Universidade
Estadual de Londrina
ROBERTA ZANI DA SILVA
FORMULAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE CONÍDIOS
DE BEAUVERIA BASSIANA (BALS.) VUILL.
Londrina
2006
ROBERTA ZANI DA SILVA
FORMULAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE CONÍDIOS
DE BEAUVERIA BASSIANA (BALS.) VUILL.
Tese
apresentada
ao
Curso
de
Pós-graduação
em
Agronomia da Universidade Estadual de Londrina, como
requisito à obtenção do título de Doutor em Agronomia.
Orientador: Pedro Manuel de Oliveira Janeiro Neves
Londrina
2006
CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO ELABORADA PELA DIVISÃO DE PROCESSOS
TÉCNICOS DA BIBLIOTECA CENTRAL DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE
LONDRINA.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
S586f
Silva, Roberta Zani da.
Formulação e armazenamento de conídios de Beauveria Bassiana
(Bals.) Vuill. / Roberta Zani da Silva. – Londrina, 2006.
87f. : il.
Orientador: Pedro Manuel de Oliveira Janeiro Neves.
Tese (Doutorado em Agronomia) - Universidade Estadual de
Londrina, 2006.
Inclui bibliografias.
1. Microorganismos – Controle – Teses. 2. Fungos entomopatogênicos – Teses. 3. Embalagens – Teses. I. Neves, Pedro Manuel de Oliveira Janeiro. II. Universidade Estadual de Londrina. III. Título.
CDU 632.937
Comissão Examinadora
__________________________________
Prof. Dr. Pedro M. O. J. Neves (Orientador)
__________________________________
Prof. Dr. Amarildo Pasini
_________________________________
Profa. Dra Débora C. Santiago
__________________________________
Prof. Dr. Edson Hirosi
__________________________________
Dr. Rogério B. Lopes
__________________________________
Prof. Dr. Ayres O. Menezes Jr. (suplente)
_________________________________
Prof. Dr. Luiz F. A. Alves (suplente)
Londrina, 24 de fevereiro de 2006.
i
"A descoberta consiste em ver o que todo mundo viu
e pensar o que ninguém pensou."
A. Szent-Gyorgyi
ii
Ao meu amado filho Lucas, companheiro de
todas as horas.
DEDICO
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus por me iluminar e me dar sabedoria nos momentos de dificuldade.
A minha mãe Marta que é a responsável por eu ter chegado até aqui, reflexo do que
busco no espelho do caráter, exemplo de mulher batalhadora, de incentivo e amor
incondicional. Não menos ao meu pai Carlos sinônimo de honestidade que me incentivou
sempre da melhor maneira.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) pela bolsa e a taxa de
bancada concedidas.
À Universidade Estadual de Londrina por me conceder a oportunidade de realizar este
curso.
A Milênia Agrociências que permitiu a utilização das suas dependências para o
desenvolvimento das formulações.
Ao meu orientador Professor Doutor Pedro Neves pela orientação, amizade e dedicação.
Ao Pesquisador Edmo Lotufo Lente (Milênia Agrociências) pelo apoio e auxílio na
condução deste trabalho.
Aos Professores de Entomologia Dr. Amarildo Pasini, Dr. Ayres de Oliveira Menezes
Júnior, Dra. Dileimar Galegos, Dr. José Lopes e Dr. Maurício Ursi Ventura que
contribuíram
de
forma
indispensável
para
minha
formação
transmitindo
seus
conhecimentos.
À professora Doutora Inês Cristina Fonseca pelo auxílio na análise estatística dos dados.
Aos amigos do Laboratório de Controle Microbiano de Insetos, em especial a Janaina
Zorzetti e a Silvia Akimi pelo auxílio e amizade..
RESUMO GERAL
Um dos fatores limitantes à utilização em maior quantidade dos fungos
entomopatogênicos é a dificuldade na manutenção da viabilidade dos conídios durante
o armazenamento, o que torna importante a necessidade de desenvolvimento de
formulações e embalagens que aumentem a vida de prateleira destes microorganismos.
Diante disto, o objetivo desta tese foi desenvolver formulações de conídios de
Beauveria bassiana e identificar embalagens que mantivessem a sua viabilidade por
longo período em diferentes temperaturas. Para se estimar a vida de prateleira dos
conídios de B. bassiana (CG 432) formulados foram elaboradas quatro formulações, pó
molhável, pó dispersível em óleo, suspensão concentrada e granulada que foram
armazenadas em quatro condições: freezer (-11 ± 1 °C), refrigerador (6 ± 2 °C) e
câmara climatizada a 25 ± 1°C e 35 ± 1°C) durante 180 dias. Para verificar o efeito das
embalagens sobre a viabilidade dos conídios foi utilizada a formulação granulada
(conídios com arroz parbolizado) acondicionada em embalagens de Coex, poliéster
metalizado e polietileno armazenadas durante 180 dias em refrigerador (6 ±2 °C) e
câmara climatizada a 25 ± 1 °C. A formulação suspensão concentrada foi a que
manteve os conídios viáveis por mais tempo em refrigerador e freezer, sendo também a
mais virulenta a adultos de Hypothenemus hampei, já a granulada foi a que manteve os
conídios viáveis por mais tempo na temperatura ambiente. Os conídios acondicionados
na embalagem tipo Coex em refrigerador e a temperatura ambiente foram os que
apresentaram maior porcentagem de germinação. Pelo exposto pode-se concluir que o
tipo de formulação e a embalagem podem influenciar na viabilidade dos conídios de B.
bassiana durante o armazenamento.
Palavras-chave:
embalagens.
Controle
microbiano,
entomopatógenos,
vida-de-prateleira,
ABSTRACT
One of the limiting factors in the use of more substantial amounts of entomopathogenic
fungi is the difficulty in maintaining conidial viability during storage. The need for
developing formulations and packagings that would increase the shelf life of these
microorganisms is therefore important. Considering this, the objective of this dissertation
was to develop conidial formulations of B. bassiana and identify packagings that would
maintain conidial viability for a long period at different temperatures. In order to estimate
the shelf life of formulated B. bassiana (CG 432) conidia, four formulations were
prepared: wettable powder, oil-dispersible powder, concentrated suspension, and a
granular formulation. These were stored under four conditions: freezer (-11 ± 1 °C),
refrigerator (6 ± 2 °C ), and incubator (at 25 ± 1 °C and 35 ± 1 °C) for 180 days. A
granular formulation (conidia with parboiled rice) was used to verify the effect of different
packaging materials on conidial viability. The formulation was wrapped in Coex,
metallized polyester, or polyethylene, and stored for 180 days in refrigerator (6 ± 2 °C)
and in an incubator at 25 ± 1 °C. The concentrated suspension formulation maintained
the conidia viable for the longest time in refrigerator and freezer, and was also the most
virulent to Hypothenemus hampei adults. The granular formulation, however, maintained
the conidia viable for the longest time at room temperature. The conidia wrapped in the
Coex-type packaging showed the highest germination percentage when stored in the
refrigerator and at room temperature. From the above, it can be concluded that
formulation type and packaging may influence B. bassiana conidial viability during
storage.
Keywords: Microbial control, entomopathogens, shelf life, packagings.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................4
2.1. Efeito da Temperatura, Umidade e Armazenamento em Formulações com
Conídios de Fungos Entomopatogênicos.........................................................................6
2.2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................11
3. ARTIGO 1: VIDA DE PRATELEIRA DE FORMULAÇÕES COM CONÍDIOS DE
BEAUVERIA BASSIANA (BALSAMO) VUILLEMIN .......................................................18
3.1. RESUMO.................................................................................................................19
3.2. ABSTRACT .............................................................................................................20
3.3. INTRODUÇÃO ........................................................................................................21
3.4. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................23
3.4.1. Descrição das Formulações .................................................................................26
3.4.1.1 Pó dispersível em óleo (OP) ..............................................................................26
3.4.1.2. Pó Molhavel (PM) ..............................................................................................27
3.4.1.3. Suspensão Concentrada (SC)...........................................................................28
3.4.1.4. Granulada para aplicação direta (GR)...............................................................30
3.4.2. Virulência dos conídios formulados ......................................................................31
3.5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................33
3.5.1. Viabilidade das Formulações ...............................................................................33
3.5.2. Características Físico-Químicas...........................................................................44
3.5.3. Virulência dos Conídios Formulados. ...................................................................46
3.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................49
4. ARTIGO 2: VIABILIDADE DE CONÍDIOS DE BEAUVERIA BASSIANA
(BALSAMO) VUILLEMIN ACONDICIONADOS EM DIFERENTES EMBALAGENS. .....56
4.1. RESUMO.................................................................................................................57
4.2. ABSTRACT .............................................................................................................58
4.3. INTRODUÇÃO ........................................................................................................59
4.4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................61
4.5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................64
4.5.1. Viabilidade dos Conídios Durante o Armazenamento ..........................................64
4.5.2. Conteúdo de Água dos Conídios durante o Armazenamento ..............................73
4.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................83
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................85
6. CONCLUSÕES ..........................................................................................................87
1
1. INTRODUÇÃO
Entre os diferentes agentes de controle biológico de pragas estão os
patógenos de insetos, com destaque para os fungos, que têm sido utilizados para o
controle de insetos há mais de cem anos.
Os fungos são patógenos de largo espectro, pois podem infectar
diferentes estágios de desenvolvimento dos insetos hospedeiros como ovos, larvas,
pupas e adultos, sendo esta característica desejável e muito peculiar desse grupo.
Alguns são virulentos e a maioria é altamente especializada na penetração via
tegumento, o que os coloca em vantagem quando comparados com outros grupos
de patógenos que só entram no inseto por via oral, penetrando através do
mesêntero (Alves, 1998).
Entre os fungos entomopatogênicos, Beauveria bassiana (Balsamo)
Vuillemin é um dos mais empregados no mundo, devido à sua fácil produção a baixo
custo em grandes quantidades e sua ação de contato por penetrar diretamente na
cutícula do hospedeiro sem a necessidade de ingestão dos conídios pelos insetos
(Prior e Greathead, 1989).
No Brasil e no mundo, B. bassiana vem sendo empregado em
diversos programas de controle de pragas como no do moleque-da-bananeira
(Cosmopolites sordidus), do cupim de montículo (Cornitermes cumulans), da broca
dos citrus (Diploschema rotundicolle), da broca-do-café (Hypothenemus hampei), de
moscas domésticas (Musca domestica), do besouro do milho (Prostephanus
truncatus), bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis),do besouro da batata
(Leptionarsa decemlineata) em coleópteros de grãos armazenados como Tribolium
2
castaneum , Sitophilus zeamais, Pantorhytes plutus entre outros.
Entretanto, um dos fatores limitantes à utilização em maior
quantidade de fungos entomopatogênicos é a dificuldade na manutenção da
viabilidade dos conídios por longos períodos (McClatchie et al., 1994), o que torna
importante a necessidade de desenvolvimento de formulações e embalagens que
aumentem a vida de prateleira destes fungos.
A aplicação, que é geralmente efetuada por pulverização tendo
como principal diluente a água, também é dificultada, pois a superfície do conídio é
altamente hidrófoba. Dessa forma, diferentes produtos deverão ser adicionados ao
agente microbiano de modo a permitir não só sua suspensibilidade e dispersão em
veículo apropriado, como também para aumentar a deposição, espalhamento,
molhamento, adesão, retenção e toxicidade sobre o alvo para qual é dirigido (Costa
et al., 2003).
Os principais fatores que influenciam de forma direta a viabilidade
dos conídios durante o armazenamento são a umidade, a temperatura e a
luminosidade. A umidade e temperatura baixas são geralmente fatores de
estabilidade do produto mantendo-o viável por maior tempo. Entretanto, a baixa
temperatura requer custos de armazenamento e a baixa umidade custos de
secagem. A luminosidade requer embalagens especiais que não possibilitem que a
luz atinja os conídios durante o armazenamento.
Assim a formulação ideal deve manter a viabilidade dos conídios em
condições não controladas, ser de baixo custo, otimizar a aplicação no alvo e
proteger os conídios após a aplicação.
