UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Veterinária
Tese
Avaliação da transmissão vertical e horizontal de
Neospora caninum (Long, 1990) em bovinos de
criação extensiva, cronicamente infectados no
Brasil
Nilton Azevedo da Cunha Filho
Pelotas, 2013
NILTON AZEVEDO DA CUNHA FILHO
Avaliação da transmissão vertical e horizontal de Neospora caninum (Long,
1990) em bovinos de criação extensiva, cronicamente infectados no Brasil
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Veterinária da
Universidade Federal de Pelotas,
como requisito parcial à obtenção do
título de Doutor em Ciências (área
do
conhecimento:
Medicina
Veterinária Preventiva).
Orientadora: Profa Dra Nara Amélia da Rosa Farias
Pelotas, 2013
Dados de catalogação na fonte:
Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901
Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
C972a
Cunha Filho, Nilton Azevedo
Avaliação da transmissão vertical e horizontal de
Neospora caninum (Long, 1990) em bovinos de criação
extensiva, cronicamente infectados no Brasil / Nilton
Azevedo Cunha Filho. – 67f. ; il. – Tese (Doutorado).
Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Área de
concentração: Medicina Veterinária preventiva.
Universidade Federal de Pelotas. Faculdade de
Veterinária. Pelotas, 2013. – Orientador Nara Amélia da
Rosa Farias.
1.Veterinária. 2.Transmissão vertical. 3.Bovinos.
4.Neospora caninum. 5.Transmissão horizontal. I.Farias,
Nara Amélia da Rosa. II.Título.
CDD:
636.2
Banca examinadora:
Prof. Dr. Diego Moscarelli Pinto, (UFPEL)
Prof. Dr. Fabio Pereira Leivas Leite, (UFPEL)
Prof. Dr. Jerônimo Lopes Ruas, (UFPEL)
Profª. Drª. Nara Amélia da R. Farias, (UFPEL)
Agradecimentos
Em primeiro lugar gostaria de agradecer a Deus por ter me
proporcionado a vida e a oportunidade de completar esse ciclo muito
importante em minha carreira acadêmica.
A minha orientadora Nara Amélia da Rosa Farias por todos esses anos
de convívio e ensinamentos.
Aos integrantes do Laboratório de Parasitologia pelo auxílio na execução
do trabalho, no qual foram indispensáveis.
Ao professor Doutor Ary Pappen e seu filho Felipe Geraldo Pappen pela
disponibilidade da fazenda e dos animais para a realização desse experimento,
pois sem a sua contribuição nada disso poderia ter sido feito.
A minha mãe, padrasto e irmão pelos incentivos e confiança que
depositaram em mim.
A todos os meus familiares que de uma maneira ou de outra estão
sempre ao meu lado.
A minha esposa (Cíntia) pela ajuda na realização desse estudo, pelo
companheirismo e dedicação ao longo dessa e de muitas outras jornadas.
¨ Agradeço todas as dificuldades que enfrentei.
Não fosse por elas, eu não teria saído do
lugar.
As facilidades nos impedem de caminhar.
Mesmo as críticas nos auxiliam muito. ¨
(Chico Xavier)
Resumo
CUNHA FILHO, Nilton Azevedo. Avaliação da transmissão vertical e
horizontal de Neospora caninum (Long, 1990) em bovinos de criação
extensiva, cronicamente infectados, no Brasil. 2013. 67f. Tese (Doutorado)
- Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de
Pelotas, Pelotas, Brasil.
é causador de grandes perdas econômicas na bovinocultura,
devidas ao aborto. Já foi demonstrado que a transmissão vertical de N. caninum
é a principal rota de infecção entre bovinos, seguida pela transmissão
horizontal. Poucos estudos demonstram qual o resultado desse tipo de
transmissão em rebanho criado a campo. O experimento 1 teve o objetivo de
avaliar a ocorrência de transmissão vertical de N. caninum em matrizes de
criação extensiva de gado de corte e verificar a relação entre soropositividade e
aborto. Foi coletado sangue das matrizes no período pré-gestacional e, após,
em mais três momentos do período gestacional, além de uma coleta de seus
bezerros ao nascer. A soroprevalência nas matrizes, constatada na triagem foi
de 32,2% (29/90). O índice de transmissão vertical foi de 75,8% e todas as
matrizes avaliadas levaram a gestação a termo, demonstrando que N. caninum
está presente na propriedade estudada, com índices elevados de transmissão
vertical, porém sem influência aparente no desempenho reprodutivo das
matrizes. O experimento 2 objetivou demonstrar a importância da transmissão
horizontal na manutenção de N. caninum nesse mesmo rebanho. Foram
acompanhadas, através de exames sorológicos, 61 matrizes soronegativas
durante os terços gestacionais e seus bezerros ao nascer (n=61) e durante o
primeiro ano de vida (n=24). Não ocorreu soroconversão em nenhuma das
matrizes. Nos bezerros, no entanto, ocorreu essa soroconversão, indicativa de
infecção horizontal por N. caninum, em 12,5%, ao final dos 12 meses. Isso indica
a interferência da transmissão horizontal nesse rebanho. O experimento 3
teve o objetivo de detectar a presença do DNA de N. caninum em cordão
umbilical de bezerros soropositivos filhos de matrizes soropositivas. Coletou-se
o cordão umbilical de 20 bezerros no momento do nascimento para os testes
laboratoriais pela técnica de PCR. O DNA do parasito foi confirmado em 1/20
(5,0%) dos cordões umbilicais. Este é o primeiro relato da detecção de DNA de
N. caninum em cordão umbilical de bezerros pela técnica de PCR.
Neospora caninum
Palavras-chave: Transmissão vertical. Bovinos. Neospora caninum. Transmissão
horizontal.
Abstract
CUNHA FILHO, Nilton Azevedo. Avaliação da transmissão vertical e
horizontal de Neospora caninum (Long, 1990) em bovinos de criação
extensiva, cronicamente infectados, no Brasil. 2013. 67f. Tese (Doutorado)
- Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de
Pelotas, Pelotas, Brasil.
is causing great economic losses in cattle, due to abortion. It
has been shown that the transmission of N. caninum is the primary route of
infection in cattle, followed by horizontal transmission. Few studies demonstrate
the outcome of this type of transmission in herd raised in pasture cattle. The
first experiment aimed to evaluate the occurrence of vertical transmission of N.
caninum in beef cattle and verify the relationship between seropositivity and
abortion. Blood was collected from mothers in the pre-pregnancy and after,
three more times in the gestation period, plus a sampling of calves at birth. The
seroprevalence in the arrays found in the screening was 32.2% (29/90). The
vertical transmission rate was 75.8% and all dams evaluated completed
pregnancy, demonstrating that N. caninum is present on the property studied, with
high transmission rates, but no apparent influence on the reproductive
performance of dams. The second experiment aimed to demonstrate the
importance of horizontal transmission in maintaining N. caninum in the same
herd. Were accompanied by serological tests, 61 seronegative mothers during
pregnancy thirds and their calves at birth (n = 61) and during the first year of life
(n = 24). No seroconversion occurred in any of the dams. In calves, however,
that seroconversion occurred, indicative of horizontal infection by N. caninum,
12.5% at the end of 12 months. This indicates that horizontal transmission
interference occurred in this herd. The third experiment aimed to detect the
presence of DNA of N. caninum in umbilical cord of calves positive of positive
dams. Was collected the umbilical cord of 20 calves at birth for laboratory
testing by PCR. The DNA of the parasite was confirmed by 1/20 (5.0%)
umbilical cords. This is the first report of the detection of DNA from N. caninum in
umbilical cord of calves by PCR.
Neospora caninum
Keywords: Vertical
transmission.
transmission.
Cattle.
Neospora
caninum.
Horizontal
Lista de Figuras
ARTIGO 3
Primeira identificação de Neospora caninum por PCR
em cordão umbilical de bezerros de criação extensiva
de gado de corte no Brasil
Figura 1
Gel de agarose com produtos de PCR para Neospora
caninum de cordões umbilicais de bezerros nascidos de
matrizes soropositivas, utilizando iniciadores Np6 e Np21,
que produzem bandas aos 327 pares de base: Marcador
de pares de base (1); bezerros negativos (2-4 e 6-8);
bezerro positivo (5); controle negativo (9) e controle
positivo (10)..........................................................................
Figura 2
57
Bezerra com opacidade córnea, PCR positiva para N.
caninum, filha de matriz soropositiva com altos títulos de
anticorpos no último terço gestacional em propriedade de
criação extensiva de gado de corte do extremo sul do
Brasil.....................................................................................
