UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
Walkiria Luckwu de Santana Silva
Análise in silico de uma matriz DRE na seqüência promotora de
genes da Levedura Saccharomyces cerevisiae
RECIFE, 2004
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
WALKIRIA LUCKWU DE SANTANA SILVA
Análise in silico de uma matriz DRE na seqüência promotora de
genes da Levedura Saccharomyces cerevisiae
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Genética do Centro de
Ciências Biológicas da Universidade Federal
de Pernambuco, para obtenção do título de
Mestre em Genética.
ORIENTADOR: Dr. Marcos Antônio de Morais Jr (Depto. Genética - CCB)
CO-ORIENTADORA: Dra. Katia Silva Guimarães (Centro de Informática)
RECIFE, 2004
Agradecimentos
Aos meus pais, irmãs e sobrinhas, por torcerem tanto por esta conquista.
Ao Prof. Dr. Marcos de Morais Jr., por sua orientação, dedicação, profissionalismo
e ética.
À Profa. Dra. Katia S. Guimarães, por incentivar sempre a ultrapassar limites, por
saber o momento de cobrar e por compreender o ser de cada um.
Aos companheiros do Laboratório de Bio-Informática (BioLab), por um ambiente
de trabalho harmonioso e disponibilidade em ajudar, especialmente Gustavo
Bastos, pela ajuda na formatação do texto da dissertação.
À amiga Simone, por partilhar dias interpretando artigos científicos e por sua
amizade marcante.
À Profa. Dra. Vera Lúcia de Meneses Lima, Coordenadora do Programa de PósGraduação em Bioquímica da UFPE (Universidade Federal de Pernambuco), por
mostrar-se amiga, me ajudando em momentos importantes desta jornada.
À Profa. Dra. Maria Tereza Jansem de Almeida Catanho, Coordenadora do
Programa de Pós-Graduação em Biofísica da UFPE, por seu exemplo como
professora e profissionalismo.
Ao Centro de Informática da UFPE, por disponibilizar sua estrutura e à FACEPE
(Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco) pelo
apoio através do BioLab.
A todos que fazem o Programa de Pós-Graduação em Genética do Centro de
Ciências Biológicas da UFPE, especialmente à Profa. Dra. Ana Benko-Iseppon,
pelas sugestões que colaboraram para o aprimoramento da qualidade do texto desta
dissertação.
Aos amigos da Pós-Graduação em Genética, que compartilharam as várias etapas
do mestrado.
Agradeço em especial
ao meu Deus que sempre esteve comigo nesta
caminhada, a quem dedico este trabalho.
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Sumário
Lista de Figuras ............................................................................................................................... 6
Lista de Tabelas............................................................................................................................... 7
Lista de Abreviações ....................................................................................................................... 8
Resumo............................................................................................................................................ 9
1 Introdução................................................................................................................................ 10
2 Revisão Bibliográfica.............................................................................................................. 12
2.1 A levedura Saccharomyces cerevisiae .............................................................................. 12
2.2 O genoma de S. cerevisiae ................................................................................................ 12
2.3 Regulação e expressão gênica em S. cerevisiae................................................................ 13
2.3.1 GAL: exemplo de regulon em S. cerevisiae................................................................ 15
2.4 Reparação de lesões no DNA............................................................................................ 17
2.4.1 Reparação por reversão direta do dano ....................................................................... 19
2.4.2 Reparação por excisão de bases (REB)....................................................................... 21
2.4.3 Reparação por excisão de nucleotídeos (REN) ........................................................... 21
2.4.4 Reparação de bases mal emparelhadas ("Mismatch repair" MMR) ........................... 21
2.4.5 Reparação por recombinação ...................................................................................... 22
2.4.6 Resposta SOS .............................................................................................................. 23
2.5 Reparação de Lesões no DNA de S. cerevisiae ................................................................ 23
2.5.1 Grupo RAD3 ............................................................................................................... 24
2.5.2 Grupo RAD6 ............................................................................................................... 24
2.5.3 Grupo RAD52 ............................................................................................................. 25
2.6 Regulação da expressão de genes de reparação ................................................................ 26
2.7 Ferramentas Computacionais e Fatores de Transcrição .................................................... 27