A escolha dos adjuvantes, solventes e inertes utilizados nas
formulações dos micoinseticidas deve ser criteriosa, uma vez que, além de manter a
3
estabilidade da formulação não podem influenciar na viabilidade dos conídios, já que
neste caso o ingrediente ativo é um organismo vivo.
Os micoinseticidas comerciais podem ser formulados em pó, em
soluções aquosas, suspensões emulsionáveis, granulados e óleos (Bateman, 1995;
Tanaka e Kaya, 1993), tendo como principais objetivos a facilidade de aplicação em
campo para atingir o inseto alvo, incremento da vida de prateleira e persistência no
ambiente após a aplicação (Feng et. al., 1994).
Diante disto, o objetivo desta tese foi desenvolver formulações de
conídios de B. bassiana e identificar embalagens que mantivessem a viabilidade dos
conídios durante o armazenamento em diferentes temperaturas.
A tese é apresentada na forma de artigos científicos, a saber:
• Artigo 1: Vida de prateleira de formulações com conídios de Beauveria bassiana
(Balsamo) Vuillemin.
• Artigo 2: Viabilidade de conídios de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin
acondicionados em diferentes embalagens.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
Agente biológico de controle é o organismo vivo, de ocorrência
natural ou obtido por manipulação genética, introduzido no ambiente para o controle
de uma população ou de atividades biológicas de outro organismo vivo considerado
nocivo (Decreto Nº 4.074, DE 4 DE JANEIRO DE 2002). Agentes microbiológicos
são os microrganismos vivos de ocorrência natural, bem como aqueles resultantes
de técnicas que impliquem na introdução natural de material hereditário,
excetuando-se os organismos cujo material genético (DNA/RNA) tenha sido
modificado por qualquer técnica de engenharia genética (OGM) (INSTRUÇÃO
NORMATIVA CONJUNTA Nº. 3 DE 10 DE MARÇO DE 2006).
Segundo Couch e Ignoffo (1981), a combinação de um agente
microbiológico ativo e um segundo material é tecnicamente considerado uma
formulação, entretanto muitas vezes é necessário acrescentar determinados
compostos (adjuvantes) que melhorem o desempenho do patógeno em condições
de campo aumentando a sua distribuição e cobertura e principalmente permitam o
armazenamento sob condições nas quais se minimize o custo com perda mínima na
qualidade do produto.
Para o desenvolvimento de uma formulação a base de agentes de
controle microbiano são necessárias pesquisas da viabilidade e virulência do
patógeno durante o processo de produção e desenvolvimento do produto. A
refrigeração pode garantir uma conservação adequada, principalmente quando
preparadas com elevado teor de umidade. A vida de prateleira destas formulações
deve ser de no mínimo 18 meses quando armazenadas sob condições ambientais,
5
excluindo-se aquelas fornecidas por contrato para aplicação em data específica,
para as quais são considerados três a seis meses de preservação (Couch e Ignoffo
1981).
Vários estudos estão relacionados com a influencia da temperatura e
do armazenamento na viabilidade de fungos entomopatogênicos formulados
(Marques et al., 1999; Pereira e Roberts, 1991; Smith et al., 1999), assim como na
umidade da formulação para aumentar a vida de prateleira dos conídios (Hedgecock
et al., 1995; Hong et al., 1997; Moore et al., 1996; Sanyang, 2000), entretanto, estes
estudos ainda são insuficientes para uma formulação adequada, uma vez que a
tecnologia utilizada continua sendo de propriedade industrial, e estudos realizados
sobre a influencia de embalagens nestas formulações não estão disponíveis na
literatura especializada.
Apesar de existirem alguns estudos sobre formulações de fungos,
pouco tem sido realizado nesta área e os produtos existentes no comércio não
chegam a ser preservados por mais de 60 dias (Alves, 1992).
Um dos fatores a ser considerado na qualidade dos micoinseticidas
é sua viabilidade que é medida pela porcentagem de germinação dos conídios. Para
se ter um mínimo de qualidade os micoinseticidas devem apresentar germinação
maior que 85% (Jenkis e Grzywacz 2000).
A vida de prateleira de um micoinseticida é um fator critico no seu
sucesso (Couch e Ignoffo, 1981) sendo dependente da retenção de alta viabilidade
dos conídios durante o armazenamento (McClatchie et al., 1994), sendo a
temperatura
um
fator
importante
a
ser
considerado
na
capacidade
de
armazenamento dos conídios (Daoust e Roberts, 1983; Walstad et al., 1970;
Stathers et al., 1993).
6
2.1. Efeito da Temperatura, Umidade e Formulações no Armazenamento de
Conídios de Fungos Entomopatogênicos
Em estudos sobre a viabilidade de Metarhizium anisopliae e B.
bassiana verificou-se, que a 21 °C, os conídios de B. bassiana perderam a
viabilidade aos 15 dias e M anisopliae aos 75 dias. Entretanto quando armazenados
a 8 °C, permaneceram viáveis após 12 meses, (Walstad et al., 1970).
A formulação de B. bassiana padronizada na Rússia, denominada
Beauverin ou Boverin, contém caulim e 2 x 109 conídios/g e o controle de qualidade
dessa preparação abrange contagem de conídios para estimativa de germinação e
estudos sobre virulência (Ferron, 1978).
Daoust et al. (1982) trabalhando com formulações granuladas e pós
de M. anisopliae, verificaram que a virulência do fungo nas preparações foram
reduzidas significativamente em relação aos conídios não formulados quando estas
foram armazenadas a 4 e 20°C durante 8 e 12 meses. Entretanto uma das
formulações em pó tendo como diluente óleo de rícino seco (Trixin R) aumentou
significativamente a virulência destes conídios. Os óleos tem a vantagem de se
misturarem
Foram estudados os efeitos de óleos minerais e vegetais, veículos
aquosos, não aquosos, granulados e pós, sobre a viabilidade dos conídios de M.
anisopliae
armazenados durante o período de 12 meses em
diferentes
temperaturas. Verificou-se que as formulações aquosas e oleosas reduziram a
viabilidade dos conídios de M. anisopliae após dois meses de armazenamento a 19
e 26°C, enquanto que, na maioria das formulações granuladas e pós a viabilidade
permaneceu alta, por um período de 12 meses a 4 °C. Entretanto, a 20°C a
viabilidade decresceu para 80% após seis meses e menos de 50% após 12 meses,
7
na maioria das formulações pós (Daoust et al., 1983).
Com B. bassiana, Batista Filho e Cardelli (1986), constataram, que a
viabilidade dos conídios foi mantida com o armazenamento em freezer (-13 °C)
durante 10 meses, enquanto que a 5 °C houve queda acentuada da viabilidade após
seis meses.
Alves et al. (1987) estudaram a viabilidade de 64 formulações de
conídios de M. anisopliae armazenados em temperatura ambiente, refrigerador e
freezer. Foram utilizados os seguintes diluentes e adjuvantes: talco, sílica gel,
pirofilita, OB-MBY, filito, OB-YB, caulim, bentonita, acido bórico, LE-36SMO e farinha
de arroz. Verificaram que as melhores formulações para armazenamento a
temperatura ambiente foram as com filito e farinha de arroz, em refrigerador, as
formulações com sílica gel e talco e para armazenamento em freezer uma
formulação contendo 50% de conídios e 50% de sílica gel.
Prior e Jollands (1988), estudaram o armazenamento de B. bassiana
em formulações com óleo de coco e água e verificaram que os conídios perderam
viabilidade nos primeiros vinte dias de armazenamento em temperatura ambiente
(25 °C), entretanto mantiveram-se viáveis tanto em óleo quanto em água em
refrigerador (2 °C).
Kybal e Kalalova (1990) citaram que o inseticida microbiano Boverol,
à base de B. bassiana é um pó insolúvel em água contendo pelo menos 1010
conídios/g, que armazenado na temperatura de até 10 °C por 12 meses mantém
70% de viabilidade, porém Starcová e Weiser (1992), afirmaram que este
micoinseticida pode ser armazenado na mesma temperatura por 5 anos mantendose com 80% de viabilidade na mesma temperatura.
Conídios de M. flavoviride formulados em óleo de soja e querosene,
8
mantiveram-se viáveis por três meses na temperatura de 5 e 15°C, já a 25°C e 35°C
os conídios perderam viabilidade aos 15 dias (Stathers et al., 1993).
De acordo com Yin (1983), citado por Feng et al. (1994), a
viabilidade dos conídios de B. bassiana com 8% de conteúdo de água foi de 81%
depois de 12 meses de armazenamento a 4 °C, entretanto quando o conteúdo de
água foi aumentado para 15% os mesmos conídios puderam ser armazenados por
apenas seis meses. Quando formulado com um inerte (argila) e armazenado a 26 °C
por 12 meses, não houve queda significativa na viabilidade, Chen et al. (1990),
citado por Feng et al. (1994).
No armazenamento de conídios de M. flavoviride formulados em
óleos vegetais de soja e amendoim com e sem antioxidantes e em óleo mineral
Edex, Moore et al. (1995) verificaram que a 8 °C, os conídios apresentavam-se com
mais de 90% de viabilidade em todas as formulações, já quando armazenados a
17°C as formulações de óleo de amendoim estavam com 70% de viabilidade, aos 15
meses de armazenamento.
Marques e Alves (1996), trabalhando com diferentes formulações de
conídios de B. bassiana constataram que aos 180 dias de armazenamento conídios
puros e conídios mais arroz do meio de cultura mantiveram sua viabilidade em 95%
a 21 °C, mas quando formulados com amido de arroz a viabilidade caiu para 53%.
Aos 240 dias conídios puros e conídios mais arroz do meio de cultura ainda
mantinham 80 % de viabilidade na mesma temperatura, entretanto quando a
temperatura foi aumentada para 30 °C todas as formulações encontravam-se
inviáveis.
Hidalgo et al. (1998), estudando o efeito de formulações com
conídios de B. bassiana no controle de Sitophilus zeamais em milho armazenado,
9
observaram aos 45 dias de armazenamento uma queda na germinação dos conídios
formulados com óleo mineral (Shellsol) de 90,7% para 55,3 % e 77% na temperatura
de 25°C e 4°C respectivamente, já quando formulados em talco e peletes de gordura
a 4°C, não houve queda significativa na germinação.
Em estudos sobre o efeito do armazenamento prolongado sobre os
conídios de B. bassiana formulados em talco, amido de milho, sílica gel, farinha de
arroz e grãos de milho, Alves et al. (1996), observaram que nenhuma das
formulações mantiveram-se com 100 % de viabilidade durante cinco meses.
Conídios de B. bassiana formulados em “peletes” de óleo de canola
hidrogenado com e sem feromônio, em pó e em sílica gel mantiveram-se viáveis
durante 51 semanas em freezer e em refrigerador, já a 25 °C estes apresentaram
germinação em torno de 30% (Smith et al., 1999).
Shimizu e Mitani (2000) verificaram que os conídios de B. bassiana
foram mais tolerantes a altas temperaturas quando os conídios foram secos
adicionando sílica gel nas formulações em óleo.
Conídios de M. flavoviridae armazenados em refrigerador (8°C)
apresentaram germinação acima de 90% quando formulados com óleo e 20 ppm de
inseticida piretróide lambda-cialotrina durante 12 meses (Sanyang et al., 2000).
Hong et al. (2001), estudando o efeito do armazenamento sobre a
longevidade de conídios de B. bassiana verificaram que a umidade acima de 5%
influenciou negativamente sobre a longevidade dos conídios de alguns isolados
testados.
Em estudos sobre o efeito de formulações na viabilidade e
armazenamento a médio prazo de conídios de M. anisopliae, Alves et al. (2002),
verificaram que os conídios mantiveram-se viáveis por mais tempo a 10°C do que a
11
2.2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALVES, R. T.; BATEMAN, R. P.; GUNN, J.; PRIOR, C.; LEATHER, S. R. Effects of
different formulations on viability and medium-term storage of Metarhizium anisopliae
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ALVES, S. B.;. PEREIRA, R. W.; STIMAC, J. L.; VIEIRA, S. A. Delayde germination
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C. J. 67p. 1995.
