Parte III:
CULTURA DE CÉLULAS
1.CULTURA DE CÉLULAS
a)Objectivo
_0
9
b)Tipo de Culturas Celulares
Q
SC
c)Passagem das Células
IC
A
2.COLECÇÃO DE CÉLULAS
C
LÍN
a)ECACC
c)NIH
3.MEIOS DE CULTURA
A
C
4.Como escolher um meio
VI
RO
LG
O
IA
b)ATCC
II
M
5.Constituintes básicos do meio de cultura
6.DESCONGELAÇÃO: COMO INICIAR UMA CULTURA
7.TRIPSINIZAÇÃO
8.CONTAGEM DE CÉLULAS
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
9
_0
SC
Q
A
IC
C
LÍN
IA
O
VI
RO
LG
C
A
M
II
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
CULTURA DE CÉLULAS
A
Q
SC
_0
9
Objectivo:
Isolamento viral a partir de material biológico adequado
Propagação in vitro de vírus já isolados
C
LÍN
IC
Condições:
II
M
A
C
VI
RO
LG
O
IA
Esterilidade
Frascos de cultura em plástico ou vidro tratados
Meios de cultura*
Estufa de CO2
Microscópio invertido
Hote de fluxo laminar vertical
*Meios de cultura: satisfação das exigências nutricionais das
células
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
TIPOS DE CULTURAS CELULARES
A
Q
SC
_0
9
Modo de propagação:
1.
Suspensão
2.
Monocamada
3.
C
LÍN
IA
O
2.
Primárias
Secundárias
Contínuas
2.
3.
M
A
Epiteliais
Fibroblásticas
Outras (células sanguíneas, nervosas, musculares)
II
1.
C
Morfologia das células:
VI
RO
LG
1.
IC
Natureza das células:
TIPOS DE CULTURAS CELULARES
_0
9
Modo de propagação:
Q
SC
Suspensão: as células crescem sem estarem
aderentes entre si ou ao suporte sólido (paredes
interiores do frasco de cultura ou outro recipiente onde
estejam a ser cultivadas)
M
A
C
Monocamada: crescem aderindo ao suporte sólido e
entre si. Estas células necessitam, para serem
transferidas para outro suporte sólido, de serem
dissociadas entre si e do suporte sólido onde se
fixaram (métodos enzimáticos e/físicos).
II
2.
VI
RO
LG
O
IA
C
LÍN
IC
A
1.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
TIPOS DE CULTURAS CELULARES
Natureza das células
C
LÍN
IC
A
Q
SC
_0
9
Células primárias:
resultam directamente de um órgão ou tecido animal;
têm uma vida limitada.
C
VI
RO
LG
O
IA
Células secundárias:
Derivam de subculturas das células primárias;
Podem atingir as 50 passagens ou subculturas.
II
M
A
Células contínuas:
Derivam de tecidos cancerosos ou de células primárias
e secundárias que sofreram transformação;
Têm a capacidade de se multiplicarem ilimitadamente,
sem inibição de contacto e com grande rapidez.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
TIPOS DE CULTURAS CELULARES
A
Q
SC
_0
9
Modo de propagação:
1.
Suspensão
2.
Monocamada
3.
C
LÍN
IA
O
2.
Primárias
Secundárias
Contínuas
2.
3.
M
A
Epiteliais
Fibroblásticas
Outras (células sanguíneas, nervosas, musculares)
II
1.
C
Morfologia das células:
VI
RO
LG
1.
IC
Natureza das células:
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
COLECÇÃO DE CÉLULAS
SC
_0
9
Será possível introduzir, propagar, consolidar e disseminar erros durante a
manipulação numa linha celular?
Sim, repare-se que, muitos contaminantes são invisíveis ao olho nu (micoplasma ou
vírus que não induzem efeito citopático), ou seja existem contaminações inaparentes!
VI
RO
LG
O
IA
C
LÍN
IC
A
Q
Sistematizam as técnicas de cultura
Crioconservação em Azoto Líquido
Técnicos permanentes e especializados
Controlo de Qualidade para contaminações microbianas, nomeadamente o
Micoplasma
Garantem a identidade e a pureza da linha celular
Recomendações
II
M
A
C
características a linha celular
como manter a linha celular
como lidar com dificuldades
qual o meio de cultura apropriado
qual o material necessário
quais as condições de incubação, etc.
formulários de encomenda
quem pode depositar
como pode depositar
etc.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
AS “MEGASTORES”
European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC),
HLS Centre for Applied Microbiology and Research,
Porton Down, Salisbury SP4 OJG, UK.
