UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
CURSO DE FARMÁCIA
THIANY CRIPPA RONSANI
TÉCNICA DE CG/EM UTILIZADA PARA ANÁLISE FORENSE
CRICIÚMA, JUNHO DE 2010
THIANY CRIPPA RONSANI
TÉCNICA DE CG/EM UTILIZADA PARA ANÁLISE FORENSE
Trabalho de Conclusão do Curso, apresentado para
obtenção do grau de Farmacêutico Generalista no Curso
de Farmácia da Universidade do Extremo Sul Catarinense,
UNESC.
Orientadora: Profª. Dra. Patrícia de Aguiar Amaral
CRICIÚMA, JUNHO DE 2010
THIANY CRIPPA RONSANI
TÉCNICA DE CG/EM UTILIZADA PARA ANÁLISE FORENSE
Trabalho de Conclusão de Curso aprovado pela Banca
Examinadora para obtenção do Grau de Farmacêutico
Generalista, no Curso de Farmácia da Universidade do
Extremo Sul Catarinense, UNESC.
Criciúma, 28 de Junho de 2010.
BANCA EXAMINADORA
Profª. Patrícia de Aguiar Amaral – Doutora - (UNESC) - orientadora
Prof. Eduardo João Agnes - Mestre - (UNESC)
Prof. Sílvio Ávila Júnior – Doutor – (UNESC)
RESUMO
Ciência Forense é uma área interdisciplinar que tem como objetivo dar suporte às
investigações relativas à justiça civil e criminal com embasamento na criminalística e nas
ciências forenses aplicadas. Com a formação generalista do farmacêutico, viu-se a
necessidade de explorar a área de atuação do farmacêutico como perito criminal. Desta forma,
o presente trabalho teve como objetivo demonstrar a técnica de Cromatografia Gasosa
acoplada com Espectrometria de Massas (CG/EM) na investigação de crimes; assim como
fornecer maiores informações do papel do farmacêutico dentro da ciência forense. O método
baseou-se no levantamento bibliográfico da técnica CG/EM com exemplos de artigos que as
correlacionam com a prática criminal.
Palavras-chave: Cromatografia gasosa, espectrometria de massas, análise forense, perito
criminal.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Esquema de cromatógrafo a gás ........................................................................... 12
Figura 2: Diagrama esquemático de um espectrômetro de massa típico. .............................. 23
Figura 3: Espectro de massas do metano. ............................................................................ 32
Figura 4: Representação de um espectrômetro de massas de ionização de elétron............... 34
Figura 5: Esquema de um espectrômetro de massas acoplado a um cromatografo gasoso. ... 39
Figura 6: Conceitos abrangentes de cromatografia gasosa bidimensional. ........................... 41
Figura 7: Perfil cromatográfico da análise de uma amostra de urina de um individuo adulto,
do sexo masculino, não usuário de esteróides anabólicos. ..................................................... 44
Figura 8: Perfil cromatográfico da análise de uma amostra de urina de um indivíduo adulto,
do sexo masculino, usuário de testosterona........................................................................... 44
Figura 9: Perfil cromatográfico da análise de uma amostra de urina de um indivíduo adulto,
do sexo masculino, usuário de estanozolol. .......................................................................... 45
Figura 10: Molécula de reticulina – precursor do alcalóide do ópio. .................................... 46
Figura 11: Fluxograma da divisão da polícia do Estado de São Paulo. ................................. 47
Figura 12: Inserção do Farmacêutico nos núcleos do Centro de Exames, Análises e
Pesquisas. ............................................................................................................................ 48
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CEAP - Centro de Exames, Análises e Pesquisas
CG/EM – Cromatografia gasosa acoplada com Espectrometria de Massas
CGL - Cromatografia Gás-Líquido
CGS - Cromatografia Gás-Sólido
CI - (abreviatura do inglês) Ionização Química
DC - (abreviatura do inglês) Ionização por Dessorção de Campo
DNA - (abreviatura do inglês) Ácido Desoxi Ribonucléico
EI - (abreviatura do inglês) - Ionização por Impacto de Elétrons
FAB - (abreviatura do inglês) Bombardeio por Átomos Rápidos
IC - Instituto de Criminalística
IML - Instituto Médico-Legal
M/Z - Massa /Carga
MALDI - (abreviatura do inglês) Dessorção/Ionização com Laser
M.M - Massa Molecular
MS-MS - (abreviatura do inglês) Espectrometria de Massas em Seqüência
Nd/YAG - Neodímio/Ítrio Alumínio
PLOT - (abreviatura do inglês) Coluna Capilar com Parede Porosa
SCOT - (abreviatura do inglês) Coluna Capilar com Suporte Recoberto
TOF - (abreviatura do inglês) Espectrômetros de Massas por Tempo de Vôo
U.M.A - Unidade de Massa Atômica
WCOT- (abreviatura do inglês) Coluna de Parede Recoberta
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO............................................................................................................. 8
2
OBJETIVOS ............................................................................................................... 10
3
2.1
Objetivo Geral...................................................................................................... 10
2.2
Objetivos Específicos ........................................................................................... 10
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .............................................................................. 11
3.1
TÉCNICAS UTILIZADAS EM CROMATOGRAFIA GASOSA ..................... 12
3.1.1
Instrumentos para a Cromatografia Gasosa (CG) ........................................ 13
3.1.1.1
Sistema de Gás de Arraste ...................................................................... 13
3.1.1.2
Sistema de Injeção da Amostra .............................................................. 14
3.1.1.3
Colunas Cromatográficas ....................................................................... 15
3.1.1.4
Sistemas de Detecção............................................................................... 17
3.1.1.4.1 Detector de Condutividade Térmica .................................................. 19
3.1.1.4.2 Detector por Ionização em Chama ..................................................... 20
3.1.1.4.3 Detector de Captura de Elétrons ........................................................ 20
3.1.1.4.4 Detector Termiônico ........................................................................... 21
3.1.1.4.5 Outros Detectores ................................................................................ 22
3.1.1.5
4
5
Termostato .............................................................................................. 22
ESPECTROMETRIA DE MASSAS .......................................................................... 23
4.1
Sistema de Introdução da Amostra ..................................................................... 24
4.2
Métodos de Ionização/ Fonte de Íons .................................................................. 25
4.3
Íons Moleculares e Composição Isotópica........................................................... 28
4.4
Fragmentação....................................................................................................... 31
4.5
Espectrometria de Alta Resolução ...................................................................... 32
4.6
ANALISADORES DE MASSAS ......................................................................... 32
4.6.1
Espectrômetros de Massas com Setores Magnéticos ..................................... 33
4.6.2
Espectrômetros de Massas com Quadrupolo ................................................. 34
4.6.3
Espectrometria de Massas por Captura de Elétrons ..................................... 35
4.6.4
Espectrômetro de Massas por Tempo de Vôo ............................................... 35
4.6.5
Espectrômetros de Massas com Transformações de Fourier ........................ 36
4.6.6
Espectrometria de Massas em Seqüência ...................................................... 36
DETECTORES ........................................................................................................... 37
6 A ESPECTROMETRIA DE MASSAS ACOPLADA COM A CROMATOGRAFIA
GASOSA (CG/ EM) ........................................................................................................... 38
7 EXEMPLO DO EMPREGO DE CG/EM EM ANÁLISE DE AMOSTRAS
HUMANAS NA BUSCA DE INFORMAÇÕES SOBRE A CAUSA/CRIME ................. 40
7.1
CG x CG - Nova técnica analítica para a ciência forense ................................... 40
7.2 Desenvolvimento e Validação de IE–CG–EM. Método para Determinação de
Benzodiazepinas e seus Metabólitos no Sangue: Aplicações na Clínica e Toxicologia
Forense ............................................................................................................................ 41
7.3 Determinação de Esteróides Androgênicos Anabólicos em Urina por
Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas .................................... 43
7.4 CG–EM Detecção e Caracterização de Reticulina como Marcador de Usuários
de Ópio ............................................................................................................................ 45
8
O PAPEL DO PROFISSIONAL FARMACÊUTICO NA PERÍCIA CRIMINAL .. 46
9
CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 50
10 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ........................................................................... 51
8
1
INTRODUÇÃO
Ciência Forense é uma área interdisciplinar que tem como objetivo dar suporte às
investigações relativas à justiça civil e criminal com embasamento na criminalística e nas
ciências forenses aplicadas como, por exemplo: a patologia e medicina forense, odontologia
forense, psiquiatria forense, toxicologia forense, química forense.
Neste momento acreditamos ser esclarecedor colocar o significado da palavra forense;
―a palavra forense significa toda a informação ou investigação relativa ao foro judicial‖
(FERREIRA, 2004).
Farias (2007 apud QUIMICA HOJE, 2007, p. 14) define a Química Forense como "a
parte da ciência que aplica os conhecimentos da química e áreas afins aos problemas de
natureza forense utilizando-se de métodos analíticos‖.
Já o autor Zarzuela (1995, p. 93) define Química Forense como sendo ―o ramo da
Química que se ocupa da investigação forense no campo da química especializada, a fim de
atender aspectos de interesse judiciário‖. Tal ramo da química atende basicamente as áreas de
estudos da criminalística e da medicina forense.
Uma vez conceituado química forense é interessante designar a especialidade que trata
da investigação analítica de amostras oriundas de casos crime envolvendo substâncias tóxicas,
conhecida como toxicologia forense (RANGEL, 2004).
Várias técnicas analíticas são utilizadas na investigação e elucidação de casos crime.
Umas dessas técnicas utilizadas para a investigação forense é a cromatografia, método físicoquímico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição
destes componentes entre duas fases, onde uma permanece estacionária enquanto a outra se
move através dela (SOLOMONS; FRYHLE, 2005). É o método analítico mais utilizado pelos
químicos forenses. Eles também utilizam outras técnicas de detecção como: cromatografia
gasosa, com detecção de ionização de chama e o amostrador rarefeito (usado para material
biológico), cromatografia líquida (usada na identificação de anfetamina, efedrina e
epinefrina), cromatografia em camada delgada; todas com os mais variados usos (HARRIS,
2008; SKOOG, et al., 2007). Além disso, a espectrometria, a microscopia e outros métodos
também são utilizados. O uso depende do método adequado ao problema em questão e dos
9
recursos de cada laboratório. Farias (2007 apud QUIMICA HOJE, 2007, p. 16) em seu livro
exemplifica: ―Um método clássico como a cromatografia em camada delgada pode ser muito
útil na determinação dos carbamatos, princípio ativo de diversos inseticidas comerciais, que
por sua vez, são freqüentemente utilizados em tentativas de suicídio ou homicídios por
envenenamento‖. A cromatografia gasosa é freqüentemente acoplada com a espectrometria de
massas em uma técnica chamada de ―Análise por CG/EM‖. A Cromatografia gasosa separa os
componentes de uma mistura, enquanto o espectrômetro de massas fornece a informação
estrutural sobre cada um deles. A análise CG/EM também pode gerar dados quantitativos
quando os padrões de concentração conhecida são usados com a amostra desconhecida
(SOLOMONS; FRYHLE, 2005).
