D.M.M. BIODIVERSITY AND EVOLUTION FEVEREIRO 2010 Nº 2 MENSAL C I Ê N C I A No fim das comemorações do bicentenário do nascimento de Charles Darwin e dos 150 anos da publicação da obra “Sobre a Origem das Espécies por Selecção Natural”, entrevistamos a equipa responsável pelo estudo da resistência das bactérias E.coli a antibióticos – “CSI – Coli Sob Investigação”. Financiados pela Ciência Viva, no âmbito do “Desafio bactéria”, este grupo desenvolveu um interessante projecto que ajuda a compreender melhor a selecção natural, descrita primeiramente por Darwin, em 1859, que tem vindo a ser desenvolvida e corroborada por inúmeros investigadores, apresentando‐se actualmente sob a forma de Neo‐Darwinismo ou Teoria Sintética da Evolução. Este projecto serve também de modelo para o estudo do desenvolvimento da resistência das baterias aos antibióticos. apendicite, peritonite e septicémia, sendo esta habitualmente tratada por antibióticos como a ampicilina, aminopenicilina ou estreptomicina. O grupo de investigadores dos conceituados laboratórios da Escola Secundária Dom Manuel Martins, em Setúbal, efectuaram estudos com colónias de E. coli, em meios de cultura sem, e com ampicilina a várias concentrações (10% / 15% / 20% / 25%), com o intuito de verificar o desenvolvimento da resistência das mesmas a um dos mais potentes antibióticos do mercado. A Escherichia coli foi a base de todo o estudo por ter uma elevada taxa de resistência a antibióticos. É uma bactéria bacilar que pode ser encontrada no lúmen intestinal de seres humanos e de outros animais de sangue quente. Destaca‐se por ser um dos poucos organismos vivos capazes de produzir todos os componentes de que é constituída. A E. coli é uma das principais causas dos distúrbios do organismo humano como intoxicação alimentar, Encontrámo‐nos com o grupo, composto por Diana Santana, Joana Andorinha e Sofia Nogueira
e obtivemos uma entrevista exclusiva! O que as levou a estudar este tema? Sempre tivemos um interesse especial pela evolução das espécies. Anteriormente a este projecto trabalhámos num sobre geração espontânea vs evolução e desde que visitamos a exposição “Charles Darwin – Evolução e Biodiversidade”, no Porto, a nossa curiosidade ficou aguçada. Para além disso, obviamente o timing foi perfeito! A Ciência Viva lançou o Desafio Bactéria em comemoração dos 150 anos da publicação de “Sobre a Origem das Espécies por Selecção Natural”. Nunca é demais relembrar o extenso e brilhante trabalho que Charles Darwin desenvolveu. Como se relaciona o “Desafio bactéria” com a teoria Darwinista? Tudo! Neste desafio estamos a estudar a eficácia da selecção natural. Algumas das bactérias são colocadas em meios LB, que promove o crescimento destas, enquanto que outras são colocadas em meios com antibiótico (Ampicilina = factor de resistência). O objectivo era verificar o crescimento de bactérias resistentes ao antibiótico. Em que consistiu a vossa experiência? Não queremos aborrecer‐vos com os pormenores e detalhes ínfimos da experiência mas vamos falar‐vos das partes mais importantes que convêm compreender. Foi feito um riscado para isolar colónias. Ao fazermos o riscado as bactérias vão ficando separadas criando colónias isoladas. Isto é feito para que todas as bactérias resultem apenas de uma, o que as torna geneticamente iguais (faz delas clones). Foi a partir de uma dessas colónias que fizemos a cultura mãe. Todo o procedimento foi feito em assépcia. Após isolamento de uma colónia e seu crescimento em meio LB, 24h a 37ºC procedemos às inoculações com 4 diluições 1:10 para uma caixa de Petri com meio LB e ampicilina, onde não obtivemos qualquer crescimento de bactérias. Da mesma cultura mãe fizemos meios de cultura líquidos A (meio LB) e B (meio LB + ampicilina). 