Telephone (44) 980610391; fax (44) 980 611315.
Q
SC
_0
9
“Description of holdings: 1200 cell lines and hybridomas, 250 HLA-defined cell lines,
and approximately 7000 human genetic and chromosome abnormality cell lines (2000
stored as untransformed lymphocytes).”
C
LÍN
IC
A
American Type Culture Collection (A TCC),
12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA.
Telephone (301) 991 2600; fax (301) 231 5826.
M
A
C
National Institute of Health (NIH)
About us….
VI
RO
LG
O
IA
“The A TCC has a large and comprehensive stock of material built up over
a considerable period of time. A certain number of deposits carry 'certified
cell line' status and extensive testing programmes have been carried out
on this material. The whole of the collection comprises over 3200 cell lines
and hybridomas from approximately 75 different species.”
II
“The NIH AIDS Reagent Program evolved from a small bank of HIV research materials into a
unique worldwide resource of state-of-the art reagents for HIV and other pathogens.
Many of these reagents are not commercially available.
The first Catalog, published in 1988, listed 62 reagents from 20 contributors. Reagents are
shipped to scientists all over the world.
The value of the NIH AIDS Reagent Program is evident from the diversity of registered users;
as of June 2003, scientists from the US and 65 foreign countries registered to receive reagents.
During the past year over 14,000 reagents were provided.
US scientists obtaining AIDS reagents from the program work primarily in academ-ic settings.”
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
COLECÇÃO DE CÉLULAS DE CULTURA CELULAR
II
M
A
C
VI
RO
LG
O
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C
LÍN
IC
A
Q
SC
_0
9
EPITELIAL: 293T
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
_0
II
M
A
C
VI
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LG
O
IA
C
LÍN
IC
A
Q
SC
EPITELIAL/FIBROBLÁSTICA: GHOST (derivadas
das Hos=osteosarcoma humano)
9
COLECÇÃO DE CÉLULAS DE CULTURA CELULAR
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
COLECÇÃO DE CÉLULAS DE CULTURA CELULAR
II
M
A
C
VI
RO
LG
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IA
C
LÍN
IC
A
Q
SC
_0
9
FIBROBLÁSTICA:Vero; Fibroblastos de Salmão, MRC-5
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
COLECÇÃO DE CÉLULAS DE CULTURA CELULAR
II
M
A
C
VI
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C
LÍN
IC
A
Q
SC
_0
9
LINFOCÍTICA:Linfócitos humanos mortos…
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
COLECÇÃO DE CÉLULAS DE CULTURA CELULAR
A
C
VI
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IA
C
LÍN
IC
A
Q
SC
_0
9
SUSPENSÃO: J774
II
M
LINFOBLASTÓIDE PROMONOCÍTICA: U937
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
MEIOS DE CULTURA
C
LÍN
IC
A
Q
SC
_0
9
De um modo geral as células requerem um ambiente estéril,
componentes nutricionais, pH e temperatura estáveis.
Hoje em dia já existem várias formulações de meios de cultura
disponíveis, de acordo com o tipo de cultura com que se está a trabalhar.
II
M
A
C
VI
RO
LG
O
IA
Exemplos:
• BME (basal medium Eagle´s)
• EMEM (minimum essencial medium with Earl´s salts)
• DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium, meio sintético
complexo)
• RPMI 1640 (criado pelo Roswell Park Memorial Institute, meio
sintético complexo)
• CMRL (basal médium designed for serum-free formulations)
• D-22 (basal medium for insect cell culture)
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
COMO ESCOLHER UM MEIO?
C
LÍN
IC
A
Q
SC
_0
9
a. Tipo de células
i.
Aderentes (Vero)
ii.
Suspensão (Ly Humanos)
iii.
Tipo de densidade celular
(baixa, para clonagens: 293T, meio com HEPES)
(elevada: bio-reactores com densidades na ordem do s108células/mL)
VI
RO
LG
O
IA
b. Sistemas estáticos
São os sistemas clássicos de cultura em frasco deitado ou na vertical, em
laboratório de baixa ou média produtividade.
II
M
A
C
c. Sistemas dinâmicos ou perfusão contínua (sistema aberto)
O meio terá que ter à partida todos os nutrientes necessários para a duração
da cultura, nomeadamente em termos de fontes de energia, mas tendo em
conta que a degradação destes aumenta os níveis de toxicidade. Portanto
podem ser introduzidos controladamente no meio.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
CONSTITUINTES BÁSICOS DO MEIO?
