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Influência da microflora de cura na ocorrência de Listeria spp.
em queijos tradicionais
Influence of the ripening microflora of traditional cheeses
on the occurrence of Listeria spp.
Maria Manuela Guerra1,2* e Fernando M. de Almeida Bernardo2
Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Av. Condes de Barcelona, 2765-470 Estoril, Portugal
2
Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa. CIISA,
Av. da Universidade Técnica, Polo Universitário da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal
1
Resumo: A maturação do queijo consiste num conjunto complexo de processos bioquímicos, no qual a microflora específica desempenha um papel importante. As bactérias lácticas e os
Enterococcus produzem vários compostos bactericidas que inibem parte da microflora indesejável sendo alguns também responsáveis pelas características organolépticas dos queijos. Em
54 queijos tradicionais alentejanos, onde se havia pesquisado a
presença de Listeria spp., efectuaram-se contagens da flora láctica e de Enterococcus, com o objectivo de verificar a existência
de alguma influência entre os tipos e teores de microflora de cura
e a ocorrência de Listeria spp. naqueles produtos. Verificou-se
que os teores médios de flora láctica e de Enterococcus se situava entre 6,9 e 8,6 Log10 UFC/g e entre 5,9 e 7,6 Log10 UFC/g,
respectivamente. Os teores médios mais elevados de flora láctica
ocorreram em queijos fabricados com leite cru e em meia cura
enquanto que os teores médios mais elevados de Enterococcus
foram observados nos queijos fabricados com leite cru e curados.
As amostras contaminadas por Listeria spp. apresentaram simultaneamente elevados teores de flora láctica e de Enterococcus, o
que parece indicar que esta microflora não influenciou a colonização de Listeria spp. nos queijos em estudo.
Palavras chave: Enterococcus, Flora Láctica, Listeria spp., L.
monocytogenes, Queijos.
Summary: Cheese ripening corresponds to a complex biochemical process where specific microflora plays an important role.
Lactic acid bacteria and Enterococcus produce several bactericidal compounds that inhibit spoilage microflora and that may
also be responsible for the organoleptic characteristics of the
cheeses. Lactic acid bacteria and Enterococcus countings were
performed in 54 traditional cheeses previously studied for the
presence of Listeria spp., in order to assess the influence of the
ripening microflora on the occurrence of Listeria spp. in those
products. Lactic acid bacteria and Enterococcus average countings ranged from 6,9 to 8,6 Log10 CFU/g and from 5,9 to 7,6
Log10 CFU/g, respectively. The higher levels of lactic acid bacteria were obtained from half ripened cheeses produced with raw
milk whereas for the Enterococcus the higher countings were
registered for the completely ripened cheeses produced with raw
* Correspondência: email: [email protected]; telf: + 351
21 0040779; Fax: + 351 21 0040719
milk. The samples contaminated with Listeria spp. also registered high levels of lactic acid bacteria and Enterococcus, which
may indicate a Listeria colonisation independent from the ripening microflora of the studied cheeses.
Key words: Cheeses, Enterococcus, Lactic acid bacteria, Listeria spp., L. monocytogenes.
Introdução
Com bastante frequência, as bactérias do género Listeria estabelecem relações bióticas com os outros elementos constituintes das microfloras dos alimentos.
Os mecanismos das relações antagónicas que se estabelecem entre microrganismos colonizadores nos
alimentos têm um enorme significado tecnológico e
em Saúde Pública, evitando, muitas vezes, os perigos
decorrentes da presença de microrganismos patogénicos (Mossel e Garcia, 1984). As bactérias produtoras
de ácido láctico, produzem vários compostos bactericidas durante a maturação dos alimentos, como os ácidos orgânicos que fazem baixar o pH, o peróxido de
hidrogénio e as bacteriocinas. São alguns destes compostos responsáveis pelas características organolépticas e que inibem também alguns germes da microflora
indesejável (Raccach et al., 1979; Abdel-Bar e Harris, 1984; Piard e Desmazeaud, 1991; Abdalla, et al.,
1993b; Héchard et al., 1993; Nettles e Barefoot, 1993).
Há muito que se reconhece que a maturação do queijo
consiste num conjunto complexo de processos bioquímicos, no qual a microflora específica desempenha um
papel importante. As espécies implicadas na maturação
de alimentos (queijos) pertencem ao género Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc e Lactobacillus. Na maturação intervêm ainda propionobacterias e leveduras. Por outro lado, as características da
ordenha praticadas nas ovelhas e cabras, fazem prever
uma elevada contaminação fecal, quer nos leites quer
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Gerra, M.M. e Bernardo, F.M.A.
