAKA et al.,
2004; 2005; PETKOVA et al., 2005) (Figura 10). Isso é muito semelhante à reação de
nucleação existente em cristais. Essa propriedade é tão fascinante que levou alguns
pesquisadores a propor que prions podem ser outro tipo de gene, quebrando o principal
dogma da biologia molecular, onde a informação é unidirecional: DNA ÆRNA Æ Proteínas
(WICKNER et al., 2004; BUSSARD, 2005).
C
A
semente B
Fibra B
Fibra A
A
A
B
D
semente A
Fibra A
Fibra B
B
B
Figura 10. Sementes obtidas de fibras amilóides propagam sua informação estrutural para
as fibras filhas. A e B mostram fibras amilóides distintas geradas a partir da mesma proteína,
variando-se apenas a condição de agregação que pode ser diferentes temperaturas, presença ou não
de agitação, etc. C) Fibras formadas na condição de agregação que favorece a conformação do tipo
A, quando semeadas por sementes de fibras B, adquirem a informação estrutural contida nas
sementes B. D) O mesmo que em C invertendo as condições.
Por que sementes de agregados mais estáveis e instáveis levam a fenótipos mais brando e
severos, respectivamente? Como dito anteriormente, as sementes guardam informação
estrutural, portanto, quando as células são transformadas com sementes de agregados mais
instáveis, por exemplo, os agregados citoplasmáticos terão a mesma identidade estrutural das
sementes. A severidade do fenótipo depende da razão entre proteína solúvel/proteína
agregada. Quanto menor for essa razão, mais severo será o fenótipo.
41
Agregados mais instáveis são mais facilmente fragmentados pelas chaperonas
citoplasmáticas que agregados mais estáveis. Essa fragmentação gera muitas sementes, que
serão capazes de arrebanhar mais proteínas solúveis, tornando o fenótipo mais severo. Para
agregados mais estáveis ocorre o contrário, já que a fragmentação é dificultada pela própria
estabilidade das fibras. A taxa de fragmentação e formação de novas fibras deve ser maior que
o tempo de geração da levedura, fazendo com que novos agregados sejam passados para a
célula filha, mantendo assim o fenótipo priônico.
Em mamíferos, a barreira entre as espécies consiste no grande período de incubação ou
transmissão ineficiente de prions entre uma espécie para outra, devido a diferenças na
seqüência da PrP (PRUSINER et al., 1990). A encefalopatia espongiforme bovina (mal da
vaca louca) é uma variante distinta apresentando reduzida barreira entre as espécies quando
comparada a outras variantes (COLLINGE, 1999). É proposto que a proteína do prion PrP de
cada espécie é capaz de assumir uma grande variedade de conformações e que uma
determinada conformação pode infectar apenas as espécies que podem assumir essa mesma
conformação (COLLINGE, 1999). Portanto, a barreira entre espécies é um fenômeno
dependente de variações conformacionais específicas dos prions. Uma barreira de espécies
similar, com dependência de variantes, tem sido observada entre variantes de [PSI+] entre S.
cerevisiae e Pichia methanolica (NAKAYASHIKI et al., 2001).
5- A evolução criou mecanismos para evitar a formação de agregados amilóides
Até dez anos atrás, a habilidade de formar fibras amilóides era considerada uma
propriedade exclusiva de poucas proteínas, como as associadas com doenças. Entretanto, em
1998, Christopher Dobson mostrou que mesmo uma proteína não relacionada a doenças
amilóides, no caso o domínio homólogo src da fosfatidil inositol quinase 3 bovina, tinha a
capacidade de, em baixo pH, formar agregados amilóides estruturalmente indistinguíveis do
encontrados em patologias humanas (GUIJARRO et al., 1998). Essa observação foi
totalmente casual e aconteceu durante a tentativa dos pesquisadores em explorar a estrutura e
a dinâmica desta proteína em um estado parcialmente enovelado populado nesses baixos pH.
Após esse estudo, houve uma grande quantidade de estudos mostrando que, em determinadas
condições, há formação de agregados amilóides a partir de proteínas não relacionadas a
doenças (STEFANI & DOBSON, 2003). A partir desses resultados, concluiu-se que a
formação de fibras amilóides é uma propriedade genérica de cadeias polipeptídicas, ao invés
42
de uma característica peculiar de poucas seqüências desafortunadas (DOBSON, 2003).
Baseados em estudos in vitro e in silico, foram observadas algumas características que tornam
uma proteína mais propensa a agregar de forma amilóide. Basicamente, o aumento na
hidrofobicidade e tendência a formar folhas beta em regiões chaves da seqüência protéica
resultam no aumento da propensão em agregar, enquanto que o aumento na carga geral tem o
efeito oposto devido ao aumento da repulsão intermolecular (BEMPORAD et al., 2006). A
Figura 11 mostra diversas proteínas modeladas usando o programa TANGO que usa os
parâmetros descritos acima para calcular a propensão das proteínas em sofrer agregação
(FERNANDEZ-ESCAMILLA et al., 2004).
43
Figura 11. Estruturas representativas de proteínas envolvidas em doenças amilóides.
Seqüências mostradas em azul são preditas com pouca propensão a formar agregados amilóides
enquanto amarelo, laranja e vermelho indicam uma propensão crescente. Adaptado de JANH &
RADFORD, 2008.
44
Diversos são os mecanismos usados pelos organismos para tentar evitar a agregação ou a
presença
de
agregados
amilóides
como
discutido
no
tópico
“Enovelamento
e
desenovelamento protéico na célula”. Além disso, muitos trabalhos indicam que as
proteínas por si só adquiriram seqüências e adaptações estruturais que as tornaram capazes de
escapar, não apenas de agregações gerais indesejadas, mas também evitar a formação
específica de agregados amilóides, conforme descrito a seguir.
A propensão de uma proteína agregar diminui abruptamente quando ela está enovelada em
uma estrutura globular estável (KELLY, 1998). Isso é devido ao fato que, na maioria das
vezes, para formar fibras amilóides, proteínas bem enoveladas e estáveis precisam perder ao
menos parte de sua estrutura nativa. Essa desestruturação, em geral, é termodinamicamente
desfavorável e pode ser acelerada por vários fatores como mutações, oxidações, deaminação,
envelhecimento entre outros (BIESCHKE et al., 2006). A existência de uma forte pressão
seletiva que garante a estabilidade conformacional do estado nativo, ao menos para resíduos
de aminoácidos não diretamente envolvidos em catálise ou ligação, é bem estabelecida (XIA
& LEVITT, 2004). Regiões locais com alta propensão intrínseca de formar agregados estão
geralmente imbricadas na manutenção do estado enovelado estável. Isto sugere que estas
regiões foram selecionadas a se enovelarem rapidamente a fim de evitar contatos interprotéicos e a sua agregação (SANCHEZ et al., 2006). Esta observação sugere uma forte
correlação entre estabilidade termodinâmica e a necessidade de evitar agregação
(BASTOLLA & DEMETRIUS, 2005).
Proteínas ricas em folha beta seriam fortes candidatas a se associarem umas com as outras
formando estruturas amilóides. Entretanto, foi mostrado que nessas proteínas as fita beta
periféricas sofreram uma série de adaptações a fim de evitar isso. Algumas dessas adaptações
são loops intercalares e alfa hélices entre as fitas, além da formação de estruturas em barril de
folhas beta e a adição de resíduos que atrapalham a agregação como resíduos carregados,
prolinas, glicinas, etc (RICHARDSON & RICHARDSON, 2002). Resíduos de prolina
possuem restrições estruturais que dificultam a adaptação das proteínas em folha beta. Graças
a seu pequeno tamanho, resíduos de glicina possuem alto nível de flexibilidade
conformacional e alto custo entrópico associado com sua estruturação secundária
(STEWARD et al., 2002; PARRINI et al., 2005). Ainda não se sabe se essa estratégia é
especifica para alguns grupos específicos de proteínas ou uma estratégia mais geral.
Resíduos guardiões são aminoácidos com baixa probabilidade de formar agregados
(prolina, lisina, arginina, glutamanto e aspartato) encontrados flanqueando 90% das 26.000
45
seqüências protéicas de E. coli com grande potencial de agregação (ROUSSEAU et al., 2006).
Essas seqüências foram preditas por bioinformática através de programas que calculam a
tendência de regiões de proteínas a agregar. Esses resíduos geralmente não são conservados
em proteínas evolutivamente relacionadas, pois cada tipo de resíduo pode exercer seu papel
em posições ligeiramente diferente ou no outro lado do segmento, e pode ser substituído por
um dos outros quatro resíduos (ROUSSEAU et al., 2006).
Proteínas nativamente desenoveladas formam grupo de proteínas que possuem em comum
a ausência ou pequena proporção de estrutura secundária, na qual a maior parte do grupo
possui função desconhecida (UVERSKY, 2002). Essas proteínas possuem em média grande
proporção de resíduos carregados e baixa proporção de resíduos hidrofóbicos. Além disso,
possuem baixo número de seqüências propensas à agregação (LINDING et al., 2004) e alta
proporção de prolinas (TOMPA, 2002). Como dito anteriormente, o bom enovelamento
protéico é a principal estratégia para prevenir a agregação. No outro extremo existem as
proteínas nativamente desenoveladas que também possuem baixa tendência a agregar
(existem exceções como alfa sinucleína, peptídeo Aβ, etc). Portanto, parece que a evolução
busca o equilíbrio na proporção e localização de resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos que
permitam, na maioria das vezes, o favorecimento do enovelamento protéico em detrimento da
agregação protéica.
É interessante notar que proteínas que são altamente expressas nos organismos possuem a
tendência a agregar menor que proteínas menos expressas (TARTAGLIA et al., 2007). Além
disso, proteínas consideradas essenciais e proteínas que formam complexos homooligoméricos possuem a tendência menor de agregar quando comparadas à proteínas não
essenciais e à proteínas não homo-oligoméricas, respectivamente (CHEN et al., 2008). Isso
sugere que a evolução age sobre diferentes hierarquias contra a agregação protéica.
6- Amilóides Funcionais
A hipótese de amilóides funcionais sugere que os organismos souberam tirar vantagens do
fato de muitas proteínas formarem fibras amilóides criando funcionalidade para essas
estruturas, apesar do fato dos agregados amilóides serem geralmente tóxicos (FOWLER et al.,
2007). Amilóides funcionais foram descobertos na última década primeiramente em muitos
microrganismos, como bactérias (CHAPMAN et al., 2002; CLAESSEN et al., 2003) e fungos
(COUSTOU et al., 2002; KING et al., 1997); em insetos (ICONOMIDOU et al., 2000),
46
peixes (PODRABSKY et al., 2001; GRAETHER et al., 2003) e, posteriormente, em humanos
(GILKS et al., 2004; FOWLER et al., 2006).
Um exemplo de amilóide funcional é o depósito de fibras amilóides formadas pela
proteína curlina, que são usados por E. coli para colonizar superfícies inertes e mediar
ligações a proteínas do hospedeiro (CHAPMAN et al., 2002). Outro exemplo envolve a
bactéria filamentosa Streptomyces coelicolor, que produz hifas aéreas, permitindo a dispersão
eficiente de seus esporos. O desenvolvimento dessas hifas parece depender de uma classe de
proteínas chamadas chalpinas, capazes de formar fibras amilóides que cooperam no seu
desenvolvimento (CLAESSEN et al., 2003). Nesses organismos, a síntese das proteínas
amilóides está sob controle altamente regulado. No caso da proteína curlina, a formação de
agregados depende de diferentes proteínas incluindo uma responsável apenas pelo processo de
nucleação (BARNHART &CHAPMAN, 2006).
Talvez o exemplo mais extraordinário e polêmico dos amilóides funcionais seja a proteína
CPEB, que modula a formação de memória de longa duração em Aplysia californica (espécie
de lesma marinha utilizada como modelo no estudo da memória) (SI et al., 2003ab). CPEBs
são proteínas altamente conservadas que se ligam à seqüências específicas de RNA
caracterizadas por motivos curtos 3’ RNA, chamados de elementos de poli-adenilação
citoplasmático (CPEs). CPEBs regulam a ativação de RNAm adormecidos modulando seu
estado de poli-adenilação, assim como sua localização (MENDEZ & RICHTER, 2001). Em
A. californica, a forma neuronal de CPEB, ApCEPB, controla a tradução de RNAm que
codifica para proteínas estruturais (N-actina, por exemplo) e proteínas regulatórias (efrinas,
como exemplo), responsáveis pela manutenção do crescimento sináptico e plasticidade de
longa duração (BAILEY et al., 2004). A serotonina induz a produção de ApCEPB e sua
inibição abole o mecanismo de facilitação de longa duração (SI et al., 2003ab). ApCEPB
contem um domínio conservado responsável por sua agregação. Isso faz com que essa
proteína, quando expressa em levedura, se comporte como prion. Ao contrário da maioria dos
agregados descritos, a atividade dessa proteína é aumentada quando no estado agregado.
Desse modo, é proposto que, após o estímulo de serotonina, ApCEPB pode atingir uma
concentração suficientemente alta, dependendo do estímulo, capaz de levar a sua agregação
com a conseqüente ativação. Essa atividade seria duradoura, pois uma vez que ApCEPB se
encontra agregada, assim como um prion, seria capaz de estimular a agregação de mais
ApCPEB permitindo a memória de longa duração (SHORTER & LINDQUIST, 2005).
47
Outro amilóide funcional fascinante é a proteína humana Pmel17. Os melanossomos, que
são lisossomos que se diferenciaram em melanócitos para a produção de melanina, são
caracterizados por fibras intra-lumiares, que surgem quando ocorre a síntese de melanina.
Esse material fibroso, com características de fibras amilóides, surge da agregação do domínio
intra-lumial da proteína Pmel17 quando clivada por uma proteína convertase (BERSON, et
al., 2003). Esse fragmento agrega rapidamente in vitro formando fibras amilóides bem
características (FOWLER et al., 2006). Os agregados servem de arcabouço para o depósito de
melanina dentro do melanossomo e sua importância é tão grande que mutações em
camundongons que abolem a formação dessas fibras, levam à perda progressiva dos
melanócitos, sugerindo que esses agregados protegem as células dos efeitos tóxicos da
geração de melanina (FOWLER et al., 2006).
Existem ainda evidências de que agregados de um organismo podem beneficiar outro.
Recentemente, foi mostrado que a proteína fosfatase alcalina do sêmen humano é capaz de
formar agregados amilóides. Esses agregados aumentam muito a susceptibilidade de células
humanas à infecção pelo HIV (MÜNCH et al., 2007). Essa descoberta pode abrir novas
frentes de pesquisa, não só no que diz respeito a AIDS, mas também em outras infecções,
onde vírus e microorganismos podem obter vantagens frente ao hospedeiro ao usar agregados
amilóides do próprio hospedeiro como facilitadores da infecção.
48
PARTE I
INTRODUÇÃO
1- Sup35
A proteína Sup35 é composta por três regiões, N, M e C, que foram delimitadas conforme
a composição e homologia de seqüência com outros fatores de tradução (Figura 1)
(KUSHNIROV et al., 1988).
Figura 1. Esquema representando os diferentes domínios de Sup35, suas propriedades e
funções. Adaptado de SERIO et al., 1999.
A região N é a região amino-terminal (1–123) apresentando a composição e distribuição
de aminoácidos bastante peculiar, onde cerca de 79% dos resíduos são glicina (17%), tirosina
(16%), asparagina (16%) ou glutamina (29%). Esta região contém seis repetições imperfeitas
da seqüência QGGYQ(Q)QYNP (KUSHNIROV et al., 1988). A presença de grande
quantidade de asparaginas e glutaminas aproxima a Sup35 de um grupo de proteínas que
causam doenças que afetam o homem, onde os principais exemplos são a Doença de
Huntington e Doença de Machado-Joseph (PERUTZ 1999; ZOGHBI & ORR, 2000), o que
faz de Sup35 um bom modelo para essas doenças.
O domínio N determina a propriedade de prion da Sup35 denominado [PSI+]. Ele é
necessário para a propagação de [PSI+] (DOEL et al., 1994; TER-AVANESYAN et al., 1994)
e a super expressão desta região sozinha é suficiente para induzir o elemento [PSI+] em todas
as cepas [psi-] (CHERNOFF et al., 1992; DERKATCH et al., 1996). Esse domínio tem alta
49
propensão em agregar no citoplasma das células, quando é expresso isolado. Experimentos in
vitro mostraram que essa porção da proteína é, de fato, altamente insolúvel em tampão
fisiológico e forma amilóides, mesmo na presença de altas concentrações de desnaturantes, o
que dificulta seu manuseio e seu uso em estudos in vitro (GLOVER et al., 1997; KING et al.,
1997).
A região M da Sup35 (124 - 253) é altamente carregada, devido à presença de resíduos de
ácido glutâmico (18%) e de lisina (19%). Essa região não apresenta arginina e apenas 5% de
resíduos de ácido aspártico. Embora não seja essencial para a indução de [PSI+], a região M
aumenta a solubilidade da região N, mas não elimina suas propriedades amiloidogênicas. Em
contraste ao domínio N, que agrega mesmo em altas concentrações de agentes caotrópicos, o
domínio NM pode existir na forma solúvel, sendo capaz de guardar as propriedades
amiloidogênicas de N, bem como induzir o fenótipo [PSI+]. Em adição, NM quando
purificado, forma lentamente amilóides in vitro em tampões fisiológicos (GLOVER et al.,
1997). Essa tem sido, portanto, a versão mais estudada dessa proteína.
A região carboxi-terminal da Sup35, domínio C (254-686) tem seqüência homóloga ao
fator de tradução EF-1α (KUSHNIROV et al., 1988). Essa região se complexa com a Sup45.
Funcionando assim, como fator de terminação de tradução de RNAm (Figura 2)
(STANSFIELD et al., 1995). Essa região contém vários sítios ligantes de GTP. Diferente dos
domínios N e M, esse domínio é essencial para a viabilidade, já que é, de fato, o domínio
funcional da proteína (TER-AVANESYAN et al., 1994).
O domínio NM da proteína Sup35 quase não possui estrutura secundária ou terciária na
forma solúvel (GLOVER et al. 1997; SCHEIBEL & LINDQUIST, 2001). Recentemente, foi
mostrado que, quando o domínio NM é retirado de uma solução contendo uréia, ele colapsa
de maneira similar a intermediários formados durante o enovelamento (MUKHOPADHYAY
et al., 2007). Mesmo assim, NM está enquadrado dentro do grupo das chamadas proteínas
nativamente desenoveladas. Resumidamente, Sup35 é uma proteína com três domínios com
características bem distintas, o N terminal com a tendência muito grande a agregar, o domínio
M altamente carregado que confere solubilidade ao N e provavelmente modula sua agregação
além de separá-lo do domínio C, que é bem enovelado e funcional.
50
Figura 2. Função de Sup35. Em (A) está mostrado o comportamento normal de Sup35 e Sup45,
que formam um complexo que reconhece e se liga aos códons de finalização marcando o fim da
tradução. Em (B) está esquematizado o que ocorre quando Sup35 agrega, levando ao não
reconhecimento dos códons de finalização e a geração de proteínas com segmentos extras.
Adaptado de SHORTER & LINDQUIST, 2005.
2- Função de Sup35
A proteína Sup35 tem função importante no processo final da tradução protéica quando,
em associação com a proteína Sup45, forma um complexo capaz de desligar o RNA
mensageiro dos ribossomas, marcando o fim da tradução (Figura 2). Isto ocorre nas
seqüências conhecidas como término de tradução ou códons de finalização. Sup35 é
homóloga ao fator de liberação eRF-3 (releasing factor), enquanto a Sup45 apresenta
homologia com o fator eRF1, de mamíferos (STANSFIELD et al., 1995). Esses fatores de
liberação reconhecem determinados códons e terminam a síntese protéica.
Existem várias maneiras de detectar se a proteína Sup35 está na forma solúvel e ativa ou
na forma agregada e inativa. A maneira mais utilizada é a inserção de um códon de
finalização no gene ade1-14 (ADE1). Este gene codifica uma proteína envolvida na
biossíntese de adenina. Se a Sup35 estiver solúvel, o códon de finalização será reconhecido,
gerando formas truncadas da proteína Ade1, porém a célula só cresce na presença de adenina.
Por outro lado, se Sup35 estiver agregada, este códon não será reconhecido e a proteína Ade1
será sintetizada de forma íntegra. Desta forma, na forma agregada, ocorre a supressão da
51
mutação nonsense e a célula cresce em meio desprovido de adenina. Quando o crescimento
for em meio completo (YPD), é feita a análise da cor das colônias. Nas cepas [psi-] onde
Sup35 está solúvel, as colônias apresentam coloração vermelha devido ao acúmulo de
pigmentos de intermediários metabólicos derivados da interrupção da síntese de adenina. Já as
cepas [PSI+], onde Sup35 está agregada, formam colônias brancas, resultado do metabolismo
normal de adenina (COX, 1965). Resumindo, células [PSI+] geram colônias brancas ao passo
que células [psi-] geram colônias vermelhas.
3- Relação entre chaperonas e prions de leveduras
Embora os prions de levedura apresentem tendência intrínseca de formarem agregados
amilóides in vitro, a propagação dos prions de levedura depende criticamente de uma grande
variedade de proteínas chaperonas. Certas chaperonas, incluindo membros das famílias
HSP70 e HSP40, inibem a formação de prions e sua replicação, enquanto que, outros
membros dessas mesmas famílias promovem a propagação dos prions. A proteína Hsp104,
que pertence à família HSP100, é uma chaperona que aumenta a termotolerância das células,
já que promove a desagregação de proteínas agregadas pelo calor. Hsp104 é capaz de agir de
duas formas: tanto o excesso de sua expressão como sua deficiência resultam na perda de
[PSI+] (CHERNOFF et al., 1995). Enquanto a deleção do gene HSP104 cura todos os prions
de levedura, sua super expressão só afeta [PSI+]. Desta forma, a manutenção estável de prions
deve envolver o balanço entre a atividade de uma chaperona específica (que tenta prevenir a
agregação) e a tendência intrínseca de prion em sofrer agregação e se dividir.
Estudos recentes têm tentando endereçar a questão de como a Hsp104 pode aumentar a
propagação do prion. A Hsp104 interage diretamente com Sup35 solúvel in vitro
(SCHIRMER & LINDQUIST, 1997), o que sugere que o excesso da proteína chaperona
poderia curar [PSI+], tanto por seqüestrar a proteína Sup35, quanto por enovelá-la em uma
conformação que não seria suscetível à conversão em prion. A necessidade de ter a expressão
de Hsp104 endógeno para a propagação de todos os prions de levedura poderia resultar da
habilidade desta chaperona de quebrar grandes agregados protéicos em pedaços menores, que
serviriam como semente para novos prions que seriam, então, particionados entre as células
filhas. Desta forma, acredita-se que Hsp104 em excesso cura as células [PSI+] ao interagir
com a proteína Sup35, mantendo-a solúvel. Por outro lado, sua ausência em células Δhsp104
levaria a não manutenção de [PSI+], já que o fracionamento das fibras de Sup35p para
posterior partição entre as células filhas seria dependente desta chaperona. Consistente com
52
esta linha de pensamento está a não necessidade de Hsp104 para o aparecimento de novo da
agregação de Sup35, ao passo que a depleção da atividade de Hsp104 de células [PSI+] leva
tanto à diminuição do número de agregados de Sup35, quanto ao aumento do tamanho dos
agregados (WEGRZYN et al., 2001).
Um outro exemplo do efeito das chaperonas nos prions é a chaperona citoplasmática Ssa
(família HSP70) que promove a agregação de Sup35. A super expressão de Ssa aumenta a
taxa de agregação de Sup35 e antagoniza o efeito da super expressão de Hsp104, que leva a
cura de [PSI+]. Por outro lado, a depleção da atividade de Ssa promove a perda de [PSI+].
Contrariamente, outra família de chaperonas, Ssb1 e Ssb2 (família HSP70), antagoniza a
agregação de Sup35. Enquanto que a super expressão de proteínas Ssb aumenta a taxa de cura
de [PSI+], a sua deleção tem efeito contrário. Uma vez que as chaperonas Ssb parecem agir
junto às cadeias de proteínas nascentes durante a tradução, é possível que a conversão de
Sup35 em um estado de prion possa ocorrer durante a síntese da proteína, ou seja, antes que a
proteína tenha adotado sua conformação final estável (JONES et al.; 2003; CHERNOFF et
al., 1999). De toda forma, ainda não se conhece claramente o papel das diferentes chaperonas
na biologia da proteína Sup35.
4- [PSI+] é uma doença ou uma escolha evolutiva?
Apesar do domínio NM de Sup35 ser totalmente dispensável para a atividade da proteína
na tradução de RNAm em S. cerevisiae, a manutenção de domínios homólogos em outros
organismos sugere que a agregação de Sup35 é uma característica mantida pela evolução.
Atualmente existem duas correntes na literatura que tentam explicar a existência de [PSI+]
(CHERNOFF, 2007). A primeira hipótese denominada “prion patológico” considera [PSI+]
como um prion patológico similar ao encontrado em mamíferos. Essa hipótese se baseia no
fato de nunca ter sido encontrada na natureza nenhuma levedura contendo o prion [PSI+]
(NAKAYASHIKI et al., 2005). Apesar de [PSI+] não alterar a taxa de crescimento de células
em fase exponencial, algumas cepas [PSI+] exibem maior mortalidade em fase estacionária
(COX et al., 1988), similar ao processo apoptótico de células de mamíferos. Sup35 agregada
interage com algumas proteínas do citoesqueleto envolvidas na via endocítica e a citotoxidade
em células que super expressam Sup35 com citoesqueleto defeituoso é aumentada
(GANUSOVA et al., 2006). Essa hipótese explica a conservação de NM como uma outra
função adaptativa ainda desconhecida não relacionada ao prion. Como o domínio NM
interage com diversas proteínas celulares (BAILLEUL et al., 1999), é possível que NM
influencie a função de Sup35 até mesmo modulando sua localização celular. Além disso, a
53
deleção de NM leva a alteração no ciclo celular do fungo Podospora anserina (GAGNY &
SILAR, 1998), sugerindo que esta região não é completamente irrelevante no funcionamento
da proteína.
A segunda hipótese, chamada “prion adaptativo”, baseia-se primeiramente na
manutenção do domínio NM em diversas leveduras (HARRISON et al., 2007). A resposta de
células isogênicas [PSI+] e [psi-] foi avaliada contra 150 condições de crescimento diferentes,
incluindo muitas encontradas na natureza (TRUE & LINDQUIST, 2000). Em
aproximadamente 25% das condições [PSI+] foi vantajoso e para outros 25% [psi-] obteve
vantagem. Nas demais condições (50%) não houve diferença entre os fenótipos. Esse
trabalho, junto com outros (JOSEPH & KIRKPATRICK, 2008) sugere que o prion de Sup35
funciona como uma herança epigenética, ou seja, independente de genes, capaz de gerar
variação fenotípica que, em alguns casos, pode ser benéfica para as células (CHERNOFF,
2007).
A freqüência do aparecimento e desaparecimento de [PSI+] é tão baixa quanto mutações
(10-5-10-7) (SHORTER & LINDQUIST, 2005), com a vantagem de que seu surgimento não
altera o genoma, mas apenas o status da solubilidade de Sup35. Como a agregação de uma
proteína tão importante pode beneficiar as células? Em geral, células normais pulam
erroneamente o códon de finalização dos RNAm em uma taxa muito baixa (< 0,1%) sendo
que o erro pode chegar a 25% em células [PSI+] (VON DER HAAR & TUITE, 2006). Isso
pode gerar proteínas com C-terminal estendido, que podem, por ventura, gerar vantagem
frente a algumas situações. Por outro lado, proteínas com segmentos desenovelados adicionais
podem contribuir para disparar proteínas de choque térmico, deixando a célula pronta para
atravessar o período de estresse. Além disso, alguns genes de leveduras foram silenciados
com códons de finalização durante a evolução. Em células [PSI+], esse genes silenciados
podem ser reativados conferindo “novas” alternativas não mais disponíveis para as células
normais. Um exemplo é a enzima antizima, um regulador negativo da síntese de poli-aminas
em leveduras. A produção de antizima é controlada através da mudança de +1 frame no códon
de finalização, ou seja, para escapar da degradação do proteassomo a antizima necessita ser
traduzida pulando o primeiro códon de finalização e só parando no segundo. Isso ocorre com
muita freqüência em células [PSI+], levando ao aumento na síntese de poli-aminas, com
conseqüente variação na sensibilidade a várias situações quando comparada com células
normais (NAMY et al., 2008).
54
O primeiro trabalho que provou que [PSI+] confere vantagens em relação às células
normais foi feito usando como agentes estressantes o calor e o etanol (EAGLESTONE et al.,
1999). Entretanto, até hoje, não foram identificados quais mecanismo moleculares estão
envolvidos nessa resposta diferenciada. A seguir está descrito como células de leveduras
montam a resposta metabólica contra os diversos tipos de estresse.
5- Resposta de Saccharomyces cerevisiae ao estresse
Os mecanismos de resposta ao estresse buscam proteger a célula de potenciais danos
causados pelas condições adversas e também atuam no reparo de danos produzidos pelo
estresse. Para tanto, ocorrem mudanças metabólicas e o rearranjo no padrão de expressão
gênica, levando a célula a um novo estado fisiológico. Isso significa que, proteínas não
expressas em condições normais são sintetizadas ou o nível de expressão de genes
regularmente expressos é alterado em relação à situação anterior ao estresse. Desse modo, a
célula não só se recupera das lesões causadas pelo agente estressante como também fica mais
protegida contra danos futuros.
A resposta celular ao estresse mais bem caracterizada em S. cerevisiae é a induzida por
choque térmico. Quando células crescidas sob temperatura ótima de 28oC são transferidas
para 37 oC, observa-se uma série de alterações no metabolismo. A célula pára o ciclo celular
na fase G1 e há repressão geral na síntese de proteínas; simultaneamente, ocorre acúmulo
intracelular do dissacarídeo trealose e o aparecimento das proteínas de choque térmico
(HSPs). Muitas dessas HSPs, como por exemplo, as das famílias das Hsp60, Hsp70 e a
Hsp90, atuam como chaperonas, auxiliando no correto enovelamento de proteínas (BECKER
& CRAIG, 1994), enquanto que a Hsp104 participa do processo de dissolução de agregados
intracelulares formados por proteínas comprometidas pelo estresse térmico (PARSELL et al.,
1994). O calor também prejudica o funcionamento das proteínas implicadas na cadeia
respiratória. Como resultado, a redução do oxigênio torna-se menos eficiente, refletindo numa
produção aumentada de radicais livres. Entre as proteínas induzidas por choque térmico estão
enzimas como catalases e superóxido dismutases, que catalisam diretamente a degradação do
peróxido de hidrogênio, promovendo, então, proteção contra o estresse oxidativo
(HOHMANN & MAGER, 1997). Graças a esse conjunto de fatores, células pré-tratadas com
temperaturas sub-letais (37 a 42 ºC) adquirem tolerância quando expostas a temperaturas que
seriam letais (≥ 50 ºC) (HOHMANN & MAGER, 1997).
55
A trealose é um dissacarídeo não redutor cuja função, acreditava-se, ser fonte de energia e
carbono. No entanto, com o avanço do conhecimento de anidrobiose, uma nova função como
protetor celular foi atribuída a este açúcar. Devido a sua estrutura química, a molécula de
trealose interage facilmente com proteínas e fosfolipídeos de membrana. Essa característica é
muito importante para o papel protetor da trealose em estresses como congelamento e
desidratação, ambos envolvidos na remoção de água nos sistemas biológicos. A trealose, por
sua vez, é capaz de substituir a água de hidratação das biomoléculas durante estes processos,
prevenindo a fusão da fase lipídica, bem como a desnaturação das proteínas. A trealose
substitui as moléculas de água ligando-se tanto às cabeças polares dos fosfolipídeos, quanto
aos domínios hidrofílicos das proteínas, mantendo, assim, a fluidez da membrana e o
enovelamento protéico (SINGER & LINDQUIST, 1998ab).
Estudos de microarranjo em células de Saccharomyces cerevisiae submetidas a uma
ampla variedade de estresses químicos e ambientais mostraram que a resposta para cada
situação específica possui características particulares. Entretanto, analisando-se os genes
normalmente expressos é possível detectar a regulação estereotipada após a transição para
condições estressantes, denominada de resposta ao estresse ambiental (ESR). Embora o
número de genes regulados na ESR possa variar conforme a intensidade ou tempo de duração
do estresse, em geral, observa-se a forte repressão de genes codificantes para proteínas
envolvidas na síntese de proteínas e ciclo celular. Especula-se que a redução do número de
transcritos e seus produtos podem ajudar na conservação de energia enquanto a célula se
adapta a nova condição, um papel que já havia sido proposto para a redução de genes
codificantes de proteínas ribossomais (WARNER, 1999). Em contraste, os genes induzidos na
ESR estão envolvidos em várias funções celulares, como metabolismo de carboidratos,
enovelamento de proteínas, defesa contra agentes oxidantes, reparo do DNA entre outras
(GASCH et al., 2000).
6- Regulação da transcrição de genes responsivos ao estresse
Em S. cerevisiae, a regulação da expressão de genes envolvidos na resposta ao estresse
está sob o controle de fatores de transcrição que são translocados para o núcleo quando a
célula é exposta ao agente estressante. Destacam-se dois sistemas principais de ativação de
genes responsivos ao estresse: o do fator de transcrição Hsf1 e os fatores Mns2/Msn4 (Figura
3) (ESTRUCH, 2000).
Hsf1 foi identificado como fator de transcrição capaz de ligar-se na seqüência promotora
HSE (Heat Shock Element, nGAAn ) presente no promotor de uma série de genes comumente
56
ativados por altas temperaturas (SORGER & PELHAM, 1987), por estresse oxidativo ou
induzido por limitação de nutrientes (HAHN et al., 2004). Os Hsfs presentes em S. cerevisiae
e em metazoários reconhecem o mesmo motivo HSE e apresentam regiões de alta
conservação, como o domínio de ligação ao DNA tipo “helix-turn-helix” e um domínio
importante para a formação de trímeros tipo “coiled-coil” hidrofóbico. Apesar da conservação
estrutural, há grande variabilidade no número e na importância de Hsfs para cada organismo.
Assim como S. cerevisiae, Drosophila sp. apresenta apenas um Hsf, importante para oogênese
e o início do desenvolvimento larval, além da sobrevivência a estresses severos (JEDLICKA
et al., 1997). Em contraste, aves e mamíferos possuem 3 isoformas de Hsf reguladas
diferentemente e com papéis distintos na fisiologia celular (PIRKKALA et al., 2001). Em
plantas, essa especialização é ainda mais evidente, uma vez que Arabidopsis thaliana possui
21 isoformas de Hsf que são finamente controlados, atuando na coordenação de diferentes
processos fisiológicos (BANIWAL et al., 2004).
Altas temperaturas
Perturbações na membrana plasmática
Mudança de temperatura Limitação de Nitrogênio Alta osmolaridade Ácidos Acúmulo de glicogênio Síntese de trealose
Condições ótimas Estresse oxidativo
Figura 3. Visão geral das vias de sinalização em resposta ao estresse em S. cerevisiae.
Mediante o estímulo de estresse, fatores de transcrição são ativados e translocados para o núcleo,
onde desencadearão a transcrição de genes possuindo seqüências reguladoras em seus promotores.
Além disso, há a repressão de genes relacionados à replicação celular, o que induz a parada na fase
G1 do ciclo mitótico. Estresses como calor, estresse osmótico e exposição ao etanol levam ao
acúmulo
de
trealose.
Modificado
Yeast_Biology/13_Regulation.htm.
de
http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/
57
Como regra geral, Hsf é constitutivamente monomérico e apresenta localização
citoplasmática, mas quando ativado, forma homotrímeros concentrados no núcleo. Em S.
cerevisiae, Hsf1 é encontrado associado ao DNA e na forma trimérica, mesmo em condições
normais de crescimento. De fato, vários genes dependem da atividade basal desse fator para
sua transcrição, o que explica o fato de HSF1 ser um gene essencial para a sobrevivência da
levedura. No entanto, sabe-se que o estresse induz o estado de hiper-ativação, no qual a
formação de trímeros é favorecida e a afinidade de ligação de Hsf1 ao DNA é aumentada,
passando, então, a ocupar uma quantidade maior de promotores e, conseqüentemente,
promovendo a ativação de uma série de novos genes, dentre eles os que codificam para HSPs
(HAHN et al., 2004).
Os mecanismos evolvidos nessa modulação da atividade ainda são debatidos na literatura,
já que diferentes tipos de regulação têm sido associados à ativação de Hsf1. Foi observado
que Hsf1 torna-se hiper-fosforilado em situações de estresse térmico ou oxidativo, o que
sugere uma regulação dependente de proteínas cinase. Entretanto, a fosforilação parece estar
relacionada tanto à ativação quanto a inativação de Hsf1, dependendo do aminoácido
fosforilado (ESTRUCH, 2000). A interpretação do papel da fosforilação torna-se mais
complexo com a observação de que diferentes estresses levam a diferentes níveis e padrões de
fosforilação (LIU et al., 1996). Também foi reportado que atividade de Hsf1 pode ser
modulada diretamente por modificações estruturais induzidas por estresse. Resíduos de
cisteína localizados próximos à região de ligação ao DNA atuariam como sensor para o estado
redox da célula, induzindo a formação da forma trimérica de Hsf1 frente ao estresse oxidativo
(AHN & THIELE, 2003). Além disso, foi demonstrado in vitro que o aumento de temperatura
é capaz de causar mudanças estruturais na região de ligação ao DNA que se assemelham com
a conformação do estado ativado de Hsf1 (BULMAN et al., 2001). Sabe-se também, que um
dos níveis de regulação da atividade de Hsf1 passa pela estrutura da região promotora, já que
o número de HSEs e o arranjo das repetições na seqüência do promotor influenciam na forma
e na afinidade de ligação de Hsf1 ao DNA (HASHIKAWA & SAKURAI, 2004;
EASTMOND & NELSON, 2006)
Outro fator de transcrição de S. cerevisiae importante para a ativação gênica em resposta
ao estresse é Msn2 e seu parálogo Msn4. Esses fatores de transcrição tipo “Zinc finger” agem
de forma redundante ao promover a ativação de genes através da região regulatória STRE
58
(Stress Response Element), composta por uma ou mais repetições do pentanucleotídeo
CCCCT (GASCH et al., 2000).