A Cromatografia Gasosa é um método que auxilia na detecção e identificação de
amostras conhecidas ou desconhecidas que chegam aos laboratórios forenses. Os peritos
analisam as amostras através das técnicas disponíveis nos laboratórios; obtém os resultados
identificando a amostra em questão e emitem o laudo com todas as informações necessárias
para outros peritos concluírem o caso de investigação criminal.
Este trabalho tem como objetivo demonstrar a técnica de CG/EM na investigação de
crimes; assim como fornecer maiores informações do papel do farmacêutico dentro da ciência
forense.
10
2
2.1
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Demonstrar a técnica de CG/EM na investigação de crimes; assim como fornecer
informações do papel do farmacêutico dentro da ciência forense.
2.2
Objetivos Específicos
 Descrever a técnica de Cromatografia Gasosa;
 Descrever a técnica de Espectrometria de Massa;
 Descrever a utilização das técnicas na investigação criminal;
 Relacionar alguns casos de crimes que foram elucidados com CG/EM;
 Estabelecer o papel do farmacêutico dentro da equipe forense;
11
3
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A ciência forense lança mão de várias técnicas científicas na busca de respostas na
investigação de crimes, como por exemplo: na busca de culpados através de indícios que
orientem ou elucidem a arma utilizada no crime, se o indivíduo envolvido estava sob ação de
alguma substância nociva, na comprovação e identificação de cadáveres em estado de
decomposição (ou não) através de DNA, entre outros casos. Uma das técnicas utilizadas pela
perícia para análise e identificação de crimes é a cromatografia gasosa acoplada com a
espectrometria de massas, onde há um resultado mais específico para identificação e
quantificação de amostras.
As técnicas cromatográficas são de larga aplicação em química e bioquímica, na
pesquisa e na indústria. Estas técnicas cromatográficas variam desde as de extrema
simplicidade, que podem ser facilmente manipuladas por não peritos, até as de alta
sofisticação, usadas por especialistas. Entre esses dois extremos existem muitas variações de
maior ou de menor complexidade. Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia
ocupa um lugar destaque devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e
quantificação das espécies químicas, por si mesmo ou em conjunto com outras técnicas, como
por exemplo, a espectrofotometria ou a espectrometria de massas. Substâncias voláteis ou
gases podem ser separados utilizando-se a técnica ―Cromatografia Gasosa‖. A separação
baseia-se na diferente distribuição das substâncias da amostra entre uma fase estacionária
(sólida ou líquida) e uma fase móvel (gasosa) (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997).
A cromatografia gasosa é uma técnica muito utilizada para a identificação de várias
sustâncias em uma mesma amostra por ter uma alta sensibilidade. Essa sensibilidade faz com
que a quantidade de amostra a ser utilizada seja pequena (em µg). Essa técnica apresenta
algumas desvantagens, pois depende da volatilidade do analito, mas como vantagem,
apresenta elevada capacidade de separação e é operacionalmente simples (Figura 1)
(HARRIS, 2008; SKOOG et al., 2007).
12
Figura 1: Esquema de cromatógrafo a gás
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
3.1
Fonte de gás de arraste
Controlador da vazão e regulador de pressão
Sistema de injeção da amostra
Coluna cromatográfica
Sistema de detecção
Registrador
Termostato para injetor (a), coluna (b) e detector (c). COLLINS; BRAGA; BONATO; 1997.
TÉCNICAS UTILIZADAS EM CROMATOGRAFIA GASOSA
A técnica de desenvolvimento mais utilizada em cromatografia gasosa é a eluição.
Uma corrente de gás passa continuamente pela coluna e quando a amostra vaporizada é
introduzida rapidamente nesta corrente de gás, ela é arrastada através da coluna. As
substâncias presentes na amostra, depois de separadas, chegam ao detector que gera um sinal
para o registrador (COLLINS; BRAGA; BONATO; 1997).
De acordo com o tipo de fase estacionária usada, a cromatografia gasosa pode ser
classificada em: cromatografia gás-sólido (CGS) ou cromatografia gás-líquido (CGL).
13
Na cromatografia gás-sólido (CGS), a fase estacionária é um sólido com uma grande
área superficial e a separação baseia-se em mecanismos de adsorção das substâncias neste
sólido. A CGS é usada principalmente na análise de gases permanentes e compostos apolares
de baixa massa molecular (SKOOG et al., 2007).
Na cromatografia gás - líquido (CGL) a fase estacionária é um líquido pouco volátil,
recobrindo um suporte sólido ou as paredes de colunas capilares. A separação baseia-se em
mecanismos de partição das substâncias entre a fase líquida e a fase gasosa. A utilização CGL
corresponde à cerca de 95% do total de aplicações (HARRIS, 2008; COLLINS; BRAGA;
BONATO, 1997).
3.1.1 Instrumentos para a Cromatografia Gasosa (CG)
A cromatografia gasosa é realizada a partir de um instrumento que necessita de
componentes básicos que são: sistema de gás de arraste, sistema de injeção de amostra,
colunas cromatográficas e sistemas de detecção (SKOOG et al., 2007).
3.1.1.1 Sistema de Gás de Arraste
É a fase móvel gasosa da CG e deve ser quimicamente inerte. Os gases utilizados para
a fase móvel são: o argônio, o hidrogênio, o nitrogênio e o hélio, que é o mais utilizado, sendo
compatível com a maioria dos detectores (HARRIS, 2008). Estes gases estão disponíveis em
cilindros pressurizados. São necessários reguladores de pressão, manômetros e medidores de
vazão para se controlar a vazão do gás. As vazões são normalmente controladas por um
regulador de pressão de dois estágios no cilindro do gás e algum tipo de regulador de pressão
ou regulador de fluxo montado no cromatógrafo (SKOOG et al., 2007; COLLINS; BRAGA;
BONATO, 1997).
Duas considerações devem ser levadas em conta: os cilindros de gás devem estar
presos por cintas ou correntes; e gases de refugo, especialmente hidrogênio, devem ser
eliminados em uma capela (VOGEL; MENDHAM, 2002).
14
O hidrogênio e o hélio em vazões elevadas dão uma resolução melhor que o
nitrogênio, pois os solutos se difundem mais rapidamente através do hidrogênio e do hélio do
que através do nitrogênio (HARRIS, 2008).
As impurezas no gás de arraste degradam a fase estacionária, sendo necessário utilizar
gases de alta qualidade e ainda assim, estes gases precisam passar por purificadores para
remover impurezas como: oxigênio, água e traços de compostos orgânicos antes de entrarem
na coluna (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). Tubos de aço ou de cobre devem ser
utilizados ao invés de tubos de plásticos ou de borracha, para as linhas de gás. Metais são
menos permeáveis ao ar e não desprendem substâncias voláteis que podem contaminar o fluxo
de gás (HARRIS, 2008).
3.1.1.2 Sistema de Injeção da Amostra
A amostra deve ser injetada de tal maneira que se obtenha uma banda única e estreita,
sendo que falhas na técnica de injeção podem causar assimetrias nos picos. A eficiência da
coluna requer que a amostra seja de tamanho adequado não devendo ultrapassar a capacidade
da coluna, determinada pela quantidade de fase estacionária, e uma diminuição do volume de
amostra injetada provoca um aumento na eficiência da coluna (SKOOG et al., 2007).
A injeção de gases é comumente feita através de uma seringa ou de válvulas, já a de
amostras líquidas, pode ser feita utilizando-se microsseringas, e mais raramente válvulas
(COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997).
Seringas calibradas são empregadas para a injeção da amostra aquecida localizada na
cabeça da coluna, a porta de admissão da amostra ordinariamente é mantida a cerca de 50º C
acima do ponto de ebulição do componente menos volátil da amostra (SKOOG, et al., 2007).
Uma boa técnica utilizada para a injeção de amostra líquida em uma coluna
cromatográfica é a injeção em forma de ―sanduíche‖. Essa técnica consiste em uma seqüência
de admissões na seringa, inicialmente com ar, depois solvente, novamente ar, a amostra e
finalmente mais ar. Quando a agulha é inserida através de um septo de borracha dentro da
entrada da injeção do cromatógrafo, que está aquecida, a amostra não evapora imediatamente,
pois não há nenhuma amostra na agulha, caso houvesse amostra inicialmente na agulha, os
15
componentes mais voláteis principiariam a evaporar e estariam esgotados antes da amostra ser
injetada. A bolha de ar atrás da amostra na agulha evita a mistura da amostra com o solvente.
O solvente retira qualquer amostra que possa estar retida na agulha e a bolha final de ar expele
todo o solvente da agulha (HARRIS, 2008).
A injeção de amostra em colunas capilares pode ser efetuada com divisão de fluxo (é o
meio rotineiro para se introduzir pequenos volumes de amostra em colunas capilares); sem
divisão de fluxo (é a melhor para quantidades traço de solutos com alto ponto de ebulição em
solventes com baixo ponto de ebulição) e direto na coluna (é melhor para solutos
termicamente instáveis e solventes com alto ponto de ebulição; é melhor para análises
quantitativas) (HARRIS, 2008).
3.1.1.3 Colunas Cromatográficas
A coluna cromatográfica constitui-se de um tubo longo contendo a fase estacionária.
Este tubo pode ser de cobre, aço inox, alumínio, vidro, sílica fundida, teflon, etc. O material
ideal é aquele que não deve interagir com o recheio e nem com as substâncias presentes na
amostra. As colunas podem ser classificadas em capilares e recheadas (analíticas e
preparativas) (SKOOG, et al., 2007; COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997).
Colunas capilares ou tubulares abertas são estreitas e compridas feitas de sílica
fundida e recobertas com poliimida (um plástico capaz de resistir até 350ºC) para suportar e
proteger a coluna da umidade atmosférica. Esse tipo de coluna oferece maior resolução,
menores tempos de análise e maior sensibilidade do que as colunas empacotadas (recheadas),
mas elas têm menos capacidade de amostra (HARRIS, 2008). Existem vários tipos de colunas
capilares: a coluna de parede recoberta (abreviatura do inglês WCOT) – possuem a parede
interna do capilar recoberta com um filme de espessura entre 0,1 e 0,5 µm, da fase
estacionária. A coluna capilar com suporte recoberto (abreviatura do inglês SCOT) a parede
interna do capilar é recoberta com uma camada de um adsorvente (suporte) recoberto com a
fase estacionária líquida. Coluna capilar com parede porosa (abreviatura do inglês PLOT) tem
se quando a parede do capilar é recoberta apenas com uma camada adsorvente, que neste caso
é a própria fase estacionária (HARRIS, 2008; COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997).
