BAG
Journal of
Basic & Applied Genetics
COMUNICACIONES
LIBRES
GMI
GENÉTICA DE
MICROORGANISMOS
Journal of Basic & Applied Genetics. Suppl. Vol XXIII (1) 2012
GMI
GMI 1
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE GENES
EN ECTOMICORRIZAS DE Scleroderma laeve
Y Eucalyptus grandis
Betancourth BL1, MF Pereira2, MP Zubieta3, JA Teixeira3, MV
Queiroz3, EF Araújo3. 1Lab. de Patologia Florestal e Genética
da Interação Planta-Patógeno, Departamento de Fitopatologia,
BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, MG Brasil,
2
Laboratório de Associações Micorrízicas, Departamento de
Microbiologia, BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa,
MG, Brasil, 3Laboratório de Genética Molecular e de Microorganismos, Departamento de Microbiologia, BIOAGRO,
Universidade Federal de Viçosa, MG, Brasil.
e-mail: [email protected]
Ectomicorrizas (ECM) son asociaciones mutualistas
entre raíces de plantas y hongos del suelo.
Scleroderma laeve es un hongo basidiomiceto
capaz de formar ECM con Eucalyptus. Estudios
sobre expresión génica son importantes para el
entendimiento de mecanismos que ocurren durante
la formación de ECM. El gen que codifica RAS fue
descrito en diferentes trabajos siendo expresado
diferencialmente en varias asociaciones ECM, de la
misma forma que genes de factores de elongación de
traducción, importantes en la síntesis proteica, y genes
que codifican proteínas de las subunidades de ATP
sintetasa, responsables por proveer el ATP necesario
para para sustentar las funciones dependientes de
energía en ECM. Las proteínas monoméricas RAS
son responsables por unirse al GTP y regulan vías de
transducción de señales, promoviendo alteraciones
adaptativas que pueden resultar en la formación de
ECM. En esta investigación, secuencias parciales
de los genes que codifican ATP sintetasa (atp6),
proteína RAS (ras) y el factor de elongación
ef1α (ef1α) fueron aisladas y su expresión génica
analizada antes y después del contacto físico entre
S. laeve y Eucalyptus grandis, durante la formación
de ECM. Las secuencias parciales de los genes atp6,
ras y ef1α de S. laeve fueron obtenidas con 503,
368 y 879 pb, respectivamente. Los genes atp6 y
ef1α fueron expresados durante todas las etapas de
la formación de las ECM. El gen ras fue expresado
después de tres, 15 y 30 días, sugiriendo que las vías
de transducción de señales mediada por ras pueden
ser funcionales durante el estabelecimiento de la
simbiosis.
GMI 2
ANÁLISIS GENÉTICO PARA LA
PRODUCCIÓN DE CO2 EN Saccharomyces
cerevisiae DURANTE UNA FERMENTACIÓN
VÍNICA
Jara M1, F Salinas2, G Liti2, MA Ganga1, C Martínez1,3.
1
Laboratorio de Biotecnología y Microbiología Aplicada,
Departamento de Ciencia y Tecnología de Alimentos,
Universidad de Santiago de Chile (USACH), 2Institute of
Research on Cancer and Ageing of Nice (IRCAN), University
of Nice Sophia-Antipolis, 06107 Nice, France, 3Centro de
Estudios en Ciencia y Tecnología de los Alimentos (CECTA),
Universidad de Santiago de Chile (USACH).
e-mail: [email protected]
Deducir los factores genéticos que influyen en
los patrones de variación fenotípica permite
conocer las bases moleculares de la diversidad
fenotípica. La principal estrategia para estudiar
los rasgos cuantitativos es a través del análisis de
ligamiento en el cual la identificación de los loci
de rasgos cuantitativos (QTLs) ha sido realizada
analizando las variaciones fenotípicas en una
etapa de un determinado proceso, dentro y entre
especies. Sin embargo, las múltiples bases genéticas
subyacentes solo son observables si los QTL’s
tienen una contribución a través de todo el proceso
y una significancia al momento del análisis. En este
trabajo, haciendo uso de un cruzamiento entre dos
cepas divergentes de Saccharomyces cerevisiae,
nosotros realizamos un análisis de ligamiento que
pemitió correlacionar la variación fenotípica para el
rasgo pérdida de CO2 con 5 regiones cromosómicas
a través del proceso de fermentación, demostrando
que los QTLs muestran patrones dinámicos a
través de este proceso y que supone un control
genético sobre la varianza fenotípica en una manera
tiempo específica. A nuestro entender es la primera
descripción de QTL dinámicos.
GMI 3
EFECTO DE LOS GENES ARR1, RDL1 Y
ATO2 EN EL CONSUMO DE NITRÓGENO
DURANTE LA FERMENTACIÓN
ALCOHÓLICA
Muñoz V1, D Soto1, V García1, MA Ganga1, C Martínez1,2.
1
Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos.
