CROMATOGRAFIA
Histórico
M. TSWEET (1903): Separación de diferentes
pigmentos vegetales en columnas rellenadas con
adsorventes sólidos y solventes variados.
éter de
petróleo
mistura de
pigmentos
CaCO
pigmentos
separados
3
Cromatografia =
kroma [color] + graph [escribir]
(griego)
CROMATOGRAFIA
Modalidades y Clasificación
FM = Líquido
Cromatografia
Líquida
FM = Gas
Cromatografia
Gasosa (CG)
Sólida
Cromatografia
Gas-Sólido (CGS)
Líquida
Cromatografia
Gas-Líquido (CGL)
En CG a FE
puede ser:
Cromatógrafo Gaseoso
1
6
2
4
5
3
1 - Reservorio de Gas y Controles de Vapor / Presión.
2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.
3 - Columna Cromatográfica.
4 - Detector.
5 – Amplificador de Señal.
6 - Registro de Señal (Registrador con Computadora).
Observación: en rojo: temperatura controlada
INSTRUMENTACIÓN
Gas de Arraste
Fase Móvil en CG: NO interacciona con la muestra - apenas se desliza a través de la columna.
Siendo usualmente referida como GAS DE
ARRASTE
Requisitos:
INERTE No debe reaccionar con la muestra,
fase estacionaria o superfícies del instrumento.
PURO Debe ser exento de impurezas que
puedan degradar la fase estacionaria.
Impurezas típicas en gases y sus efectos:
H2O, O2
hidrocarbonetos
oxida / hidroliza algunas FE
incompatibles con el DCE
ruído sin señal del
DIC
INSTRUMENTACIÓN
Gas de Arraste
Requisitos:
COSTO
COSTO Gases de altísima pureza pueden ser
muy caros.
C
B
A
A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)
PUREZA
COMPATIBILIDAD CON EL DETECTOR Cada
detector demanda um gas de arraste específico
para mejor funcionamiento.
Selección de Gases de Arraste en Función del
Detector:
He , H2
DCT
DIC
N2 , H2
DCE
N2 (SS), Ar + 5% CH4
INSTRUMENTACIÓN
Alimentación del Gas de Arraste
Componentes necesarios en la linea de
gas:
controladores de vapor / presión de gas
dispositivos para purificación de gas (“traps”)
3
4
6
2
1
5
1 - Cilindro de Gas
2 - Regulador de Presión Primario
3 - “Traps” para eliminar impurezas del gas
4 - Regulador de Presión Secundario
5 - Regulador de Vapor (Controlador Diferencial de Flujo)
6 - Medidor de Vapor (Rotametro)
Nota: Tubos y Conecciones: Acero Inox o Cobre
INSTRUMENTACIÓN
Inyector “en-columna” Convencional
1
2
3
4
1 - Septo (silicona)
2 - Alimentación de gas de arraste
3 - Bloque metálico caliente
4 - Punta de columna cromatográfica
INSTRUMENTACIÓN
Inyección “en-columna” de líquidos
1
2
3
1 - Punta de aguja de microjeringa introducida al
inicio de la coluna.
2 – La muestra inyectada y vaporizada
instantaneamente al inicio de la columna.
3 - “Plug” de vapor de mustra forzado para gas de
arraste a fluir por la columna.
INSTRUMENTACIÓN
Parametros de Inyección
TEMPERATURA DE INYECTOR Debe ser suficientemente elevada para que la muestra se
vaporice imediatamente, sin descomposición
Regla Gral: Tinj = 50oC encima de la
temperatura de ebulición del componente
menos volátil
VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de
columna y del estado físico de la muestra
muestras
Líquidas
muestras
Gasosas
 = 3,2 mm (1/4”)
0,2 L ... 20 L
0,1 ml ... 50 mL
capilar
 = 0,25 mm
0,01 L ... 3 L
0,001 ml ... 0,1 mL
Columna
empaq.