Ao contrário de Hsf1, Msn2/4 não são conservados evolutivamente em mamíferos e não
são essenciais para a viabilidade celular. Entretanto, Msn2/4 são muito importantes para a
adaptação de S. cerevisiae, já que a seqüência promotora STRE está presente na grande
maioria dos genes que compõem a resposta ao estresse ambiental ESR, já descrita
anteriormente (MARCHLER et al., 1993).
Em condições normais de crescimento, Msn2/4 estão localizados no citoplasma, mas com
o estímulo de estresse esses fatores passam a se concentrar no núcleo. O direcionamento de
Msn2/4 para o núcleo está relacionado à baixa atividade da proteína cinase dependente de
AMPc (PKA) (Figura 1). Isso ocorre devido à diminuição dos níveis intracelulares do AMPc
associada à baixa taxa de crescimento, característica essa comum a células sob estresse ou
carência nutricional (GORNER et al., 1998). Dessa forma, a expressão dos genes sob controle
desses fatores é reprimida durante o crescimento de S. cerevisiae em meio rico contendo fonte
de carbono fermentável, mas é induzida na fase de transição para o metabolismo respiratório,
sob condições de limitação de nutrientes e por diversos tipos de estresses, como choque
térmico, alta osmolaridade, acidez e exposição ao etanol (MARTINEZ-PASTOR et al., 1996).
Uma vez no núcleo, Msn2 interage com a proteína Gal11, componente do complexo
mediador de replicação da RNA pol II, do qual também faz parte à proteína cinase Ssn3,
responsável pela hiper-fosforilação desse fator. Para Msn2/4, a hiper-fosforilação parece estar
relacionada à sua degradação via proteassomo (LALLET et al., 2006). Entretanto, ainda não
está esclarecido como o estresse ambiental ativa a ligação de Msn2/4 ao DNA. Sabe-se que o
direcionamento desses fatores para o núcleo não é o fator determinante, já que, a simples
retenção de Msn2/4 no núcleo, através da supressão da proteína exportadora Msn5, não leva a
ativação de genes responsivos ao estresse (BOY-MARCOTTE et al., 2006).
Dessa forma, fica claro que a resposta celular ao estresse constitui um fenômeno
complexo e envolve um intrincado mecanismo de regulação cuja compreensão envolve a
cuidadosa análise da resposta celular, não a um só tipo de situação, mas sim aos vários fatores
que compõem o ambiente.
59
OBJETIVOS
1- Objetivo geral
Avaliar de forma comparativa a resposta de células de levedura S. cerevisiae [PSI+] e
[psi-] frente ao estresse de choque térmico.
2- Objetivos específicos
1- Avaliar a influência do pré-tratamento a 37 ºC no choque térmico a 50 °C quanto à
sobrevivência das células;
2- Quantificar a síntese do dissacarídeo protetor trealose durante o tratamento a 37
ºC;
3- Verificar por RT-PCR semi-quantitativo a indução dos genes TPS1 e HSP12
durante o tratamento a 37 ºC;
4- Avaliar através do uso do sistema reporter fusionado a enzima beta-Gal a
atividade dos fatores de transcrição Msn2/4 e Hsf1 em resposta ao choque térmico
a 37 ºC;
5- Determinar qual a importância dos fatores de transcrição Msn2/4 na indução de
resistência estresse térmico;
6- Comparar através do uso da sonda fluorescente bis-ANS a proporção de proteínas
mal enoveladas nessas células.
60
MATERIAL E MÉTODOS
1- Microorganismos e condição de crescimento
Células de levedura Saccharomyces cerevisiae [PSI+] e [psi-] BSC783/4a, SUQ5, ade2-1,
ura3-1, his3-11, his3-15, leu2-3, leu2-112, MATa, proveniente do Laboratório do Dr. Mick
Tuite da Universidade de Kent, Reino Unido, foram crescidas em meio rico YPD (2%
glucose, 1% extrato de levedura, 2% peptona) pH 5,6 a 28 ºC com constante aeração até a fase
fermentativa (DO600 nm= 1,0). Todas as outras cepas usadas foram provenientes desta cepa e
cresceram nas mesmas condições.
2- Oligonucleotídeos
Os oligonucleotídeos usados neste trabalho estão listados na tabela 1.
Tabela 1. Oligonucleotídeos usados nesta tese
N°
1
Oligonucleotídeo
MSN2F
2
MSN2R
3
4
MSN2C
MSN4F
5
MSN4R
6
7
8
9
10
MSN4C
KANB
HIS2
TPS1F
TPS1R
Seqüência
TTTTCAACTTTTATTGCTCATAGAAGAACTAGATCTAAAATGC
GTACGCTGCAGGTCGAC
ATGAAGAAAGATCTATCGAATTAAAAAAATGGGGTCTATTAA
TCGATGAATTCGAGCTCG
TCAACAAGACTTCCCAGTTAGAAAC
TCGGCTTTTTTTTCTTTTCTTCTTATTAAAAACAATATAATGCG
TACGCTGCAGGTCGAC
GCTTGTCTTGCTTTTATTTGCTTTTGACCTTATTTTTTTCAATCG
ATGAATTCGAGCTCG
GATGCTACACATGTTTCCCTTAGAT
CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT
ATTACGGCTCCTCGCTGCAGA
TGTCTTCCGTGCAAAGAGTG
CAGCCTGTCGACACCAACTA
3- Construção das cepas Δmsn2/ msn4, HSE-βGal e STRE-βGal
A construção de Δmsn2/msn4 foi feita em duas etapas, na primeira foram geradas cepas
[PSI+] e [psi-] Δmsn2. Foi feito o PCR com plasmídeo pFA6a-kan MX6 usando os
oligonucleotídeos 1 e 2 nas condições descritas previamente (WACH et al., 1998). As
condições do PCR foram; 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 5 ng pFA6a-kan MX6, 1 μM dos
oligonucleotídeos. As amostras foram incubadas a 95 °C por 10 minutos e 5 U/μl de Taq
foram adicionadas para cada amostra. Os ciclos do PCR foram repetidos 34 vezes usando 95
°C por 1 minuto, 54 °C por 1 minuto e 72 °C por 2 minutos. O produto desse PCR foi usado
para transformar, usando-se acetato de lítio (GIETZ & WOODS, 2002) as cepas [PSI+] e [psi-
61
] em um meio YPD contendo o agente seletor gentamicina na concentração de 200 mg/l
(WACH et al., 1998). A confirmação da deleção foi feita usando os oligonucleotídeos 3 e 7
nas seguintes condições, 94 °C por 2 minutos seguido de 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos,
50 °C por 30 segundos e 72 °C por 1,5 minuto. Para a construção da cepa Δmsn2/msn4, foi
usada a mesma estratégia descrita anteriormente usando-se o plasmídeo pFA6a-His MX6, os
oligonucleotídeos 4 e 5 e as cepas [PSI+] e [psi-] Δmsn2. O meio seletor foi o meio mínimo
sem histidina (SHERMAN, 2002) e os oligonucleotídeos 6 e 8 foram usados para confirmar a
deleção.
A transformação com HSE-βGal (HASHIKAWA et al., 2006) e STRE-βGal (BOYMARCOTTE et al., 1998) foram feitas usando-se as construções descritas anteriormente,
transformando com acetato de lítio (GIETZ & WOODS, 2002) e selecionando com o meio de
cultura apropriado. Todas essas construções foram obtidas através de uma colaboração com a
Dra Tatiana Domitrovic.
4- Medidas de atividade especifica de β-galactosidase
A extração e a atividade de β-galactosidase foi feita seguindo protocolo previamente
descrito (ROSE et al., 1990).
5- Viabilidade celular
Após os tratamentos térmicos, as células foram diluídas apropriadamente e plaqueadas em
meio sólido YPD. A viabilidade celular foi determinada por contagem de unidades
formadoras de colônias após dois dias de crescimento a 28 °C. Todas as placas foram feitas
em duplicata.
6- Extração de RNAm, RT-PCR e análise densitométrica
A extração do RNAm, produção do cDNA e o RT-PCR para HSP12 e ACT1 foram feitos
como descrito anteriormente (PALHANO et al., 2004). Para o gene TPS1, o cDNA obtido foi
amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos 9 e 10 nas seguintes condições: 94 oC por 1
minuto, 60 oC por 1 minuto e 72 oC por 1 minuto, seguido de 5 minutos de incubação a 72 oC.
As curvas de amplificação para esses três genes foram obtidas através da coleta de amostras
nos ciclos 24, 30 e 36. As análises densitométricas foram feitas usando o programa Image J
dividindo-se a área da banda de interesse pela área do gene de actina (ACT1) do mesmo
62
tempo de incubação. As amostras foram visualizadas através de eletroforese em gel de
agarose 2 % corado com brometo de etídio.
7- Extração e dosagem de trealose
A extração e dosagem de trealose foram feitos como descrito anteriormente (PARROU et
al., 1997).
8- Marcação e quantificação das proteínas totais com a sonda bis-ANS
Vinte mililitros de células de leveduras crescendo em meio rico na fase fermentativa
(DO600 nm= 1,0) foram centrifugadas a 5000 X g por 5 min a 4 ºC, lavadas duas vezes com 20
ml de água gelada e o precipitado foi ressuspendido em 1 ml de uma solução contendo 1 mM
de PMSF, 1 µg/ml de DTT, 1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de pepstatina, 1 µg/ml de
aprotinina, 20 U/ml de DNAse e 20 U/ml de RNAse a 4 ºC. Essa solução foi transferida para
um tubo de vidro gelado onde foram adicionadas pérolas de vidro lavadas e a suspensão foi
agitada 5 vezes por 30 seg alternando por 30 seg no gelo. Após a extração das proteínas, as
amostras foram passadas para microtubos de centrífuga e centrifugadas a 15.000 X g por 15
min a 4 ºC. O sobrenadante foi passado para um novo tubo e mantido no gelo. A concentração
de proteínas foi determinada pelo método de Lowry (LOWRY et al., 1951) e parte da amostra
foi transferida para um novo tubo contendo 100 µM de Bis-ANS, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 10
mM de MgSO4 para concentração final de proteínas de 1 mg/ml. Duzentos microlitros de cada
amostra foram aplicados em placa de 96 poços mantida no gelo e levadas à exposição de luz
UV (115 V, 60 Hz, 0,16 A, 254 nm) a distância de 1 cm por 60 min (PIERCE et al., 2006). As
amostras foram, então, fervidas por 10 min em tampão de amostra desnaturante contendo SDS
e β-mercaptoetanol. Foram aplicados 30 µg de proteína por poço e as amostras foram
separadas eletroforeticamente em gel de SDS-PAGE a 12% protegido da luz. Após a corrida,
o gel foi visualizado em transiluminador UV onde só são visíveis as proteínas que
incorporaram covalentemente o Bis-ANS. Depois de visualizado em UV, o gel foi corado
com Comassie Blue G250. A intensidade de proteínas que ligam Bis-ANS é a razão arbitrária
entre a área das bandas do gel excitado com luz UV e a área das bandas do gel corado com
Comassie Blue G250. Essa razão foi calculada com o uso do programa Image J. Como
controle, foram usadas amostras que sofreram todos os tratamentos descritos acima exceto o
tratamento com luz UV de 60 min.
63
9- Análises estatísticas
Todas as placas foram feitas em duplicata e cada experimento foi feito em triplicata.
Utilizando-se o programa Prism® (Graphpad Software, Inc, San Diego, EUA), foram feitos
os gráficos e o desvio padrão de três experimentos independentes está representado por barras
de erro. O teste estatístico empregado foi o teste t.
64
RESULTADOS
1- Células contendo o prion [PSI+] são mais tolerantes ao choque térmico que
células [psi-]
Experimento comparando-se a termotolerância [PSI+] e [psi-] já haviam sido descritos na
literatura (EAGLESTONE et al., 1999). Inicialmente, comparamos essa mesma resposta
utilizando a cepa BSC783/4a cedida pelo Dr Tuite. A Figura 4 mostra que células de
leveduras [PSI+] quando pré-tratadas por 60 min a 37 ºC se tornam mais resistentes ao
estresse subseqüente a 50 ºC por 20 min que células normais [psi-]. Esses resultados estão de
acordo com dados descritos anteriormente, onde maior termotolerância também foi observada
para células [PSI+] (EAGLESTONE et al., 1999). Nós também observamos que sem prétratamento, as cepas [PSI+] e [psi-] exibem tolerância similar ao estresse térmico (Figura 4).
Esses resultados sugerem que as células [PSI+] montam uma resposta diferente comparada às
células [psi-], quando estressadas com calor. Os próximos experimentos buscaram revelar que
diferenças são essas e como elas são controladas.
Sobrevivência celular
1
(células.ml- )
10 8
10 7
[PSI+ ]
10 6
[psi-]
10 5
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
28 ºC
50 ºC
37 ºC 60' 50 ºC
Figura 4. Sensibilidade ao estresse térmico de células [PSI+] e [psi-]. As células de levedura
foram crescidas em meio rico até a primeira fase exponencial (1 X 107 células.ml-1) e submetidas
ao estresse a 50 ºC por 20 min com ou sem pré-condicionamento a 37 ºC por 60 minutos. Células
que não sofreram nenhum estresse (28 ºC) foram usadas como controle.
2- A síntese de trealose durante o choque térmico é mais rápida em células [PSI+]
65
A síntese de trealose durante o choque térmico é uma característica muito importante
devido ao papel desse dissacarídeo durante e após o choque térmico (SINGER &
LINDQUIST, 1998b). Até o presente, nenhum estudo havia correlacionado a maior
termotolerância de células [PSI+] a esse dissacarídeo. Com o objetivo de observar se a síntese
de trealose se encontrava alterada durante o choque térmico em leveduras contendo o prion,
foi feita a cinética de exposição a 37 ºC, onde em diferentes intervalos de tempo os níveis de
trealose foram quantificados (Figura 5). Observamos que as células [PSI+] sintetizam e
degradam mais rapidamente a trealose que células [psi-]. Esse comportamento foi mantido
quando analisamos a cinética de transcrição do gene TPS1, gene que codifica para a enzima
trealose sintase 1, responsável pelo início da síntese de trealose em leveduras (Figuras 6A,
6C). Esses dados mostram que, para trealose, as células priônicas possuem um metabolismo
mais rápido, dependente de ativação transcripcional, quando comparadas às células normais
Trealose
(μg glicose/107 células)
[psi-].
1.00
[PSI+ ]
[psi-]
0.75
0.50
0.25
0.00
0
30
60
90
120
150
Tempo em 37 °C (min)
Figura 5. Cinética de síntese e degradação de trealose durante a exposição de S. cerevisiae a
37 ºC. Células de levedura em primeira fase exponencial (1 X 107 células.ml-1) crescendo a 28 ºC
foram transferidas para 37 ºC e alíquotas foram recolhidas nos intervalos de tempo 0, 30, 60 e 120
min para a dosagem de trealose intracelular.
3- A rápida resposta transcripcional das células [PSI+] não é exclusiva para o gene
TPS1
Decidimos verificar se o aumento da expressão do gene TPS1 também seria observado
para outros genes correlacionados ao choque térmico. Escolhemos o gene HSP12, um
importante marcador de resposta trascripcional ao choque térmico (VARELA et al., 1995).
66
Interessantemente, observamos o mesmo perfil de indução de HSP12 observado para TPS1,
nas células [PSI+], ou seja, o gene foi rapidamente ativado em resposta ao choque térmico
(Figura 6). TPS1 e HSP12 possuem em comum a presença de seqüências STRE em sua região
up stream, onde se ligam os fatores de transcrição Msn2/4. Com o objetivo de avaliar se a
resposta que observamos para TPS1 e HSP12 poderia ser uma resposta ainda mais geral,
transformamos células [PSI+] e [psi-] com a construção contendo a enzima β-galactosidase
sobre o controle do promotor STRE (BOY-MARCOTTE et al., 1998). Isso permitiu a análise
indireta da atividade dos fatores Msn2/4.
B
2.5
2.5
2.0
2.0
[PSI+]
[psi-]
1.5
1.5
1.0
1.0
TPS1
0.5
0
10
20
Tempo em 37 °C (min)
C
HSP12
30
0
10
20
Tempo em 37 °C (min)
30
0.5
RNAm HSP12/ACT1
RNAm TPS1/ACT1
A
0.0
Tempo de incuba ção das células à 37 ºC (min)
0
3
5
10
30
0
3
5
10
30
TPS1
HSP12
ACT1
[PSI+]
[psi-]
Figura 6. Perfil de expressão gênica de células [PSI+] e [psi-] expostas ao choque térmico de
37 ºC. Células em primeira fase exponencial foram incubadas a 37 ºC e alíquotas em diferentes
intervalos de tempo foram retiradas para análise da indução gênica de TPS1 (A) e HSP12 (B)
Como controle foi usado o gene ACT1. Os gráficos foram construídos através da quantificação
densitométrica da Figura (C). Cada tempo de incubação a 37 ºC é representado por três bandas,
que são produtos de RT-PCR semi-quantitativo nos ciclos 24, 30 e 36.
Como observado na Figura 7A, células [PSI+] ativam Msn2/4 com maior velocidade e em
maior proporção que células [psi-]. Isso indica que existe a ativação global de Msn2/4 mais
robusta em células [PSI+] que poderia explicar sua maior resistência ao estresse de choque
67
térmico. Essa observação não havia sido descrita anteriormente e explicaria o fenótipo de
maior termotolerância observado para células [PSI+].
Outro fator de transcrição crucial na resposta celular ao choque térmico é o fator Hsf1. A
fim de determinar a atividade de Hsf1, usamos a mesma estratégia usada para avaliar Msn2/4.
As células [PSI+] e [psi-] foram transformadas com um gene reporter similar ao usando
anteriormente. A diferença se encontra em sua região promotora que onde a região STRE foi
substituída pela região HSE, região onde Hsf1 se liga. As células transformadas foram
incubadas a 37 ºC e a atividade de β-galactosidase foi avaliada em diferentes intervalos de
tempo. Surpreendentemente, observamos o contrário do observado para Msn2/4: células
priônicas exibiram a ativação menor de Hsf1 e não houve uma diferença estatisticamente
significativa na cinética entre as duas cepas (Figura 7B).
80
B
STRE-βGal
60
[psi-]
40
20
0
[PSI+]
0
30
60
90
120
150
Atividade de β-Gal (mU)
Atividade de β-Gal (mU)
A
Tempo em 37 ºC (min)
70
60
50
40
30
20
10
0
HSE-βGal
0
30
60
90
120
150
Tempo em 37 ºC (min)
Figura 7. Atividade dos fatores de transcrição Msn2/4 e Hsf1 em células [PSI+] e [psi-]
submetidas ao choque térmico. As cinéticas de indução dos fatores Msn2/4 (A) e Hsf1 (B) foram
avaliadas submetendo as células ao choque térmico a 37 ºC e dosando a atividade da enzima βgalactosidase (βGal). A síntese de βGal é condicionada à ativação dos fatores de transcrição
estudados, pois sua região promotora foi posta sobre o controle de STRE (A) e HSE (B), regiões
no DNA de ligação de Msn2/4 e Hsf1, respectivamente.
4- Os fatores Msn2/4 são essenciais na maior termo-tolerância observada para as
células [PSI+]
Os dados até agora apresentados sugerem que os fatores de transcrição Msn2/4 são os
principais responsáveis pela maior resistência ao calor observada para as células [PSI+]. Uma
maneira de tornar essa evidência mais sólida seria remover esses fatores e observar o
comportamento das células estudadas frente ao calor. Como são fatores homólogos, é
68
necessária a remoção de ambos os fatores. Construímos as cepas [PSI+] e [psi-] Δmsn2/4 e
submetemos essas cepas aos mesmos tratamentos realizados anteriormente com as cepas
selvagens (Figura 4). Observamos que as células sem Msn2/4 foram muito mais sensíveis ao
choque térmico a 50 ºC que suas respectivas parentais selvagens (comparar a Figura 4 com a
Figura 8). Esse dado já era esperado (BOY-MARCOTTE et al., 1999) e mostra a importância
desses fatores para a termo-proteção. Quando pré-tratamos as células [PSI+] e [psi-] Δmsn2/4
a 37 ºC por 60 minutos e depois as submetemos a 50 ºC por 20 minutos, observamos que as
duas células foram capazes de adquirir termo-tolerância. Entretanto, as células [PSI+] se
comportam como as células [psi-], deixando de exibir maior resistência, como observado nas
células selvagens, onde havia expressão de Msn2/4 (Figura 4). O fato das cepas [PSI+] e [psi-]
Δmsn2/4 adquirirem termo-tolerância após o tratamento a 37ºC não é uma surpresa, pois
outras cepas já mostraram o mesmo comportamento (BOY-MARCOTTE et al., 1999), que
pode ser explicado pela ação de outros fatores (por exemplo, Hsf1) capazes de proteger as
células contra o insulto térmico. O que nós observamos de interessante foi à perda da
vantagem apresentada por células priônicas na ausência de Msn2/4, confirmando que esses
fatores são os responsáveis pela maior resistência das células [PSI+] ao choque térmico
(Figura 8). É importante ressaltar que, as células [PSI+] e [psi-], após a deleção, mantiveram
seus fenótipos priônico e não priônico, respectivamente, como evidenciado pela coloração das
colônias cultivadas em meio contendo pouca adenina (dados não apresentados).
Sobrevivência celular
(células.ml-1)
10 8
Δmsn2/4
10 7
[PSI+ ]
[psi-]
10 6
10 5
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
28 ºC
50 ºC
37 ºC 60' 50 ºC
Figura 8. Sensibilidade ao estresse térmico de células [PSI+] e [psi-] desprovidas dos genes
MSN2 e MSN4. As células de levedura foram crescidas em meio rico até a primeira fase
exponencial (1 X 107 células.ml-1) e submetidas ao estresse térmico a 50 ºC por 20 min com ou
sem pré-condicionamento a 37 ºC por 60 min. O crescimento de células não submetidas ao
estresse térmico (28 ºC) foi usado como controle.
69
5- Células [PSI+] acumulam mais proteínas mal enoveladas que células [psi-]
Com o intuito de verificar se células [PSI+] produzem excesso de proteínas mal
enoveladas quando comparadas com células normais, foi adaptado um protocolo capaz de
comparar de maneira global a proporção de proteínas mal enovelas no organismo. Esse
protocolo consiste na extração total das proteínas celulares e a incorporação covalente através
de luz UV da sonda Bis-ANS, uma sonda fluorescente que se liga às regiões hidrofóbicas das
proteínas. Bis-ANS é muito usado no estudo de proteínas purificadas in vitro por revelar
intermediários protéicos com alta exposição de bolsões hidrofóbicos (TAKASHI et al., 1977).
A Figura 9B mostra o gel de SDS-PAGE excitado com luz UV onde apenas proteínas que
incorporam a sonda Bis-ANS são capazes de emitir fluorescência. Observamos que o extrato
protéico de células [PSI+] crescidas a 28 ºC liga significativamente mais Bis-ANS que o
extrato de células normais (comparar linha 5 com linha 3, Figura 9B e Figura 9C). Como
controle, usamos extratos protéicos incubados com Bis-ANS, não tratados com luz UV, que
promove a ligação covalente da sonda às proteínas mal enoveladas. (linhas 2 e 4, Figura 9B)
Nesse caso, não observamos nenhuma fluorescência do Bis-ANS, confirmando que a
fluorescência resultante é devido à incorporação covalente de Bis-ANS nas proteínas. É
importante notar que, a diferença observada nas células [PSI+] não é resultado da maior
ligação a Bis-ANS aos próprios agregados de Sup35, já que a marcação é uniformemente
aumentada, mesmo em proteínas com menos de 75 kDa (peso molecular de Sup35) (Figura
9).
70
kDa
A
56
42
27
20
C
15
[psi -]
1
2
3
4
56
42
27
20
5
p<0,005
B
[PSI+]
0.0
0.2
0.4
*
0.6
0.8
1.0
1.2
Intesidade Bis-ANS/
Intensidade Comassie (u.a.)
15
Figura 9. Análise de proteínas totais mal enoveladas através de marcação com a sonda BisANS. SDS-PAGE de extrato bruto total de proteínas corado com Comassie Blue (A) ou
excitado com UV, onde apenas proteínas que incorporaram Bis-ANS fluorescem (B). Os números
à esquerda de ambos os géis correspondem à massa molecular em kDa do padrão de peso
molecular aplicado na linha 1. As linhas 2 e 4 correspondem ao extrato protéico obtido das células
[PSI+] e [psi-], respectivamente, onde o Bis-ANS não foi incorporado às proteínas, mostrando que
não existe fluorescência intrínseca nas proteínas analisadas. Nas linhas 3 e 5, os extratos foram
ligados covalentemente ao Bis-ANS e correspondem ao extrato protéico das células [PSI+] e [psi-],
respectivamente. (C) Média total das proteínas mal enoveladas feita a partir da intensidade das
bandas do gel B dividido pelo gel A. Células [PSI+] acumulam, em média, mais proteínas mal
enoveladas que células [psi-].
71
DISCUSSÃO
Prions, assim como agregados amilóides, foram até uma década atrás, considerados
exclusivamente patogênicos. Entretanto, vários exemplos de prion e agregados amilóides
fisiológicos vêem surgindo nos últimos anos (FOWLER et al., 2006). Como qualquer
proteína tem a capacidade de agregar de forma amilóide (DOBSON, 2003), acredita-se que
evolutivamente algumas proteínas foram selecionadas para este fim e, na forma amilóide, as
células levariam vantagem dessa conformação (FOWLER et al., 2006). É importante que as
células controlem finamente a entrada dessas proteínas no estado priônico. No caso de Sup35,
essa propriedade é tão regulada, que depende de fatores intrínsecos da própria proteína, como
a capacidade das sementes em formar agregados com a mesma identidade estrutural da fibra
mãe e de fatores extrínsecos a própria Sup35, como a dependência de outras proteínas,
particularmente as chaperonas (CHERNOFF, 2007). O envolvimento íntimo de algumas
proteínas relacionadas ao estresse como Hsp104, Hsp70 e Hsp40 na formação ou propagação
do prion, além do efeito na resposta celular ao estresse de leveduras priônicas, sugere uma
possível explicação para a conservação de domínios priônicos, como NM de Sup35, durante a
evolução (CHERNOFF, 2007).
A agregação de Sup35 gera nas células [PSI+] a diminuição de sua função em reconhecer
o códon de finalização de RNAm durante a tradução. Apesar disso, nós observamos que
células [PSI+] adquirem maior termo-tolerância que células [psi-] quando pré-tratadas com
temperaturas sub-letais (Figura 4). Essa diferença é determinada pela atividade diferenciada
dos fatores de transcrição ao estresse Msn2/4, que tornaram as células [PSI+] mais eficientes
em armar uma resposta contra a temperatura. Uma conseqüência disso foi à rápida indução de
síntese e degradação do dissacarídeo protetor trealose (Figura 5). É interessante notar que,
depois de 60 min de exposição a 37 ºC, não existe diferença estatística nos níveis de trealose
entre as cepas [PSI+] e [psi-]. Então, como explicar a maior tolerância de [PSI+] observada na
Figura 4, onde as células foram tratadas por 60 min a 37 ºC? Uma possibilidade pode estar na
dinâmica existente entre a síntese e a degradação de trealose em leveduras (SINGER &
LINDQUIST, 1998ab). Células de leveduras deletadas no gene TPS1 são mais sensíveis a
uma gama variada de estresses, pois são incapazes de produzir trealose. Entretanto, o mesmo
comportamento é observado em células deletadas no gene NTH1, gene que codifica para a
enzima trealase citoplasmática, responsável pela degradação da trealose, levando ao acúmulo
de trealose. Além disso, células tratadas a 37 ºC induzem a síntese dos genes TPS1 e NTH1,
72
ambos controlados por Msn2/4 (GASCH et al., 2000). Essa paradoxal indução de genes
relacionados à síntese e degradação de trealose ao mesmo tempo é chamada de ciclo fútil por
alguns autores (FRANÇOIS & PARROU, 2001). Existem evidências que esse ciclo não é
fútil, mas sim um mecanismo fino de controle de síntese e degradação no momento certo.
Durante a exposição a 37 ºC, as células acumulam trealose para proteger, principalmente, suas
membranas e proteínas contra a agregação. Entretanto, o desenovelamento de muitas
proteínas não pode ser evitado, e a presença de grandes quantidades de trealose após o
estresse, dificulta o trabalho de chaperonas (por exemplo, Hsp104) que tentam renaturar essas
proteínas desenoveladas. Desse modo, a remoção citoplasmática da trealose após o estresse é
tão importante quanto sua síntese antes do estresse severo. Uma possibilidade é que as células
[PSI+] possuam esse controle funcionando de forma mais ágil que células [psi-], levando essas
células a sofrerem menos com os efeitos tóxicos tardios do estresse térmico.
Acreditamos que os fatores Msn2/4 são determinantes na resposta diferenciada de células
[PSI+] ao calor, pois eles são mais induzidos nessas células (Figura 7A) e sua ausência as
torna tão sensíveis quanto células [psi-] (Figura 8). Um resultado curioso foi a menor ativação
de Hsf1 em células [PSI+] comparadas às células [psi-] (Figura 7B). Entretanto, quando
avaliamos a indução do gene HSP12, observamos o mesmo perfil de indução mais rápida nas
cepas [PSI+] (similar ao observado para TPS1) (Figura 6). Enquanto TPS1 possui apenas a
seqüência STRE em seu promotor, HSP12 possui STRE e HSE, ou seja, HSP12 é controlado
tanto por Msn2/4 quanto por Hsf1. Isso sugere que, ao menos para HSP12, a importância dos
fatores Msn2/4 seja maior que Hsf1 na indução gênica diferenciada de células priônicas
(comparar Figura 6A com Figura 6B). Além disso, a ação de Hsf1 parece estar mais
relacionada ao pré-condicionamento em temperaturas maiores (39 a 42 ºC), enquanto Msn2/4
em temperaturas mais brandas (35 a 38 ºC) (PARROU et al., 1997), como as utilizadas em
nossos experimentos. Uma outra possibilidade é o efeito causado pelos erros das células
[PSI+] na estrutura/atividade dos próprios fatores de transcrição Hsf1 e Msn2/4. Como
descrito anteriormente, a atividade de Hsf1 é extremamente dependente de sua conformação,
oligomerização e fosforilação, o que pode explicar, em parte, sua menor atividade em células
[PSI+].
73
ATP
Cdc25
Crescimento
Cyr1
Hsp70
AMPc
PKA
Condição ótima
Msn2/4
ATP
Cdc25
Resposta ao
estresse
Crescimento
PKA
Cyr1
AMPc
Hsp70
Condição de estresse
[PSI+]
Msn2/4
Prion
[psi-]
Resposta ao
estresse
Normal
Figura 10. Modelo esquemático da sinalização celular em resposta ao estresse em leveduras
[PSI+]. Em condições ótimas de crescimento, as proteínas (círculos negros) se encontram bem
enoveladas, a concentração de AMPc se encontra elevada e a célula direciona seu metabolismo
para o crescimento. Em condições onde ocorre desenovelamento protéico, como por exemplo, o
choque térmico, parte das proteínas desenoveladas recrutam a proteína Hsp70 sinalizando para a
diminuição intracelular de AMPc e conseqüente parada no crescimento. Simultaneamente, a célula
arma uma resposta para se defender contra o estresse. Em células [PSI+], devido aos constantes
erros na tradução do RNAm causado pela agregação de Sup35, as células produzem a quantidade
aumentada de proteínas mal enoveladas (círculos negros com extensão em vermelho) que podem
fazer com que as células respondam de forma mais ágil ao estresse térmico.
Os erros na tradução do RNAm em células [PSI+] podem gerar proteínas com C terminal
estendido, que podem gerar proteínas com atividade diferenciada. Por outro lado, algumas
proteínas podem ter dificuldade em seu enovelamento, pois esses peptídeos extras não foram
selecionados pela evolução para estar na seqüência nativa dessas proteínas. Tal fato gerar o
excesso de proteínas mal enoveladas. A constante produção de proteínas mal enoveladas pode
tornar a célula mais responsiva quando expostas a uma situação de estresse (Figura 10). De
fato, nós observamos que células [PSI+] acumulam mais proteínas mal enoveladas que células
74
normais (Figura 9). O modelo atual que postula como as leveduras controlam a indução de
Msn2/4 está apresentado na Figura 10. Células em condições ótimas direcionam seu
metabolismo à divisão celular. O controle central dessas vias é exercido pela proteína cinase
A dependente de AMPc (PKA) (Figura 10). Altas concentrações de AMPc ativam PKA que
fosforila Msn2/4 inativando-os e, ao mesmo tempo, ativa diversas proteínas responsáveis pelo
crescimento celular (ESTRUCH, 2000). Os níveis de AMPc celular são finamente controlados
através de sua síntese, realizada pela adenilato ciclase, ou degradação, realizada por
fosfodiesterases. É proposto que Cdc25 interage fisicamente com a chaperona Ssa1
(pertencente à família das HSPs 70) modulando a atividade da guanilato ciclase. Quando
juntas, Cdc25 e Ssa1 ativam indiretamente a guanilato ciclase Cyr1, levando ao aumento de
AMPc e conseqüente inibição de Msn2/4 (GEYMONAT et al., 1998). Entretanto, quando as
células são estressadas, parte de Ssa1 é recrutada por proteínas citoplasmáticas que estão
desenoveladas e isso reduz a quantidade de Ssa1 disponível para interagir com Cdc25 levando
a diminuição nos níveis de AMPc e conseqüente ativação de Msn2/4 (Figura 10). Esse
termômetro celular pode estar mais afinado em células que experimentam constantes níveis de
proteínas mal enoveladas no citoplasma, no caso células [PSI+], fazendo com que estas células
respondam de maneira mais efetiva ao choque térmico (Figura 10).
Se células [PSI+] possuem níveis basais aumentados de proteínas mal enoveladas (Figura
9), capazes de ativar todo o sistema descrito na Figura 10, seria de se esperar que essas células
expressassem
de
maneira
constitutiva
altos
níveis
de
trealose,
chaperonas
e,
consequentemente, fossem mais resistentes ao choque a 50 ºC sem pré-condicionamento a 37
ºC. Entretanto, não foi isso o observado nas células [PSI+] (Figuras 4, 5 e 6). Obviamente, o
cenário é muito mais complexo do que se imagina. Um exemplo dessa complexidade é
mostrado no trabalho de Namy e colaboradores (NAMY et al., 2002). Nesse trabalho, é
explorada a capacidade das células em reconhecer de forma diferente (até 100 vezes) a
presença de códons de finalização no RNAm, dependendo dos nucleotídeos vizinhos ao códon
de finalização. Isso significa que, mesmo em células normais, existe uma taxa de erros no
reconhecimento de códons de finalização e isso depende apenas da estrutura do RNAm no
qual ele esta inserido. Usando ferramentas de bioinformática, esses pesquisadores
encontraram diversos genes onde o códon de finalização tem grande potencial de não ser bem
reconhecido, destacando-se o gene PDE2. Esse gene codifica para a principal fosfodiesterase
de leveduras. A taxa de leituras erradas de PDE2 aumentou 22 vezes em células [PSI+],
levando ao aumento intracelular de AMPc nessas células. Esses altos níveis de AMPc pode
75
compensar os efeitos causados pelo acúmulo de proteínas mal enoveladas em [PSI+], tornando
essas células tão sensíveis a 50 ºC (sem pré-condionamento a 37 ºC) quanto células normais.
Existe uma complexa e intricada relação entre a presença de agregados amilóides, a
atividade de chaperonas e a resposta celular ao estresse. Recentemente, foi demonstrado que a
presença de mutações que desestabilizam proteínas nativas leva ao surgimento de outros
agregados patológicos como agregados da proteína relacionada com a doença de Huntington
(GIDALEVITZ et al., 2006). Em leveduras, mutações em genes importantes para a resposta
ao estresse (incluindo MSN2) aumentam a taxa de aparecimento de células [PSI+]
(TYEDMERS et al., 2008). Sugere-se que, em condições de estresse, o sistema de controle de
enovelamento celular fique saturado, permitindo o surgimento de agregados amilóides. Resta
saber o que realmente é importante para o bem estar celular e o que não passa de especulação.
Nesse sentido, os dados aqui reportados apontam os fatores de transcrição Msn2/4 como
elementos chaves que parecem estar envolvidos de alguma forma na termotolerância das
células [PSI+]. Os dados aqui apresentados serão brevemente resumidos na forma de
manuscrito e submetidos à publicação.
76
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
• Observamos que cepas com o fenótipo [PSI+] são mais resistentes ao choque térmico
que cepas [psi-]. Essa maior resistência foi dependente dos fatores de transcrição Msn2/4.
A fim de tornar esse dado mais sólido, seria interessante realizar as curvas de dosagem de
trealose e quantificação de HSP12 e TPS1 nas cepas Δmsn2/4 e analisar se a resposta
diferenciada das cepas [PSI+] se torna mais similar às células [psi-].
• Nós focamos nosso estudo na indução de apenas dois genes relacionados ao estresse.
Pretendemos no futuro, realizar experimentos de microarranjo nas células [PSI+] e [psi-]
submetidas ou não a temperatura de 37 ºC, sendo que o ideal seria realizar uma cinética
similar à apresentada para os genes HSP12 e TPS1.
• Quando ativados, Msn2/4 migram para o núcleo e ativam a transcrição de vários genes
relacionados ao estresse. Trabalhos recentes mostraram que depois de ativados, Msn2/4
entram e saem do núcleo de uma forma sincronizada e pulsante (CAI et al., 2008). Seria
interessante avaliar se esse perfil de transição entre o núcleo e citoplasma é diferenciado
nas células [PSI+]. Esses experimentos poderiam ser feitos através de microscopia de
fluorescência em tempo real e/ou espectroscopia de correlação de fluorescência, usando
cepas [PSI+] e [psi-] contendo o fator Msn2 conjugado com GFP. Essas cepas já foram
construídas em nosso laboratório e pretendemos realizar esses experimentos no futuro.