57
Lista de Tabelas
ARTIGO 1
Estudo da transmissão vertical de Neospora caninum
em bovinos de criação extensiva do Brasil
Tabela 1
Ocorrência de anticorpos para N. caninum pela técnica de
IFI em matrizes bovinas de corte, criadas extensivamente,
número de gestações e fase gestacional................................ 36
Tabela 2
Distribuição, segundo o título de anticorpos para N.
caninum, de matrizes bovinas de criação extensiva de gado
de corte, em diferentes momentos do ciclo reprodutivo no
sul do Rio Grande do Sul, Brasil............................................. 37
Tabela 3
Relação da soropositividade para N. caninum em pares
mãe/filho de bovinos criados extensivamente no sul do Rio
Grande do Sul, Brasil.............................................................. 37
ARTIGO 2
Infecção horizontal por Neospora caninum em bovinos
de criação extensiva no sul do Brasil
Quadro 1
Infecção pós-natal por N. caninum, ao longo do primeiro ano
de vida de bezerros nascidos soronegativos, em
propriedade de criação extensiva de gado de corte do Rio
Grande do Sul, Brasil.............................................................. 46
Sumário
1
Introdução............................................................................................
11
2
Objetivos..............................................................................................
14
3
Artigos
15
3.1
ARTIGO 1 Estudo da transmissão vertical de Neospora
caninum em bovinos de criação extensiva do Brasil..................... 15
Resumo................................................................................................ 16
Introdução............................................................................................
17
Material e Métodos..............................................................................
19
Resultados e Discussão......................................................................
20
Referências.......................................................................................... 27
3.2
ARTIGO 2 Infecção horizontal por Neospora caninum em
bovinos de criação extensiva no sul do Brasil...............................
38
Abstract................................................................................................ 39
Resumo................................................................................................ 40
Introdução............................................................................................
40
Material e Métodos..............................................................................
41
Resultados...........................................................................................
42
Discussão............................................................................................
43
Referências.......................................................................................... 44
3.3
ARTIGO 3 Primeira identificação de Neospora caninum por PCR
em cordão umbilical de bezerros de criação extensiva de gado
de corte no Brasil............................................................................... 47
Resumo................................................................................................ 48
Introdução............................................................................................
49
Material e Métodos..............................................................................
50
Resultados e Discussão......................................................................
52
Referências.......................................................................................... 53
4
Conclusão Geral..................................................................................
5
Referências.......................................................................................... 59
Anexos...........................................................................................................
58
61
1 INTRODUÇÃO
Neospora caninum
foi observado pela primeira vez em filhotes de cães na
Noruega causando sinais neurológicos (BJERKAS et al., 1984). Desde então,
relatos da infecção por este agente têm sido feitos em várias espécies,
incluindo ruminantes (DUBEY & LINDSAY, 1996). Este protozoário é um
coccídio formador de cistos nos tecidos dos hospedeiros intermediários e
responsável por causar falhas reprodutivas em bovinos (DUBEY et al., 2007).
Cadore et al., (2010) estudando a ocorrência de anticorpos em
amostras de soros fetais, detectaram 15% (39/260) de animais soropositivos
para N. caninum. Neste estudo os autores observaram que tanto a
imunoglobulina tipo G (IgG) como a imunoglobulina tipo M (IgM) podem servir
de marcadores de infecção transplacentária em fetos bovinos. No entanto, os
anticorpos da classe IgG foram detectados com maior frequência.
Estudos feitos na Austrália, Argentina, Brasil, Canadá, México,
Holanda, Nova Zelândia, Espanha, Ucrânia e Estados Unidos da América em
propriedades de criação de gado de corte e gado de leite demonstram que as
perdas relacionadas a N. caninum podem chegar a 1,298 bilhões de dólares por
ano, com cerca de 2/3 destas perdas sofridas pela indústria de gado de leite
(842,9 milhões de dólares) e 1/3 pela indústria de gado de corte (455,4 milhões
de dólares) (REICHEL et al., 2013).
No geral, é menor o conhecimento sobre as causas de aborto por N.
caninum
no gado de corte do que no gado de leite, devido à dificuldade de
encontrar fetos abortados durante o primeiro trimestre da gestação.
Consequentemente, torna-se mais difícil uma avaliação exata de perdas
econômicas causadas por este agente no gado de corte (DUBEY, 2003).
N. caninum
já foi descrito em diversos países da America Latina, como
Uruguai, Brasil, Argentina, Chile, Paraguai e Peru (MOORE, 2005). Vazquez et
al. (2009) estudando gado de corte no sul do México, observaram que este
protozoário é comum nos trópicos mexicanos, com prevalências variando de 0
12
a 45% dependendo do município estudado. No pampa úmido, a maior área de
produção agrícola e pecuária da Argentina, N. caninum também encontra-se
infectando vacas de criação de gado de corte com soroprevalência de 17,3%
(MOORE et al., 2009).
Hall et al. (2005) observaram uma taxa de transmissão vertical de 75%
em gado leiteiro na Austrália, dados similares obtidos por Pappen et al. (2006)
em bovinos leiteiros no Brasil. Este tipo de transmissão é muito importante,
pois mantém o parasito na população sem a necessidade do hospedeiro
definitivo (FIORETTI et al., 2003).
Trees e Willians (2005) sugeriram o termo infecção transplacentária
(TPI) endógena, para caracterizar a transmissão fetal a partir de uma infecção
materna recrudescente adquirida antes da prenhez e exógena (TPI) para definir
a infecção fetal que acontece como resultado de uma infecção da matriz
durante a gestação. De acordo com os autores estas duas situações são muito
distintas
para
serem
consideradas
por
um
só
termo
(transmissão
transplacentária), principalmente na sua estratégia de controle e implicações
epidemiológicas.
Além da transmissão vertical observa-se também a ocorrência de
transmissão horizontal, onde os bovinos se contaminam através da ingestão de
oocistos esporulados em fezes de cães (Canis lupus familiares) que são os
hospedeiros definitivos de N. caninum (McALLISTER et al.,1998). Os oocistos
podem atingir pastagens e aguadas e por fim virem a contaminar os animais,
entre eles os bovinos. Além do cão, observa-se outros canídeos fazendo parte
desta epidemiologia, como é o caso do coiote (C. latrans) (GONDIM et al., 2004),
do dingo (C. lu. dingo) (KING et al., 2010), que no continente australiano tem
grande importância pois é nativo na região e convive com bovinos nas
propriedades rurais (STOESSEL et al., 2003) e, mais recentemente, foi definido
também como hospedeiro definitivo de N. caninum o gênero tipo deste grupo o
lobo cinza (C. lupus) (DUBEY et al., 2011).
13
No presente trabalho, foram examinados soros de fêmeas bovinas em
idade gestacional, para verificar quais os índices de transmissão vertical e
horizontal de N. caninum em criação extensiva de gado de corte no sul do Brasil,
e estabelecer qual a relação entre soropositividade e aborto.
14
2 OBJETIVOS
Geral
Determinar a importância da transmissão vertical e horizontal na
epidemiologia de Neospora caninum em rebanho bovino de corte do sul do Rio
Grande do Sul, Brasil.
Específicos
- Detectar a ocorrência de anticorpos para N. caninum em fêmeas bovinas
em idade reprodutiva de criação extensiva de gado de corte.
- Avaliar os índices de transmissão vertical de N. caninum e estabelecer a
relação entre soropositividade e aborto.
- Verificar os níveis de transmissão horizontal de N. caninum durante o
primeiro ano de vida de bezerros nascidos desse rebanho.
- Diagnosticar N. caninum por PCR em cordões umbilicais de bezerros
nascidos de matrizes soropositivas.
15
3 ARTIGOS
3.1 Artigo 1
Título: Estudo da transmissão vertical de Neospora caninum em bovinos de
criação extensiva do Brasil
Autores:
Nilton Azevedo da Cunha Filho;
Plínio Aguiar de Oliveira;
Fernando Caetano de Oliveira;
Felipe Geraldo Pappen;
Luis Fernando Pita Gondim;
Nara Amélia da Rosa Farias.
Artigo formatado de acordo com as normas da revista Acta Parasitologica
(ISSN 1230-2821 online)
16
Estudo da transmissão vertical de Neospora caninum em bovinos de criação extensiva
do Brasil
Nilton A. da Cunha Filho1*; Plínio Aguiar de Oliveira2; Fernando Caetano de Oliveira2;
Felipe Geraldo Pappen3; Luis Fernando Pita Gondim4, Nara Amélia da R. Farias2.
1*. Programa de Pós Graduação em Veterinária, Universidade Federal de Pelotas,
Brasil. E-mail: [email protected]
2. Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto de Biologia, Universidade
Federal de Pelotas, Brasil.
3. Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia, Concórdia, SC, Brasil.
4. Departamento de Patologia e Clínicas, Escola de Medicina Veterinária, Universidade
Federal da Bahia (UFBA), Brasil.
Resumo
Neospora caninum é causador de grandes perdas econômicas na pecuária de vários
países, inclusive o Brasil. O estudo buscou avaliar a importância da transmissão vertical
de N. caninum em rebanho bovino de criação extensiva do Brasil, através do índice de
aborto, da probabilidade de transmissão vertical e sua relação com os títulos de
anticorpos das matrizes. Foi realizado inquérito sorológico por imunofluorescência
indireta, com ponto de corte 1:100, em 90 matrizes, que foram monitoradas durante a
gestação. Foi coletado sangue dos bezerros filhos dessas matrizes, antes de ingerir o
colostro, para a realização da prova sorológica com ponto de corte 1:25. Observou-se
que, no rebanho total, 32,2% (29/90) das vacas eram soropositivas para N. caninum.