12
BATEMAN, R. P.; ALVES, R. T. Delivery systems for mycoinsecticides using oilbased formulations. Aspects of Applied Biology, v. 57, p. 163-170. 2000.
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bassiana (Bals.) Vuill. isolados de bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis
Boheman) obtidos em diferentes meios de cultura e armazenados a diferentes
temperaturas. Biológico, v. 52, p. 51-59.1986.
BRASIL. Decreto-Lei Nº 4.074, DE 4 DE JANEIRO DE 2002. Regulamenta a Lei no
7.802, de 11 de julho de 1989, que dispõe sobre a pesquisa, a experimentação, a
produção, a embalagem e rotulagem, o transporte, o armazenamento, a
comercialização, a propaganda comercial, a utilização, a importação, a exportação, o
destino final dos resíduos e embalagens, o registro, a classificação, o controle, a
inspeção e a fiscalização de agrotóxicos, seus componentes e afins, e dá outras
providências. Diário Oficial da União; Poder Executivo, Brasília, 08 de janeiro de
2002.
BRASIL. Instrução normativa nº 3, de 10 de março de 2006. Estabelece
procedimentos a serem adotados para efeito de registro de agentes microbiológicos,
empregados no controle de uma população ou de atividades biológicas de um outro
organismo vivo considerado nocivo. Diário Oficial da União Poder Executivo,
Brasília de 15 de março de 2006.
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Biocontrol, v. 48, p. 705-712. 2003.
COSTA, E. A. D.; ALMEIDA, J. E. M.; LOUREIRO, E. S.; SANO, A. H..
Compatibilidade
de
adjuvantes
no
desenvolvimento
“in
vitro”
dos
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entomopatogênicos Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin e Beauveria bassiana
(Bals.) Vuillemin. STAB, v. 22, p. 38-40. 2003.
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18
3. ARTIGO 1: VIDA DE PRATELEIRA DE FORMULAÇÕES COM
CONÍDIOS DE BEAUVERIA BASSIANA (BALS.) VUILL.
19
3.1. RESUMO
Um dos fatores limitantes à utilização em maior quantidade de fungos
entomopatogênicos é a dificuldade na manutenção da viabilidade e da virulência dos
conídios por longos períodos, tornando-se importante o desenvolvimento de
formulações que aumentem ou preservem essas propriedades durante o
armazenamento destes microorganismos. O objetivo deste trabalho foi verificar o
efeito de formulações e do armazenamento na viabilidade de conídios de Beauveria
bassiana ao longo do tempo. Para se estimar a vida de prateleira dos conídios de B.
bassiana (CG 432) formulados foram desenvolvidas quatro formulações: Pó
molhável, pó dispersível em óleo, suspensão concentrada e granulada que foram
armazenadas em quatro condições (freezer (-11 ± 1 °C), refrigerador (6 ± 2 °C),
câmara climatizada a 25 ± 1 °C e 35 ± 1 °C) durante 180 dias. A formulação
suspensão concentrada foi a que manteve os conídios viáveis por mais tempo em
refrigerador e freezer, sendo também a mais virulenta a adultos de Hypothenemus
hampei, apresentando melhores características físico-químicas, já a granulada foi a
que manteve os conídios viáveis por mais tempo na temperatura ambiente, as
formulações pó dispersível em óleo e pó molhável não mantiveram os conídios
viáveis durante o armazenamento. Pelo exposto pode-se concluir que a formulação,
a temperatura e o tempo de armazenamento influenciam na viabilidade dos conídios
de B. bassiana durante o armazenamento.
Palavras-chave:
Controle
microbiano,
entomopatogênicos, armazenamento.
entomopatógenos,
fungos
20
3.2. ABSTRACT
One of the limiting factors in the use of more substantial amounts of
entomopathogenic fungi is the difficulty in maintaining conidial viability during
storage, making it important to develop formulations that increase or preserve these
properties during the storage of these microorganisms. The objective of this work
was to verify the effect of formulations and storage on the conidial viability of
Beauveria bassiana with time. In order to estimate the shelf life of formulated B.
bassiana (CG 432) conidia, four formulations were developed: wettable powder, oildispersible powder, concentrated suspension, and a granular formulation. These
were stored under four conditions: freezer (-11 ± 1 °C), refrigerator (6 ± 2 °C), and
incubator (at 25 ± 1 °C and 35 ± 1 °C) for 180 days. The concentrated suspension
formulation maintained the conidia viable for the longest time in refrigerator and
freezer, and was also the most virulent to Hypothenemus hampei adults, showing the
best physicochemical characteristics. The granular formulation, however, maintained
the conidia viable for the longest time at room temperature. The oil-dispersible
powder and wettable powder formulations did not maintain conidial viability during
storage. From the above, it can be concluded that formulation, temperature, and
storage time influence B. bassiana conidial viability during storage.
Keywords: Microbial control, entomopathogens, entomopathogenic fungi, storage.
21
3.3. INTRODUÇÃO
Uma das vantagens da utilização de fungos entomopatogênicos, no
controle de pragas, em especial Beauveria bassiana, é sua fácil produção a baixo
custo e sua ação de contato, por penetrar diretamente na cutícula sem a
necessidade de ingestão dos conídios pelos insetos (Prior e Greathead, 1989).
Entretanto, um dos fatores limitantes à utilização em maior
quantidade de fungos entomopatogênicos é a dificuldade na manutenção da
viabilidade dos conídios por longos períodos (McClatchie et al., 1994), o que torna
importante a necessidade de desenvolvimento de formulações e definição de
embalagens que mantenham a estabilidade destes microorganismos durante o
armazenamento contribuindo para o aumento da vida de prateleira destes fungos.
Vários estudos estão relacionados com a influência da temperatura e
do armazenamento na viabilidade de fungos entomopatogênicos formulados
(Marques et al., 1999; Pereira e Roberts, 1991; Smith et al., 1999), assim como na
umidade da formulação para aumentar a vida de prateleira dos conídios (Hedgecock
et al., 1995; Moore et al., 1996; Hong et al., 1997; Sanyang et al., 2000). Entretanto,
estes estudos ainda são insuficientes para uma formulação adequada, uma vez que
a tecnologia continua sendo segredo industrial, e estudos realizados sobre a
influencia de embalagens nestas formulações não estão disponíveis na literatura
especializada.
Um dos fatores a ser considerado na qualidade dos micoinseticidas
é sua viabilidade que é medida pela porcentagem de germinação dos conídios. Para
22
ter-se um mínimo de qualidade, os micoinseticidas devem apresentar germinação
maior que 85% (Jenkis e Grzywacz, 2000).
A vida de prateleira de um micoinseticida é um fator critico no seu
sucesso (Couch e Ignoffo, 1981) sendo dependente da retenção da alta viabilidade
dos conídios durante o armazenamento (McClatchie et al., 1994).
Os micoinseticidas comerciais podem ser formulados em pó, em
suspensões aquosas, suspensões emulsionáveis, granulados e óleos (Bateman
1995; Tanaka e Kaya, 1993), tendo como principais objetivos a facilidade de
aplicação em campo para atingir o inseto alvo, incremento da vida de prateleira e
persistência no ambiente após a aplicação (Feng et. al., 1994).
Entretanto, formulações oleosas aumentam a infectividade no inseto
(Prior e Jollands, 1988; Bateman et al., 1993) aumentam a tolerância dos conídios a
altas temperaturas e mantém uma maior viabilidade dos conídios em relação ao pó
seco (Moore et al., 1996).
A escolha dos adjuvantes, solventes e inertes utilizados nas
formulações dos micoinseticidas deve ser criteriosa, uma vez que, além de manter a
estabilidade da formulação não podem influenciar negativamente na viabilidade dos
conídios, já que neste caso o ingrediente ativo é um organismo vivo.
Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi verificar o efeito de
formulações e do armazenamento na viabilidade de conídios de Beauveria bassiana
ao longo do tempo.
23
3.4. MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Controle Microbiano de
Insetos da Universidade Estadual de Londrina e no Laboratório de Formulação da
Milênia Agrociências, Londrina, Paraná, Brasil.
Foram utilizados conídios de B. bassiana do isolado CG432
(EMBRAPA-CENARGEN) produzidos em arroz pelo método de bandejas (Alves e
Pereira, 1989) (Figura 1) e retirados do arroz com o auxilio de um equipamento
coletor de fungos entomopatogênicos (Neves et al., 1991).
Fig. 1. Produção de conídios de B. bassiana pelo método de bandejas.
Os conídios foram secos em sala climatizada a 18 °C com auxílio de
um desumidificador por 48 horas.
Foram elaboradas quatro formulações contendo conídios de B.
bassiana; pó dispersível em óleo (OP), pó Molhável (PM), suspensão concentrada
26
3.4.1. Descrição das Formulações
3.4.1.1 Pó dispersível em óleo (OP) (Figura 3).
Foram feitas inicialmente, três formulações deste tipo, sendo que a
escolhida para o teste de vida de prateleira foi a que apresentou melhor fluidez, este
parâmetro pode prever a compactação da formulação.
Fig. 3. Formulação Pó Dispersível em Óleo (OP).
Esta formulação continha uma concentração de 4.28 x 1010 conídios
g-1 de formulação, germinação inicial de 98,57% e de 18,65% de conteúdo de água.
A suspensibilidade foi determinada segundo a NBR 13313:1995 a
molhabilidade/umectabilidade segundo a NBR 13242:1994
Os componentes, a quantidade e o custo da formulação OP se
encontram na Tabela 1.
27
Tabela 1. Componentes, quantidade e custo da formulação Pó dispersível em óleo
(OP) de conídios de Beauveria bassiana.
Componentes
Quantidade %
Custo U$/kg
Conídios de B. bassiana (ingrediente ativo)
50
145
Sulfossuccinato de sódio (umectante/dispersante)
4
0,25
Poliacrilato (dispersante)
2
0,14
Sílica 39 AB amorfa (dessecante)
5
0,08
Silicato de alumínio e magnésio (inerte)
39
0,40
Total
100
145,87
3.4.1.2. Pó Molhável (PM)
Foram feitas inicialmente quatro formulações do tipo PM (Figura 4),
sendo que a escolhida para o teste de vida de prateleira foi a que apresentou melhor
molhabilidade.
Fig. 4. Formulação Pó Molhável (PM)
Esta formulação continha uma concentração de 1,20 x 1010 conídios
g-1 de formulação, germinação inicial de 87,03% e 11,40% de conteúdo de água.
28
Os componentes, a quantidade e o custo da formulação PM se
encontra na Tabela 2.
Tabela 2. Componentes, quantidade e custo da formulação Pó molhável (PM) de
conídios de Beauveria bassiana.
Quantidade
%
Custo U$/Kg
Conídios de B. bassiana (ingrediente ativo)
15
43,50
Nonilfenol adsorvido em sílica (umectante)
10
0,40
Alquil naftaleno de sódio (umectante/dispersante)
10
0,40
Terra de diatomáceas (inerte)
65
0,26
Total
100
44,56
Componentes
3.4.1.3. Suspensão Concentrada (SC)
Foram feitas inicialmente seis formulações deste tipo (Figura 5),
sendo que muitas delas não foram viáveis ou por causar morte dos conídios nas
primeiras 24 horas ou pela grande dificuldade de determinar a concentração (bolhas
de óleo) e germinação dos conídios (aprisionamento dos conídios) (Figura 6.). Assim
foi escolhida a formulação que possibilitou avaliar os parâmetros escolhidos e não
interferiu negativamente na porcentagem de germinação inicial dos conídios.
29
Fig. 5. Formulação Suspensão Concentrada (SC).
Fig. 6. Apreensão de conídios pelo óleo ao Microscópio Ótico (40X).
Esta formulação continha uma concentração de 2,70 x 109 conídios
g-1 de formulação, germinação inicial de 93,73 % e10,63% de conteúdo de água.