• Nós sugerimos que os fenótipos diferenciados em relação ao choque térmico são
devido à diminuição da função de Sup35 nas células [PSI+]. Uma outra possibilidade é a
de que esses fenótipos sejam causados pela presença dos agregados de Sup35.
Acreditamos que a maior resistência de células [PSI+] seja devido ao maior erro na
tradução dos códons de terminação. Já foi mostrado que uma cepa com uma mutação em
Sup35 que compromete sua função sem a necessidade da agregação de Sup35 leva ao
mesmo fenótipo de resistência ao calor das células [PSI+] (EAGLESTONE et al., 1999).
Nós possuímos essa cepa e pretendemos confirmar nossa hipótese através do seu uso.
Também pretendemos verificar se a resistência observada para a cepa BSC783-4a se
estende para outras cepas de levedura com e sem prion.
PARTE II
Os resultados apresentados nesse manuscrito mostram que a agregação de Sup35NM ocorre
através do mecanismo de nucleação seguido de extensão. Quando a agregação é realizada em
temperaturas diferentes (como por exemplo, 4 e 25 ºC), observamos que apenas a fase de
extensão mostrou-se sensível a temperatura. Através do uso da mutação F117W, observamos que
essa posição de Sup35NM é internalizada antes da formação das fibras amilóides, o que nos
permitiu caracterizar melhor os núcleos de Sup35NM. Esses núcleos foram capazes de “quebrar”
a fase lag da agregação de Sup35NM, porém incapazes de levar a informação estrutural relativa à
sua condição de formação para fibras crescidas de novo. Esse manuscrito foi aceito para
publicação no periódico Biochemistry e encontra-se em fase de correções.
A Fluorescent Mutant of the NM-domain of the Yeast Prion Sup35 Provides Insight Into
Fibril Formation and Stability†
†
This work was supported by grants from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de
Janeiro (FAPERJ), Millennium Institute for Structural Biology in Biomedicina and
Biotechnology (CNPq Millennium Program), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) to DF.
Fernando L. Palhano‡, Cristiane B. Rocha‡, Alexandre Bernardino§, Gilberto Weissmuller§,
Claudio A. Masuda‡, Mónica Montero-Lomelí‡, André Marco Gomes‡, Peter Chien║, Patrícia M.
B. Fernandes⊥ and Debora Foguel‡*
‡
Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Biologia Estrutural e Programa de Biologia
Molecular e Biotecnologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 21941-590,
Brazil, §Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro, 21941-590, Brazil, ║Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology,
Cambridge, Massachusetts 02139, ⊥Núcleo de Biotecnologia, Universidade Federal do Espírito
Santo, Vitória, ES 29040-090, Brazil.
*Correspondence should be addressed to Debora Foguel: email: [email protected]
Phone: (55-21) 2562-6761 Fax: (55-21) 2270-8647.
Running Title: Trp fluorescence unravels the effects of temperature on NM aggregation
Abbreviations: AFM, atomic force microscopy; CD, circular dichroism; FCS, Fluorescence
Correlation
Spectroscopy;
FITC,
fluorescein
isothiocyanate;
GdmCl,
guanidinium
hydrochloride; HHP, high hydrostatic pressure; LS, light scattering; Phe, phenylalanine; thio-T,
thioflavin T; Trp, tryptophan; YPD, Yeast Peptone and Dextrose medium.
ABSTRACT
The Sup35 protein of Saccharomyces cerevisiae forms a prion that generates the [PSI+]
phenotype. Its NM region governs prion status, forming self-seeding amyloid fibers in vivo and
in vitro. A tryptophan mutant of Sup35 (NMF117W) was used to probe its aggregation. Four
indicators of aggregation - Trp117 maximum emission, Trp polarization, thio-T binding, and
light scattering increase - revealed faster aggregation at 4oC than at 25oC, and at 4oC all
indicators changed in a concerted fashion. Curiously, at 25oC the changes were not
synchronized: the first two indicators, which reflect nucleation, changed faster than the last two,
which reflect fibril formation. These results suggest that nucleation is not sensitive to
temperature, whereas fibril extension is. Small amounts (5%) of the nuclei produced at 4o or
25oC added to a suspension containing the soluble NM domain accelerated the aggregation, as
expected, but unlike seeds, they were not able to propagate any structural information; which
seems to be formed at a later stage of aggregation. The 4oC-grown fibrils were less stable than
25oC-grown fibrils against GdmCl. However, they were both resistant to high pressure, and
adopted an altered conformation under pressure that bound more thio-T. From these data, we
calculated the change in volume and free energy associated with this conformational change.
AFM revealed that the fibrils grown at 4oC were statistically smaller than those grown at 25oC.
In conclusion, the introduction of Trp117 allowed us to dissect more deeply the effects of
temperature on the aggregation of Sup35 NM domain.
Protein misfolding and aggregation have been implicated in several human and animal
diseases, such as Alzheimer´s, Parkinson´s, and prion diseases (1). Among them, prion disease is
the only one that is transmissible: the aggregates are infectious units that are able to recruit the
soluble, cellular proteins of the host organism (2). This phenomenon was discovered during the
study of the transmissible spongiform encephalopathies of mammals (2) but was later also found
to occur in fungi with certain epigenetically inherited traits (3). Saccharomyces cerevisiae
encodes at least six different proteins - Sup35, Ure2, Rnq1, Swi1, Mca1 and Cyc8 - that can form
transmissible aggregates that cause a non-Mendelian pattern of inherence during mating and
division (4, 5, 6, 7).
The S. cerevisiae prion [PSI+] causes translational read-through of stop codons and is
detected by the suppression of nonsense mutations (8). The [PSI+] state is caused by selfpropagating aggregates of the Sup35 protein, which is an essential translation termination factor
(4). As a consequence, [PSI+] cells that contain ade1-14, a nonsense mutation in ADE1, are able
to grow in media lacking adenine because of sufficient read-through of ade1-14. In contrast,
isogenic [psi-] cells require adenine supplementation and have a red color due to the
accumulation of a pigmented intermediate in adenine metabolism (9). The Sup35 protein has
three distinct regions. The first is an N-terminal domain (N, amino acids 1-124) that is
glutamine-asparagine-rich, has five imperfect nine-residue repeats, and is necessary and
sufficient for [PSI+] formation. The second is a highly charged middle region (M, amino acids
125-253). The third is a C-terminal domain (C, amino acids 254-686) that carries the translation
termination function (10). N and M region govern prion status.
In the few last years, the NM domain of Sup35 has been widely studied, first, to
understand its role in prion biology and, second, to use it as a model for the prion diseases
because it shares sequence similarity with the prion protein and a similar mechanism of
transmissibility (11). In vitro, the NM domain forms self-seeding amyloid fibers (10, 12). De
novo NM polymerization is characterized by a long lag phase, in which part of the protein
oligomerizes and converts to an amyloidogenic nucleus, followed by a cooperative, assembly
phase in which the soluble proteins rapidly associate with the mature nucleus and convert to
amyloid (13). The lag phase can be eliminated with the addition of preformed NM fibers or seeds
(13, 14).
Recently, studies performed by Lindquist´s group have shown that, during the initial
steps of NM fiber formation, the core of the fibril collapses into a non-amyloid solvent-protected
state that is thought to facilitate intermolecular head-head interactions. The molecule then enters
the amyloid state, and fibers grow by head-to-head and tail-to-tail additions to form a β-helical
structure (15). Contrary to this model, the crystal structure of a hepta-peptide derived from
Sup35 revealed an in-register parallel β-sheet organization in the amyloid fibril (16); this
structure has been recently reinforced with solid-state NMR studies on the NM domain (17).
Introduction of pure Sup35 fibrils into yeast cells causes a conversion to [PSI+] with
varying prion phenotypes (18, 19). When NM fibrils formed at 4 °C are introduced into [psi-]
cells, a strong [PSI+] phenotype is observed. When, however, NM fibrils formed at 25 °C are
introduced, they produced weak [PSI+] strains (19). In light of this result, it is thought that the
NM domain is able to produce distinct amyloid conformations, depending on the temperature at
which the fibrils were grown, which have distinct consequences for phenotype. Fibrils produced
at 4 °C are more fragile than those grown at 25 °C; this fragility can create additional terminal
ends that can more efficiently capture the soluble host proteins, potentially causing the stronger
phenotype observed in vivo (20).
Tryptophan (Trp) fluorescence has been used successfully to study protein folding,
association, and aggregation due to the high sensitivity of Trp emission to its local environment
(21-25). Here, we have constructed a mutant of the NM domain of Sup35, in which the
phenylalanine at position 117 is replaced by Trp (NMF117W). NM has no endogenous Trp
residues; position 117 was chosen because it lies in the transition zone between the N and M
domains, a region that has been implicated in Sup35 fibril polymorphism (15). We show that this
mutation does not compromise the in vitro or in vivo properties of the NM domain, allowing us
to use NMF117W for further studies. Aggregation was faster at 4 oC than at 25 oC, and at 4 oC all
four indicators of aggregation - shift in Trp 117 maximum emission, Trp polarization, thio-T
binding, and light scattering (LS) increase - changed in a concerted fashion. Curiously, at 25 oC
the changes in these four indicators did not occur at similar times: the first two indicators
changed faster than the last two. These data show that the spectroscopic changes associated with
Trp emission, which seem to reflect nucleus formation, are temperature independent and present
similar kinetics at 4 and 25 oC. Thio-T binding and LS increase, which reflect fibril formation,
however, were sensitive to the fibril growth temperature, being faster at 4 oC. We also
investigated the stability of the 4 and 25 oC-grown fibrils and we showed that the fibrils
produced at 4 oC were more unstable than the fibrils grown at 25 oC. Both fibrils were resistant
to high pressure, assuming an altered conformation that binds more thio-T. AFM measurements
revealed that the fibrils grown at 4 oC were statistically smaller than those grown at 25 oC.
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Materials- Oligonucleotides were obtained from DNAgency; Taq polymerase, T4 DNA ligase
and restriction endonucleases were from Invitrogen. Thioflavin T and acrylamide were obtained
from Sigma. All others reagents were of analytical grade.
Plasmid construction - DNA manipulations were carried using standard procedures (26).
Genomic DNA of strain W303-1A (MATa ade2 his3 leu2 trp1 ura3) was used as a template to
amplify wild type (wt) Sup35NM by PCR with the following primers: forward 5´-C GCG GAT
CCG ATG TCG GAT TCA AAC CAA GG-3´ and reverse 5´-AGG GAG CTC ACC ACC AAA
CAT ATC GTT AAC-3´. The PCR was conducted with 30 cycles of heat denaturation at 94 °C
for 1 min, primer annealing at 53 °C for 1 min, and DNA chain extension at 72 °C for 3 min, and
a final extension at 72 °C for 10 min. The PCR products were purified from bands in 1% agarose
gels with QIAquick gel extraction kit (Qiagen). The DNA from Sup35NM wt was digested with
BamH I and Sac I and cloned into pBlueScript II for sequencing. Sup35NM was amplified from
pBlueScript II using primers that introduce a His tag at the C terminus (27). This product was
subcloned into Nde I/EcoR I sites of the T7 expression plasmid, pAEd4. The natural occurrence
of a unique EcoR V restriction site near the target position allowed us to create a new forward
primer 5´-G CAA GGA TAT CAA GCT GGT TGG CAA CCA CAG-3´ that harbors the
F117W mutation (bold) and EcoR V site. The DNA fragment containing the F117W mutation
was then created by PCR using the above forward primer and the same reverse primer that was
used for Sup35NM wt construction. This fragment was cloned into EcoR V/ Sac I sites of
Sup35NM wt pBlueScript II to create Sup35NM F117W pBlueScript II. Construction of the
mutated pAEd4 plasmid was carried out as described for Sup35NM wt (27).
Gene integration and replacement - Yeast strains expressing SUP35 with the F117W domain
were generated by replacing the wild-type chromosomal locus in the parental strain 74-D694
[PSI+] (MATα ade1-14 his3 leu2 trp1 ura3), as described previously (27, 28). The gene was
introduced by treating the cells with lithium acetate (29).
Protein expression and purification - Pure NMwt and NMF117W were prepared as described
previously (30). Briefly, cells were lysed by sonication in buffer A (20 mM Tris-HCl, 8 M urea,
pH 8.0). The lysate was cleared of debris by centrifugation at 30,000 x g for 20 min at 10 °C.
The supernatant was passed through an affinity column with Ni2+ (Chelating SepharoseTM,
Amershan) pre-equilibrated with buffer A. The column was washed with 5 column volumes of
buffer B (20 mM Tris-HCl, 8 M urea, 40 mM immidazole, pH 8.0) and eluted with buffer C (20
mM Tris-HCl, 8 M urea, 400 mM immidazole, pH 8.0). Pooled fractions were applied to a Q
Sepharose Fast Flow column (Pharmacia) pre-equilibrated with buffer C. The column was
washed with 5 bed volumes of 20 mM Tris-HCl, 8 M urea, 100 mM NaCl, pH 8.0 and eluted
with 300 mM NaCl in the same buffer. The pure protein was concentrated with a Centricon 5
kDa (Millipore) and filtered with a Centricon 100 kDa (Millipore). Protein concentration was
determined by UV absorption at 280 nm, using an extinction coefficient (ε) of 29,800 M-1 and
35,300 M-1 for wt and F117W, respectively.
Aggregation of Sup35NM - Concentrated NM solution was diluted at least 200-fold into
phosphate buffer (5 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4) to a concentration of 5
μM. Reactions were carried out at 4 or 25 °C under constant gentle agitation (60 rpm) with
micro-stir bars. In the experiments where nuclei were used to nucleate a fresh, soluble sample of
NMwt, samples were incubated for the indicated times (20 min) under aggregating conditions,
and then, 5% (w/w) of this solution was transferred to a fresh solution of NMwt (4.75 µM).
Aggregation was continued in the absence of agitation, either at 4 or 25 oC, as stated and
monitored by the Congo Red (CR) spectral-shift assay, as reported previously (30).
Limited proteolysis of Sup35NM fibrils - Fibrils were produced under agitation for 4 h at 4 or 25
o
C. Then, fibrils were centrifuged at 20,000 x g for 1 h at 10 °C re-suspended in phosphate buffer
and incubated with chymotrypsin (1/250, w/w) for 15 min at 25 °C (19). The reaction was
stopped by the addition of SDS and boiled for 10 min. The samples were separated on 12% SDSPAGE and stained with Coomasie Brilliant Blue R-250.
Characterization of NM assembly by SDS solubility. Non-fibrilar NM domain remains soluble in
2% (w/v) SDS, while the amyloid fibrils are insoluble in SDS at room temperature (30). Soluble
NM (5 μM) was stirred (60 rpm) at 25 or 4 °C. Then, aliquots (20 μL) were withdrawn along
time, incubated in the presence of 2% SDS at room temperature before running in a 12% SDSPAGE. As a control, fibrils grown at 4 or 25 oC during 150 min were produced, boiled for 10
min in the presence of 2% SDS before application in the gel. The gels were stained with
Coomassie Blue. The bands were quantified by Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Error bars
represent the S.D. of two measurements.
Spectroscopic measurements - All spectroscopic measurements were performed in an ISS
spectrofluorimeter (Champaign, IL) using slit widths of 1 nm for excitation and emission.
Scattered light (320 nm) was collected at an angle of 90 °C of the incident light by integrating
the intensity at 315-325 nm. The fluorescence emission of thioflavin-T (20 μM) was recorded
from 460 to 520 nm, with excitation at 450 nm.
Tryptophan emission was performed by exciting the samples at 295 nm to minimize fluorescence
contribution from the tyrosine residues and collecting the emission from 315 to 400 nm. The
average energy of the fluorescence emission spectra was measured by the center of spectral mass
<v>:
<v> = Σvi.Fi/ΣFi,
(1)
where Fi is the fluorescence emitted at wavelength vi. The extent of reaction (α) is related to
<vt> by the expression
α = (<vt> – <vi>)/(<vi> - <vf>)
(2)
where <vi> and <vf> are the initial and final values of center of spectral mass in nm,
respectively, while <vt> is the center of spectral mass at time t.
Fluorescence polarization - Fluorescence polarization was measured on an ISS-PC1
spectrofluorometer (ISS, Champaign, IL) and calculated from p = (I║-I┴)/(I║ + I┴), where
I║and I┴ are the intensities of the emission when the polarizers were oriented parallel or
perpendicular, respectively, to the polarizer of the exciting light. The samples were excited at
295 nm, and the filters WG335 and 7-54 were used in the emission.
Acrylamide quenching- Tryptophan fluorescence quenching experiments were performed with
NMF117W (5 µM) in the soluble and aggregated states (4 or 25 oC). Aliquots of a stock solution of
9 M acrylamide were added to the samples, which were diluted in 5 mM potassium phosphate,
150 mM NaCl, pH 7.4. Excitation was set at 295 nm and emission collected from at 315 to 400
nm. The spectra were corrected for blank and dilution effects. The data were analyzed using the
Stern–Volmer equation for collision quenching, F0/F=1+KSV [Q], where F0 and F are the initial
steady-state emission intensities at λmax in the absence and presence of acrylamide, [Q] is the
molar concentration of acrylamide, and KSV is the Stern–Volmer quenching constant (22).
Denaturation of fibrils by GdmCl - Preformed fibrils at 4 or 25 °C were centrifuged at 20,000 x g
for 1 h at 10 °C and re- suspended in phosphate buffer with increasing concentrations of GdmCl.
These suspensions were incubated at 25 °C for 2 h and then analyzed by thio-T binding and Trp
emission.
Circular dichroism - Circular dichroism (CD) measurements were performed in a Jasco-715
spectropolarimeter (Jasco Corporation, Tokyo, Japan) using a 1.0-mm path-length quartz cuvette
in 5 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4. NMwt at 5 µM was gently agitated (60
rpm) with micro-stir bars at 4 or 25 °C for 0, 15, 20, 25 min, and 4 h, and then their CD spectra
were recorded. The settings for wavelength scans were 1 nm bandwidth, 0.4 s response time, 100
nm min–1, and five accumulations. The baselines (buffer alone) were subtracted.
High pressure measurements - The high pressure cell (31) was purchased from ISS (Champaing,
IL). Fibrils at 5 µM grown at 4 or 25 °C were diluted in 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4
and subjected to increasing pressures at 25 °C in steps of 340 bar. Tris-HCl buffer was chosen
because its pKa does not change significantly under high pressure (32). At each pressure step, the
sample was allowed to equilibrate for 10 min prior to making measurements. No time-dependent
changes in fluorescence spectra were observed between 10 and 60 minutes. Fluorescence
emission of free thio-T is not influenced by high pressure.
Thermodynamic parameters - The standard volume change associated with fibril structure
perturbation induced by HHP (ΔVF1Æ F2) and the equilibrium constant (KF1Æ F2) associated with
this process was determined from the following thermodynamic relation:
ln [(αp)/(1-αp)] = p (ΔVF1Æ F2/RT) + ln KF1Æ F2,
(3)
where α is the extent of reaction, R is the gas constant, and T the temperature in K at which the
experiment was performed.
Atomic force microscopy images - The fibrils or oligomers were diluted to 1 µM in phosphate
buffer and then placed directly onto freshly cleaved mica for 10 min in a volume of 50 μl. Then,
the samples were washed five times with 200 μl of ultra pure water and air dried overnight.
Tapping-mode AFM in air was performed using an Asylum MFP-3D BIO AFM (Asylum
Research, Santa Barbara, CA). Olympus rectangular silicon cantilevers with resonance frequency
of 70 kHz and nominal spring constant of 2 N/m were used. Samples were imaged at scan rates
of 0.5-1.0 Hz, and 512 x 512 pixels were collected per image. At least three regions of each
surface were investigated to confirm homogeneity of the samples. Height measurements were
estimated by section analyses using IGOR PRO (Wavemetrics, OR) with at least 150 individual
fibrils from scan sizes of 2-5 μm. To measure topological height of the fiber, 25 μm2 of three
independent images were analyzed using a threshold of 3 nm. For each image, the program
analyzed ∼22,000 points. Each point corresponds to the touch of the tip in the surface of the
fibril.
Sample labeling and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) measurements. Soluble
NMwt at 1 mM was incubated with 4 mM FITC in phosphate buffer (5 mM potassium phosphate,
150 mM NaCl, 6M GdmCl, pH 7.4) for 90 min at 4 °C. Then, the free probe was removed by
extensive washing in a centricon (cut off 10 kDa) at 25 °C. The labeled protein was filtered in a
Centricon 100 kDa (Millipore). The labeling efficiency was estimated by measuring the
absorption at 494 nm (ε = 68,000 M-1) and 280 nm (ε = 29,800 M-1). The extent of labeling was
40% suggesting that, as expected, at pH 7.4 the N-terminus is preferentially labeled. Labeled
nuclei were produced by incubating 5 μM FITC-labeled NM under gentle stirring at 25 °C for 20
min in Tris buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4). After this time, the sample was
centrifuged at 20,000 x g for 15 min at 15 °C to remove any fibril present. Five % of these
labeled nuclei (w/w) were then transferred to a solution of soluble NM (4.75 μM) to produce
fibrils at 25 oC. FCS measurements were carried out in an ALBA Fluorescence Correlation
Spectrometer (ISS, Champaign, IL, USA) using a Nikon TE2000-U inverted microscope with a
two-photon excitation regime. A Ti:Sa Tsunami laser, pumped by a Millenia Pro 15sJ (Spectra
Physics, Mountain View, Ca, USA) was focused in the sample with a water immersion 63x
objective, 1.2 N.A. A wavelength of 780nm was used for FITC-labeled NM excitation.
Fluorescence was collected by the same lens and separated from excitation by a dichroic mirror
700dcxru (Chroma, VT, USA). After the dichroic the beam was split by a 50/50 beam splitter
and the resulting beams focused to two APD detectors. The fluctuations traces recorded were
processed in Vista ISS software for autocorrelation and fitting calculations. Autocorrelation
curves were fitted to a model function describing the free diffusion through a 3D Gaussian
excitation volume obtained by two-photon excitation. From the curves fittings the diffusion
times τD are obtained and diffusion coefficients calculated from the relation τD =ωo2/8D (33, 34).
Data processing - Each experiment was performed at least in triplicate, and the bars indicate the
standard deviation of each point. The data in Figure 6 were evaluated statistically with an
analysis of variance (ANOVA, Tukey's Multiple Comparison Test) (35) using the software
Prism® (Graphpad Software, Inc, San Diego, EUA).
RESULTS
Fibrillation properties of NM F117W in vivo and in vitro. The replacement of a phenylalanine
(Phe) with a tryptophan (Trp) at position 117 does not alter the biological properties of the NM
domain of Sup35 protein in vivo and in vitro (Supporting Information, Figure S1). The
replacement of a genomic copy of the gene encoding Sup35 in the yeast S. cerevisiae with one
encoding Sup35F117W in a [PSI+] strain does not abolish the [PSI+] trait, as indicated by the white
color of the cells plated on an YPD medium (Supporting Information, Figure S1A). In vitro
experiments show that the NMF117W forms fibrils at 4 and 25 °C at the same rate of wild type
protein as measured by thio-T binding (Supporting Information, Figure S1B), being faster at 4
°C (as previously shown for the NMwt) (13, 15). The t1/2 values (time required to achieve 50% of
aggregation) for NMF117W were 40 ± 3 min and 67 ± 3 min at 4 and 25 °C, respectively, which
are identical to those observed for NMwt (Table 1).
It has been shown that fibrils grown at 4 °C are more susceptible to proteolysis than those
grown at 25 °C; this finding suggests that there are differences in the packing and architecture of
fibrils grown at different temperatures (19). Again, the digestion pattern of the fibrils composed
of NMF117W was identical to that observed for wild type fibrils (Supporting Information, Figure
S1C and D). At last, we probed the ability of NMF117W seeds to nucleate its own aggregation as
well as that of NMwt. The addition of 5% NMwt seeds accelerated the conversion of soluble
NMF117W into amyloid fibrils at the same rate as NMF117W seeds (not shown). Similar results were
obtained using NMF117W to seed soluble NMwt protein (not shown), suggesting that the
substitution at position 117 does not alter the structural complementarities between NMwt and
NMF117W.
Taken together these initial observations suggest that the PheÆTrp substitution at
position 117 does not alter the in vivo or in vitro properties of the NM domain of Sup35 protein.
Monitoring the fibrillation properties of the NM domain by Trp-fluorescence emission and
polarization: the region around position 117 assumes its final position early in aggregation.
The presence of a Trp residue in the NM domain creates a new opportunity to investigate the
aggregation properties of this domain in vitro. Soluble NMF117W presents a center of spectral
mass of Trp emission that is completely red shifted (355 nm), suggesting, as expected, that Trp
117 is extensively exposed to the aqueous environment in the soluble protein (Figure 1A and
inset). The inset also shows the expected lack of emission by NMwt that is excited at 295 nm.
Upon fibril formation (Figure 1A), the center of spectral mass shifts 5 nm toward the blue (350
nm), indicating that, as aggregation proceeds, the region around Trp 117 moves from its
completely exposed position to a lesser exposed region. Although a shift of 5 nm is significant,
the value at 350 nm indicates that there is still some accessibility to water in this region. It has to
be emphasized that the spectroscopic properties of Trp 117 does not change when NMF117W is
heated up to 90 oC, what causes secondary structure gain but not its aggregation (36).
Fluorescence polarization measurements are suitable for measuring the formation of
molecular assemblies such as protein-DNA complexes, protein oligomers, or, as reported here,
fibril formation (Figure 1B) (37, 38). In the soluble state, the polarization value of NMF117W was
0.15; this value increased to 0.4 upon fibril formation (Figure 1B). The polarization value of Trp
117 in the soluble, monomeric state of NMF117W (0.15) is higher than expected, probably due to
the contribution of the global rotation of the protein and local motions of Trp 117. Again, there
were no significant differences in kinetics of aggregation at 4 or 25 °C. The t1/2 values at 4 and 25
°C were similar and equal to 27 ± 2 min and 22 ± 3 min, respectively (Figure 1B and Table 1).
Interestingly, when Trp fluorescence emission (center of spectral mass) was used as a
reporter of fibril formation, there was no difference in the fibrillation rates at 4 and 25 °C (Figure
1A), in contrast to data from thio-T binding (Figure 1C). By following Trp fluorescence, the t1/2
values observed were 27 ± 3 min at 4 °C and 24 ± 2 min at 25 °C, while by monitoring thio-T,
the t1/2 values were 40± 3 at 4 and 67± 3 min at 25 °C (Table 1). In addition, when SDS
resistance was used to report fibril formation, there was difference in fibrillation rates at 4 and 25
o
C (Figure 1D) and the profiles overlapped with that displayed by thio-T binding (Figures 1E and
F).
Figures 1E and F compare the extent of fibrillation (α) of NMF117W at 4 and 25 oC,
respectively, as followed by thio-T binding, light scattering increase, shift in the center of mass
of Trp emission, SDS-resistance and increase in polarization. When fibrillation was performed at
25 °C (Figure 1F), the changes in the center of mass of Trp emission and polarization occurred
before the changes in thio-T binding, SDS-resistance and light scattering. After 50 min of
aggregation at this temperature, almost all of the spectroscopic changes related to Trp 117 had
already occurred, while the changes in the fluorescence properties of thio-T and SDS-resistance,
fibril indicators, had changed only ~20%. Curiously, at 4 °C (Figure 1E), the changes in Trp 117
spectroscopy, thio-T binding, SDS-resistance and light scattering increase occurred in an almost
concerted fashion, leveling off at around 50-60 min (Table 1).
Taken together, these results suggest that very early in the aggregation process of the NM
domain, when the nucleus is formed (nucleation phase), the region around position 117 already
assumes its final position, regardless of the temperature employed during fibril formation. Next,
the growth of this nucleus into fibrils through the addition of soluble species (extension phase) is
temperature-dependent, occurring faster at 4 °C. Thus, the spectroscopic properties of Trp 117
allow us to determine the steps in the aggregation of the NM domain that are temperature
sensitive. The lag phase is temperature-independent, leading to the formation of a species that
does not yet bind thio-T but has the region around position 117 positioned in its final
environment that seems to be not completely buried (15, 39, 40). The exponential phase,
however, depends on the temperature, leading to the formation of mature fibrils that bind thio-T.
To gain additional insight about the accessibility of Trp 117 in the soluble versus
aggregated NM domain, acrylamide quenching was performed (41). Figure 2 shows the SternVolmer plots for the soluble and fibrillar forms of NMF117W grown at 4 or 25 °C, which were
used to determine the Stern-Volmer constants (KSV, slopes of the plots). The soluble protein has a
KSV of 12.38 ± 0.42 M-1, indicating, as expected, that Trp 117 is solvent-exposed. The KSV for the
25- and 4 °C -grown fibrils were much lower, being equal to 5.35 ± 0.27 and 7.18 ± 0.18 M-1,
respectively, and confirming the burial of Trp 117.
Are the nuclei elements of self-propagating structural information or is this property restricted
to the seeds? It has been shown that the addition of seeds obtained by fractionation of a
suspension of preformed fibrils can accelerate the fibrillation process of several amyloidogenic
proteins, including Sup35 (10, 42). In several cases, these seeds can also transfer structural
information to the next generation of growing fibrils (19, 39, 43) regardless of the experimental
conditions in which the daughter fibrils grow. Thus, these seeds catalyze the aggregation reaction
and propagate the structural information that was present in the fibrils from which they
originated. While these two functions are interrelated, they can be probed separately, as shown
below.
We wanted to test whether the nucleus that is formed in the lag phase of spontaneous
aggregation reactions already has structural information that could be passed to the next
generation of growing fibrils. In other words, we asked if the structural information is restricted
to seeds, which are small pieces of mature amyloid fibrils, or could be already be present in and
perpetuated by the nuclei.
In our first attempt to answer this question, NMwt was incubated under aggregating
conditions at 4 or 25 oC for 20 min (time span of the lag phase), and then 5% (w/w) of this
suspension was transferred to a solution containing fresh, soluble NMwt. Both, the “nucleated”
and the control solutions (no added nucleus) were allowed to aggregate in a quiescent condition
at 25 oC (Figure 3A) or at 4 oC (Figure 3B). As shown in Figure 3, the addition of a small
quantity of nuclei (hollowed symbols) considerably accelerated the aggregation reaction, as
detected by Congo Red binding. Since nuclei addition accelerates the reaction at a rate that
leveled off in less than 10 h, we could not detect any difference in the kinetics of aggregation at 4
or 25 oC when they were present (compare the curves with circles in panel A and B). This result
implies that the nuclei, as expected, are able to act as catalysts of the aggregation reaction, even
when present at low concentrations.
In order to confirm that the formed fibrils in the nucleated samples (hollowed symbols)
were being built from the added nuclei and not from new formed nuclei, we took advantage of
fluorescence correlation spectroscopy (FCS) technique. In FCS measurements, fluctuations arise
from the change of the small number of fluorescent molecules that diffuse freely through the
excitation volume. The autocorrelation function of the fluctuating signal provides information on
the diffusion time of the molecules and the average number of molecules occupying the
excitation volume. An increase in particle size, as expected for oligomerization and aggregation
processes, is observed as an increase in diffusion times and consequently as a shift of the
autocorrelation curves to the right (33, 44, 45).
To perform FCS measurements, the monomeric, soluble NM domain was labeled with
FITC, which was used to prepared FITC-labeled nuclei (20 min under aggregating condition).
Five % of these labeled nuclei were added to a soluble, unlabeled NM domain solution which
remained for 130 min under quiescent condition to see whether larger, labeled species would be
formed (fibrils). Figure 3C shows the normalized autocorrelation curves obtained for the FITClabeled monomeric NM domain (triangles), a solution with FITC-labeled nuclei (circles) and the
species obtained from the incubation of 5% FITC-labeled nuclei with 95% unlabeled NM
monomers (squares). As seen, labeled NM monomers show a relatively fast diffusion time with a
diffusion coefficient of approximately 90 μm2/s obtained by fitting the autocorrelation function
as described in experimental procedures section. The autocorrelation function of the FITClabeled nuclei shifts to longer times compatible with the larger size of these species. Indeed, the
average diffusion coefficient calculated for the nuclei was slower and equals to ~0.35 μm2/s,
confirming their larger size in relation to the monomer of NM. Interestingly, the species formed
when an aliquot of 5% of labeled-nuclei was added to a 95% solution of unlabeled monomers
presented an even larger shift in the autocorrelation function, suggesting that the added FITClabeled nuclei were used to construct the larger fibrils present. On the other hand, if the labeled
nuclei are kept for the same period of time in the absence of added monomers, no change in
particle size is observed and the correlation curve overlapped with that of the labeled-nuclei (not
shown). These results confirm that the nuclei are included in the larger aggregates formed by
recruitment of new monomers in solution.
Our next approach was to evaluate whether the nuclei, like seeds, could transfer structural
information to the next generation of growing fibrils. Fibril stability was probed with GdmCl
(Figure 3D), a suitable approach since the fibrils grown at 4 oC are weaker than those grown at
25 oC, allowing us to discriminate between them (see also Figure 5A). The approach we used
was to produce nuclei for 20 min at 4 or 25 oC. Then, 5% of these nuclei were added to fresh
solutions of NMwt (4.75 μM), which were incubated at 25 or 4 oC, respectively, during 50h under
quiescent condition (see the scheme at the bottom of Figure 3). As a control, two samples with 5
μM NMwt were let to aggregate for 50h at 4 or 25 oC without agitation. The fibrils were then
withdrawn and incubated in the presence of the varying concentrations of GdmCl (mentioned in
the abscissa of Figure 3D). Thio-T binding was used as an indicator of fibril integrity.
As seen in Figure 3D, the stability of the 25oC-grown fibrils seeded by nuclei produced at
4 oC was equal to that observed for the fibrils that remained at 25 oC for the entire time (compare
the curves in circles). The same was true for the inverse experiment, in which the nucleation was
performed at 25 oC and extension (50h) was performed at 4 oC (compare the curves in triangles).
The insets show AFM images of the species that accumulated during the first 20 min of
aggregation at 4°C; only spherical aggregates were seen, and no fibrils were detected. Together,
these data indicate that structural information present in the fibrils and in the seeds made from
them is not imprinted yet into the nuclei that are formed in the initial steps of the NM
aggregation.
In order to have additional insights whether the nuclei have already structural information
being able to self-propagate it, we produce nuclei with different ages (15, 20, and 25 min) at 4 or
25 oC. Then, the temperature of the solution was either left the same (filled symbols in Figure 4)
or switched from 4 to 25 oC or vice-versa (hollowed symbols in Figure 4). These solutions were
incubated with agitation for up to 4 h to complete fibril formation (see the experimental scheme
in the upper right position of Figure 4). The fibrils were then withdrawn and incubated in the
presence of the varying concentrations of GdmCl (mentioned in the abscissa of Figure 4) to
check their integrity by thio-T.
As seen in Figure 4A, the stability of the fibrils that were at 4 oC for 15 min before being
transferred to 25 oC (4 h, extension) was equal to that observed for the fibrils that remained at 25
o
C for the entire experiment (compare the curves in circles). The same was true for the inverse
experiment, in which the nucleation was performed at 25 oC and extension was performed at 4
o
C (compare the curves in triangles). The insets show AFM images of the species that
accumulated during the first 15 min of aggregation at 4°C; only spherical aggregates were seen,
and no fibrils were detected. Figure 4B presents the data from the experiment in which the nuclei
were produced during 20 min at 4 or 25 oC before the temperature switch. A similar result was
obtained for this experiment, although it was possible to see a slight difference in stability of
these fibrils. AFM images of the aggregates formed in the first 20 min of aggregation at 4 oC
show the absence of mature fibrils and the presence only of spherical aggregates (inset of panel
B). Even when more mature nuclei were used as seeds (25 min grown nuclei), similar results
were obtained (Figure 4C) reinforcing the idea that the nuclei are not able to self perpetuate their
structural information. However, AFM of these nuclei presented already some small fibrils
presents (not shown). To perform the experiment described in panel C, we centrifuged briefly the
solution before shifting the temperature and, as seen in the inset of panel C, only small,
reminiscent fibrils were present being the majority of the nuclei suspension composed of round
aggregates.
In order to confirm this result by using another approach, chymotrypsin resistance of the
fibrils was investigated (Figure 4 D and E). As seen, the fibrils grown for the entire period at 4
o
C presented a similar resistance against chymotrypsin as the fibrils grown at 4 oC in the
presence of nuclei grown for 25 min at 25 oC (compare the data with triangles). The same was
true for the fibrils grown at 25 oC (compare the data with circles), which as already shown
presented an enhanced resistance to chymotrypsin digestion (19).
In order to have insights on the secondary structure content of the nuclei formed at these
times of aggregation (15, 20 and 25 min) at 4 and 25 oC, circular dichroism (CD) was used
(Supporting Information, Figure S2A and B). It has to be emphasized that the spectra represent
the secondary structure content of the whole population of molecules present at the above time
points in the aggregation reaction, including any unfolded, soluble protein still present in the
solutions, which makes spectra interpretation somewhat tenuous. Nevertheless, early aggregates
or nuclei were found to have an increasing β-sheet content over the course of maturation while
still retaining a random coil structure (minimum close to 200 nm) that is absent from the mature
amyloid fibrils. Thus, the small oligomers or nuclei formed at 4 and 25 oC have similar
secondary structures, as seen in CD, and tertiary structure, as measured with Trp fluorescence,
and they are not able yet to self-propagate structural information.
Together, these data reinforce the idea that the structural information is not imprinted into
the nucleus (small oligomers) that is formed in the initial steps of the NM aggregation. Only
when fibrils were present (or in the presence of seeds) did we observe that structural information
conferred by the temperatures could be transferred to the growing fibrils (extension). These data
suggest that the self-perpetuating structure of the amyloid fibril of the NM domain seems to be
absent from the early aggregates that are formed in the initial steps of NM aggregation. The
structure of the nuclei formed at 4oC seems to be similar to that of the nucleus formed at 25 oC;
the differences in morphology described for fibrils grown at these two temperatures should be
obtained in later steps in the process of NM aggregation. These results are in accordance with
Petkova et al (2005) (46) who showed that, although quiescent fibrils of Aβ 1-40 are different
from the agitated fibrils in several aspects, including toxicity, early aggregates of both types had
similar toxicities, indicating a lack of self-perpetuating structural conformation at this stage of
aggregation.