Não observou-se diferença estatisticamente significativa entre matrizes com menos de
duas gestações em comparação com aquelas que tinham três ou mais gestações, assim
17
como a diferença entre as prevalências para N. caninum nos terços gestacionais
analisados. A probabilidade de transmissão vertical foi de 75,8% sendo o maior título
encontrado nos animais adultos, no período pré-gestacional o de 3200. N. caninum esta
presente na propriedade estudada com índices elevados de transmissão vertical, porém
não teve influência aparente no desempenho reprodutivo das matrizes.
Palavras-chave: Neospora caninum, transmissão vertical, bovinos, bezerros, sorologia.
Introdução
Desde seu surgimento na década de 80 Neospora caninum vem sendo responsável por
desordens neurológicas em filhotes de cães e problemas reprodutivos em bovinos
(Dubey, 2003). Estudos têm demonstrado que cães (Canis lupus familiares) (McAllister
et al. 1998), coiotes (C. latrans) (Gondim et al. 2004), dingos (C. lu. dingo) (King et al.
2010) e o lobo cinza (C. lupus) (Dubey et al. 2011) são os hospedeiros definitivos deste
parasito.
Em bovinos a rota vertical é considerada a mais importante, quando esta ocorre no
primeiro terço da gestação (70-100 dias) geralmente se observa morte embrionária, e, no
segundo terço, o aborto (Bartley et al. 2012). Quando a infecção se dá no último terço
dificilmente ocorrem mortes fetais e abortos, mas sim o nascimento de bezerros
clinicamente normais, porém persistentemente infectados (PI) (Bartley et al. 2004 e
Almeria et al. 2011).
Inquéritos soroepidemiológicos de N. caninum em propriedades de criação de gado de
leite e gado de corte demonstram que o agente encontra-se disseminado no rebanho. No
Brasil, os dados desta parasitose em rebanhos de gado de corte e de leite foram relatados
18
em estudos de prevalência realizados nos estados de Goiás (Melo et al. 2001), Paraná
(Locatelli-Dittrich et al. 2001), Minas Gerais e Rio Grande do Sul (Ragozo et al. 2003),
São Paulo (Sartor et al. 2003), Mato Grosso do Sul (Andreotti et al. 2004), Rio de
Janeiro (Munhoz et al. 2006), com taxas de prevalência que variaram de 6 a 58 %.
Aguiar et al. (2006) observaram em Rondônia uma prevalência em bovinos de corte de
9,5% e em bovinos de leite de 11,6%, sendo que em 100% das propriedades de corte
havia pelo menos um animal infectado. Neste mesmo estudo os autores demonstraram
que o tamanho da propriedade rural e o número de bovinos por propriedade são
importantes fatores de risco para a infecção por N. caninum.
Marques et al. (2011) verificaram através da técnica de ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay), em matrizes de gado de corte da raça zebuína abatidas em
matadouros no estado do Paraná, que 15,1% dos bovinos reagiram positivamente para
N. caninum. Sorologia positiva foi observada em 14,4% das vacas prenhes, enquanto
que nos animais não gestantes esta prevalência foi de 15,8%. Apesar de uma
prevalência maior nos animais que não estavam gestando a análise estatística não
demonstrou diferença significativa nessas prevalências. Durante esse estudo 83 fetos
foram recolhidos para avaliação sorológica, e em apenas 1,4% desses foram detectados
anticorpos para N. caninum.
Dados de transmissão vertical de N. caninum em bovinos de criação extensiva de gado
de corte, naturalmente infectados não tem sido muito estudados, principalmente devido
à dificuldade da obtenção de soros de bezerros sem a interferência de anticorpos
colostrais nesse tipo de rebanho, o que os torna muitas vezes subestimados. Portanto os
dados de transmissão vertical em bovinos de criação extensiva de gado de corte ainda
são insuficientes. Assim o objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de
19
transmissão vertical de N. caninum em matrizes de criação extensiva de gado de corte e
verificar a relação entre soropositividade e aborto.
Material e Métodos
Área de estudo e amostragem
O experimento foi realizado em propriedade de criação extensiva de gado de corte
localizada no sul do Rio Grande do Sul, Brasil. Foram avaliadas 90 matrizes da raça
Braford, em idade reprodutiva, para a determinação do status sorológico para N.
caninum. A amostra foi composta de matrizes primíparas e multíparas, sendo que a sua
maioria composta por animais que já haviam gestado seis vezes (25 matrizes). Dessas
matrizes foram coletadas amostras de sangue antes da prenhez, e após, trimestralmente
no período de dezembro de 2010 a setembro de 2011. O sangue dos bezerros foi
coletado no momento do nascimento antes da ingestão do colostro. Para isso as matrizes
foram acompanhadas diariamente, na época de parição (setembro a dezembro de 2011).
Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da
Universidade Federal de Pelotas, RS, Brasil, sob o código nº CEEA 8682.
Detecção de anticorpos para N. caninum
Os anticorpos para N. caninum foram identificados por imunofluorescência indireta
(IFI) conforme Björkman e Uggla (1999). Lâminas sensibilizadas com taquizoítos da
Cepa Nc-Bahia foram utilizados conforme descrito por Gondim et al. (2001). Os soros
dos bovinos adultos foram diluídos inicialmente a 1:100 (Aguiar et al. 2011) e os soros
dos bezerros a 1:25 (Wouda et al. 1997). Os soros positivos nesses títulos foram
diluídos seriadamente na base dois até a máxima diluição reagente. Soros controles
20
negativos e positivos foram incluídos em cada reação. Foi utilizado conjugado anti-IgG
bovino (molécula inteira) produzida em coelhos, marcado com fluoresceína, conforme
recomendado pelo fabricante (Sigma-Aldrich, Brasil).
Analise Estatística
Os dados foram organizados em planilhas no programa Excel do Windows (Microsoft).
Avaliou-se, diretamente a ocorrência da transmissão vertical de N. caninum através da
fórmula P=X/(X + Y), na qual X corresponde à frequência de bezerros positivos
nascidos de vacas positivas e Y corresponde à frequência de bezerros negativos
nascidos de vacas positivas (Oliveira et al. 2010). As variáveis foram avaliadas
utilizando-se o teste de associação Two by Two do programa Statistix 9.0 (Analytical
Software, Tallahasee, FL) com intervalo de confiança de 95%. Este teste expressa os
resultados com base nos valores de Qui-quadrado e Teste Exato de Fisher. A associação
foi considerada significativa quando o valor de p foi ≤ 0,05.
Resultados e Discussão
Soroprevalência para N. caninum
A soropositividade para N. caninum nas matrizes no período pré-gestacional foi de
32,2% (29/90) (Tabela 1). Frequências similares foram encontradas por Melo et al.
(2006) em Goiás (29,6%). A frequência de 32,2% encontrada no presente estudo foi
superior as observadas por Ragozzo et al. (2003) no Rio Grande do Sul (21,4%),
Hasegawa et al. (2004) em São Paulo (15,6%) e Bañales et al. (2006) em Montevidéu,
Uruguai, (13,6%) em bovinos de corte e Chanlun et al. (2007) na Tailândia (12%) em
bovinos de produção leiteira. Estudos de N. caninum no Brasil e em outros países
21
demonstram que o agente encontra-se disseminado nos rebanhos bovinos com
diferentes prevalências, essas comparações entre diferentes estudos, devem ser
realizadas com cautela, devido a diferenças nos pontos de corte das reações, das
técnicas de diagnósticos utilizadas e dos tipos de rebanhos avaliados (Dubey e Schares
2006).
Minervino et al. (2008) observaram em gado de corte da maior região produtora de
carne bovina do estado do Pará, prevalência de 19,2% (23/120) e os títulos dos animais
variaram de 100 (26,7%) a 1600 (6,7%), sendo o título 200 (33,3%) o mais frequente.
No presente estudo observou-se que, durante a triagem pré-gestacional, 58,6% (17/29)
das matrizes soropositivas apresentavam títulos baixos de anticorpos (≤ 200), sendo o
título mais frequente (10/29), o de 100 (34,5%), e o mais elevado o de 3200, constatado
em dois animais (6,9%). No último terço gestacional ocorreu um pico de anticorpos em
34,5% (10/29) das matrizes, que atingiram ou ultrapassaram o título 1600, não
verificado durante os terços gestacionais iniciais (Tabela 2). Portanto, apesar de os
dados de prevalências encontrados no Pará terem sido inferiores aos do presente estudo,
a variação nos títulos de anticorpos foram similares. Animais soropositivos para N.
caninum geralmente apresentam títulos variáveis, entretanto níveis elevados e
crescentes de anticorpos podem indicar um risco maior de aborto do que animais com
títulos baixos (Kashiwazaki et al. 2004; López-Gatius et al. 2005).