Sólidos: convencionalmente se disuelve en un
solvente adecuado y se inyecta la solución
INSTRUMENTACIÓN
Microjeringas para Inyección
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
Microjeringa de 10  L:
aguja (inox 316)
êmbolo
cuerpo
(pirex)
Microjeringa de 1  L (sección ampliada):
cuerpo
aguja
guia
embolo
INSTRUMENTACIÓN
Colmunas: Definiciones Básicas
EMPAQUETADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
CAPILAR
 = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Relleada con sólido pulverizado (FE sólida o FE
líquida depositada sobre
las partículas de relleno)
Paredes internas recubiertas con un film fino
(fracción de  m) de FE
líquido o sólido
INSTRUMENTACIÓN
Temperatura de la Columna
TEMPERATURA DE LA
COLUMNA
CONTROL CONFIABLE DE LA
TEMPERATURA DE LA COLUMNA ES
ESENCIAL PARA OBTENER BUENA
SEPARACIÓN EN CG
INSTRUMENTAÇÃO
Forno da Coluna
Características Desejáveis de um Forno:
FÁCIL ACESSO À COLUNA A operação
de troca de coluna pode ser frequente.
AQUECIMENTO
E
ESFRIAMENTO
RÁPIDO Importante tanto em análises de
rotina e durante o desenvolvimento de
metodologias analíticas novas.
TEMPERATURA ESTÁVEL E
REPRODUTÍVEL
A temperatura deve ser mantida com
exatidão e precisão de ± 0,1°C.
Em cromatógrafos modernos (depois de 1980),
o controle de temperatura do forno é totalmente
operado por microprocessadores.
INSTRUMENTAÇÃO
Programação Linear de Temperatura
Misturas complexas (constituintes com
volatilidades muito diferentes)
separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAIXA:
- Componentes mais
voláteis são separados
- Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo
como picos mal definidos
TCOL ALTA:
- Componentes mais voláteis não são separados
- Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente
INSTRUMENTAÇÃO
Programação Linear de Temperatura
A temperatura do forno pode ser variada
linearmente durante a separação:
Consegue-se boa
separação dos
componentes da
amostra em menor
tempo
TINI Temperatura Inicial
TFIM Temperatura Final
tINI Tempo Isotérmico Inicial
tFIM Tempo Final do Programa
R Velocidade de Aquecimento
TEMPERATURA
Parâmetros de uma programação de temperatura:
TFIM
R
TINI
tFIM
tINI
TEMPO
INSTRUMENTAÇÃO
Programação Linear de Temperatura
Possíveis problemas associados à PLT:
VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE
A viscosidade de um gás aumenta com a
temperatura.
viscosidade
vazão
DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE Devido
ao aumento de volatilização de FE líquida
INSTRUMENTAÇÃO
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o
material eluido, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
Idealmente: cada substância separada aparece
como um PICO no cromatograma.
INSTRUMENTAÇÃO
Detectores
Mais Importantes:
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA
(DCT OU TCD) Variação da condutividade
térmica do gás de arraste.
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC
OU FID) Íons gerados durante a queima
dos eluatos em uma chama de H2 + ar.
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS
(DCE OU ECD) Supressão de corrente
causada pela absorção de elétrons por
eluatos altamente eletrofílicos.
ANALÓGICO
REGISTRO
DE
SINAL
Registradores XY
DIGITAL
Integradores
Computadores
FASES ESTACIONÁRIAS
Conceitos Gerais
LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: sólidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de
tubos finos de materiais inertes (colunas capilares)
FE
líquida
SUPORTE
Sólido inerte
poroso
Tubo capilar de
material inerte
Para minimizar a perda de FE líquida por
volatilização, normalmente ela é:
Entrecruzada: as
cadeias poliméricas
são quimicamente
ligadas entre si
Quimicamente ligadas:
as cadeias poliméricas
são “presas” ao suporte
por ligações químicas
SÓLIDOS Colunas recheadas com material
finamente granulado (empacotadas) ou depositado
sobre a superfície interna do tubo (capilar)
FASES ESTACIONÁRIAS
Características de uma FE ideal
SELETIVA Deve interagir diferencialmente
com os componentes da amostra.