3 Referências Bibliográficas ...................................................................................................... 29
4 Manuscrito............................................................................................................................... 37
5 Abstract ................................................................................................................................... 60
6 Conclusões .............................................................................................................................. 61
7 Anexos..................................................................................................................................... 62
7.1 Anexo 1 ............................................................................................................................. 63
7.2 Anexo 2 ............................................................................................................................. 69
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Lista de Figuras
Figura 1. Agrupamento gênico presente no cromossomo II envolvido na via Leilor. .................. 15
Figura 2. Esquema básico da regulação dos genes GAL em S. cerevisiae. .................................. 16
Figura 3. Respostas ao dano do DNA. .......................................................................................... 18
Figura 4. Esquema de fotorreativação ao dano de DNA reverso. ................................................. 20
Figura 5. A reparação de quebras de dupla-fita em DNA. ............................................................ 22
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Lista de Tabelas
Table 1. Computational analysis of DNA repair genes from S. cerevisiae identified by
MatInspector algorithm containing DRE-matrix elements in their promoter regions. ......... 55
Table 2. List of the yeast genes showing 95% or more sequence homology to DRE-matrix and its
characteristics. ....................................................................................................................... 56
Table 3. Yeast transcription factor-encoding genes identified by MatInspector for the presence of
a DRE-matrix motif in their –500 bp promoter sequence. .................................................... 57
Table 4. Homology between known regulatory motifs in the yeast genome and the DRE-matrix
motif. ..................................................................................................................................... 59
7
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Lista de Abreviações
BIOBASE
DBM
DDR
DIN
DRE
GBF
GTF
HSE
IUPAC
pb
PBS
PIC
REB
REN
S. pombe
STRE
TBP
TF
TRANSFAC
UAS
URS
UV
Banco de Dados Biológicos
Motivos de Ligação de DNA
Resposta ao Dano no DNA
Indução por Danos no DNA
Elemento que Responde a Danos
Centro Nacional de Biotecnologia – Braunschweig, Alemanha
Fator de Transcrição Geral
Elemento de Choque Térmico
União Internacional de Química Pura e Aplicada
Pares de Bases
Sítio de Ligação de Promotores
Complexo de Pré-Iniciação
Reparo por Excisão de Bases
Reparo por Excisão de Nucleotídeos
Saccharomyces pombe
Elemento de Resposta ao Estresse
Proteína Ligadora da Seqüência TATA
Fator de Transcrição
Banco de Dados de Fatores de Transcrição
Seqüência Ativadora a Montante
Seqüência Repressora a Montante
Radiação Ultra-Violeta
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Resumo
A regulação da expressão gênica envolve uma complexa rede de interações entre fatores de
transcrição e elementos regulatórios da região promotora dos genes. Dados experimentais
disponíveis na literatura demonstram a importância de uma seqüência de 15 pares de base (pb)
na regulação do gene SNM1(PSO2), necessário para o processo de reparação de lesões no DNA
da levedura Saccharomyces cerevisiae. Estes dados foram fundamentais na elaboração da
hipótese acerca da dispersão deste elemento na região promotora de outros genes de reparação e
de sua importância na indução destes genes mediada por danos no DNA da levedura. Verificouse a presença desta seqüência de 15 pb nas regiões promotoras de outros genes de reparação de
DNA, o que proporcionou a construção de uma matriz de peso relacionando nucleotídeos
conservados, transições e transversões nas diferentes posições da seqüência consenso
denominada seqüência consenso semelhante ao elemento DRE (Damage Response Element) do
gene RAD2. Posteriormente, a análise de homologia foi expandida, utilizando ferramentas
computacionais de análise matricial que proporcionam a geração de uma seqüência consenso
identificada também em muitos outros genes desta levedura. A grande maioria não estando
relacionada com processos de reparação ou metabolismo do DNA. Este elemento semelhante ao
elemento regulatório DRE apresentou alta homologia com outras seqüências regulatórias
presentes no genoma da levedura. O fato deste elemento estar presente na região promotora de
quase um terço dos genes da levedura e de que sua presença parece não estar diretamente
relacionada com a indução destes genes por agentes mutagênicos, sugerem fortemente que a
seqüência semelhante ao elemento DRE descrita neste trabalho deve atuar como um elemento
regulatório envolvido com mecanismos gerais de regulação da expressão gênica em S.
cerevisiae.