A suspensibilidade foi determinada segundo a NBR 13313:1995 a
miscibilidade a 30 °C segundo a NBR 13240:1994, a densidade real segundo a
NBR: 13826: 1997 e a viscosidade com o auxilio de um viscosímetro .
Os componentes, a quantidade e custo da formulação SC se
encontra na Tabela 3.
30
Tabela 3. Componentes, quantidade e custo da formulação Suspensão concentrada
(SC) de conídios de Beauveria bassiana.
Componentes
Quantidade %
Custo U$/Kg
B. bassiana (ingrediente ativo)
5
14,50
Óleo vegetal etoxilado
95
1,78
Total
100
16,28
3.4.1.4. Granulada para aplicação direta (GR)
Para esta formulação somente foram utilizados conídios de B.
bassiana e arroz parbolizado (substrato de desenvolvimento) (Figura 7), assim após
a secagem nas bandejas estes foram submetidos ao armazenamento.
Fig. 7. Formulação Granulada (GR).
Esta formulação continha uma concentração de 1,4x108 conídios g-1
de formulação, germinação inicial de 98,00% 13,11% de conteúdo de água.
Os componentes, a quantidade e custo da formulação GR se
encontra na Tabela 4.
31
Tabela 4. Componentes, quantidade e custo da formulação Granulada (Gr) de
conídios de Beauveria bassiana.
Componentes
Quantidade %
Custo U$/Kg
B. bassiana (ingrediente ativo)
2
5,80
Arroz parbolizado
98
0,90
Total
100
6,70
3.4.2. Virulência dos conídios formulados
Para determinar o tempo letal de cada formulação, foram utilizados
adultos da broca-do-café (Hypothenemus hampei) (Ferrari, 1867), capturados em
armadilhas com cairomônio em terreiro de secagem.
As formulações utilizadas não passaram pelo processo de
armazenamento, sendo preparadas no mesmo dia em que foi feito o bioensaio. Os
conídios formulados apresentavam 95% de germinação 24 horas após mistura.
Cada formulação foi diluída em água para que se obtivesse uma
suspensão de 1x 108 conídios mL-1. Esta concentração foi determinada com base em
estudos já realizados por Neves e Hirose (2005).
Grupos de 20 insetos desinfetados com solução de hipoclorito de
sódio a 2% foram mergulhados em 20 mL de cada suspensão por 30 segundos.
Após o mergulho as brocas foram colocadas em placas de Petri
recobertas com filme plástico sendo oferecidas folhas de cafeeiro provenientes de
plantas sem tratamento fitossanitário desinfetadas com hipoclorito de sódio e
lavadas com água corrente.
A avaliação do número de insetos mortos foi realizada diariamente
32
durante sete dias. Para avaliação da mortalidade confirmada pelo fungo, os insetos
foram colocados em câmara úmida.
O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso com cinco
repetições.
Para determinar a TL90 de cada formulação, os dados foram
submetidos a análise de Probit utilizando o programa Polo-PC (LeOra Software,
1987).
33
3.5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.5.1. Viabilidade das Formulações
Quando as formulações de B. bassiana foram armazenadas em
freezer (-11 ± 1 °C) (Tabela 5) observou-se que até os 180 dias, a formulação pó
molhável (PM) foi a que provocou maior redução na viabilidade (26,6%), sendo as
maiores reduções observadas a partir dos 120 dias de armazenamento. Os conídios
formulados em suspensão concentrada (SC), granulada (GR) e Pó dispersível em
óleo (OP) não perderam significativamente a viabilidade durante os 180 dias de
armazenamento, sendo que a formulação SC foi a que obteve maior desempenho
entre as formulações nas condições de freezer.
Em condições de refrigerador (6 ± 2 °C), os conídios das
formulações PM e OP foram os que apresentaram maiores reduções na germinação,
sendo significativas a partir dos 90 e 120 dias de armazenamento, respectivamente
(Tabela 6). Novamente a SC foi a formulação que promoveu uma menor perda de
viabilidade dos conídios (4,3%) nestas condições, sendo seguida pela GR (7,4%),
sendo que não houve diferença significativa entre os dias de armazenamento para
estas duas formulações.
Estes resultados são semelhantes aos encontrados por Daoust et al.
(1983) que embora estudando formulações de M. anisopliae em óleos, verificou
redução na viabilidade dos conídios após 60 dias de armazenamento a 19 e 26 °C,
enquanto que, na maioria das formulações granuladas e pós a viabilidade
permaneceu alta por um período de 12 meses a 4°C.
34
Tabela 5. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de redução da germinação de
conídios de Beauveria bassiana formulados e armazenados em freezer (temperatura
-11 ± 1 °C) durante 180 dias.
Formulações
Dias
OP
GR
SC
PM
Redução (%)
30
2,6 ± 0,56 A a*
3,2 ± 0,56 A a
1,0 ± 0,66 A a
8,2 ± 0,51 A a
60
5,7 ± 1,02 A a
4,9 ± 0,69 A a
2,2 ± 0,31 A a
12,8 ± 0,77 A ab
90
8,1 ± 1,50 A a
6,4 ± 1,04 A a
3,0 ± 0,30 A a
16,0 ± 2,01 A ab
120
11,4 ± 1,39 AB a
6,4 ± 0,70 A a
3,4 ± 0,57 A a
22,5 ± 0,67 B ab
150
13,2 ± 0,88 AB a
7,3 ± 0,97 A a
3,7 ± 0,43 A a
26,4 ± 1,49 B b
180
15,1 ± 1,09 AB a
8,1 ± 0,49 A a
4,1 ± 0,25 A a
26,6 ± 1,08 B b
CV
37,52
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferem entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
35
Tabela 6. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de redução da germinação de
conídios de Beauveria bassiana formulados e armazenados em refrigerador
(temperatura 6 ± 2 °C) durante 180 dias.
Formulações
Dias
OP
GR
SC
PM
Redução (%)
30
6,8 ± 1,44 A a*
1,9 ± 0,49 A a
0,6 ± 0,52 A a
9,3 ± 0,97 A a
60
10,1 ± 0,84 A ab
3,7 ± 0,69 A a
1,6 ± 0,36 A a
11, 6 ± 1,41 A a
90
17,2 ± 2,07 AB ab
4,6 ± 0,57 A a
3,3 ± 0,58 A a
24,0 ± 1,45 B b
120
21,2 ± 1,59 B ab
4,8 ± 0,77 A a
3,4 ± 0,47 A a
26,4 ± 0,67 B b
150
22,1 ± 0,85 B ab
6,6 ± 0,40 A a
3,4 ± 0,21 A a
26,9 ± 1,60 B b
180
25,5 ± 1,15 B b
7,4 ± 0,36 A a
4,3 ± 0,48 A a
28,0 ± 1,22 B b
CV
37,52
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferem entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Em câmara climatizada (25 ± 1 °C), (Tabela 7), os conídios das
formulações OP e PM já apresentavam queda de 40% na viabilidade aos 30 dias de
armazenamento, diferindo significativamente das formulações GR e SC, que
perderam somente 8,15% e 6,4%, respectivamente, em relação a viabilidade inicial.
A porcentagem de redução da germinação dos conídios da
formulação SC foi significativamente maior do que a da granulada aos 90 dias de
armazenamento, sendo que os conídios da formulação granulada mantiveram-se
com alta viabilidade até este período na temperatura ambiente, e os formulados em
SC já não estavam mais viáveis aos 90 dias de armazenamento (Tabela 7). O
mesmo foi observado por Alves et al. (1996) quando formularam B. bassiana em
grãos de arroz e armazenaram a temperatura ambiente (15-38 °C).
36
Tabela 7. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de redução da germinação de
conídios de Beauveria bassiana formulados e armazenados em câmara climatizada
(BOD) a temperatura 25 ±1 °C durante 180 dias.
Formulações
Dias
OP
GR
SC
PM
Redução (%)
30
57,4 ± 1,74 C a*
8,2 ± 1,80 A a
6,4 ± 0,91 A a
40,7 ± 4,38 B a
60
100,0 ± 1,74 B b
8,5 ± 0,84 A a
15,9 ± 3,69 A a
93,9 ± 0,54 B b
90
______
22,9 ± 1,23 A a
72,5 ± 5,94 B b
100,0 ± 0,00 C c
120
______
64,6 ± 1,87 A b
100,0 ± 0,00 B c
______
150
______
83,8 ± 1,53 A c
______
______
180
______
100,0 ± 0,00 A c
______
______
CV
37,52
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferem entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Estudando o armazenamento de conídios de M. flavoviride
formulados em óleo de soja e querosene, Stathers et al., (1993) também observaram
que os conídios mantiveram-se viáveis por mais tempo em temperaturas de 5 e
15°C, do que a 25 °C e 35 °C. O mesmo foi observado por Smith et al. (1999) que
trabalhando com conídios de B. bassiana formulados em peletes de óleo de canola
hidrogenado com e sem feromônio, em pó e em sílica gel observaram que os
conídios mantiveram-se viáveis durante 357 dias em freezer e em refrigerador, já a
25 °C estes apresentaram germinação em torno de 30% .
Resultados semelhantes foram encontrados por Prior e Jollands
(1988), que verificaram que em formulações de óleo de coco e água os conídios de
B. bassiana perderam viabilidade nos primeiros vinte dias de armazenamento em
37
temperatura ambiente (25 °C), entretanto mantiveram-se viáveis em ambas
formulações em refrigerador (2 °C).
As formulações OP, PM, e SC reduziram em mais de 90% a
viabilidade de conídios nos 30 dias de armazenamento em câmara climatizada a 35
± 1 °C (Tabela 8), diferindo significativamente da GR que perdeu 52,2% da
germinação inicial.
Para 30 dias, (Tabela 9), 60 dias (Tabela 10), 90 dias (Tabela 11),
120 dias (Tabela 12), 150 dias (Tabela 13) e 180 dias (Tabela 14), o
armazenamento em freezer (-11 ± 1 °C) e em refrigerador (6 ± 2 °C ) não diferiram
significativamente entre si em todas as formulações.
Tabela 8. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de redução da germinação de
conídios de Beauveria bassiana formulados e armazenados em câmara climatizada
(BOD) a temperatura 35 ± 1 °C durante 180 dias.
Formulações
Dias
OP
GR
SC
PM
Redução (%)
30
100,0 ± 0,00 B a*
52,2 ± 0,56 A a
96,6 ± 2,01 B a
98,8 ± 0,54 B a
60
______
97,1 ± 1,27 A b
100,0 ± 0,00 A a
______
90
______
100,0 ± 1,20 A b
______
______
120
______
______
______
______
150
______
______
______
______
180
______
______
______
______
CV
37,52
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferem entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
38
Tabela 9. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de redução da germinação de
conídios de Beauveria bassiana formulados e armazenados em quatro condições de
temperatura durante 30 dias
Temperatura ( °C)
Formulações
-11
6
25
35
Redução (%)
OP
2,6 ± 0,56 A*
6,8 ± 1,43 A
57,4 ± 1,74 B
100,0 ± 0,00 B
GR
3,2 ± 0,56 A
1,9 ± 0,49 A
8,2 ± 1,80 B
52,2 ± 0,56 ± C
SC
1,0 ± 0,66 A
0,6 ± 0,52 A
6,4 ± 0,91 A
96,6 ± 2,01 B
PM
8,2 ± 0,51 A
9,3 ± 0,97 A
40,7 ± 4,38 B
98,8 ± 0,54 C
CV
37,52
*Médias seguidas da mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de
probabilidade.
Tabela 10. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de redução da germinação
de conídios de Beauveria bassiana formulados e armazenados em quatro condições
de temperatura durante 60 dias.
Temperatura ( °C)
Formulações
-11
6
25
35
Redução (%)
OP
5,7 ± 1,02 A*
10,1 ± 0,84 A
100,0 ± 0,00 B
GR
4,9 ± 0,69 A
3,7 ± 0,69 A
8,5 ± 0,84 A
97,0 ± 1,27 B
SC
2,2 ± 0,31 A
1,6 ± 0,36 A
15,9 ± 3,69 A
100,0 ± 0,00 B
PM
12,8 ± 0,77 A
11,6 ± 1,41 A
93,9 ± 1,09 B
100,0 ± 0,00 B
CV
______
37,52
*Médias seguidas da mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de
probabilidade.