16
As colunas de suporte recoberto podem processar maiores quantidades de amostras do
que as colunas de parede recoberta devido à elevada área superficial, já o seu desempenho é
intermediário entre os desempenhos das colunas de parede recoberta e das colunas
empacotadas – recheadas (HARRIS, 2008).
Segundo Harris (2008, p. 585) os diâmetros internos de uma coluna são normalmente
de 0,10 a 0,53 mm e os comprimentos de 15 a 100 m, sendo comum com 30m. Já para Collins
e colaboradores (1997, p. 156) eles descrevem que foram introduzidas por GOLAY em 1958
com diâmetros internos de 0,15, 0,32, 0,53 e 0,75 mm e comprimentos de 10 a 100 m.
Uma maior resolução é observada em colunas mais estreitas do que colunas mais
largas, porém exigem maior pressão de operação e possuem menos capacidade de amostra. O
sistema de processamento de gases de um espectrômetro de massas tende a ficar mais
sobrecarregado com colunas de diâmetros de 0,32 mm ou maiores, fazendo com que o fluxo
de gás tenha que ser dividido e somente uma fração seja direcionada para o espectrômetro de
massas (HARRIS, 2008).
A espessura do filme afeta primariamente o caráter da retenção e a capacidade da
coluna. Os filmes espessos são empregados com compostos altamente voláteis, porque retém
os solutos por um tempo maior, provendo assim maior intervalo de tempo para que a
separação ocorra. Filmes espessos da fase estacionária podem impedir os analitos de
chegarem à superfície da sílica e reduzem a formação de caudas nos picos, mas também
podem aumentar o sangramento (decomposição e evaporação) da fase estacionária em
temperaturas elevadas. Já os filmes finos são úteis para separar as espécies de baixa
volatilidade em um tempo razoável. A espessura de 0,25 µm é padrão para colunas de 0,25 ou
0,32 mm (SKOOG et al., 2007).
A escolha da fase estacionária líquida baseia-se na regra ―semelhante dissolve
semelhante‖, sendo que colunas apolares são melhores para solutos apolares, colunas
intermediárias para solutos intermediários e colunas fortemente polares para solutos
fortemente polares. A fase estacionária se decompõe com o envelhecimento da coluna
expondo os grupos silanol (Si—O—H), o que aumenta a cauda nos picos. A exposição ao
oxigênio também degrada a coluna. Para se reduzir a tendência da fase estacionária em sair da
coluna, faz-se que a fase estacionária se ligue de forma covalente à superfície da sílica ou
forme ligações covalentes cruzadas entre as moléculas da própria fase. Entre os sólidos
utilizados como camada porosa de colunas capilares, a alumina (Al2O3) consegue separar
17
hidrocarbonetos em uma cromatografia de adsorção (gás-sólido). Moléculas pequenas podem
entrar e serem parcialmente retidas na estrutura da cavidade de peneiras moleculares feitas de
materiais inorgânicos ou orgânicos (HARRIS, 2008).
Atualmente colunas recheadas analíticas são construídas preferencialmente com aço
inox ou vidro; elas apresentam comprimento típico entre 1 e 3 m e diâmetro interno de 1 a 4
mm (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). Para os autores Skoog et al. (2007, p. 911) e
Harris (2008, p. 589) ―os comprimentos são respectivamente de 2 e 3 m e diâmetros de 2 e 4
mm; 1 a 5 m de comprimento e 3 a 6 mm de diâmetro‖. As colunas empacotadas (recheadas)
contêm partículas finas de um suporte sólido recoberto com a fase estacionária líquida nãovolátil, ou o próprio sólido pode ser a fase estacionária. Os tubos são enrolados na forma de
bobinas com diâmetros de 15 cm para possibilitar uma termostatização conveniente no forno.
O suporte sólido é freqüentemente constituído por sílica, que é sinalizada para reduzir as
ligações hidrogênio com solutos polares. Teflon é um suporte útil nos caso de solutos que
continuam a ter tendências à associação, porém seu uso é limitado a temperaturas inferiores a
200 ºC (HARRIS, 2008; SKOOG et al., 2007; COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997).
O recheio, ou suporte sólido em uma coluna recheada, serve para fixar a fase
estacionária líquida de forma que a maior área superficial possível esteja exposta à fase
móvel. Pequenas partículas uniformes e esféricas com boa resistência mecânica e com uma
área superficial de pelo menos 1 m2/g, constituiria o suporte ideal. O material deve ser
molhado uniformemente pela fase líquida e ser inerte a temperaturas elevadas (SKOOG et al.,
2007).
Um menor tamanho de partícula diminui o tempo necessário para o soluto atingir o
equilíbrio, aumentando assim a eficiência da coluna. Porém quanto menor for a partícula,
menor é o espaço entre as partículas e, por isso, é necessária uma pressão maior para forçar a
fase móvel a passar através da coluna (HARRIS, 2008).
3.1.1.4 Sistemas de Detecção
Dezenas de detectores têm sido analisados e empregados em separações
cromatográficas. As substâncias presentes na amostra passam através da coluna, onde são
18
separadas, e chegam ao sistema de detecção (SKOOG et al., 2007; COLLINS; BRAGA;
BONATO, 1997).
Um detector ideal deve apresentar algumas das características citadas, como:
 Seletividade; detectores seletivos respondem a apenas uma classe de
substancias e são mais sensíveis que os universais, que podem responder a
todas as substâncias;
 Sensibilidade; é definida como a mudança na resposta do detector em função
da quantidade detectada. Em geral, as sensibilidades nos detectores atuais
situam-se na faixa de 10-8 a 10-15 g do soluto/s-1;
 Boa estabilidade e reprodutibilidade;
 Ruído; são deflexões da linha de base num certo período de tempo,
representando efeitos eletrônicos no sistema de detecção;
 Quantidade mínima detectável; o nível de ruído do detector determina a
quantidade mínima detectável (em picogramas - 10-12g ou menos - ou em 108
g), definida como a quantidade de amostra que gera uma resposta duas vezes
maior que o nível de ruído;
 Resposta linear aos solutos que se estenda a várias ordens de grandeza;
 Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400ºC;
 Um tempo de resposta curto e independente da vazão;
 Uma alta confiabilidade e facilidade de uso; o detector deve, na medida do
possível, tolerar a ação de operadores inexperientes;
 Similaridade de resposta a todos os solutos ou, alternativamente, uma resposta
altamente previsível e seletiva a uma ou mais classes de solutos;
 Não deve destruir a amostra (SKOOG et al., 2007; COLLINS; BRAGA;
BONATO, 1997).
Não existe nenhum detector que preencha a todos esses requisitos. Collins e
colaboradores (1997, p. 158-159) mencionam que os detectores podem ser classificados em
19
integrais ou universais. Descrevem os detectores integrais, também chamados de cumulativos,
sendo aqueles que respondem à massa total da substância em uma zona eluída. Quando o gás
de arraste passa pelo detector, gera uma linha de base; uma substância da amostra ao ser
eluída gera uma subida da linha de base, cuja altura é proporcional a sua concentração; a
eluição de uma nova substância gera uma nova subida da linha de base. Já os detectores
diferenciais ou instantâneos – que são os mais utilizados em cromatografia gasosa – são
descritos como aqueles que respondem de maneira proporcional à concentração ou ao fluxo
de massa da substância eluída, gerando picos, cuja área ou intensidade do sinal elétrico é
proporcional à concentração ou ao fluxo de massa.
Os detectores mais utilizados em cromatografia são: detector de condutividade
térmica, detector por ionização em chama, detector por captura de elétrons, detector
termiônico e outros detectores (HARRIS, 2008; SKOOG et al., 2007; COLLINS; BRAGA;
BONATO, 1997).
3.1.1.4.1 Detector de Condutividade Térmica
No passado eram os mais utilizados, pois são detectores de resposta universal,
sensíveis à concentração, mas não são sensíveis para detectar analitos em colunas de 0,53 mm
de diâmetro (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997).
Seu funcionamento baseia-se na medição da capacidade de uma substância em
transportar calor de uma região quente para uma região fria. Neste detector, o corpo quente é
um conjunto de filamentos de metal (platina, tungstênio, níquel) dentro de um bloco metálico.
O eluato de uma coluna cromatográfica passa por esse filamento, e quando o analito emerge
da coluna, a condutividade do fluxo gasoso diminui, o filamento torna-se mais quente, sua
resistência elétrica aumenta e ocorre a variação de diferença de potencial elétrico presente nos
terminais de filamento. O detector mede a variação de diferença de potencial (HARRIS,
2008).
O gás de arraste usado com este detector deve ter uma condutividade térmica elevada,
uma massa molecular pequena. O hélio é o gás de arraste mais usado no caso de um detector
de condutividade térmica. Possui a segunda maior condutividade térmica, depois do
20
hidrogênio, de modo que qualquer analito que se misture com o hélio diminui a condutividade
do fluxo gasoso (SKOOG et al., 2007).
Este detector tem como vantagem não destruir a amostra que elui da coluna, o que
possibilita a sua recuperação na mesma forma química em que foi injetada, sendo útil para
fins preparativos (SKOOG et al., 2007; COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997).
3.1.1.4.2 Detector por Ionização em Chama
Este detector tem uma alta sensibilidade e resposta quase universal, apesar de
responder a propriedades do soluto; é sensível ao fluxo de massa que passa por ele em um
determinado tempo. O gás de arraste chega ao detector e uma chama produzida pela
combustão de ar e hidrogênio queima e ioniza algumas das moléculas presentes nesta corrente
gasosa (a maioria dos compostos orgânicos produz íons e elétrons quando pirolizados à
temperatura de uma chama ar/hidrogênio), que são coletados por um eletrodo. A quantidade
de íons formados quando a amostra está presente no gás é muito maior que a quantidade
formada quando somente o gás de arraste está sendo queimado. A corrente resultante (≈10 -12
A) é medida com um picoamperímetro (SKOOG et al., 2007).
Ele é sensível à maioria dos hidrocarbonetos e não apresenta sensibilidade a
substâncias que não sejam hidrocarbonetos como H2, He, N2, O2, CO, CO2, H2O, NH3, NO,
H2S e SiF4 (HARRIS, 2008).