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
1 Introdução
A aplicação de tecnologias relacionada ao seqüenciamento genômico está gerando um
catálogo de informações que precisam ser cuidadosamente decifradas. A organização e
decodificação de todo este conjunto de informações podem trazer valiosas informações sobre os
mecanismos biológicos. A Biologia Computacional tem como uma de suas metas agilizar a
busca destas informações, localizando sinais prováveis de genes e produtos de genes de
seqüências de DNA ainda não caracterizadas experimentalmente. Embora as predições
computacionais compreendam conceitualmente métodos rápidos e simples, a análise de genes
ainda não caracterizados não é tarefa trivial. Para tanto, faz-se necessário o embasamento
biológico para melhor compreensão das informações a serem relacionadas e extraídas. A seleção
cuidadosa do conjunto de dados a serem utilizados para construir e testar uma busca é da maior
importância. Estas informações são particularmente úteis quando em conexão com seqüências de
DNA de genes conhecidos em outros organismos, pois as regiões codificantes estão presentes
como pequenas ilhas em um mar de DNA não codificante.
O interesse inicial deste trabalho foi o de utilizar seqüências de nucleotídeos que estivessem
relacionadas com a regulação de um grupo ou de grupos de genes envolvidos em reparação do
DNA da levedura S. cerevisiae, baseando-se em uma seqüência de 15 pb presente na região
promotora do gene SNM1(PSO2). Esta seqüência está relacionada com a regulação da expressão
do gene SNM1(PSO2) pela presença de lesões induzidas por agentes intercalantes no DNA das
células. Seqüências homólogas foram encontradas em outros genes da levedura S. cerevisiae.
Vários elementos regulatórios, já conhecidos, estão envolvidos na regulação gênica em resposta
a diferentes condições ambientais nesta levedura. Famílias de genes co-regulados proveram um
conjunto de dados ideal para calibrar os métodos de análise in silico de busca por homologia
direta, mas estes ainda são insuficientes para validação dos resultados. Desta forma, busca-se
cada vez mais a aplicação de métodos baseados não apenas na homologia direta entre as bases
nitrogenadas, mas na análise posicional a partir de distribuições matriciais das bases em uma
dada seqüência. Neste sentido, o presente trabalho teve como principal objetivo a extensão da
análise de homologia entre seqüências de nucleotídeos que estão presentes na região promotora
de genes de reparação, através da análise de distribuição matricial das bases nitrogenadas, e a
aplicação do resultado gerado na busca de seqüências homólogas na região promotora de todos
os genes da levedura S. cerevisiae. O processo de análise foi dividido em várias etapas: i)
identificar a existência de homologias entre as regiões promotoras dos genes de reparação
SNM1(PSO2) e RAD2 com outros genes de reparação da levedura; ii) identificar genes presentes
no genoma de S. cerevisiae que contenham em sua região promotora seqüências com pelo menos
95% de similaridade com os motivos encontrados na região promotora dos genes de reparação
10
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
em questão; iii) analisar a relação funcional entre os genes selecionados, baseada na anotação
dos bancos de dados de microarrays, para validação dos resultados obtidos; iv) identificar genes
envolvidos em outras vias metabólicas que apresentem a seqüência consenso descrita para os
genes de reparação estudados, indicando as possíveis vias de interação dos mecanismos de
reparação de lesões no DNA com vias metabólicas diversas da célula; v) e relacionar a seqüência
regulatória encontrada neste estudo com seqüências regulatórias já descritas na literatura ou
encontradas por outras análises in silico. Os métodos usados e os resultados obtidos serão
apresentados em um manuscrito que compõe este documento.