39
Tabela 11. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de redução da germinação
de conídios de Beauveria bassiana formulados e armazenados em quatro condições
de temperatura durante 90 dias.
Temperatura (°C)
Formulações
-11
6
25
35
______
______
Redução (%)
OP
8,1 ± 1,50 A*
17,2 ± 2,07 A
GR
6,4 ± 1,04 A
4,6 ± 0,57 A
22,9 ± 1,23 B
98,8 ± 1,20 C
SC
3,0 ± 0,30 A
3,3 ± 0,58 A
72,5 ± 5,64 B
100,0 ± 0,00 C
PM
16,0 ± 2,01 A
24,0 ± 1,45 A
100,0 ± 0,00 B
CV
37,52
*Médias seguidas da mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de
probabilidade.
Tabela 12. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de redução da germinação
de conídios de Beauveria. bassiana formulados e armazenados em quatro
condições de temperatura durante 120 dias.
Temperatura (°C)
Formulações
-11
6
25
35
______
______
Redução (%)
OP
11,4 ± 1,39 A*
21,2 ± 1,59 A
GR
6,4 ± 0,70 A
4,8 ± 0,77 A
64,6 ± 1,87 B
______
SC
3,4 ± 0,57 A
3,4 ± 0,47 A
100,0 ± 0,00 B
______
PM
22,5 ± 0,67 A
26,4 ± 1,13 A
CV
______
______
37,52
*Médias seguidas da mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de
probabilidade.
40
Tabela 13. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de redução da germinação
de conídios de Beauveria bassiana formulados e armazenados em quatro condições
de temperatura durante 150 dias.
Temperatura (°C)
Formulações
-11
6
25
35
______
______
Redução (%)
OP
13,2 ± 0,88 A*
22,1 ± 0,85 A
GR
7,3 ± 0,97 A
6,6 ± 0,40 A
SC
3,7 ± 0,43 A
3,4 ± 0,21 A
______
______
PM
26,4 ± 1,49 A
26,9 ± 1,60 A
______
______
CV
83,8 ± 1,52 B
______
37,52
*Médias seguidas da mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de
probabilidade.
Tabela 14. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de redução da germinação
de conídios de Beauveria bassiana formulados e armazenados em quatro condições
de temperatura durante 180 dias.
Temperatura (°C)
Formulações
-11
6
25
35
______
______
Redução (%)
OP
15,1 ± 1,09 A*
25,5 ± 1,14 A
GR
8,1 ± 0,49 A
7,4 ± 0,36 A
SC
4,1 ± 0,25 A
4,3 ± 0,48 A
______
______
PM
26,6 ± 1,08 A
28,0 ± 1,22 A
______
______
CV
100,0 ± 0,00 B
______
5,93
*Médias seguidas da mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de
probabilidade.
41
Nenhuma das formulações mantiveram-se viáveis na temperatura
ambiente pelo período de 18 meses sugerido por Couch e Ignoffo (1981), entretanto,
a formulação granulada foi a que conservou a viabilidade dos conídios por mais
tempo nesta temperatura, tendo aumento exponencial da redução da germinação
com o aumento do tempo de armazenamento (Figura 9). Este resultado é
importante, pois esta formulação não requer nenhuma tecnologia, pois os conídios
foram simplesmente armazenados juntamente com o substrato de desenvolvimento
(arroz).
Marques e Alves (1996), trabalhando com diferentes formulações de
conídios de B. bassiana também constataram uma maior viabilidade em conídios
mais arroz do meio de cultura quando armazenados por 180 dias a 21 °C.
Já na formulação SC foi onde ocorreram as menores reduções de
viabilidade dos conídios nas condições de temperaturas mais baixas sendo que na
temperatura ambiente (25 ± 1 °C) a porcentagem de germinação caiu
exponencialmente (Figura 10) durante todo o período de armazenamento. Esta
formulação por ser a base de óleo tem a vantagem de se misturar melhor com os
conídios lipofílicos (Stathers et al., 1993), além de facilitar a aplicação por
pulverização em Ultra-Baixo-Volume (UBV) (Bateman, 2000). Os óleos vegetais
também podem aumentar a eficiência de fungos entomopatogênicos contra os
insetos em comparação a formulações em soluções aquosas (Prior e Jollands,
1988).
% Redução Germinação
42
y = 0.6921x - 24.684
R2 = 0.9388
100
80
60
40
20
0
0
30
60
90
120
150
180
Dias de Armazenamento
Fig. 9. Redução da germinação (%) dos conídios de Beauveria bassiana em
formulação granulada (GR) armazenados em câmara climatizada (25 ± 1 °C)
% Redução Germinação
durante 180 dias.
y = 0.022618x 2 -0.02618x - 44.0146
R2 = 0.99
100
80
60
40
20
0
0
30
60
90
120
150
Dias de Armazenamento
Fig. 10. Redução da germinação (%) dos conídios de Beauveria bassiana
formulados em suspensão concentrada (SC) armazenados em câmara climatizada
(25 ± 1 °C) durante 120 dias.
Se considerarmos que para se ter um mínimo de qualidade os
micoinseticidas devem apresentar germinação maior que 85% (Jenkis e Grzywacz,
2000), podemos afirmar que a formulação SC pode ser armazenada em freezer e
refrigerador durante seis meses e em temperatura ambiente (25 ± 1 °C) por 1 mês, a
43
GR em freezer e refrigerador durante seis meses e em temperatura ambiente (25 ±
1°C) durante dois meses, já a formulações OP pode ser armazenada em freezer
durante 5 meses e em refrigerador durante dois meses, não podendo ser
armazenada na temperatura ambiente. Os conídios utilizados na formulação PM já
estavam com o mínimo de viabilidade no início do experimento, mas se
considerássemos 100% de viabilidade inicial esta poderia ser armazenada em
freezer durante três meses e em refrigerador por dois meses não podendo ser
armazenada em temperatura de 25 °C.
A baixa viabilidade da formulação OP nas temperaturas mais altas
pode ser atribuída ao alto conteúdo de água dos conídios da formulação, em torno
de 18,65%, pois conídios com baixa umidade podem ser mais tolerantes ao
armazenamento em altas temperaturas (Hedgecock et al., 1995, Moore et al., 1996)
e pela utilização do sulfossuccinato de sódio (umectante/dispersante), que é um
tensoativo aniônico que pode ser prejudicial a B. bassiana. Testes realizados por
Marques (1993) revelaram o efeito negativo de surfactantes aniônicos pertencentes
ao grupo alquil sulfato de sódio e alquil sulfossuccinato de sódio em conídios de B.
bassiana e M. anisopliae.
Já a baixa viabilidade na formulação PM pode ser atribuída ao uso
do nonilfenol que é um surfactante não iônico. Segundo Burges (1998) surfactantes
não iônicos são menos desejáveis por causarem danos aos microorganismos,
entretanto Marques (1993) não encontrou incompatibilidade após 24 horas de B.
bassiana com este tensoativo, o uso do alquil naftaleno sulfonato de sódio utilizado
nesta formulação, é um tensoativo aniônico, e por este motivo também pode ter sido
prejudicial a B. bassiana.
44
Alves et al. (2002) estudaram a compatibilidade de emulsificantes,
umectantes e dispersantes utilizados em formulações aquosas e oleosas com
conídios de M. anisopliae, não verificando efeito negativo destes componentes na
germinação dos conídios após 24 e 48 horas de incubação, entretanto, verificaram
este efeito após 35 dias de armazenamento.
A escolha dos adjuvantes de uma formulação de agentes de controle
microbiano, talvez seja a etapa mais difícil no desenvolvimento de uma formulação,
uma vez que, não basta avaliar a compatibilidade entre os adjuvantes e o agente em
questão somente com testes de compatibilidade onde o tempo de contato é de no
máximo 24 horas, o ideal é que se estude o efeito dos prováveis adjuvantes
isoladamente sob condições diversas de armazenamento como tempo e
temperatura.
3.5.2. Características Físico-Químicas
A suspensibilidade (NBR 13313:1995) da formulação OP foi de 70%,
molhabilidade/umectabilidade de 6 minutos, densidade aparente de 0.2460 g cm-3 e
pH inicial de 6,02. Já a suspensibilidade da formulação PM foi de 85%, a
molhabilidade/umectabilidade (NBR 13242:1994) de 30 segundos e 4 centésimos,
densidade aparente de 0,1825 g cm-3 e pH inicial de 6,75.
A suspensibilidade da formulação SC foi de 80%, miscibilidade a 30
°C (NBR 13240: 1994) ótima, densidade real de 1,0090 g cm-3 , viscosidade: 1200cp
e pH inicial de 6,39.
A densidade aparente da formulação GR foi de 0,672 g cm-3, e pH
inicial de 5,80.
A suspensibilidade das formulações OP, PM e SC ficaram dentro da
45
faixa
desejada
segundo
a
NBR
8510:1997
formulações
PM
devem
ter
suspensibilidade no mínimo de 50%, SC no mínimo de 80% e OP no mínimo de
60%, o que mostra que estas três formulações não terão problemas na mistura no
tanque do pulverizador, proporcionando uma distribuição homogênea durante a
pulverização, sem a necessidade de constantes agitações para que não ocorram
perdas, em determinados locais da cultura.
A molhabilidade/umectabilidade da formulação PM também foi
satisfatória, já a molhabilidade/umectabilidade da OP não foi, talvez, pela alta
proporção de conídios utilizados na formulação e a baixa concentração de
surfactantes, não sendo uma boa formulação para mistura no tanque do
pulverizador.
A miscibilidade a 30 °C da SC foi ótima não apresentando separação
do material sólido (conídios ) do líquido (óleo).
O pH da formulação OP, PM, SC e GR após 180 dias de
armazenamento em refrigerador foi de 7,0; 6,2; 6,6 e 5,8, respectivamente e em
freezer de 7,1; 6,3; 6,4 e 5,6, respectivamente, não havendo grandes variações
mantendo-se na faixa de neutralidade durante o armazenamento.
O pH é um parâmetro importante a se considerar principalmente no
que se refere a contaminantes na produção de fungos entomopatogênicos (Jenkis e
Grzywacz, 2000), e influência na germinação do fungo, que pode ser atrasada em
valores extremos, os valores do pH considerados ótimos estão entre 5,5 e 7,0,
(Vélez et al., 1997) sendo assim neste estudo, o pH das formulações encontrou-se
na faixa desejável.
Os testes de determinação das características físico-químicas das
formulações a base de fungos entomopatogênicos infelizmente, ainda são os
47
diatomáceas que pode ser utilizada como sinergista de B. bassiana no controle de
besouros de grãos armazenados (Lord, 2001) foi umas das formulações que
apresentou maior TL90.
Tabela 15. Tempo Letal (TL90), equação da reta e Qui-quadrado (Χ2)para
formulações de conídios de B. bassiana na concentração de 108 conídios na brocado-café (Hypothenemus hampei).
Formulações
TL90 (IC*)
Equação da reta
Χ2
OP
4,9 (3,734-8,233)
y= 3,722404 + 3,7027706 logx
24,65**
PM
5,1 (4,019-7,822)
y= 3,473684 + 3,9616199 logx
22,0**
SC
2,6(1,395-4,133)
y= 5,922583 + 0,86718737 logx
0,9 n.s
GR
5,7 (4,334-8,798)
y= 3,975036 + 3,0798298 logx
14,9**
Conídio puro
5,1(4,115-7,295)
y= 4,0331833 + 3,1652078 logx
11,1**
*IC= intervalo de confiança; ** significativo: n.s= não significativo.