A prevalência de anticorpos para N. caninum foi mais elevada em matrizes com menos
de duas gestações, demonstrando tendência à significância em comparação com aquelas
que tinham três ou mais gestações, sendo de 42,9% (15/35) e de 25,5% (14/55)
respectivamente (Tabela 1). A ocorrência de animais positivos se manteve similar
durante os terços gestacionais avaliados, sendo de 15,6% (14/90) no primeiro e segundo
22
terço e de 20% (18/90) durante o terceiro terço gestacional. Apesar deste pequeno
aumento na prevalência, essa diferença não foi estatisticamente significativa (Tabela 1).
Transmissão vertical de N. caninum
Foi constatado que 75,8% (22/29) dos bezerros nascidos de vacas soropositivas tinham
anticorpos para N. caninum ao nascer, indicando a ocorrência de transmissão
intrauterina (Tabela 3). Outros estudos tem sido realizados em bovinos de leite, em
animais que vão para abate ou com infecções experimentais, sendo constatadas taxas de
transmissão que variam de 73 a 95% (Paré et al. 1996 e Davison et al. 1999).
Moré et al. (2009) observaram em bovinos de leite da Argentina, frequência de
transmissão vertical de 37% (52/140), considerada baixa, como demonstrado por Paré et
al. (1996), diferente do encontrado no presente estudo, esta diferença pode ser atribuída
ao ponto de corte utilizado na reação de IFI, pois no estudo acima citado a diluição
inicial utilizada foi a 200.
A probabilidade de transmissão vertical foi maior em matrizes com até dois partos
(86,7%, 13/15) do que naquelas com mais de três partos (64,3%, 9/14), essa diferença
foi estatisticamente significativa (p < 0,05), demonstrando que animais mais velhos têm
indícios de imunidade adquirida. Paré et al. (1996) relataram que uma baixa taxa de
transmissão vertical pode ser causada por uma estimulação contínua do sistema imune
materno, e, portanto, animais mais velhos seriam mais expostos ao agente, tendo como
consequência uma maior capacidade de proteção à progênie por imunidade natural.
Cardoso et al. (2012) observaram, em estudo longitudinal em três fazendas produtoras
de leite do Estado de São Paulo, índices de transmissão vertical de 83,3%, esses autores
demonstraram que existe um alto grau de correlação entre taxa de transmissão vertical e
23
a prevalência de animais positivos. No presente estudo, a soroprevalência geral das
matrizes foi similar (32,2%) ao citado anteriormente (28,6 a 37,1%), assim como a
probabilidade de transmissão vertical (75,8%), no entanto, no presente estudo, o risco
de uma vaca soropositiva transmitir o agente à progênie, foi independe da prevalência
no rebanho.
O nascimento de bezerros positivos, filhos de vacas positivas (transmissão vertical) foi
estatisticamente maior (p < 0,01) do que os de matrizes soronegativas, demonstrando
que vacas soropositivas têm mais chances de terem filhos soropositivos do que matrizes
soronegativas, visto que nenhum animal soronegativo transmitiu o agente à progênie
(Tabela 3).
Também no Rio Grande do Sul, Hein et al. (2012) observaram, em sorologia pareada
entre mães e filhas, alta associação (p ≤ 0,0001) entre sorologia positiva das mães e
transmissão vertical, sustentando a hipótese de que a transmissão vertical é uma
importante via de manutenção do N. caninum nos rebanhos, independente do tipo de
exploração da propriedade. Björkman et al. (1996) obtiveram resultados similares e
afirmam que esse fato pode manter a infecção por diversas gerações.
Nos animais avaliados não observou-se a presença de abortos, natimortos nem
mortalidade neonatal, independente do status sorológico das matrizes. Innes et al.
(2002) descreveram, em um trabalho sobre perspectivas para a produção de uma vacina,
que a imunidade adquirida seria importante na proteção contra o aborto mas insuficiente
para prevenir a transmissão vertical do parasita completamente. Essa hipótese foi
comprovada no presente estudo, em animais com imunidade naturalmente adquirida.
Oliveira et al. (2010) observaram soroprevalência geral de 32,7% para N. caninum, em
bovinos de central de transferência de embrião. Ao serem avaliados exclusivamente
aqueles com histórico de aborto, essa taxa foi de 75%, indicando relação entre a
24
infecção pelo agente e problemas reprodutivos no rebanho. Paz et al. (2007) realizaram
um estudo em novilhas receptoras de embrião criadas em sistema extensivo no Mato
Grosso do Sul, e observaram soropositividade para N. caninum de 29,5%. Os autores
não constataram diferença estatística entre as taxas de prenhez destes animais em
relação às fêmeas soronegativas da mesma categoria, assim como o observado no
presente estudo. Dados similares também foram obtidos por Dijkstra et al. (2002), não
sendo detectada associação entre sorologia positiva para N. caninum e aborto. Os
autores atribuíram esse fato à possível baixa virulência da cepa de N. caninum com a
qual o rebanho estaria infectado. Cepas pouco virulentas foram demonstradas por RojoMontejo et al. (2009) em camondongos BALB/c na Espanha. Também na Espanha
García-Melo et al. (2010) identificaram oito isolados de N. caninum obtidos a partir de
bezerros
saudáveis
infectados
congenitamente.
Nenhum
dos
isolados
teve
patogenicidade capaz de causar quaisquer sinais clínicos da doença nos modelos
biológicos utilizados para o teste (camondongos BALB/c).
Essa situação pode ter
ocorrido também no rebanho avaliado no presente estudo, ja que na propriedade
estudada o número de matrízes na reprodução é mantido por animais do própio rebanho,
sugerindo que devido a sucessívas passagens da mesma cepa de N. caninum nos
animais, essa ja poderia estar atenuada, porém mais trabalhos sobre virulências de cepas
e identificação de isolados de N. caninum são necessários para que se possa ter certeza
desse fato. Além disso, seria importante salientar as boas condições sanitárias e de
condição corporal do rebanho estudado, o que poderia ter contribuído para a proteção
dos animais contra N. caninum. Esse agente pode ser oportunista, causando perdas em
rebanhos mal nutridos e/ou infectados por bactérias ou vírus que deprimam
imunológicamente o hospedeiro, contribuindo assim para o desencadeamento ou
reagudização da neosporose (Melo et al. 2004). Essa hipótese é confirmada pelos
25
resultados de Silva et al. (2008) em bovinos de leite. Os autores observaram que
propriedades com soroprevalência mais elevada para N. caninum tinham animais com
estado nutricional classificado como ruim, enquanto que, naquelas em que os animais
apresentavam estado nutricional regular, a soroprevalência era menor.
Durante o último terço de gestação, 62,1% (18/29) das matrizes tiveram níveis de
anticorpos inferiores ou iguais aos detectados durante a triagem pré-gestacional,
enquanto que em 37,9% (11/29) esses títulos foram aumentados. A taxa de transmissão
vertical foi de 100% nas vacas que tiveram aumento do título de anticorpos, e de 61,1%
nas que mantiveram ou tiveram redução desse título. Essa diferença é significativa (p ≤
0,05) e sugere uma recrudescência da infecção pré-existente e consequente transmissão
do agente ao feto. Outros autores também constataram que fêmeas persistentemente
infectadas, e que apresentam aumento no nível de anticorpos específicos durante a
gestação, tem uma maior probabilidade de transmitir N. caninum ao feto (Stenlund et al.
1999 e Guy et al. 2001).
Não houve problemas reprodutivos no rebanho estudado, já que todas as matrizes,
soropositivas ou não, levaram a gestação a termo. Waldner et al (1998) também
constataram que o aumento de títulos de anticorpos para N. caninum durante a prenhez,
não teve relação com a ocorrência de aborto em bovinos. Níveis elevados de anticorpos
podem ocorrer devido à infecção horizontal com altas doses de oocistos e multiplicação
eficiente do parasito no hospedeiro, que parece não ter sido o caso do presente estudo, já
que todas as matrizes soropositivas avaliadas já tinham esse status no início do
experimento e nenhuma das soronegativas soroconverteu positivamente. Nesse trabalho,
foram avaliados bovinos persistentemente infectados.
Os títulos de anticorpos para N. caninum nas matrizes durante o último terço da
gestação, e em seus bezerros ao nascer, demonstrou que vacas com altos títulos de
26
anticorpos (≥ 800) obtiveram maior índice de transmissão vertical (91,7%, 11/12), do
que naquelas com títulos inferiores (64,7%, 11/17), embora essa diferença não seja
estatisticamente significativa (p = 0,1). Moore et al. (2009), na Argentina, também
observaram que vacas com altos títulos de anticorpos tiveram mais chances de infectar
os filhos do que mães com títulos mais baixos. Paré et al. (1996) observaram vacas que
apresentaram altos níveis de anticorpos durante o final da gestação ou um aumento na
sua quantidade entre o 3º e o 8º mês e detectaram uma maior probabilidade de
transmissão do agente à progênie, quando comparadas com aquelas com baixos níveis
de anticorpos ou com níveis decrescentes desses.