Using Trp117 fluorescence emission to evaluate fibril stability: 4 °C- versus 25 °C - grownfibrils. To study the difference in stability of fibrils grown at 4 or 25 °C, we compared the
GdmCl-induced dissociation-denaturation profiles of the NMF117W fibrils (Figure 5A) by
measuring a decrease in thio-T binding (circles) and the red shift in the center of mass of Trp
emission (triangles). The data are expressed as extent of reaction (α), and the inset shows the raw
data of the center of spectral mass.
With thio-T fluorescence, we observed fibril dissociation at lower GdmCl concentrations
(circles) than when we assayed with Trp fluorescence (triangles), in which the red shifts were
found to vary from 350 to 355 nm (inset). The fibrils grown at 4 °C (GdmCl1/2 thio-T = 0.96 M
and GdmCl1/2trp = 1.9 M) were less resistant to GdmCl treatment than the fibrils produced at 25
°C (GdmCl1/2 for thio-T = 1.7 M and GdmCl1/2 for Trp = 2.7 M), a finding that is consistent with
the previous observation that fibrils grown at 4 °C are more disordered than those grown at 25 °C
(15, 19).
We also investigated the effects of high hydrostatic pressure (HHP) on fibrils of NMF117W
grown under different temperatures (Figures 5B and C). HHP is a physical tool to modulate
protein-solvent interactions through a volume change caused by elimination of void volumes and
hydration of amino acid groups (47). HHP was recently applied to evaluate amyloid stability,
using transthyretin and α-synuclein as models (48). When the fibrils grown at 25 oC (Figure 5B)
or 4 °C (Figure 5C) were subjected to HHP in the absence of GdmCl (circles), there was an
increase in thio-T binding, in contrast to the decrease that was observed in the dissociation
experiment with GdmCl. This result suggests that the amyloid structure is preserved under
pressure and perhaps assumes a distinct conformation that is able to accommodate more
molecules of thio-T. Curiously, the fibrils grown at 4 °C were even more capable of binding
thio-T under pressure than the 25 °C-grown fibrils, which suggests that their structures are
indeed different. Light scattering did not change under pressure, reinforcing the conclusion that
the fibrils are intact (not shown). Also, the center of spectral mass of Trp 117 was slightly red
shifted upon compression by 2 and 1.5 nm for the 4- and 25 °C-grown fibrils, respectively (not
shown). This slight red shift induced by pressure indicates that Trp117 is not as exposed in either
type of fibrils as in the soluble protein.
The ability to bind thio-T under pressure was gradually lost when increasing
concentrations of GdmCl were added to the pressure buffer (triangles and squares in Figures 5B
and C). This result was expected because the addition of 1-2 M GdmCl was already found to
produce some fibril dissociation (Figure 5A). It is important to note that, after returning to
atmospheric pressure, the thio-T binding property was recovered (isolated symbols in the left of
panels B and C), suggesting that the structural changes induced by HHP on fibril architecture are
reversible. Indeed, AFM images of these “after pressure” fibrils showed no differences in
morphology (not shown).
Taken together these data suggest that the amyloid fibril of the NM domain of Sup35
exists in two different states, which we designate here as F1 and F2. F2 is formed under pressure
and has an enhanced thio-T binding capacity. From the data in Figures 5B and C, we calculated
the volume and the free energy changes associated with this conversion (F1↔ F2) according to
equation 3 (Experimental Procedures – inset of Figure 5B). The volume changes in the
conversion of F1ÆF2 were 51 and 48 mL/mol, while the changes in free energy were 2.03 and
1.47 kcal/mol at 25 and 4 °C, respectively.
AFM reveals small but significant differences between the fibrils grown at 4 or 25 °C. We
have applied AFM quantitative-imaging analyses to the Sup35 fibrils grown at 25 oC (upper
images) and 4 °C (lower images). Representative images of surface-absorbed NMwt (left images)
and NMF117W (right images) fibrils that were acquired using non-contact AFM are shown in
Figures 6 A-D. The fibrils composed of NMF117W are indistinguishable from the NMwt fibrils in
terms of morphology, regardless of the temperature employed during aggregation.
As previously reported (15, 19), the core of the fibrils of an NM-domain that was grown
at 4 °C seems to be shorter than the one composed of fibrils that were grown at 25 oC
(encompassing residues 31-86 and 21-121, respectively). Thus, the fibril grown at 4 oC possesses
an additional extended segment that weakens its structural stability. These conclusions were
raised based on the behavior of different fluorescent probes attached to different points in the
sequence of the NM domain (15). We wondered if it would be possible to visualize this slight
difference in morphology by AFM, so we examined the height of the cross section of 150
individual fibrils of NMwt grown at 25 or 4 °C. The mean height of the fibrils grown at 25 °C
was 4.83 ± 0.58 nm (mean ± standard deviation, n = 150), whereas the mean for fibrils grown at
4 °C was 4.47 ± 0.45 nm (mean ± standard deviation, n = 150). This difference, while very small,
is significant (P<0.001 in Tukey test, Experimental Procedures). There are also consistent
differences in the Gaussian histograms of height distributions for the fibrils grown at 4 and at 25
o
C (Figures 6E and F). While the Gaussian distribution of 4 oC-grown fibrils is centered about
4.36 ± 0.41 nm, the height distribution for the 25 oC-grown fibrils is centered about 4.75 ± 0.59
nm. We also measured the topographical height, which allows the analysis of the whole image
rather than individual fibrils (49). Using this analysis, we quantified the height frequency above a
threshold of 3 nm. Figure 6G shows the consistent differences that we observed in the Gaussians
fits of the 25 and 4 °C fibrils after considering 66,000 points per sample.
DISCUSSION
We constructed an NM mutant of the Sup35 protein that introduced a tryptophan residue
at position 117, which we used to probe the aggregation process of this protein. This approach
takes advantage of the sensitivity of Trp to its surrounding environment, which can be monitored
with changes in spectroscopic behavior. The introduction of a Trp residue at position 117 of the
NM domain of Sup35 protein compromised neither its in vivo function, which is to recognize
nonsense codons as a translation termination factor (9) nor its ability to induce the prion state.
Interestingly, this probe allowed us to more thoroughly dissect the mechanism of aggregation
and examine the effect of temperature (4 and 25 °C) on the kinetics of NM-fibril formation.
The fibrillation process of the NM domain can be divided simplistically into two steps: a
lag phase, in which part of the soluble protein oligomerizes and transitions into an
amyloidogenic nucleus (small oligomer), and an assembly phase (extension), in which the
remaining soluble protein rapidly associates with this nucleus and becomes an amyloid fibril (1315). The data presented here suggest that temperature does not affect the first step of NM
fibrillation, which is better visualized by analyzing the changes in the spectroscopic behavior of
the Trp residues introduced in position 117. At 4 or 25 oC, the shift in the center of mass of Trp
117, as well as the increase in polarization, occurred with identical kinetics. The second step of
NM fibrillation, however, which is better visualized by the increase in the light scattering, SDSresistance and thio-T binding, is affected by temperature, occurring faster at 4 oC (Table 1 and
Figure 1).
Previous studies have already addressed this curious effect of low temperature on the
kinetics of in vitro NM aggregation (13, 50) and the strength of the [PSI+] phenotype (19). Serio
and collaborators (13) were the first to show that at low temperatures, aggregation of NM
domain of Sup 35 is faster, a counter-intuitive observation since, in general, low temperatures
inhibit fibril formation. Scheibel and Lindquist explained this observation by the idea that agents
that diminish NM flexibility also diminish NM aggregation, e.g., high temperature, osmolytes
and the deletion of the repeats of the NM domain (36).
In an elegant study performed by Krishnan and Lindquist (15), the analysis of the
accessibility of 37 cysteines introduced along the primary sequence of the NM domain and the
behavior of attached fluorescent probes was used to construct a structural model for a fibril
grown at 25 oC. Although a model for the 4 oC-grown fibrils was not presented in this study, by
using the same approach, it was possible to detect a structural distinction between these two
types of fibrils. It has been postulated that fibrils grown at 4 oC have a shorter core, made up of
residues 31-86, than the central core of the fibrils grown at 25 oC, which spans residues 21-121.
Data from our acrylamide quenching experiments are also consistent with this observation since
the Stern-Volmer constants obtained suggest that Trp 117 is slightly more solvent-exposed in the
fibrils grown at 4 oC than in those grown at 25 oC. Also, through the use of excimer formation
(15), it was also possible to map the intersubunit interface, which turned out to be shorter in the 4
o
C-grown fibrils. Taken together, these observations provide an explanation for why the fibrils
grown at 4 oC are less stable and more breakable than those grown at 25 oC. The fragility of these
fibrils would also explain why they produce a stronger phenotype when introduced in yeast cells
(19) since mother cells pass pieces of prions to their daughters, which more easily perpetuate the
cycle of conversion.
In Linquist´s study (15), the closest introduced cysteines to our Trp 117 were at positions
112 and 121. Interestingly, these probes produced conflicting data. Positions 112 and 121 were
partially accessible to pyrene maleimide in the fibrils grown at 25 oC after 3 h of labeling,
whereas experiments performed with an acrylodan label suggested that these positions were
sequestered from the solvent after NM fibrillation. The authors suggested that this region of the
fibril may be fluctuating between an extended and folded conformation. Our data are consistent
with the data presented by Krishnan and Lindquist (15), and we suggest that residues 112, 117,
and 121 are located at the border between the core domain and the extended segment of the
fibril. This conclusion is based on the data from partial blue shift of Trp emission upon
aggregation as well as data from the acrylamide quenching (Figures 1 and 2). Recently, Toyama
et al (40) used hydrogen-deuterium exchange coupled with solution NMR spectroscopy to
dissect the structural differences in the fibrils of the NM domain grown at 4 and 37 oC. They
showed that the core of the fibrils grown at 37 oC spans the first 70 residues, while the core of
the fibrils formed at 4 oC is shorter, including only the first 40 residues. Again, position 117 in
both fibrils seems to be in a position of the amyloid fibril that is not completely exposed nor
completely protected.
Krishnan and Lindquist (15) proposed in their study that the establishment of the head-tohead contacts is responsible for the lag phase in NM aggregation. In their model, the head region
would comprise the first 40 amino acids of the NM domain; the labeled-cysteines inserted into
this region complete all spectroscopic changes without a lag phase in less than ~50 min. In our
study, however, we note that the Trp inserted at position 117, though far from the head region of
the NM domain, also completes all changes in its spectroscopy in less than 50 min in a
temperature-independent fashion with a very short lag phase (Figure 1). This result suggests that
somehow the segment around this position accompanies the structural modification that is
necessary for the formation of head-to-head contacts and a nucleus. Indeed, in this study it was
also suggested that the region of the M domain close to the N domain (region around position
117) becomes structured only when N residues convert to amyloid, while the distal region of the
M domain remains unstructured after fibril formation. Thus, we postulate that the 5-nm shift
observed in Trp 117 emission during the early steps of NM aggregation reflects a structural
modification that takes place in the proximal region of the M domain, which seems to become
structured upon N organization.
Additionally, our data suggest that the structural modification that leads to the formation
of this early collapsed aggregate is not influenced by the temperature (nucleation event). The
extension reaction (conversion of the nuclei/small oligomers into mature fibril) seems to be an
enthalpy-driven process that is favored by lower temperature. During extension, temperature
shapes the final structure of the amyloid fibril, being more loose at 4 oC and more tight and
compact at 25 oC (Figures 5 and 6). The nuclei or small aggregates do not have the selfpropagation feature (Figures 3D and 4) that is presented by the fibrils or by the seeds (pieces of
fibrils) although, as shown by FCS measurements (Figure 3C), they are incorporated in the fibril.
Nevertheless, recently Orte and collaborators (51) have shown by single-molecule fluorescence,
a myriad of highly heterogeneous oligomers of the SH3 domain whose stability increases with
time before incorporation into amyloid fibrils. Thus, it is possible that there might be a specific
population of mature oligomers, which is able to self-perpetuate their structural information onto
the growing fibrils. In the case of Sup35, since the lag phase was very short under the
experimental regime here utilized, the isolation of such a specific population of oligomers would
be very difficult.
There is still no definitive model of the Sup35 fibril. Several studies have found Sup35 to
form a β-helical structure with head-to-head and tail-to-tail interactions, in which the tail region
length determines differences in fibrils and, consequently, phenotypes of the strain (19, 20).
More recently, Tycko’s group (17) used solid-state NMR on Sup35 fibrils to show an in-register
parallel β-sheet structure, in which some regions of M domain are able to become structured in
the amyloid fold. They suggest that structural variations in the M domain may be responsible for
the differences in prion strains. If this model is indeed correct, it is possible that at the nucleus
stage the in-register parallel β-sheet structure is still not completely defined and not influenced
by the temperature at which the nuclei form, as suggested here.
Here, we also evaluated the stability of Sup35 fibrils grown at 4 or 25 oC against
dissociation-denaturation induced by GdmCl (Figure 5A) and HHP (Figures 5B and C). As
previously shown, the fibrils grown at low temperature are less stable than the ones grown at a
higher temperature (15, 19). By using NMF117W, we were able to separate the dissociation and
denaturation processes, with the former occurring in lower GdmCl concentrations.
HHP causes dissociation and denaturation of proteins due to the existence of a void
volume in the protein native state (52). The effects of HHP on amyloid fibrils vary with the
protein under study, experimental conditions, and age of the aggregates (48, 53). In the case of
NM amyloid fibrils, instead of disrupting the fibrils, HHP induces a new structural organization
that is able to accommodate more thio-T molecules, similar to what has been reported for β2microglobulin (54). Rearrangements of the amyloid fibril into a new conformation have been
observed with prion protein (PrP) after heat treatment in the presence of Triton X-100 (55).
Interestingly, the fibrils grown at 4 oC were able to incorporate more thio-T under pressure than
the fibrils grown at 25 oC (Figures 5B and C); this result could be explained by the higher
compactness of the latter. The structural changes caused by HHP in absence of GdmCl were
reversible, allowing us to obtain the thermodynamic parameters associated with this structural
transition (Figure 5). From the estimated changes in volume (ΔV = 48.31 ± 1.83 ml/mol and ΔV
= 51.09 ± 3.39 ml/mol for the 4 and 25 °C fibrils, respectively), we observed that both fibrils are
converted into a more packed state that occupies lower volumes. The volume change obtained
with β2-microglobulin under pressure was 66 mL/mol (54), a value quite similar to the one
described here.
The free energy change associated with this transition is low, being even smaller for the
fibrils grown at 4 °C fibrils (ΔG = 1.47 ± 0.07 kcal/mol and 2.03 ± 0.15 kcal/mol for the 4 and 25
°C grown-fibrils, respectively). Pressure mainly interferes with hydrophobic and ionic
interactions and eliminates water–excluded cavities. Hydrogen bonds are insensitive to HHP
(52). Recently, Nelson and coworkers (16) solved the structure of an amyloid fibril composed of
a hepta-peptide (GNNQQNY) derived from the Sup35 protein. The structure revealed a dry
interface between the two sheets and networks of hydrogen bonds among amide groups of
glutamine and asparagine side-chains. Considering that this pattern of interaction prevails along
the amyloid fibril of the entire NM domain, it might explain the insensitivity of NM fibrils to
HHP. Upon compression, water infiltrates the interior of the protein and carries more thio-T
molecules to the fibril core.
Atomic force microscopy (AFM) has been used extensively to study the morphology and
sub-structure of fibrillar aggregates (56). With AFM, several groups have characterized the
structural polymorphism of different species of amyloid fibrils (43, 57, 58). Based on these
previous observations, we employed AFM to try to find morphological differences between the 4
and 25 oC-grown fibrils of the NM domain. Indeed, AFM revealed slight, but consistent and
statistically significant differences between these two types of fibrils (Figure 6). The height of 25
o
C-grown fibrils was 8% higher than that that of the 4 oC-grown fibrils, which is consistent with
the existence of a shorter core in the fibril grown at 4 oC (15, 19, 39, 40). Moreover, there were
differences up to 24% in measurements of mass per length (mpl) of Sup35 amyloid fibrils of
distinct classes (59), suggesting that Sup35 is able to form polymorphic fibrils that are distinct in
shape, degree of polarity, growth rate (60), mass per length (59), and height (Figure 6). The
differences in fibril morphology reported for Sup35 fibrils, as well as for other amyloidogenic
proteins (61, 62), are probably due to plasticity in the amyloid fold, which is considered an
ancient fold (63), and as such must be able to accommodate different primary sequences or
similar sequences grown under different conditions in the same archetypal structure.
ACKNOWLEDGMENT
We are grateful to Emerson R. Gonçalves for competent technical assistance and Martha M.
Sorenson for critical reading of manuscript.
SUPPORTING INFORMATION AVAILABLE
Figure S1 show that the PheÆTrp substitution at position 117 does not alter the in vivo or in
vitro properties of the NM domain of Sup35 protein. Figure S2 depicts the circular dichroism
spectra of the species formed during the initial phase (nucleation) of NMwt aggregation at 25 or 4
°C. This material is available free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.
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Tab. 1.
Figure legends
Figure 1. Time courses of NMwt and NMF117W aggregation at 4 or 25 °C, as measured by
different probes. (A) Changes in the center of spectral mass of Trp 117 during aggregation of
NMF117W at 4 °C (open circles) or at 25 °C (filled circles). The inset represents the emission
spectra of soluble NMF117W (solid black line) grown at 25 °C (dashed line) or at 4 °C (solid gray
line). For comparison, the emission spectrum of NMwt, where no Trp emission was detected
(dotted line), is also shown. (B) Changes in fluorescence polarization during the aggregation of
NMF117W at 4 °C (open triangles) and at 25 °C (filled triangles). (C) Changes in thio-T binding
during the aggregation of NMF117W at 4 °C (open squares) and at 25 °C (filled squares). (D)
Changes in SDS solubility during the aggregation of NMF117W at 4 °C (open diamonds) and at 25
°C (filled diamonds). The upper gels show the bands from where the extension of SDS-solubility
was evaluated. NMF117W-fibril formation at 4 oC (E) or 25 oC (F) was evaluated by thio-T
binding (filled circles), shift in the center of spectral mass of Trp 117 (open circles), polarization
(open triangles), light scattering (filled triangles) and SDS-solubility (diamonds).
Figure 2. Trp 117 is accessible to acrylamide quenching in soluble NMF117W but partially
protected in the fibrillar state (Stern-Volmer plots). Small volumes of acrylamide were added
to 5 µM of soluble (filled squares) or fibrilar NMF117W obtained at 4 oC (hollowed symbols) or at
25 oC (filled circles), and the emission of tryptophan was measured. The initial fluorescence
values obtained in the absence of acrylamide were divided by the fluorescence observed after
each addition of the quencher (Stern-Volmer plots).
Figure 3. Nuclei of NM break the lag phase of NM assembly in quiescent conditions but
they are not able to self-propagate structural information. Soluble NMwt at 5 μM was
allowed to aggregate under quiescent conditions in the absence (filled circles) or in the presence
of 5% (w/w) of nuclei (hollowed circles) at 25 °C (A) or at 4 °C (B). Nuclei formed by stirring 5
μM of soluble NMwt at 25 oC or at 4 oC for 20 min were added to samples incubated at 25 °C and
4 °C, respectively. At indicated times, the extent of fibril formation was assayed by Congo Red
binding. (C) Autocorrelation curves as measured by FCS of 0.25 μM FITC-labeled NM
monomers (triangles), 0.25 μM of FITC-labeled nuclei (circles) or fibrils formed from a solution
containing 5% FITC-labeled nuclei (0.25 μM) incubated for 130 min in the presence of 95%
unlabeled NM monomers (4.75 μM) (squares). (D) Soluble NMwt at 5 μM was allowed to
aggregate under gentle stirring at 4 oC or at 25 oC for 20 min to produce nuclei. Five % of these
nuclei were added to 4.75 μM soluble NMwt and this suspension was let to aggregate for the next
50 h under quiescent condition at 25 and 4 oC, respectively (see the scheme on the lower
position). As a control, two samples were allowed to aggregate at 4 or 25 oC for 50 h under
quiescent condition in the absence of nuclei. After this time, the fibrils were incubated for 2 h in
the indicated concentrations of GdmCl (abscissa), and thio-T binding was evaluated. Symbols:
(filled triangles) 4 oC/50h; (filled circles) 25 oC/50h; (hollowed triangles) 5% nuclei 25 oCÆ
extension at 4 oC/50h; (hollowed circles) 5% nuclei 4 oC Æ extension at 25 oC/50h. The inset
show the AFM image of the species produced after 20 min of aggregation at 4 oC. The image is 2
μm by 2 μm.
Figure 4. Nuclei or small oligomers of the NM do not yet contain the self-perpetuating
information that is present in small fibrils or seeds. Soluble NMwt at 5 μM was allowed to
aggregate under gentle stirring at 4 oC or at 25 oC for 15 (A), 20 (B), or 25 (C) min; then, the
temperatures were switched (4 oC Æ25 oC and 25 oCÆ 4 oC) for the next 4 h. As a control, two
samples were allowed to aggregate at 4 or 25 oC for 4 h (see scheme on the upper right position).
After this time, the fibrils were incubated for 2 h in the indicated concentrations of GdmCl
(abscissa), and thio-T binding was evaluated. Symbols in panels A, B and C: (filled triangles) 4
o
C/4h; (filled circles) 25 oC/4h; (hollowed triangles) 25 oCÆ4 oC/4h; (hollowed circles) 4 oC Æ
25 oC/4h. The insets show the AFM images of the species produced after 15, 20, or 25 min of
aggregation at 4 oC. The images of the aggregates formed at 25 oC are not shown due to their
similarity to those observed at 4 oC. Each image is 2 μm by 2 μm. (D) Digestion patter of the
fibrils from panel C (same symbols as in panel C). Note that the fibrils grown at 4 oC are more
susceptible to chymotrypsin than the 25 oC-grown fibrils and this pattern did not change after the
temperature shift (open triangles and circles). (E) Quantification of the gels present in panel D.
Figure 5. GdmCl induces dissociation-denaturation of the NMF117W fibril, while high
hydrostatic pressure (HHP) induces only a structural modification on fibril architecture.
(A). Comparing the stability of the NMF117W 4 oC- and 25 oC-grown fibrils against GdmCl
induced dissociation- denaturation. Preformed fibrils at 5 μM were incubated in the indicated
concentrations of GdmCl (abscissa) for 2 h; then, the center of mass of Trp emission (tringles)
and thio-T binding (circles) was evaluated. The data for fibrils grown at 4 oC are shown in
hollowed symbols, while data for 25 oC grown fibrils are shown in filled symbols. The inset
shows the raw data for the shift in the center of mass of Trp emission for fibrils grown at 25 °C
(filled triangles) or 4 °C (open triangle). Fibrils at 5 μM obtained at 25 (B) or at 4 oC (C) were
subjected to increasing pressures, and the binding of thio-T was measured after a 10 min
equilibration. The fibrils were compressed in the absence (circles) or in the presence of 1
(triangles) or 2 M (squares) GdmCl. Note that there is an increase in thio-T binding under
pressure, suggesting a rearrangement of fibril structure rather than dissociation. The open
symbols in the left represent the return to atmospheric pressure. (Inset) Plot of ln (α/1-α) versus
pressure for the data presented in panels B and C (absence of GdmCl). The ΔG F1ÆF2 and ΔV
F1ÆF2
were obtained by the intercepts and the slopes, respectively. Filled and hollowed symbols
represent 25 oC- and the 4 °C-grown fibrils, respectively.
Figure 6. The fibrils produced at 25 oC are higher than those grown at 4 oC. AFM images of
the fibrils of NMwt (A and C) and NMF117W (B and D) aggregated at 25 °C (A and B) or 4 °C (C
and D). Each image is 5 μm by 5 μm. The height frequencies of fibrils of NMwt aggregated at 4
°C (E) or 25 °C (F) are statistically different. (G) Gaussian fit to topographical height
distribution of Sup35 fibrils aggregated at 25 °C (closed symbols) or 4 °C (open symbols).
For Table of Contents Use Only.
A Fluorescent Mutant of the NM-domain of the Yeast Prion Sup35 Provides Insight Into
Fibril Formation and Stability
Fernando L. Palhano‡, Cristiane B. Rocha‡, Alexandre Bernardino§, Gilberto Weissmuller§,
Claudio A. Masuda‡, Mónica Montero-Lomelí‡, André Marco Gomes‡, Peter Chien║, Patrícia M.
B. Fernandes⊥ and Debora Foguel‡*
A
351
352
353
354
355
25
50
1.0
0.5
0.0
4 ºC
25 ºC
0
B
0.4
Polarization
350
Fluorescence
intensity (a.u.)
Center of spectral mass
of tryptophan (nm)
Fig 1.
320
360
400
Wavelength (nm)
0.3
0.2
4 °C
25 °C
0.1
0.0
75 100 125 150 175 200
0
25
50
Time (min)
75
25 °C
C
0
10
0.6
0.0
0.4
4°C
25 °C
0.2
0.0
25
20
30
40
55
100 °C
120 150 150
4 °C
SDS solubility
Th-T Fluorescence (u.a.)
Time (min)
0
125
Time (min)
1.0
0.8
100
50
75 100
Time (min)
125
D
0.2
0.4
0.6
4 °C
25 °C
0.8
1.0
150
0
50
100
Time (min)
150
1.0
1.0
Th-T
CM
Pol
LS
SDS
0.4
0.2
4 °C
0.0
25
50
75
100
Time (min)
125
150
Th-T
CM
0.6
α
α
0.6
0
F
0.8
E
0.8
Pol
LS
SDS
0.4
0.2
25 °C
0.0
0
25
50
75
100
Time (min)
125
150
Fig 2.
7
Soluble
6
F0/F
5
4 °C fibril
4
25 °C fibril
3
2
1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Acrylamide [M]
0.5
0.6
1.5
1.0
0.5
A
0.0
0
10
20
30
40
1.0
NormalizedG (τ)
25 °C
2.0
nuclei + monom er
0.8
nuclei
0.6
0.4
0.2
C
m onomer
0.0
0.001
50
0.01
Time (h)
1
10
1.0
4 °C
2.5
0.1
Time (sec)
2.0
0.8
1.5
0.6
α
Bound CR/protein (mol/mol)
Bound CR/protein (mol/mol)
Fig 3.
0.4
1.0
0.5
0
10
20
30
40
D
0.2
B
0.0
0.0
0
50
Time (h)
agitation
2
3
GdmCl (M )
quiescent
4 °C
5%
4 °C 20’
25 °C
25 °C
5%
25 °C 20’
1
4 °C
50h
50h
50h
50h
4
Fig 4.
Center of Spectral
mass (nm)
Fig 5.
1.0
0.8
352
354
356
1
α
0.6
350
3
5
GdmCl (M)
A
0.4
0.2
0.0
0
1
2
3
4
5
6
GdmCl (M )
3.0
1.5
0.0
400
-1.5
ln(α/1-α)
500
0M
-3.0
300
1000
2000
ThT Fluorescence (a.u.)
Pressure (bar)
1M
B
200
2M
100
0
0M
400
300
1M
200
100
2M
0
0
1000 2000 3000
Pressure (bar)
C
Fig 6.
25
20
A
F117W
B
25 °C
15
Frequency
wt
4 °C fibrils
E
10
5
0
20
25 °C fibrils
F
15
10
5
C
0
D
3
4
5
6
7
Height (nm)
400
25 °C fibrils
Frequency
4 °C
300
4 °C fibrils
200
100
0
3
G
4
5
6
Topographical height (nm)
7
Supporting Information
A Fluorescent Mutant of the NM-domain of the Yeast Prion
Sup35 Provides Insight Into Fibril Formation and Stability
Fernando L. Palhano‡, Cristiane B. Rocha‡, Alexandre
Bernardino§, Gilberto Weissmuller§, Claudio A. Masuda‡, Mônica
Montero-Lomelí‡, André Marco Gomes‡, Peter Chien║, Patrícia
M. B. Fernandes⊥ and Debora Foguel‡*
Fig S1.
B
Fraction of amyloid
A
1.0
4 °C
0.8
0.6
25 °C
0.4
0.2
0.0
0
25
50
75 100 125 150 175 200
Time (min)
C
D
70
Chymotrypsin
Resistance (%)
60
50
40
30
20
10
ºC
ºC
F1
1
7W
25
4
7W
F1
1
t2
5
w
w
t4
ºC
ºC
0
Figure S1. F117W substitution does not interfere with the in vivo and in vitro properties of
Sup35. A. Plasmids encoding the wild type (Sup35wt) and the Trp mutation (Sup35F117W) were
introduced into yeast [PSI+] to replace the genomic copy of sup35. Both plasmids were able to
maintain [PSI+] phenotype (white colonies on YPD). The [psi-] strains are red, indicating a normal
translation termination activity. B. Kinetics of fibril formation for the NMwt (hollowed symbols)
and NMF117W (filled symbols) at 4 (triangles) or 25 °C (circles), as monitored by thio-T
fluorescence and light scattering (not shown due to its similarity with thio-T data). Soluble NM (5
μM) was stirred (60 rpm), and thio-T fluorescence was recorded every five minutes. C. Partial
proteolysis of NMF117W (lower panel) and NMwt (upper panel) fibrils grown at 4 or 25 °C. After
aggregation, the samples were digested with chymotrypsin (1/250 w/w) at 25 °C for 15 min.
Undigested (-) and digested (+) samples were separated by SDS-PAGE gel and stained with
Coomassie Blue and quantified as in panel (D). The secondary structure of NMF117W was examined
and compared to that of the NMwt. The far-UV CD spectra of both proteins were identical and
indistinguishable from that of a random-coil-rich protein (not shown).
Fig S2.
Ellipticity (mdeg)
15
25 °C
10
5
0
-5
-10
A
-15
-20
190 200 210 220 230 240 250 260
Wavelength (nm)
Ellipticity (mdeg)
10
4 °C
5
0
-5
-10
-15
B
-20
-25
190 200 210 220 230 240 250 260
Wavelength (nm)
Figure S2. Secondary structure content of the nuclei formed at 4 and 25 °C. Circular
dichroism spectra of the oligomeric species produced after 15 (red line), 20 (green line), and 25
(blue line) min of aggregation at 25 °C (A) or 4 °C (B). Data with protein immediately diluted in
buffer (black line) or aggregated for 4 h (dashed line) are shown as controls.
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
• Observamos que os núcleos de Sup35NM formados tanto a 4 ºC quanto a 25 ºC foram
capazes de quebrar a fase lag de agregação de Sup35, mas se mostraram incapazes de passar
sua informação estrutural para futuras gerações de fibras. Esse dado sugere que esses núcleos
são estruturas que permitem a geração de fibras amilóides com diferentes estruturas. Seria
interessante avaliar se os núcleos de Sup35NM seriam capazes de nuclear a agregação de
outras proteínas com pouca estrutura secundária como a alfa-sinucleína e o peptídeo Aβ. Isso
poderia esclarecer se o núcleo formado por uma proteína é versátil o suficiente para nuclear a
agregação de outra proteína.
• Se os núcleos não são capazes de transmitir a informação estrutural quem são essas
entidades? Essa talvez seja a pergunta mais difícil de ser respondida de toda essa tese. Os
núcleos formados são metaestáveis o que torna sua caracterização muito difícil. Além disso,
tentamos várias abordagens como gel filtração e utilização de cross links seguido de SDSPAGE, mas não conseguimos isolar essas estruturas de forma homogênea. Uma possibilidade
é tentar substituir os núcleos formados por agitação (fase lag de 25 min) por núcleos que
surgem em condições quiescentes (fase lag de 10-20 h). Existe a possibilidade dos núcleos
formados sem agitação serem diferentes daqueles formados mediante agitação. Teríamos que
investigar se os núcleos quiescentes seriam capazes de transmitir a informação estrutural às
futuras gerações de fibras.
• Seria interessante uma caracterização mais apurada dos núcleos formados a 4ºC ou a 25
ºC. Isso poderia ser feito usando outros mutantes de Sup35NM. Construímos os
oligonucleotídeos para realizar a mutações Y13W, Y45W e F92W em Sup35NM. Em posse
desses mutantes, poderemos observar diferentes regiões da proteína e analisar se esses
resíduos são internalizados de forma distinta nos núcleos de 4ºC e 25 ºC.
124
PARTE III
INTRODUÇÃO
1- Transtirretina
A transtirretina (TTR) foi primeiramente isolada e seqüenciada por Dewitt Goodman em
1974 e recebeu o nome de pré-albumina por migrar antes da albumina em eletroforese
(HAMILTON & BENSON, 2001). Seu nome foi mudado a fim de descrever suas principais
funções fisiológicas: trans de transportadora, ti de tiroxina e retina relativo à retinol. A TTR é
uma proteína homotetramérica de 55 kDa onde cada monômero é composto por 127 resíduos
de aminoácidos que formam uma estrutura rica em folha β. A TTR está envolvida no
carreamento do hormônio tiroxina e da proteína ligadora de holo-retinol pelo plasma e líquor,
sendo secretada, principalmente, pelo fígado e plexo coróide (Figura 1) (HAMILTON &
BENSON, 2001). A TTR não atravessa a barreira hemato-encefálica e possui meia vida de
aproximadamente 2 dias (VAHLQUIST et al., 1973) sendo seus principais locais de
degradação o fígado, rins, pele e músculo (MAKOVER et al., 1988). A TTR liga e transporta
aproximadamente 15-25% da tiroxina sérica e 80% da tiroxina no sistema nervoso central
(HAGEN & ELLIOTT, 1973).
A TTR é altamente conservada em diversas espécies e está presente até em bactérias como
E. coli (POWER et al., 2000). Apesar disso, camundongos sem o gene que codifica TTR não
apresentam fenótipo, o que indica que esses animais compensam a ausência da proteína por
outros mecanismos (EPISKOPOU et al., 1993). O principal interesse no estudo da TTR se
baseia no fato dessa proteína estar relacionada diretamente ao tipo mais comum de amiloidose
familiar hereditária e a amiloidose sistêmica existentes em humanos (WESTERMARK, 2005)
Além disso, vários estudos vêm mostrando sua relação com outros processos fisiológicos
(RICHARDSON, 2007) como a regeneração nervosa (FLEMING et al., 2007) e o surgimento
de outras doenças amilóides como o Alzheimer (COSTA et al., 2008; BUXBAUM et al.,
2008).
2- Amiloidoses causadas por transtirretina
A transtirretina, em condições ainda não bem compreendidas, forma fibras amilóides que
acumulam sob a forma de agregados insolúveis, levando assim ao aparecimento da amiloidose
(PEPYS, 2006).
A TTR está envolvida principalmente em três tipos de amiloidose: a Amiloidose
125
Sistêmica Senil (ASS), causada por depósitos da proteína selvagem (wt); a Polineuropatia
Amiloidótica Familiar (PAF), causada pelo depósito de mais de 90 mutantes pontuais da TTR
e a Amiloidose Leptomeningeal (AL), também causada por mutações pontuais (HOU et al.,
2007).
Figura 1. Figura ilustrativa da proteína transtirretina. As folhas beta internas são mostradas
em azul, enquanto as externas estão em vermelho. As alfa hélices estão em amarelo, enquanto os
loops que contribuem para a formação do tetrâmero estão representados em verde. Extraído de
HAMILTON & BENSON, 2001.
A AAS pode afetar até 25% de pessoas com mais de 80 anos e é caracterizada por
depósitos da proteína TTR selvagem (wt) em diversos órgãos, principalmente o coração
(WESTERMARK et al., 1990). Em geral, a ASS é uma doença benigna sem sintomas, mas,
em alguns casos, os excessivos depósitos amilóides podem levar à cardiomegalia e à falência
cardíaca (PITKÄNEN et al., 1984). A agregação da proteína wt em grande proporção da
população, embora ocorra de forma lenta, revela que a TTR é uma proteína com tendência
natural de formar depósitos amilóides. Essa tendência pode ser grandemente acelerada pela
presença de mutações que desestabilizam a proteína.
126
A PAF é uma doença autossômica dominante caracterizada por depósitos amilóides
sistêmicos nos tecidos conectivos com exceção do fígado e parênquima cerebral e particular
acúmulo no sistema nervoso periférico, levando à disfunção dos órgãos e finalmente à morte
(SOUSA & SARAIVA, 2003). Em 1929 Bruyn e Stern descreveram uma doença com toda
sintomatologia clínica de PAF (KYLE, 2001), mas, só em 1939, o médico português Corino
Andrade observou que um pescador na comunidade de Povoa de Varzin, Portugal,
apresentava um tipo de neuropatia periférica que ficou conhecida como “doença dos
pezinhos”, caracterizada pela falta de sensibilidade a cortes provocados pelas redes de pesca
(ANDRADE, 1952). Treze anos depois, ele descreveu 74 pacientes com a mesma doença
(ANDRADE, 1952). Desde então, a PAF tem sido descrita no mundo todo com os principais
focos em Portugal, Suécia e Japão (BUXBAUM & TAGOE, 2000). A mutação mais
encontrada na PAF é a mutação V30M, única mutação descrita no Brasil (BITTENCOURT et
al., 2005). Entretanto, a mutação que causa os sintomas mais agressivos é a L55P levando seu
portador à morte na segunda ou terceira década de vida (JACOBSON et al., 1992a).
3- Amiloidoses Leptomeningeais (AL)
As AL são amiloidoses raras de herança autossômica dominante sendo caracterizadas
patologicamente por depósitos de TTR nos vasos das leptomeninges no parênquima cerebral
ao redor do sistema ventricular e na retina (PETERSEN et al., 1997). Esses depósitos levam à
demência progressiva, desordem locomotora, infartos cerebrais, isquemia, derrame, coma e
morte (BENSON, 1996). A Figura 2 ilustra as estruturas anatômicas envolvidas na síntese e
circulação do líquor, e consequentemente da TTR produzida no sistema nervoso central
(RANSOHOFF et al., 2003).
