Expressão oviduto-específca de duas
proteínas terapêuticas em galinha
transgênica
S. G. Lillico*, A. Sherman*, M. J. McGrew*, C. D. Robertson†, J. Smith†, C. Haslam†, P. Barnard†,
P. A. Radcliffe‡, K. A. Mitrophanous‡, E. A. Elliot†, and H. M. Sang*
Amanda F. Sarmento
Nathani C. B. Denardi
Rafael L. Farinha
Engenharia de Proteínas
Prof. Dr. Marcos Túlio Oliveira
Resumo
Uso de vetores lentivirais para transportar construtos transgenes possuindo
sequências regulatórias originalmente pertencentes ao gene da ovalbumina, e que
serão usados para a expressão de duas proteínas terapêuticas: a miR24 e a hIFNβ1a
Introdução


Estratégia Básica
Focagem da expressão em um tecido secretor

Uso Comum em diversos animais
-
Ovelhas
-
Cabras
-
Gado
-
Coelho
-
Galinhas
Introdução
•
Avanços em Transgenese em Aves
–
Poedeiras como Biorreatores
–
Biorreatores são caros e demoram para ser estabelecidos
Ovalbumina
–
54% da parcela protéica a Clara
–
Expressada nas células da glândula tubular
Relembrando...
Vantagens
•
Uso das Poedeiras e seus ovos
–
Menor Tempo de Introdução
–
Estabilização dos Níveis de Produção Rápida
–
Manejo Barato
–
Potencial de uso de proteínas que são tóxicas às células de mamíferos
–
Perfil de glicosilação beneficial
–
Redução da imunogenecidade do produto purificado
Vetor
•
Vetor lentiviral derivado do virus infeccioso da anemia equina (EIAV)
•
Virus atenuado por deleção de todas as sequências codificadores virais
Transgenes
•
Minianticorpo ScFv-Fc (miR24)
–
Anticorpo monoclonal de camundongo
–
Potencial para o tratamento de melanoma maligno
IFN-β-1a Humana (Human Interferon-β 1a)
•
Expressão dirigida pela sequência regulatória do gene da Ovalbumina de galinhas
Ovalbumina
•
Constitui cerca de 54% da parcela protéica do ovo
•
Expressão somente nas células da gândula tubular do oviduto
•
Sequências regulatorias do gene da ovalbumina são bastante estudadas
•
Objetivo: síntese de proteínas terapêuticas recombinantes funcionais como um
componente da clara dos ovos
Design dos Construtos
•
Vetores EIAV que tem capacidade para 9kb
•
Sequências regulatórias e partes da estrutura éxon/intron do gene da ovalbumina
foram usadas para a construção dos construtos
•
2 construtos: OVA e EREOVA
Construto OVA
•
Elemento regulador dependente de esteróides - SDRE