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nos queijos a que deram origem, para além da flora láctica habitual. As bactérias lácticas e os Enterococcus
produzem vários compostos responsáveis pelas características organolépticas dos queijos e ao mesmo tempo
inibem parte dos germes da microflora indesejável.
Em queijos tradicionais alentejanos, onde se pesquisou a presença de Listeria spp. (Guerra e Bernardo,
1999), efectuaram-se contagens da flora láctica e de
Enterococcus, com o objectivo de verificar a existência
de alguma influência entre os tipos de microflora de
cura e a ocorrência de Listeria spp. naqueles produtos.
Material e métodos
A partir da suspensão-mãe em água Peptonada Tamponada de 54 amostras de queijos tradicionais alentejanos, efectuaram-se diluições decimais e semeou-se,
por incorporação, em duplicado, 1 ml de cada uma
delas em gelose de diferenciação e contagem de Lactobacilli e Streptococci no iogurte (L-S modificada) (NP1864/87), em gelose de Man Rogosa e Sharpe (MRS)
(Oxoid CM361) e em gelose Canamicina Esculina
Azida Agar (CEAA) (Oxoid CM591 + SR92) para a
contagem das floras láctica e enterocócica, respectivamente. As geloses foram incubadas a 37ºC durante 2448 horas, sendo as culturas em L-S em microaerofilia
(Gas Generating Kit Oxoid BR 38). Após a incubação
procedeu-se à contagem de colónias características. Na
gelose L-S foram consideradas características as colónias lenticulares, pequenas com 0,1 a 0,2 mm de diâmetro redondas ou ovais, de bordos regulares, brancas
com centro vermelho, envolvidas por uma zona clara
(Streptococcus lácticos) e colónias grandes com 1 mm
de diâmetro, rizóides, de bordos irregulares, vermelhas
escuras, envolvidas por uma zona turva esbranquiçada (Lactobacilllus) (NP 1864/87). Na gelose de MRS
contaram-se as colónias de 0,5 a 1 mm de diâmetro, redondas, lisas ou rugosas, brancas ou incolores brilhantes (Oxoid, 1990). No meio de CEAA contaram-se as
colónias redondas com 1 a 2 mm de diâmetro, brancas
ou acinzentadas, envolvidas por um halo negro de pelo
menos 1 cm (Enterococcus) (Oxoid, 1990).
Resultados
Verificou-se que os teores médios de flora láctica e
de Enterococcus dos queijos tradicionais produzidos
no Alentejo se situava entre 6,9 e 8,6 Log10 UFC/g e
entre 5,9 e 7,6 Log10 UFC/g, respectivamente. Os teores médios mais elevados de flora láctica ocorreram
em queijos fabricados com leite cru e em meia cura
enquanto que os teores médios mais elevados de enterococos foram observados nos queijos fabricados com
leite cru e curados (Quadro 1).
As amostras contaminadas por Listeria spp. (Guerra
e Bernardo, 1999) apresentaram simultaneamente elevados teores de flora láctica e Enterococcus (Quadro
2).
Nos queijos em meia cura, fabricados com leite cru
de ovelha e vaca, onde se efectuaram contagens e que
se apresentaram contaminados por Listeria spp. [T4
(q1), T4 (q2), T4 (q5), T4 (q8)], os teores de flora láctica e de Enterococcus eram > 8 Log10 UFC/g e entre
5,3 e 7,8 Log10 UFC/g, respectivamente. Nos queijos
em meia cura fabricados com leite pasteurizado de
ovelha e vaca, registaram-se teores > 7,9 Log10 UFC/g
de flora láctica e > 6,8 Log10 UFC/g de Enterococcus,
exceptuando três queijos com 3,3 Log10 UFC/g, 5,6
Log10 UFC/g, e 5,7 Log10 UFC/g. Os queijos curados
fabricados com leite cru de ovelha e contaminados por
Listeria spp., apresentaram teores de flora láctica > 7,4
Log10 UFC/g e > 6,0 Log10 UFC/g de Enterococcus.
Inclusivamente, alguns queijos contaminados por Listeria spp. apresentaram os teores mais elevados destas
duas floras, como é o caso de 2 amostras de queijo em
meia cura, fabricados com leite cru de ovelha e vaca,
[T4 (q1) e T4 (q2)], de um queijo em meia cura fabricado com leite pasteurizado de ovelha e vaca, [T5
(q12)] e de um queijo curado fabricado com leite cru
de ovelha, [T2 (q2)] (Quadro 2).