As formulações OP e PM desenvolvidas neste trabalho não são
boas formulações para conídios do fungo entomopatogênico B. bassiana, pois além
de não mante-los viáveis por mais de três meses em temperaturas acima de 6 °C,
também não aumentaram a virulência dos mesmos. Embora a formulação GR tenha
sido a que manteve os conídios viáveis por mais tempo a temperatura ambiente ( 25
± 1 °C) também não aumentou a virulência, tendo TL90 semelhante a dos conídios
não formulados.
A formulação SC manteve os conídios de B. bassiana viáveis por 30
dias na temperatura ambiente, aumentando consideravelmente a sua virulência em
adultos da broca-do-café. Sendo assim dentre as formulações desenvolvidas neste
48
trabalho em condições de laboratório esta foi a que apresentou melhor desempenho
em termos de armazenamento em baixas temperaturas e virulência dos conídios de
B. bassiana.
Alguns fatores ainda devem ser investigados sobre formulações e
armazenamento de fungos entomopatogênicos, principalmente no que se refere a
compatibilidade de inertes e surfactantes presentes nas formulações e tipos de
embalagens para o seu acondicionamento.
Deve-se considerar também no desenvolvimento de formulações o
inseto a ser controlado e o sistema de cultivo da lavoura em questão. Estudos sobre
a fitotoxicidade e tecnologia de aplicação das formulações contendo fungos
entomopatogênicos também devem ser realizados.
49
3.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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56
4. ARTIGO 2: VIABILIDADE DE CONÍDIOS DE BEAUVERIA
BASSIANA (BALSAMO) VUILLEMIN ACONDICIONADOS EM
DIFERENTES EMBALAGENS
57
4.1. RESUMO
Um dos fatores limitantes à utilização em maior quantidade de fungos
entomopatogênicos é a dificuldade na manutenção da viabilidade dos conídios por
longos períodos de armazenamento, o que torna importante a necessidade de
desenvolvimento de formulações e embalagens que aumentem a vida de prateleira
destes microorganismos. Entretanto estudos realizados com embalagens no
armazenamento destes fungos são inexistentes na literatura especializada. Diante
disto, o objetivo deste trabalho foi identificar embalagens que mantivessem a
viabilidade dos conídios por longos períodos de armazenamento em diferentes
temperaturas. O trabalho foi desenvolvido no laboratório de controle microbiano de
insetos da Universidade Estadual de Londrina. Foi utilizada uma formulação
granulada (conídios e arroz parbolizado) de B. bassiana (CG 432) acondicionados
em três tipos de embalagens: Coex, poliéster metalizado e polietileno, que foram
armazenadas durante 180 dias em refrigerador (6 ± 2 °C) e câmara climatizada (25 ±
1 °C). Os parâmetros utilizados para avaliar a influência das embalagens sobre a
viabilidade dos conídios foi a porcentagem de germinação e o conteúdo de água. Os
conídios acondicionados na embalagem tipo Coex foram os que apresentaram maior
porcentagem de germinação em refrigerador e a temperatura ambiente durante todo
o período de armazenamento, sendo também a embalagem que proporcionou
menor ganho de água pelos conídios durante o armazenamento. Independente da
embalagem os conídios armazenados em refrigerador
apresentaram maior
porcentagem de germinação em relação aos armazenados a temperatura ambiente
(25 ± 1°C). Concluiu-se que o tipo de embalagem pode interferir na viabilidade dos
conídios durante o armazenamento.
Palavras-chave: Controle microbiano, fungos entomopatogênicos, temperatura,
conteúdo de água, armazenamento.
58
4.2. ABSTRACT
One of the limiting factors in the use of more substantial amounts of
entomopathogenic fungi is the difficulty in maintaining conidial viability for long
periods of storage. The need for developing formulations and packagings that would
increase the shelf life of these microorganisms is therefore important. However, there
are no studies available in the specialized literature on packaging for storage of these
fungi. Considering this, the objective of this work was to identify packagings that
would maintain conidial viability for long storage periods at different temperatures.
The work was developed at the insect microbial control laboratory of Universidade
Estadual de Londrina, Brazil. A granular B. bassiana (CG 432) formulation (conidia
and parboiled rice) was used, wrapped in three different types of packagings: Coex,
metallized polyester, and polyethylene, which were stored in refrigerator (6 ± 2 °C)
and in an incubator (25 ± 1 °C) for 180 days. Germination percentage and water
content were the parameters used to evaluate packaging influence on conidial
viability. The conidia wrapped in Coex packaging showed the highest germination
percentage in refrigerator and at room temperature during the entire storage period.
This packaging also provided the lowest water acquisition by the conidia during
storage. Regardless of packaging, the conidia stored in refrigerator showed the
highest germination percentage in relation to those stored at room temperature (25 ±
1 °C). It was concluded that the type of packaging may interfere with conidial viability
during storage.
Keywords: Microbial control, entomopathogenic fungi, temperature, water content,
storage.
59
4.3. INTRODUÇÃO
Um dos fatores limitantes à utilização em maior quantidade de
fungos entomopatogênicos é a dificuldade na manutenção da viabilidade dos
conídios por longos períodos (McClatchie et al., 1994).
A temperatura, umidade e a luminosidade alta, assim como o
conteúdo de água dos conídios, são fatores críticos que interferem na viabilidade
durante o armazenamento, conídios com baixa umidade podem ser mais tolerantes
ao armazenamento em altas temperaturas (Hedgecock et al., 1995; Moore et al.,
1996). A umidade e temperatura baixas são geralmente fatores de estabilidade dos
conídios mantendo-os viáveis por maior espaço de tempo.
Na tentativa de solucionar estes problemas tem-se desenvolvido
métodos de secagem e formulações (Hedgecock et al., 1995; Hong et al., 1997;
Marques et al., 1999; Moore et al., 1996; Pereira e Roberts, 1991; Sanyang, 2000;
Smith et al., 1999) para que os conídios de fungos entomopatogênicos possam
manter-se viáveis durante longos períodos de armazenamento, entretanto, estudos
realizados sobre a influencia de embalagens em formulações ou em conídios puros
destes microorganismos não estão disponíveis na literatura especializada.
A utilização de embalagens adequadas para o acondicionamento de
conídios formulados ou não pode servir de barreira entre os conídios e o meio
impedindo que ocorra troca de água com o ambiente e que a luz não atinja os
conídios durante o armazenamento.
60
Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar embalagens que
mantivessem a viabilidade dos conídios de B. bassiana por longos períodos de
armazenamento em diferentes temperaturas.
61
4.4. MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Controle Microbiano de
Insetos da Universidade Estadual de Londrina.
Foi utilizada uma formulação granulada contendo conídios de B.
bassiana do isolado CG432 e arroz parbolizado (substrato de desenvolvimento).
A formulação foi seca em sala climatizada a 18 °C com auxílio de um
desumidificador por 48 horas.
A formulação com porcentagem de germinação de 98,20% e 11,
76% de conteúdo de água foi acondicionada em três tipos de embalagens e
armazenada em duas temperaturas; 6 ± 2 °C (refrigerador) e 25 ± 1 °C (câmara
climatizada).
As embalagens utilizadas foram: Frasco Coex (polietileno de alta
densidade co-extrusado) com capacidade para 100 mL, Poliéster Metalizado de
polietileno de baixa densidade com 123 µ de espessura e Polietileno transparente
(Figura 1).
A viabilidade e a umidade dos conídios foram avaliadas a cada 30
dias durante seis meses de armazenamento nas duas temperaturas.
A viabilidade foi determinada utilizando teste de germinação e o
conteúdo de água através da umidade em base seca (UBS) em estufa a 105 °C até
peso constante de acordo com a AOAC (1995).
62
Coex
Poliéster metalizado
Polietileno
Fig. 1. Tipos de embalagens utilizadas para o acondicionamento da formulação
granulada com de conídios de B. bassiana.
As amostras destrutivas foram feitas em triplicata contendo 5g de
material, sendo que de cada amostra foram inoculadas três placas para avaliação da
germinação e da umidade.
Para avaliar a porcentagem de germinação dos conídios da
formulação foi inoculada e espalhada com alça de Drigalski 0,1 mL de uma
suspensão de 1 x 106 conídios mL-1 em placas de Petri contendo meio BatataDextrose-Ágar (BDA).
As placas foram incubadas durante 24 horas em câmara climatizada
tipo B.O.D a 25 ± 1,0 °C e fotoperíodo de 12 horas, após este período foi realizada a
contagem dos conídios dividindo-se as placas em quatro quadrantes e contando no
mínimo 100 conídios por quadrante entre aqueles germinados e não germinados.
63
O delineamento experimental foi em esquema fatorial 3 x 2 x 6 e as
médias submetidas à análise de variância e comparadas pelo Teste de Tukey a 5%
utilizando o programa de análise estatística.
Foi realizada análise de correlação entre a porcentagem de
germinação e o conteúdo de água pelo coeficiente de Pearson.
Foi realizada análise de regressão para verificar o efeito do tempo
de armazenamento na viabilidade e no conteúdo de água dos conídios
acondicionados nas embalagens.
64
4.5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.5.1. Viabilidade dos Conídios de B. bassiana Formulados Durante o
Armazenamento
Quando a formulação granulada de B. bassiana foi armazenada em
refrigerador (6 ± 2 °C), a viabilidade dos conídios acondicionados nas embalagens
Coex, poliéster e polietileno não diferiram significativamente entre si até os 150 dias,
entretanto aos 180 dias a viabilidade dos conídios acondicionados na embalagem de
polietileno foi significativamente menor do que nas outras duas embalagens (Tabela
1).
Não houve diferença significativa na porcentagem de germinação
dos conídios entre os 30, 60 e 90 dias de armazenamento (Tabela 1) quando
acondicionados na embalagem tipo coex e polietileno em refrigerador, as menores
porcentagens foram observadas aos 150 e 180 dias de armazenamento.
Já para a embalagem de poliéster não houve diferença significativa
entre os 30 e 60 dias de armazenamento, onde foram observadas as maiores
porcentagens de germinação nesta embalagem, 96,61% e 90,22% respectivamente
(Tabela 1).
65
Tabela 1. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de germinação de conídios
de Beauveria bassiana em formulação granulada acondicionada em três tipos de
embalagens armazenadas em refrigerador (temperatura 6 ± 2 °C) durante 180 dias.
Embalagens
DIAS
Coex
Poliéster metalizado
Polietileno
% Germinação
30
96,0 ± 0,60 A a*
96,6 ± 0,69 A a
94,2 ± 0,68 A a
60
92,6 ± 0,43 A ab
90,2 ± 0,89 A ab
91,1 ± 0,39 A ab
90
89,1 ± 0,18 A abc
87,5 ± 0,25 A bc
86,7 ± 0,42 A ab
120
87,4 ± 0,25 A bc
83,2 ± 0,68 A bcd
84,3 ± 0,36 A bc
150
83,5 ± 0,80 A cd
78,9 ± 0,42 A cd
76,8 ± 1,45 A c
180
78,7 ± 0,97 A d
75,7 ± 0,35 A d
66,9 ± 1,77 B d
CV
6,37
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferem entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Na temperatura de 25°C não ocorreu diferença significativa entre as
três embalagens aos 30 dias de armazenamento, entretanto aos 60, 90, 120, 150 e
180 dias a porcentagem de germinação dos conídios na embalagem Coex foi
significativamente maior que na de poliéster metalizado e polietileno, sendo que a
porcentagem de conídios viáveis acondicionados nesta ultima caiu acentuadamente
de 92,7 % para 32,9% aos 30 dias de armazenamento e aos 90 dias já estavam com
0% de germinação. (Tabela 2).
66
Tabela 2. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de germinação de conídios
de Beauveria bassiana bassiana em formulação granulada acondicionada em três
tipos de embalagens armazenadas em câmara climatizada (25 ± 1 °C) durante 180
dias.
