XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Efeitos da cilostamida e metades foliculares durante a maturação in vitro de oócitos bovinos1
Effects of cilostamide and follicular hemisections during in vitro maturation of bovine oocyte
Ana Kelry Carneiro Lopes2, Francisco Taiã Gomes Bezerra3, Anderson Weiny Barbalho Silva4, José Jackson
do Nascimento Costa5, Regislane Pinto Ribeiro3, Adriel Pereira de Castro2, José Renato de Sousa Passos3 e
José Roberto Viana Silva6
1
Parte da proposta de mestrado de Francisco Taiã Gomes Bezerra, financiado pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – Edital 06/2011.
2
Graduando em Zootecnia, Universidade Estadual Vale do Acaraú –UVA, Sobral-CE, Brasil. Bolsista
CNPq/Capes. e-mail: [email protected]
3
Mestre em Biotecnologia pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do
Ceará (UFC), Sobral-CE, Brasil.
4,5
Doutorando em Biotecnologia pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia – RENORBIO,
Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza-CE, Brasil.
6
Núcleo de Biotecnologia de Sobral- NUBIS, Universidade Federal do Ceará (UFC), Sobral-CE, Brasil.
Resumo: Este estudo avaliou a influência de cilostamida e metades foliculares no bloqueio da retomada da
meiose e no nível de AMPc em complexo cumulus oócito (CCOs) de bovinos cultivados por 12 horas. Para
tal, CCOs de bovinos foram submetidos à pré-maturação por 12 horas com cilostamida (10µM) e/ou metades
foliculares e em seguida foi avaliado o efeito. Os estudos in vitro indicaram que a associação de 10µM
cilostamida e metades foliculares favorece significativamente o bloqueio da retomada espontânea da meiose
e mantém o nível de AMPc em CCOs de bovinos pré-maturados por 12 horas.
Palavras–chave: bovino, cilostamida, metades foliculares, MIV.
Abstract: This study evaluated the influence of cilostamide and follicular hemisections in blocking the
resumption of meiosis and in the cAMP-level of bovine cumulus oocyte complex (COC) cultured for 12
hours. To this end, bovine COCs were subjected in a pre-IVM for 12 hours with cilostamide (10μM) and
follicular hemisections and then the effect was evaluated. In vitro studies showed that the association of
10μM cilostamide plus follicular hemisections significantly favors the lock of spontaneous resumption of
meiosis and maintains the level of cAMP in pre-matured bovine COCs for 12 hours.
Keywords: bovine, cilostamide, hemisections follicular, IVM.
Introdução
A maturação oocitária in vitro (MIV) é uma etapa crucial e limitante para o sucesso da produção in
vitro de embriões em algumas espécies. A simples remoção dos complexos cumulus oócitos (CCOs) do
ambiente folicular culmina em reinício meiótico espontâneo independente da maturidade citoplasmática, o
que resulta em menores taxas de desenvolvimento embrionário in vitro (Tosti, 2006). Postula-se que a
inibição ou atraso da maturação nuclear espontânea in vitro, forneça mais tempo para o acúmulo de
moléculas que são importantes para o desenvolvimento do embrião, o que poderia melhorar potencialmente a
eficiência da produção de embriões in vitro (Bilodeau-Goeseels, 2012). Estudos indicam que a retomada
espontânea da meiose ocorre, principalmente, devido a uma diminuição na concentração de monofosfato de
adenosina cíclico (AMPc), que tem um papel importante no controle da maturação de oócitos de mamíferos
(Thomas et al., 2002). Considerando que baixas taxas de capacitação oocitária são obtidas in vitro, diversos
estudos têm sido realizados para a obtenção de mecanismos que atuem no bloqueio da retomada espontânea
da meiose com o objetivo de proporcionar mais tempo para os oócitos desenvolverem competência meiótica
completa, resultando em oócitos de melhor qualidade. Dessa maneira, o uso de substâncias que mantenham
altas concentrações de AMPc no interior do oócito, como a cilostamida (Bilodeau-Goeseels, 2012), tem
contribuído para o bloqueio da retomada da meiose in vitro. Outro método que tem sido bastante estudado é o
cocultivo de COCs com metades foliculares. Estudos realizados com a utilização de metades foliculares
indicam que essas células produzem fatores que inibem a progressão da meiose oocitária (Barreta et al.,
2008). Contudo, ainda é desconhecido o efeito da associação de cilostamida e metades foliculares no
bloqueio da retomada espontânea da meiose. Dessa forma, os objetivos desse trabalho foram avaliar os
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efeitos da cilostamida e metades foliculares no bloqueio da retomada espontânea da meiose por 12 horas e
quantificar o nível de AMPc no complexo cumulus ócito (CCO), células do cumulus (CC) e oócito desnudo
(OD) em bovinos.