3.1.1.4.3 Detector de Captura de Elétrons
O detector de captura de elétrons é um detector seletivo, que responde muito bem a
halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos, mas é
relativamente insensível a hidrocarbonetos, álcoois e cetonas. Sua seletividade a haletos faz
com que ele seja útil nas análises de pesticidas clorados (COLLINS; BRAGA; BONATO,
1997). O gás de arraste deve ser o nitrogênio ou a mistura de 5 % de metano em argônio
(HARRIS, 2008). A amostra eluída de uma coluna passa sobre uma fonte radioativa emissora,
geralmente níquel-63. Um elétron do emissor causa a ionização do gás carreador e a produção
21
de uma rajada de elétrons, produz-se uma corrente constante entre um par de eletrodos em
decorrência desse processo de ionização, na ausência de espécies orgânicas (SKOOG et al.,
2007).
Quando
ocorre a presença de
espécies orgânicas,
a corrente decresce
significativamente. O detector de captura de elétrons é extremamente sensível e tem como
vantagem não alterar a amostra significativamente (ao contrário do detector de ionização de
chamas, que consome toda a amostra), mas sua resposta linear é limitada a cerca de duas
ordens de grandeza (HARRIS, 2008; SKOOG et al., 2007; COLLINS; BRAGA; BONATO,
1997).
3.1.1.4.4 Detector Termiônico
Os detectores termiônicos são detectores por ionização que utilizam sais de metais
alcalinos em um plasma1 gerado pela aplicação de um potencial elétrico adequado em um
fluxo de ar e hidrogênio (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). Sua seletividade e
sensibilidade são dependentes de variáveis como corrente de aquecimento da pérola, potencial
do queimador, posição da pérola, vazão de ar e hidrogênio e escolha do gás de arraste.
Segundo Collins e colaboradores (1997, p. 164) existe uma pérola nestes detectores, de um sal
de metal alcalino (brometo de césio ou sulfato de rubídio), que é eletricamente aquecida e
colocada entre o queimador e o eletrodo coletor. Para anular a resposta do detector no modo
de ionização de chamas e evitar a perda dos íons do metal alcalino, a fonte é mantida em um
potencial negativo. A chama ou o plasma são suportados pelo fluxo de ar e hidrogênio
presentes na região da pérola. A ação catalítica do metal alcalino em compostos contendo
nitrogênio ou fósforo fora íons com carga negativa, que são coletados no ânodo para produzir
uma corrente (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997).
1
Plasma é um gás quente e parcialmente ionizado que contém uma concentração relativamente alta de elétrons.
(Skoog et al., 2007, p. 802).
22
3.1.1.4.5 Outros Detectores
Um detector fotométrico de chama mede a emissão óptica proveniente do fósforo,
enxofre, chumbo, estanho, ou outros elementos selecionados. O processo ocorre de forma
similar ao detector de ionização de chamas, necessitando passar por uma chama de ar-H2,
onde os átomos excitados emitem radiações características de enxofre ou fósforo, que são
isolados por um filtro de interferência de banda estreita e detectados por meio de uma
fotomultiplicadora. Um detector de fotoionização usa uma fonte na região do ultravioleta de
vácuo para ionizar os compostos aromáticos e insaturados, com pequena resposta para
hidrocarbonetos saturados ou compostos orgânicos halogenados. Um detector de
quimioluminescência de enxofre capta a exaustão proveniente de um detector de ionização de
chamas, onde o enxofre foi oxidado e um detector de quimioluminescência de nitrogênio
funciona de maneira semelhante (HARRIS, 2008, p. 599).
3.1.1.5 Termostato
As temperaturas do injetor, coluna e detector de um cromatógrafo devem ser
controladas durante uma análise. Uma temperatura considerada ótima para o injetor é aquela
em que a temperatura proporcione a evaporação total da amostra, porém, não havendo a
decomposição térmica da amostra injetada. A temperatura do sistema de aquecimento da
coluna deve ser mantida constante durante a análise – no caso de cromatografia gasosa – ou
no caso de programações, fornecer uma variação de temperatura, de maneira reprodutível
(COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997).
Segundo Collins e colaboradores (1997, p. 166) ―O controle de temperatura da coluna
deve ser rigoroso e reprodutível para que não haja alterações nos tempos de retenção durante
as análises‖.
23
4
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
A técnica de espectrometria de massas é muito utilizada acoplada com as técnicas de
cromatografias. É uma técnica utilizada para o estudo de massas de átomos, moléculas e
fragmentos (HARRIS, 2008; SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
O autor Becker (1997, p. 141) diz que: ―a espectrometria de massas é um método
analítico, com o qual se pode obter informações sobre a massa molecular, a composição
elementar e a estrutura de compostos orgânicos‖.
Silverstein e colaboradores (2007, p. 1) descrevem a técnica como sendo simples:
Um composto é ionizado (método de ionização), os íons são separados na base da
razão massa/carga (método de separação dos íons) e o número de íons que
correspondem a cada ―unidade‖ de massa/carga é registrado na forma de um
espectro.
Na espectrometria de massas ocorre a ionização das moléculas, a fragmentação e
posteriormente a separação em fase gás, para a obtenção de um espectro segundo a razão
massa/carga (m/z) (VOGEL; MENDHAM, 2002). Quando o composto é analisado no
espectro, a maior parte dos íons adquire carga unitária, ocorrendo à seleção pelo espectro das
massas, em prática, e em teoria, permitindo a identificação do composto original (VOGEL;
MENDHAM, 2002). Logo abaixo será apresentado um esquema de espectrômetro de massas
(figura 2).
Figura 2: Diagrama esquemático de um espectrômetro de massa típico. (SILVERSTEIN; WEBSTER;
KIEMLE, 2007).
24
As amostras a serem introduzidas no espectrômetro de massas necessitam estar
atomizadas – convertidas em átomos e íons em fase gasosa (SKOOG et al., 2007). Podem ser
amostras orgânicas e biológicas, inorgânicas, em fase gasosa, liquida ou sólidas, ou
depositadas em superfícies (VOGEL; MENDHAM, 2002). Amostra passa pelo sistema de
vácuo, onde é vaporizada e ionizada pela uma fonte de íons, onde as moléculas sofrem
fragmentação e passam a ser íons moleculares. Esses íons moleculares são acelerados e
dirigidos para um campo magnético onde os íons descrevem uma trajetória circular, cujo raio
depende da relação massa/carga, resultando a sua separação (HARRIS, 2008; SOLMONS;
FRIHLE, 2005; VOLLHARDT; SCHORE, 2004; BECKER, 1997).
Um espectrômetro de massas depende de algumas técnicas a serem utilizadas para o
seu funcionamento como: sistema de introdução da mostra, métodos de ionização (fonte de
íons), fragmentação, espectrometria de alta resolução, analisadores de massas e por fim, os
detectores.
4.1
Sistema de Introdução da Amostra
Para a espectrometria de massas, temos duas classes de atomizadores: os atomizadores
contínuos e atomizadores discretos. Os atomizadores contínuos, as amostras são
introduzidas de forma continuas e são representados pelos plasmas e as chamas. Já nos
atomizadores discretos, as amostra são introduzidas de forma discreta com um dispositivo
que pode ser uma seringa ou um auto-amostrador, faz parte dessa classe o atomizador eletro
térmico (SKOOG et al., 2007).
Os atomizadores contínuos possuem métodos de introdução da amostra, onde a
nebulização direta é a forma mais empregada. O nebulizador converte um liquido em um jato
gasoso de spray ou névoa denominada de aerossol. Com a introdução continua da amostra na
chama ou no plasma, produz-se uma população em estado estacionário de átomos, moléculas
e íons. O plasma dos atomizadores é definido como ―uma mistura de gás quente parcialmente
ionizado, que contém uma concentração relativamente alta de íons" (SKOOG et al., 2007).
Os atomizadores de chama contêm um nebulizador pneumático que converte a
solução da amostra em um aerossol, que é introduzido em um queimador que fornece uma
25
chama estável proporcionando um aumento da sensibilidade e reprodutibilidade para absorção
atômica (SKOOG et al., 2007).
O atomizador discreto eletro térmico proporciona um aumento na sensibilidade
devido a atomização acontecer em um curto intervalo tempo. As amostras são introduzidas
em um forno de volume confinado, onde não são diluídas tanto quanto estariam em um
plasma ou em uma chama. Eles são empregados para medidas de absorção atômica e de
fluorescência atômica (SKOOG et al., 2007).
4.2
Métodos de Ionização/ Fonte de Íons
Vários métodos de ionização são utilizados para a espectrometria de massas, mas antes
de falar dos métodos torna-se interessante descrever a fonte de íons utilizada para gerar a fase
gasosa a ser analisada pelo espectrômetro (VOGEL; MENDHAM, 2002). Os métodos
dividem-se em três grandes áreas: fase gás, dessorção e ionização por evaporação
(SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
Nos métodos de ionização em fase gás, estão inseridos os de ionização por impacto
de elétrons (EI) e o de ionização química (CI). É um dos métodos mais antigos utilizados,
pois se aplicam à compostos com pressão de vapor de ordem 10 6 torr em uma temperatura na
qual o composto é estável (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
A ionização por impacto de elétrons (EI) as moléculas colidem com um feixe de
elétrons formando íons moleculares radicais. Essa colisão ocorre devido ao bombardeio de
elétrons com alta energia (70 eV), onde haverá a remoção de um elétron da molécula de
amostra para produção de um cátion-radical, conhecido como íon molecular. Essa energia é
mais elevada do que se torna necessário para a ionização (8 a 15 eV), onde o íons molecular
se decompõem em fragmentos carregados e sem carga:
M+e
M+. + 2e
M+.
A+ + B.
M+.
C+ + D.
26
Nos espectros EI geralmente obtêm-se íons positivos, porém, a obtenção de íons
negativos torna-se possível invertendo-se as voltagens na fonte de íons (HARRIS, 2008;
BECKER, 1997).
A ionização química (CI) ocorre paralelamente a EI, que leva a um grau elevado de
fragmentação em que não se observa o íon molecular. A CI é utilizada porque não é
submetida ao bombardeamento de elétrons com alta energia, e sim, a utilização de um gás
reagente (normalmente metano, isobutano, amônia) que é introduzido na fonte e ionizado, e
que por colisões transmite a sua carga às moléculas que estão a ser investigadas, ocorrendo a
transferência de prótons para produzir íons [M + 1] + (BECKER, 1997). Um exemplo é o gás
reagente metano (CH4) que com energia suficiente (100-200 eV) é convertido em uma
variedade de produtos reativos:
CH4 + e-
CH4+. + 2e-
CH4+. + CH4
CH4+.