Embalagens
DIAS
Coex
Poliéster metalizado
Polietileno
% Germinação
30
93,5 ± 0,81 A a*
92,1 ± 0,65 A a
92,7 ± 0,62 A a
60
79,0 ± 1,5 A b
71,4 ± 4,75 B b
32,9 ± 3,01 C b
90
68,2 ± 1,90 A c
48,9± 2,97 B c
0,0 ± 0,00C c
120
54,7 ± 1,82 A d
33,1 ± 0,81 B d
______
150
42,8 ± 2,30 A e
0,0 ± 0,00 B e
______
180
35,2 ± 1,39 A e
______
______
CV
6,37
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferem entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Aos 30 dias de armazenamento não houve diferença significativa na
porcentagem de germinação entre as temperaturas de 6 ± 2 °C e 25 ± 1 °C para as
três embalagens (Tabela 3), entretanto aos 60 dias (Tabela 4), 90 dias (Tabela 5),
120 dias (Tabela 6), 150 dias (Tabela 7) e 180 dias (Tabela 8) a porcentagem de
germinação em todas as embalagens foi significativamente maior quando
67
Tabela 3. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de germinação de conídios
de Beauveria bassiana bassiana em formulação granulada acondicionada em três
tipos de embalagens armazenadas em refrigerador (5-8 °C) e câmara climatizada
(25 ± 1,0 °C) durante 30 dias.
Temperatura ( °C)
Embalagens
6
25
% Germinação
Coex
96,0 ± 0,60 A*
93,5 ± 0,81 A
Poliéster Metalizado
96,6 ± 0,69 A
92,1 ± 0,65 A
Polietileno
94,2 ± 0,67 A
92,7 ± 0,62 A
CV
6,37
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
Tabela 4. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de germinação de conídios
de Beauveria bassiana. bassiana em formulação granulada acondicionada em três
tipos de embalagens armazenadas em refrigerador (6 ± 2 °C) e câmara climatizada
(25 ± 1 °C) durante 60 dias.
Temperatura ( °C)
Embalagens
6
25
% Germinação
Coex
92,6 ± 0,43 A*
79,0 ± 1,50 B
Poliéster Metalizado
90,2 ± 0,89 A
71,4 ± 4,75 B
Polietileno
91,1 ± 0,39 A
32,9 ± 3,01 B
CV
6,37
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
68
Tabela 5. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de germinação de conídios
de Beauveria bassiana em formulação granulada acondicionada em três tipos de
embalagens armazenadas em refrigerador (6 ± 2 °C) e câmara climatizada (25 ± 1
°C) durante 90 dias.
Temperatura ( °C)
6
Embalagens
25
% Germinação
Coex
89,09 ± 0,18 A*
68,22 ± 1,90 B
Poliéster Metalizado
87,45 ± 0,26 A
48,98 ± 2,97 B
Polietileno
86,71 ± 0,42 A
0,0 ± 0,00 B
CV
6,37
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
Tabela 6. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de germinação de conídios
de B. bassiana em formulação granulada acondicionada em três tipos de
embalagens armazenadas em refrigerador (6 ± 2 °C) e câmara climatizada (25 ± 1
°C) durante 120 dias.
Temperatura ( °C)
Embalagens
6
25
% Germinação
Coex
87,4 ± 0,25 A*
54,6 ± 1,82 B
Poliéster Metalizado
83,2 ± 0,68 A
33,1 ± 0,81 B
Polietileno
84,3 ± 0,36 A
______
CV
6,37
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
69
Tabela 7. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de germinação de conídios
de Beauveria bassiana em formulação granulada acondicionada em três tipos de
embalagens armazenadas em refrigerador (6 ± 2 °C) e câmara climatizada (25 ± 1
°C) durante 150 dias.
Temperatura ( °C)
6
Embalagens
25
% Germinação
Coex
83,5 ± 0,80 A*
42,8 ± 2,30 B
Poliéster Metalizado
78,9 ± 0,96 A
0,0 ± 0,00 B
Polietileno
76,8 ± 1,45 A
_____
CV
6,37
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
Tabela 8. Média e erro padrão (± EP) da porcentagem de germinação de conídios
de Beauveria bassiana em formulação granulada acondicionada em três tipos de
embalagens armazenadas em refrigerador (5-8 °C) e câmara climatizada (25 ± 1,0
°C) durante 180 dias.
Temperatura ( °C)
Embalagens
6
25
% Germinação
Coex
78,7 ± 2,75 A*
35,2 ± 1,39 B
Poliéster Metalizado
75,7 ± 0,35 A
_____
Polietileno
66,9 ± 1,77 A
_____
CV
6,37
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
70
Considerando que para se ter um mínimo de qualidade os
micoinseticidas devem apresentar germinação maior que 85% (Jenkis e Grzywacz,
2000) podemos afirmar que os conídios de B. bassiana com substrato de
desenvolvimento acondicionados em embalagens Coex podem ser armazenados em
refrigerador por 120 dias (87,4%) e em temperatura ambiente por 30 dias (93,5%).
Já quando acondicionados em embalagens de poliéster metalizado e de polietileno
podem ser armazenados em refrigerador por 90 dias e em temperatura ambiente por
30 dias.
Embora nenhuma das embalagens tenha mantido a viabilidade
inicial dos conídios durante os 180 dias de armazenamento, na embalagem Coex
estes ainda apresentavam porcentagem de germinação de 78,7% em refrigerador e
32,20 em câmara climatizada a 25°C, enquanto na embalagem de poliéster
metalizado e polietileno a 25°C apresentavam 0% de germinação aos 150 e 90 dias
respectivamente.
A análise de regressão mostrou que tanto em refrigerador quanto na
temperatura ambiente (25 ± 1 °C) a porcentagem de germinação caiu com o passar
dos dias, na embalagem Coex (Figura 2) e na de poliéster metalizado ( Figura 3 e
Figura 4). Nas condições de refrigerador, a porcentagem de germinação dos
conídios acondicionados na embalagem Coex caiu linearmente, já em câmara
climatizada (25 ± 1 °C) esta queda foi exponencial. Quando os conídios foram
acondicionados na embalagem de polietileno, tanto em refrigerador (6 ± 2°C) (Figura
5), quanto em câmara climatizada a queda na germinação foi exponencial (Figura 6).
% de Germinação
71
y = -0.1099x + 99.437
R2 = 0.9862
100
80
60
y = 0.0006x 2 - 0.519x + 108.59
R2 = 0.998
40
20
0
0
30
60
90
120
150
180
Dias de Armazenamento
Coex 5-8C
Coex 25C
Fig. 2. Porcentagem de germinação de conídios de Beauveria bassiana em
% de Germinação
formulação granulada acondicionada em embalagem tipo Coex durante 180 dias.
100
80
60
y = 0.0002x 2 - 0.1777x + 101.29
R2 = 0.9934
40
20
0
0
30
60
90
120
150
180
Dias de Armazenamento
Fig. 3. Porcentagem de germinação de conídios de Beauveria
bassiana em
formulação granulada acondicionada em embalagem de Poliéster metalizado
armazenada em refrigerador (temperatura 6 ± 2 °C) durante 180 dias.
% de Germinação
72
y = -5E-05x3 + 0.0114x2 - 1.4912x + 128.33
R2 = 0.9971
100
80
60
40
20
0
0
30
60
90
120
150
180
Dias de Armazenamento
Fig. 4. Porcentagem de germinação de conídios de Beauveria
bassiana em
formulação granulada acondicionada em embalagem de Poliéster metalizado
% de Germinação
armazenada em câmara climatizada (temperatura 25 ± 1 °C) durante 150 dias.
100
80
60
y = -0.0009x 2 + 0.0186x + 93.873
R2 = 0.9889
40
20
0
0
30
60
90
120
150
180
Dias de Armazenamento
Fig. 5. Porcentagem de germinação de conídios de Beauveria bassiana em
formulação granulada acondicionada em embalagem de Polietileno armazenada em
refrigerador (temperatura 6 ± 2 °C) durante 180 dias.
% de Germinação
73
100
y = -1.5457x + 134.63
R2 = 0.9728
80
60
40
20
0
0
30
60
90
120
Dias de Armazenamento
Fig. 6. Porcentagem de germinação de conídios de Beauveria bassiana em
formulação granulada acondicionada em embalagem de Polietileno armazenada em
camara climatizada (temperatura 25 ± 1 °C) durante 90 dias.
4.5.2. Conteúdo de Água da Formulação Granulada com Conídios de B.
bassiana durante o Armazenamento.
Não houve diferença significativa no conteúdo de água da
formulação entre as três embalagens durante os 180 dias de armazenamento em
refrigerador (Tabela 9), com exceção para a embalagem de polietileno que aos 60
dias de armazenamento, a formulação apresentou conteúdo de água de 17,2%,
esse valor discrepante em relação aos outros pode ter sido ocasionado pelo mau
fechamento ou abertura das embalagens avaliadas nesta data. Na embalagem tipo
Coex e poliéster metalizado não ocorreu diferença significativa no conteúdo de água
nos dias de armazenamento em refrigerador, já na embalagem de polietileno o
conteúdo
de
água
da
formulação
aos
30
dias
de
armazenamento
significativamente menor do que nos outros dias de avaliação (Tabela 9).
foi
74
Tabela 9. Média e erro padrão (± EP) do conteúdo de água (UBS) de uma
formulação granulada com conídios de Beauveria bassiana acondicionada em três
tipos de embalagens armazenadas em refrigerador (6 ± 2 °C) durante 180 dias.
Embalagens
DIAS
Coex
Poliéster metalizado
Polietileno
UBS %
30
12,1 ± 0,16 A a*
12,2 ± 0,13 A a
11,5 ± 0,56 A c
60
12,5 ± 0,30 B a
13,2 ± 0,18 B a
17,2 ± 0,15 A a
90
13,0 ± 0,24 A a
12,9 ± 0,21 A a
13,2 ± 0,16 A bc
120
12,9 ± 0,18 A a
13,0 ± 0,10 A a
13,3 ± 0,07 A b
150
13,1 ± 0,27 A a
13,3 ± 0,29 A a
13,4 ± 0,08 A b
180
12,7 ± 0,06 A a
13,7 ± 0,32 A a
13,7 ± 0,26 A b
CV
5,06
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferem entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Na temperatura de 25°C aos 30 e 90 dias de armazenamento o
conteúdo de água da formulação acondicionada na embalagem Coex foi
significativamente menor (12,3%) do que na de poliéster metalizado (14,0%) e na de
polietileno (14,7%), já nas outras datas de avaliação não houve diferença
significativa no conteúdo de água da formulação nas três embalagens (Tabela 10). O
conteúdo de água da formulação acondicionada na embalagem Coex aos 120 dias
de armazenamento foi significativamente maior do que nos outros (14,1%), já na
embalagem de poliéster e polietileno o maior conteúdo de água foi observado aos 90
dias de armazenamento, 16,2% e 17,1% respectivamente.
75
Tabela 10. Média e erro padrão (± EP) do conteúdo de água (UBS) de uma
formulação granulada com conídios de Beauveria bassiana acondicionada em três
tipos de embalagens armazenadas em câmara climatizada (25 ± 1 °C) durante 180
dias.
Embalagens
DIAS
Coex
Poliéster Metalizado
Polietileno
UBS %
30
12,3 ± 0,20 B b*
14,0 ± 1,16 A b
14,7 ± 0,77 A b
60
12,7 ± 0,16 A ab
13,2 ± 0,46 A b
12,6 ± 0,03 A c
90
13,174 ± 0,02 B ab
16,2 ± 0,99 A a
17,1 ± 0,28 A a
120
14,1 ± 0,65 A a
14,2 ± 0,22 A b
______
150
13,8 ± 0,15 A ab
14,6 ± 0,38 A ab
______
180
13,6 ± 0,14 A ab
______
______
CV
5,06
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferem entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Aos 30 dias de armazenamento não ocorreu diferença significativa
entre o conteúdo de água da formulação acondicionada na embalagem Coex
armazenada a 6 e 25°C, entretanto o conteúdo de água da formulação
acondicionada nas embalagens de polietileno e poliéster foram significativamente
maiores a 25 °C (Tabela 11).