Elemento regulador negativo - NRE

Exon 1

Intron 1

Começo do Exon 2

2,8 Kb
Construto EREOVA
•
Elemento potencializador respondedor a estrógeno – ERE
•
Aplicado ao 5’ do Elemento Regulador dependente de esteróides - SDRE
•
3,5 kb
Proteínas Alvo
•
Minianticorpo ScFv-Fc (miR24) clonada adjacente à sequência OVA
•
hIFNβ1a clonada adjacente à OVA e EREOVA
Construto OVA
Construto EREOVA
Sequência Reguladora da Ovalbumina
Elementos Lentivirais
•
Sequências regulatórias do gene da Ovalbumina
Produção e Análise das Aves Transgênicas
Vetores foram então injetados em embriões dentro de ovos recém postos para
gerar a G0 (Geração Zero) de aves transgênicas
Produção e Análise das Aves Transgênicas
(OVA-miR24)
•
Foi estimado que um único galo G0 (Ave OR2-4) teria presente a sequência do
vetor (OVA-miR24)
•
Esse OR2-4 foi cruzado com poedeiras de estoque para gerar a geração G1
•
463 pintinhos representam a G1
–
19 (4%) transgênicos
Poedeiras de
Estoque
Galo OR2-4 (G0)
463 Aves (G1)
4%
19 Aves
Transgênicas (G1)
Fragmentação do
DNA
Southern Blotting
Análise da G1 (miR24)
•
Somente uma inserção por ave
•
Hind III → 2 Inserções (13kb e 8 kb)
•
SpeI → 1 Inserção (5,2 kb)
Hind III
SpeI
SpeI
Sítios de Restrição usados na análise de restrição
Hind III
Produção e Análise das Aves Transgênicas
(OVA/EREOVA-hIFNβ1a)
•
Um galo G0 (Ave OI2-4)
–
•
Vetor OVA-IFN
Três galos G0 (Aves EOI2-6, EOI3-11 e EOI3-13)
–
Vetor EREOVA-IFN
•
Esse galos também foram cruzados com poedeiras de estoque para gerar outra geração G1
•
DNA genômico foi isolado de:
–
2 pintinhos G1 (Vetor OVA-IFN)
–
12 pintinhos G1 (Vetor EREOVA-IFN)
Poedeiras de
Estoque
Galo OI2-4 (G0)
2 Aves Transgênicas
(G1)
Fragmentação do
DNA
Southern Blotting
Galo EOI2-6(G0)
Poedeiras de
Estoque
Galo EOI3-11(G0)
Galo EOI3-13(G0)
12 Aves
Transgênicas (G1)
Fragmentação do
DNA
Southern Blotting
Análise da G1 (OVA/EREOVA-hIFNβ1a)
NcoI
Ncol/Ndel
NcoI
NdeI
Sítios de Restrição usados na análise de restrição
Análise da G1 (OVA-hIFNBeta1a) no Ncol
e Ncol/Ndel
•
2 Aves G1 descendentes do
Galo OI2-4 (G0)
•
Lane 10 e 11 no Ncol/Ndel de
3.3 kb
Análise da G1 (EREOVA-hIFNβ1a) no
Ncol e Ncol/Ndel
•
2 Aves G1 descendentes do
Galo EOI2-6 (G0)
•
Lane 8 e 9 no Ncol/Ndel de
4.4 kbb
Análise da G1 (EREOVA-hIFNBeta1a) no
Ncol e Ncol/Ndel

7 Aves G1 descendentes do
Galo EOI3-13(G0)

Lane 1 e 6 com bandas iguais
no Ncol de 6 kb

Lane 1, 3, 6 e 7 no
Ncol/Ndel de 4.4 kb
Análise da G1 (EREOVA-hIFNβ1a) no
Ncol e Ncol/Ndel

3 Aves G1
descendentes do Galo
EOI3-11(G0)

Lane 12, 13 e 14 no
Ncol de 10 kb

Lane 12, 13 e 14 no
Ncol/Ndel de 4.4 kb
Análise da G1 (EREOVA-hIFNβ1a) no
Ncol e Ncol/Ndel

9 aves mostraram o
Transgene intacto de 4.4 kb

3 aves mostraram um
fragmento truncado de 1.2
kb (Um evento de Splicing)
Splicing
•
•
O splicing apresentado foi confirmado através de PCR
Entre um Doador de Splice críptico forte dentro da sequência ERE e o site de
aceitação de splice no exon 2
Expressão do transgene é
restrita ao oviduto

Procurou-se dirigir a expressão do transgene no oviduto de galinhas poedeiras
utilizando sequências reguladoras do gene da ovalbumina para controlar a
expressão das 2 proteínas terapêuticas.

Amostras de tecido: oviduto, pâncreas, cérebro, intestino, fígado, coração e
músculo do peito → adulto G1 e galinhas transgênicas hemizigóticas G2
Avaliar se a expressão do transgene foi restrita ao aviduto de galinhas adultas
Expressão do transgene é restrita ao oviduto


Análises Northern blot do RNA total extraído destes tecidos realizadas em:
2 galinhas G1
2 galinhas G2 portadoras
do transgene OVA-miR24
1 galinha
controle
não transgênica
2 galinhas G2 portadoras
do transgene EREOVA-IFN
Transcrições de ambos miR24 e hIFNβ1a → limitadas à região magno do oviduto,
assim como a transcrição ovalbumina endógena

RT-PCR de amostras de um das galinhas G2 portadora do transgene OVA-miR24
→ confirmação que o transcrito miR24 foi restrito ao magnum
M: magnum
S: baço
P: pâncreas
B: cérebro
H: coração
I: intestino
L: fígado
Br: músculo do
peito
R: miR24
I: hIFNβ1a
O: ovalbumina
18S: RNA ribossomal
18S
2 galinhas G1
2 galinhas G2
carregando vetor
OVA-miR24
2 galinhas G2
carregando vetor
EREOVA-IFN
galinha controle
não transgênica