Os resultados do presente trabalho demonstram que N. caninum está presente na região
estudada, parasitando cerca de 1/3 das matrizes de corte, que apresentam, em sua
maioria, títulos baixos (≤ 200) de anticorpos. Essa infecção não afeta os índices de
prenhez nem de natalidade do rebanho, talvez devido à baixa virulência da cepa
presente, ou ao elevado índice nutricional dos bovinos.
A transmissão vertical é a principal forma de manutenção do agente no rebanho
estudado, e a análise sorológica das matrizes no período pré-gestacional, pode indicar
sua capacidade de transmitir N. caninum à progênie, pois essa transmissão ocorreu em
mais de 75% das soropositivas e em nenhuma soronegativa. A elevação do título de
anticorpos das matrizes durante a prenhez aumenta a probabilidade de transmissão
vertical, assim como nas matrizes com até duas gestações, mas não o risco de aborto.
27
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36
Tabela 1 – Ocorrência de anticorpos para N. caninum pela técnica de IFI em matrizes
bovinas de corte, criadas extensivamente, número de gestações e fase gestacional.
Variáveis
Positivos (%)
Negativos (%)
Total
P
OR
Até duas
15 (42,9%)
20 (57,1%)
35
0,06a
2,19
> duas
14 (25,5%)
41 (74,5%)
55
Total
29 (32,2%)
61 (67,8%)
90
Primeiro
14 (15,6%)
76 (84,4%)
90
0,28b
0,74
Segundo
14 (15,6%)
76 (84,4%)
90
Terceiro
18 (20,0%)
72 (80,0%)
90
Nº de gestações
Trimestre da Gestação
* Teste Exato de Fisher
a
Um grau de liberdade
b
Dois graus de liberdade
37
Tabela 2 - Distribuição, segundo o título de anticorpos para N. caninum, de matrizes
bovinas de criação extensiva de gado de corte, em diferentes momentos do ciclo
reprodutivo no sul do Rio Grande do Sul, Brasil.
Número de Matrizes Positivas (%)
Título de
Total de
Anticorpos
Período Pré-gestacional
1º Terço
2º Terço
3º Terço
Positivas (%)
100
10 (34,5)
3 (16,7)
4 (22,2)
3 (16,7)
20 (24,1)
200
7 (24,1)
7 (38,9)
8 (44,4)
2 (11,1)
24 (28,9)
400
4 (13,8)
6 (33,3)
5 (27,8)
1 (5,6)
16 (19,3)
800
5 (17,2)
2 (11,1)
1 (5,6)
2 (11,1)
10 (12,0)
1600
1 (3,4)
0 (0)
0 (0)
5 (27,8)
6 (7,2)
3200
2 (6,9)
0 (0)
0 (0)
2 (11,1)
4 (4,8)
6400
0 (0)
0 (0)
0 (0)
3 (16,7)
3 (3,6)
Total
29 (100)
18 (100)
18 (100)
18 (100)
83 (100)
Tabela 3 – Relação da soropositividade para N. caninum em pares mãe/filho de bovinos
criados extensivamente no sul do Rio Grande do Sul, Brasil.
Bezerro
Animais
Total
Soropositivo (%)
Soronegativo (%)
Matriz soropositiva
22 (75,8%)
07 (24,2%)
29
Matriz soronegativa
0 (0%)
61 (100%)
61
Total
22 (24,4%)
68 (75,6%)
90
Teste Exato de Fisher P < 0,01
38
3.2 Artigo 2
Titulo: Infecção horizontal por Neospora caninum em bovinos de criação
extensiva no sul do Brasil
Autores:
Nilton Azevedo da Cunha Filho;
Felipe Geraldo Pappen;
Cíntia Lidiane Guidotti Aguiar;
Plínio de Oliveira Aguiar;
Fernando Caetano de oliveira;
Luis Fernando Pita Gondim;
Nara Amélia da Rosa Farias.
Artigo formatado de acordo com as normas da revista Pesquisa Veterinária
Brasileira (0100-736X impresso)
39
Infecção horizontal por Neospora caninum em bovinos de criação extensiva
no sul do Brasil
Nilton A.C. Filho1*, Felipe G. Pappen2, Cíntia L.G. Aguiar1, Plínio O. Aguiar1,
Fernando C. Oliveira1, Luis F.P. Gondim3, Nara A.R. Farias1.
1
Laboratório de Parasitologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia da
Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), Pelotas, RS, Brasil;
2
Instituto Federal Tecnológico, Campus Concórdia, Concórdia, SC, Brasil;
3
Departamento de Patologia e Clínicas, Escola de Medicina Veterinária,
Universidade Federal da Bahia (UFBA), Brasil.
E-mail: [email protected]
ABSTRACT – Cunha Filho, N.A., Pappen, F.G., Aguiar, C.L.G., Aguiar, P.O., Oliveira,
F.C., Gondim, L.F.P. & Farias, N.A.R. 2013. [Horizontal infection by Neospora
caninum in cattle extensive breeding in southern Brazil.] Infecção horizontal
por Neospora caninum em bovinos de criação extensiva no sul do Brasil.
Laboratório de Parasitologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia,
Universidade Federal de Pelotas, Campus Universitário-Pelotas-C.P. – 354, s/n,
Capão do Leão, RS 96010-900, Brasil. E-mail: [email protected]. Neospora
caninum is a protozoan that causes reproductive failure in cattle worldwide. This
protozoan has as main hosts cattle and dogs. The transmission to cattle can occur
vertically or horizontally, and vertical transmission as the most important one,
because it keeps the agent in the population for various generations. Evidence of
horizontal transmission are the lack of association between the serostatus pairs
dams daughters, seroprevalence increase with increasing age of the animals,
abortion epidemic where several animals abort while positive and seroconversion
in longitudinal studies. The aim of this study was to demonstrate the importance of
horizontal transmission of Neospora caninum in maintaining a herd of beef cattle
naturally infected. For this we performed a serological survey by indirect
immunofluorescence (IFI) with initial title 100 in 90 Braford cattle on a property
in southern Brazil. From this serological screening 61 seronegative pregnant
mothers were selected to be serologically tested during pregnancy to exclude the
possibility of animals positive for N. caninum this period. Blood was collected from
their calves at birth and evaluated by IFI to N. caninum with cutoff 25. Of these 24
heifers calves were chosen to be monitored with blood samples for a period of 12
months. Of the 90 females examined this herd 61 (67,8%) were seronegative to N.
caninum. In none time during the period pregnancy was detected antibodies to N.
caninum in 61 pregnant dams together. The calves born from these dams did not
have antibodies to N. caninum at birth, which demonstrated the absence of vertical
transmission. A serological evaluation of the 24 calves born to seronegative dams
revealed the occurrence of seroconversion positive horizontal infection of N.
40
caninum in these animals. In the first collection (three months of the years) it was
observed that 4.2% (1/24) of calves were seropositive for the agent, these indices
increased in subsequent samplings, reaching 12.5% (3/24) in the last collection
(next twelve months of the years). The detection of this infection and increasing
prevalence with increasing age of the calves indicates interference from horizontal
transmission of this herd.
INDEX TERMS – Neospora caninum, horizontal transmission, cattle, dams.
RESUMO – Neospora caninum é um protozoário causador de perdas reprodutivas
em bovinos no mundo. Este protozoário tem como seus principais hospedeiros os
bovinos e os cães. A transmissão para os bovinos pode ocorrer de forma vertical ou
horizontal, sendo a transmissão vertical considerada a mais importante delas, pois
mantém o agente na população por diversas gerações. Evidências de transmissão
horizontal são, a falta de associação entre o status sorológico de pares mães e
filhas, a soroprevalência aumentando conforme o aumento da idade, aborto
epidemico, e soroconversão positiva em estudos longitudinais. O objetivo do
presente estudo foi demonstrar a importância da transmissão horizontal na
manutenção de N. caninum em um rebanho de gado de corte naturalmente
infectado. Realizou-se sorologia por imunofluorescência indireta (IFI) com ponto
de corte 100 em 90 bovinos da raça Braford em uma propriedade de criação
extensiva de gado de corte no extremo sul do Brasil. A partir desta triagem as
matrizes prenhes soronegativas foram selecionadas para serem avaliadas durante
o período gestacional para excluir a possibilidade de animais positivos para N.
caninum neste período. Foi coletado sangue de seus bezerros ao nascer e avaliados
mediante IFI para N. caninum com ponto de corte 25. Desses bezerros foram
escolhidos 24 para serem acompanhados com coletas de sangue por um período de
12 meses. Das 90 fêmeas analisadas 61 (67,8%) eram soronegativas, e em nenhum
momento do período gestacional foi detectado anticorpos para N. caninum nessas
matrizes. Os bezerros filhos dessas matrizes também não tinham anticorpos para
N. caninum ao nascer, o que demonstrou a ausência de transmissão vertical. A
avaliação sorológica das 24 bezerras filhas de matrizes soronegativas revelou a
ocorrência de soroconversão positiva e infecção horizontal de N. caninum nesses
animais. Na primeira coleta (bezerros com até 3 meses de idade) observou-se que
4,2% (1/24) dos bezerros eram soropositivos para o agente, esses índices
aumentaram nas coletas subsequentes, chegando a 12,5% (3/24) na última coleta
(próximo aos 12 meses de idade). A detecção dessa infecção e o aumento da
soroprevalência com o aumento da idade dos bezerros indica a interferência da
transmissão horizontal neste rebanho.