11
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
2 Revisão Bibliográfica
2.1 A levedura Saccharomyces cerevisiae
A levedura S. cerevisiae é um fungo unicelular bastante importante do ponto de vista
industrial pela sua utilização em processos de produção de alimentos, notadamente pão, cerveja e
vinho. Do ponto de vista científico, esta levedura compreende um dos sistemas eucariotos mais
bem conhecidos, sendo que trabalhos na área de fisiologia, bioquímica e genética contribuíram
significativamente para a elucidação de mecanismos genéticos mais variados, desde as bases
moleculares dos mecanismos de biossíntese celular (replicação, transcrição e tradução, por
exemplo) até o conhecimento de mecanismos que controlam o envelhecimento celular e o
desenvolvimento neoplásico, passando pela base genética de diversas doenças humanas
(Friedberg, 2003). Seu genoma foi totalmente seqüenciado (Oliver, 1996), sendo o primeiro
genoma eucarioto a ser finalizado, e os seus mais de 6400 genes estão presentes no
Saccharomyces Genome Database (SGD) (Cherry et al., 1998).
A S. cerevisiae possui um genoma com o máximo de 15.000 Kb de comprimento contendo
poucos íntrons e seqüências repetidas (Oliver, 1996). Este organismo possui um número variado
de cromossomos lineares, entre 12 e 16, dependendo da linhagem, compostos por uma cadeia de
DNA associada às histonas (Perez-Ortin et al., 1989). Estas células são haplóides. Na fase
assexuada, ou vegetativa, as células se reproduzem através de divisões mitóticas em processos
denominados brotamento multilateral (Phaff, 1990). A fase sexuada ocorre por esporulação e
conjugação, envolvendo mitose e meiose. As leveduras se mantêm no ciclo vegetativo até que
condições de estresse se estabeleçam, o que as leva a iniciarem um ciclo de vida gametofítico
(Castilho-Valavicius et al., 1992).
As informações do genoma de S. cerevisiae, colhidas através de análises experimentais
podem ser utilizadas para predição in silico de locais onde ocorrem seqüências que obedecem a
um padrão comum, possibilitando caracterizar famílias de genes e sua regulação. Neste sentido,
foi demonstrado por Wolter et al. (1996) que uma seqüência de 15 pares de bases na região
promotora do gene SNM1, um gene necessário para o processo de reparação em S. cerevisiae, é
responsável pela indução deste gene na presença de lesões no DNA da levedura induzidas por
agentes intercalantes. Esta seqüência foi encontrada na região promotora de outros genes de
reparação desta levedura (Wolter et al., 1996).
2.2 O genoma de S. cerevisiae
O seqüenciamento completo do genoma da levedura S. cerevisiae foi finalizado em 1996,
tendo sido realizado por um consórcio internacional de laboratórios. Trata-se de um genoma
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
altamente compacto, com aproximadamente 6.400 genes, que correspondem a 72% do total da
seqüência de nucleotídeos. O tamanho médio para cada gene é de 1,45 Kb ou 483 códons.
Apenas 70% dos genes foram caracterizados experimentalmente e 30% ainda têm função
desconhecida (Winzelera et al., 2003).
As informações genômicas sobre a levedura S. cerevisiae estão disponíveis em vários bancos
de
dados
distintos,
como
o
Saccharomyces
Genome
Database
–
SGD
(http://www.yeastgenome.org/) (Dolinski et al., 2002), o Martinsried Information Center for
Protein Sequences – MIPS (http://mips.gsf.de/) (Mewes et al., 1999; Mewes et al., 2000), o qual
contém informações sobre seqüências de proteínas anotadas, e o Yeast Protein Database – YPD
(https://www.incyte.com/proteome/database/YPD) (Costanzo et al., 2000), que possui um
conjunto de dados com ênfase em propriedades funcionais e físicas das proteínas. Novas
informações são periodicamente incorporadas a esses bancos.