Para investigar o local de síntese de miR24 com mais detalhes → imuno
histoquímica em secções do magnum com anti-igG humana Fc-específica

A proteína miR24 foi localizada em células tubulares, e ausente nas células
epiteliais adjacentes (fig.4)

Estes dados demonstram que 2,8 e 3,5 kb sequência reguladora 5' do gene da
ovalbumina → suficiente para conferir a expressão tecido-específica dos
transgenes utilizando o vetor lentiviral


Derivado do vírus HIV
Capacidade de mediar a transdução potente e expressão estável
dentro de células divisíveis e não divisíveis tanto in vitro como in
vivo
Detecção imuno-histoquímica de miR24
em secções do ouviduto
Células epiteliais
que não produzem
miR24
Galinha
OR2-4:25:59
Células da glândula
tubular expressando
o transgene → verde
controle
Corante nuclear
Proteínas recombinantes são secretadas
dentro da clara do ovo

A quantidade de proteína recombinante produzida por ovo foi analisada pela
medição das proteínas de uma série de ovos postos por aves transgênicas
individuais (G1 e G2)

Ensaios de ELISA → presença da proteína recombinante

Analisado os 20 primeiros ovos e a cada 10 → para cada galinha (máx de 150
ovos)

Proteína recombinante → detectada na clara do ovo de todos os ensaios de
ovos (fig.5)
Concentração da proteína recombinante na clara do ovo de galinhas
transgênicas
miR24 recombinante
hIFNβ1a recombinante
Valores médios:
3,5 a 426 ug/ml
Recombinante hIFNβ1a em clara de ovo é funcional

Análise da clara do ovo de galinhas portadoras do transgene hIFNβ1a →
determinar se a proteína recombinante sintetizada era funcional

Os ovos foram recolhidos: 1 galinha (O12-4:380) transportadora do vetor OVAIFN e 2 galinhas ( EO12-6:328 e EO13-13: 813) transportadoras do vetor
EREOVA-IFN

Claras dos ovos → ensaiadas quanto a presença do transgene ativo hIFNβ1a
ensaio com padrão antiviral/citopático

Células VeroE6 → incubadas com diluições de clara de ovos recolhidos das
galinhas transgênicas → células foram infectadas com vírus Semliki Forest

Avaliação do grau de proteção das células contra a infecção, realizada pela clara
do ovo e o controle positivo recombinante HIFNβ1a

Citólise
Atividade biológica do recombinante hIFNβ1a em clara de
ovo de galinhas transgênicas



As claras de ovos de todas
as galinhas transgênicas
demonstraram atividade
antiviral neste ensaio
citopático
Nenhuma proteção foi
observada utilizando o
controle de ovos de
estoque
Estes dados demonstram a
equivalência funcional
do recombinante hIFNβ1a
entre diferentes galinhas
transgênicas
Discussão
Discussão

Foi relatado que vetores lentivirais podem ser utilizados para a produção
eficiente de galinhas transgênicas.

Neste trabalho, foi utilizado vetores lentivirais derivados EIAV para
demonstrar a expressão tecido-específica de proteínas heterólogas no
oviduto de galinhas poedeiras, utilizando transgenes derivados de sequências
regulatórias do locus do gene da albumina no frango.

O gene da ovalbumina de galinha codifca mais da metade da proteína da
clara do ovo → 2,2 g/ovo (máx 105 cópias de mRNA de ovalbumina/célula do
oviduto)
Discussão

Análise de Northern blot de mRNA extraído de vários tecidos de galinhas
transgênicas em postura: as transcrições a partir de qualquer transgênico foram
restritas à porção magno do oviduto. Coincidentemente com a expressão da
ovalbumina.

Não foi detectada expressão ectópica em nenhum dos tecidos analisados

Coloração imuno-histoquímica das seções do magno revelou que a síntese da
proteína recombinante foi restrita à região que contém as células das glândulas
tubulares. O local de síntese da ovalbumina no magnum estava ausente nas
células epiteliais adjacentes.