CH5+ + .CH3
CH3+ + H.
CH3+ + CH4
C2H5+ + H2
A escolha do gás reagente permite o controle da tendência que tem o íon [M + 1] +
produzido por CI de se fragmentar. O principal uso da ionização química é a detecção de íons
moleculares, determinando os pesos moleculares (HARRIS, 2008).
Nos métodos de dessorção, estão inseridos: ionização por dessorção de campo,
bombardeio
por
átomos
rápidos,
ionização
por
dessorção
com
plasma
e
dessorção/ionização com laser. Nesses métodos as moléculas da amostra passam de uma
fase condensada para a fase de vapor na forma de íons, ocorrendo de forma direta. Essa
técnica é utilizada para compostos pesados, não voláteis ou iônicos (SILVERSTEIN;
WEBSTER; KIEMLE, 2007).
O método de dessorção possui algumas desvantagens importantes como:
 Não utilizam eficientemente a amostra disponível;
 A informação obtida é limitada;
27
 Seu principal uso é a determinação do peso molecular, em caso de substâncias
desconhecidas e em alguns casos, a obtenção de uma massa exata;
 Os espectros obtidos são complicados por abundantes íons na matriz
(SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
A ionização por dessorção de campo (DC) é um método no qual a amostra é
colocada em um campo elétrico forte, onde gradientes de voltagem muito altos removem o
elétron da amostra e o cátion resultante é repelido para longe do emissor. Os íons formados
são desadsorvidos e têm pouquíssima energia em excesso, ocorrendo pouca fragmentação.
Neste tipo de ionização, substâncias que não são voláteis também podem ser analisadas,
diferentemente da ionização química e por impacto de elétrons (BECKER, 1997).
No bombardeio por átomos rápidos (FAB), usam-se átomos de xenônio ou argônio
de alta energia (6-10 keV) para o bombardeamento da amostra dissolvida em um liquido com
baixa pressão de vapor, como por exemplo, o glicerol. A amostra é protegida pela matriz de
danos excessivos provocados pela radiação (VOGEL; MENDHAM, 2002). O resultado é a
formação de íons moleculares e fragmentos tanto da sustância a investigar, como também da
matriz (BECKER, 1997). Um dos maiores problemas encontrados nessa técnica é que o
espectro mostra sempre um alto nível de íons gerados pela matriz, limitando a sensibilidade e
podendo esconder fragmentos iônicos importantes da amostra e a técnica é mais útil com
massas inferiores a 6 kDa (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
A ionização por dessorção de plasma é uma técnica usada quase que exclusivamente
com analisadores de vôo, por ser muito especializada. A amostra é bombardeada e ionizada
com o produto de fissão do califórnio 252 ( 252Cf) com energia de 80-100 MeV. Com a
decomposição do
252
Cf, é produzido duas partículas que se movem em direções diferentes.
Uma partícula atinge o detector marcando o tempo inicial, enquanto a outra atinge a matriz
que ejeta alguns íons em um espectrômetro de vôo (TOF-EM). Os íons são liberados em
formas protonadas onde tem uma energia muito baixa, e em conseqüência, observam-se
raramente fragmentos úteis para a análise da estrutura molecular. Esta técnica é útil para
massas de peso molecular até 45 kDa (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
Na dessorção/ionização com laser (MALDI), pode-se utilizar um feixe pulsado de
laser para a ionização das amostras em espectrometria de massas. A técnica é acoplada com o
analisador de tempo de vôo ou transformação de Fourier, por ser pulsada em milissegundos.
28
São usados dois tipos de laser: o de CO2 – emite radiação no infravermelho distante - e o laser
de neodímio/ítrio-alumínio (Nd/YAG) – emite radiação na região do ultravioleta na faixa de
266nm (VOGEL; MENDHAM, 2002). Ocorre à mistura de alguns picomols da amostra com
a matriz, e são irradiados com pulsos de laser, fazendo com que íons da amostra sejam
ejetados da matriz para o espectrômetro de massas. Como acontece com outros métodos que
utilizam matrizes, MALDI é afetado pela interferência de picos da matriz, fazendo com que a
determinação do íon molecular da amostra desconhecida seja pouco precisa. Nesse método, os
resultados obtidos são armazenados e sua média é o espectro desejado; o tempo de operação é
pequeno (5 min); e o sistema é sensível (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007;
VOGEL; MENDHAM, 2002).
Nos métodos de ionização por evaporação encontramos a espectrometria de massas
por nebulização térmica e por nebulização com elétrons. Nesse método os íons perdem as
moléculas de solvente com ionização simultânea, deixando os íons para análise das massas.
(SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
Na espectrometria por nebulização térmica, a solução da amostra é introduzida
através de um tubo capilar no espectrômetro de massas. Esse tubo vai nebulizar e evaporar
parcialmente o solvente, tendo a formação de uma corrente de pequenas gotas que entram na
fonte de íons. Os íons da amostra podem ser analisados após uma evaporação completa do
solvente (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
A espectrometria de massas por nebulização com elétrons usa uma fonte de íons
por nebulização com elétrons, operando em pressões próximas a da atmosfera. A amostra
entra na fonte de íons em um tubo envolvido por um fluxo de nitrogênio que é o gás
nebulizador. A solução deixa o tubo, formando um aerossol de gotículas carregadas. O
efluente é arrastado pelo fluxo do gás nebulizador para o espectrômetro de massas, onde é
analisado (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
4.3
Íons Moleculares e Composição Isotópica
O espectro de massas de um composto é um gráfico que apresenta as massas dos
fragmentos sobre o eixo x (valores m/z) e intensidade sobre o eixo y (numero de íons de uma
dada m/z colidindo com o detector). O pico base é o pico mais intenso do espectro o qual é
29
atribuído uma intensidade 100%, e o pico principal ou íon molecular é o pico que corresponde
ao cátion radical não fragmentado (M+) (MCMURRY, 2005). O íon molecular M+. irá nos
informar qual a massa molecular de uma amostra desconhecida, porém sob o impacto de
elétrons (EI) alguns íons fragmentam-se com muita facilidade. Para solucionar esse problema,
é melhor obter um espectro de ionização química (CI) onde teremos um pico intenso em [M +
1]+ e pouquíssima fragmentação (HARRIS, 2008).
Segundo Harris (2008, p. 528)
Uma maneira prática para estabelecermos a composição de íons moleculares, é a
regra do nitrogênio: Se um composto apresenta um número ímpar de átomos de
nitrogênio, além de um número qualquer de átomos de C, H, halogênios, O, S, Si, P,
então M+. terá uma massa nominal ímpar. E para um composto com um numero par
de átomos de nitrogênio (0, 2, 4, etc.), M+. terá uma massa nominal par.
Muitos compostos orgânicos apresentam isótopos naturais. A tabela 1 mostra a
abundância dos isótopos de elementos comuns.
30
Tabela I - Massas Exatas dos Isótopos
Peso
Elemento
Atômico
Nuclídeo
Massa
Hidrogênio
1,00794
1
1,00783
Carbono
Nitrogênio
Oxigênio
12,01115
14,0067
15,9994
H
D(2H)
2,01410
12
C
12,00000 (padrão)
13
C
13,00336
14
N
14,0031
15
N
15,0001
16
O
15,9949
17
O
16,9991
18
O
17,9992
Flúor
18,9984
19
F
18,9984
Silício
28,0855
28
Si
27,9769
29
Si
28,9765
30
Si
29,9738
Fósforo
30,9738
31
P
30,9738
Enxofre
32,0660
32
S
31,9721
33
S
32,9715
34
S
33,9679
35
Cl
34,9689
37
Cl
36,9659
79
Br
78,9183
81
Br
80,9163
Cloro
Bromo
Iodo
35,4527
79,9094
126,9045
Fonte: SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007.
127
I
126,9045
31
Os picos isotópicos fornecem métodos para a determinação das fórmulas moleculares
das amostras desconhecidas. Para o carbono, hidrogênio e nitrogênio, o isótopo principal é
uma unidade de massa maior do que o isótopo mais comum. Esses elementos dão origem aos
―picos de isótopos‖ em M +1, onde é o pico isotópico com uma unidade de massa maior do
que o íon molecular, e para M + 2, o isótopo é duas unidades de massa maior que o isótopo
mais comum – para os elementos oxigênio, enxofre, cloro e bromo (SOLOMONS; FRIHLE,
2005). Um exemplo é a massa unitária do íon molecular de C 7H7NO (m/z 121), a soma das
massas unitárias dos isótopos mais abundantes: (7 x 12 [para 12C]) + (7 x 1 [ para 1H]) + (1 x
14 [para
14
N]) + (1 x 16 [para
16
O]) = 121 (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
Outro exemplo de isótopos são as fórmulas moleculares C5H12 e C4H8O com massa molecular
(MM) = 72, porém diferenciam-se por poucas casas decimais: C5H12 tem massa exata de
72,0939 unidades de massa atômica (u.m.a), enquanto C4H8O possui massa exata de 72,0575
u.m.a. Sendo assim a soma da massa atômica exata de cada isótopo da molécula é medida à
soma da média de massas atômicas (MCMURRY, 2005).
4.4
Fragmentação
Segundo Mcmurry (2005, p. 392), ―o espectro de massa de um composto orgânico é
único, dependendo de sua estrutura, a probabilidade de dois compostos possuírem massas
idênticas é pequena‖. Desse modo torna-se possível a identificação estrutural de um composto
pela interpretação do modelo de fragmentação observado (MCMURRY, 2005).
Os fragmentos formados pela energia de ionização produzem outros picos no espectro
de massas, contendo massa molecular menor do que a do íon molecular original, fazendo com
que o espectro resultante seja chamado de padrão de fragmentação do espectro de massas. O
pico base é definido com intensidade de 100% enquanto que os demais picos podem ser o
pico do íon molecular ou de outros fragmentos (Figura 3) (VOLLHARDT; SCHORE, 2004).
32
Figura 3: Espectro de massas do metano. O pico m/z = 16 corresponde a CH4=. , referem-se ambos ao pico base
e ao pico principal. O espectro de massas também mostra picos m/z = 15 e 14, correspondendo à clivagem do íon
molecular em fragmentos CH3= e CH2=.. VOLLHARDT; SCHORE, 2004.