Doze diferentes mutações (L12P, D18G, A25T, V30M, V30G, A36P, T49P, G53E, F64S,
Y69H, Y114C, V122I) já foram descritas associadas com AL (BRETT et al., 1999, VIDAL et
al., 1996, SEKIJIMA et al., 2003, HERRICK et al., 1996, PETERSEN et al., 1997,
JACOBSON et al., 1992b, NAKAGAWA et al., 2008, ELLIE et al., 2001, DOUGLASS et
al., 2007, UEMICHI et al., 1999, BLEVINS et al., 2003, DOWELL et al., 2007). Essas
mutações estão localizadas em diferentes regiões da proteína tornando difícil descrever uma
possível região preferencial (hot spot) na estrutura da TTR que estaria envolvida com maior
desestabilização da proteína e desenvolvimento das AL. Também não existe correlação com o
tipo de mutação e os sintomas apresentados, já que algumas dessas mutações, como V30M e
V122I, também causam a PAF
127
Figura 2. Estruturas anatômicas envolvidas na circulação do líquor no sistema nervoso
central. O líquor é continuamente secretado pelas células epiteliais do plexo coróide localizado no
sistema ventricular do cérebro. O líquor circula a partir dos ventrículos para o espaço subaracnóide
localizado entre as membranas aracnóide e pia, e é reabsorvido para a circulação sistêmica através
dos vilos aracnóides. Nas AL grandes quantidades de agregados de TTR se depositam nas
membranas aracnóide e pia (leptomeninges), no espaço subaracnóide e também nos vasos situados
no espaço subaracnóide. Adaptado de RANSOHOFF et al., 2003.
128
4- Fatores que influenciam na patologia
A severidade com que os sintomas da PAF acometem os pacientes é determinada por uma
gama de fatores (BUXBAUM & TAGOE, 2000). Pacientes suecos apresentam menor
penetrância, ou seja, desenvolvem sintomas mais tardios que pacientes portugueses e
japoneses que portam a mesma mutação (BUXBAUM & TAGOE, 2000). Isso sugere que
componentes genéticos e comportamentais influenciam a severidade da PAF. Cada monômero
de TTR possui uma cisteína na posição 10. Isso faz com que TTR sofra diversas modificações
pós-traducionais como sulfonação, tiolação (LIM et al., 2003), nitrosilação (SAITO et al.,
2005) entre outras que, em última instância, alteram sua amiloidogenecidade. De fato, apenas
5-15% da TTR circulante no plasma se encontra livre de alguma modificação pós-traducional
(HAGEN & ELLIOTT, 1973) e certamente essas modificações modulam a taxa de agregação
da TTR.
Nenhum outro fator afeta tanto a agressividade da PAF quanto o tipo de mutação. Essas
mutações já foram encontradas em diversos segmentos da molécula de TTR (Figura 3) e nem
sempre levam ao desenvolvimento da doença. O caso excepcional da mutação T119M leva à
diminuição dos sintomas causados por uma segunda mutação amiloidogênica, fenômeno
conhecido como trans-supressão (ALMEIDA et al., 2000), que será discutido com mais
detalhes na parte IV desta tese. Recentemente, as estruturas cristalográficas de 23 diferentes
mutações da TTR foram comparadas com a da proteína wt (HORNBERG et al., 2000), tendo
ficado claro que, as mudanças estruturais observadas nas variantes são tão sutis e
inconsistentes que foram consideradas não significativas, tornando difícil determinar qual
seria a alteração estrutural responsável pela maior propensão da TTR em agregar. Apesar do
intenso esforço de vários grupos em tentar decifrar quais mudanças estruturais estariam
relacionadas com a agregação da TTR, mudanças estruturais significativas só foram
observadas recentemente, em cristais crescidos em pH ácido, que favorece a agregação
(PALANINATHAN et al., 2008). Ao contrário dos dados estruturais, estudos termodinâmicos
usando diversos agentes desnaturantes como uréia (HAMMARSTROM et al., 2002),
guanidina (QUINTAS et al., 1999) ou alta pressão hidrostática (FERRÃO-GONZALES et al.,
2003) foram capazes de relacionar de maneira inversa a estabilidade termodinâmica dos
mutantes com sua tendência a agregar in vitro (SEKIJIMA et al., 2005).
Outro fator determinante na amilodogenecidade da TTR é sua cinética de dissociação
(HAMMARSTROM et al., 2002). Apesar de ter sido mostrado que a TTR pode agregar como
tetrâmero (FERRAO-GONZALES et al., 2000; ENEQVIST et al., 2000) ou como dímero
129
(OLOFSSON et al, 2001), o modelo mais difundido de agregação da TTR é o do
intermediário monomérico amiloidogênico que pressupõe sua dissociação em monômeros
(Figura 4). Os monômeros provenientes da dissociação da TTR, em condições ainda não
muito claras, sofrem desenovelamento parcial antes de se associarem e, finalmente,
agregarem como fibras amilóides (Figura 4) (HOU et al., 2007). Cada mutação afeta de forma
diferente a taxa de dissociação da TTR, sendo a taxa de dissociação diretamente proporcional
a amilodogenecidade dos mutantes (HAMMARSTROM et al., 2002). Quando ligada a tiroxina,
a TTR fica menos propensa a agregar devido a sua menor taxa de dissociação.
Figura 3. Monômero da transtirretina, onde estão assinalados a posição de algumas
mutações descritas. Extraído de BUXBAUM & TAGOE, 2001.
130
Figura 4. Esquema mostrando a formação de agregados amilóides de transtirretina. O
tetrâmero nativo da TTR dissocia-se naturalmente em monômeros. A taxa com que TTR se
dissocia varia de acordo com mutações, sendo diretamente correlacionada à amiloidogenecidade
do mutante. O monômero da TTR pode oligomerizar-se novamente a tetrâmero. Entretanto,
devido a sua baixa estabilidade termodinâmica, esse monômero pode sofrer um rearranjo
estrutural dando origem ao intermediário amiloidogênico. Essa mudança pode ser desencadeada
ou acelerada por mudanças de pH, oxidação ou modificações pós-traducionais. O intermediário
amiloidogênico possui forte tendência a se associar a outros dando inicio a agregação. Essa
agregação passa pela formação de oligômeros, proto-filamentos e finalmente a fibras amilóides.
Recentemente, um trabalho usando 32 mutantes diferentes de TTR tentou correlacionar
estabilidade termodinâmica, cinética de dissociação-desnaturação, amiloidogenecidade in
vitro e agressividade da doença in vivo (SEKIJIMA et al., 2005). Interessantemente, houve
uma correlação forte entres esses parâmetros para quase todos os mutantes testados, exceto
para as mutações A25T e D18G. Esses mutantes exibiram as menores estabilidades
termodinâmicas, as maiores taxas de dissociação-desnaturação e agregação in vitro, mas os
pacientes com essas mutações apresentavam sintomas tardios (∼40 anos) e restritos ao sistema
nervoso central. Isso se deve ao fato de que esses mutantes nesses pacientes serem
encontrados apenas no líquor, estando ausentes no sangue (MITSUHASHI et al., 2005). Ao
contrário das outras mutações e da proteína selvagem, A25T e D18G não são secretadas para
fora dos hepatócitos. As mudanças estruturais causadas por essas mutações são tão grandes,
que o controle de qualidade de enovelamento do retículo endoplasmático as direciona para a
via de degradação dependente de proteassoma denominada ERAD (endoplasmic reticulum
associated degradation) (SEKIJIMA et al., 2005). No caso das células do plexo coróide,
responsáveis pela síntese de TTR no líquor, acredita-se que a grande quantidade de tiroxina
ali presente, seja capaz de estabilizar esses mutantes até sua secreção. Como no líquor a
quantidade de TTR é dez vezes menor que no sangue, essas mutações, mesmo sendo muito
mais propensas a agregar, poderiam levar mais tempo para causar os sintomas da doença.
131
Em algumas mutações como V30M e L55P, a maioria dos pacientes desenvolve sintomas
de PAF, enquanto em outras, como A25T e D18G, os sintomas são de AL. Pacientes com a
mutação V112I, assim como pacientes com ASS, desenvolvem depósitos cardíacos. O
tropismo de determinados variantes em agregar em órgãos específicos pode ser explicado, em
parte, por fatores como o descrito acima. Entretanto para a maioria das mutações, essa é uma
das questões mais enigmáticas no estudo das amiloidoses causadas pela TTR.
5- Estrutura da TTR e mudanças conformacionais associadas à agregação
A TTR é um tetrâmero do tipo diedral, ou seja, composta de um par de dímeros (Figura
5). Cada monômero é formado por um sanduíche com duas folhas beta, cada uma formada por
quatro fitas beta (CBEF e DAGH). Dois monômeros através das fitas F e H se unem para
produzir um dímero de duas folhas betas intermolecular formadas por oito fitas,
DAGHH’G’A’D’ e CBEFF’E’B’C’. O tetrâmero é estabilizado por interações fracas
estabelecidas entre dois dímeros (FOSS et al., 2005) com contatos ocorrendo através de
interações hidrofóbicas back-to-back entre os loops AB e GH. Uma cavidade central onde a
tiroxina se liga é formada nos espaços entre as folhas DAGH de cada uma das quatro subunidades do monômero. O bolso hidrofóbico formado no contato tetramérico é o ponto de
interação com a proteína transportadora de retinol (RBP) (Figura 5).
Figura 5. Estrutura tridimensional da TTR. A) O dímero da TTR é estabilizado por interações
entre as fitas H, H’ e F, F” entre monômeros distintos. B) Tetrâmero onde o canal de ligação a
tiroxina é mostrado (TBC). O local de ligação à proteína ligadora de retinol (RBP) está
132
representado em vermelho. C) Mesmo tetrâmero sofrendo rotação de 90° no eixo vertical.
Extraído de LAIDMAN et al., 2006.
Apesar das estruturas cristalinas dos diversos mutantes apontarem mudanças estruturais
mínimas entre si, muitos estudos mostram que alterações significativas ocorrem na TTR
durante e após sua agregação. Experimento usando troca de hidrogênio-deutério (OLOFSSON
et al., 2004) e spin labeling (SERAG et al., 2002) mostraram que as folhas beta internas
permanecem protegidas do solvente nas fibras, enquanto a região CD se desloca e expõe as
fitas A e B (Figura 6). É importante ressaltar que, ambos os estudos usaram condições
drásticas, como 55 ºC por 4 dias ou pH 4,4 por 7 dias, para a obtenção das fibras amilóides de
TTR. Estudos usando anticorpos mostram que epítopos presentes nas fibras não são acessíveis
na TTR nativa e epítopos presentes na TTR nativa não estão mais presentes nas fibras de TTR
(GUSTAVSSON et al., 1994; GOLDSTEINS et al., 1999). Estudos biofísicos e estruturais
confirmam a variabilidade conformacional da região CD (LIU et al., 2000ab; HORNBERG et
al., 2004). Recentemente, dois estudos usando mutantes naturais, artificiais e a proteína
selvagem resolveram à estrutura cristalográfica dessas proteínas em condições ácidas de pHs
(3,5-4,5) que favorecem a agregação. A principal mudança observada por ambos os estudos
foi à perda da única alfa hélice do monômero que conecta as fitas E e F (PASQUATO et al.,
2007; PALANINATHAN et al., 2008). Essas mudanças foram atribuídas, principalmente, à
mudança no estado de protonação de histidinas responsáveis por contatos importantes para a
manutenção da estrutura dessa região.
133
Figura 6. Modelo esquemático da organização da TTR em fibras. A) A estrutura nativa da
TTR, representada como monômero, é perturbada na região CD (vermelho) durante a agregação,
resultando na exposição das fitas B e B’ favorecendo a associação entre várias subunidades.
Durante a agregação, ocorrem interações entre as fitas F e F’(circulo verde) e entre as fitas B e B’
(circulo azul). De acordo com o modelo as fibras são arranjadas na ordem (BEFF’E”B)n. C)
Modelo mostrando três monômeros de TTR organizados como parte de uma fibra. O grau de
exposição dos resíduos é simbolizado pelas cores onde azul, amarelo e vermelho é a ordem
crescente de exposição. Adaptado de SERAG et al., 2002 e OLOFSSON et al., 2004.
134
6- A mutação A25T
Dentre as mais de 80 mutações descritas para a TTR, destaca-se a mutação A25T, uma
mutação descrita em um paciente japonês com AL. Até o momento, essa proteína apresenta a
menor estabilidade dentre todos os mutantes conhecidos da TTR sendo a variante com maior
tendência de agregar (SEKIJIMA et al., 2005). De forma geral, a agregação da TTR é
fortemente acelerada pela acidificação do meio. Enquanto a proteína selvagem é estável em
pH 7,0 e leva ao menos um mês para agregar em pH 5,0, a mutante A25T agrega em menos
de 1 hora em pH 5,0 (SEKIJIMA et al., 2003). A diminuição do pH é uma estratégia valiosa
para a compreensão da agregação da TTR, visto que a agregação da maioria dos mutantes é
rara em pH 7,0, tornado sua caracterização e estudo in vitro muito difíceis. Entretanto, ainda
não foi provado que a TTR experimenta ambientes tão ácidos durante sua reciclagem,
sugerindo que sua agregação ocorra em pHs próximo a 7,0, porém com cinética muito lenta
(décadas). Como a mutação A25T causa profunda instabilidade na TTR, esta proteína pode
ser uma importante ferramenta para acompanhar a agregação da TTR em pH 7,0 ou em
ambientes mais fisiológicos como o plasma e o líquor. Além disso, a resolução da estrutura
desta variante pode revelar alterações estruturais significativas, ainda não observadas nas
estruturas resolvidas até o momento.
7- Fisiopatologia das Amiloidoses Leptomeningeais
Outro aspecto importante e ainda pouco entendido na patologia das AL é como os
agregados de TTR levam aos sintomas observados na clínica. Alguns dos sintomas
apresentados pela AL estão relacionados com o aumento da permeabilidade da barreira
hematoencefálica,
sangramentos
intracraniais
e
dentro
do
espaço
subaracnóideo
(MITSUHASHI et al., 2004; BENSON, 1996). Recentemente, foram descritos dois casos
onde micro-hemorragias cerebrais foram associados com a presença de agregados de TTR nas
leptomeninges (DOWELL et al., 2007; ROBBINS & YASEN, 2008). O acúmulo de
agregados amilóides em vasos do córtex e leptomeninges é conhecido como angiopatia
amilóide cerebral, sendo encontrado em alguns tipos de patologias como a de Alzheimer,
doenças de prions e AL (YAMADA, 2000). A angiopatia amilóide cerebral causada pela
proteína APP (relacionada com a doença de Alzheimer) pode levar a resposta inflamatória nos
vasos cerebrais recrutando monócitos e células microgliais (WEGIEL et al., 2004). O papel
destas células é tentar livrar os vasos dos agregados amilóides através de fagocitose ou
135
ativação do sistema imune. Além disso, existe também o recrutamento de células microgliais
para sítios onde estão presentes agregados conhecidos como placas senis na doença de
Alzheimer (GONZÁLEZ-SCARANO & BALTUCH, 1999). Alguns autores defendem que as
células microgliais têm um papel benéfico em doenças neurodegenerativas, pois estariam
contribuindo para a remoção dos agregados amilóides (HANISCH & KETTENMANN,
2007). Por outro lado, a ativação dessas células poderia levar a produção de várias citocinas e
moléculas pró-inflamatórias como óxido nítrico, que poderiam ser fatais para neurônios
adjacentes, tornando o quadro ainda mais grave (BLOCK et al., 2007). Apesar de
controversos, existem diversos dados na literatura que apontam à importância de células
inflamatórias do sistema nervoso central na progressão de doenças neurodegenerativas
(BLOCK et al., 2007). Entretanto, para a AL, ainda não foram demonstradas as
conseqüências celulares e moleculares do acúmulo de TTR nos vasos da leptomeninge, sendo
ainda desconhecidos os fatores que levariam aos sintomas observados na clínica.
É fundamental o conhecimento molecular e celular dos fenômenos da agregação, acúmulo
dos agregados e da resposta que o organismo prepara contra os agregados causadores das AL.
O entendimento das mudanças causadas por estas mutações, usando como modelo a variante
A25T, bem como das características bioquímicas destes agregados e a descrição ou não da
resposta inflamatória mediada por células de microglia contra estes agregados poderão juntos
contribuir para o planejamento racional na terapêutica a ser adotada contra as AL e contra
outras doenças neurodegenerativas que elicitam resposta inflamatória.
Atualmente, apenas a polineuropatia familiar amiloidótica possui terapia disponível que
consiste no transplante de fígado (SARAIVA, 2001), principal órgão produtor de TTR
circulante no plasma. Entretanto, como a proteína presente no líquor que agrega nas
leptomeninges é produzida no próprio cérebro (plexo coróide), essa terapia não é efetiva.
Ainda não existe terapia disponível para AL. Uma alternativa promissora é o uso de
antiinflamatórios não esteroidais (AINES). Análogos de diclofenaco têm sido testados com
sucesso na prevenção da agregação de diversos mutantes da TTR (KLABUNDE et al., 2000).
Isso se deve ao fato dessas moléculas se ligarem no canal da TTR onde o hormônio tiroxina se
liga fisiologicamente. Essa ligação provoca leves alterações estruturais na TTR tornando-a
mais estável e, portanto, menos amiloidogênica. O uso de AINES como alternativa no
tratamento das AL é interessante também por outro aspecto, caso se comprove que a
inflamação é um componente importante na patologia das AL essas moléculas poderiam ter
um segundo papel diminuindo a inflamação e melhorando o quadro clínico dos pacientes.
136
OBJETIVOS
1- Objetivo geral
Caracterizar a variante da transtirretina A25T quanto aos aspectos estruturais, estabilidade
termodinâmica e propriedades bioquímicas, celulares e fisiológicas, a fim de se
compreender quais são os eventos moleculares e celulares que levam essa proteína a
causar a amiloidose leptomeningeal.
2- Objetivos específicos
1- Determinar por difração de raios X a estrutura tridimensional da variante A25T na sua
forma apo, ligada ao hormônio tiroxina, ao antiinflamatório não esteroidal ácido
flufenâmico e a sonda fluorescente 1,8 ANS;
2- Calcular a estabilidade termodinâmica de A25T usando como agente desnaturante alta
pressão hidrostática (FERRÃO-GONZALES et al., 2003);
3- Caracterizar utilizando ensaios bioquímicos, como ligação de vermelho de Congo,
tioflavina T, microscopia de força atômica, cromatografia de gel filtração e
eletroforese em gel de poliacrilamida, a cinética agregação de A25T;
4- Reproduzir a cinética de agregação de A25T em pH mais próximos aos fisiológicos;
5- Caracterizar por microscopia de força atômica e ensaios de digestão com proteinase K
as diferenças conformacionais entre agregados de A25T obtidos nos pH 5, 6 e 7;
6- Avaliar se os agregados de A25T são tóxicos contra linhagens neuronais;
7- Analisar se os agregados de A25T são capazes de estimular a resposta inflamatória
usando como modelo culturas primárias de células de microglia;
8- Caracterizar que tipo de resposta às células de microglia desenvolvem quando
estimuladas por agregados de A25T.
137
MATERIAL E MÉTODOS
1- Expressão e Purificação da proteína A25T
O plasmídeo contendo a mutação A25T foi cedido pelo Dr. Jeffery W. Kelly do Scripps
Research Institute (La Jolla, California, EUA), amplificado em células de E. coli DHα5 e
purificado usando o kit Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification System (Promega, USA).
O plasmídeo purificado foi inserido por choque térmico em E. coli BL21/DE3. A expressão e
purificação da variante A25T foram feitas como descrito anteriormente (LASHUEL et al.,
1999).
2- Caracterização do perfil de desnaturação e dissociação da proteína A25T
utilizando Alta Pressão Hidrostática (APH)
Utilizamos como agente desnaturante APH que, conforme mostrado anteriormente pelo
nosso grupo (SILVA et al., 2001; FOGUEL & SILVA, 2004) tem se mostrado uma eficaz
ferramenta para esse propósito. A desnaturação da proteína foi monitorada pela fluorescência
do triptofano. Em todos os ensaios a proteína foi pressurizada em tampão Tris 25 mM, KCl
50 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5 e a pressão foi aumentada de 205 em 205 bar com intervalos de
5 minutos para alcance do equilíbrio. O espectro de emissão do triptofano foi obtido após
excitação da amostra em 280 nm e coleta da emissão na faixa de 300-400 nm. Todas as
amostras testadas mostraram reversibilidade após um ciclo de compressão-descompressão.
Foram feitos 3 ensaios de titulação de pressão onde foram medidos o desvio do centro de
massa espectral do triptofano. Avaliamos a dependência de temperatura (1°C e 37°C), da
concentração (1 e 10 μM) e a estabilidade comparativa com outros variantes, como L55P e
com a própria proteína selvagem (1 μM a 1°C). Baseado nas curvas de desvio de centro de
massa de cada amostra foi calculado o ∆G e ∆V de dissociação utilizando a fórmula
matemática:
ln[(αp)4/(1-αp)] = p(ΔV/RT) + ln(Kd/256C3)
(1)
onde Kd é a constante de dissociação, C é a concentração de proteína, p é a pressão e α é
o grau de dissociação.
O grau de dissociação (α) foi calculado usando a fórmula:
α = (〈νp〉 - 〈νi〉)/(〈νi〉 - 〈νf〉)
(2)
138
onde 〈νi〉 e 〈νf〉 são os valores inicial e final do centro de massa respectivamente, enquanto
〈νp〉 é o centro de massa na pressão p.
3- Cristalização, determinação e refinamento da estrutura da variante A25T
Para cristalização, foram utilizadas as amostras A25T em Tampão Tris 20 mM e KCl 50
mM, pH 7,5 utilizando a técnica de hanging drop vapor-diffusion. Os cristais cresceram
durante uma semana a 20°C na condição Hampton Crystal Screen I#14, 0,2 M CaCl2, 0,1 M
HEPES, 28% (v/v) polietilenoglicol 400, pH 7,5 (Hampton Research Inc.) equilibrando-se 1
μl de TTR a 10 mg/ml em 1 μl de solução. Os cristais foram congelados em nitrogênio líquido
até o momento da coleta. Os dados de difração de raios X foram coletados na linha MX2 do
LNLS (Laboratório Nacional de Luz Sincrotron, Campinas, Brasil). O processamento das
imagens, a determinação de fase e refinamento foram conduzidos através de substituição
molecular utilizando MolRep (VAGIN & TEPLYAKOV, 1997) e usando a forma apo da
TTR humana como modelo de pesquisa (PDB referência 3CFM). O melhoramento da
estrutura foi feito usando o programa Coot (EMSLEY & COWTAN, 2004). As estruturas
foram sobrepostas para a visualização do desvio médio quadrático entre elas com o auxílio do
programa Superpose da suíte de programas CCP4i (POTTERTON et al., 2003). Todas as
Figuras de estrutura foram feitas usando o programa PyMol (DeLano Scientific LLC,
http://www.pymol.org). A validação da estrutura foi feia usando o programa Procheck
(LASKOWSKI et al., 1993). Todas as etapas acima foram feitas em colaboração com o
doutorando Leonardo C. Palmieri e com o Professor Luís Maurício T. R. Lima.
4- Marcação da variante A25T com a sonda fluorescente Acrilodan
A marcação de A25T e L55P com acrilodan foi feita como descrito anteriormente
(PALHANO et al., 2009).
5- Taxa de Agregação por gel filtração
Os ensaios de agregação foram acompanhados por HPLC utilizando a coluna de gel
filtração GPC 300 (SynChropak) equilibrada em tampão Tris 25 mM, KCl 50 mM, EDTA 1
mM, NaN3 5 mM, pH 7,5 sob fluxo contínuo de 0,4 ml/min.
Os experimentos com as variantes A25T e L55P foram preparados utilizando-se 2 ml de
cada amostra na concentração de 3,5 μM em tampão Tris HCl 25 mM, KCl 50 mM, EDTA 1
139
mM, NaN3 5 mM pH 7,3 a 37˚C. O experimento foi acompanhado por gel filtração durante 30
dias. Foi calculada a área dos picos correspondentes aos agregados e ao tetrâmero.
Foram realizados também experimentos de agregação a 37˚C utilizando plasma humano
como meio de reação. As proteínas A25T e L55P (3,5 μM) marcadas com acrilodan ficaram
incubadas por 5 dias a 25˚C. O fluido ideal para simular a agregação da variante A25T no
ambiente do sistema nervoso central é líquor humano devido ao fato desta variante ser apenas
encontrada neste ambiente (SEKIJIMA et al., 2003). No entanto, utilizamos o plasma humano
pela dificuldade de obtenção de líquor humano, que requer um procedimento invasivo para
obtê-lo.
6- Caracterização do perfil de agregação da variante A25T e L55P marcadas com
acrilodan em plasma humano utilizando PAGE nativo
A marcação das variantes com acrilodan nos permitiu visualizar facilmente no gel nativo o
desaparecimento da banda correspondente ao tetrâmero e o aparecimento de uma nova banda
correspondente aos agregados. Em todos os ensaios foram utilizadas amostras na
concentração de 3,5 μM incubadas a 25˚C por 0, 1, 3, 4 e 5 dias. O gel (10%) foi protegido da
luz durante e após a corrida que foi realizada a 4˚C com voltagem constante de 100 V. As
bandas foram visualizadas com o auxílio de transiluminador. O gel foi visualizado excitandose as amostras com luz UV e as áreas das bandas correspondentes ao tetrâmero e ao agregado
marcados com acrilodan foram medidas e quantificadas com o software ImageJ.
7- Análise de ligação de vermelho do Congo e fluorescência de tioflavina T
Em ensaios de ligação de vermelho do Congo (VC) as amostras foram analisadas
conforme descrito anteriormente (KLUNK et al., 1989). Cada amostra foi diluída para a
concentração de 1 μM em tampão fosfato de potássio 5 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 contendo
a solução de VC de 10 μM. As absorbâncias em 540 e 477 nm foram medidas após 5 minutos
de ligação e a taxa de ligação foi calculada utilizando a fórmula: mol VC ligado/mol de ptn
= DO 540/25295 - DO477/46306 (KLUNK et al., 1989). Para a tioflavina T, amostras
processadas como descrito acima em solução contendo 20 µM de tioflavina T foram
analisadas no fluorímetro sendo excitadas em 450 nm e a emissão coletada entre 465-520 nm.
8- Perfil de digestão por proteinase K
Agregados amilóides são, de forma geral, parcialmente resistente à ação da enzima
proteolítica proteinase K (BOCHAROVA et al., 2006). A proteína A25T na concentração de
140
20 µM foi agregada em tampão MES 20 mM, KCl 50 mM, EDTA 1 mM, NaN3 5 mM nos
pHs 5, 6 e 7 a 37 ºC por 30 dias. As amostras foram centrifugadas a 20.000 X g por 1 h a 10
ºC e o precipitado foi ressuspendido em tampão fosfato de potássio 5 mM, NaCl 150 mM, pH
7,4. Os agregados obtidos foram incubados na razão de 250:1 com proteinase K por 45 min a
37 ºC. Após esse tempo, as amostras foram fervidas por 10 min em tampão desnaturante e
aplicadas em SDS-PAGE 18% a fim de se avaliar o perfil de digestão destes agregados.
9- Microscopia de Força Atômica (AFM), Microscopia de campo claro e
Microscopia de fluorescência
As imagens de AFM foram obtidas a partir de amostras da variante A25T solúvel e
agregada. Cada amostra foi diluída até a concentração de 1 μM e adsorvidas em mica, lavadas
5 vezes com água ultra pura, secas por 24 horas em temperatura ambiente e analisadas em
microscópio de força atômica (Asylum MFP-3D BIO AFM, Asylum Research, Santa Barbara,
CA). As imagens foram feitas usando-se cantilever retangular de silício com constante de
mola de 2 N/m e freqüência de ressonância de 70 kHz.
As imagens celulares de campo claro e de fluorescência foram obtidas utilizando
Microscópio invertido Nikon Eclipse TE 3000.
10- Preparo das amostras da A25T para as culturas celulares
As amostras de TTR precipitadas em sulfato de amônio (LASHUEL et al., 1999) foram
desalinizadas em PBS estéril pH 7,3, filtradas em filtro 0.22 μm e passadas em coluna de
polimixina B para a remoção de endotoxinas (WEINSTEIN et al., 2008), de acordo com as
especificações do fabricante (Pierce Biotechnology). As amostras foram divididas em três
lotes, a saber; 1. amostras solúveis congeladas em N2 líquido até o posterior uso; 2. amostras
incubadas a 37 ºC por 3 semanas em pH 7,3 na concentração de 30 µM denominadas
“agregados de pH 7,3”, 3. amostras incubas nas mesmas condições descritas em 2, porém
utilizando-se pH 5,0, que foram denominadas então “agregados de pH 5,0”.
Todos esses passos foram realizados de maneira estéril usando água livre de endotoxinas,
a fim de evitar a possível ativação da microglia por contaminantes. Amostras solúveis devem
ser preparadas no dia ou guardadas em N2 líquido, pois mesmo a 4 ou – 20 ºC as amostras
agregam rapidamente.
Além dos cuidados descritos acima quanto à presença de endotoxinas, nos certificamos,
através de SDS-PAGE 15%, que a pureza das nossas amostras eram superior a 90%, como
indicado na Figura 7. A densitometria das bandas foi feita usando o programa Image J.
141
Também foi realizado western blot onde a eletroforese em SDS-PAGE foi feita em gel
15% de acrilamida. Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas
PVDF durante 15 min (80 mA) em tampão Tris-glicina (25 mM Tris-HCl, glicina 192 mM,
pH 7,0) contendo 20 % de metanol. As membranas PVDF foram incubadas em TTBS (TrisHCl 20 mM, 500 mM NaCl, 0,05% Tween-20, pH 7,5) contendo 2 % de albumina de soro
bovina (Sigma) por 2 h a 4 °C. Então, as membranas foram incubadas por 2 h a temperatura
ambiente com anticorpo anti TTR de coelho (DAKO, 1:10.000) contendo 2 % de albumina de
soro bovina. Após extensiva lavagem em TTBS, as membranas PVDF foram incubadas com
anticorpo anti IgG de coelho conjugado com a enzima fosfatase alcalina (Sigma, 1:5.000) por
1 h a 25 ºC na presença de 2 % de albumina de soro bovina. A imunoreatividade das proteínas
foi visualizada usando-se BCIP e NBT (Sigma), substrato para a fosfatase alcalina.
A Figura 7 mostra o esquema ilustrativo resumindo os passos descritos acima e descritos
posteriormente nos itens 12, 13 14.
A25T solúvel
A25T agregado
de pH 7,3 e 5,0
Coluna de
polimixina B
Western Blot
Dosagem de
NO e IL1β
PAGE Nativo
TTR
TTR
0,5
1
2
Concentração (μM)
Figura 7. Metodologia empregada para o preparo das amostras de A25T usadas nas culturas
celulares. A proteína A25T foi purificada como descrito anteriormente (LASHUEL et al., 1999),
e aplicada em coluna de polimixina B para a remoção de endotoxinas. A pureza dessas amostras
foi confirmada por PAGE nativo e Western Blot, sendo superior a 90 %. As amostras foram
incubadas em diferentes condições e aplicadas nas células de microglia isoladas de camundongos.
Do sobrenadante do meio de cultura foi feita a dosagem de óxido nítrico (NO) e interleucina 1
beta (IL1β). A viabilidade celular também foi avaliada por diferentes técnicas.
11- Análise da viabilidade de células neuronais na presença de agregados de A25T
142
As células utilizadas neste ensaio foram culturas imortais de neuroblastoma (N2A)
cultivadas como descrito previamente (GOMES et al., 2008). As células foram cultivadas em
meio Dubecco’s modificado Eagle’s suplementado com 10% de soro fetal bovino e 2% de
antibióticos (penicilina, eritromicina e gentamicina) em atmosfera com 5% de CO2 por 3 dias
a 37 °C. As células foram transferidas para placas de 96 poços (5000 células/poço) e as
amostras de TTR foram adicionadas na concentração de 1 μM por 3 dias, e após esse tempo,
foram realizados os ensaios de viabilidade celular utilizando-se MTT (item 13). As culturas
de N2A foram feitas em colaboração com a doutoranda Priscila F. Silva do nosso laboratório.
12- Cultura primária de microglia
Com a finalidade de avaliar a capacidade da variante A25T ativar células microgliais
induzindo resposta inflamatória, foram feitos ensaios utilizando-se uma linhagem primária de
células microgliais de córtex murino. As células foram isoladas de camundongos suíços recém
nascidos e purificadas para obter ~ 99% de células microgliais totais (LIMA et al., 2001). As
culturas de microglia foram feitas em colaboração com o laboratório do Professor Vivaldo
Moura Neto, através da Professora visitante Flávia R. S. Lima e sua orientanda de mestrado
Anna Carolina Fonseca. Para cada ensaio, as células foram aderidas a uma placa de 96 poços.
Foram utilizadas amostras de A25T na forma solúvel e agregada. Como controle positivo de
ativação microglial, foi usado LPS na concentração de 100 ng/ml e como controle negativo
apenas o meio de cultura. O ensaio foi feito num período de 48 h e tanto as células como o
sobrenadante da cultura foram processados e analisados. Para a dosagem de IL1β as células
foram primadas por 6h com 10 ng/ml com LPS a fim de se estimular a produção de pró-IL1β
(HALLE et al., 2008) e, então, incubadas durante a noite na presença das diferentes amostras.
Como controle positivo foi usado ATP na concentração de 3 mM.
13- Ensaios de Viabilidade Celular: MTT, incorporação de timidina tritiada e
Live/Dead
Para realizar o ensaio fluorimétrico Live/Dead (Molecular Probes), foram utilizados
calceína e brometo de etídio diluídos em meio DMEM sem soro. As amostras foram
incubadas protegidas da luz com a solução de Live/Dead por 30 minutos e fixadas após este
período com paraformaldeído 4%. Para realizar o ensaio colorimétrico com MTT foi feita
uma solução estéril de MTT 1 mg/ml em PBS pH 7,3 que foi adicionada ao sobrenadante da
cultura de células e deixado sob incubação a 37ºC, 5% de CO2 por 2 horas. Após este período,
143
o sobrenadante foi delicadamente retirado e o formazan diluído com DMSO. A leitura da
absorbância foi feita em 570 nm e calculada a porcentagem de formazan metabolizado usando
como controle as células expostas somente ao meio de cultura (MOSMANN, 1983). O ensaio
de incorporação de timidina tritiada foi feito como descrito anteriormente (JIANG et al.,
1995).
14- Dosagem de óxido nítrico (NO) e IL- 1β em cultura primária de microglia
A dosagem de NO foi feita indiretamente através da dosagem de nitrito pelo método de
Griess, a partir da mistura do sobrenadante da cultura de células na proporção (1:1) com os
reagentes sulfanilamida 0.1% e N-1-naftiletilenodiamina 0.1% (NIMS et al., 1996). A
absorbância foi coletada em 540 nm e o cálculo da concentração feito através da regressão
linear da curva de nitrito e da fórmula: Concentração (µM)= DO540/inclinação. As dosagens
de IL- 1β foram feitas com o uso de kit comercial (PeproTech, New Jersey) com o
sobrenadante das culturas de acordo com as recomendações do fabricante.
15- Ensaio de fagocitose dos agregados de A25T por células de microglia
As células de microglia foram cultivadas como descrito acima na presença de A25T
solúvel ou agregada marcadas com a sonda fluorescente acrilodan. Após 24h de incubação, as
amostras foram lavadas e fixadas em paraformaldeido 4% para posterior análise em
microscópio de fluorescência. A droga citocalasina D (inibidora de fagocitose) foi utilizada na
concentração de 2,5 µM a fim de se avaliar se o fenômeno em questão foi dependente de
fagocitose.
144
RESULTADOS
1. Estrutura cristalográfica da proteína A25T
Inicialmente, buscamos resolver a estrutura da variante A25T para tentar compreender o
porquê da sua grande instabilidade e seu alto potencial amiloidogênico (SEKIJIMA et al.,
2003). Desta forma, as estruturas de A25T e TTR selvagem (wt) foram resolvidas por
cristalografia de raio-X com cristais crescidos nas mesmas condições de cristalização. Os
dados da coleta e refinamento estão descritos na Tabela 1.
A estrutura cristalina consiste de dois monômeros por unidade assimétrica denominados
monômero A e B. A Figura 8B mostra a melhor sobreposição estrutural entre a proteína wt e
duas estruturas de A25T resolvidas independentemente. Uma grande diferença entre A25T e a
proteína wt é observada, sendo que, em média, o desvio médio quadrático dos carbonos alfa
(RMSD Cα) ficou em torno de 0,83 Å. As estruturas dos dois cristais de A25T mostram boa
sobreposição (Figura 8B), indicando reprodutibilidade na cristalização, difração, estrutura
resolvida e refinamento. A região de maior sobreposição entre a TTR wt e A25T situa-se
entre os aminoácidos 90 a 95 (fita F) com 0,3 Å de RMSD. Todas as demais regiões
desviaram muito em relação à TTR wt, indicando mudanças conformacionais importantes na
estrutura da variante A25T causada pela mutação. Como comparação, a Figura 8C mostra o
Desvio do monômero A do mutante L55P, onde foram encontradas as maiores modificações
estruturais descritas até então para TTR (SEBASTIÃO et al., 1998). Na média, o RMSD do
carbono alfa da estrutura do variante L55P sobreposta com a TTR wt é de 0,50 Å, enquanto
que para A25T os valores são de 0,83 Å. A única região onde os valores de RMSD de L55P
são maiores que os de A25T corresponde aos aminoácidos 54 e 55, local da mutação L55P.