2.3 Regulação e expressão gênica em S. cerevisiae
A regulação da transcrição tem sido reconhecida como uma importante etapa em uma cascata
de pontos de controle para regulação e expressão dos genes de um dado organismo. O modelo
mais simples de regulação de transcrição dos organismos eucariotos e procariotos é a ativação ou
repressão do aparato de transcrição por proteínas regulatórias que se ligam a uma seqüência de
DNA de extensão limitada, localizada geralmente em elementos de atuação em cis localizados a
montante (upstream) de um dado gene a ser transcrito (Lee et al., 2002). As interações entre as
proteínas regulatórias e o DNA ocorrem principalmente através de ligações do tipo pontes de
hidrogênio, diretas ou mediadas por moléculas de água, entre as cadeias laterais dos aminoácidos
e as bases nitrogenadas, bem como através de interações hidrofóbicas (Wingender, 1993).
Os fatores de transcrição são, em geral, proteínas que apresentam pelo menos dois domínios,
um domínio capaz de se ligar ao DNA e um outro de ativação da transcrição, responsável pelo
controle da expressão de um determinado gene (Mitchell e Tjian, 1989). Estes fatores podem ser
agrupados em diferentes classes de acordo com os motivos estruturais usados no reconhecimento
das seqüências específicas, tais como: hélice-alça-hélice, homeodomínios, dedos de zinco (zinc
finger) e zíper de leucina (Harrison, 1991; Wingender, 1993). Entretanto, existem muitos
motivos estruturais que não pertencem a nenhuma classe descrita, levando à possibilidade da
existência de novas classes de fatores de transcrição. Uma característica interessante dos fatores
de transcrição é que seu domínio de ligação ao DNA é separado do seu domínio de ativação, sem
modificar suas propriedades específicas (Ptashne e Gann, 1997).
Os grupos de elementos regulatórios controlam o início da transcrição de genes estruturais
em eucariotos. Estes elementos são reconhecidos pelos fatores de transcrição. A partir deste
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
reconhecimento as RNA polimerases podem atuar na transcrição daquele gene especificamente.
A RNA polimerase I (RNA pol I) e RNA polimerase III (RNA pol III) transcrevem genes que
codificam RNAs transportadores e RNAs ribossomais, respectivamente. A RNA polimerase II
(RNA pol II) transcreve genes que codificam os RNAs mensageiros e vários RNAs nucleares
pequenos. A correta iniciação da transcrição depende da reunião de enzimas e de fatores de
transcrição. O início da transcrição pela RNA pol II envolve uma ampla fase de reunião de
fatores de transcrição gerais (General Transcription Factor - GTF) na região promotora dos
genes alvos para formar o complexo de pré-iniciação (Pre-Initiation Complex - PIC) (Ptashne e
Gann, 1997).
O promotor basal constitui o principal alvo para a RNA pol II. O elemento TATA, localizado
a 25 pares de base (pb) a montante do sítio de iniciação da transcrição, é um dos seus elementos
basais melhor caracterizado, sendo rico em pirimidinas e atuando independentemente ou
sinergisticamente com outros elementos. Elementos promotores proximais podem ser
encontrados em qualquer trecho entre as posições 50 e 200 pb anteriores ao sítio de iniciação de
transcrição, e os ativadores transcricionais que se ligam a estas seqüências regulam a transcrição.
Os elementos distais, por sua vez, podem ser encontrados longe do sítio de iniciação da
transcrição em ambas orientações e direções, constituindo um outro grupo de DNA alvo para
fatores moduladores da atividade da RNA pol II (Hernandez, 1993). A partir do tipo de sítio de
reconhecimento, os fatores de transcrição podem ser divididos em dois grandes grupos: os
fatores de transcrição gerais, os quais estão envolvidos no reconhecimento das seqüências
regulatórias gerais, como o motivo TATA presente na quase totalidade dos genes, e os fatores de
transcrição específicos, os quais estão envolvidos na regulação de um gene ou conjunto de genes
em resposta a um dado momento metabólico (Wingender, 1993). O primeiro fator de iniciação
geral identificado foi o TFIIA (Matsui et al., 1980), originalmente descrito como essencial para a
transcrição de muitos, se não todos os genes nucleares. Entretanto, TFIIA parece atuar mais
como um co-ativador que auxilia a regulação da transcrição da RNA pol II por anular a inibição
de fatores repressores associados à proteína ligante da seqüência TATA (TATA Binding Protein
– TBP) (Ozer et al., 1998).