Estudos semelhantes: camundongo, rato, porco e codorna.
Discussão

A região ERE (incluído na construção EREOVA): 4 sítios de ligação semi-palindrômicas
para o receptor de estrógeno → agem sinergicamente in vitro

Previu-se que a inclusão deste elemento pode aumentar a quantidade de proteínas
recombinantes sintetizadas por galinhas transgênicas

Comparando ovos de uma galinha (O12-4:380) carregando o OVA-IFN com ovos de
galinhas (EO13-13:813 e EO13-11:649) portadoras do EREOVA-IFN, revelou-se que a
inclusão deste elemento não resultou em um aumento significativo do nível da
proteína hIFNβ1a na clara do ovo

Exceção: galinhas EO12-6:328 → nível 2x maior de proteína

Nº de galinhas transgênicas analisadas limitado → não é possível retirar conclusões
definitivas sobre a infuência dos diferentes elementos reguladores ovalbumina sobre os
níveis de expressão do transgene a partir desses dados.
Discussão

Local de integração do vetor, base genética das galinhas, fatores epigenéticos
→ suscetível na infuência do nível de expressão de qualquer integrante
transgene específico

É pouco provável que as variações observadas nos níveis de expressão da
proteína recombinante impediriam a sua padronização sobre algumas
galinhas
Discussão

Embora não observou-se evidências de silenciamento do transgene,
prosseguiu-se com as avaliações dos níveis de expressão do transgene em
várias gerações → confirmar a estabilidade a longo prazo da expressão →
necessária para a produção comercial de proteínas

O presente trabalho demonstrou a combinação da geração eficiente de
galinhas transgênicas com a síntese de proteínas terapêuticas funcionais em
níveis elevados na clara do ovo
Métodos
Construção do plasmídeo
•
Rato quimérico, mini anticorpos humanizados scFv- Fc , conhecidos como miR24 e
sequências codificantes hIFNβ1a foram modificados para refetir o enviesamento
de códons na galinha e incluir o peptídeo sinal da lisozima do frango no fim do 5’.
•
A sequência codificante miR24, sintetizada por Entelechon (Regensburg, Alemanha),
foi amplificado por PCR para introduzir SmaI e PmlI que fanqueiam locais de
endonucleases de restrição e em seguida clonado em pGEMTeasy (Promega,
Madison, WI) para gerar pLE11.
•
A sequência hIFNβ1a contendo a SmaI que fanqueia locais de endonucleases de
restrição foi sintetizada por Geneart (Regensburg, Alemanha) e são fornecidos em
PCR-Script (Stratagene, La Jolla, CA).
Construção do plasmídeo

Os iniciadores 5DHR2 (5'- CTTAAGTCCTCAGACTTGGC – 3') e 3Sma (5'GCCCCGGGTGAACTCTGAGTTGTCTAG -3'), foram desenhadas para amplificar um
fragmento 5’ de 2,8 kb à sequência codificadora do gene da ovalbumina de galinha.

O produto de PCR foi clonado em pGEMTeasy para gerar pLE10 plasmídeo (promotor de
OVA).

Primers LD675for (5'- CTGCAGAAAAATGCCAGGTGG – 3') e LD675rev (5'TCTAGAGAGAGTAAGCAACAATCTTCT -3'), foram concebidos para amplificar uma
região de 675 pb abrangendo o ERE , um local de hipersensibilidade da DNasel de
aproximadamente 3,3 kb 5’ para o local de início da transcrição da ovalbumina.
Construção do plasmídeo

O produto de PCR foi clonado em pGEMTeasy para gerar o plasmídeo pLE20a. O
pLE10 foi linearizado no extremo 5’ final da sua sequência reguladora ovalbumina
com Ncol, e foram geradas extremidades rombas com a T4 DNA polimerase.

O ERE foi excisado do pLE20a com EcoRI e foram geradas extremidades rombas
com T4 DNA polimerase e depois ligado ao pLE10 para gerar o plasmídeo pLE21
(EREOVA promotor) .

miR24 foi excisada a partir de pLE11 por digestão com Smal / Pmll e subclonado no
local Smal de pLE10 dar pRI38. O promotor foi excisado do pRI38 pela digestão
com SacII/MluI e subclonado nos sítios SacII/AscI do mínimo EIAV no vetor lentiviral
pONY8.45Nmcs para dar pLE38 (OVA-miR24).
Construção do plasmídeo

hIFNβ1a foi subclonado no local Smal de pLE21 dar pLE43. O promotor /
transgene foi excisado do pLE43 por digestão com Aatll / MluI, e foram geradas
extremidades rombas com a T4 DNA polimerase. pONY8.45Nmcs foi digerido
com SacII / AscI, foram geradas extremidades rombas com T4 DNA polimerase, e
o promotor / transgene acima ligado para dar pLE46 (EREOVA-IFN).