76
Tabela 11. Média e erro padrão (± EP) do conteúdo de água (UBS) de uma
formulação granulada com conídios de Beauveria bassiana acondicionada em três
tipos de embalagens armazenadas em refrigerador (6 ± 2 °C) e em câmara
climatizada (25 ± 1 °C) durante 30 dias.
Temperatura ( °C)
6
Embalagens
25
UBS %
Coex
12,1 ± 0,16 A*
12,3 ± 0,20 A
Poliéster Metalizado
12,2 ± 0,14 B
14,0 ± 1,16 A
Polietileno
11,5 ± 0,56 B
14,7 ± 0,77 A
CV
5,06
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
Aos 60 dias de armazenamento não ocorreu diferença significativa
no conteúdo de água da formulação na embalagem coex e poliéster entre o
refrigerador e a temperatura ambiente (B.O.D) (Tabela 12). Aos 90 dias de
armazenamento (Tabela 13) o conteúdo de água na temperatura ambiente foi
significativamente maior nas embalagens de polietileno e poliéster, não sendo
observada diferença no conteúdo de água da formulação entre as duas
temperaturas na embalagem Coex.
77
Tabela 12. Média e erro padrão (± EP) do conteúdo de água (UBS) de uma
formulação granulada com conídios de Beauveria bassiana acondicionada em três
tipos de embalagens armazenadas em refrigerador (6 ± 2 °C) e em câmara
climatizada (25 ± 1 °C) durante 60 dias.
Temperatura ( °C)
Embalagens
6
25
UBS %
Coex
12,5 ± 0,30 A*
12,6 ± 0,16 A
Poliéster Metalizado
13,2 ± 0,18 A
13,2 ± 0,46 A
Polietileno
17,2 ± 0,15 A
12,6 ± 0,03 B
CV
5,06
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
Tabela 13. Média e erro padrão (± EP) do conteúdo de água (UBS) de uma
formulação granulada conídios de Beauveria bassiana acondicionada em três tipos
de embalagens e armazenadas em refrigerador (6 ± 2 °
78
O
conteúdo
de
água
da
formulação
aos
120
dias
foi
significativamente menor quando armazenados em refrigerador do que a
temperatura ambiente (Tabela 14). Aos 150 dias de armazenamento (Tabela 15) não
ocorreu diferença significativa no conteúdo de água dos conídios na embalagem
Coex entre a temperatura ambiente (câmara climatizada 25°C) e a de refrigerador,
entretanto o conteúdo de água formulação armazenada na embalagem de poliéster
metalizado em refrigerador foi significativamente menor do que em câmara
climatizada a 25°C.
Tabela 14. Média e erro padrão (± EP) do conteúdo de água (UBS) de uma
formulação granulada com conídios de Beauveria bassiana acondicionada em três
tipos de embalagens armazenadas em refrigerador (6 ± 2 °C) e em câmara
climatizada (25 ±1 °C) durante 120 dias.
Temperatura ( °C)
Embalagens
6
25
UBS %
Coex
12,9 ± 0,19 B*
14,1 ± 0,64 A
Poliéster Metalizado
13,0 ± 0,10 B
14,2 ± 0,22 A
Polietileno
13,3 ± 0,07 A
______
CV
5,06
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
79
Tabela 15. Média e erro padrão (± EP) do conteúdo de água (UBS) de uma
formulação granulada com conídios de Beauveria bassiana acondicionada em três
tipos de embalagens armazenadas em refrigerador (6 ± 2 °C) e em câmara
climatizada (25 ± 1 °C) durante 150 dias.
Temperatura ( °C)
Embalagens
6
25
UBS %
Coex
13,1 ± 0,27 A*
13,8 ± 0,15 A
Poliéster Metalizado
13,3 ± 0,30 B
14,6 ± 0,38 A
Polietileno
13,4 ± 0,08 A
______
CV
5,06
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
Aos 180 dias de armazenamento (Tabela 16) não ocorreu diferença
significativa no conteúdo de água da formulação acondicionada na embalagem Coex
entre a temperatura ambiente (câmara climatizada 25°C) e a de refrigerador.
Nenhuma das embalagens conseguiu manter o conteúdo de água
inicial dos conídios de 11, 2% durante os 180 dias de armazenamento.
80
Tabela 16. Média e erro padrão (± EP) do conteúdo de água (UBS) de uma
formulação granulada com conídios de Beauveria bassiana acondicionada em três
tipos de embalagens e armazenada em refrigerador (6 ± 2 °C) e em câmara
climatizada (25 ±1 °C) durante 180 dias.
Temperatura ( °C)
Embalagens
6
25
UBS %
Coex
12,7 ± 0,06 A*
13,6 ± 0,14 A
Poliéster Metalizado
13,5 ± 0,32 A
______
Polietileno
13,7 ± 0,26 A
______
CV
5,06
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.
Com o resultado da análise de regressão pode-se observar que na
embalagem Coex em refrigerador (Figura 7), ocorreu aumento no conteúdo de água
da formulação até os 120 dias, já a 25°C este aumento foi observado até os 150 dias
de armazenamento havendo queda novamente, sendo que os menores conteúdos
de água foram observados nesta temperatura. Na embalagem de poliéster em
refrigerador (Figura 8), o maior conteúdo de água da formulação foi observado aos
180 dias de armazenamento e na embalagem de polietileno a 25°C (Figura 9), o
gráfico mostrou que ocorreu uma queda no conteúdo de água dos 30 aos 60 dias
aumentando de novo até os 90 dias de armazenamento.
UBS
81
y = -1E-04x 2 + 0.0254x + 11.411
R2 = 0.9498
14.5
14
13.5
13
12.5
12
11.5
y = -0.0001x 2 + 0.0362x + 11.131
R2 = 0.8767
0
30
60
90
120
150
180
Dias de Armazenamento
Coex 5-8C
Coex 25C
Fig. 7. Conteúdo de água (UBS) de uma formulação granulada com conídios de
B. bassiana acondicionada em três embalagens tipo Coex durante 180 dias.
14
y = 0.0077x + 12.266
R2 = 0.7433
UBS
13.5
13
12.5
12
0
30
60
90
120
150
180
Dias de Armazenamento
Poliéster 5-8C
Fig. 8. Conteúdo de água (UBS) de uma formulação granulada com conídios B.
bassiana acondicionada em embalagens de Poliéster metalizado durante 180 dias.
82
20
UBS
15
10
y = 0.0036x 2 - 0.395x + 23.24
R2 = 1
5
0
0
30
60
90
Dias de Armazenamento
Polietileno 25C
Fig. 9. Conteúdo de água (UBS) de uma formulação granulada com conídios de B.
bassiana acondicionada em embalagens de Polietileno durante 180 dias.
A análise da correlação pelo coeficiente de Pearson mostrou que
existe correlação significativa negativa entre conteúdo de água da formulação e a
porcentagem de germinação dos conídios de B. bassiana (r= -0,4974; p= 0,0038),
durante o armazenamento, sendo assim, além do conteúdo de água com o qual a
formulação com fungos entomopatogênicos é armazenada influenciar negativamente
na viabilidade dos conídios, (Hedgecock et al., 1995;) o ganho de água durante o
armazenamento também pode interferir negativamente na viabilidade.
O tipo de embalagem em que se acondiciona uma formulação
granulada com conídios de B. bassiana pode interferir no tempo de armazenamento.
Neste estudo não foi possível verificar se a embalagem que manteve
os conídios viáveis por mais tempo foi também a que manteve o conteúdo de água
da formulação baixo, pois em todas as embalagens testadas ocorreram variações no
conteúdo de água da formulação durante todo o período de armazenamento.
83
4.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Sorok. and Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. in trays. Ecossistema, v. 14, p. 188192. 1989.
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Chemists, Washington DC. 1995.
HEDGECOCK, S.; MOORE, D.; HIGGINS, P. M.; PRIOR, C. Influence of moisture
content on tolerance and storage of Metarhizium flavoviride conidia in an oil
formulation. Biocontrol Science and Technology, v. 5, p. 371-377.1995.
HONG, T. D.; ELLIS, R. H.; MOORE, D. Development of a model to predict the effect
of temperature and moisture on fungal spore longevity. Annals of Botany, v. 79, p.
121-128. 1997.
JENKIS, N. E.; GRZYWACZ, D. Quality control of fungal and viral biocontrol agentsAssurance of products performance. Biocontrol Science and Technology, v. 10, p.
753-777. 2000.
MCCLATCHIE, G. V.; MOORE, D.; BATEMAN, R. P.; PRIOR, C. Effects of
temperature on the viability of the conidia of Metarhizium flavoviride in oil
formulations. Mycological Research, v. 98, p. 749-756. 1994.
84
MARQUES, J. E.; ALVES, S. B.; MARQUES, R. M. I. Effects of the temperature and
storage on formulations with mycelia of Beauveria bassiana (Bals.) Vuill and
Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. Brazilian Archivies of Biology and
Technology, v. 42, p. 153-160. 1999.
MOORE, D.; DOURO-KPINDOU, O. K.; JENKINS, N. E.; LOMER, C. J. Effects of
moisture content and temperature on storage of Metarhizium flavoviride conidia.
Biocontrol Science and Technology, v. 6, p. 51-61. 1996.
PEREIRA, M. R.; ROBERTS, W. D. Alginate and cornstarch mycelial formulations of
entomopathogenic fungi, Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal
of Economical Entomology, v. 84, p.1657-1661. 1991.
SANYANG, S.; VAN EMDEN, H. F.; MOORE, D. Laboratory shelf-life of oilformulated conidia of the locust and grasshopper fungal pathogen Metarhizium
flavoviride Gams & Rozsypal, in mixtures with the pyretroid insecticide lambdacyhalothrin. Journal of Pesticide Management, v. 46, p. 165-168. 2000.
SMITH, S. M.; MOORE, D.; KARANJA, L. W.; CHANDI, E. A. Formulation of
vegetable fat pellets with pheromone and Beauveria bassiana to control the larger
grain borer, Prostephanus truncatus (Horn). Pesticide Science, v. 55, p. 711-718.
1999.
85
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados desta pesquisa indicam que a formulação de B.
bassiana granulada, isto é,
o fungo
juntamente com seu substrato de
desenvolvimento é a que proporciona melhor armazenamento aos conídios em
temperaturas mais altas, fator interessante já que esse tipo de formulação não
requer alta tecnologia, entretanto a formulação com óleo vegetal, proporciona melhor
estabilidade a baixas temperaturas e maior virulência aos conídios, resultados estes
que já foram observados em outros estudos.
Vale salientar que mais estudos com embalagens para o
acondicionamento de formulações devem ser realizados, principalmente com
diferentes tipos de formulações, uma vez que trabalhos nesta área ainda não estão
disponíveis na literatura especializada e os parâmetros a serem observados não
estão bem definidos.
Além de estudos sobre a estabilidade das formulações a base de
fungos entomopatogênicos durante o armazenamento, muitos problemas ainda
devem ser solucionados com relação a estabilidade das formulações a campo, como
a identificação de agentes que possam minimizar os efeitos dos raios UV e da
chuva, persistindo no ambiente, fitotoxicidade e seletividade dos adjuvantes a outros
agentes de controle biológico, também devem ser estudados.
O
desenvolvimento
de
formulações
que
se
adequem
aos
equipamentos já disponíveis nas propriedades rurais é também de suma
importância, uma vez que a sua utilização não deve encarecer o processo de
produção.
87
6. CONCLUSÕES
•
Os conídios de Beauveria bassiana formulados em óleo vegetal podem ser
armazenados por 180 dias em freezer e em refrigerador sem perder a viabilidade;
•
Os conídios de Beauveria bassiana em formulação granulada podem ser
armazenados em freezer e em refrigerador durante 180 dias e em temperatura
ambiente (25°C) durante 2 meses;
•
A formulação suspensão concentrada foi a mais virulenta a adultos de
Hipothenemus hampei;
•
A embalagem tipo Coex é a melhor embalagem para acondicionamento de uma
formulação granulada contendo conídios de Beauveria bassiana;
•
Conídios de B. bassiana armazenados a baixas temperatura mantém-se viáveis
por mais tempo independente da formulação e da embalagem.