4.5
Espectrometria de Alta Resolução
Os espectros descritos até o presente momento são considerados espectros de ―baixa
resolução‖, pois eles medem somente até o numero inteiro mais próximo da unidade de
massas. Muitos laboratórios são equipados com esse tipo de espectrômetro, porém, há alguns
laboratórios que estão equipados com os mais caros espectrômetros de massa de ―alta
resolução‖. Esses espectrômetros diferem-se dos demais devido a sua capacidade de medir
valores de m/z com até quatro casas decimais, fornecendo um método extremamente exato
para determinar as massas moleculares (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007;
SOLOMONS; FRYHLE, 2005). Para se obter a garantia de medidas exatas de massas, os
espectrômetros são calibrados com compostos como o perfluoroquerosene (CF3(CF2)nCF3) ou
o perfluorotributilamina ((CF3CF2CF2CF2)3N). Em trabalhos de alta resolução, as amostras
desconhecidas devem ser medidas conjuntamente com os padrões (HARRIS, 2008).
4.6
ANALISADORES DE MASSAS
Os analisadores de massa são o coração do espectrômetro de massas, pois eles que
separam a mistura de íons formados na fonte de acordo coma suas razões massa/carga
33
(SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007; VOGEL; MENDHAM, 2002).
Os
analisadores diferem entre si pelas características que cada um possui. A diferença de cada
analisador é feita através do ―poder de resolução‖ R. O R é definido por R = m/variação m;
onde variação m = diferença entre massas de dois picos adjacentes separados no limite da
resolução do aparelho e m = média da massa nominal dos dois picos (VOGEL; MENDHAM,
2002).
Os analisadores a serem descritos a seguir são: espectrômetros de massas com setores
magnéticos, com quadrupolo, espectrometria de massas por captura de elétrons, espectrômetro
de massas por tempo de vôo, com transformações de Fourier e espectrometria de massas em
seqüência.
4.6.1 Espectrômetros de Massas com Setores Magnéticos
Esse tipo de espectrômetro utiliza um campo magnético para desviar os íons em
movimento para uma trajetória curva. O campo magnético funciona separando os íons de
massas diferentes (os mais leves desviam-se mais do que os mais pesados) e com energia
cinética constante, pela trajetória de curva diferente que cada um faz (SILVERSTEIN;
WEBSTER; KIEMLE, 2007). Os íons são formados a partir de partículas neutras com um
pequeno espalhamento de energia cinética e passam a ser acelerados a partir de diversas
intensidades dependendo da região dentro da fonte de íons onde eles foram criados (Figura 4)
(HARRIS, 2008).
A variação da energia cinética dos íons que surgem da fonte de íons (~ 0,1%) é quem
determina o poder de resolução de um espectrômetro de massas. O poder de resolução de um
setor magnético com focalização dupla pode chegar a 100.000 quando utilizadas fendas de
abertura pequenas, o que proporciona o modelo de formas moleculares inequívocas, sendo
muito útil (HARRIS, 2008; SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
34
Figura 4: Representação de um espectrômetro de massas de ionização de elétron. As moléculas são
ionizadas por colisão com elétrons a alta energia, provocando a fragmentação de algunas moléculas. A saída,
após a passagem dos fragmentos carregados através de um campo magnético, ocore de acordo com sua massa.
MCMURRY, 2005.
4.6.2 Espectrômetros de Massas com Quadrupolo
Devido a seu custo, o espectrômetro de massas com quadrupolo é um dos mais
utilizados. É formado por quatro hastes metálicas paralelas as quais recebem um potencial
elétrico constante e um potencial oscilante de radiofreqüência (HARRIS, 2008;
SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007; VOGEL; MENDHAM, 2002). O campo
elétrico irá defletir os íons em trajetórias complexas na medida em que mudam da câmara de
ionização em direção para o detector. Através das variações rápidas dos potenciais elétricos,
íons com massas diferentes são selecionados para atingirem o detector. Registros com 2 a 8
espectros por segundo são efetuados por instrumentos de transmissão com quadrupolos,
chegando a cobrir uma faixa de 4000 unidades de m/z (HARRIS, 2008). No que se refere à
resolução e à faixa de massas, o espectro de setor magnético é superior ao de quadrupolo
(SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
35
4.6.3 Espectrometria de Massas por Captura de Elétrons
Esse tipo de espectrometria é semelhante ao do quadrupolo devido a aparência e a
operação dos dois se assemelharem, mas a espectrometria de massas por captura de elétrons
(armadilha de elétrons) é mas versátil e com maior potencial de desenvolvimento. É um dos
métodos mais utilizados para a separação de massas devido a sua compactação e adequação
para o uso como detector cromatográfico (HARRIS, 2008). Ao contrário do quadrupolo que
filtra as massas, a armadilha de íons pode ―prender‖ os íons por tempos longos, com
importantes conseqüências como: a produção de um espectro de massas convencionais após a
liberação dos íons presos para um determinado detector (SILVERSTEIN; WEBSTER;
KIEMLE, 2007).
Na armadilha de íons as substancias que surgem da coluna cromatográfica
introduzem-se na cavidade do analisador de massas, por intermédio e uma linha de
transferência aquecida. Elétrons provenientes do filamento aquecido são admitidos por um
eletrodo comutador, localizado na parte superior da cavidade. A cavidade é formada por dois
eletrodos terminais e um eletrodo central em forma de anel, que promovem ionização das
moléculas devido a formação dos íons pela cavidade. Esses eletrodos encontram-se isolados
entre si. Pode-se realizar a ionização química, onde um gás reativo é colocado dentro da
cavidade (metano) (HARRIS, 2008). Um potencial de radiofreqüência é aplicado no eletrodo
central, fazendo com que os íons circulem em trajetórias estáveis dentro da cavidade. Os íons
são ejetados da cavidade devido a radiofreqüência com um determinado valo m/z, onde são
capturados pelo multiplicador de elétrons e detectados com alta sensibilidade. Esse processo
permite uma sensibilidade de 10-100 vezes mais do que os de instrumentos de quadrupolo
devido ao alcance da metade dos íons, com todos os valores de m/z, no detector (VOGEL;
MENDHAM, 2002).
4.6.4 Espectrômetro de Massas por Tempo de Vôo
Silverstein e colaboradores (2007, p. 11) definem esse analisador como simples: ―íons
são acelerados por um potencial (V) e passam por um tubo até um detector. Se todos os íons
que entram no tubo tiverem a mesma energia, então íons de massas diferentes terão
velocidades diferentes‖.
36
No entanto, esse aparelho necessita produzir os íons em uma determinada localização
e momento conhecido, limitando os espectrômetros de massas por tempo de vôo (TOF) às
técnicas de ionização pulsada (HARRIS, 2008, VOGEL; MENDHAM, 2002).
Esse tipo de instrumento possui excelente sensibilidade devido à falta de fendas. É
muito utilizado para análise de biomoléculas de grande massa (SILVERSTEIN; WEBSTER;
KIEMLE, 2007).
4.6.5 Espectrômetros de Massas com Transformações de Fourier
Devido a seu alto custo, esses espectrômetros de massas com transformações de
Fourier não são muito comuns. Nesse tipo de analisador os íons são mantidos em uma célula
sob um campo magnético de alta intensidade e um potencial elétrico de captura. Cada íon
órbita no interior de cada célula, em uma direção perpendicular à do campo magnético com
uma freqüência simétrica ao m/z do íon. A célula recebe um pulso de radiofreqüência que faz
com que todas as freqüências cicloidais entrem em ressonância, para originar um
interferograma. O interferograma - que é um espectro no domínio do tempo – sofre uma
conversão de Fourier para um espectro no domínio da freqüência, que dá o espectro m/z
convencional. Esse é um método de alta resolução podendo ser acoplado à instrumentação de
cromatografia e de vários métodos de ionização (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE,
2007).
4.6.6 Espectrometria de Massas em Seqüência
A espectrometria de massas em seqüência (MS-MS) um íon ―principal‖ da
fragmentação inicial é selecionado, onde ele fragmenta-se novamente gerando íons ―filhos‖.
Esses íons filhos, em misturas complexas, fornecem evidencia inequívoca da presença de um
composto conhecido, e permitem a obtenção de muitas informações estruturais de compostos
novos ou desconhecidos (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
Silverstein e colaboradores (2007, p. 12) exemplificam o método através de um
exemplo:
37
Um uso comum da MS-MS envolve a ionização de uma amostra impura, com
recuperação seletiva de um íon característico do composto que está sendo estudado e
obtenção de um espectro de diagnóstico dos íons filhos produzidos por aquele íon.
[...] MS-Ms pode ser uma poderosa ferramenta de procura de compostos.
Sendo assim, esse método pode ser utilizado para a análise de amostra de urina
humana na detecção de drogas ou de seus metabólitos (SILVERSTEIN; WEBSTER;
KIEMLE, 2007).
5
DETECTORES
A espectrometria de massas utiliza alguns tipos de detectores para auxiliar na
identificação dos compostos, sendo os cinco principais: asa placas fotográficas, o vaso de
Faraday, as multiplicadoras de elétrons, as multiplicadoras de elétrons em canais e os
detectores de cintilação (VOGEL; MENDHAM, 2002).
As placas fotográficas possuem alta resolução e são mais rápidas do que os
dispositivos eletrônicos. Elas têm a capacidade de detectar simultaneamente os íons de
qualquer massa, quando utilizado um analisador de geometria invertido (VOGEL;
MENDHAM, 2002).
O vaso de Faraday é um vaso de metal para onde todos os íons são dirigidos, e só é
utilizado em aplicações especiais. Possui como desvantagem a baixa sensibilidade devido as
correntes induzidas pelos feixes de íons (utilizados no circuito que controla o vaso) serem
muito pequenas, porém, o sinal produzido é muito estável e reprodutível. Esse sistema é
utilizado sempre que as informações quantitativas são importantes no espectro de massas
(VOGEL; MENDHAM, 2002).
As multiplicadoras de elétrons ou detectores de cintilação, em geral, utilizadas
como equipamento dos espectrômetros de massas por serem dispositivos muito versáteis e
sensíveis. Existem dois tipos de multiplicadoras de elétrons: o dispositivo de dinodo discreto e
de dinodo contínuo. Ambos trabalham da mesma forma e tem características de ganho
semelhantes, porém, no dinodo contínuo, os elétrons são substituídos por um tubo de vidro
curvo, feito com vidro de alto conteúdo de chumbo dopado com óxidos de metais. Os íons
chegam aos dois tipos de detectores, para atingirem um bom funcionamento, devem ter alta
38
velocidade e energia. As vantagens que as multiplicadoras de elétrons possuem, é que são;
confiáveis, robustas e sensíveis, porém seu desempenho e tempo de meia vida são afetados
pelo vácuo do espectrômetro de massas, podendo ocorrer contaminação (VOGEL;
MENDHAM, 2002).