A sequência do ERE foi excisado de pLE43 por digestão com Afll / AATI para
gerar pLE42 plasmídeo. O promotor / transgene de pLE42 foi excisada com Apal /
MluI, foram geradas extremidades rombas com T4 DNA polimerase, e o fragmento
foi ligado no pONY8.45Nmcs para dar pLE45 (OVA-IFN).
Produção lentivírus
•
Vetores de estoque foram gerados por FuGene6 (Roche, Lewes, UK) transfecção
de células HEK293T foram cultivadas em pratos de 144mm com 10,2 µg do
vetor plasmidial/5,1µg de gag/ pol plasmidio (pESYNGP)/2,5µg de rev plasmidio
(pESYNRev)/0,2 µg de plasmidio VSV-G (pRV67).
•
Quarenta e oito horas após a transfecção, meio de cultura de tecido foi colhido e
filtrado(0,22 µm) e em seguida centrifugado a 6.000 x g durante 20h a 4°C,
seguido por ultracentrifugação a 50.500 x g durante 120 min a 4°C. O pellet foi
ressuspenso em tampão de formulação (20 mM de Tris/100 mM de NaCl / 10 mg /
ml de sacarose/10 mg/ml de manitol, pH 7,4). Alíquotas de vetor foram
armazenadas a 80°C.
Produção e Análise de aves transgênicas
•
•
•
Pássaros transgénicos foram produzidas por injeção de vetores virais em embriões de
pintos na fase de ovo recém colocado, seguido por cultura dos embriões que eclodem. Os
pintinhos nascidos são elevados até a maturidade sexual e DNA extraído de sêmen de
machos adultos foi analisada por PCR , para identificar galos que possuem as sequências do
vetor na linha germinal.
Os galos identificados por este método foram cruzados com galinhas de tipo selvagem , e
os seus descendentes foram rastreados por PCR para identificar aves transgénicas G1
hemizigotos.
As inserções no vetor em pássaros G1 individuais foram analisadas por Southern transfer.
DNA genômico (10µg), extraído de todo sangue, foi digerido com as endonucleases de
restrição apropriadas, resolvido num peso / volume de gel de agarose 0,7 % e transferido
para membrana Hybond –N. As manchas foram analisadas por meio de sondas marcadas
com [32P]dCTP utilizando um kit II RediPrime ( Amersham Biosciences ). A hibridação foi,
em fosfato de sódio 500 mM (pH 7,2) / 7% de SDS a 65°C e foi detectada por
autoradiografia.
RNA e análise de proteínas
•
•
•
Amostras de tecidos (aprox. 50mg) foram extraídas, congelado e armazenado a 80°C e até
ser necessário. O RNA total foi preparado usando RNA de abelha (AMS Biotech, Abingdon,
Reino Unido) e 10 de µg foi resolvido sobre um desnaturante 1% peso/volume de gel de
agarose. RNA foi transferido para membranas Hybond-N (Amersham Biosciences),
utilizando 10 x SSC (1xSSC = 0,15 M cloreto de sódio/0,015 M citrato de sódio, pH 7).
Hibridização era como em Southern blots.
Para ensaio de proteína recombinante expressa na clara do ovo, os ovos foram
cuidadosamente aberto e a clara foi recuperada livre de gema. A clara de ovo foi misturada
durante pelo menos 60 min a 4°C com 4 volumes de tampão acetato de Na gelado, 50 mM
(pH 5,0), para remover a maior parte da fracção ovomucin (inibidor de tripsina).
Para a detecção de proteína miR24, plascas 2B Immulon (Thermo Labsystems, Basings toke,
UK) foram revestidas com IgG de ovelha anti-humano (γ-cadeia específica, AU004; The
Binding Site, Birmingham, U.K.) o anticorpo a uma concentração de 4µg /ml 50 mM de
tampão de carbonato/bicarbonato (pH 9,6) e incubado durante 1h à temperatura ambiente,
o padrão usado foi o anticorpo IgG1 humano (BP078; The Binding Site).
RNA e análise de proteínas
•
•
•
Placas foram lavadas com PBS/0.05% de Tween 20 (PBST) antes de adsorver
amostra de solução de clara de ovo (pH 5,5). Amostras de clara de ovo foram