TERMOS DE INDEXAÇÂO – Neospora caninum, transmissão horizontal, bovinos,
matrizes.
INTRODUÇÃO
A nesporose é considerada uma das principais enfermidades causadoras de
aborto em bovinos em todo o mundo (Dubey & Schares, 2006), tendo um impacto
significativo na produção pecuária, tanto em propriedades de criação de gado de
41
corte como em propriedades de criação de gado de leite. Ambos os modos de
transmissão, vertical e horizontal, desempenham papel importante na infecção dos
bovinos. A transmissão horizontal ocorre quando os bovinos se infectam com
oocistos eliminados nas fezes de cães (Canis lupus familiaris) (McAllister et al.,
1998) ou canídeos silvestres (C. latrans, C. lu. dingo e C. lupus) (Gondim et al.,2004;
King et al., 2010; Dubey et al., 2011).
Estudos tem demonstrado uma baixa incidência de soroconversão em
rebanhos endemicamente infectados e com historia clínica de neosporose,
sugerindo um baixo nível de transmissão horizontal (Schares et al. 1998, Hietala e
Thurmond 1999, Frössling et al. 2005). Bartels et al. (2007) observaram que a taxa
de incidência de transmissão horizontal é de 1,4 infecções a cada 100 bovinos
analisados. Essa ocorrência está associada à presença de cães nas fazendas e
geralmente em bovinos sem sinais clínicos evidentes. Segundo os autores, a
soroprevalência para o agente pode aumentar de forma silenciosa através da
infecção transplacentária exógena (exógena TPI).
O objetivo do presente estudo foi demonstrar a importância da transmissão
horizontal na manutenção de N. caninum em um rebanho de criação extensiva de
bovinos de corte naturalmente infectados.
MATERIAL E MÉTODOS
Área de Estudo
Participaram do experimento animais de um rebanho de propriedade de
criação de gado de corte, com sistema de criação extensiva, localizada no sul do Rio
Grande do Sul, Brasil. A propriedade estudada não apresentava cães, mas eram
observados cães vadios transitando, além desses animais, a presença de canídeos
silvestres era frequente entre os animais de produção da fazenda.
Animais Experimentais
Foram avaliadas por imunofluorescência indireta (IFI) em dezembro de
2010, 90 fêmeas bovinas da raça Braford, em idade reprodutiva, para a exclusão da
infecção por N. caninum. A amostra foi composta de matrizes primíparas e multíparas,
sendo que a sua maioria composta por animais que já haviam gestado seis vezes (25
matrizes). Os animais eram criados em campo nativo, sem a adição de suplementos
na alimentação. Segundo informações do proprietário da fazenda os bovinos não
tinham histórico de abortamento nem de doenças reprodutivas. Esta triagem
inicial dos animais foi realizada para que fosse possível formar o grupo de matrizes
soronegativas para serem acompanhadas durante a gestação, sendo selecionados
61 animais. Posteriormente, 24 bezerras nascidas dessas matrizes, tiveram
acompanhamento sorológico desde o parto até os 12 meses. O estudo foi aprovado
pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de
Pelotas, RS, Brasil, sob o código nº CEEA 8682.
Colheita das Amostras
O sangue foi coletado em tubos tipo vacutainer, sem anticoagulante, por
venocentese da veia jugular ou coccígea, no centro de manejo da propriedade. As
amostras de sangue dos bezerros ao nascer foram coletadas a campo por punção
da veia jugular. O material coletado foi mantido em temperatura ambiente para
retração do coágulo, e depois levado, sob-refrigeração, para o Laboratório de
Parasitologia do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade
42
Federal de Pelotas (UFPel). Os soros foram separados dos coágulos por
centrifugação a 1800g por 10 minutos e acondicionados em tubos de polipropileno
(tipo eppendorf) identificados e mantidos a -20ºC até o momento das análises
sorológicas.
Perfil sorológico das matrizes e de seus bezerros ao nascer
Os 61 animais selecionados foram acompanhados durante o período
gestacional com coletas de sangue no primeiro, segundo e último terço da gestação
para avaliar a possibilidade de primo-infecção durante o período gestacional ou
até mesmo soro-conversão positiva de animais com títulos abaixo do ponto de
corte utilizado. O sangue dos bezerros filhos destas matrizes foi coletado ao nascer.
Vinte e quatro bezerras selecionadas pelo proprietário para permanecerem na
fazenda, foram acompanhadas através de exames sorológicos trimestrais, por um
período de 12 meses.
Anti-IgG bovino (molécula inteira) marcado com
isotiocianato de fluoresceína (Sigma, Aldrich, Brasil) foi utilizado conforme
recomendações do fabricante. O resultado da sorologia foi considerado negativo
quando não observou-se fluorescência dos taquizoítos na diluição inicial 1:100
(PITEL et al. 2001) para os animais adultos e 1:25 (WOUDA et al. 1997) para os
bezerros.
Análise Laboratorial
Utilizaram-se lâminas sensibilizadas com taquizoítos da Cepa Nc-Bahia
conforme descrito por Gondim et al. (2001). As lâminas foram acondicionadas em
caixa de polipropileno e mantidas a -20ºC até o momento do uso. Em cada lâmina
foram colocados os soros a serem testados acrescidos de um controle negativo e
um positivo. As leituras foram realizadas em microscópio de fluorescência no
aumento de 400x. Os controles positivos apresentavam sempre fluorescência total
bem visível e os negativos encontravam-se sem fluorescência, apresentando-se
avermelhados devido à presença da solução de Azul de Evans.
Análise Estatística
Os dados foram organizados em planilhas no programa Excel do Windows
(Microsoft). As variáveis foram avaliadas utilizando-se o teste de associação Two
by Two do programa Statistix 9.0 (Analytical Software, Tallahasee, FL, 2008) com
intervalo de confiança de 95%. Este teste expressa os resultados com base nos
valores de Qui-quadrado e Teste Exato de Fisher. A associação foi considerada
significativa quando o valor de p foi ≤ 0,05.
RESULTADOS
Do total de 90 matrizes analisadas durante uma triagem pré-gestacional, 61
(67,8%) eram soronegativas para N. caninum. Durante todo o período gestacional
avaliado (1º, 2º e último terço), não observou-se a ocorrência de anticorpos para N.
caninum nesses animais, demonstrando ausência de soro-conversão positiva em
matrizes com títulos abaixo do ponto de corte utilizado, ou infecção horizontal
durante a gestação. Seus respectivos bezerros foram negativos para anticorpos
anti-N. caninum ao nascer, antes da ingestão de colostro, demonstrando a ausência
de transmissão vertical exógena ou endógena.
43
Durante o primeiro ano de vida de 24 bezerras selecionadas pelo
proprietário da fazenda para servirem de novilhas de reposição, foi detectada a
presença de anticorpos anti-N. caninum em três delas (12,5%) (Quadro 1). Na
primeira coleta de sangue desses animais, em torno dos 3 meses de idade,
observou-se uma ocorrência de 4,2% (1/24) de soropositividade para N. caninum.
Essa ocorrência se manteve a mesma na coleta seguinte, quando os animais
encontravam-se próximos aos seis meses de idade. O aumento no número de
animais soropositivos ocorreu próximo aos nove meses de idade das bezerras
(3/24, 12,5%) e se manteve o mesmo até o final do experimento. Apesar desse
aumento, diferença estatística significativa não foi observada (p > 0,05). A detecção
de animais soropositivos, filhos de mães soronegativas, indica a presença do
agente no ambiente, infectando os bovinos pela forma horizontal.
DISCUSSÃO
As 61 matrizes amostradas, pertenciam a um rebanho de criação extensiva
de gado de corte, as quais se mantiveram soronegativas durante todo o período
gestacional avaliado. Os bezerros filhos dessas matrizes também não tinham
anticorpos ao nascer, o que demonstrou a ausência de transmissão vertical
exógena ou soro-conversão positiva de matrizes com baixos títulos de anticorpos.