Os detectores de cintilação são usados como alternativa para sanar os problemas pela
multiplicadora de elétrons. São utilizados um cintilador ou detector de Daly, que são
semelhantes aos detectores utilizados em radioquímica. O detector de é uma
fotomultiplicadora convencional que possui uma janela de disco de fósforo cristalino que
quando é atingido pelos íons, a superfície emite fótons de luz os quais são detectados pela
multiplicadora. A amplificação dos elétrons ocorre em um vidro sujeito a alto vácuo,
independente do espectrômetro, o que proporciona um tempo de vida mais longo ao detector,
além de ser mais estável do que as multiplicadoras de elétrons convencionais (VOGEL;
MENDHAM, 2002).
As multiplicadoras de elétrons em canais são operadas em conjunto com
instrumentos mais modernos. Cada canal funciona como uma multiplicadora de elétrons, que
quando ligados dois ou mais conjuntos um após o outro, podem gerar ganhos muito elevados.
Esse arranjo permite o controle de cada canal independente dos demais (VOGEL;
MENDHAM, 2002).
6
A ESPECTROMETRIA DE MASSAS ACOPLADA COM A CROMATOGRAFIA
GASOSA (CG/ EM)
Após transcorrer sobre as técnicas de CG e EM separadamente é necessário um olhar
no sentido da utilização desses equipamentos de consonante, com a finalidade de fornecer em
uma mesma análise amostral, dados relacionados à característica físico-química da amostra,
assim como fornecer a estrutura química analisada. A análise fornecerá um resultado
irrefutável, ou seja, sem margem para dúvidas, o que é de suma importância no momento de
fornecer laudos periciais que podem culpar ou inocentar um réu.
Portanto a técnica de CG é associada à EM para fornecer melhores resultados.
Enquanto a CG separa os componentes de uma mistura, o EM fornece a informação estrutural
39
sobre cada um deles. Quando utilizados em conjunto, fornecem dados quantitativos quando os
padrões de concentração conhecida são utilizados com a amostra desconhecida
(SOLOMONS; FRYHLE, 2005).
Na análise da CG/EM, uma quantidade pequena da amostra a ser analisada é injetada
no cromatógrafo a gás. A amostra é vaporizada e arrastada por um fluxo de gás inerte para
dentro da coluna capilar, o interior da coluna capilar é revestido com uma fase estacionária de
baixa polaridade. Na medida em que as moléculas vão passando pela coluna, a velocidade
com que elas se movem irá depender dos seus pontos de ebulição e pelo grau de afinidade
pela fase estacionária. Moléculas com pontos mais baixos de ebulição e apolares transitam
mais rapidamente. O tempo que cada composto leva para se movimentar é descrito como
tempo de retenção2. Na proporção de saída de cada componente da mistura pela coluna de
CG, eles são transportados para o espectrômetro de massas, onde as moléculas serão
bombardeadas por elétrons; os íons e os fragmentos são constituídos, e o espectro de massas
mostra o resultado (figura 5) (SKOOG et al., 2007; SOLOMONS; FRYHLE, 2005).
Figura 5: Esquema de um espectrômetro de massas acoplado a um cromatógrafo gasoso (CG/EM) capilar típico.
SOLOMONS; FRYHLE, 2005.
2
Tempo de retenção é o tempo decorrido entre a injeção da amostra e o aparecimento do pico do soluto no
detector de uma coluna cromatográfica (Skoog et al., 2007, p. 879).
40
7
EXEMPLO DO EMPREGO DE CG/EM EM ANÁLISE DE AMOSTRAS
HUMANAS NA BUSCA DE INFORMAÇÕES SOBRE A CAUSA/CRIME
7.1
CG x CG - Nova técnica analítica para o ambiente forense
A técnica de CG x CG é um novo método analítico utilizado para a identificação de
compostos no ambiente forense. Essa técnica utiliza duas dimensões de cromatografia gasosa,
o que possibilita uma maior identificação de picos. Para a análise e identificação de
compostos desconhecidos por CG x EM são necessários colunas capilares de alta resolução e
um detector de espectrômetro de massas de quadrupolo. Essa técnica produz alguns picos
formados por separação de íons ou método de monitoramento de íons do espectro de massas,
que podem conter compostos inesperados com a mesma amostra de íons. A nova técnica
analítica é capaz de separar em uma ordem de magnitude mais compostos de misturas
complexas do que os métodos tradicionais de CG, ela produz cromatogramas com milhares de
resoluções de picos de amostras enquanto que o método tradicional de cromatografia tem uma
resolução de 100 picos. Para a análise do ambiente forense, a técnica permite a examinação
completa de uma grande variedade de compostos químicos, como por exemplo; na extração
de sedimentos marinhos contaminados com compostos orgânicos, como alcanos, cicloalcanos,
alquilbenzenos, alquilnaftalenos, etc, e frações de biomarcadores de petróleo. A leitura feita
por CG x CG em dois planos identifica melhor os picos que são posteriormente analisados
por CG x EM para uma comparação dos dados (figura 6) (FRYSINGER; GAINES, 2002).
41
Figura 6: Conceitos abrangentes de cromatografia gasosa bidimensional. (CG x CG): (a) pico cromatográfico
primeira dimensão contendo coeluentes, (b) Modulador de amostras do pico de primeira dimensão e injeta pico
estreito em segunda dimensão, (c) coeluentes são separados na segunda dimensão (d) fluxo de dados serial FID é
cortado em segmentos e guardado em uma ordem, (e) matriz é visualizada com um contorno. FRYSINGER;
GAINES, 2002.
7.2
Desenvolvimento e Validação de IE–CG–EM. Método para Determinação de
Benzodiazepinas e seus Metabólitos no Sangue: Aplicações na Clínica e
Toxicologia Forense
A cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas é um método validado
para a separação, identificação e quantificação de 23 benzodiazepínicos e seus derivados. É
um método com alta seletividade, sensibilidade e confiável para a análise de compostos em
amostras de sangue humano. Esse método foi avaliado com sucesso para a aplicação na
investigação de casos clínicos específicos e de interesse forense. Através desse método podese identificar o uso por abuso de benzodiazepinas por: erro de posologia ou overdose,
tentativa de suicídio, rotas de tráfico, por ser uma das classes de drogas mais utilizadas pelos
42
usuários. Este trabalho exemplifica o uso da técnica demonstrando cinco casos onde os
benzodiazepínicos foram utilizados.
1. Os benzodiazepínicos podem ter influenciado na capacidade de condução de
veículo por um individuo (caso I).
2. Os benzodiazepínicos podem ter diminuído os reflexos de um indivíduo
(casoII).
3. Os benzodiazepínicos mostram sinergia dinâmica com álcool (caso III)
4. Os benzodiazepínicos mostram sinergia dinâmica com opióides (caso IV) que
pode ser fatal.
5. Os benzodiazepínicos podem ter sido tomados acidentalmente (caso V).
Caso I: Um homem, 38 anos, motorista envolvido em um acidente de trânsito foi internado
em um hospital. A análise toxicológica foi realizada para a presença de álcool e outras drogas
de abuso em sangue. A análise da amostra de sangue revelou a presença de alprazolam e
midazolam, em concentrações de 10,3 e 395,8 ng/ml, respectivamente. Usando o método
desenvolvido a identificação e a determinação quantitativa dos dois benzodiazepínicos foi
possível. Midazolam foi dado dentro do hospital antes da intubação, enquanto que o
alprazolam tinha sido tomado pelo indivíduo sem prescrição médica. Levando em
consideração que os benzodiazepínicos, em geral, podem influenciar a capacidade de
condução de um indivíduo, a ingestão de alprazolam pode ser considerada como uma
provável causa do acidente de trânsito (PAPOUTSIS et al., 2010).
Caso II: mulher de 72 anos foi retirada morta do mar e a autópsia revelou que sua morte foi
causada por afogamento. A análise de seu sangue revelou a presença de diazepam e seus
metabólitos nordiazepam e temazepam, nas concentrações de 181,2, 370,6 e 70,3ng/ mL,
respectivamente. Os resultados da análise toxicológica mostrou que a causa do afogamento
poderia ser acidental como resultado de depressão do sistema nervoso central e diminuição
dos reflexos do indivíduo, devido ao consumo de diazepam (PAPOUTSIS et al., 2010).
Caso III: mulher de 45 anos foi encontrada morta num quarto de hotel com uma garrafa vazia
de bebida alcoólica ao seu lado. Pela análise da amostra de sangue dela, a presença de
lorazepam a uma concentração de 295,6 ng / ml foi revelado. Alcoolemia mostrou-se 1,7 g /
43
L. O caso acima é um exemplo clássico de uma sinergia de benzodiazepínicos com álcool. A
morte pode ser atribuída à sinergia de lorazepam e álcool (PAPOUTSIS et al., 2010).
Caso IV: Um homem de 27 anos foi encontrado morto em uma área abandonada com
apetrechos de abuso de drogas perto dele. Durante a autópsia, apenas um extenso edema
pulmonar foi encontrado. A análise da amostra de seu sangue revelou a presença de 7aminoflunitrazepam, principal metabólito do flunitrazepam, em uma concentração de 306,4
ng / mL. Além disso, com a utilização de um método específico para a determinação de
opiáceos, a presença de morfina, codeína e 6acetilmorfina, que implica o uso de heroína, foi
confirmado. É bem conhecido que os usuários de heroína geralmente recebem
benzodiazepínicos, juntamente com a heroína ou como um substituto do mesmo. Este caso é
um exemplo típico de uso simultâneo de heroína e flunitrazepam de um usuário de droga
(PAPOUTSIS et al., 2010).
Caso V: Uma criança de 4 anos foi admitida ao hospital com sintomas de sonolência,
disartria3 e perda de seu equilíbrio. A análise de seu sangue revelou a presença de
bromazepam, em uma concentração de 119,1 ng / mL. A análise toxicológica foi realizada no
quadro do diagnóstico diferencial e mostrou que os sintomas apresentados não foram por
razões patológicas, mas foram o resultado de envenenamento acidental, como foi
comprovado, devido à ingestão de comprimidos de bromazepam, que foram prescritos para o
seu avô que vivia na mesma casa (PAPOUTSIS et al., 2010).
7.3
Determinação
de
Esteróides
Androgênicos
Anabólicos
em
Urina
por
cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas
Algumas substâncias estão na lista de uso proibido determinado pelo Comitê Olímpico
Internacional (COI) e os esteróides andrógenos anabólicos (EAA) são uma delas.