24h volvidas verificámos que houve crescimento bacteriano apenas nas caixas de Petri sem antibiótico com o meio de cultura A. Já no meio de cultura B eram esperadas algumas bactérias na caixa de Petri com ampicilina, mas, infelizmente isso não aconteceu. Na caixa de Petri sem ampicilina houve proliferação de bactérias em número inferioro ao A. Como não foram obtidos os resultados esperados (resistentes) deixamos decorrer mais 24h e verificamos crescimento nas caixas com ampicilina a 10 e 15mg/mL, sendo que na caixa com a concentração a 10mg/mL se observava um maior número de bactérias. Ainda assim estas bactérias que sobreviveram não podem ser consideradas verdadeiras resistentes pois apenas resistem a baixas concentrações de antibiótico e ao estarem em contacto com o antibiótico perdem a capacidade de se multiplicarem. Porque utilizaram ampicilina em vez de qualquer outro antibiótico? A ampicilina foi escolhida por estar entre a lista de antibióticos mais utilizados no combate a distúrbios causados pela E. coli, e por ser um dos mais eficientes. Como tal, decidimos testar os efeitos deste fármaco nas bactérias, tentado perceber os efeitos posteriores no organismo humano. Os resultados dizem‐nos que uma exposição regular desta à ampicilina faz com que estas fiquem “habituadas” ao contacto com o mesmo antibiótico, originando bactérias resistentes. Esta “habituação ” resulta da acumulação de mutações no código genético das bactérias que origina variabilidade genética e possibilita o processo da selecção natural, que consiste na sobrevivência do mais forte. Neste caso as bactérias capazes de resistir multiplicam‐se e formam colónia de clones com a mesma capacidade. Esta situação aplica‐se fora do laboratório devido à toma negligente de antibióticos, uma vez que é cada vez mais usual entre os doentes não tomar os antibióticos até ao fim, criam‐se bactérias resistentes que podem, mais tarde, não responder ao antibiótico tomado inicialmente, o que leva á necessidade da toma de um mais efectivo. Este tipo de comportamento irresponsável leva à necessidade de criar antibióticos mais fortes, no entanto em último caso na falta de um antibiótico eficaz, desenvolve‐se uma infecção generalizada que leva à morte do indivíduo (septicémia). Consta que enfrentaram algumas dificuldades … É verdade, foi complicado crescerem bactérias resistentes. Mas claro que não desanimámos. Os anos de experiência dizem‐nos que há sempre algo que não corre como planeado, como a ausência de crescimento de bactérias no meio com ampicilina mesmo após a repetição do procedimento. No meio incubado sem ampicilina houve crescimento de bactérias, o que revela sobrevivência, no entanto, a ausência de crescimento no meio com ampicilina demonstra a não resistência. Melhoramos a experiência aumentando o tempo de incubação da cultura B com ampicilina por mais 24h, e assim sim fomos capazes de obter resultados. Experiência retirada da participação no Desafio? As investigadoras revelam: “Fomos iluminadas pela sabedoria de Darwin! As E.coli não têm mais segredos perante a Ciência” Com a realização deste desafio tivemos a oportunidade de manusear novos equipamentos de laboratório! Também foi bom pelo convívio, e porque se revelou oportuno para relembrarmos os conhecimentos que adquiridos anteriormente. Mas talvez a lição mais importante que retiramos da nossa participação reverte para a tecnologia utilizada, aprendemos que não se deve utilizar uma máquina fotográfica ou de filmar sem primeiro verificar que temos material para a conectar com um computador, e quando este é o caso que não existem problemas de software que impeçam a passagem do material gravado na máquina. E neste último parágrafo, fizeram‐no como Charles Darwin a propósito da sua teoria da evolução: “Foi como confessar um crime”