Entretanto, resultados sorológicos negativos em bezerros com menos de 180 dias
devem ser interpretados com cautela, pois o sistema imune destes animais ainda
não é completamente competente (BARTLEY et al. 2004). Porém como as matrizes
foram analisadas sorológicamente durante os períodos da gestação pode-se confiar
na soronegatividade desses bezerros.
A avaliação sorológica durante o primeiro ano de vida, das 24 fêmeas filhas
de matrizes soronegativas revelou a ocorrência de soroconversão positiva e
infecção horizontal com N. caninum nestes animais. Na primeira coleta (próximo
aos três meses de idade) observou-se que 4,2% (1/24) delas eram soropositivas
para o agente. Esses índices aumentaram nas coletas subsequentes, chegando a
12,5% (3/24) na última coleta, próxima aos 12 meses de idade, porém esta
diferença não foi estatísticamente significatíva (p > 0,05) (quadro 1). A detecção
desses anticorpos e o aumento da soroprevalência com o aumento da idade dos
bezerros indica a interferência da transmissão horizontal nesse rebanho. A
associação entre idade dos bovinos e soroprevalência tem sido inconsistente entre
vários estudos. Waldner et al. (1998) e Sanderson et al. (2000) observaram que
vacas jovens são mais propensas a serem soropositivas para N. caninum, do que
animais mais velhos, porém outros autores não tem encontrado relação alguma
entre idade dos bovinos e soroprevalência (Davison et al. 1999), ou tem observado
aumento da prevalência com o aumento da idade (Jensen at al. 1999).
As vacas adultas deste rebanho podem ter sido infectadas no útero e, como
não ocorreu infecção horizontal significativa nem recrudescência da infecção
durante o período avaliado, os títulos destes animais podem ter caído ao longo do
tempo o que pode resultar em uma diminuição aparente na soroprevalência com a
idade. Esta situação se reflete diretamente na ausência de anticorpos colostrais
para N. caninum transferidos aos bezerros deste rebanho, o que os torna
suscetíveis à infecção ambiental pelo agente. Hall et al. (2005) observaram, em um
estudo longitudinal na Austrália, que 15% das infecções por N. caninum na
propriedade estudada eram causados por infecção horizontal, já que os animais
44
não eram nascidos de mães soropositivas. Os autores atribuíram essa infecção a
oocistos liberados por cães que podem ter se infectado com N. caninum ao ingerir
fetos abortados, restos placentários ou carcaça de animais mortos deixadas no
campo.
Outra situação a ser discutida são as variações ambientais que ocorrem de
um ano para outro e podem influenciar na soroprevalência dos animais,
principalmente por se tratar de um ambiente não controlado, ou seja, bovinos
mantidos a campo, sob condições naturais. Diferenças nas condições climáticas
podem ter favorecido a sobrevivência de oocistos de N. caninum, o aumento de
chuvas e temperaturas mais amenas podem ser fatores ambientais importantes na
manutenção do agente no ambiente. A importância do aumento de populações
caninas domésticas e selvagens não pode ser descartado, este tipo de situação
pode colaborar com a maior exposição de bovinos ao agente e consequentemente
outros hospedeiros também, completando assim a tríade epidemiológica de N.
caninum. Cunha-Filho et al. (2008) observaram, na mesma região do presente
estudo, que cães de propriedades rurais onde os proprietários não recolhem
carcaça ou fetos de animais do campo, tem 2.2 vezes mais chances de serem
soropositivos para N. caninum.
Na propriedade deste estudo, apesar de não haver cães domésticos, muitas
vezes eram observados cães vadios transitando. Além disso, existem muitos
canídeos silvestres (Lycalopex gymnocercus e Cerdocyon thous), e estes foram
observados junto às matrizes, tentando ingerir restos placentários. Embora esses
canídeos ainda não tenham sido confirmados como hospedeiros definitivos de N.
caninum, anticorpos para o agente já foram descritos nesses animais na mesma
propriedade de estudo (CAÑÓN-FRANCO et al. 2004).
Apesar de apenas três animais (12,5%) terem se infectado por N. caninum
durante o primeiro ano de vida e nenhuma das matrizes soronegativas ter
adquirido a infecção durante o período gestacional, a propriedade em estudo
demonstra a presença do agente no ambiente infectando os bovinos pela forma
horizontal. A complexidade dessa modalidade de infecção torna os programas de
controle de N. caninum mais complicados, principalmente porque as fontes de
infecção para o rebanho são muito variadas e algumas até mesmo desconhecidas.
Os resultados permitem concluir que N. caninum está presente no ambiente
da propriedade estudada e parasitando bovinos de corte, sendo a transmissão
horizontal um importante fator a ser considerado, já que pode estar contribuindo
para a elevação da taxa de transmissão vertical de N. caninum em gestações
subsequentes.
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Quadro 1 . Infecção pós-natal por N. caninum, ao longo do primeiro ano de vida de
bezerros nascidos soronegativos, em propriedade de criação extensiva de gado de
corte do Rio Grande do Sul, Brasil.
Animais Até 3meses
3,1-6meses
1
(-)
(-)
2
(-)
(-)
3
(-)
(+)
4-12
(-)
(-)
13
(+)
(+)
14-24
(-)
(-)
Total
1/24 (4,2%) 2/24 (8,3%)
(-) – bezerros negativos
(+) – bezerros positivos
6,1-9meses
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
3/24 (12,5%)
9,1-12mseses
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
3/24 (12,5%)
47
3.3 Artigo 3
Titulo: Primeira identificação de Neospora caninum por PCR em cordão
umbilical de bezerros de criação extensiva de gado de corte no Brasil
Autores:
Nilton Azevedo da Cunha Filho;
Felipe Geraldo Pappen;
Alceu Gonçalves Junior;
Fábio Pereira Leivas Leite;
Luis Fernando Pita Gondim;
Nara Amélia da Rosa Farias.
Short Communication formatada de acordo com as normas da revista
Veterinary Parasitology, (ISSN: 0304-4017).
48
Primeira identificação de Neospora caninum por PCR em cordão umbilical de
bezerro de criação extensiva de gado de corte no Brasil
Nilton Azevedo da Cunha Filhoa*, Felipe Geraldo Pappenb, Alceu Gonçalves Juniorc,
Fabio Pereira Leivas Leitec, Luis Fernando Pita Gondimd, Nara Amélia da Rosa Fariasa
a
Laboratório de Parasitologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia da
Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), Pelotas, RS, Brasil;
b
Instituto Federal Tecnológico, Campus Concórdia, Concórdia, SC, Brasil;
c
Universidade Federal de Pelotas, Centro de Biotecnologia (CenBiot), Brasil;
d
Departamento de Patologia e Clínicas, Escola de Medicina Veterinária,
Universidade Federal da Bahia (UFBA), Brasil.
* Corresponding author. Tel.: 53-3275-7398; fax: 53-3275-7169
E-mail address: [email protected]
Resumo: A presença de DNA de Neospora caninum em cordão umbilical de bezerros
filhos de matrizes soropositivas de criação extensiva de gado de corte foi investigada. O
estudo foi realizado com 20 bezerros no extremo sul do Brasil. O nascimento dos
bezerros foi acompanhado para que fosse possível a coleta de sangue antes da ingestão
do colostro, e a obtenção do cordão umbilical. Os exames sorológicos foram realizados
através da técnica de imunofluorescência indireta (IFI) com ponto de corte 1:25, além
de reação em cadeia da polimerase (PCR) no tecido do cordão umbilical. Anticorpos
para N. caninum foram detectados em 60% (12/20) dos bezerros, enquanto que o DNA
do parasito (PCR positivo) foi confirmado em 1/20 (5,0%) dos cordões umbilicais. Esse
49
bezerro nasceu com opacidade córnea unilateral, sinais clínicos compatíveis com
neosporose. Esse é o primeiro relato da detecção de DNA de N. caninum em cordão
umbilical de bezerros filhos de matrizes soropositivas pela técnica de PCR.
Palavras chave: Neospora caninum, bezerros, cordão umbilical, bovinos.
1. INTRODUÇÃO
Neospora caninum é um protozoário pertencente ao Filo Apicomplexa da
Família Sarcocystidae (Dubey et al., 1988), sendo considerado uma das principais
doenças reprodutivas em bovinos do mundo (Dubey et al., 2007). O principal sinal
clínico da infecção em bovinos é o aborto que pode ocorrer a partir dos três meses de
gestação (Dubey, 2003).
Os cães domésticos (Canis lupus familiares) são considerados hospedeiros
definitivos de N. caninum, pois eliminam oocistos nas fezes, após a ingestão de tecidos
infectados (McAllister et al., 1998). Estudos demonstraram que coiotes (C. latrans)
(Gondim et al., 2004), dingos (C. lu. dingo) (King et al., 2010) e o lobo cinza (C. lupus)
(Dubey et al., 2011) também são hospedeiros definitivos desse protozoário.