A Figura 9 mostra a sobreposição da estrutura da TTR wt e da variante A25T, revelando o
afastamento das fitas beta em A25T, que aumenta à medida que seguimos do centro para a
periferia da molécula. Isso é evidenciado pelo aumento na distância das pontes de hidrogênio
intramoleculares (Figura 10), que são importantes para o enovelamento do monômero. Além
disso, a distância das pontes de hidrogênio que ajudam a formar o dímero da TTR que se dá
através de interações entre as fitas H/H’ e F/F’, também são aumentadas na variante A25T
(Figura 11A). Ao contrário do dímero, as principais interações que mantêm o tetrâmero não
são pontes de hidrogênio e sim interações hidrofóbicas (HÖRNBERG et al., 2000). Essas
interações são interações fracas que contribuem para estabilização do tetrâmero da TTR
devido à cooperatividade entre elas (HÖRNBERG et al., 2000). A variante A25T possui
145
praticamente a metade dessas interações, quando comparada com a proteína wt: 59 contra
110, respectivamente. Além disso, a distância dessas ligações e aumentada na variante A25T
(Figura 11B). Esses dados indicam que a mutação A25T causa profunda alteração estrutural,
comprometendo diversos tipos de interação importantes para a manutenção da proteína no
estado tetramérico. Essas alterações explicam a maior instabilidade da variante A25T e, por
conseguinte, sua maior amiloidogenecidade.
2. Efeito de ligantes na estrutura de A25T
Diversos trabalhos mostram que além da tiroxina (T4), várias moléculas são capazes de se
ligar à TTR (JOHNSON et al., 2005). Essas moléculas pertencem as mais variadas classes, a
saber; polifenóis como o resveratrol (KLABUNDE et al., 2000); isoflavonas como a
genisteína (GREEN et al., 2005) e anti-inflamatórios não esteroidais (AINE), como o ácido
flufenâmico, diclofenaco entre outros (KLABUNDE et al., 2000). A maioria dessas moléculas
causa em algum grau a diminuição da agregação da TTR por diminuir a dissociação do
tetrâmero (JOHNSON et al., 2005).
Com o objetivo de avaliar se as mudanças causadas pela mutação A25T poderiam ser
revertidas pela ação de ligantes, cristais de A25T foram incubados em solução contendo as
seguintes moléculas: tiroxina (T4), a sonda fluorescente 1-anilino-8-naftaleno sulfonato (1,8
ANS) e ácido flufenâmico (Figura 13A). As estruturas cristalográficas de A25T complexada
com esses ligantes foram, então, resolvidas. A Figura 12A mostra o Desvio da sobreposição
entre A25T na forma apo ou ligada com T4 e a proteína TTR selvagem. A maior parte das
alterações estruturais causadas pela mutação A25T são revertidas pela ligação a T4 (Figura
12A). De maneira similar, a ligação com ácido flufenâmico e 1,8 ANS também leva a variante
A25T a assumir a conformação mais próxima da proteína selvagem (Figura 12B). De fato, o
RMSD médio usando como referência a proteína wt cai de 0,83 Å para a forma apo de A25T
para 0,42, 0,37 e 0,51, paras as formas ligadas a 1,8 ANS, T4 e ácido flufenâmico,
respectivamente (Figura 13B).
A estabilização causada pelos ligantes foi confirmada em ensaios de agregação usando T4
como modelo. Para tal, duas amostras de A25T, uma com e outra sem T4 foram incubadas em
pH 5,0. A amostra sem T4 agregou em menos de uma hora, enquanto a presença de T4 inibiu
por completo a agregação de A25T (Figura 13C).
146
Tabela 1. Dados cristalográficos e refinamento de dados da difração da TTR selvagem e A25T na forma apo e na
presença de ligantes.
selvagem
A25T
apo #1
Dados e parâmetros
P21212
P21212
25, 85~1,90
24,55~1,65
(1,95~1,90)
(1,69~1,65)
42,4, 83,5, 63,5
45,1, 87,8, 66,6
unidade assimétrica
2
Multiplicidade
Completeza (%)
Grupo espacial
Resolução (Å)
Dimensões da célula a, b, c (Å)
apo #2
P21212
Ácido
1,8ANS
T4
Flufenâmico
P21212
P21212
P21212
64,42~1,80
65,2~1,90
64,3~1,9
(1,85~1,80)
(1,95~1,90)
(1,94~1,90)
45,1, 87,8, 66,8
43,3, 85,3, 64,4
43,9, 85,6, 65,2
43,1, 85,3, 64,3
2
2
2
2
2
3,2 (2,1)
7,6 (7,4)
5,8 (5,7)
3,4 (3,4)
4,6 (4,6)
4,1 (4,1)
97,0
99,9
99,9
99,8
98,6
99,8
28,44-1,80
Número de subunidades na
{I/σ(I)}
19,9 (3,2)
22,8 (4,9)
14,2 (2,3)
16,7 (4,2)
17,5 (4,4)
17,6 (5,0)
Rmerge (%)
5,7 (25,4)
5,7 (33,4)
8,9 (62,7)
5,1 (24,7)
5,7 (31,0)
6,1 (26,0)
N° de reflexões
16.837 (1.163)
30.872 (2.229)
23.907 (1.716)
21.568 (1.552)
18.676 (1.325)
18.174 (1.337)
N° de reflexões usadas por Rfree
909 (71)
1.647 (116)
1.286 (89)
1.162 (70)
1.009 (76)
1.146 (84)
Rwork / Rfree (%)
19,4 / 25,4
14,5 / 21,2
18,4 / 23,5
20,3 / 24,9
20,1 / 25,5
20,8 / 24,5
26,3
24,9
23,97
23,6
25,0
25,8
2/231
0/230
0/230
0/230
0/230
0/230
0,02
0,04
0,03
0,02
0,01
0,01
2,13
2,12
1,80
1,67
1,08
1,45
Refinamento
2
Bfactor (Å )
Gráfico de Ramachandran- não
permitidos
Rmsd distância de ligação (Å)
o
Rmsd ângulo de ligação ( )
147
H
G
D
A
C
B
E
F
A
3.0
monômero A 1
monômero B 1
Desvio Cα (Å)
2.5
monômero A 2
monômero B 2
A25T
2.0
1.5
B
1.0
0.5
0.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 110 120 130
Amino ácido
3.0
A25T
Desvio Cα (Å)
2.5
monômero A
L55P
2.0
1.5
C
1.0
0.5
0.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 110 120 130
Amino ácido
Figura 8. Mudanças estruturais causadas pela mutação A25T. A) Modelo esquemático da
estrutura secundária da TTR onde as fitas beta estão em rosa, à alfa hélice em vermelho, os loops
em azul e o C e N terminal em amarelo. B) Cálculo do desvio da sobreposição dos monômeros A
e B da proteína selvagem versus duas estruturas independentes de A25T (1 e 2). Notar a grande
sobreposição entre os monômeros 1A e 2A e entre os monômeros 1B e 2B, mostrando que as duas
148
estruturas de A25T são idênticas. C) Análise comparativa entre o monômero A das variantes
A25T e L55P (5ttr.pdb) calculada da mesma forma que em (B). A unidade assimétrica da TTR é
um dímero, portanto, os monômeros A e B não possuem estrutura idêntica e foram analisados
independentemente. A análise comparativa dos monômeros foi feita através do programa
Superpose da suíte de programas CCP4i (POTTERTON et al., 2003; ver Material e Métodos). A
Figura A foi feita usando o servidor PDBsum (http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/).
wt
A25T
Figura 9. Sobreposição da TTR selvagem com a variante A25T. Em azul, a proteína selvagem
(wt) e em vermelho, A25T. Notar o aumento nas distâncias entre as fitas beta adjacentes de A25T
partindo do centro para a periferia da proteína (seta pontilhada). Figura gerada usando PyMol.
149
wt
A25T
Fitas
D
A
G
H
Figura 10. Sobreposição da estrutura da proteína selvagem (cinza) e A25T (verde). Detalhes
das pontes de hidrogênio intramoleculares onde ocorre o aumento nas distâncias na proteína A25T
quando comparada com a proteína selvagem (wt). Figura gerada pelo programa PyMol.
150
Dímero AB
B
Interface de tetramerização
17.5
A25T (n = 18)
wt (n = 18)
Frequência
Frequência
4
3
2
1
15.0
A25T (n = 59)
12.5
wt (n = 110)
10.0
7.5
5.0
2.5
0
2,
65
2,
70
2,
75
2,
80
2,
85
2,
90
2,
95
3,
00
3,
05
3,
10
3,
15
2,
6
2,
7
2,
8
2,
9
3,
0
3,
1
3,
2
3,
3
3,
4
3,
5
3,
6
3,
7
3,
8
3,
9
0.0
Distância (Å)
Distância (Å)
Figura 11. Histograma das distâncias entre os contatos entre diferentes sub-unidades da
TTR. A) Análise comparativa entre as distâncias das pontes de hidrogênio existentes entre os
monômeros A e B (dímero AB) da TTR na proteína selvagem (azul) e da variante A25T
(vermelho). No eixo y, freqüência é o número absoluto de contatos existentes com a distância em
angstrons (Å) descrita no eixo x. B) Análise similar à descrita em (A) usando todos os contatos
responsáveis pela tetramerização da TTR. Ambas as Figuras foram geradas usando o servidor
PDBsum (http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/).
151
A
3.0
monômero A
monômero B
Desvio Cα (Å)
2.5
monômero A + T4
monômero B + T4
A25T
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 110 120 130
Amino ácido
B
Monômero A
Monômero B
Ácido flufenâmico
T4
1,8 ANS
Ácido flufenâmico
T4
1,8 ANS
3.0
A25T
Desvio Cα (Å)
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 110 120 130
Amino ácido
Figura 12. Efeito da ligação das moléculas T4, 1,8 ANS e ácido flufenâmico na conformação
da variante A25T. A) Os monômeros A e B da proteína A25T ligados ou não a tiroxina (T4) são
comparados à proteína TTR selvagem na forma apo. Notar a diminuição das distâncias em ambos
os monômeros de A25T ligada com T4 em relação à proteína A25T na forma apo. B)
Sobreposição dos monômeros A e B de A25T ligada a T4, ácido flufenâmico e 1,8 ANS em
relação à forma apo da TTR selvagem. Os três ligantes causam mudanças muito similares em
A25T. Análise feita através do programa Superpose da suíte de programas CCP4i (POTTERTON
et al., 2003).
152
A
1,8 ANS
T4
Ácido flufenâmico
B
C
1.0
1,8 ANS
Ácido Flufenâmico
0.8
D0 400
monômero A
monômero B
T4
0.6
A25T pH 5,0
0.4
A25T pH 5,0
+ T4 (1:20)
0.2
Apo
0.0
0.0
0.2
0.4
0.6
RMSD Cα (Å)
0.8
0
10
20
30
40
Tempo (min)
50
Figura 13. Conseqüência da ligação de ligantes na conformação e amiloidogenecidade de
A25T. A) Estrutura das moléculas 1,8 ANS, tiroxina (T4) e ácido flufenâmico. B) Média geral do
RMSD calculado pela sobreposição das formas apo, ligada ao 1,8 ANS, T4 e ácido flufenâmico de
A25T contra a forma apo da proteína selvagem. Dados calculados usando a Figura 12B. C) Perfil
de agregação de 3,5 μM de A25T a 25 °C em pH 5,0 na ausência (vermelho) e na presença de 70
μM de T4 (azul). Medida feita através da densidade óptica a 400 nm (DO400).
3. Análise da estabilidade da variante A25T frente à Alta Pressão Hidrostática
(APH)
A estabilidade desta variante foi previamente avaliada usando-se como agente
desnaturante variações de pH (SEKIJIMA et al., 2003), que, por sua vez, atua
desestabilizando as ligações intramoleculares que levam a dissociação do tetrâmero em
monômeros parcialmente desenovelados que agregam formando fibras amilóides (PEPYS,
2006). Decidimos avaliar a estabilidade da A25T frente à APH, conforme em estudos
prévios feito pelo nosso grupo com a TTR. A pressão hidrostática é muito útil, tanto como
ferramenta para o estudo de complexos protéicos (DNA-proteína, RNA-proteína), quanto
para o estudo do enovelamento e dissociação de proteínas (SILVA et al., 2001). Foram
realizadas duas titulações de pressão, a primeira com o intuito de observar se havia
153
dependência de temperatura e a segunda para analisar a dependência de concentração na
dissociação e desnaturação dos tetrâmeros (Figuras 14A e 14B). Observamos, através da
análise do desvio do centro de massa espectral do triptofano, que a dissociação da variante
A25T é dependente de temperatura, havendo perda de estrutura quaternária e terciária em
pressões menores quando em baixas temperaturas, como 1°C (Figura 14A) (FERRÃOGONZALES et al., 2003). No entanto, não observamos diferença de estabilidade quando
variamos a concentração de proteína de 1 μM para 10 μM (Figura 14B), o que seria
A
340
1 μM
342
37 °C
1 °C
344
346
348
350
0
1000
2000
Pressão(bar)
3000
Centro de massa espectral (nm)
Centr o de mass
assa
a espectr al (nm )
esperado para o processo de dissociação.
B
340
1 °C
342
10 μM
1 μM
344
346
348
350
0
1000
2000
3000
Pressão(bar)
Figura 14. Dissociação-desnaturação da variante A25T submetida à alta pressão
hidrostática. O centro de massa espectral do triptofano foi seguido em função da pressão em pH
7,5. A) Experimento realizado a 37 ºC ou a 1 ºC usando-se 1 μM de A25T. B) Dependência de
concentração frente à pressão para 1 ou 10 μM de A25T pressurizados a 1 °C. Em todos os
ensaios as mudanças observadas foram reversíveis.
4- Comparação da estabilidade das variantes A25T e L55P frente à APH
Decidimos comparar a instabilidade da variante A25T em relação a variante L55P, a
variante associada à forma da doença mais agressiva, utilizando APH como agente
perturbador. Após um ciclo de compressão e descompressão, pudemos observar que a
variante A25T dissocia em menor pressão que a variante L55P (Figura 15A). O p1/2 (valor de
pressão necessário para atingir 50% de dissociação-desnaturação) da variante A25T foi de
600 bar, valor bem menor que os 900 bar necessários para dissociar-desnaturar a proteína
L55P (Tabela 2). Usando-se os dados apresentados na Figura 2A e as equações descritas na
secção de Material e Métodos, calculamos o ∆G, variação de energia livre, e o ∆V, variação
de volume para cada variante (inset). Observamos que a variação de volume foi similar para
154
as duas variantes (Tabela 2), ao passo que a variante A25T apresentou menor estabilidade
termodinâmica quando comparada a L55P, embora a diferença tenha sido pequena (Tabela 2).
Tabela 2. Parâmetros termodinâmicos
da dissociação de A25T e L55P
1.0
ln (α4/1-α)
0.8
α
0.6
0.4
0.2
-2
-6
0
0.0
0
1000
L55P
A25P
-10
400
800
Pressão (bar)
2000
L55P
A25T
ΔV (ml/mol)
328 ± 16
362 ± 88
ΔG (kcal/mol)
27,6 ± 0,23
25,0 ± 0,89
P ½ (bar)
900
600
3000
Pressão (bar)
Figura 15. Comparação entre a estabilidade à alta pressão hidrostática entre as variantes
A25T e L55P. Extensão da reação (α) calculado com a equação 2 descrita em Material e Métodos
usando a curva apresentada na Figura 14B. Condições: concentração de proteína 1 μM,
temperatura 1 °C e pH 7,5. O inset representa a regressão linear das curvas da Figura 14B
calculado de acordo com a equação 1 descrita em Material e Métodos. Em todos os ensaios as
mudanças observadas foram reversíveis.
5- Agregação da TTR em pH 7,3 monitorado por gel filtração
A TTR wt não agrega em pH próximo da neutralidade. Resolvemos avaliar se o mesmo
ocorria com a A25T, principalmente porque o pH do líquor é próximo de 7. Para isso,
incubamos a variante A25T em pH 7,3 a 37 °C e monitoramos sua agregação durante 30 dias
usando gel filtração (Figura 16A). Comparamos sua agregação com a proteína L55P e a
proteína selvagem incubadas nas mesmas condições (Figuras 16B e 16C). A proteína na
forma tetramérica elui em aproximadamente 8,5 min. Com o passar dos dias, observamos um
novo pico correspondente a amostras com maior peso molecular (Figura 16A). O tamanho
dessas espécies é difícil de ser definido, pois o volume de eluição está muito próximo do
volume de exclusão da coluna utilizada e, além disso, o pico é relativamente largo indicando
uma população heterogênea (Figura 16A). Conforme observado, enquanto A25T agregou em
pH 7,3, não observamos a presença de agregados para a proteína selvagem e apenas uma
pequena quantidade para a proteína L55P (Figuras 16B e 16C). Depois de 10 dias, a
quantidade de agregados de A25T se manteve estável até 30 dias de incubação (Figura 16D).
155
A
A25T
B
tetrâmero
tetrâmero
L55P
agregados
agregados
C
tetrâmero
% Agregados
wt
D
40
30
20
L55P
A25T
10
0
0
10
20
30
Tempo (dias)
Figura 16. Cinética de agregação da proteína wt, A25T e L55P em pH 7,3 monitorada por
gel filtração. Amostras da variante A25T (A), L55P (B) e TTR selvagem (C) foram incubadas em
pH 7,3 na concentração de 3,5 μM a 37 °C. Durante 30 dias, alíquotas foram retiradas e aplicadas
na coluna de gel filtração GPC300 para monitorar a agregação das amostras. O eixo y indica a
fluorescência do triptofano (Ex: 280 nm, Em: 320 nm) em unidades arbitrárias. D) Porcentagem
de agregados formados calculada a partir das Figuras 16A e 16B. 100% é a somatória da área do
pico dos agregados e do tetrâmero para cada amostra.
6- Caracterização dos agregados amilóides através da ligação a corantes específicos
Observamos que a variante A25T agrega mesmo em condições brandas como pH 7,3. Para
caracterizar esses agregados como fibras amilóides, realizamos ensaios com os corantes
vermelho do Congo e tioflavina T. Apesar de desconhecermos ao certo qual o mecanismo de
ligação desses corantes (HAWE et al., 2008), sabe-se que as mais diversas fibras amilóides
podem ser caracterizadas através de ensaios bioquímicos de ligação a eles (WU et al., 2005).
Como observado na Figura 17, a proteína A25T agregada por 30 dias em pH 7,3 a 37 °C ligase fortemente aos dois corantes testados. Como controle, usamos a proteína A25T solúvel ou
a proteína wt incubada por 30 dias em pH 7,3, que apresentaram apenas ligação residual a
ambos os corantes. Esses dados sugerem que os agregados formados por A25T em pH 7,3 são
agregados amilóides.
156
mol VC/mol ptn
1.25
1.00
1.50
Vermelho do Congo (VC)
Fluorescência de ThT
1.25
1.00
0.75
0.75
0.50
0.50
0.25
0.25
0.00
0.00
wt
A25T solúvel
A25T agregada
Intensidade de fluorescência
de tioflavina T (u.a.)
1.50
Figura 17. Caracterização dos agregados de A25T. Análise da ligação de vermelho do Congo
(VC) em barras vermelhas ou da fluorescência de tioflavina T (ThT) em barras amarelas das
amostras de TTR selvagem, A25T solúvel ou agregados de A25T de pH 7,3. O eixo y da esquerda
significa o número de mol de VC ligado por mol de proteína, enquanto o eixo y da direita indica a
intensidade de fluorescência de tioflavina T em unidades arbitrárias (u.a.). Em todos os ensaios a
concentração de proteínas usada foi de 1 μM. Os agregados de pH 7,3 foram obtidos incubando
3,5 μM da proteína A25T a 37 °C por 30 dias.
7- Caracterização morfológica dos agregados por microscopia de força atômica
(AFM)
A técnica que permite a melhor caracterização de agregados amilóides é sua
visualização através de microscopia eletrônica de transmissão ou microscopia de força
atômica (AFM). Escolhemos esta última para caracterizar os agregados obtidos em pH 7,3
(Figura 18). Após 15 dias de agregação, os tetrâmeros (Figura 18A) evoluem para
oligômeros e pequenos agregados fibrilares (Figura 18B). Após 30 dias em pH 7,3, esses
agregados se associam formando fibras amilóides maduras (Figura 18C). Ainda notamos a
presença de grande quantidade de proteína não agregada, mesmo depois de 30 dias de
incubação (Figura 18C). Quando comparamos a morfologia dos agregados obtidos por
incubação em pH 7,3 com aqueles obtidos em pH 5,0, notamos grandes diferenças
morfológicas (comparar Figura 18C com 18D). Enquanto os agregados de pH 7,3
apresentam organização característica de fibras amilóides, os agregados de pH 5,0
apresentam-se como grumos ou agregados amorfos (Figura 18D). Mesmo assim, esses
agregados ligam fortemente o corante vermelho do Congo (dados não mostrados). Esses
dados sugerem que, ao menos morfologicamente, os agregados formados em diferentes
157
valores de pH possuem diferenças que podem ser conseqüência da diferente forma que
esses agregados se associam.
A25T solúvel
A25T pH 7,3 15 dias
A
B
C
D
A25T pH 7,3 30 dias
A25T pH 5,0 30 dias
Figura 18. Microscopia de força atômica dos agregados de A25T. Amostra de A25T diluída
em pH 7,3 solúvel (A) ou incubada a 37 °C por 15 dias (B) ou 30 dias (C). Também foram feitos
agregados em pH 5,0 onde a amostra foi incubada durante 30 dias a 37 °C (D). Cada imagem tem
2,5 por 2,5 μm.
8- Análise do perfil de digestão por proteinase K dos diferentes agregados de A25T
Observamos anteriormente que a proteína A25T forma fibras com morfologia diferente
dependendo do pH utilizado durante a agregação. Com o objetivo de caracterizar melhor essas
diferenças, foram produzidos agregados de A25T através de incubação nos pH 5,0, 6,0 e 7,0
durante 30 dias a 37 °C. As amostras foram centrifugadas e o precipitado de cada amostra foi
ressuspendido em tampão fosfato pH 7,4. Incubamos esses agregados com a enzima
proteinase K (PK) que de hidrolisa aminoácidos alifáticos e aromáticos apolares. Após a
digestão, as amostras foram aplicadas em SDS-PAGE que nos permite caracterizar a
susceptibilidade dos agregados a esta protease. Quanto mais protegidos estiverem os sítios de
clivagem, menos susceptível à degradação por proteinase K será a amostra. Como observado
na linha 3 da Figura 19, a proteína A25T solúvel foi quase toda digerida pela PK, enquanto os
agregados de pH 5,0 se mostraram muito resistentes à digestão (linha 5). Essa resistência é
perdida gradualmente quando os agregados são formados em pH 6,0 e 7,0 (linhas 7 e 9). Isso
158
sugere que, além das diferenças morfológicas observadas na Figura 18, a estrutura das fibras
formadas por A25T é fortemente dependente do pH utilizado. Mesmo as fibras de pH 7,0, que
apresentaram a maior susceptibilidade à digestão por PK, apresentaram o perfil de digestão
diferente da proteína solúvel (comparar linhas 3 e 9). Os agregados de pH 7,0, mesmo sem
PK, apresentaram algum grau de degradação (linha 8), indicando que parte das fibras
agregadas em pH 7,0 são formadas por fragmentos da proteína A25T.
A25T s
PK
kDa
Agr pH 5,0
Agr pH 6,0
Agr pH 7,0
-
+
-
+
-
+
-
+
2
3
4
5
6
7
8
9
20
15
7
1
Figura 19. Digestão dos agregados de A25T com proteinase K. Os agregados (Agr) de A25T
formados em pH 5,0, 6,0 e 7,0 foram digeridos (+) com proteinase K (PK) por 45 minutos a 37 °C,
antes se serem aplicados em SDS-PAGE 15%. Como controles, foram usados agregados que não
foram digeridos (-) com PK e a proteína solúvel (A25T s) com (+) e sem (-) digestão por PK.
9- Agregação da variante A25T em plasma humano
Com o objetivo de se aproximar ainda mais do ambiente fisiológico onde a proteína A25T
agrega, foram realizados ensaios de agregação em plasma humano. Como dito anteriormente,
o fluido ideal seria o líquor, mas, devido à dificuldade em obter esse tipo de material, optamos
por realizar nossos experimentos em plasma humano. Nesse caso, tivemos que marcar a
proteína A25T com uma sonda fluorescente (acrilodan) para possibilitar sua observação em
um ambiente tão complexo como o plasma humano. A Figura 20A mostra o PAGE nativo do
plasma humano (linhas 1 e 2) corado com comassie blue, revelando a grande complexidade
protéica encontrada nessa amostra. Esse mesmo gel foi excitado com luz UV com o objetivo
de revelar apenas a proteína A25T marcada com acrilodan (linha 6). Mesmo amostras de
plasma sem A25T marcada apresentam uma banda forte referente à albumina (linha 5), que se
deve a auto-fluorescência da albumina que ocorre em alta concentração no plasma.
159
A proteína A25T marcada foi incubada em plasma a 25 °C por 5 dias. Observamos que a
banda referente ao tetrâmero (TTR) diminui enquanto que uma nova banda relativa à presença
de agregados de alto peso molecular surge com o passar do tempo (Figura 20B). Como
comparação, foi feito o mesmo experimento usando a variante L55P marcada com acrilodan.
Observamos que a variante A25T agrega mais que L55P (Figura 20B). Através da
quantificação da porcentagem da banda dos agregados em relação à proteína solúvel, foi
calculada a porcentagem de agregados presentes em função do tempo (Figura 20C). A
agregação de A25T foi mais rápida em plasma que em pH 7,3 (comparar Figura 20C com
16D), sugerindo que, mesmo que o pH do plasma seja igual ao do tampão Tris, outros fatores
podem determinar a cinética de agregação de A25T no plasma.
10- Agregados formados no plasma são constituídos de diversas proteínas
Sabe-se que fibras amilóides são compostas majoritariamente por um tipo de proteína.
Entretanto, várias outras proteínas, como a proteína amilóide do soro P, podem ser
encontradas em depósitos amilóides in vivo (PEPYS, 2006). Essas proteínas se depositam nas
fibras amilóides, e, muitas vezes, são responsáveis por aumentar a estabilidade e por dificultar
seu reconhecimento pelo sistema imune (PEPYS, 2006). A alta amiloidogenecidade da
proteína A25T nos permitiu explorar sua agregação em condições nunca antes exploradas,
principalmente devido ao tempo dos experimentos. Decidimos avaliar se durante a agregação
de A25T observada no plasma, esses agregados seriam capazes de recrutar outras proteínas
plasmáticas. Para isso, incubamos a proteína A25T em plasma humano por 30 dias a 37 °C e
após esse período, centrifugamos e lavamos os agregados obtidos. Esses agregados foram
aplicados em SDS-PAGE como mostrado na Figura 21. Observamos que, além da proteína
A25T (que corre como monômero de 14 kDa) existe grande quantidade de outras proteínas
que co-precipitam com os agregados de A25T. Essas proteínas estão realmente relacionadas
com os agregados de A25T visto que o plasma incubado na ausência de A25T apresenta
pequena quantidade de proteínas que precipitam após 30 dias de incubação a 37 °C (linha 2).
Outro controle usado foi incubar a mesma concentração de A25T em pH 7,3 nas mesmas
condições descritas (linha 3). Observamos que a proteína incubada em tampão pH 7,3
apresenta grande pureza sendo evidente duas bandas, uma de 14 kDa correspondente ao
monômero e outra de 28 kDa referente aos dímeros que persistem mesmo nas condições
desnaturantes do SDS-PAGE. A banda de 14 kDa da amostra incubada em tampão apresentase ligeiramente inferior a banda da amostra incubada em plasma (comparar linha 1 com linha
160
3). Isso indica que durante a agregação em plasma a proteína A25T sofre alguma modificação
pós-traducional.
A
kDa
1
2
3
4
5
6
agregados
272
132
66
albumina
TTR
29
B
A25T
C
L55P
50
agregados
albumina
% Agregados
40
30
20
10
A25T
L55P
0
TTR
0
1
2
3
4
5
6
Tempo (dias)
Figura 20. Monitorando a agregação da TTR em plasma humano. A) As amostras de TTR
foram marcadas com acrilodan como descrito em Material e Métodos com o objetivo de
possibilitar o acompanhamento da agregação da TTR em plasma humano. As linhas 1, 2 e 3
correspondem ao gel PAGE nativo 12% corado com comassie blue enquanto as linhas 4, 5 e 6
correspondem ao mesmo gel excitado com luz UV onde o acrilodan fluoresce. As amostras 2/5 e
3/6 correspondem a plasma humano sem e com adição de 3,5 μM de A25T- acry, respectivamente.
A forte banda próximo a 66 kDa indica a presença da albumina, que mesmo não marcada com
acrilodan também fluoresce devido a sua alta concentração no plasma. A banda abaixo da
albumina corresponde a A25T acry (TTR). B) As proteínas A25T acry e L55P acry foram
incubadas em plasma humano a 25 °C por 5 dias e analisadas por PAGE nativo 12% excitado com
UV. Observar a grande presença de agregados na amostra de A25T em relação à amostra L55P. C)
Cinética de agregação de TTR em plasma humano através da quantificação dos agregados onde
100% corresponde à soma da área da banda dos agregados e da proteína TTR solúvel.
161
kDa
193
103
56
42
28
20
TTR
15
A25T +
plasma
plasma
A25T
1
2
3
6
4
Figura 21. Análise dos agregados de A25T formados em plasma. A proteína A25T na
concentração de 10 μM foi incubada em plasma humano (linha 1) ou em tampão pH 7,3 (linha 3) a
37 °C por 30 dias. Após esse período, as amostras foram centrifugadas, lavadas com H2O e
centrifugadas novamente. Essas amostras foram ressupendidas em tampão de amostra
desnaturante, fervidas e aplicas em SDS-PAGE 15 %. Como controle, uma amostra contendo
plasma humano sem adição de A25T foi submetida às mesmas condições descritas acima, onde
fica evidente que poucas proteínas do plasma precipitam nessas condições.
11- Avaliação da toxicidade dos agregados de A25T
Após a caracterização estrutural, bioquímica e biofísica da variante A25T, ensaios
celulares foram realizados a fim de esclarecer quais os mecanismos celulares responsáveis
pela sintomatologia observada nas AL. Apesar da maioria dos agregados de TTR presentes
nas AL serem encontrados nas leptomeninges e vasos subaracnóides, existem casos onde
ocorre a presença de agregados no parênquima cerebral (NAKAMURA et al., 2005). Com o
objetivo de verificar se os agregados formados pela proteína A25T são tóxicos para células
neuronais, realizamos ensaios de citotoxicidade usando como modelo células de
neuroblastoma murino. A toxicicidade foi avaliada através de redução mitocôndrial do MTT
(MOSMANN, 1983) e da liberação da enzima lactato desidrogenase (RAECHER et al.,
1990). Como observado na Figura 22, os agregados de A25T formados em pH 5,0 e 7,3 na
concentração de 1 μM não foram tóxicos para as culturas de neuroblastoma. Como controle,
162
foi usada a proteína A25T solúvel que também não se mostrou tóxica para as culturas, quando
LDH
% de sobrevivência
MTT
% de sobrevivência
comparada apenas à adição do veículo (PBS).
120
100
80
A
60
40
20
120
100
80
B
60
40
20
ag
re
ga
do
pH
7,
3
5,
0
pH
do
re
ga
ag
A
25
T
A
25
T
so
lú
ve
l
A
25
T
PB
S
0
Figura 22. Viabilidade celular aos agregados de A25T. Culturas de neuroblastoma foram
incubadas por 3 dias com agregados de A25T formados em pH 5,0 ou 7,3 na concentração de 1
μM. Como controles, foram usados o tampão PBS ou 1 μM de A25T solúvel. A viabilidade
celular foi determinada por redução do MTT (A) ou liberação da enzima lactato desidrogenase,
LDH (B). 100% de sobrevivência é relativo à sobrevivência das células incubadas com PBS.
12- Agregados de A25T ativam células de microglia
Parece existir uma forte correlação entre doenças neurodegenerativas, como o mal de
Alzheimer e Parkinson, e o aparecimento de focos de resposta inflamatória, que seriam
desencadeados pelas proteínas desenoveladas ou agregadas (BLOCK & HONG, 2005;
BLOCK et al., 2007, MEDA et al., 2001; JEKABSONE et al., 2006). Existem poucos
163
trabalhos que investigam a correlação entre resposta inflamatória e amiloidose causada por
transtirretina (BUXBAUM, 2006; SOUSA & SARAIVA, 2003; SOUSA et al., 2001) sendo
todos relacionados aos sintomas da FAP. Até o presente momento, não foi demonstrado a
relação entre a agregação da TTR com neuroinflamação. Então, decidimos analisar se a
variante A25T possui a capacidade de induzir resposta inflamatória em culturas primária de
microglia.
A microglia é a célula responsável pela imunidade no sistema nervoso central e quando
ativada muda de uma forma com menor área citoplasmática para uma forma mais amebóide.
As células ativadas expressam diversas moléculas pró-inflamatórias como citocinas e óxido
nítrico (NO) (SUZUMURA, 2002) e são importantes na resposta inflamatória no sistema
nervoso central.
Neste ensaio foi analisada a presença de nitrito, um dos indicadores da produção de NO
liberado após ativação microglial. O nitrito foi dosado do sobrenadante das culturas celulares
estimuladas com a variante A25T solúvel, ou agregada em pH 7,3 ou pH 5,0. Observamos
que, apenas as amostras agregadas são capazes de induzir a produção de NO nas células
microgliais, sendo os agregados de pH 5,0 mais eficientes que os de pH 7,3 (Figura 23A).
Como controle positivo, usamos lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), um conhecido indutor
de resposta inflamatória (RIVEST, 2003). Com o objetivo de avaliar se a indução de liberação
de NO era dependente de fagocitose, incubamos as células nas mesmas condições descritas
acima na presença da droga citocalasina D (Cit-D), um potente inibidor da polimerização da
actina que inibe a fagocitose das células microgliais (MIMURA & ASANO, 1976). Como
observado na Figura 23A, a presença de Cit-D diminui os níveis de NO liberados por células
incubadas com agregados de A25T, sugerindo que sua ativação é dependente de fagocitose.
A presença da citocina pró-inflamatória IL-1β também foi analisada nas amostras de
A25T solúvel e agregada utilizando como controle positivo células ativadas por ATP
(INOUE, 2002). Ao contrário do NO, não observamos em nenhuma situação, exceto no
controle positivo, a liberação de IL1β (Figura 23B).
164
A
LPS
PBS
A25T solúvel
A25T agr pH 5,0 + Cit-D
A25T agr pH 5,0
A25T agr pH 7,0 + Cit-D
A25T agr pH 7,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0.6
0.7
0.8
Nitrito (μM)
B
ATP
PBS
A25T solúvel
A25T agr pH 5,0 + Cit-D
A25T agr pH 5,0
A25T agr pH 7,0 + Cit-D
A25T agr pH 7,0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
IL-1 beta (ng/ml)
Figura 23. Ativação das células de microglia incubadas com agregados de A25T. As células
de microglia foram incubadas com diferentes amostras e o sobrenadante foi retirado para dosagem
de nitrito (produto da degradação do óxido nítrico) (A) e interleucina 1 beta (B). Como controles
positivo e negativo para a dosagem de óxido nítrico, foram usados LPS (100 ng/ml) e tampão
PBS, respectivamente, enquanto para a dosagem de IL1β foram usados ATP (3 mM) e tampão
PBS, respectivamente. A concentração de A25T foi de 1μM para todos os ensaios. Para inibir a
fagocitose foi usada a droga citocalasina D (Cit-D) na concentração de 2,5 µM.
165
13- Fagocitose dos agregados de A25T
Usando a proteína A25T marcada com a sonda acrilodan (A25T acry), foi possível
observar a presença dos agregados de A25T dentro das células de microglia (Figura 24). A
Figura 24A mostra um campo onde as células foram incubadas com a proteína A25T acry
solúvel, onde só é possível a visualização dos núcleos celulares através da marcação com
brometo de etídeo (pontos vermelhos). Por outro lado, células incubadas com A25T acry
agregada em pH 7,3 apresentam intensa marcação citoplasmática relativa à presença dos
agregados. Essa marcação é muito diminuída quando as células são incubadas com Cit-D
(Figuras 24B e 24C), confirmando os resultados descritos na Figura 23A. Detalhes das células
incubadas com agregados de pH 7,3 e pH 5,0 são mostrados na Figuras 24D e 24E,
respectivamente. As imagens revelam a presença de agregados distribuídos no citoplasma
sendo difícil sugerir apenas com essas imagens algum compartimento particular onde esses
agregados podem se acumular.
14- Os agregados de A25T não são tóxicos para as células microgliais
A toxicidade dos agregados de A25T foi avaliada através da incorporação de timidina
tritiada (Figura 25A), contagem do número de células por campo (Figura 25B), redução de
MTT mitocôndrial (Figura 25C) e através da sonda LIVE/DEAD (Figuras 25D-G). Dentre
todos os ensaios testados, houve diferença em relação ao controle apenas na incorporação de
timidina tritiada (Figura 25A). Isso sugere que nas demais situações, A25T solúvel, A25T
agregada pH 7,3 e LPS, as células se proliferaram um pouco menos que o controle (PBS). Os
outros ensaios mostram que a presença de agregados de A25T é capaz de ativar a resposta
inflamatória sem comprometer a viabilidade celular.
166
A
NÚCLEO
A25T acry
B
C
D
E
Figura 24. Fagocitose de agregados de A25T por células de microglia. Amostras de A25T
marcadas com acrilodan (A25T acry) foram incubadas com células de microglia por 24 horas. Após
esse período as células foram fixadas e o núcleo das células foi corado com brometo de etídeo. A)
A25T solúvel. Agregados produzidos em pH 7,3 incubados na ausência (B) ou presença de 2,5 µM de
citocalasina D (C). Em D e E, imagens ampliadas de células incubadas com agregados de A25T
produzidos em pH 7,3 e 5,0, respectivamente. Em todos os ensaios a concentração de proteína usada
foi de 1 μM. A marcação em verde corresponde a A25T marcada com acrilodan (A25T acry) enquanto
em vermelho os núcleos celulares estão marcados com brometo de etídio. Aumento de 200X em A,
B e C e de 2000X em D e E.