_0
SC
Sais inorgânicos (oligoelementos)
Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-, HCO3Mantêm o potencial de membrana
São co-factores nas reacções ezimáticas intracelulares
Factores de adesão (tripsinização)
Q
b.
•
•
•
•
9
a. Água
C
LÍN
IC
A
c. sistemas tampão
O meio de cultura necessita de sistemas tampão para compensar a evolução do CO2, libertado pelas células e da
produção de ácido láctico, resultante do metabolismo da glucose.
VI
RO
LG
O
IA
Explos (não tóxicos, com pKa=6,1):
• Bicarbonato
• Fosfato
A conjugação da concentração de bicarbonato e a tensão de CO2 promove a osmolaridade e pH correctos.
II
M
A
C
d. hidratos de carbono
• Glucose
• Maltose
• Sacarose
• Frutose
• Galactose
A glucose é o hidrato de carbono mais usado como fonte de energia do meio.
e. Indicadores de pH
• Vermelho de fenol (2mg/L)
Qualquer que seja o meio requer a presença de um indicador de pH, que nos chamará mais facilmente à atenção
para as alterações que possam ocorrer devidas ao metabolismo das células.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
CONSTITUINTES BÁSICOS DO MEIO?
O
M
A
C
h. lípidos (ácidos gordos)
• Colesterol
• Ácido linolénico e linoleico
• Ácido palmítico, etc.
É um dos componentes fornecido pelo soro.
II
_0
SC
Q
IC
A
SUPLEMENTOS
i.
Hormonas
ii.
Soro
iii.
Proteínas
e
péptidos para meios sem
soro (alfa-globulina,
fibronectina, albumina e
transferrina)
iv.
Antibióticos e
Antifúngicos
•
Gentamicina (50ug/
mL)
•
Penicilina (100UI)/
mL / Estreptomicina (50ug/
mL)
•
Anfotericina B
(fungisona)
Mantêm a esterilidade do meio, mas numa escala
industrial estão ausentes.
Não podem ser citotóxicos
Têm que ser de largo espectro, e induzir o mínimo de
resistências
Atenção à relação custo/benefício.
IA
Aminoácidos essenciais
Arginina
Cisteína
Prolina
L-Glutamina, etc.
VI
RO
LG
g.
•
•
•
•
i.
C
LÍN
vitaminas
• Ácido para-amino benzóico
• Biotina
• Ácido fólico
• Ácido nicotínico
• Riboflavina
• Tiamina
• Inositol
• Vit. B12
• Vit. E
• Vit. A
São intervenientes em numerosos processos metabólicos.
9
f.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
MEIOS COM SORO, PORQUÊ?
II
M
A
C
VI
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LG
O
IA
C
LÍN
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A
Q
SC
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9
Em 1950 o primeiro meio com soro teve um sucesso imenso, porque este aditivo fornecia elementos
essenciais, mas desconhecidos, ao meio, e de uma forma empírica:
• Factores de Crescimento (estimulam e aceleram o crescimento e diferenciação celular;
previnem os processos de Apoptose)
o EGF, IL-6, PDGF, Insulina
• Albumina
o liga-se aos iões tóxicos, funcionando como agente desintoxicante;
o é um “carrier” de Vit. lipossolúveis e esteróides
o é um factores de protecção contra os choques físicos das pipetagens, etc.
• Factores de Adesão celular
o Fibronectina
o Laminina
o Fetuína
• Transportador do ião Fe+++. O complexo Transf/Fe+++ é fundamental nos receptores
celulares.
o Transferrina
• Antiproteases (previne a degradação proteolítica das células e do próprio meio)
o Alfa1-antitripsina (tripsinização)
Alfa2-macroglobulina
TIPOS DE SORO
FCS (soro bovino fetal)
NCS (soro de recém-nascido de vitela), com altos teores de biotina.
Várias espécies animais e de animais de diferentes idades.
Os soros de animais adultos não são tão eficientes, porque não são tão ricos.
São obtidos no matadouro, por punção cardíaca asséptica, ou por animais “dadores”.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
MEIOS SEM SORO
C
VI
RO
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O
IA
C
LÍN
IC
A
Q
SC
_0
9
Sempre que possível seria desejável que não se usasse soro nos
meios de cultura:
 É um componente empírico e com elementos não
quantificados (albumina);
 Não pode ser usado no fabrico de produtos biofarmacêuticos;
 Não pode ser usado em técnicas que requerem um meio
sintético de composição bem definida e conhecida,
nomadamente em estudos de factores de crescimento,
citocinas, moléculas de adesão, etc.;
 Pode transportar vírus ou factores de inibição.