A transmissão vertical, da mãe para o feto, e a horizontal, quando os bovinos se
infectam pela ingestão de oocistos esporulados, já foram demonstradas como modos de
transmissão de N. caninum em bovinos. Esse agente é considerado um dos parasitos
mais eficientes em realizar a transmissão transplacentária nessa espécie. Essa pode
ocorrer devido a infecção por ingestão de oocistos (exógena) ou reativação de infecção
crônica em bovinos infectados (endógena) (Williams et al., 2009). A ocorrência da
neosporose pode variar com o tipo de exploração dos bovinos, manejo dos rebanhos,
raça e a presença de hospedeiros definitivos (Dubey et al, 2007).
50
O diagnóstico da neosporose bovina é baseado na detecção de lesões
características em tecidos fetais, como por exemplo, encefalite não supurativa,
associado a detecção do parasito por imunoperoxidase ou reação em cadeia da
polimerase (PCR) (Dubey, 2003; Wouda e Buxton, 2007).
A técnica de PCR é muito sensível e capaz de detectar um taquizoíto em 1 a 2
mg de tecido infectado (Dubey e Schares, 2006).
A detecção de DNA de N. caninum já foi observada, como por exemplo, em
cérebro e pulmões de diversos animais (Lally et al., 1996; Holmdahl e Mattson, 1996),
sêmen de bovinos (Ortega-Mora et al., 2003), fetos abortados (Şuteu et al., 2010) ,
fluídos uterinos (Silva et al., 2012) e oocistos eliminados por canídeos (Hill et al.,
2001). O objetivo deste estudo foi investigar a presença de DNA de N. caninum em
cordão umbilical de bezerros filhos de matrizes soropositivas de criação extensiva de
gado de corte do extremo sul do Brasil.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Área de estudo e amostragem
O estudo foi realizado em uma fazenda de gado de corte, onde as coordenadas
geográficas são 31º 34´50.57´´ S, 52º 19´52.41´´ W e altitude média de 97 m, Brasil. Foi
acompanhado o nascimento de vinte bezerros cruza Braford, filhos de matrizes
soropositivas, para que fosse possível obter o cordão umbilical imediatamente após o
parto. Amostras de sangue foram coletadas dos bezerros, antes da ingestão do colostro,
para a detecção de anticorpos para N. caninum por imunofluorescência indireta (IFI)
com ponto de corte 1:25. Os cordões umbilicais e o soro sanguíneo foram estocados a –
20ºC até o momento das análises na Universidade Federal de Pelotas. Esse estudo foi
51
aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de
Pelotas, RS, Brasil, sob o código nº CEEA 8682.
2.2 Extração do DNA
A extração do DNA dos cordões umbilicais foi realizada através da utilização de
Kit easy DNA (Invitrogen), protocolo 3 (Anexo 1), indicado para pequenas quantidades
de células e tecidos. Para a extração, foram utilizados 100 mg de cordão umbilical.
Após o DNA extraído, sua concentração foi determinada por espectrofotometria a 280
namômetros. O DNA foi estocado a -20ºC até o momento das análises moleculares.
2.3 PCR
A técnica de PCR foi realizada com primers específicos para N. caninum
Np6/Np21+ que amplificam a região Nc-5 de N. caninum (Müller et al. 1996). Foram
incluídos em cada reação um controle positivo e negativo (cepa Nc-1 e água mili-q
como controle negativo). Cada mistura de reação continha 50 mM MgCl 2, 1X PCR
Buffer (10 mM Tris HCl, 50 mM KCl, pH 8.3), 200 uM dNTPs, 2.5 unidades taqDNA
polimerase (Ludwig Biotec), 2 ul DNA, 16,55 ul de água ultra pura e 1,0 ul (10 uM) de
cada um dos primers (Np 21 [gtgcgtccaatcctgtaac] e Np 6 [cagtcaacctacgtcttct]). A
amplificação foi realizada em termociclador (Biocycler).
A ciclagem para a
amplificação consistiu de uma desnaturação inicial a 94°C durante 3 min, seguida por
40 ciclos de desnaturação (94°C, 1 min.), anelamento (50°C, 1 min.) e extensão (72°C,
2 min.), com uma extensão final a 72°C durante 5 min. Após a amplificação alíquotas
de 10 ml foram submetidas a electroforese em gel de agarose a 1,5%, em comparação
com marcador de peso molecular de 100 pb (DNA Leadder 100 bp (Invitrogen)). Os
géis foram corados com brometo de etidio e fotografados (LPix Image H6) em
52
transiluminador (Locus Biotecnologia)
para verificar a presença do fragmento
específico (337 pb), sob luz UV.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Observou-se que 60% (12/20) dos bezerros eram soropositivos para N. caninum
ao nascer. Na IFI 91,7% (11/12) dos animais analisados eram soropositivos e
clinicamente normais ao nascimento. A PCR resultou de amplificação específica em
uma amostra de cordão umbilical (5,0%, 1/20) na altura aproximadamente de 337 pb. O
fragmento amplificado é característico da presença de DNA de N. caninum quando
usado os primers Np6 e Np21 (Figura 1). Esse animal nasceu com opacidade córnea
unilateral e título de anticorpos, de 1600 (Figura2), tendo desenvolvimento normal,
chegando a fase adulta. Os títulos de anticorpos da mãe haviam variado durante a
gestação, ocorrendo soroconversão negativa entre o primeiro e segundo terços, voltando
a ter um pico de anticorpos no último terço da gestação, com título de 3200. Ambas,
matriz e bezerra, eram soronegativas para Toxoplasma gondii, IBR (Rinotraqueíte
Infecciosa Bovina) e BVD (Diarréia Viral Bovina), reforçando a hipótese de que o sinal
clínico foi causado por N. caninum. A transmissão do agente para o feto provavelmente
ocorreu no terço médio da gestação, pois pode ter havido a recrudescência da infecção
da mãe. Nesta fase da gestação, os bezerros já começam a montar uma resposta imune
aos micro-organismos, porém insuficiente para protegê-los totalmente dos efeitos
patogênicos do agente, e geralmente quando isso ocorre, nascem com sinais clínicos da
doença, como por exemplo, opacidade córnea (verificada neste caso), aparência
assimétrica dos olhos, exoftalmia, ou os mais graves como sinais neurológicos (Dubey e
Schares, 2006). De Meerchman et al. (2002), encontraram forte associação entre níveis
53
elevados de anticorpos nas matrizes e lesões histopatológicas em fetos, compatíveis
com neosporose.
N. caninum já foi demonstrada em tecidos por imunohistoquímica e PCR no
fígado, placenta, rim e cérebro de fetos bovinos abortados e adultos (Shivaprasad et al.,
1989; Wouda et al., 1997).
A baixa ocorrência de detecção de DNA de N. caninum no cordão umbilical dos
bezerros pode ser explicada pela diferença na distribuição desse agente nos tecidos,
pois a maioria dos taquizoítos é encontrada no cérebro (85%), fígado (26%) e coração
(14%) (Wouda et al., 1997). Aliado a esse fato, a presença de sinal clínico no bezerro
positivo na técnica de PCR, pode ter demonstrado que em animais com neosporose
congênita a detecção de DNA do parasito pode ser mais facilitada, devido a
disseminação do agente, principalmente nos envoltórios e anexos fetais, o que pode não
ocorrer em bezerros saudáveis, porém cronicamente infectados.
Esse é o primeiro relato da detecção de DNA de N. caninum em cordão
umbilical de bezerros, podendo servir como nova alternativa para o diagnóstico deste
agente em bezerros nascidos com sinais clínicos de nesoporose congênita, porém mais
estudos devem ser realizados para que se possa ter certeza dessa afirmação.
4. REFERÊNCIAS
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57
Fig. 1. Gel de agarose com produtos de PCR para Neospora caninum de cordões
umbilicais de bezerros nascidos de matrizes soropositivas, utilizando iniciadores Np6 e
Np21, que produzem bandas aos 327 pares de base: Marcador de pares de base (1);
bezerros negativos (2-4 e 6-8); bezerro positivo (5); controle negativo (9) e controle
positivo (10).
Fig. 2. Bezerra com opacidade córnea, PCR positiva para N. caninum, filha de matriz
soropositiva com altos títulos de anticorpos no último terço gestacional em propriedade
de criação extensiva de gado de corte do extremo sul do Brasil.
58
4 CONCLUSÃO GERAL
A transmissão vertical de N. caninum é uma importante rota de
manutenção do agente no rebanho, já que uma taxa elevada desse modo de
infecção foi observada nos bezerros;
Apesar de alta ocorrência de transmissão vertical essa não teve relação
com abortos;
N. caninum
esta presente no ambiente estudado infectando os bovinos
pela forma horizontal;
A transmissão horizontal pode estar contribuindo para o aumento da
taxa de transmissão vertical em gestações subsequentes nos animais
analisados.
A detecção de DNA de N. caninum em cordão umbilical, pode servir como
nova alternativa para o diagnóstico desse agente em bezerros nascidos com
sinais clínicos de nesoporose congênita.
59
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Anexos
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Anexo 1 – Kit easy DNA invitrogen
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