% CPM 3H-Timidina
167
100
N° células/campo
p < 0,005
LIVE
*
*
75
*
50
DEAD
D
E
F
G
25
400
B
300
200
100
125
MTT
% de sobrevivência
A
C
100
75
50
25
10
0
ng
/m
l
7,
3
LP
S
pH
ag
re
ga
do
so
lú
ve
l
A2
5T
A2
5T
PB
S
0
Figura 25. Viabilidade das células de microglia incubadas com agregados de A25T. Incorporação
de timidina tritiada (A), contagem do número de células por cinco campos em microscopia com
aumento de 20 vezes (B), redução de MTT (C) de células de microglia incubadas por 48 horas com as
seguintes amostras; tampão PBS (D), A25T solúvel (E), agregados de A25T pH 7,3 (F) e LPS 100
ng/ml (G). As mesmas amostras foram usadas para o ensaio de LIVE/DEAD (D, E, F e G) onde
células viáveis são marcadas com calceína (verde) e células mortas são marcadas com brometo de
etídio (vermelho). Aumento de 200X.
168
DISCUSSÃO
Apesar da estabilidade termodinâmica ser um parâmetro importante na agregação
amilóide, a taxa com que os tetrâmeros de TTR se dissociam em monômeros parcialmente
desenovelados
parece
ser
o
principal
fator
na
amiloidogenecidade
da
TTR
(HAMMARSTROM et al., 2002). A partir dos resultados descritos anteriormente, pudemos
observar que a variante da transtirretina A25T é altamente instável quando comparada a
variante associada à forma da doença mais agressiva, L55P. A sua instabilidade foi
demonstrada através de experimentos utilizando alta pressão hidrostática, onde observamos
que a dissociação da A25T ocorre em menor pressão quando comparada a L55P (Figura 15).
Através do cálculo dos parâmetros termodinâmicos, pudemos analisar que os valores de ∆G
variam quando comparamos as variantes A25T e L55P (Tabela 2). O cálculo dos ∆G de
associação revelou que a variante A25T é 2,6 kcal/mol mais instável que a proteína L55P.
Isso explica em parte por que a proteína A25T agregou mais que L55P em todos os ensaios
analisados (Figuras 16 e 20). Quanto aos valores de ΔV não observamos diferenças
significativas (Tabela 2). Esse dado foi inesperado, pois como a mutação A25T torna a TTR
mais expandida, esperávamos que a variação de volume durante sua dissociação-desnaturação
fosse diferente da encontrada na variante L55P.
Resolvemos avaliar através de cristalografia de raios X se a mutação A25T causava
grandes perturbações na estrutura da proteína. A resolução da estrutura cristalizada da A25T
nos permitiu identificar algumas diferenças estruturais significativas entre a A25T e a TTR
wt. Algumas destas mudanças estruturais provavelmente afetam o enovelamento da proteína e
a intensidade de interação entre cada resíduo, como demonstrado nas Figuras 8, 9, 10 e 11.
Cada monômero da transtirretina tem um núcleo hidrofóbico composto por 8 folhas beta que
interagem entre si mantendo o monômero enovelado. Ao contrário das mudanças estruturais
descritas para outras mutações da TTR, a mutação A25T realmente afetou de maneira
significativa a estrutura nativa da TTR. Essas mudanças não se concentraram apenas no local
próximo a mutação. De maneira geral, toda a estrutura foi comprometida, resultando no
afastamento entre as folhas beta que enfraqueceria as interações hidrofóbicas destas regiões
facilitando a dissociação do tetrâmero (Figuras 8-11). Como conseqüência dessa conformação
anômala da variante A25T, verificamos, através de ensaios de agregação em pH 7,3, a rapidez
da formação de agregados amilóides da variante A25T, que ocorreu em menos de 5 dias em
plasma humano (Figura 20).
169
Analisamos a organização dos agregados formados em pH 7,3 por AFM, verificamos que
estes possuem estrutura amilóide (Figura 18) que foi confirmada pela grande afinidade pelo
corante Vermelho do Congo e tioflavina T (Figura 17). Essa caracterização de agregados de
TTR formados em pH brando ainda não foi descrita na literatura. Isso traz novas
possibilidades na caracterização dos agregados de TTR in vitro, pois as informações
estruturais dos agregados de TTR descritas até o presente foram obtidas usando-se condições
drásticas de agregação. Nossos dados sugerem que os agregados formados em pH 7,3 são
distintos dos agregados em pH 5,0 (Figuras 18 e 19). Como a agregação em pH 7,3 é muito
mais lenta que em pH 5,0, seria esperado que os agregados de pH 7,3 fossem mais
organizados que os de pH 5,0. Morfologicamente isso foi evidente (Figura 18). Entretanto,
quando avaliamos a susceptibilidade desses agregados à proteinase K, observamos que os
agregados de pH 7,3 foram mais susceptíveis a ação desta enzima sugerindo que esses
agregados são mais frouxos e expõem mais resíduos ao solvente que os agregados de pH 5,0
(Figura 19). Seria interessante no futuro, uma caracterização mais detalhada desses diferentes
agregados, a fim de se determinar quais as semelhanças e diferenças entre eles.
Os agregados de A25T formados em plasma possuem associados a ele uma grande
variedade de proteínas plasmáticas (Figura 21). Não sabemos se esse comportamento seria
reproduzido em um ambiente menos complexo como o líquor. De qualquer forma, esse dado
sugere que durante ou após a agregação, os agregados de A25T recrutam outras proteínas que
não agregariam espontaneamente (Figura 21). Já foi descrito que a presença de agregados
amilóides de outras proteínas, como por exemplo, lisozima ou albumina bovina, pode
antecipar a agregação da proteína alfa-sinucleína (YAGI et al., 2005). Neste caso, foi sugerido
que a grande variação conformacional da proteína alfa-sinucleína permite que ela se adapte a
presença de sementes de outras proteínas distintas, acelerando sua agregação. No nosso caso,
não sabemos se as proteínas associadas aos agregados de A25T também estão agregadas na
conformação amilóide ou se são apenas proteínas que se associaram à região exposta ao
solvente dos agregados de A25T. Certamente, a presença dessas proteínas poderia
comprometer o clearance desses agregados exacerbando sua toxicidade. Outra questão em
aberto é qual a identidade dessas proteínas. A resposta para essas questões pode trazer
informações que nos aproximem mais da verdadeira identidade dos agregados de TTR,
tornando mais viável à interdição em alguma etapa desse processo capaz de inibir as
conseqüências deletérias da agregação da proteína TTR.
A participação de variantes altamente amiloidogênicas, como a A25T, na patologia da
amiloidose leptomeningeal e em outras amiloidoses ainda não foi elucidada. Observamos que
170
os agregados de A25T não são tóxicos às culturas de neuroblastoma (Figura 22). Como
descrito anteriormente, intermediários oligoméricos são mais tóxicos que fibras amilóide
maduras. Uma possibilidade para explicar a ausência de toxicidade dos agregados de A25T
pode estar no fato de termos usado agregados maduros. Entretanto, não observamos nenhuma
toxicidade quando usamos amostras de A25T solúvel (Figura 22). Nessas amostras, depois de
três dias de incubação com as células de neuroblastoma, foram encontradas espécies
oligoméricas (dados não mostrados) similares às encontradas durante 3 dias de agregação de
A25T em tampão pH 7,3 (Figura 16). Isso indica que mesmo espécies oligoméricas de A25T
na concentração de 1 μM não são tóxicas às células de neuroblastoma. Os trabalhos que
mostraram citotoxicidade de agregados de TTR contra este tipo de células usaram a
concentração de proteínas três vezes maior que a usada nesta tese (REIXACH et al., 2004).
Isso pode explicar em parte a ausência de toxicidade por nós observada.
Também analisamos se a variante amiloidogênica A25T era reconhecida como molécula
estranha por células da imunidade inata. Nos experimentos com cultura primária de microglia,
observamos que a forma agregada da A25T é reconhecida e induz a ativação microglial
induzindo também a liberação de óxido nítrico (Figura 23). É importante ressaltar que nas AL
ocorre com freqüência o rompimento de vasos cerebrais. Isso pode ser devido ao
comprometimento da vasculatura devido ao acúmulo de agregados de TTR. Isso pode ser
agravado pela possível inflamação local desencadeada pelas células de microglia. Na tentativa
de remover esses agregados, a microglia, através da ação do óxido nítrico, pode aumentar a
permeabilidade vascular tornando o quadro do paciente ainda mais grave.
Um resultado surpreendente foi a ausência de produção da citocina IL1β pelas células de
microglia ativadas por agregados de A25T (Figura 23). IL1β é uma citocina pró-inflamatória
responsável, entre outras coisas, por ativar fagócitos e células mononucleares durante a
inflamação (LEMERE, 2007). Recentemente, foi descrita a liberação de IL1β através da ação
do conjunto de proteínas denominado inflamassomas (MARTINON et al., 2007).
Inflamassomas são um conjunto multimérico de proteínas citoplasmáticas encontradas em
fagócitos que controlam a liberação de IL1β. Partículas como urato (MARTINON et al.,
2006), asbesto (DOSTERT et al., 2008) e mesmo agregados de Aβ (HALLE et al., 2008)
induzem, via inflamassomos, a liberação de IL1β em fagócitos. Imaginávamos que esse seria
um mecanismo geral das células fagocíticas contra material insolúvel. Entretanto, não
observamos esse comportamento para agregados de A25T. Não sabemos por qual via os
agregados de A25T induzem a liberação de óxido nítrico. Alguns potenciais alvos descritos
171
para outros agregados amilóides na literatura são o receptor RAGE (CHEN et al., 2007),
CD36 (KOENIGSKNECHT & LANDRETH, 2004) e CD47 (BAMBERGER et al., 2003). A
participação desses receptores pode, no futuro, ser testada através do uso de inibidores ou
anticorpos específicos.
Observamos que diferentes ligantes reduzem as mudanças estruturais causadas pela
mutação A25T (Figuras 12 e 13) e, ao menos para a tiroxina, a ligação à variante A25T inibiu
por completo sua agregação em pH 5,0 (Figura 13C). Esses dados somados a diversos
trabalhos da literatura apontam para o uso de ligantes como estratégia terapêutica para tratar
as amiloidoses causadas por TTR. Os AINE estão entre os ligantes mais promissores graças a
sua alta atividade inibidora da agregação da TTR e ao fato dos testes clínicos para muitos
deles já terem sido realizados. No caso da variante A25T, o ácido flufenâmico é um bom
candidato (Figuras 12 e 13). Sua ação pode se dar ao menos de duas formas, quais sejam,
inibindo a agregação de A25T e diminuindo a ativação microglial. Sabe-se que a formação de
lamelipódios, protusões citoplasmáticas que ocorrem durante a fagocitose da microglia, é
dependente de canais de cloreto (FURTNER et al., 2007). Esses canais são inibidos pelo
ácido flufenâmico (ZIERLER et al., 2008). Portanto, o uso de ácido flufenâmico, proibido nos
EUA, mas permitido no Brasil, poderia diminuir a fagocitose dos agregados e conseqüente
liberação de óxido nítrico, diminuindo as hemorragias causadas pelos agregados de A25T.
Em resumo, a caracterização estrutural e bioquímica da variante A25T pode ser expandida
para outras mutações da TTR onde a caracterização ficaria inviável devido ao longo tempo
dos experimentos. Mostramos que essa mutação causa profunda mudança estrutural que
aumenta a taxa de dissociação da TTR. Isso nos permitiu caracterizar agregados formados em
condições mais próximas da fisiológica. Observamos que esses agregados formados em pH
7,3 diferem dos agregados formados em pH 5,0, sugerindo que sejam vistos com cautela os
dados estruturais obtidos através da agregação da TTR em pH ácidos. Também mostramos
pela primeira vez que esses agregados são fagocitados por células microgliais, o que sugere a
participação dessas células no mecanismo patológico das AL. Ainda não sabemos se esses
dados se reproduzem in vivo e caso o sejam não sabemos qual o papel das células microgliais
na curso da doença. Também mostramos que os ligantes T4, 1,8-ANS e ácido flufenâmico
revertem parcialmente às mudanças causadas pela mutação A25T, sugerindo que AINE
possam ser usados na terapia contra as AL. Esses dados serão, em breve, agrupados na forma
de dois manuscritos, um relativo aos dados estruturais e outro aos dados celulares, que serão
submetidos para publicação.
172
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
• Graças a grande instabilidade da variante A25T fomos capazes de formar agregados de
TTR em condições bandas como, por exemplo, em pH 7,3. Observamos por AFM e
digestão com proteinase K que esses agregados são diferentes dos agregados formados em
pH 5,0. Seria interessante uma caracterização mais detalhada dos agregados de pH 7,3, já
que esse valor de pH nos parece mais fisiológico. Uma possibilidade seria o uso de RMN
acoplada a troca de hidrogênio e deutério. Como o HSQC da TTR já está assinalado,
poderíamos produzir A25T marcada com
13
Ce
15
N e produzir os agregados de pH 7,3.
Como já observamos que esses agregados são sensíveis a presença de SDS (dados não
apresentados), poderíamos colocá-los em D2O e SDS e realizar diversos espectros de
RMN a fim de determinar o grau de exposição dos resíduos ao solvente.
• Observamos que ao agregar em plasma humano, os agregados de A25T arrebanham
uma enorme quantidade de proteínas. Seria interessante caracterizar quais são essas
proteínas por proteoma. Outra questão é saber se esse tipo de comportamento também
ocorre com a proteína incubada no líquor.
• Observamos que os agregados de A25T não são tóxicos à cultura de neuroblastoma,
nem a cultura primária de neurônios (dados não mostrados). Devemos aprimorar esse
ensaio aumentando a concentração de A25T e separando os agregados insolúveis dos
oligômeros solúveis. Também seria interessante avaliar se o sobrenadante da cultura de
microglia causa alguma disfunção às culturas neuronais. Isso pode ser feito através de coculturas onde os neurônios e a microglia ficam separados por uma membrana semipermeável.
• Os melhores modelos in vivo para o estudo das doenças amilóides causadas por TTR
são ratos transgênicos que expressam diferentes mutações da proteína como, por exemplo,
a mutação V30M (UEDA et al., 2007). Apesar de serem o sistema que mais se aproxima
do real, esse animais apresentam acúmulos de amilóides principalmente no intestino e
esôfago, locais onde são encontrados pouco ou nenhum agregado nas três formas de
amiloidose causadas por TTR em humanos. Agregados nas leptomeninges nunca foram
observados nesses animais, tornando o entendimento das AL ainda mais difícil. Nossa
173
proposta é injetar agregados da proteína A25T marcados com a sonda fluorescente
acrilodan no ventrículo (local da síntese de líquor) de animais sadios. Usando cortes
histológicos analisados por microscopia de fluorescência, objetivamos avaliar se esses
agregados são capazes de se acumular no sistema nervoso desses animais a fim de dar o
primeiro passo na criação de um modelo animal de estudo para as AL.
174
PARTE IV
Os resultados apresentados nesse artigo apontam para um possível protocolo a ser
usado no tratamento da PAF que se baseia na obtenção de monômeros da T119M
através do uso de alta pressão hidrostática, 4M de uréia, pH 5,0 e 1 ºC. Nessa condição,
fomos capazes de dissociar de maneira irreversível o tetrâmero deste variante
extremamente estável da transtirretina. Os monômeros desenovelados de T119M ficam
aprisionados enquanto houver uréia no tampão. Quando diluídos em tampão sem uréia,
esses monômeros se enovelam rapidamente em monômeros que, com o passar das
horas, se re-associam formando tetrâmeros. O fato da associação desses monômeros em
tetrâmeros ser lenta nos abriu uma janela de tempo para a produção de heterotetrâmeros
formados por subunidades altamente amiloidogênicas, como por exemplo, V30M, L55P
e A25T, e subunidades não amiloidogênicas, T119M. Observamos que a formação de
heterotetrâmeros foi capaz de estabilizar as variantes A25T, L55P e V30M da TTR,
mesmo quando os experimentos foram realizados em plasma, prevenindo dessa forma
sua agregação. Esses resultados foram publicados no periódico The Journal of
Biological Chemistry em 2009.
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 284, NO. 3, pp. 1443–1453, January 16, 2009
© 2009 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Printed in the U.S.A.
Trapping the Monomer of a Non-amyloidogenic Variant
of Transthyretin
EXPLORING ITS POSSIBLE USE AS A THERAPEUTIC STRATEGY AGAINST TRANSTHYRETIN
AMYLOIDOGENIC DISEASES *
Received for publication, September 12, 2008, and in revised form, October 28, 2008 Published, JBC Papers in Press, November 4, 2008, DOI 10.1074/jbc.M807100200
Fernando L. Palhano, Larissa P. Leme, Roberta G. Busnardo, and Debora Foguel1
From the Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Biologia Estrutural, and Instituto Milênio de Biologia Estrutural e
Biotecnologia Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 21941-590, Brazil
Transthyretin (TTR)2 is a 55-kDa homotetrameric protein
composed of identical 127-residue subunits with a predomi-
* This work was supported by grants from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Comissao de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nivel Superior, and Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio
de Janeiro. The costs of publication of this article were defrayed in part by
the payment of page charges. This article must therefore be hereby
marked “advertisement” in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to
indicate this fact.
1
To whom correspondence should be addressed. Tel.: 55-21-2562-6761;
E-mail: [email protected].
2
The abbreviations used are: TTR, transthyretin; FAP, familial amyloidotic
polyneuropathy; HHP, high hydrostatic pressure; M-TTR, monomer of wt
TTR; wt, wild-type; T4, thyroxine; bis-ANS, bis(8-anilinonaphthalene-1-sulfonate); VBO, 2-[(3,5-dichlorophenyl)amino]benzoic acid; MES, 4-morpholineethanesulfonic acid; HPLC, high pressure liquid chromatography; FITC,
fluorescein isothiocyanate.
JANUARY 16, 2009 • VOLUME 284 • NUMBER 3
nantly ␤-sheet structure (1). TTR is found in human plasma
(0.1– 0.4 mg/ml) and cerebral spinal fluid (0.017 mg/ml). The
plasma form serves as a secondary carrier for thyroxine (T4)
and binds to retinol-binding protein (1), whereas the form that
resides in the cerebral spinal fluid is the primary T4 transporter
(2).
Wild-type TTR is responsible for senile systemic amyloidosis, a disease that affects 10% of people over 80 years old and is
characterized by heavy amyloid deposits in the heart (3).
Around 80 point mutants of TTR have been described thus far
that are involved in familial amyloidotic polyneuropathy (FAP),
familial amyloidotic cardiomyopathy, and central nervous system amyloidosis (4). In general, patients with the familial form
of the disease experience the first symptoms by the time they
reach their second or third decade with peripheral neuropathy,
cardiomyopathy, and leptomeningeal deposition (5).
Among the variants of TTR identified worldwide, V30M and
L55P are the most important because of their high frequency of
occurrence and the aggressiveness of the symptoms they evoke.
A25T is one of the most unstable known tetramer of TTR that
is involved in central nervous system amyloidosis (6). The nonamyloidogenic variant T119M has been described as an interallelic trans-suppressor variant in compound heterozygotes
and has a high frequency of occurrence in the Portuguese population. In heterozygotic individuals, this variant, which forms a
highly stable tetramer (7), ameliorates the effects of the pathogenic mutation, reducing the severity of the symptoms (8, 9).
This variant also presents an enhanced T4 binding capacity.
X-ray crystallography studies have revealed that the substitution of methionine for threonine at position 119, a residue
located in the T4-binding channel, allows for closer contact
between the hormone and the protein and, therefore, the
increased T4 binding affinity of T119M (9, 10). Additionally
T119M carriers have higher TTR serum levels because of the
slow clearance rate of this variant from serum in contrast to
V30M, which is cleared even faster than the wild-type protein
(11).
Several studies have identified the major contributions of
single amino acid substitutions on the thermodynamic stability,
rate of tetramer dissociation, and amyloidogenicity of TTR
(12–14). In a recent report, Hammarstrom et al. (7) observed
that T119M dissociates 40-fold slower and reassembles
90 –200-fold slower than the wt TTR. These slow rates of folding and unfolding allow the protein to be very stable and resist
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
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Downloaded from www.jbc.org at CAPES on January 11, 2009
Transthyretin (TTR) is a 127-residue homotetrameric ␤-sheetrich protein that transports thyroxine in the blood and cerebrospinal fluid. The deposition of fibrils and amorphous aggregates of
TTR in patients’ tissues is a hallmark of TTR amyloid disease.
Familial amyloidotic polyneuropathy is a hereditary form of TTR
amyloidosis that is associated with one among 80 different variants
of TTR. The most aggressive variants of TTR are V30M, L55P, and
A25T, and the propensity to undergo aggregation seems to be
linked to tetramer stability. T119M is a very stable, non-amyloidogenic variant of TTR. Here we show that the combination of high
hydrostatic pressure with subdenaturing concentrations of urea (4
M) at 1 °C irreversibly dissociates T119M into monomers in less
than 30 min in a concentration-dependent fashion. After pressure
and urea removal, long lived monomers are the only species present in solution. We took advantage of the slow reassociation kinetics of these monomers into tetramers to produce heterotetramers
by mixing the T119M monomers with the tetramers of the aggressive mutants of TTR. Our data show that T119M monomers can be
successfully incorporated into all of these tetramers even when the
exchange is performed in a more physiological environment such
as human plasma; these monomers render the resultant heterotetramers less amyloidogenic. The data presented here are relevant for
the understanding of T119M folding and association reactions and
provide a protocol for producing T119M monomers that function as
inhibitorsofTTRaggregationwhenincorporatedintotetramers.This
protocol may provide a new strategy for treating TTR diseases for
which there is no therapy available other than liver transplantation.
Production of Heterotetramers as a Strategy to Prevent FAP
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Chemicals—All reagents were of analytical grade. Bis(8-anilinonaphthalene-1-sulfonate) (bis-ANS) was purchased from
Molecular Probes (Eugene, OR). 2-[(3,5-Dichlorophenyl)amino]benzoic acid (VBO) (23), an analog of diclofenac, was dissolved in DMSO to yield a stock solution of 2 mM. Distilled
water was filtered and deionized through a Milli-Q water puri-
1444 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
fication system (Millipore Corp., Bedford, MA). The high pressure experiments were performed in the following buffer: 50
mM MES, 100 mM KCl, pH 5.0 (buffer A). Urea, when necessary,
was added to this buffer. The experiments performed at pH 7.0
were performed in 50 mM Tris-HCl, 100 mM KCl (buffer B). We
emphasize that MES and Tris buffers were chosen for the pressure experiments because their pH does not change significantly under high pressure. The ⌬V for the protonic ionization
of MES and Tris is positive and equal to 3.9 and 4.3 cm3/mol,
respectively (24).
Protein Purification—Recombinant wt TTR, A25T, V30M,
L55P, monomer of wt TTR (M-TTR), and T119M were
expressed and purified as described previously (25). Protein
concentration was determined using an extinction coefficient
of 7.76 ⫻ 104 M⫺1 cm⫺1 at 280 nm. The engineered M-TTR has
already been described (26); it has two point mutations (F87M
and L110M) that prevent its tetramerization.
Spectroscopic Measurements under Pressure—We used a
high pressure cell equipped with optical windows that has been
described elsewhere (27); it was purchased from ISS Inc.
(Champaign, IL). Fluorescence spectra were recorded on an ISS
K2 spectrofluorometer (ISS Inc.). The kinetic experiments
under pressure were performed by increasing the pressure
quickly to the mentioned values (in less than 1 min); the spectroscopic measurements were then collected over time. In the
experiments where pressure was titrated, pressure was
increased in steps of 200 bars. At each step, the sample was
allowed to equilibrate for 15–20 min prior to making measurements. The high pressure cell was equipped with a circulating bath, which allowed us to control temperature during
compression.
Tryptophan emission spectra were obtained by setting the
excitation to 280 nm and collecting the emission in the 300 –
400-nm range. The mean energy of the fluorescence emission at
pressure p evaluated by the center of spectral mass 冓␯p冔 is given
by Equation 1,
冓 ␯ p冔 ⫽
冘␯ F / 冘F
i i
i
(Eq. 1)
where Fi is the fluorescence emitted at wavelength ␯i. The
degree of dissociation (␣) is related to 冓␯p冔 by the expression
␣ ⫽ 共 冓 ␯ p 冔 ⫺ 冓 ␯ i 冔 兲 / 共 冓 ␯ i 冔 ⫺ 冓 ␯ f冔兲
(Eq. 2)
where 冓␯i冔 and 冓␯f冔 are the initial and final values of the center of
spectral mass in nm, respectively, and 冓␯p冔 is the center of spectral mass at pressure p.
The light scattering increase was measured to evaluate the
aggregation of the protein. Light scattering was measured by
exciting the samples at 320 nm and collecting the scattered light
from 315 to 325 nm. Bis-ANS and VBO spectra were recorded
by exciting the sample at 360 and 320 nm and collecting emission from 400 to 600 and from 450 to 600 nm, respectively.
The experiments shown in Figs. 1–5 were repeated at least
twice, and there was less than 10% discrepancy among them.
For experiments shown in Figs. 6 and 7, the error bars represent
the S.D. of three independent measurements.
Thermodynamic Parameters—The standard volume change
of folding (⌬V) for the M-TTR and for the T119M monomers
VOLUME 284 • NUMBER 3 • JANUARY 16, 2009
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high urea concentrations for long periods of time. For example,
after 96 h of incubation in the presence of 8 M urea, only 40% of
the population of T119M tetramers dissociate into monomers
(7). This high thermodynamic stability displayed by T119M tetramers has been used to explain why this variant protects
against FAP disease: the formation of an amyloidogenic species,
be it a monomer (15), a dimer (16), or an altered tetramer (17–
19), would be disfavored.
Damas and co-workers (9) resolved the atomic structure of
T119M unbound and bound to T4 by x-ray analyses. It was
clear from their data that the enhanced structural stability displayed by T119M is mainly due to new H-bonds within each
monomer and between the monomers as well as to changes in
the overall protein conformation that are provoked by Met-119,
which extends into the T4-binding channel. No major structural changes, however, were observed in the structure of
T119M that could explain its diminished amyloidogenicity.
High hydrostatic pressure (HHP) has been used successfully
to denature and dissociate proteins, protein-DNA complexes,
virus particles (20), and, more recently, protein aggregates and
amyloid fibrils (21). In addition, we have shown recently that
after a cycle of compression-decompression, wt and variants of
TTR (L55P and V30M) form fibrils under mild conditions (pH
5–5.6 at 37 °C). At 1 °C, the main species that is recovered after
a cycle of compression-decompression is the tetramer of TTR;
these tetramers are less stable than the native, non-pressurized
TTR. This altered tetramer is called T4* and is thought to represent a preaggregate state of TTR (17). In these studies (18),
even when low temperature (1 °C) was combined with HHP, we
did not notice any dissociation of T119M, confirming its high
thermodynamic stability as described previously (22).
In the present study, we combined HHP with subdenaturing
concentrations of urea to facilitate the dissociation of T119M
into monomers, and then after decompression and urea dilution, folded monomers were recovered. T119M monomers presented a thermodynamic stability similar to that of the wt monomer, suggesting that most of the differences in stability
between the tetramers of T119M and wt TTR can be attributed
to the intersubunit contacts inside the tetramers and not to the
intrasubunit contacts of the monomers. Our data also show
that T119M monomers can be successfully incorporated into
amyloidogenic tetramers even when the exchange is performed
in a more physiological environment, such as the plasma;
these monomers render the resultant heterotetramers less
amyloidogenic. The data presented here are relevant for
understanding the T119M folding and association reactions
and provide a protocol for producing stable T119M monomers that function as inhibitors of TTR aggregation when
incorporated into tetramers; this protocol may be a new
strategy for treating TTR diseases.
Production of Heterotetramers as a Strategy to Prevent FAP
and the unfolding equilibrium constant (Ku) were determined
from the thermodynamic relation
ln 关共␣p兲/共1 ⫺ ␣p兲兴 ⫽ p共⌬V/RT兲 ⫹ ln Ku
(Eq. 3)
JANUARY 16, 2009 • VOLUME 284 • NUMBER 3
RESULTS
The High Pressure-induced Denaturation of T119M in the
Presence of Subdenaturing Concentrations of Urea Is
Irreversible—We have shown previously that the variants of
TTR, namely L55P, V30M, and T119M, present different levels
of thermodynamic stability against HHP: at 1 °C, L55P ⬍
V30M ⬍ wt ⬍⬍⬍ T119M. Under the conditions we used in this
first study (pH 7.5 or 5.0 and 1 or 37 °C), the tetramers of
T119M were unusually highly resistant to the high pressure
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
1445
Downloaded from www.jbc.org at CAPES on January 11, 2009
where ␣ is the extent of reaction, p correspond to a given pressure, R is the gas constant, and T the temperature in K at which
the experiment was performed. The ⌬V is calculated from the
slope of the curve, and Ku is the intercept on the y axis.
Circular Dichroism Measurements—Circular dichroism
measurements were performed in a Jasco-715 spectropolarimeter (Jasco) using a 1.0-mm-path length quartz cuvette. The
buffer used for circular dichroism measurements was 25 mM
Tris-HCl, 100 mM KCl, pH 7.0, with or without 4 M urea. Data
were averaged for five scans at a speed of 100 nm/min collected
in 0.2-nm steps. The base lines (buffer alone) were subtracted
from the corresponding spectra.
Fibril Formation—Aggregation was performed by incubating
TTR in 20 mM acetate buffer, pH 4.4, at 37 °C for 72 h. Fibrillation of TTR was evaluated by Congo red binding according to
Klunk et al. (28). Briefly the samples were centrifuged at
17,000 ⫻ g for 30 min, and the pellet was resuspended in 5 mM
potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4, and incubated
with 10 ␮M Congo red. Then absorbance was recorded at 540
and 477 nm (28). The increase in absorbance at 400 nm was also
used to evaluate the extent of fibril formation (data not shown
because of their similarity with Congo red).
The HHP protocol to induce fibril formation was also used
(17). Briefly TTR was compressed at 3,000 bars for 60 min in
buffer A at 37 °C to induce the structural modifications that are
necessary to trigger aggregation. After removing the pressure,
the light scattering was measured as stated above to evaluate
the extent of fibril formation.
Size Exclusion Chromatography—High performance liquid
chromatography was carried out in a TSK3000 column at room
temperature using an HPLC system (Shimadzu SPD-10A). The
system was equilibrated in buffer B. A flow rate of 1 ml/min was
used. Sample elution was monitored by Trp fluorescence at 330
nm and absorbance at 280 nm. For T119M labeled with FITC,
the elution was monitored by FITC fluorescence (excitation at
494 nm and emission at 520 nm).
Production of Heterotetramers by HHP Treatment—Monomers or tetramers of T119M were mixed with tetramers of
V30M in a ratio of 2:1 in buffer B. This solution was compressed
at 3,000 bars at 25 °C for 60 min to allow for the complete
dissociation of V30M tetramers (18). After releasing the pressure, samples were kept at 4 °C for 24 h to allow for complete
subunit exchange. This solution was injected into the HPLC
system, and the peak corresponding to the tetramer was collected, concentrated, and used to evaluate the aggregation rate
using the HHP protocol described under “Fibril Formation.”
Production of Heterotetramers at Ambient Pressure—Heterotetramers were produced as described previously (29).
Briefly a solution of T119M monomers, obtained by the HHP
treatment in the presence of 4 M urea, was concentrated in a
Centricon (cutoff, 5 kDa; Millipore Corp.) up to ⬃400 ␮M. Then
this concentrated solution of monomers was rapidly diluted to
8 ␮M in 11 ml of 10 mM phosphate, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1
mM dithiothreitol, pH 7.0, in the presence of a 1 ␮M concentration of the amyloidogenic variants, A25T, L55P, or V30M (ratio
of 2:1 (w/w) T119M monomer:variant tetramer). The mixtures
were dialyzed for 24 h at 4 °C against the mentioned buffer to
remove residual urea and to allow for subunit exchange (incorporation of T119M monomers into the amyloidogenic variants
of TTR). Then this solution was transferred to 37 °C for 72 h to
induce aggregation after being concentrated to ⬃ 21 ␮M and
mixed with equal volumes of 200 mM acetate, pH 4.4. After
acetate addition, the concentrations of amyloidogenic variant
and T119M tetramers were 3.5 and 7 ␮M, respectively. As a
control, the same protocol was repeated replacing T119M
monomers with T119M tetramers where we expected no subunit exchange. The extent of aggregation after subunit
exchange was compared with those displayed by solutions containing 3.5 ␮M A25T, L55P, or V30M alone, which represents
100% aggregation for each variant.
Sample Labeling—The amyloidogenic variant (A25T, L55P,
or V30M) at 200 ␮M was incubated with 2 mM acrylodan in
buffer B for 90 min at 4 °C. Then the free probe was removed by
extensive washing in a Centricon (cutoff, 30 kDa) at 25 °C. The
labeling efficiency was estimated by measuring the absorption
at 372 nm (⑀ ⫽ 1.64 ⫻ 104 M⫺1 cm⫺1) and 280 nm (⑀ ⫽ 7.76 ⫻
104 M⫺1 cm⫺1). For all variants used, the extent of labeling was
higher that 75%. A similar protocol was used for labeling
T119M with FITC except that in this case we used the buffer 10
mM phosphate, 100 mM KCl, pH 7.0. Labeling efficiency was
calculated by absorption at 494 nm (⑀ ⫽ 6.8 ⫻ 104 M⫺1 cm⫺1).
Trans-suppression in Human Plasma—T119M monomers at
400 ␮M were diluted to 28 ␮M in human plasma containing a 3.5
␮M concentration (2:1, w/w) of the amyloidogenic variants
A25T, L55P, or V30M, which had been previously labeled with
acrylodan. The samples were incubated at 4 °C for 24 h to allow
subunit exchange. Then to induce protein aggregation, a small
volume of 0.5 M HCl was added to change the plasma pH from
7.3 to 4.4. After 72 h of incubation at 25 °C, the appearance of
aggregates and the extent of remaining acrylodan-labeled tetramers were estimated by measuring the fluorescence intensity
of this band on native PAGE (10%) under UV light. The bands
were quantified by Image J (30). The fraction of remaining tetramers was calculated by dividing the fluorescence intensity of
the band corresponding to the acrylodan-labeled tetramers
incubated at pH 4.4 for 72 h by the intensity of this band before
acidification (soluble tetramers). The same protocol was performed with TTR variants in the absence of T119M monomers
or in the presence of T119M or wt tetramers (same ratio: 2:1,
w/w). Electrophoresis was performed at 4 °C with 100 V and
protection from light.
Production of Heterotetramers as a Strategy to Prevent FAP
1446 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
Downloaded from www.jbc.org at CAPES on January 11, 2009
treatment (18). Its partial dissociation-denaturation has been
shown previously to occur only at high urea concentrations (8
M) for prolonged incubation times (96 h (7)).
To find an experimental condition under which the quaternary and tertiary structures of T119M could be perturbed more
easily and rapidly, we performed several pressure titration
curves at pH 5.0 and 37 °C in the presence of increasing subdenaturing concentrations of urea, ranging from 2 to 4.5 M (Fig.
1A, hollow symbols). We followed the changes in the center of
spectral mass of Trp fluorescence emission to evaluate the
extent of dissociation-unfolding of T119M; because TTR has
two Trp residues per monomer, they have been used as suitable
sensors of the changes in tertiary structure of TTR (12, 17, 18,
31). As seen in Fig. 1A, at 37 °C, pressure titration in the presence of increasing concentrations of urea promoted a progressive but partial shift to the red of the maximum emission of Trp,
suggesting an incomplete denaturation event. Even in the presence of 4.5 M urea and 3.0 kilobars, the maximum emission of
Trp reached only 346 nm, a value compatible with a large but
incomplete exposure of the Trp residues to the aqueous
environment.
Because it has previously been shown that low temperatures
facilitate the dissociation of TTR (7, 17, 18), we performed a
pressure titration curve at 1 °C in the presence of 4 M urea,
aiming to destabilize the tetrameric structure of T119M even
more (Fig. 1A, filled circles). Under these conditions, the maximum emission of the Trp shifted to 350 nm, suggesting that the
Trps were fully exposed to the aqueous environment. Thus, to
be dissociated and unfolded in a short time frame, the tetramers
of T119M need a combination of HHP, urea, and low temperature. As shown in Fig. 1A by the isolated symbols on the left,
however, after decompression in any condition, the maximum
emission of Trp did not return to its original value (342 nm),
indicating that the structural perturbation induced by HHP in
the presence of urea is irreversible. As shown previously, even
after 96 h in the presence of 8 M urea, denaturation of T119M is
only partial (40%) and does not reach equilibrium (7).
To address the time dependence of the HHP-induced dissociation of T119M in the presence of urea, kinetic experiments
were performed at 3,000 bars (1 °C at pH 5.0); the data are
shown in Fig. 1B. As expected, the higher the concentration of
urea added to the medium, the faster the dissociation of the
tetramers: in the presence of 4 M urea, the complete exposure of
Trp to the red (351 nm) took ⬃20 –30 min, whereas at 4.5 M
urea, this transition took around 5 min. Again the process was
irreversible as indicated by the lack of recovery of the initial
value of the Trp maximum emission (isolated symbols on the
left).
The dissociation of oligomeric proteins such as TTR is
expected to be accompanied by dependence on protein concentration (32). To investigate whether the reaction under question was indeed the dissociation of T119M tetramers into
monomers or the denaturation of the monomers inside the tetramer, we followed the shift in Trp emission as a function of
time in the presence of 4 M urea at 1 °C at two protein concentrations, 4 and 16 ␮M (Fig. 1C). As expected for a dissociation
reaction, the dissociation of T119M was slower at 16 ␮M than at
4 ␮M, confirming that the tetramers of T119M are indeed being
FIGURE 1. HHP induces dissociation-denaturation of TTR T119M in the presence of subdenaturing concentrations of urea. A, the center of spectral mass
of Trp emission was followed as a function of pressure at 37 °C in the presence of
2 (ƒ), 3 (䡺), 4 (E), or 4.5 M (〫) urea or in the presence of 4 M urea at 1 °C (F). The
inset shows the emission spectra of Trp before pressure in the presence of 4 M
urea, pH 5.0, at 1 °C (continuous black line); at 3,000 bars (dashed line); or after
returning to atmospheric pressure (gray line). [Protein] ⫽ 2 ␮M in all measurements. B, kinetics of the pressure-induced dissociation-denaturation of T119M (2
␮M) at pH 5.0 at 1 °C as followed by the shift in the center of spectral mass of Trp
emission in the presence of 1 (f), 3.5 (Œ), 4 (F), or 4.5 M (⽧) urea. In C, 4 (Œ) or 16
␮M (F) T119M was subjected to 3,000 bars at 1 °C at pH 5.0 in the presence of 4 M
urea, and the center of spectral mass of Trp emission was measured as a function
of time. The isolated symbols on the left in all panels represent the center of mass
values achieved after decompression; the incomplete recovery of the initial value
suggests that there is irreversibility in the structural perturbations induced by
.HHP. Excitation, 280 nm; emission, 300 – 400 nm. a.u., arbitrary units.