II
M
A
O meio sem soro:
É reprodutível;
Não tem factores desconhecidos.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
TÉCNICA DE DESCONGELAÇÃO:
COMO INICIAR UMA CULTURA
Q
SC
_0
9
Processo rápido
Libertar do DMSO que é tóxico.
Lançar as células em cultura
(Controlo de qualidade do processo de CONGELAÇÃO: Descongelar uma ampola
criopreservada com 24h, para que se veja se a congelação foi eficiente e se as células têm
boa viabilidade).
C
LÍN
IC
A
I. A partir de Frascos de Cultura, transportados à T. A.
VI
RO
LG
O
IA
O frasco de Cultura vem com o volume completo até ao máximo, de modo
a evitar entradas de ar o contaminações. Assim que chega ao laboratório,
as células devem ser passadas de imediato, para evitar o prolongamento
do sofrimento de ausência de temperatura ideal e % de CO2.
II
M
A
C
1. Transferir a suspensão ou fazer uma desagregação por
enzimática (tripsinização), química (EDTA) ou mecânica
(cell-scrapper) para tubo(s) estéril de 50mL
2. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos a 4ºC
3. Rejeitar o sobrenadante por decantação.
4. Ressuspender as células na quantidade de volume de
Meio de Cultura adequado.
5. Transferir para frasco de cultura de cultura adequado
6. Examinar ao MO invertido
Incubar em estufa 37ºC, 5%CO2.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
TÉCNICA DE DESCONGELAÇÃO:
COMO INICIAR UMA CULTURA
A partir de Criotubos, transportados em Gelo Seco (-20-30ºC)
9
II.
SC
_0
Material:
II
M
A
C
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C
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IC
A
Q
Material técnico protector (luvas, bata, protector dos sapatos, óculos ou viseira)
Câmara de fluxo estabilizada
Estufa CO2
Banho a 37ºC
Frasco de cultura T25 identificado com: Nome do técnico; data;
nº de passagem tipo de cultura
Marcador
Falcon50mL
Pipetas graduadas
Pipetador automático
Suporte com gelo
1 Criotubo com células J774 Suspensão
40mL Meio RPMI 1640 N, pré-aquecido
1 Criotubo com células aderentes
40mL Meio DMEM N, pré-aquecido
Centríuga JOUAN
Álcool 70º
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
_0
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PASSAGEM DE CÉLULAS
IC
A
Q
SC
Passagem das células ou subcultura:
II
M
A
C
VI
RO
LG
O
IA
C
LÍN
Consiste na dissociação, por acção
enzimática (tripsina) ou física (raspadores),
de uma cultura celular e utilização das
células daí resultantes para estabelecer uma
nova cultura.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
TRIPSINIZAÇÃO
SC
_0
9
Objectivo:
Libertar as células do suporte sólido (parede do frasco de
cultura) e dissociar as células entre si.
II
M
A
C
VI
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LG
O
IA
C
LÍN
IC
A
Q
Material:
frascos de cultura
Tripsina-EDTA
PBS sem Ca2+ nem Mg2+
Meio Dulbecco’s DMEM completo:
•1mM L-Glutamina
•1mM piruvato de sódio
•1mM A.A. não essenciais
•10% (v/v) soro bovino fetal
•2,5 µg/ml fungizona
•50 µg/ml gentamicina
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
TRIPSINIZAÇÃO
II
M
A
C
VI
RO
LG
O
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C
LÍN
IC
A
Q
SC
_0
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Técnica adaptada à aula prática de Virologia:
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
CONTAGEM DE CÉLULAS
EM
HEMATÍMETRO DE NEUBAUER
_0
9
1m
SC
Q
A
1m
N (1+2+3+4)
X
4
0,1 µL
1000 µL
3
II
M
A
C
VI
RO
LG
O
IA
C
LÍN
2
IC
1
Altura= 0,1 mm
Área= 1mm*1mm=1mm2
Volume= 0,1mm3
4
Diluição com Azul de Tripan
1/10 (90 µL + 10 µL)
N/4 * 105 células / ml
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
BIBLIOGRAFIA
_0
9
http://www.aidsreagent.org/
A
Q
SC
http://www.atcc.org/
C
LÍN
IC
http://www.cdc.gov/
O
IA
http://www.ecacc.org.uk/
VI
RO
LG
http://www.invitrogen.com/
M
A
C
http://www.nuncbrand.com/
II
http://www.sigmaaldrich.com/
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL