UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ - UNOCHAPECÓ
Área: CIÊNCIAS EXATAS E AMBIENTAIS
Curso: ENGENHARIA QUÍMICA
Componente Curricular: MICROBIOLOGIA BÁSICA
Turma: A e B
Período: 4º
Professor(a): RAQUEL ZENI TERNUS
Ano/Semestre: 2013/2
OBS: As informações de preparo de amostra e diluição são as mesmas para as técnicas de contagem para
psicrotróficos, mesófilos e termófilos, e para contagem de bolores e leveduras.
CONTAGEM PADRÃO DE MICRO-ORGANISMOS PSICROTRÓFICOS
1. PREPARO DA AMOSTRA
- Antes de iniciar o preparo da amostra, identificar o material que será utilizado na aula prática.
- Antes de abrir a embalagem, deve-se fazer a limpeza de sua área externa, com algodão e álcool 70%. Este procedimento tem
a finalidade de remover os contaminantes presentes.
- Pesar 25 gramas ou medir 25 mL da amostra (unidade analítica) em saco de homogeneização - Stomacher.
2. DILUIÇÃO
- Acrescentar ao saco de homogeneização Stomacher com amostra, 225 mL de água peptonada 0,1% estéril e homogeneizar
por 1 a 2 minutos.
-1
- Essa diluição é feita na proporção 1:10 (10 ).
- A partir do homogeneizado, preparar as diluições desejadas.
-2
-1
- Para preparação da segunda diluição (10 ), transferir assepticamente 1,0 mL da diluição (10 ) previamente homogeneizada
para um outro tubo com 9,0 mL de água peptonada 1% estéril (diluente).
- As diluições subseqüentes são obtidas são obtidas de maneira similar, transferindo assepticamente 1,0 mL da diluição
anterior previamente homogeneizada para um outro tubo com 9,0 mL de água peptonada 1% estéril (diluente).
- O intervalo entre a agitação e a retirada da porção de amostra para análise não deve ser superior a 3 minutos.
- O intervalo entre o início da análise (preparo da primeira diluição), e o término da análise não deve ultrapassar 20 minutos.
3. INOCULAÇÃO DA AMOSTRA
- Agitar o tubo que contém a amostra diluída;
- Abrir e flambar a boca do tubo;
- Pipetar assepticamente porções de 0,1 mL das diluições selecionadas transferindo para as placas de Petri devidamente
identificadas com Ágar Para Contagem (PCA).
- Distribuir uniformemente a amostra pela placa, com auxílio de alça de Drigalski - bastão do tipo “hockey”, até absorção
completa do inoculo.
4. INCUBAÇÃO
- Incubar as placas invertidas a temperatura de 7°C por 10 dias, ou 17ºC por 16 horas seguidas de 7ºC por 3 dias em estufa
bacteriológica.
5. RESULTADO
5.1. Contagem das colônias e cálculo do resultado
Selecionar as placas com 25 a 250 colônias para amostras em geral e 30 a 300 colônias para amostras de água, com o auxílio
de
uma
lupa,
em
um
contador
de
colônias.
Contar apenas as duas placas da diluição que apresentarem contagem entre 25 e 250 colônias.
Fazer a média da diluição.
Calcular o número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por grama ou por mL da amostra multiplicando a média do
número de colônias pelo, inverso da diluição inoculada x volume do inoculo.
UFC/g ou UFC/mL = número de colônias x inverso da diluição x volume do inoculo ou
UFC/g ou UFC/mL = número de colônias ÷ diluição x volume do inoculo
Para expressar o resultado, usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula.
CONTAGEM PADRÃO DE MICRO-ORGANISMOS MESÓFILOS
1. PREPARO DA AMOSTRA
Ver item de preparo de amostra descrito anteriormente.
2. DILUIÇÃO
Ver item de diluição descrito anteriormente.
3. INOCULAÇÃO DA AMOSTRA
- Agitar o tubo que contém a amostra diluída;
- Abrir e flambar a boca do tubo;
- As placas devem estar sobre a superfície da bancada
- Pipetar assepticamente porções de 1 mL das diluições selecionadas transferindo para as placas de Petri devidamente
identificadas.
4. ADIÇÃO DO MEIO DE CULTURA
- Verter nas placas inoculadas, 15 a 20 mL de meio de cultura, Ágar Para Contagem (PCA) previamente fundido e resfriado a
46°C- 48ºC;
- Homogeneizar (misturar) o inóculo com o meio de cultura, movimentando suavemente a placa em movimentos circulares ou
em forma de oito por 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti-horário. Esse procedimento deve ser feito
sobre a superfície da bancada.
- A homogeneização (mistura) do inóculo com o meio de cultura deve ser feita imediatamente após a adição do meio de
cultura, a fim de evitar a solidificação do ágar. A forma de homogeneizar (misturar) deve ser mantida durante toda a análise.
5. INCUBAÇÃO
- Aguardar a completa solidificação do meio de cultura. Então, inverter as placas e incubá-las a temperatura de 35°C – 37°C
por 48 horas em estufa bacteriológica.
6. RESULTADO
6.1. Contagem das colônias e cálculo do resultados
Selecionar as placas com 25 a 250 colônias para amostras em geral e 30 a 300 colônias para amostras de água, com o auxílio
de
uma
lupa,
em
um
contador
de
colônias.
Contar apenas as duas placas da diluição que apresentarem contagem entre 25 e 250 colônias.
Fazer a média da diluição.
Calcular o número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por grama ou por mL da amostra multiplicando a média do
número de colônias pelo, inverso da diluição inoculada x volume do inóculo.
UFC/g ou UFC/mL = número de colônias x inverso da diluição x volume do inóculo ou
UFC/g ou UFC/mL = número de colônias ÷ diluição x volume do inóculo
Para expressar o resultado, usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula.
CONTAGEM PADRÃO DE MICRO-ORGANISMOS TERMÓFILOS
1. PREPARO DA AMOSTRA
Ver item de preparo de amostra descrito anteriormente.
2. DILUIÇÃO
Ver item de diluição descrito anteriormente.
3. INOCULAÇÃO DA AMOSTRA
- Agitar o tubo que contém a amostra diluída;
- Abrir e flambar a boca do tubo;
- Pipetar assepticamente porções de 0,1 mL das diluições selecionadas transferindo para as placas de Petri devidamente
identificadas com Ágar Para Contagem (PCA).
- Distribuir uniformemente a amostra pela placa, com auxílio de alça de Drigalski - bastão do tipo “hockey”, até absorção
completa do inoculo.
4. INCUBAÇÃO
- Aguardar a completa solidificação do meio de cultura. Então, inverter as placas e incubá-las a temperatura de 55°C por 48
horas em estufa bacteriológica.
5. RESULTADO
5.1. Contagem das colônias e cálculo do resultados
Selecionar as placas com 25 a 250 colônias para amostras em geral e 30 a 300 colônias para amostras de água, com o auxílio
de
uma
lupa,
em
um
contador
de
colônias.
Contar apenas as duas placas da diluição que apresentarem contagem entre 25 e 250 colônias.
Fazer a média da diluição.
Calcular o número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por grama ou por mL da amostra multiplicando a média do
número de colônias pelo, inverso da diluição inoculada x volume do inóculo.
UFC/g ou UFC/mL = número de colônias x inverso da diluição x volume do inóculo ou
UFC/g ou UFC/mL = número de colônias ÷ diluição x volume do inóculo
Para expressar o resultado, usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula.
CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS
1. PREPARO DA AMOSTRA
Ver item de preparo de amostra descrito anteriormente.
2. DILUIÇÃO
Ver item de diluição descrito anteriormente.
3. INOCULAÇÃO DA AMOSTRA
- Agitar o tubo que contém a amostra diluída;
- Abrir e flambar a boca do tubo;
- Pipetar assepticamente porções de 0,1 mL das diluições selecionadas transferindo para as Placas de petri devidamente
identificadas com PDA acidificado com ácido tartárico a 10% (estéril); Nos casos em que a legislação exigir valores menores
-1
que 100 UFC/g ou mL, distribuir em duplicata 1 mL da diluição 10 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de
-1
produtos líquidos poderá ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10º), o que corresponderá à diluição 10 .
- Distribuir uniformemente a amostra pela placa, com auxílio de alça de Drigalski bastão do tipo “hockey”, até absorção
completa do inóculo.
4. INCUBAÇÃO
- Incubar, sem inverter, a temperatura de 25 °C por 5 a 7 dias.
- Se a amostra for de leite, 18ºC por 45 horas.
5. RESULTADO
5.1. Contagem das colônias e cálculo do resultados
- Selecionar as placas com 15 a 150 colônias com o auxílio de uma lupa, em um contador de colônias.
- Contar apenas as placas da diluição que apresentarem contagem entre 15 e 150 colônias.
- Fazer a média da diluição.
- Calcular o número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por grama ou por mL da amostra multiplicando a média do
número de colônias pelo, inverso da diluição inoculada
UFC/g ou UFC/mL = número de colônias ÷ diluição x volume do inóculo ou
UFC/g ou UFC/mL = número de colônias x inverso da diluição x volume do inóculo.
Para expressar o resultado, usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula.
OBSERVAÇÃO: Não abrir, em hipótese alguma, as placas que contenham crescimento de fungos, para evitar a contaminação
ambiental por meio da dispersão dos seus esporos.
REFERÊNCIA
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A.. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. 2. ed.
rev. ampl. São Paulo: Varela, 2001. 317 p.