Facultad Tecnológica. Universidad de Santiago de Chile
(USACH), 2Centro de Estudio de Ciencia y Tecnología de
los Alimentos (CECTA). Universidad de Santiago de Chile
(USACH).
e-mail: [email protected]
Saccharomyces cerevisiae es el principal responsable
de la fermentación alcohólica, proceso complejo en
el cual la escases de nitrógeno en el mosto es una de
218
Journal of Basic & Applied Genetics. Suppl. Vol XXIII (1) 2012
las principales causa de enlentecimiento y paradas
de la fermentación, provocando grandes pérdidas en
la industria. Nuestro laboratorio ha abordado este
problema mediante la comparación de los perfiles
transcripcionales de dos cepas genéticamente
emparentadas que difieren en la cantidad de
nitrógeno consumido. Así, se identificaron 348
genes que varían su expresión entre estas cepas.
Para determinar el efecto de algunos de estos genes
se evaluó la sobreexpresión de los genes ARR1 y
RDL1 que codifican para un factor transcripcional
y una proteína de función desconocida en la cepa
vínica EC1118. Los resultados indican que la
sobreexpresión de ARR1 aumenta el consumo
de amonio al final de la fermentación (94.5 ± 6.4
mgN/L) y que la sobreexpresión de RDL1 disminuye
el consumo de este compuesto (30.2 ± 1.0 mgN/L)
respecto a la cepa control (64.7 ± 8.5 mgN/L). Por
otro lado, el gen ATO2 se analizó mediante mutantes
nulas. Los resultados indican un aumento en el
consumo de aminoácidos al final de la fermentación
en la cepa AC19DATO2 (105,66 ±3,1 mgN/L)
respecto a la cepa silvestre (89,27 ± 1,29 mgN/L).
Similares resultados se obtuvieron en la cepa
EC1118DATO2 (118,1 ± 7,95 mgN/L) respecto a la
cepa EC1118 (96,8 ± 3,96 mgN/L)sugiriendo que
estos genes tienen una relación con el metabolismo
del nitrógeno.
GMI 4
USO DE α- E β-ESTERASES COMO
MARCADOR NA INTERAÇÃO ENDÓFITOPLANTA EM CANA-DE-AÇÚCAR (Saccharum
SPP.) Bevilaqua MRR1,2,4, AC Leme1,3,4, SA Rhoden1,3,4, CA
Mangolin1,2,4, JA Pamphile1,3,4, MFPS Machado1,2. 1Universidade
Estadual de Maringá - Departamento de Biotecnologia,
Genética e Biologia Celular, 2Laboratório de Cultura de Tecido
e Eletroforese de Vegetais, 3Laboratório de Biotecnologia
Microbiana , 4Programa de Pós-Graduação em Biologia
Comparada.
e-mail: [email protected]
No presente estudo as isozimas α- e β-esterases
foram usadas como marcadores moleculares para
identificar algum processo genético molecular
envolvido na relação endófito-planta em cana-deaçúcar. As α- e β-esterases também foram utilizadas
para caracterizar genéticamente estes endófitos. Para
a avaliação das esterases foi utilizada eletroforese
em gel de poliacrilamida (PAGE). Foram isolados
37 fungos endofíticos de cana-de-açúcar cultivadas
no campo, e estes foram analisados para ao padrão
GMI
de α- e β-esterases. Nos isolados foram identificadas
32 α- e β-esterases, o que permitiu separá-los em
cinco grupos. Os mesmos grupos também foram
formados usando as características morfológicas
dos endofíticos. A mesma metodologia foi utilizada
para avaliar as α- e β-esterases da variedade IACSP
95-1218 cultivada “in vitro” sem a presença de
endofíticos. Para as plantas estéreis desta variedade,
oito esterases foram evidenciadas. Quando essa
variedade foi inoculada com 4 dos 37 endofíticos
isolados, observou-se a indução da expressão
da EST-10, esta esterase não foi observada nos
enfofíticos estudados. Outra característica induzida
pelos endofíticos foi o aumento na intesidade das
demais esterases. Nossos resultados mostraram que
as α- e β-esterasessão enzimas que estão relacionadas
com processos de interação endófito-planta em
cana-de-açúcar, onde a EST-10 pode ser usada como
marcador molecular da interação entre os isolados
31, 33, 34 e 35 e plantas da variedade IACSP
GMI 5
THE EFFECT OF 3,5-DINITROSALICYLIC
ACID ON GENOMIC DNA FROM
Saccharomyces cerevisiae
CD Santos Júnior, DP Luiz, AM Bonetti, TA de Campos.
Genetics and Biochemistry Institute, Federal University of
Uberlandia, Uberlândia/MG, Brazil.
e-mail: [email protected]
DNA contamination is a huge barrier in molecular
applications, where exogenous DNA may interfere
in results. In this way, this study purposes a method
that permits the removal of DNA from samples using
DNS (3,5 dinitrosalicylic acid). This compound
reacts with reducing sugar, turning the aldehyde
group into a carboxyl group and becoming itself to
3-amino,5-nitrosalicylic acid. This mechanism could
alter the primary structure of DNA at nucleoside
level. This research was carried out using genomic
DNA extracted from Saccharomyces cerevisiae
(DNAy) through freezing and thaw protocol. The
reaction was: DNAy 19.4 pmol; Britton-Robinson
Buffer 20 μM (pH 8.0); DNS 4.4 nM; NaKC4H4O6
62.5 nM; NaOH 24 nM, nanopure water to 50 μL.