FE Seletiva:
separação
adequada dos
constituintes da
amostra
FE pouco Seletiva:
má resolução
mesmo com coluna
de boa eficiência
Regra geral: a FE deve ter características tanto
quanto possível próximas das dos solutos a serem
separados (polar, apolar, aromático ...)
FASES ESTACIONÁRIAS
Características de uma FE ideal
AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS
DE USO Maior flexibilidade na otimização
da separação.
BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E
TÉRMICA Maior durabilidade da coluna,
não reage com componentes da amostra
POUCO VISCOSA Colunas mais
eficientes (menor resistência à transferência
do analito entre fases)
DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE
PUREZA Colunas reprodutíveis; ausência
de picos “fantasma” nos cromatogramas.
FASES ESTACIONÁRIAS
FE Sólidas: Adsorção
O fenômemo físico-químico responsável pela
interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na interface entre o gás de
arraste e a FE sólida
Sólidos com grandes
áreas superficiais
(partículas finas, poros)
ADSORÇÃO
Solutos polares
Sólidos com grande
número de sítios ativos
(hidroxilas, pares de
eletrons...)
COLUNAS EMPACOTADAS
Definições Básicas
Tubo de material inerte recheado com FE sólida granulada ou FE líquida depositada sobre suporte sólido.
aço inox
MATERIAL
DO
TUBO
vidro pirex
ø = 3 mm a 6 mm
níquel
L = 0,5 m a 5 m
TEFLON
dp
MESH
Granulometria
do
recheio
60 - 80 mesh
177 - 250 m
80 - 100 mesh
149 - 177 m
100 - 120 mesh
125 - 149 m
Eficiência maximizada com:
- Diminuição de dC
- Diminuição de dp
- Recheio regular
Limitados pela resistência
à passagem de gás de
arraste
COLUNAS EMPACOTADAS
FE Líquidas: Suporte
área superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1
A FE líquida deve ser
disposta sobre um
SUPORTE sólido
microporos regulares (~ 1 m)
NÃO interagir com a amostra
boa resistência mecânica
Uso quase universal: TERRA DIATOMÁCEA
secagem
calcinação
Esqueletos fósseis
(SiO2 + óxidos
metálicos) de algas
microscópicas
fusão com soda
lavagem com ácido
silanização
Chromosorb
Anachrom
Supelcoport
...
COLUNAS CAPILARES
Diâmetro Interno
 dC = 
Eficiência
Valores comuns:
0,10 mm
0,25 mm
0,32 mm
0,53 mm
1
2
3
1
Colunas de altíssima eficiência (amostras
complexas, “Fast GC”); capacidade volumétrica
limitada de processamento de amostra
2
Diâmetros mais comuns; capacidade
volumétrica limitada de amostra requer
dispositivos especiais de injeção
3
Colunas “megabore”: menor eficiência, mas
maior capacidade de processamento permite
uso de injetores convencionais
COLUNAS CAPILARES
Colunas Capilares: Injeção
Baixa capacidade de processamento de amostra
(sub-microlitro)
Injeção direta com microseringa muito difícil !!!
Injetores com divisão (“splitters”) Sistema
pneumático despreza fração da amostra injetada
1
2
3
4
5
1 - Septo;
2 - Entrada de gás de arraste;
3 - “Liner” (misturador);
4 - Coluna Capilar
5 - Purga de gás de arraste;
6 - Válvula de controle de
purga.