A partir do fator de transcrição basal TFIID inicia-se a transcrição de RNAs mensageiros.
Este se liga ao elemento TATA em cooperação com a TBP, juntamente com um grupo de
polipeptídios designados fatores associados ao TBP (TAFs). Estes TAFs têm atividades coativadoras, sendo necessários para a função ativadora, embora não afetem o baixo nível de
transcrição basal observado na ausência de um ativador (Hernandez, 1993). A ligação do TBP e
TFIID na região promotora forma o PIC. O próximo fator de iniciação geral a entrar no PIC é o
TFIIB. A RNA pol II reconhece a plataforma TFIIB-TFIID-DNA, seguindo-se a ligação dos
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
fatores TFIIF, TFIIE e TFIIH. O TFIIF é o único com a capacidade de formar complexo muito
estável com a RNA pol II, denominado pol/F. Diferente dos outros fatores de iniciação geral, o
TFIIH auxilia várias atividades catalíticas, incluindo ATPases dependentes de DNA, DNA
helicases dependentes de ATP, e uma proteína quinase que é capaz de fosforilar o domínio Cterminal da maior subunidade da RNA pol II, revisto por Wingender (1993). Estando o PIC
completo, e na presença de nucleotídeos trifosfatos, ocorre a separação da fita sítio de iniciação
para dar origem a um complexo aberto. O domínio C–terminal da sub-unidade maior da RNA
pol II é então fosforilado, provavelmente pela atividade DNA quinase do TFIIH, e a RNA pol II
é liberada do promotor para iniciar a transcrição (Zawel e Reinberg, 1995). A cooperatividade
entre os diferentes fatores de transcrição na regulação do ciclo celular de S. cerevisiae foi
recentemente analisado a partir da combinação de dados de expressão gênica e de
imunoprecipitação cromatínica (Banerjee e Zhang, 2003).
2.3.1 GAL: exemplo de regulon em S. cerevisiae
Os genes GAL em Saccharomyces cerevisiae têm sido utilizados como modelo de estudo da
regulação dos genes eucariontes. Estes genes estão coordenadamente regulados, o que se
denomina de regulon, pelo metabolismo de assimilação da galactose. Neste regulon encontramse os genes que codificam a galactose permease (GAL2) e três enzimas da via de Leilor, que são
os produtos dos genes galactoquinase (GAL1), galactoepimerase (GAL7) e galactose-transferase
(GAL10) (Riley e Dickson, 1984; Nehlin et al., 1991; Cardinali et al., 1997). Os genes GAL1,
GAL7 e GAL10 estão dispostos em um agrupamento gênico presente no cromossomo II (Figura
1), enquanto que GAL2 localiza-se no cromossomo XII (www.yeastgenome.org).
Figura 1. Agrupamento dos genes envolvidos na via Leilor (modificado por Martins (2000), a partir de Riley e
Dickson (1984); Cardinali et al. (1997)).
A expressão destes genes é controlada de duas formas: indução por galactose e repressão por
glicose. O mecanismo da indução baseia-se na ligação do produto do gene GAL4, uma proteína
dedo de zinco do tipo C2C2, na região promotora dos genes GAL, mais especificamente na
seqüência ativadora a montante (Upstream Activator Sequence – UAS), quando as células são
cultivadas em galactose, ativando a expressão dos mesmos (Figura 2). A proteína Gal4 constitui
um fator de transcrição específico para os genes GAL. A ligação da proteína Gal4 na região
promotora sinaliza a formação dos PICs nos genes do regulon GAL, ativando o complexo de
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
iniciação de transcrição. Na ausência de galactose, a proteína Gal80 (Gal80p) interage com a
proteína Gal4, inibindo-a (Lue et al., 1987; Wu et al., 1996) (Figura 2). Na presença de glicose,
a proteína Mig1 (Mig1p), a qual possui domínios dedo de zinco do tipo C2H2, liga-se na região
promotora do gene GAL4, especificamente na seqüência repressora a montante (Upstream
Repressor Sequence – URS), inibindo sua transcrição, e conseqüentemente a dos outros genes
GAL. Adicionalmente, a proteína Mig1 se liga à região promotora dos outros genes GAL (Nehlin
et al., 1991) (Figura 2).