VOLUME 284 • NUMBER 3 • JANUARY 16, 2009
Production of Heterotetramers as a Strategy to Prevent FAP
FIGURE 2. Following dissociation-denaturation of T119M induced by HHP
in the presence of 4 M urea at 1 °C by VBO and bis-ANS binding. A, 3 ␮M
T119M was incubated in the presence of 10 ␮M VBO, a fluorescent probe that
binds to the T4-binding channels. When free in solution, VBO has no fluorescence emission, whereas upon protein binding its quantum yield increases
considerably (inset, filled squares). Upon compression, the VBO spectral area
decreases, suggesting that the T119M tetramers have dissociated. The inset
shows the fluorescence emission spectra of VBO at 0 bar (f), 2,350 bars (E),
2,750 bars (), and 3,120 bars (䡺) and after returning to atmospheric pressure
(F, superimposed with 䡺). Excitation, 320 nm; emission, 450 – 600 nm. B, 1 ␮M
JANUARY 16, 2009 • VOLUME 284 • NUMBER 3
T119M was incubated in the presence of 5 ␮M bis-ANS and subjected to
increasing pressures in the presence of 4 M urea. The extent of bis-ANS binding was evaluated by measuring the bis-ANS spectral area (excitation, 360
nm; emission, 400 – 600 nm). Inset, bis-ANS emission spectra at atmospheric
pressure (f), 1,654 bars (E), and 3,120 bars (䡺) and after atmospheric pressure return (F, superimposed with 䡺). C, extent of reaction (␣) as a function of
pressure calculated from Equation 3 using the center of spectral mass data
from Fig. 1A (Œ), the VBO data from Fig. 2A (F), the bis-ANS data from Fig. 2B
(⽧), and the center of mass of Trp emission obtained from the experiment
performed in the presence of VBO (‚). The isolated symbols on the left represent the fluorescence measurements obtained after decompression. a.u.,
arbitrary units.
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
1447
Downloaded from www.jbc.org at CAPES on January 11, 2009
irreversibly dissociated into monomers by HHP and that the
separated monomers are probably being unfolded by the combined action of pressure, urea (4 M), and low temperature (1 °C).
VBO is a fluorescent compound that only fluoresces when
bound to the T4-binding site located at the interface of the TTR
dimers. Fig. 2A (inset) shows the emission spectra of VBO
bound to the tetramers of T119M in the presence of 4 M urea at
1 °C before compression (squares) and at increasing pressures.
This experiment was performed at pH 5.5 because the fluorescence emission of free VBO is pH-dependent and considerably
higher at a pH below 5.5 (not shown). Before compression, the
fluorescence emission of VBO was high because of its binding
to the T4-binding sites in the tetramers. As pressure increased,
the tetramers dissociated, and the fluorescence emission of
VBO dropped considerably (Fig. 2A). Note that after decompression the emission spectrum of VBO remained low (inset,
spectrum in filled circles, which is under the spectrum in hollow
squares and the isolated symbol in the left of A), indicating that
after decompression tetramers do not reassemble.
To obtain additional insights into the tertiary structure content of the species formed under and after HHP treatment, bisANS binding experiments were performed (Fig. 2B). Bis-ANS is
a hydrophobic probe that binds specifically to apolar pockets on
proteins, which are present, for instance, in partially folded species (33). In the case of TTR, as shown previously, the tetramers
bind ANS compounds in the two T4-binding channels present
in the tetramer (Ref. 34 and Fig. 2B, inset). Fig. 2B shows that
upon compression at pH 5.0 at 1 °C, in the presence of 4 M urea,
the fluorescence intensity of bis-ANS decreases to very low values, confirming that the T4-binding sites are being disrupted by
the pressure treatment (Fig. 2B, inset). In addition, because the
spectrum of bis-ANS under pressure was identical to its spectrum when free in water (Fig. 2B, inset), we can conclude that
under pressure in the presence of 4 M urea T119M tetramers
dissociate, and the isolated monomers are completely unfolded.
When pressure is released, bis-ANS binding remains very low
(isolated symbol on the left), confirming that the dissociation
and denaturation processes are irreversible.
Fig. 2C shows the extent of reaction (␣; dissociation-denaturation) as a function of increasing pressure in the presence of 4 M
urea (1 °C) where the shifts in fluorescence signals of Trp (hollow triangles), VBO (circles), and bis-ANS (diamonds) are compared. As seen, the dissociation-denaturation of T119M, as followed by the changes in the signals of these three fluorescent
probes, did not change in a concerted fashion with increasing
pressure, suggesting that the quaternary and tertiary structures
of T119M are lost at different pressure values. Curiously the
Production of Heterotetramers as a Strategy to Prevent FAP
1448 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
FIGURE 3. Unfolded monomers are produced after a compression-decompression cycle of T119M tetramers in the presence of 4 M urea, pH
5.0, at 1 °C. A, 20 ␮M T119M tetramers was subjected to 3,000 bars for 120
min. After decompression, the sample was diluted 10-fold in 25 mM Tris-HCl,
100 mM KCl, pH 7.0, and injected immediately into a TSK3000 size exclusion
column (dashed line). The elution profile of the control, non-pressurized protein is shown as a continuous line. The arrow indicates the elution time of the
engineered monomer of wt TTR (F87M/L110M) that does not form tetramers.
The elution was followed by setting the excitation at 280 nm and collecting
the emission at 330 nm. B, far-UV circular dichroism spectra of T119M tetramers (2 ␮M) in the absence of urea (continuous black line), in the presence of 4 M
urea before compression (dashed black line), or after a cycle of compressiondecompression still in the presence of 4 M urea (8 ␮M; dashed gray line), or after
decompression and urea removal by diluting in 25 mM Tris-HCl, 100 mM KCl,
pH 7.0 (8 ␮M; continuous gray line). The reassembly of T119M monomers was
performed at 25 °C. a.u., arbitrary units; mdeg, millidegrees.
which refold immediately upon urea removal (MT119M, F).
Table 1 summarizes the spectroscopic properties of all the species thus far described.
The Reassociation of the Separated Monomers of T119M into
Tetramers Is a Slow Process—To investigate the kinetics of the
retetramerization of the separated monomers of T119M, a concentrated solution of T119M (20 ␮M) was subjected to 3,000
bars for 2 h in the presence of 4 M urea to produce monomers.
Then after pressure was removed, this solution was diluted 10
times at pH 7.0 at 25 °C, and aliquots of this solution were withdrawn and injected into a gel filtration column (Fig. 4A). Immediately after urea dilution, there were only monomers, which
eluted at ⬃11 min (gray line). Over time, this species disappeared, giving rise to tetramers (peak at ⬃9 min). The complete
reassociation of T119M monomers into tetramers was very
slow, taking several hours (Fig. 4A, inset), and even 8 h after the
urea dilution there were still 40% monomers remaining. The
VOLUME 284 • NUMBER 3 • JANUARY 16, 2009
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signal from VBO, which supposedly binds exclusively to the
T4-binding channels, was the last one to be perturbed by HHP,
suggesting that the T4-binding channels remain organized at
least up to 2,000 bars. We thought that perhaps the presence of
VBO would stabilize the T119M tetramers. In fact, when the
center of spectral mass of the Trp emission in the absence (Fig.
2C, filled triangles) or in the presence of VBO (hollow triangles)
are compared, a slight increase in stability of the tetramers with
VBO is evident, suggesting that VBO protects the quaternary
structure of T119M against HHP.
Bis-ANS also binds in the T4-binding channels of TTR, but
lower pressure values are required to release this binding (Fig.
2C, diamonds) than with VBO. It is possible that the differences
in affinity displayed by these two probes for the T4 channels
would explain their different profiles of unbinding under pressure where VBO, with a higher affinity, would stabilize the tetramers most.
Because the spectra of the three different probes (tryptophan, VBO, and bis-ANS) used to evaluate the quaternary and
tertiary structural changes promoted by HHP on T119M did
not recover to their original position after decompression (see
Fig. 2C, isolated symbols on the left), we performed size exclusion chromatography to characterize the size of the species
present after pressure release (Fig. 3A). It is important to note
that the sample recovered from HHP treatment still contained
4 M urea, which was washed inside the gel filtration column. Fig.
3A shows that the T119M tetramer before compression in the
presence of 4 M urea eluted as a single peak at ⬃9 min. This
elution time is compatible with the tetramer mass (56 kDa). The
sample recovered after pressure release in the presence of 4 M
urea eluted as a major peak at ⬃11 min, the same elution time of
the M-TTR (arrow) that does not form tetramers (26) because
of the presence of bulky residues in the dimeric interface that
impede tetramerization. This result suggests that the tetramers
of T119M are broken apart into monomers by the combination
of HHP and 4 M urea at 1 °C; after pressure release, the monomers remain in solution (Fig. 3A).
To study the secondary structure content of the monomers
formed after pressure release in the presence of 4 M urea, circular dichroism measurements were performed; the data are presented in Fig. 3B. TTR is composed mainly of ␤-sheets, and thus
its circular dichroism spectrum has a minimum at 216 nm (continuous black line). Before compression, even in the presence of
4 M urea, T119M presents a secondary structure content similar
to the one presented by the tetramers in the absence of urea
(compare continuous black line with dashed black line). The
presence of urea compromises the spectrum below 215 nm,
making the comparison difficult in that range. As shown, after
pressure release in the presence of 4 M urea, the monomers that
form have low secondary structure content, suggesting that
they are unfolded (dashed gray line). Thus, the presence of 4 M
urea keeps the monomers apart in an unfolded conformation
that impedes their reassociation into tetramers; however, upon
dilution of the urea (0.4 M), the secondary structure content of
the monomers immediately recovers as indicated by the continuous gray line spectrum in Fig. 3B. Taken together, these results
suggest that after releasing the pressure in the presence of 4 M
urea T119M remains as unfolded monomers (MT119M, U),
Production of Heterotetramers as a Strategy to Prevent FAP
TABLE 1
Comparison between secondary, tertiary, and quaternary structures
of T119M induced by high hydrostatic pressure
Parameter
Trp emission
(nm)
VBO binding
Bis-ANS
binding
Secondary
structure
a
TT119M
(native or
refolded
tetramer)
MT119M, U
(unfolded
monomer
under
pressure)
MT119M, U
(unfolded
monomer
after
pressure)
MT119M, F
(folded
monomer
after
urea removal)
341
351
349
343
⫹
⫹⫹
⫺
⫺
⫺
⫺
⫺
⫹
⫹ (␤-sheet)
NMa
⫺ (residual)
⫹ (␤-sheet)
Not measured; ⫺, no binding or unstructured; ⫹, moderate binding or structured;
⫹⫹, strong binding.
FIGURE 4. Reassembly of T119M monomers into tetramers depends on the
protein concentration and environment. A, 8 ␮M T119M monomers was
injected into the HPLC system in a TSK3000 column; only monomers eluting at
⬃11 min were observed (gray line). Samples were successively withdrawn and
injected into the HPLC system to monitor tetramer formation (inset, hollow circles)
and disappearance of monomer (inset, filled circles). The areas of chromatograms
were used to evaluate the percentage of tetramer formation and monomer disappearance. A shows the elution profile of the samples collected 2 (black dashed
line) and 8 h (gray dashed line) after dilution. For comparison, the elution profile of
the tetramer before compression is shown as a black line. B, 28 ␮M T119M monomers labeled with FITC was added to buffer (25 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, pH 7.0)
(inverted triangles) or to the human plasma (circles). Then the samples were successively withdrawn and injected into the HPLC system. FITC fluorescence was
used to monitor tetramer formation. The inset shows the elution profile of the
samples collected 2 (black dashed line) and 8 h (gray dashed line) after dilution in
human plasma. The elution profile of the monomer labeled with FITC is shown as
a gray line. For comparison, the elution profile of the human plasma without
T119M-FITC is shown as a black line. The reassembly of T119M monomers was
performed at 25 °C. a.u., arbitrary units.
JANUARY 16, 2009 • VOLUME 284 • NUMBER 3
almost complete (75%) reassociation into tetramers occurred
only after ⬃12–14 h.
We next investigated the kinetics of retetramerization of 28
␮M T119M monomers in a more physiological environment
such as the human plasma (Fig. 4B). For comparison, the retetramerization of 28 ␮M T119M monomers was also investigated
in buffer (pH 7.0). We used FITC-labeled T119M monomers to
follow tetramer formation in the plasma. Thus, the monomers
were added to the plasma or to the buffer, and aliquots were
withdrawn over time and injected into a gel filtration column;
the amount of tetramer was quantified (inset). As expected,
retetramerization of the separated monomers was faster at this
higher protein concentration in the buffer (Fig. 4, compare inset
of A with B, inverted triangles) than in the plasma (inset). Even
after a prolonged incubation time, almost 25% of the monomers
remained in solution. This result implies that in the plasma the
monomers of T119M persist longer, probably because of the
complexity of the plasma, and are thus available to be
exchanged and incorporated into the variant tetramers to form
heterotetramers, which is desirable for clinical purposes.
The monomer of T119M Exhibits Thermodynamic Stability
Similar to That of the wt Monomer—Because we found a condition where folded monomers of the T119M exist (short times
after decompression upon urea dilution), its pressure-induced
unfolding at 25 °C was followed by Trp fluorescence emission
and compared with that of M-TTR (Fig. 5). As seen in Fig. 5, the
unfolding curves for M-TTR and the T119M monomers are
very similar, suggesting equivalent thermodynamic stabilities.
In both cases, the unfolding process was fully reversible as seen
by the complete recovery of the center of spectral mass of Trp
after decompression (hollow symbols on the left). The thermodynamic parameters (⌬G0 and ⌬V0) for the folding process of
these two monomeric proteins were calculated from the curves
in Fig. 5 and Equation 3 (Fig. 5, inset, and Table 2).
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
1449
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FIGURE 5. The monomers of the wt and T119M present a similar thermodynamic stability during HHP. The monomers of T119M produced by HHP
treatment were diluted with 25 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, pH 7.0, resulting in a
solution with 4 ␮M monomers and 0.2 M urea. This solution was compressed in
steps at 25 °C, and the center of spectral mass of Trp emission was collected in
each pressure value (F). The wt engineered monomer of TTR was diluted at
the same conditions and subjected to HHP (f). From these data and Equation
3, a plot of ln(␣/1 ⫺ ␣) versus pressure was constructed, and the folding thermodynamic parameters for the monomers were calculated (inset and Table
1). The isolated symbols on the left represent the center of mass achieved after
returning the sample to atmospheric pressure.
Production of Heterotetramers as a Strategy to Prevent FAP
TABLE 2
⌬G and ⌬V values for the folding of the wt and T119M monomers
calculated by Equation 3
Sample
⌬G
⌬V
kcal/mol
ml/mol
wt monomer
T119M monomer
⫺2.47 ⫾ 0.13
⫺2.14 ⫾ 0.07
65 ⫾ 3.0
50 ⫾ 1.7
1450 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
VOLUME 284 • NUMBER 3 • JANUARY 16, 2009
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It is possible to conclude from the analysis of the change in
free energy of folding that the T119M monomer is as stable as
the M-TTR (⌬G ⫽ ⫺2.14 versus ⫺2.47 kcal/mol, respectively),
which suggests that the difference in stability that is observed
between the two tetramers, wt and T119M, resides in the intersubunit contacts (quaternary structure) and not in the intrasubunit contacts (tertiary structure). In addition, the volume
changes upon folding for the T119M and wt monomers were
equal to 50 and 65 ml/mol, respectively (Table 2), values which
are similar to those calculated for other monomeric proteins
(35, 36). The difference between the volume changes, although
small, seems to be significant. It is possible that the mutation at
position 119 creates a more compact monomer with lower
internal void volumes. Additionally the change in volume calculated for the dissociation of the wt tetramer by NMR (37) at
pH 7.5 is equal to 212 ml/mol, a value that is ⬃4-fold higher
than the one obtained for the unfolding of the wt monomer.
Production of Heterotetramers: the Incorporation of
T119M Monomers into Amyloidogenic Tetramers Reduces Its
Amyloidogenicity—With an elegant approach, Kelly and coworkers (29) have been able to isolate T119M/V30M hybrid
tetramers by co-expressing V30M and a tagged version of
T119M in the same bacterial cell. The tagged protein has a
short sequence of anionic residues incorporated into its N terminus. With this tag, it is possible to isolate by ion exchange
chromatography the hybrid tetramers, which have incorporated none, one, two, three, or four tagged T119M subunits. By
studying these mixed tetramers, it was clear that the incorporation of only two subunits of T119M in a V30M tetramer was
enough to almost abrogate its amyloidogenic potential.
Here we took advantage of the folded T119M monomers,
which we were able to isolate after HHP treatment upon urea
dilution, and prepared heterotetramers by mixing these monomers with tetramers composed of V30M, A25T, and L55P, variants involved in FAP or central nervous system amyloidosis.
We emphasize that the monomers that we isolate with a cycle of
compression-decompression are native and have no tag added
to its sequence.
Initially to force subunit exchange, we took advantage of
HHP, which dissociates V30M tetramers in the absence of urea
(18). Thus, 8 ␮M T119M monomers was mixed with 1 ␮M
V30M tetramers at pH 7.0; this mixture was subjected to 3,000
bars for 60 min at 25 °C to allow for the complete dissociation of
V30M tetramers. Then pressure was released, and tetramers
with mixed subunits were randomly formed. This solution was
kept for 24 h at 4 °C to allow for complete heterotetramer formation. Then it was injected into a gel filtration column to
confirm the presence of tetramers (not shown). The peak corresponding to these mixed tetramers was collected, concentrated, and used in the next step of the experiment where aggre-
gation was probed, now at pH 5.0. Of course, this sample was a
heterogeneous population of tetramers composed of zero, one,
two, three, and four subunits of T119M. We subjected these
heterotetramers to HHP using a protocol previously described
by our group (17). Briefly we have shown that after a cycle of
compression-decompression at pH 5.0 and 37 °C, TTR (wt and
variants) aggregates to form amyloid fibrils in less than 30 min.
We postulated that HHP induces a “sick fold” in the protein,
rendering it amyloidogenic.
As seen in Fig. 6A, there was a progressive increase in the
amount of light scattering corresponding to fibril formation
after decompression of a 3 ␮M solution of pure V30M, which
had been compressed for 60 min at pH 5.0 (continuous black
line). At the same concentration (3 ␮M), the mixed tetramers of
T119M and V30M subunits did not show any sign of aggregation after decompression (gray line), confirming the incorporation of T119M subunits into these tetramers and the abolishment of their ability to aggregate. As a control, the same
experiment was performed by incubating 1 ␮M V30M with 2
␮M T119M tetramers (dashed line). There was some aggregation after decompression probably as a result of the 1 ␮M
V30M that was present in the solution. Thus, from these data
we can conclude that the monomers of T119M that are produced after a pressure treatment can be incorporated into
V30M tetramers with the aid of HHP and that this incorporation inhibits amyloidogenesis.
Next we investigated whether subunit exchange could take
place spontaneously, without the aid of HHP, and render the
heterotetramers less amyloidogenic. Several aggressive amyloidogenic variants of TTR, including V30M, L55P, and A25T (1
␮M), were incubated initially in the presence of T119M monomers (8 ␮M) or T119M tetramers (2 ␮M) at 4 °C for 24 h at pH
7.0. It was expected that, under these conditions, subunit
exchange would take place to produce mixed tetramers. Then
the pH was dropped to 4.4, and the samples were kept at 37 °C
for 72 h, a condition that favors aggregation. Turbidity at 400
nm and Congo red binding assays were used to measure the
extent of fibril formation. As a positive control (100% aggregation in Fig. 6B), the mentioned tetramers were incubated alone
at pH 4.4 for 72 h. Fig. 6B shows the results of these experiments. It is evident that the extent of aggregation was significantly decreased in all samples that were previously incubated
with T119M monomers, confirming that subunit exchange had
occurred and provided protection against aggregation. The
variants that were previously incubated with T119M tetramers (T119M(T)) during the exchange phase showed around
90% aggregation, confirming that there was no subunit
exchange when tetramers of T119M were used because of
their high stability.
The Production of Heterotetramers in the Human Plasma: Is
It Possible to Use the T119M Monomers Produced after HHP as
a Strategy to Combat FAP?—Once the production of heterotetramers of T119M subunits combined with V30M, L55P, or
A25T proved to be feasible in buffer and very effective in preventing fibrillogenesis, we wondered whether this feat could be
accomplished in a more physiological environment, such as the
blood plasma. In this case, it was necessary to label the variants
of TTR with a fluorescent probe to track them in a complex
Production of Heterotetramers as a Strategy to Prevent FAP
solution. Acrylodan, which binds covalently to cysteine residues, was chosen. TTR has only one cysteine at position 10. Fig.
7A (as well as C and D, insets) shows native gels illuminated with
UV light, which acrylodan absorbs. In Fig. 7A, lane 0 it is possible to see the band corresponding to the soluble A25TAcryl,
which was added to the plasma. Because the concentration of
albumin in the plasma is very high, it is also possible to detect its
presence under UV illumination (all lanes and lane 1, which
shows the plasma before the addition of A25TAcryl).
When the pH of the plasma containing 3.5 ␮M TTR variants
labeled with acrylodan was decreased to 4.4 by adding a known
JANUARY 16, 2009 • VOLUME 284 • NUMBER 3
FIGURE 7. T119M trans-suppression can take place in human plasma. 3.5
␮M A25T (A and B), L55P (C), and V30M (D) labeled with acrylodan were incubated in human plasma in the absence (lanes 2 and bars 2), in the presence of
28 ␮M T119M monomers (lanes 3 and bars 3), in the presence of 7 ␮M T119M
tetramers (lanes 4 and bars 4), or in the presence of 7 ␮M wt TTR (lanes 5 and
bars 5) for 24 h at 4 °C to allow for subunit exchange. Then the pH was
dropped to 4.4, and the samples were kept at 25 °C for 72 h to allow the
proteins to aggregate. The samples from A25T, L55P, and V30M were applied
to native gel electrophoresis (A and inset of C and D, respectively), and the
bands corresponding to the tetramers were quantified (B, C, and D, respectively). Lane 0 in A shows A25T labeled with acrylodan in its soluble form
immediately after its addition into the plasma. Lane 1 in A shows the plasma
before the addition of the labeled TTR variants. The strong band observed in
this lane corresponds to albumin, which, because of its high concentration in
plasma, absorbs UV light. The gels were illuminated with UV light to visualize
the acrylodan-labeled TTR variants. Note the persistence of the tetramers in
the samples incubated with T119M monomers, suggesting that there was
trans-suppression due to heterotetramer formation. Error bars represent S.D.
of three measurements. * p ⬍ 0.001.
amount of HCl, the proteins aggregated and were seen in the
top of the gels after incubating at 25 °C for 72 h (Fig. 7, A
(A25T), C (L55P), and D (V30M), lanes 2). The acrylodan-labeled aggregates were also detected by gel filtration chromatography (not shown). These results show that it is possible to
follow the aggregation of acrylodan-labeled TTR in a complex
mixture like the human plasma.
Because we were able to successfully follow the aggregation
of acrylodan-labeled TTR in the plasma, the next step was to
investigate whether the aggregation of heterotetramers would
be inhibited in the plasma as it was inhibited in buffer (Fig. 6).
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
1451
Downloaded from www.jbc.org at CAPES on January 11, 2009
FIGURE 6. The incorporation of T119M subunits into amyloidogenic tetramers suppresses aggregation: production of mixed tetramers with the
aid of HHP. A, V30M tetramers (1 ␮M) were compressed for 60 min at 3,000
bars, 25 °C, and pH 7.0 in the presence of T119M monomers (8 ␮M monomers)
to dissociate V30M tetramers. After pressure was returned to atmospheric
levels and mixed tetramers formed, the sample was incubated at 4 °C for 24 h
and injected into the HPLC system to purify the tetramers. The concentration
of tetramers was adjusted to 3 ␮M, and this sample was subjected to 3,000
bars for 60 min at pH 5.0 at 37 °C. Finally the sample was decompressed, and
the light scattering (LS) was analyzed as a function of time (gray line). With the
incorporation of T119M subunits into the tetramers, aggregation was suppressed. As reported previously (18), after a cycle of compression-decompression, V30M undergoes fibrillation (3 ␮M; continuous black line). When 1 ␮M
V30M was compressed in the presence of 2 ␮M T119M tetramers, however,
there was no mixed tetramer formation because of the high resistance of the
T119M tetramer to HHP; the aggregation observed is a result of the V30M
present in the solution (dotted line). B, T119M monomers (M) or tetramers (T)
were incubated at 4 °C for 24 h at pH 7.0 with the amyloidogenic variants
A25T (white bars), L55P (gray bars), or V30M (black bars) to allow subunit
exchange. Then the pH was dropped to 4.4, and the samples were incubated
at 37 °C for 72 h. The extent of aggregation was measured by Congo red
binding assays and by the turbidity at 400 nm (not shown because of its
similarity with Congo red data). The value obtained for each variant upon
allowing it to aggregate alone was taken as 100%. As a control, T119M tetramer (hatched bars) was incubated at pH 4.4 at 37 °C for 72 h. Error bars
represent the S.D. of three measurements. a.u., arbitrary units.
Production of Heterotetramers as a Strategy to Prevent FAP
DISCUSSION
It has been observed that the allele carrying the T119M
mutation alleviates the aggressiveness of the V30M mutation in
Portuguese families that accumulate these two mutations (8, 9).
In vitro studies performed with this non-pathogenic variant
under aggregating conditions also point to its non-amyloidogenicity because no aggregation has been observed thus far. It has
been postulated that aggregation of TTR into amyloid fibrils
depends on the formation of a monomeric, amyloidogenic species that is present at acidic pH (38, 39). Because T119M tetramers are highly stable even when incubated under acidic condition for long times, the T119M amyloidogenic intermediate is
not present, rendering this tetramer non-amyloidogenic. These
observations suggest that the T119M mutation seems to protect against FAP disease by impeding tetramer dissociation.
Thus, it has been reasoned that the incorporation of T119M
subunits into tetramers would render them more stable and less
amyloidogenic.
Some studies have already shown that heterotetramers that
incorporate T119M subunits have a diminished extent of
aggregation in accordance with what has been observed in heterozygous individuals who do not have FAP symptoms. These
studies were performed with a tagged version of T119M, an
ingenious strategy to precisely map the minimum number of
T119M subunits to be incorporated into the heterotetramers to
render them less amyloidogenic or even non-amyloidogenic
(29). However, in these studies there was no attempt to express
stable, homogeneous T119M monomers as would be required
1452 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
FIGURE 8. Schematic summary of the data described here. T119M tetramers (black) under pressure (⫹p) in the presence of 4 M urea at 1 °C and pH 5.0
undergo complete unfolding (step 1) to form MT119M, U. Upon pressure release
(⫺p), the unfolded monomers refold back into native monomers (MT119M, F)
only after the removal of urea (step 2). The reassembly into tetramers is concentration-dependent, and in plasma, it takes longer to complete (step 3). The
T119M monomers, when placed in the presence of the amyloidogenic variants of TTR, exchange subunits to form heterotetramers (step 4) that are less
amyloidogenic (step 5) than the variant homotetramers (step 6).
for therapy. Recently Reixach et al. (40) showed that the very
stable tetramer of mouse TTR did not exchange subunits with
human TTR even when both proteins were incubated for 24 h
at 4 °C, a condition that favors subunit exchange. Heterotetramers were only observed after diluting a solution containing
equal amounts of mouse and human TTR denatured in 6.5 M
guanidinium hydrochloride for 2 days. Thus, our study complements what has been described previously because here we are
proposing a protocol that can produce stable monomers of
T119M, and these monomers have proved to be effective in
preventing the aggregation of several TTR variants even in a
complex environment such as the human plasma, mimicking
what would be envisioned for therapeutic purposes against FAP
disease. Up to now, because of the high thermodynamic stability of the T119M tetramers, it has not been possible to isolate
T119M monomers either for experimental study or as a possible therapy for FAP disease.
Thus, the HHP-protocol presented here represents a possible strategy to be explored to produce monomers of T119M to
be administered to FAP patients. Our results are schematically
summarized in Fig. 8. Under pressure, in the presence of subdenaturing concentrations of urea, such as 4 M, T119M tetramers undergo dissociation and unfolding (step 1). When pressure
and urea are removed, the unfolded monomer immediately
refolds into its native state (step 2); retetramerization is, as
expected, concentration-dependent and slower especially in
the plasma (step 3). When subunits of the variant tetramers of
TTR are allowed to exchange even in a complex solution like
the human plasma, they produce heterotetramers (step 4) that
are less amyloidogenic (step 5) than variant homotetramers
(step 6). This protection against aggregation was observed even
at a molar ratio of 1:2 tetramers:T119M monomers. It is possible that by increasing the amount of T119M monomers aggreVOLUME 284 • NUMBER 3 • JANUARY 16, 2009
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To answer that question, 3.5 ␮M TTRAcryl ((A25T (Fig. 7, A and
B), L55P (Fig. 7C), and V30M (Fig. 7D)) were initially mixed
with 28 ␮M T119M monomers in the plasma. These plasma
solutions were kept at 4 °C for 24 h to allow for subunit
exchange (production of heterotetramers). Then the pH was
decreased to 4.4 to induce the aggregation of TTR. After 72 h at
25 °C, native gels were run to measure the amount of remaining
tetramers; the results are presented in lane 3 of the gels in Fig. 7.
As controls, 3.5 ␮M TTRAcryl was subjected to these treatments
in the presence of 7 ␮M T119M tetramers (lanes 4) or wt tetramers (lane 5). In the gels as well as in the bar plots where the
extent of remaining tetramers was quantified by densitometry
(Fig. 7, B, C, and D), it is evident that only around 10 –15% of
tetramers remained in the positive control samples (homotetramers, bars 2). On the other hand, there was about 35– 45% of
tetramers remaining in the samples that incorporated T119M
subunits in all TTR cases (bars 3), suggesting that the incorporation of T119M monomers to form heterotetramers can take
place in a complex milieu like the human plasma and render the
tetramers less amyloidogenic. When the exchange phase was
performed with T119M tetramers (lanes 4 and bars 4) or wt
tetramers (lanes 5 and bars 5), aggregation was not inhibited;
the amount of tetramer remaining remained as low as the control. The monomers of T119M, when incubated in buffer at pH
7 or in the plasma, did not show any sign of aggregation (not
shown). Taken together, these results have an important implication because it is possible to envision a therapy based on
adding T119M monomers to plasma of FAP patients as an
alternative strategy to treat this disease.
Production of Heterotetramers as a Strategy to Prevent FAP
Acknowledgments—We are grateful to Emerson R. Gonçalves for competent technical assistance and Martha M. Sorenson for critical reading of the manuscript. We thank Dr. J. Kelly for the gift of the TTR
plasmids and for helpful discussions.
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1453
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gation could be further inhibited with a concomitant increase
in tetramer population.
Because it was possible to trap the monomer of T119M, we
were able compare its thermodynamic stability during HHP
with that of the wt monomer. The M-TTR used in the present
study is an engineered version of the protein that has two bulky
mutations that impede tetramerization (F87M/L110M) (26).
Jiang et al. (26) calculated the thermodynamic parameters
for the urea-induced denaturation of M-TTR. The ⌬G0 of
folding for the M-TTR was found to be ⫺5.5 kcal/mol, twice
that obtained in the present study where HHP was the perturbing tool (⌬G0 ⫽ ⫺2.5 kcal/mol). This discrepancy probably arises from the fact that HHP is a gentle tool for denaturing proteins; in general, partially folded states are present
under pressure. The similarity between the thermodynamic
stability of the T119M monomer with that of the wt monomer is consistent with the resolved x-ray atomic structure of
the T119M tetramer where only a few new H-bonds can been
seen within each monomer (9).
Currently the only therapy available for FAP is liver transplantation, which imposes risks for the patients and does not
clear the amyloid deposits that are already present in the
patients (41, 42). Thus, new strategies are clearly required. Several non-steroidal anti-inflammatory compounds and molecules derived from them have been shown to be very effective in
inhibiting aggregation of TTR in vitro (43, 44). These molecules
are not currently available to be administered to FAP patients,
however. New therapies are necessary to treat amyloidogenic
diseases in general and FAP in particular. Of course, additional
experiments are necessary before our strategy can be used in
the clinic, but the results described here point to its potential
use as a treatment.
185
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
• Através de um protocolo usando APH, pH 5,0, 1 ºC e 4M de uréia conseguimos
produzir monômeros da variante T119M capazes de proteger os variantes
amiloidogênicos da agregação. Entretanto, se quisermos dar prosseguimento a essa
estratégia, deveremos retirar por completo a uréia de nosso protocolo devido a sua
grande toxicidade. Conseguimos monomerizar a proteína T119M na ausência de
uréia alterando o pH de 5,0 para 3,0. Entretanto, quando diluímos os monômeros de
pH 3,0 para pH 7,0, a proteína agrega por completo. Conseguimos uma melhora em
50% quando adicionamos ao tampão 1M do osmólito sorbitol, mas temos que
melhorar nosso protocolo a fim de obter o máximo de eficiência.
186
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CURRICULUM VITAE
Nome: Fernando Lucas Palhano Soares
Nascimento: 20/02/1979
Naturalidade: Cachoeiro de Itapemirim, ES
Formação Acadêmica
-Farmácia e Bioquímica – Bacharel pela Universidade Federal do Espírito Santo, 1998 a
2003.
-Aperfeiçoamento Tecnológico - Universidade Federal do Espírito Santo, 2003 a 2004.
- Mestrado em Biologia Vegetal – Programa de Pós Graduação em Biologia Vegetal da
Universidade Federal do Espírito Santo, 2004 a 2005.
- Doutorado em Química Biológica no Instituto de Bioquímica Médica, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, 2005 a 2009.
Orientação de Estudante
1- Estefânia P. C. Azevedo. Iniciação científica. Desde 2007.
2- Liliani Fontes. Iniciação científica. Desde 2007.
3- Roberta G. Busnardo. Iniciação científica. De 2006 a 2008. (atualmente aluna de
mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, UFRJ).
4- Carlos Alberto da Silva Júnior. Iniciação científica. De 2005 a 2006. (atualmente
aluno de mestrado em Engenharia Ambiental, UFES).
5- Gisele Passos Cabral da Silva. Iniciação científica. De 2005 a 2006.
6- Livia Mitsue Gomes Yukizaki. Iniciação científica. De 2005 a 2006.
7- Jéssica Martins de Freitas. Iniciação Científica. De 2004 a 2005. (atualmente aluna de
mestrado em Biotecnologia, UFES).
8- Helena Lima Gomes. Iniciação científica. De 2002 a 2004. (atualmente mestre em
Ciências Fisiológicas, UFES).
Orientação de monografia
1- Olavo Perim Galvão. Influência da alta pressão hidrostática em esporos do fungo
Fusarium subglutinans F.sp. ananas: inativação, alterações morfológicas e
permeabilidade da membrana. 2005. (Graduação em Ciências Biologicas) Universidade Federal do Espírito Santo
Comunicações em Congresso
25 comunicações em congresso nacional
6 comunicações em congresso internacional
Publicações
Luz, J.S, Ramos, C.R.R, Santos, M.C.T, Coltri, P.P, Zanchin, N.I.T, Palhano, F.L,
Foguel, D, Oliveira, C.C. Identification of archaeal proteins that affect the exosome
function in vitro. FEBS J, submetido, 2009.
Follmer, C, Braga, C.A, Khatar, E, Palhano, F.L, Freitas, M.S, Miranda, K, Romão, L,
Lashuel, H.A, Silva, J.L, Foguel, D. The anti-Parkinsonian drug selegiline delays the
nucleation phase of α-synuclein aggregation leading the formation of non-toxic species.
J Biol Chem, submetido, 2009.
Palhano, F.L, Rocha, C.B, Bernardino, A, Weissmuller, G, Masuda, C.A, MonteroLomelí, M, Chien, P, Fernandes, P.M.B, Foguel, D. A Fluorescent Mutant of the NMdomain of the Yeast Prion Sup35 Provides Insight into Fibril Formation and Stability.
Biochemistry, aceito, 2009.
Palhano, F.L, Leme, L.P, Busnardo, R.G, Foguel, D. Trapping the monomer of a nonamyloidogenic variant of transthyretin: Exploring its possible use as a therapeutic
strategy against transthyretin amyloidogenic diseases. J Biol Chem, 284, 1443-1453,
2009.
Palhano, F.L, Foguel, D, Lindsey, G.G, Fernandes, P.M.B. Changes in protein
synthesis induced by high hydrostatic pressure treatment in micro-organisms. Curr
Proteomics, 5, 138-145, 2008.
Palhano, F.L, Vilches, T.T.B, Santos, R.B, Orlando, M.T.D, Ventura, J, Fernandes,
P.M.B. Inactivation of Colletotrichum gloesporioides by high hydrostatic pressure and
citral or lemongrass essential oil. Int J Food Microbiol, 95, 61-66, 2004.
Palhano, F.L, Orlando, M.T.D, Fernandes, P.M.B. Induction of Baroresistance by
hydrogen peroxide, ethanol and cold shock in Saccharomyces cerevisiae. Fems
Microbiol Lett, 233, 139-145, 2004.
Palhano, F.L, Gomes, H.L, Orlando, M.T.D, Kurtenbach, E, Fernandes, P.M.B.
Pressure response in the yeast Saccharomyces cerevisiae: From cellular to molecular
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Domitrovic, T, Palhano, F.L, Barjafidalgo, C, DeFreitas, M, Orlando, M.T.D,
Fernandes, P.M.B. Role of nitric oxide in the response of Saccharomyces cerevisiae
cells to the heat shock and high hydrostatic pressure. FEMS Yeast Res, 3, 341-346,
2003.