testadas em duplicado e incubadas durante 1 h à temperatura ambiente. Placas
foram lavadas com PBST, e a presença de miR24 foi revelado por anticorpo
conjugado com peroxidase de rábano IgG anti-ovelha/cabra numa diluição de
1:1.000 em PBST durante 1 h, à temperatura ambiente (AP004, The Binding Site).
As placas foram lavadas com PBST e incubados durante 5 min à temperatura
ambiente com 0,4 mg / ml de o-fenilenodiamina / 0,006% de peróxido de
hidrogénio em 50mM tampão fosfato-citrato (pH 5,0). A reação foi interrompida e
desenvolveu-se a adição de 0,25 volume de 12,5% de ácido sulfúrico.
As placas foram lidas a 490 nm e os dados foram analisados usando um log :
enredo logit no Microsoft Excel ( Microsoft, Redmond, WA). A sensibilidade do
teste ELISA foi de 8 ng/ml.
RNA e análise de proteínas
A concentração de proteína hIFNβ1a em clara de ovo foi determinada através
do uso de IFN- β humano ELISA kit (PBL Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ;
product no. 41400-2A). Os dados foram analisados utilizando GraphPad (San
Diego, CA), o software Prism. A sensibilidade do ensaio é de 250 pg/ml.
Imuno-histoquímica
•
Tecidos adultos foram isoladas e fixadas durante 30 minutos em paraformaldeído a
4% em PBS, e os tecidos foram cryoembedded e seccionados em 14µm em lâminas
microscópicas Superfrost Plus (VWR, Lutterworth, U.K.). Lâminas foram
bloqueadas em PBST contendo 10% soro de galinha inactivado pelo calor durante
1 h e incubou-se durante 1 h em solução de anticorpo secundário (diluição de
1:100 de conjugado de FITC-anti-IgG humana, Sigma, St. Louis, MO) PBST
contendo soro de galinha a 10% . As lâminas foram lavadas durante 1 hora adicional
em PBST, contrastado com Hoechst, e montado.
Ensaio de efeito citopático
•
•
Células VeroE6 foram cultivadas com uma densidade de 1x104 para cada poço de
uma placa de 96 poços (200µl por poço DMEM/10% de FBS/1% de penicilina/
estreptomicina/glutamina). Células foram incubadas a 37°C em 5% de CO2
durante 24 h. Meio foi então substituído por 100 µl de DMEM / 2% FBS / 1% de
penicilina / estreptomicina / glutamina, exceto a coluna 2, a qual 150µl de DMEM
mais 2,66% de FBS/1% de penicilina/estreptomicina/glutamina foi adicionado.
Cinquenta microlitros de amostras de teste de clara de ovos, sem diluição ou prédiluído 1:1.000 com um meio livre de soro, adicionou-se à coluna 2.
Como controles, Escherichia coli derivada de IFN1βa (PBL Biomedical Laboratories)
foi enriquecida em solução de clara de ovo de um ovo controle (sem diluição ou
pré-diluído 1:1.000 meio isento de soro) ou em SFM em 4.000 unidades/ml.
Ensaio de efeito citopático
As amostras e controles foram diluídos em série (2 vezes) entre as placas de 96
poços a partir de colunas 2 a 11. A coluna 1 foi mantida como controle não
tratado, a 12 foi mantida como controle não contaminado. As placas de células
foram então incubadas a 37 ° C, 5 % de CO2 durante 24 h antes da infecção de
cada poço nas colunas 1-11, com 150 unidades formadoras de placas de vírus da
foresta de Semliki em 100µl.
Placas de células foram ainda incubadas a 37 ° C 5 % de CO2 durante 48 h , e
vírus induzida por citólise foi avaliada utilizando o kit de citotoxicidade da lactato
desidrogenase (Roche) , de acordo com as instruções do fabricante.
Resultados foram analisados utilizando Graph-Pad Prism para comparar a título
de EC50 para as amostras de clara de ovo com o EC50 determinado a partir de
uma concentração conhecida de E . coli produziu hIFNβ1a.
Obrigado.