Material e Métodos
Ovários (n= 200) bovinos foram coletados em abatedouros locais e CCOs oriundos de folículos
ovarianos bovinos (3-8 mm de diâmetro) foram recuperados e selecionados sob um microscópio
estereoscópico. Para obtenção das metades foliculares, folículos transparentes medindo 3-6 mm em diâmetro
foram isolados e selecionadas. Os folículos foram seccionados em duas metades iguais, com auxílio de um
bisturi e os oócitos foram removidos e descartados. O meio de maturação utilizado foi o TCM-199 com sais
de Earle e L-glutamina (GibcoLabs, Grand Island, NY, USA) suplementado com 25 mM de HEPES, 0,2 mM
ácido pirúvico, 2,2 mg/mL bicarbonato de sódio, 5,0 µg/mL LH, 5,0 µg/mL FSH, 0,4% BSA, 100 UI/mL
penicilina e 50 µg/mL sulfato de estreptomicina (TCM-199*). Para avaliar os efeitos das metades foliculares
e cilostamida sobre a retomada da meiose, CCOs (n = 194) foram submetidos a pré-MIV nos seguintes
tratamentos: (I) TCM-199*; (II) TCM-199* suplementado com 10µM cilostamida; (III) TCM-199* na
presença de metades foliculares e (IV) TCM-199* suplementado com 10µM cilostamida na presença de
metades foliculares, durante 12 horas. Após o cultivo, para avaliar a funcionalidade da cromatina e
progressão meiótica, as células de cumulus foram removidas por agitação em vórtex e os oócitos foram
fixados em paraformaldeído a 4% durante 15 minutos e transferidos para 0,5% de Triton X-100. As
modificações na configuração da cromatina foram avaliados por 10µg/mL de bisbenzimida (Hoechst 33342)
e analisados sob um microscópio de epifluorescência invertido (Leica, DMI4000B). Os oócitos foram
classificados de acordo com o estágio de maturação nuclear como vesícula germinativa (VG), GVBD,
metáfase I (MI), anáfase I (AI), telófase I (TI), e metáfase II (MII). Para quantificação do nível de AMPc,
grupos de 50 CCOs foram selecionados e lavados em PBS. As amostras foram acetilados e os níveis de
AMPc nas amostras foram quantificados utilizando um kit AMPc EIA (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI,
EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os percentuais de GVBD nos diferentes tratamentos foram
avaliados utilizando um modelo estatístico para dados categóricos (PROC CATMOD). ANOVA com o pósteste de Shapiro–Wilk foram utilizados para analisar os resultados da quantificação do nível de AMPc. Os
resultados foram expressos em média ± desvio padrão (SD) e as diferenças foram consideradas significativas
quando P <0,05.
Resultados e Discussão
Após 12 horas de cultivo, foi observado um aumento significativo de oócitos em VG em CCOs
cultivados na presença de cilostamida, metades foliculares ou ambos, quando comparado ao grupo controle.
Além disso, em CCOs cultivados com cilostamida e metades foliculares, as percentagens de oócitos em VG
foram significativamente mais elevadas quando comparados com os CCOs cultivadas na presença de
cilostamida ou metades foliculares sozinho (Figura 1), enfatizando um efeito sinérgico destes compostos. No
tocante a quantificação de AMPc, CCOs cultivados na associação de cilostamida e metades foliculares
apresentaram níveis de AMPc significativamente mais elevados quando comparados aos demais tratamentos.
Portanto, a cilostamida atua como um inibidor específico de fosfodiesterase que, por sua vez, é uma
enzima de degradação de AMPc (Sasseville et al., 2009). Este estudo mostra um efeito sinérgico de
cilostamida e metades foliculares na manutenção de oócitos cultivados in vitro durante 12 horas no estágio de
vesícula germinal.
Figuras –
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Figura 1. Percentual de oócitos no estágio de vesícula germinativa (VG) após 12 horas
de cultivo em TCM-199 sozinho ou suplementado com 10µM cilostamida, ou
metades foliculares, e em TCM-199* suplementado com 10µM cilostamida
na presença de metades foliculares. Diferentes letras maiúsculas (A/ B/ C)
representam diferenças significativas entre os tratamentos (p <0,05).
Figura 2. Nível de AMPc no cultivo de CCO bovinos por 6 horas em TCM-199; TCM199 suplementado com 10µM cilostamida; TCM-199* na presença de
metades foliculares e TCM-199* suplementadas com 10µM cilostamida na
presença de metades foliculares. Distintas letras maiúsculas (A/B)
representam diferenças significativas entre os tratamentos (P <0,05).
Conclusões
Cilostamida (10µM) e metades foliculares interagem e são capazes de evitar o reinício da meiose e
manter um alto nível de AMPc em CCOs bovinos cultivados por 12 horas, possibilitando um tempo maior
para síntese de proteínas necessárias para as etapas posteriores
Literatura citada
BARRETA, M. H; OLIVEIRA, J. F.C; FERREIRA, R; ANTONIAZZI, A. Q; GASPERIN, B. G; SANDRI,
L. R; GONCALVES, P. B. D. Evidence that the effect of angiotensin II on bovine oocyte nuclear maturation
is mediated by prostaglandins E2 and F2a. Reproduction, v. 136, p. 733–740, 2008.
BILODEAU-GOESEELS, S. Bovine Oocyte Meiotic Inhibition Before In Vitro Maturation and Its Value to
In Vitro Embryo Production: Does it Improve Developmental Competence? Reproduction in Domestic
Animals, v. 47, p. 687–693, 2012.
SASSEVILLE, M; GAGNON, M. C; GUILLEMETTE, C; SULLIVAN, R; GILCHRIST, R. B; RICHARD,
F. J. Regulation of gap junctions in porcine cumulus-oocyte complexes: contributions of granulosa cell
contact, gonadotropins, and lipid rafts. Molecular Endocrinology, v. 23, p. 700–710, 2009.
THOMAS, R.E; ARMSTRONG, D.T; GILCHRIST, R.B. Differential effects of specific phosphodiesterase
isoenzyme inhibitors on bovine oocyte meiotic maturation. Developmental Biology, v. 244, p. 215-25, 2002.
TOSTI, E. Calcium ion currents mediating oocyte maturation events. Reproductive Biology and
Endocrinology, v. 4, p. 26, 2006.
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