Quadro 1 - Teores médios de Flora Láctica e de Enterococcus spp. em queijos tradicionais do Alentejo (log10 UFC/g)
Tipo de
queijo
Enterococcus spp. (CEAA)
Log10 UFC/g queijo
Flora Láctica (L-S)
Log10 UFC/g queijo
N
Média
(p)
(dp)
N
Média
(p)
(dp)
T1
---
---
---
---
5
6,6
2,06
1,43
T2
5
6,9
1,24
1,11
8
7,6
0,52
0,72
T3
---
---
---
---
3
6,2
0,69
0,83
T4
8
7,9
1,54
1,24
14
6,2
9,77
0,88
T5
7
7,9
0,22
0,47
11
6,7
1,94
1,39
T6
3
7,5
0,08
0,28
5
5,9
0,98
0,99
T6*
4
8,6
0,15
0,12
---
---
---
---
Legenda: T1: queijo de ovelha fabricado com leite cru, em meia cura; T2: queijo de ovelha fabricado com leite cru, curado; T3: queijo de cabra fabricado
com leite cru, curado; T4: queijo de mistura fabricado com leite cru de ovelha e vaca, em meia cura; T5: queijo de mistura fabricado com leite pasteurizado de ovelha e vaca, em meia cura; T6: queijo de mistura fabricado com leite pasteurizado de ovelha e vaca, curado; T6* flora láctica determinada
com gelose MRS; N: nº de amostras; (p): variância; (dp):desvio padrão; ---: Não determinado
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Quadro 2 - Correspondência entre os teores de flora láctica e enterocócica e a presença de Listeria spp.
Tipos de Queijo e amostras (q)
com
Listeria spp.
Espécies de Listeria
Teor (log10 UFC/g queijo) em flora láctica
Teor (log10 UFC/g queijo) em Enterococcus
T2(q1)
L. monocytogenes
7,8
6,7
T2(q2)
L. monocytogenes
8,0
6,3
T2(q3)
L. monocytogenes
7,9
6,3
T2(q4)
L. monocytogenes
7,4
6,0
T4(q1)
L. monocytogenes
8,7
5,9
T4(q2)
L. monocytogenes
8,6
7,8
T4(q5)
L. innocua
---
5,3
T4(q8)
L. innocua
---
5,9
T5(q1)
L. seeligeri
8,5
5,7
T5(q2)
L. seeligeri
7,1
3,3
T5(q3)
L. seeligeri
8,4
5,6
T5(q6)
L. monocytogenes; L. seeligeri
7,6
7,1
T5(q7)
L. ivanovii; L. grayi
7,9
7,7
T5(q8)
L. seeligeri; L. ivanovii; L. innocua
7,9
7,5
T5(q10)
L. seeligeri; L. innocua
---
7,7
T5(q11)
L. monocytogenes; L. ivanovii
---
7,5
T5(q12)
L. seeligeri; L. innocua
---
7,9
Teor médio
7,8
6,45
Variância (p)
0,24
1,44
Desvio padrão (dp)
0,49
1,20
Legenda: T2: queijo de ovelha fabricado com leite cru, curado; T4: queijo de mistura, fabricado com leite cru de ovelha e vaca, em meia cura; T5: queijo
de mistura fabricado com leite pasteurizado de ovelha e vaca, em meia cura
Discussão
As bactérias lácticas, homo e heterofermentadoras
têm um papel fundamental a nível das indústrias de
lacticínios, carnes, vegetais, pastelaria e de bebidas
alcoólicas, onde são frequentemente utilizadas como
“starters”. Sabe-se que, durante a maturação dos queijos, esta microflora desempenha um papel crucial, sobretudo pela formação das características organolépticas e também pela inibição do desenvolvimento de
bactérias indesejáveis (Lenoir, 1985; Demarigny et al.,
1996).
As diferenças registadas nos teores médios de flora láctica e fecal dos queijos tradicionais, produzidos
em várias zonas do Alentejo podem ser atribuídas às
distintas tecnologias de fabrico, nomeadamente, o tipo
de leite (mistura, ovelha e cabra), a utilização de leite
termicamente tratado e ainda, o estado de maturação
(meia cura / curados). Sabe-se que o número total de
germes varia relativamente pouco ao longo da maturação mas, a proporção entre os diferentes grupos microbianos evolui. Determinadas espécies ou certos grupos bacterianos multiplicam-se activamente enquanto
outras populações permanecem em número constante
ou desaparecem pouco a pouco. Estas diferentes evoluções, ligadas às condições de desenvolvimento inerentes a cada grupo de microrganismos, dependem da
composição do substrato (pH; Aw; nutrientes) e do
ambiente (temperatura, composição da atmosfera) (Lenoir, 1988).