The reactions was submitted for 5 min to one of this
treatments: 25°C, 60°C, 70°C, 80°C and 90°C, the
negative control without DNS was submitted to all
temperatures. The product was analyzed at Nanodrop
ND-1000 at UV-Vis mode and loaded in agarose gel
0.8% at 100V for 40 min. The DNA degradation
level was higher at more elevate temperatures, with
219
Journal of Basic & Applied Genetics. Suppl. Vol XXIII (1) 2012
a positive correlation (R² 0.8653). Fragments of
2kbp and another of 100-300bp were produced in
the reaction, showed by electrophoresis. The DNS
demonstrated to be an efficient method to cleave
or remove the high mass DNA from a reaction,
other studies are needed to investigate the effect
of the reaction subproducts to PCR and another
molecular biology applications, if not significant
to them it could be used to generate DNA libraries
of low length. Financial Support: CNPq, CAPES,
FAPEMIG, UFU.
GMI 6
OXIDATIVE DNA DAMAGE AND BASE
EXCISION REPAIR (BER) IN Trypanosoma
cruzi
Cabrera G, S Sepúlveda, I Ponce, L Valenzuela, S Ramirez, P
Bahamondes, S Sierra, U Kemmerling, N Galanti. Instituto de
Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina. Universidad de
Chile, Santiago, Chile.
e-mail: [email protected]
T.cruzi resists the oxidative damage to its DNA
exerted by ROS/RNS generated in vectors and
mammals. We propose that parasite DNA is repaired
via the BER pathway. DNA damage and repair were
detected by different techniques. AP-endonucleases
were identified with specific antibodies in
the parasite and their activity was assayed in
cell extracts incubated with a double stranded
oligonucleotide containing a single AP-site. DNA
repair by oligonucleotide gap filling and ligation was
also detected. Parasite viability was determined by
the MTT assay. We show that: 1) T. cruzi DNA is
damaged when exposed to H2O2 and NOO-; 2) This
damage is partially repaired by the parasite; 3) APendonucleases and their activity were detected in
the parasite; 4) Methoxyamine (Mx), a BER DNA
repair inhibitor, decreases T. cruzi AP-endonuclease
activity and, when exposed to ROS/RNS, increases
DNA fragmentation while diminishes parasite
viability; 5) Inhibition of T. cruzi AP endonucleases
and decrease in cell viability by Mx is indicative of
a conservative mechanism of DNA BER repair in T.
cruzi. It is proposed that inhibition of DNA repair
represents a possible target for the control of T. cruzi
infection. Supported by FONDECYT-Chile1090124
(to NG), 1120230 (to UK) and CONICYT PIA-Act
112
GMI
GMI 7
APURINIC/APIRIMIDYNIC
ENDONUCLEASES INVOLVED IN T.
cruzi DNA REPAIR AND INFECTION
PERSISTENCE
Sepúlveda S, L Valenzuela, I Ponce, S Ramirez, P Bahamondes,
S Sierra, U Kemmerling, N Galanti, G Cabrera. Instituto de
Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de
Chile, Santiago, Chile.
e-mail: [email protected]
T. cruzi is the etiological agent of Chagas’ disease.
To establish a chronic infection T. cruzi must resist
the oxidative damage to its DNA exerted by ROS/
RNS generated by its host. We propose that the
DNA repair BER pathway is activated when T.
cruzi is exposed to ROS/RNS, allowing its survival.
Two T. cruzi DNA repair apurinic/apyrimidinic
endonucleases (TcAP1, TcAP2) were identified in
the parasite genome. Modeling of deduced amino
acid sequences present structural characteristics
similar than the corresponding mammalian enzymes.
Antibodies against TcAP1 or TcAP2 recognized
these enzymes in the parasite but their expression
did not change when treated with ROS/RNS. TcAP1
and TcAP2 were cloned in a parasite expression
vector. Transfected TcAP1-GFP and TcAP2-GFP
parasites show that the DNA repair enzymes are in
the nucleus only. Interestingly, overexpression of
TcAP1 or TcAP2 moderately increases survival of
parasites when submitted to oxidative stress. These
results suggest that the BER pathway and particularly
TcAP1 and TcAP2 play an important role in T.
cruzioxidative DNA damage resistance leading to
parasite persistence in its hosts. FONDECYT-Chile
11100053 (to GC), 1120230 (to UK) and CONICYT
PIA-Act 112
GMI 8
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE
ESPECIES DE Phytophthora EN CULTIVOS
HORTÍCOLAS DEL NE DE LA PROVINCIA
DE BUENOS AIRES
Borassi C2, MJ Iribarren1, AM Ferri2,3, E Guillin3, BA Gonzalez1,
M Stecow4. 1Depto. Tecnología, Univ. Nac. de Luján, 2Depto.
Básicas, Univ. Nac. de Luján, 3Instituto de Genética “Ewald
A. Favret” CICVyA, INTA, Castelar, 4Instituto de Botánica
Spegazzini. Fac. Cs. Naturales.
220
Journal of Basic & Applied Genetics. Suppl. Vol XXIII (1) 2012
e-mail: [email protected]
Phytophthora es uno de los principales géneros de
patógenos de plantas con gran incidencia económica
en los cultivosde Solanáceas y Cucurbitáceas
delcinturón hortícola periurbano de Buenos
Aires-La Plata. Para estudiar la biología básica
de las enfermedades causadas por Phytophthora
es necesario identificar las distintas especies. El
empleo de técnicas moleculares en conjunto con
los métodos clásicos ha mejorado la capacidad para
determinarlas. El análisis de las secuencias de las
regiones ITS I y II del ADNr permite diferenciar
las distintas especies dentro de Phytophthora, dado
que la tasa de acumulación de mutaciones en estas
regiones se aproxima a la tasa de especiación.
Se identificaron morfológicamente casi 100
aislamientos provenientes de los partidos de Luján,
Gral. Rodríguez y Exaltación de La Cruz. Los
productos de PCR de alguno de ellos, con los primers
ITS4 e ITS5 fueron purificados y secuenciados. Las
secuencias resultantes fueron alineadas con Clustal
W; las reconstrucciones filogenéticas se realizaron
con Network 4.6.1.0. La topología obtenida resultó
congruente con las secuencias de ejemplares tipo
obtenidas de BLAST. En todos los casos el análisis
molecular coincidió con la descripción morfológica
y la literatura, validando el método. Las especies
presentes en la muestra fueron: P. capsici, P.
nicotianae y P. dreschleri.
GMI 9
ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL
DEL COMPLEJO NITROGENASA EN
Pseudomonas SP.
Setten L, G Soto, P Lisi, M Mozzicafreddo, M Cuccioloni,
M Angeletti, N Ayub. Instituto de Genética Ewald A. Favret
(CICVyA-INTA), De los reseros S/N, Castelar C.C. 25 (1712),
Buenos Aires, Argentina.
e-mail: [email protected]
Anteriormente, en el estudio de las especies del
género Pseudomona se consideraba la incapacidad de
fijar nitrógeno como una característica de importante
valor taxonómico. Sin embargo, estudios recientes
han demostrado que algunas cepas del género
Pseudomona sensu stricto tienen la capacidad de
hacerlo, tales como P. stutzeri A1501 y Azotobacter
vinelandii AvOP. En ambas especies, los genes nif,
responsables de la síntesis del complejo nitrogenasa;
fueron encontrados en islas genómicas sugiriendo
GMI
que estos genes fueron adquiridos por transferencia
horizontal. La organización de los genes nif en P.
stutzeri A1501 muestra un alto grado de similitud
con la de A. vinelandii AvOP. Por lo tanto, a partir
de esta evidencia, basándose en la secuencia de
aminoácidos del complejo nitrogenasa de P. stutzeri,
utilizando el servidor Swiss-Model homology
modelling se realizó la predicción de la estructura
tridimensional de las cadenas A y B del complejo de
esta cepa. La homología del modelo de la estructura
tridimensional del complejo nitrogenasa de P.
stutzeri, basado en la estructura X-ray publicada de
A. vinelandii, confirma que el sitio catalítico de las
nitrogenasas son extremadamente conservados.
GMI 10
ESTIMACIÓN PRELIMINAR DE
PARÁMETROS GENETICOS PARA RASGOS
DE INTERÉS ENOLÓGICO EN LEVADURAS
VÍNICAS
Araneda C1, V García2, O Aguilera2, C Martínez2,3. 1Departamento
de Producción Animal, Universidad de Chile, 2Departamento
de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Universidad de
Santiago de Chile, 3Centro de Estudios en Ciencia y Tecnología
de Alimentos, Universidad de Santiago de Chile.
e-mail: [email protected]
El mejoramiento y la obtención de nuevas variedades
de levaduras comerciales para la fermentación
de mosto se han desarrollado principalmente
utilizando herramientas biotecnológicas como la
transgénica. S. ceverisiae es un microorganismo
que puede reproducirse en forma sexual, en el que,
es posible utilizar los métodos de mejoramiento
genético aplicados a animales de granja. En este
trabajo se construyó una población de 51 familias
de S. ceverisiae a partir de cepas colectadas en ocho
orígenes geográficos distintos para asegurar una
amplia variabilidad. Estas cepas parentales se usaron
en un cruzamiento jerárquico, cruzando un parental
“macho” con dos “hembras”. Se aplicó un modelo
mixto para estimar heredabilidad y correlaciones
genéticas para ocho rasgos enológicos (Pérdida de
CO2, YAN, producción de ácido acético, glicerol y
etanol, uso de glucosa y fructosa, y rendimiento),
con el fin de evaluar la factibilidad de implementar
un programa de mejoramiento genético. En las
estimaciones se usó un algoritmo DFREML. Las
heredabilidades obtenidas fluctuaron entre 0,71 ±
0,12 para rendimiento y 1.00 ± 0,11 para YAN y
producción de etanol. Las correlaciones genéticas
221
Journal of Basic & Applied Genetics. Suppl. Vol XXIII (1) 2012
estuvieron en los niveles esperados de acuerdo a
la fisiología de la fermentación de S. ceverisiae.
La alta variabilidad genética aditiva detectada
para los rasgos estudiados puede ser explicada por
que las levaduras parentales nunca habían sido
seleccionadas para estos rasgos, y permiten inferir
amplias respuestas a la selección, compatibles con
el desarrollo de un programa de mejora genética.
Fondecyt 1100509
GMI 11
ANALISE IN SILICO DA OCORRÊNCIA
DE MICROSSATÉLITES NO GENOMA DA
BACTÉRIA Burkholderia cepacia
Barbosa LV. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia
do Maranhão.
e-mail: [email protected]
O gênero Burkholderia várias espécies e desde o
início dos anos 1980 tem sido relatado com números
crescentes de infecções em vários países. O complexo
Burkholderia cepacia pode causar infecções graves,
com cerca de 20% dos pacientes sucumbindo à
síndrome de B. cepacia. A obtenção de marcadores
moleculares da classe dos microssatélites (SSRs),
usando a bioinformática, é fundamental em várias
análises moleculares de bactérias pois gera dados
com perfis específicos para cada espécie. Este estudo
objetivou verificar a ocorrência de microssatélites no
DNA de B. cepacia a partir de ESTs passíveis de serem
utilizados como marcadores moleculares através de
buscas em bancos de dados. As seqüências de ESTs
foram obtidas pelo website do NCBI, depositadas em
arquivos FASTA e analisadas utilizando o software
SSRLocator. As configurações para os arranjos dos
microssatélites a serem localizados, compreenderam
arranjos formados entre dois e dez pares de bases
com repetições mínimas de 1x12, 2x6, 3x4, 5x3 e
6x2. Apenas sequencias não-redundantes foram
analisadas. Os melhores SSR passíveis de serem
usados como marcadores moleculares são os
hexâmeros presentes nas sequências 02, 07, 08, 09,
10, 11, 12, 15, 16, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 e 31.
Este trabalho ratifica a importância do conhecimento
da ocorrência SSR nos genomas não apenas para
um entendimento de sua distribuição, mas, para
direcionar o desenvolvimento de marcadores SSR
específicos para uso em análises genéticas. Espera-se
com a continuação do estudo, verificar a ocorrência
de EST-SSR em outras bactérias do mesmo gênero.
GMI
GMI 12
FUNGOS ASSOCIADOS A OPERÁRIAS DE
Atta laevigata (FORMICIDAE, ATTINI)
Mantovani JD1, A Rodrigues2, TB Oliveira2, M Ferro1, M Bacci1.
1
Laboratório de Evolução Molecular - Centro de Estudos de
Insetos Sociais/UNESP - Rio Claro/SP, 2Departamento de
Bioquímica e Microbiologia/UNESP - Rio Claro/SP.
e-mail: [email protected]
As formigas cortadeiras mantêm associações
com diversos simbiontes microbianos. O presente
trabalho avaliou a diversidade de fungos encontrados
na formiga Atta laevigata. O DNA genômico de
operárias provenientes de Rio Claro - SP e Bauru
- SP foi extraído para amplificação da região do
espaçador interno transcrito de fungos utilizando
os primers ITS1-F e ITS-4 gerando-se bibliotecas
ITS para cada local de coleta. As sequências foram
filtradas no pipeline E-Gene e checadas quanto
à presença de quimeras. As sequências de alta
qualidade foram agrupadas em unidades operacionais
taxonômicas (UTOs) utilizando a plataforma
MOTHUR e tiveram sua similaridade determinada
a partir do NCBI. No total foram obtidas 33 e 21
UTOs de fungos em operárias de Rio Claro e Bauru,
respectivamente. A filiação taxonômica das UTOs
prevalentes foi: Cladosporium cladosporioides
(55%) e Toxicocladosporim protearum (14,6%),
na biblioteca de Rio Claro e Coriolopsis rígida
(54,8%) e Trichosporon chiarellii (28,6%), na
biblioteca de Bauru. Devido ao caráter ubíquo de
C. cladosporioides e T. protearum, era esperada a
ocorrência desses fungos nas operárias. Resultado
interessante foi a presença de T. chiarelli. Tal levedura
foi isolada somente de jardins de fungos de formigas
Attini. C. rígida apresenta ampla capacidade de
degradação da lignina, polímero também presente
nos jardins de fungos de A. laevigata. O presente
estudo constitui-se no primeiro passo para elucidar
o papel dos fungos encontrados nas operárias desse
inseto. Apoio: Fapesp
GMI 13
EXPRESSÃO DA PROTEÍNA E2 DO
VÍRUS DA HEPATITE C EM SISTEMAS
HETERÓLOGOS
Urbaczek AC1, WC Generoso2, TF Isabel1, TA Néo1, CT
Nogueira1, JC Silva1, F Kenfe1, LM Fonseca1, F HenriqueSilva2, PI Costa1. 1Universidade Estadual Paulista-UNESPAraraquara–P/BRAZIL, 2Universidade Federal de São Carlos
- São Carlos - SP/BRAZIl.
e-mail: [email protected]
222
Journal of Basic & Applied Genetics. Suppl. Vol XXIII (1) 2012
Introdução: A Hepatite C apresenta prevalência
mundial de 3% e é um importante problema de saúde
pública. O HCV pertence à família Flaviviridae, é
envelopado e possui RNA de fita simples positiva.
O genoma codifica uma única poliproteína que é
clivada em 10 proteínas, dentre elas a glicoproteína
de envelope 2 (E2) que apresenta funções em
diferentes estágios do ciclo de replicação. Objetivo:
Expressar nos sistemas heterólogos, E. coli e P.
pastoris, uma proteína similar à glicoproteína E2
do HCV, sem o domínio TM, e fusionada à GST e
à Histidina. Testar a sua reatividade com um pool
de soros humanos HCV(+).Metodologia: O gene
codificador da proteína E2-like foi clonado no vetor
pET-42a, transformado em E. coli linhagem Rosetta
e induzido à expressão, com IPTG (200mM), à 37ºC/
300rpm/ 3h. O gene também foi clonado no vetor
pPICZαA, transformado em P. pastoris KM71H e
induzido à expressão com metanol (0,75%) à 30ºC/
250rpm/ 48h. As proteínas foram purificadas por
coluna de níquel e transferidas para uma membrana
de PVDF. A reatividade protéica foi testada pela
adição de um pool de soros HCV(+) e revelada com
IgG anti-humana biotinilada, avidina-peroxidase
e substrato TMB/H2O2. Resultados e Conclusões:
A proteína E2-like foi expressa nos dois sistemas e
mostrou reatividade específica com o pool de soros
HCV(+). Demonstrando que independentemente
da glicosilação, expressam epítopos que foram
antigenicamente reconhecidos pelos anticorpos
do soro de pacientes portadores do HCV. Suporte
Financeiro: FAPESP (2008/58957-0), FUNDECIF e
PROEX/CAPES.
GMI 14
ROL DEL SISTEMA BAESR DE Salmonella
typhimurium EN LA RESPUESTA AL
ESTRÉS OXIDATIVO GENERADO POR
CIPROFLOXACINO
Guerrero P, R Alvarez, B Collao, EH Morales, F Ipinza, IL
Calderón, CP Saavedra, F Gil. Laboratorio de Microbiología
Molecular, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad
Andrés Bello, Chile.
e-mail: [email protected]
Los antibióticos bactericidas producen un aumento
en las especies reactivas de oxígeno (ROS) producto
de una hiperactivación de la cadena transportadora
de electrones. El aumento en los ROS produce daño a
las macromoléculas. Estudios en E. coli demostraron
que en presencia de un compuesto que daña el DNA
(metilmetanosulfonato) existía un aumento en la
GMI
expresión de baeR, que codifica para el regulador del
sistema BaeSR. Esta evidencia sugiere una posible
participación de este sistema en la regulación de
la expresión génica frente a condiciones de estrés
oxidativo, probablemente activando miembros
del regulon SoxRS y OxyR. En este trabajo se
analizó mediante actividad b-galactosidasa y qRTPCR la expresión de genes de respuesta a ROS
comparando la cepa silvestre y mutante tratadas
con ciprofloxacino. En la cepa silvestre se observó
una sobreexpresión de los genes sodA y katE, lo
cual no se observó en la cepa mutante. Además se
midió actividad superóxido dismutasa, catalasa
y ROS totales para ambas cepas tratadas con el
antibiótico. En este sentido, se observó un aumento
en la actividad superóxido dismutasa solo en la cepa
silvestre, a diferencia de la mutante en baeSR donde
se observó solo un aumento en la actividad catalasa.
En ambas cepas se observó un aumento en los ROS
totales. Nuestros resultados sugieren que el sistema
de dos componentes BaeSR participa en la respuesta
defensiva de S. typhimurium expuesta a antibióticos
generadores de ROS, aumentando la actividad
superóxido dismutasa por la activación el gen sodA.
Financiamiento: FONDECYT Nº11100142, DIUNAB 15-12/R.
GMI 15
COMPARACIÓN DE DOS AISLAMIENTOS,
“SUAVE” Y “SEVERO”, DEL Onion yellow
dwarf virus (OYDV) EN CEBOLLA
Celli MG1, AK Torrico2, M Kiehr3, VC Conci4. 1Becario
Postdoctoral de CONICET, 2Becario Doctoral de CONICET,
3
Dto. Agronomía UNSur, 4Investigadora del Instituto de
Patología Vegetal (IPAVE) del INTA y de CONICET. Cno 60
cuadras Km 5,5 (5119) Córdoba, Argentina.
e-mail: [email protected]
El virus del enanismo amarillo (Onion yellow
dwarf virus; OYDV) es de distribución mundial; en
Argentina fue detectado en 1974. El objetivo de este
trabajo fue comparar los genomas de dos aislamientos
de OYDV de cebolla, el primero, proveniente de
Alemania, que produce un mosaico “suave” casi
imperceptible, y el segundo de Bahía Blanca, que
ocasiona enanismo, plantas retorcidas, estriado
amarillo y ampollas que denominamos “severo”.
Mediante transmisión mecánica se confirmó que esas
diferencias de síntomas se mantenían en los nueve
cultivares de cebolla probados. Ambos aislamientos
fueron DAS-ELISA positivos para OYDV-antisuero
y la secuencia que codifica la CP presentó 87,5-87,9%
223
Journal of Basic & Applied Genetics. Suppl. Vol XXIII (1) 2012
y 89,1-89,5% de identidad de amino ácidos (aa) con
las secuencias de OYDV depositadas en GenBank.
Mediante pirosecuenciación se obtuvieron las
secuencias completas de ambos aislamientos siendo
de 10459 y 10461 nucleótidos (nt) para el suave y
severo, respectivamente, con 92,2% de identidad
entre ellos. Ambas cepas mostraron que codifican
una poliproteína de 3381 aa con 94,5% de identidad.
La región que codifica la CP presentó el mayor
porcentaje de identidad de nt, 95,8%, y la región
NIa-Pro el mayor porcentaje de identidad de aa,
98,8%. La región P1 fue la más variable con 86,2%
y 80,8% de identidad en nt y aa, respectivamente.
Otros autores atribuyen este tipo de diferencias a
deleciones y/o diferencias en la HC-Pro y en la P1.
En el presente estudio se detectaron más diferencias
en la P1 sugiriendo que esta podría ser la región del
genoma responsable de las diferencias de síntomas
observados.
GMI 16
ESTUDIO IN VIVO DE LA MOVILIDAD DE
CASSETTES DE RELEVANCIA CLÍNICA
ENCONTRADOS EN INTEGRONES
Quiroga MP, MA Preisegger, D Centrón. IMPaM, UBACONICET, Facultad de Medicina, piso 12, C.A.B.A., Argentina.
e-mail: [email protected]
Los integrones son elementos genéticos que
contienen los componentes de un sistema de
recombinación sitio específico. Están compuestos
por un gen Inti que codifica una integrasa IntI, un
sitio de recombinaciónattI y un promotor Pc que
permite la expresión de los cassettes. Los cassettes
consisten en un marco de lectura abierto y un sitio de
recombinación attC variable en secuencia y longitud,
que es reconocido por la integrasa para escindir del
integrón al cassette e insertarlo en un attI o en otro
attC. Hasta el momento se han descripto más de 130
cassettes de resistencia a antibióticos. El objetivo de
este estudio fue evaluar la capacidad de la integrasa
de tipo 1 (IntI1) para escindir e insertar en un sitio
attI1 a diferentes cassettes de resistencia antibiótica
de relevancia en la clínica y altamente diseminados
en los aislamientos clínicos multidroga resistentes.
Realizamos ensayos de recombinación in vivo de
los cassettes blaVIM-2, aac(6´)-IId, dfrA1 y aadB en
la cepa E. coli TOP10, los cuales presentan a su vez
diferencias estructurales en sus sitiosattC. Mientras
que las frecuencias de escisión fueron disímiles entre
sí (3-80%), las de inserción fueron homogéneas
(3-7%). Estos resultados nos muestran que existen
GMI
frecuencias de recombinación particulares para
cada cassette y que los patrones moleculares que
favorecen la escisión e inserción de cassettes difieren
entre sí.
GMI 17
ANÁLISE DA DIVERSIDADE BACTERIANA
EM ALGUMAS ESPÉCIES DE FORMIGAS
ATTINI
Marchiori AC, M Ferro, M Bacci . Laboratório de Evolução
Molecular, Centro de Estudos de Insetos Sociais, Universidade
Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP).
e-mail: [email protected]
As formigas Attini cultivam fungos basidiomicetos,
com os quais vivem em mutualismo obrigatório,
e apresentam outras associações simbióticas com
diferentes micro-organismos. Com base em alguns
tipos de fungos associados a estas formigas, cinco
sistemas agrícolas foram definidos. A fim de
identificar a diversidade de bactérias associadas a
três desses sistemas, nós analisamos operárias de
três espécies de Attini: Atta laevigata(agricultura
das cortadeiras), Trachymyrmex urichi (agricultura
derivada) e Mycocepurus goeldi (agricultura
basal). Para tanto, bibliotecas de 16S rRNA foram
construídas e sequenciadas e as sequências geradas
foram qualificadas com o sistema de geração de
pipelines EGene, alinhadas com ferramenta do RDP
Pyrosequencing Pipeline e atribuídas a unidades
taxonômicas operacionais (OTU) com o programa
MOTHUR. A classificação das OTUs representativas
foi realizada empregando o programa BLAST. Foram
definidas 99 OTUs, que indicam a predominância
de proteobactérias em todos os sistemas agrícolas.
Em A. laevigata e T.urichi, que são derivadas, 96
e 38% das sequências de proteobactérias foram
classificadas como Rhizobiales, enquanto que em
M. goeldi, que ocupa uma posição filogenética basal,
nenhuma sequência foi classificada nesta ordem.
Estas bactérias podem ser mutualistas envolvidos
com a fixação de nitrogênio para a nutrição das
formigas. Burkholderiales, Rhodospirillales e
Actinomycetales também estão entre prováveis
simbiontes e foram selecionados para maior
investigação. Apoio financeiro: FAPESP e CNPq
GMI 18
IMPLANTAÇÃO DO FISH EM AMBIENTES
AQUÁTICOS SUBTROPICAIS
224
Journal of Basic & Applied Genetics. Suppl. Vol XXIII (1) 2012
OLIGOTRÓFICOS E ACIDIFICADOS
Ronqui, LB, PJ Borba Junior, H de Azevedo, H. Comissão
Nacional de Energia Nuclear-Laboratório de Poços de Caldas
(CNEN-LAPOC).
e-mail: [email protected]
Para a implantação do FISH foram utilizadas sondas
dos grandes Domínios Bactéria e Archaea em dois
corpos de água localizados na Bacia Hidrográfica do
Ribeirão das Antas e em um corpo de água localizado
nas dependências das Industrias Nucleares do
Brasil - Unidade de Tratamento de Minérios. Foram
realizados testes devido às características físicas e
químicas dos três corpos d`água. Foi necessário
sonicar as amostras das represas e a realizar a prélimpeza em filtro de 20 μm contribuíram para a melhor
visualização das células bacterianas. Para a CM foi
necessário a fixação da amostra com formaldeído,
filtragem de um maior volume de amostra de água
com pré-tratamento utilizando etanol; melhor
permeabilização das células. Para todos os pontos
amostrais, o uso de lisozima mostrou-se eficiente,
propiciando a melhor permeabilização das sondas,
bem como para o lise das cápsulas das células
bacterianas da CM. Após tais ajustes, obtivemos
resultados preliminares satisfatórios ao longo dos
últimos meses. Concluiu-se de acordo com os
resultados, que os três corpos de água ora estudados
possuem diferentes características físicas e químicas
e de concentração de material orgânico e nutrientes.
Tais fatores provavelmente atuam sobre a ocorrência,
abundância e distribuição das células bacterianas ao
longo dos corpos de água. Outro ponto importante;
os reservatórios das Antas e Bortolan recebem os
efluentes radioativos tratados provenientes da mina
de urânio Osamu Utsumi. Foram detectados que os
reservatórios possuem problemas semelhantes para
a implantação do FISH quando comparados a CM.
GMI 19
ESTRUCTURA GENÉTICA DE Phythophthora
capsici EN EL NE DE LA PROVINCIA DE
BUENOS AIRES
Iribarren MJ1, C Borassi2, E Guillín3, A Ferri2,3, B González1,
M Steciow. 1Deto. Tecnología, Univ. Nac. de Luján, 2Depto.
Básicas, Univ. Nac. de Luján, 3Inst. de genética “Ewald A.
Favret” CICVyA, INTA, Castelar, 4Inst. de Botánica Spegazzini.
Fac. Cs. Naturales.
e-mail: [email protected]
Phytophthora capsici en un patógeno de gran
importancia para los cultivos hortícolas por su rango
de hospedantes, la magnitud de las pérdidas que
GMI
ocasiona, su distribución mundial y las dificultades
para su control. Al ser P. capsici una especie
heterotálica requiere de dos grupos de apareamiento
para reproducirse en forma sexual. La proporción
de grupos presente en cada zona es variable. Esta
afecta la diversidad genética del microorganismo y
por lo tanto la eficacia de las estrategias de control
de la enfermedad. En un total de 37 aislamientos
de P. capsici obtenidos de zapallito de tronco,
pimiento y berenjena en el NE de Bs. As se
determinó la proporción de grupos de apareamiento
y se analizó la estructura genética, de acuerdo con
la secuencia de la región ITS I y II del ADNr. Se
efectuó el alineamiento, el análisis de distancias y
de estructura (en función del hospedante). Se evaluó
la presencia de recombinación. La reconstrucción
de redes filogenéticas se realizó con Network
4.6.1.0. Todos los aislamientos pertenecieron al
grupo de apareamiento A1. No se observaron
diferencias entre los aislamientos provenientes
de distintos hospedantes, pero hubo evidencia de
recombinación. Estos resultados no coinciden con el
análisis morfológico donde se observó un solo tipo
de apareamiento. Pero podrían ser explicados por la
presencia minoritaria del otro tipo de apareamiento
aún no determinado, y/ó por la entrada del patógeno
a través de semillas infectadas de otras zonas
geográficas.
GMI 20
ABUNDANCIA Y DIVERSIDAD DE
COMUNIDADES MICROBIANAS DE
SUELOS BAJO DIFERENTES ROTACIONES
Barrera VA1, R Rojo1, G Ghiessa1, N Lopez1, P Baffoni2, R
Agamennoni2, M.C Martinez1. 1Instituto de Microbiología y
Zoología Agropecuaria e Instituto de Biotecnología. Dr. N.
Repetto y De Los Reseros S/N Bs.As. Argenina, 2EEA Hilario
Ascasubi. Ruta Nac. N° 3, km 794, Ascasubi (8142), Bs. As.,
Argentina.
e-mail: [email protected]
Los microorganismos del suelo tienen un importante
rol por sus funciones ecológicas como así también
por las propiedades fitopatogénicas de algunas
especies. El objetivo de este trabajo es aplicar y
desarrollar metodologías apropiadas que permitan
determinar el efecto de diferentes esquemas de
rotaciones en suelos cultivados con cebolla sobre
la diversidad de las comunidades microbianas
presentes para, en el mediano plazo, establecer
esquemas que permitan reducir la incidencia de
enfermedades fúngicas de suelo y favorecer la
225
Journal of Basic & Applied Genetics. Suppl. Vol XXIII (1) 2012
GMI
sustentabilidad del mismo desde el punto de vista
microbiológico. Para ello se emplearon métodos
clásicos de aislamiento y caracterización de hongos
fitopatógenos y biocontroladores (del género
Trichoderma) y estudios de perfiles fisiológicos
(CLPP) y moleculares (ARISA) sobre muestras
de suelos (correspondientes a tres muestreos:
2009, 2010 y 2011) provenientes de un ensayo de
rotaciones (INTA, H. Ascasubi, Bs.As.) consistente
en monocultivo de cebolla o en rotaciones con otros
cultivos (alfalfa, agropiro, ryegrass, vicia+avena,
girasol, trigo y zapallo). Los resultados obtenidos
para los aspectos estudiados indicarían que los
tratamientos con rotaciones presentan una tendencia
favorable en cuanto a la mayor presencia de BCAs,
menor cantidad de fitopatógenos y mayor diversidad
microbiológica frente al monocultivo de cebolla.
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