Ultimamente, os EAA são os anabolizantes mais utilizados no meio esportivo com o objetivo
de aumentar a massa muscular e a resistência física dos atletas, que não demonstram
importância sobre os efeitos tóxicos causados pelo uso dos EAA. Para minimizar a dopagem
3
Disartria, corresponde às alterações que resultam de distúrbios do controle muscular causados por lesões do
sistema nervoso central ou periférico. Darley FL, Aronson A, Brown JR- Differential diagnostic patterns of
dysarthria. J Speech Hear Res 1969a; 12: 246-252.
44
no esporte, é realizado um controle sistemático pela realização de análises toxicológicas em
material biológico fornecido pelos atletas (Figura 7). Alguns métodos são propostos para a
detecção de EAA e/ou seus produtos de biotransformação em amostras de urina, e um deles é
o método analítico por CG x EM que foi validado de acordo com os guias internacionais e
nacionais que norteiam as normas de boas práticas laboratoriais (World Anti-Doping Agency,
2003a; ANVISA, 2003). Nos resultados das análises das amostras dos voluntários que
relataram o uso de esteróides androgênicos anabólicos (Figuras 8, 9), verificou-se a
prevalência do uso de estanozolol pela detecção de seus produtos de biotransformação na
urina (3-hidroxi-estanozolol e 16-beta-hidroxiestanozolol). Esse método apresentou-se preciso
e sensível para a análise quantitativa e qualitativa dos principais esteróides anabólicos
androgênicos utilizados no âmbito esportivo. Sua constatação pode ser verificada não somente
pela identificação dos esteróides e/ou seus produtos de biotransformação, mas também pelas
alterações do perfil cromatográfico das amostras biológicas analisadas (CAMPOS, D.R. et al.,
2005).
Figura 7: Perfil cromatográfico da análise de uma amostra de urina de um individuo adulto, do sexo masculino,
não usuário de esteróides anabólicos. Sendo , A – androsterona, B – etiocolanolona, C – epitestosterona, D –
testosterona (CAMPOS, D.R. et al., 2005).
Figura 8: Perfil cromatográfico da análise de uma amostra de urina de um indivíduo adulto, do sexo masculino,
usuário de testosterona. (Durateston®). Sendo A – epitestosterona, B – testosterona (CAMPOS, D.R. et al.,
2005).
45
Figura 9: Perfil cromatográfico da análise de uma amostra de urina de um indivíduo adulto, do sexo masculino,
usuário de estanozolol. (Winstrol®). Sendo A – androsterona, B – etiocolanolona, C – 3-hidroxiestanozolol, D –
16-beta-hidroxiestanozolol (CAMPOS, D.R. et al., 2005).
7.4
CG–EM Detecção e Caracterização de Reticulina como Marcador de Usuários de
Ópio
Produtos opiáceos como heroína, ópio, codeína e semente de papoula são identificados
nas amostras de urinas de usuários utilizando a técnica de CG-EM, uma vez que os
metabólitos principais G-MAM e 6-ACD são marcadores específicos dessas moléculas.
Entretanto, a noscapina e a papaverina são os alcalóides de maior constituintes do ópio e são
co-extraídos com morfina. Sendo assim, eles podem ser considerados como um marcador de
usuários de opiáceos, além de a noscapina e a papaverina serem drogas utilizadas na
terapêutica, por isso, o uso delas como marcadores têm suas limitações. A reticulina é uma
molécula precursora da tebaína e da codeína, alcalóides presentes no ópio, e está presente em
pequenas concentrações, e também em plantas. No entanto por análise através de CG-MS do
ópio a reticulina foi identificada pelo pico m/z 264 enquanto que na heroína e semente de
papoula não apresentam este pico. Após elucidação estrutural da molécula através de
comparação de produto referência que apresentou o mesmo perfil cromatográfico e o mesmo
pico m/z 264 podendo-se confirmar a presença de reticulina na amostra. Desta forma, na
ausência dos marcadores específicos de heroína e na presença de metabólitos da noscapina e
papaverina ela pode ser usada como marcador sugestivo (secundário). Neste trabalho os
pesquisadores caracterizaram usuários de ópio e derivados através da detecção da substância
reticulina (Figura 10) (AL-AMRI, A.M. et. al., 2004).
46
O
OH
HO
N
O
Figura 10: Molécula de reticulina – precursor do alcalóide do ópio.
8
O PAPEL DO PROFISSIONAL FARMACÊUTICO NA PERÍCIA CRIMINAL
A partir do século XIX, quando teve início a fase técnico-científica, cabia somente a
medicina legal toda a parte que envolvia pesquisa, exames de integridade física do corpo
humano e outros elementos associados com a materialidade do fato penal. Com o
aparecimento de novas informações e desenvolvimento das áreas técnicas, como física,
matemática, química, biologia, toxicologia, etc, tornou-se indispensável à criação de uma
nova disciplina para pesquisa, análise, interpretação dos vestígios materiais encontrados em
locais de crime, sendo fonte de apoio à polícia e à justiça: a ―Criminalística‖ (STUMVOLL;
QUINTELA, 1995).
A criminalística é uma ciência que estuda os indícios deixados no local do delito,
benefícios pelos quais se podem estabelecer, nos casos mais favoráveis, a identidade do
criminoso e as circunstâncias que ocorreram o delito. Mas para tal identificação é necessário o
envolvimento de profissionais interdisciplinares como o farmacêutico: para a realização de
exames, principalmente em laboratórios, engenheiros: para os exames de acidentes de
trânsito, redes elétricas, dentre outros profissionais. Esses profissionais que atuam na área da
criminalística são denominados de peritos (STUMVOLL; QUINTELA, 1995).
Tomamos como exemplo a Secretaria de Segurança Pública do Estado de São Paulo
que é divida em: Polícia Militar, Civil e Superintendência da Polícia Técnico-Científica.
Nesta última cabe a divisão entre Instituto de Criminalística (IC) e Instituto Médico-Legal
(IML). O Farmacêutico perito atuará no IC, na área de Centro de Exames, Análises e
Pesquisas (CEAP) podendo estar inserido no Núcleo de Análise Instrumental – análise de
47
alimentos, medicamentos -, Núcleo de Entorpecentes – análise de entorpecentes – e no Núcleo
de Biologia e Bioquímica (destacados em vermelho), que trabalha mais com a parte de análise
de DNA (Figuras 11 e 12).
Figura 11: Fluxograma da divisão da polícia do Estado de São Paulo.
48
Figura 12: Inserção do Farmacêutico nos núcleos do Centro de Exames, Análises e Pesquisas.
Diante da visão do campo de atuação para o profissional farmacêutico como perito
criminal, cabe ressaltar que para fazer parte de um desses núcleos, o profissional necessita ser
aprovado em concurso público para polícia civil ou federal.
No caso da polícia civil, qualquer profissional formado com o ensino superior pode
realizar a prova e aprovado torna-se um perito para atuar em quaisquer áreas que desejar, já
que a prova baseia-se em conteúdos de matéria de vestibular, exceto geografia e história,
sendo substituídos por conteúdos de noções de direito e informática.
Já para o concurso da polícia federal, há a prova de conhecimentos gerais que
englobam conteúdos de português, informática e atualidades, além dos conteúdos específicos
por área. No caso do farmacêutico, a área é a de farmácia que exigirá conhecimentos em:
toxicologia, farmacologia, farmacognosia, química analítica, química orgânica, química
49
inorgânica, incluindo os conhecimentos adquiridos em direito penal, direto processual penal,
direito administrativo, direito constitucional.
Além das provas objetivas e discursivas que têm caráter classificatório, o profissional
farmacêutico terá de realizar, se passar pela classificação, a prova de capacidade física que é
de caráter eliminatório, e visa avaliar a capacidade do candidato para suportar, física e
organicamente, as exigências da prática de atividades físicas a que será submetido durante o
Curso de Formação Profissional e para desempenhar as tarefas típicas da categoria funcional.
As provas são realizadas conforme a demanda pública ou a cada dois anos para perito
civil e quatro anos para perito federal.
Em anexo consta um orçamento realizado para um cromatógrafo gasoso e um
cromatógrafo gasoso acoplado à espectrometria de massas. A cotação encontra-se em moeda
americana e livre de taxas de impostos, ou seja, importação direta. Caso a aquisição seja via
perkin-elmer devem-se acrescentar essas taxas, o que significa em uma adição de 50% ou
mais no valor final.
50
9
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os laboratórios de criminalística utilizam-se de vários métodos para análise e
identificação de amostras trazidas ao laboratório pela equipe forense, para a elucidação de
crimes. Após a compilação das informações sobre cromatografia gasosa e espetrometria de
massas, observa-se a importância da técnica no que tange a especificidade, grau de pureza e
reprodutibilidade dos resultados, fornecendo um grau de confiabilidade próximo a 100%,
descaracterizando qualquer dúvida sobre a veracidade do laudo.
O farmacêutico é um profissional multi e interdisciplinar o que valida seu perfil na
área forense, além é claro de ser um dos poucos profissionais que possui em sua formação
disciplinas que incluem a cromatografia como ferramenta no isolamento e caracterização de
moléculas orgânicas como, por exemplo, os fármacos, informação indispensável para técnica
forense.
No curso de farmácia/UNESC a cromatografia permeia as disciplinas de química,
controle de qualidade, farmacognosia, toxicologia, imunologia e hematologia (eletroforese
capilar) além de oferecer a disciplina optativa de Análise Orgânica Instrumental, sendo um
estímulo e um facilitador para profissionais que optarem por essa área. O curso também
fornece informações para que o acadêmico possa se preparar para prestar a prova oferecida
para especialista em farmácia.
Em relação à aquisição do equipamento, uma vez que é sugerido pelo profissional da
área, deve-se pensar no objetivo a ser alcançado e é claro no valor disponível para o
investimento. No entanto a compra de um equipamento que possa ser utilizado para um
grande número de amostras e que tenha facilidade de manutenção deve ser priorizada frente
aos outros instrumentos.
51
10 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
AL-AMRI, A.M. et al. The GC–MS detection and characterization of reticuline as a marker of
opium use. Forensic Science International, v.140, p. 175–183, 2004.
BECKER, H. G. O. Organikum: química orgânica experimental. 2. ed Lisboa: Fundação
Calouste Gulbenkian, 1997. 1053 p.
CAMPOS, Daniel Rossi et al. Determinação de esteróides androgênicos anabólicos em urina
por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. Revista Brasileira de
Ciências Farmacêuticas. v. 41, n. 4, out./dez., 2005
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53
ANEXO A – CROMATÓGRAFO GASOSO
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ANEXO B – CROMATÓGRAFO GASOSO ACOPLADO A UM ESPECTRÔMETRO
DE MASSAS
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