6
- Menor sensibilidade (boa parte da amostra é desprezada)
- Divisão da amostra raramente é uniforme (fração purgada
dos constituintes menos voláteis é sempre menor)
- Ajuste da razão de divisão é mais uma fonte de erros
COLUNAS CAPILARES
Large Volume Injection (LVI)
Combinando injetores com temperatura programada, válvulas controladas por microprocessador e pré-colunas pode
ser feita injeção de grandes volumes (> 100  L) de amostra
1 Colunas e
injetor frios;
válvula de purga
aberta (solvente é
eliminado)
2 Colunas e
injetor aquecidos;
válvula de purga
fechada
(constituintes de
interesse
transferidos para
coluna analítica)
COLUNAS CAPILARES
Colunas Multicapilares
“Feixes” paralelos de
colunas capilares
com dC convencional
- Eficiência próxima à das colunas convencionais
- Capacidade similar à das colunas empacotadas
- Colunas mais curtas: análises mais rápidas
Separação de
explosivos em coluna
multicapilar (OV-17,
1000 capilares x 6 m)
1 - 2,6-DNT
2 - 2,4-DNT
3 - 2,4,6-TNT
4 - 3,4,5-TNT
5 - 2,3,4-TNT
6 - RDX ?
7 - tetryl
DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL Massa de
SINAL (S)
um analito que gera um pico com altura igual a três
vezes o nível de ruído
S
=3
N
RUÍDO (N)
RUÍDO Qualquer componente do sinal gerado pelo
detector que não se origina da amostra
Contaminantes nos gases
Fontes
de
Ruído
Impurezas acumuladas no detector
Aterramento elétrico deficiente
DETECTORES
Detector por Ionização em Chama
PRINCÍPIO Formação de íons quando um composto
é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio
O efluente da coluna é
misturado com H2 e O2 e
queimado. Como numa
chama de H2 + O2 não
existem íons, ela não conduz
corrente elétrica.
Quando um composto
orgânico elui, ele também é
queimado. Como na sua
queima são formados íons, a
chama passa a conduzir
corrente elétrica
DETECTORES
Detector por Ionização em Chama
COLETOR
AR
FLAME TIP
H2
BLOCO
COLUNA
O ar e o H2 difundem para o
interior do coletor, onde se
misturam ao efluente da coluna
e queimam:
Uma diferença de potencial
elétrico é aplicada entre o flame
tip e o coletor - quando se
formam íons na chama, flue uma
corrente elétrica:
DETECTORES
Detector por Ionização em Chama
Química da Chama de Hidrogênio:
Incandescência
Estrutura da chama
três regiões básicas
Reação
Quebra
Região de quebra Mistura dos gases, pré-aquecimento,
início da quebra das moléculas de H2, O2 e dos analitos.
Zona de reação Reações exotérmicas com produção e/ou
consumo de radicais H, O, OH, HO2 (provenientes do H2), CH
e C2 (proveniente do analito) e íons CHO+ (analito).
Zona de incandescência Emissão de luz por decaimento de
espécies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visível).
Queima de substâncias
com ligações C-H
Queima de H2
CH + O  CHO+ + e1 íon formado a cada ~105 átomos
de C queimados
Formam-se apenas
radicais !!!
ventajas de la cromatografía
gaseosa
1.eficiente, permite alta
resolución
1.requiere muestras pequeñas
(ml)
1.alta sensibilidad, detecta
ppm y a menudo ppb
limitaciones de la
cromatografía gaseosa
1.la muestra debe ser
volátil
1.no aplicable a muestras
termolábiles
1.muestras “sucias”
requieren de un clean-up
previo
1.cuantitativa (en ciertas
condiciones)
1.se debe utilizar otro
sistema de detección (ej.
MS) para la confirmación
la identificación
1.alta velocidad de análisis
1.es necesario algo de
entrenamiento y
experiencia
1.buena exactitud
1.fácil de usar, bien conocida
BIBLIOGRAFIA
•
•
http://mail.fq.edu.uy/~planta/pdf/FarmacognosiaPE80/GC.doc
http://www.chemkeys.com/esp/md/mds_7/cgced_1/cgced_1.htm