Em Portugal, Freitas et al. (1995) ao caracterizarem
o queijo Picante da Beira Baixa, verificaram uma evolução progressiva de flora láctica de 9 log10 no início a
7 log10 UFC/g no final da maturação. Estes valores incluem, no entanto, os teores de Enterococcus, os quais
predominaram no final do período de maturação destes
queijos (180 dias). Giraffa et al. (1997), numa revisão
sobre o papel queijeiro dos Enterococcus referem que
na microflora de vários queijos têm-se encontrado teores daqueles microrganismos entre 7 log10 e 8 log10
UFC/g.
É possível distinguir duas categorias de queijos:
queijos fabricados com leite cru com ou sem a adição
de “starters” e os queijos fabricados com leite pasteurizado com adição de “starters”. Nos primeiros queijos
(normalmente de pasta mole e de pasta semi-mole) os
Enterococcus presentes no leite podem multiplicar-se
durante o processamento e a maturação e, dependendo
da tecnologia, podem corresponder à microflora predominante do queijo. A presença nos fermentos lácteos
é explicada pela sua resistência térmica. Aqueles fermentos são obtidos a partir de leites pasteurizados e
incubados a 42º-44ºC durante 12 a 15 horas, ou seja,
permitindo uma selecção natural de bactérias lácticas
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Gerra, M.M. e Bernardo, F.M.A.
resistentes ao calor e termofílicas. No segundo caso,
normalmente queijos frescos ou de pasta mole, a presença de Enterococcus indesejáveis pode conduzir a
problemas organolépticos atribuídos a más condições
de higiene durante a produção do queijo. Os queijos
produzidos na região do Alentejo que foram analisados
podem inserir-se em ambas as categorias, embora não
lhes sejam adicionados fermentos lácticos. A presença de Enterococcus nos queijos produzidos a partir de
leite pasteurizado, pode dever-se às características de
resistência térmica deste género de bactérias (termodúricas).
Verificou-se no entanto que os teores de flora láctica
e de Enterococcus não exerceram um efeito antagónico
visível nos queijos contaminados por Listeria spp., em
condições naturais. Não obstante, em ensaios in vitro
foi reconhecida a capacidade inibitória de L. monocytogenes por parte de isolados recolhidos no presente
estudo (Guerra e Bernardo, 2001) e que foi atribuída
à produção de ácidos orgânicos e/ou à produção de
peróxido de hidrogénio. Outros autores verificaram a
inexistência de antagonismos entre a flora láctica e Listeria, como é o caso de Shaack e Marth (1988a,b) que
demonstraram a sobrevivência de L. monocytogenes
durante a fermentação de leite desnatado, na presença
de Lactococcus cremoris e Lactococcus lactis e durante 12 dias no iogurte. De salientar, por outro lado, os
trabalhos de Abdalla et al. (1993a,b) que determinaram
a sobrevivência de L. monocytogenes em queijo branco
picante, fabricado com a adição de bactérias lácticas
e substâncias antimicrobianas, entre as quais, ácidos
orgânicos e peróxido de hidrogénio. Estes autores verificaram que nenhuma das substâncias antimicrobianas
inibiu o patogénico, mas em contrapartida, as culturas
lácticas inibiram-no ao longo do processo de maturação do referido queijo. Acresce considerar que pelo
facto de no presente estudo não se ter realizado uma
avaliação ao longo do processo tecnológico de fabrico
e maturação, os resultados poderem também reflectir
o momento em que ocorreram as contaminações por
Listeria. Isto é, poderem traduzir uma contaminação
cruzada superficial, da distribuição, mais do que uma
contaminação da produção, hipótese já formulada anteriormente (Guerra e Bernardo, 1999) e que tornaria
ineficaz uma eventual actividade inibitória por parte
das microfloras láctica e enterocócica.
Os resultados deste trabalho revelam a existência de
elevados teores de flora láctica e de enterococos nos
queijos tradicionais produzidos em várias zonas do
Alentejo, notando-se algumas diferenças atribuídas
às distintas tecnologias de fabrico (tipo de leite e estado de maturação). A referida microflora não parece
influenciar a colonização de Listeria spp., pelo menos
nos queijos em estudo, uma vez que as amostras contaminadas apresentavam, simultaneamente, elevados
teores daquelas floras, embora possam existir factores
que tenham contribuído para essa observação, nomeadamente o momento das contaminações por Listeria
spp.
188
RPCV (2005) 100 (555-556) 185-188
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