Figura 2. Desenho esquemático básico da regulação dos genes GAL em Saccharomyces cerevisiae (Reproduzido de
Martins (2000)).
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
2.4 Reparação de lesões no DNA
A exposição de células a agentes que danificam o DNA ativa mecanismos de reparação
comandados por uma série de genes que estão envolvidos na própria reparação de lesões e em
outros metabolismos associados. Os mecanismos de reparação de lesões em S. cerevisiae podem
ser divididos em três tipos: (i) o mecanismo de reparação por excisão (grupo do gene RAD3), (ii)
o mecanismo por reparação mutagênica (grupo do gene RAD6) e (iii) o mecanismo por reparação
recombinacional (grupo do gene RAD52). Esta divisão é praticamente a mesma adotada para os
mecanismos de reparação bacterianos e de células humanas (Friedberg et al., 1995) (Figura 3).
Dentro destes grupos há genes cujas proteínas desempenham papéis específicos, enquanto que os
produtos de outros genes atuam de forma mais geral, participando inclusive de outros
mecanismos de reparação (Game, 2000). Também dentro de cada grupo podemos encontrar
genes que são induzidos pela presença de lesões no DNA, enquanto que outros apresentam a sua
expressão basal quase que inalterada (Friedberg et al., 1995; Jelinsky et al., 2000; Gasch et al.,
2001).
As mutações podem ocorrer tanto a nível gênico quanto cromossômico. A mutação gênica é
o processo pelo qual os genes são alterados, podendo levar a uma perda ou ganho de função, seja
pela substituição, inserção ou remoção de um único par de bases (mutação de ponto) ou de um
segmento de pares de bases. A mutação cromossômica pode ser classificada como alterações
numéricas e estruturais dos cromossomos (Friedberg et al., 1995). Embora a mutação consista na
principal fonte de variabilidade genética, sendo assim importante para a evolução, a estabilidade
do material genético também é fundamental para a continuidade da vida. Portanto, a reparação
de danos no DNA é um processo essencial para a manutenção da integridade da informação
genética (Tebbs et al., 1999). Para tanto, as células desenvolveram uma série de sistemas
enzimáticos capazes de reparar o DNA danificado (Friedberg et al., 1995). Provavelmente,
mecanismos simples de reparação de danos no DNA evoluíram para mecanismos enzimáticos
complexos capazes de corrigir a grande maioria dos danos induzidos por diversos agentes
mutagênicos. Esses mecanismos agem prevenindo efeitos citotóxicos e mutagênicos do DNA
danificado (Cline e Hanawalt, 2003).
Os mecanismos de proteção do material genético podem ser divididos em duas categorias: a
prevenção de erros e a reparação dos erros. A primeira categoria é caracterizada por evitar que
haja reações lesivas no DNA. Alguns sistemas enzimáticos neutralizam compostos químicos
antes que eles reajam com o DNA. Um exemplo de tal sistema envolve detoxificação dos
radicais superóxidos produzidos pelo agente oxidativo H2O2: a enzima superóxido dismutase
catalisa a conversão de radicais superóxidos em peróxidos de hidrogênio em água. Outra via de
prevenção de erros depende do produto do gene mutT, o qual produz uma enzima que impede a
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
incorporação no DNA de 8-oxodGTP, que surge por oxidação de dGTP, hidrolisando o trifosfato
de 8-oxodG em monofosfato (Fowler et al., 2003).
Figura 3. Respostas ao dano do DNA. Dano de DNA (ilustrado como um triângulo preto) resulta em reparação ou
em tolerância. (a) durante tolerância ao dano, locais danificados são reconhecidos pela maquinaria de replicação
antes que eles possam ser reparados, resultando numa detenção que pode ser aliviada pelo desvio (bypass)
replicativo (síntese translesão de DNA). (b) reparação de DNA envolve a excisão de bases e síntese de DNA (linhas
em ondas vermelhas), que requer DNA dupla-fita. Bases desemparelhadas, geralmente geradas por erros durante a
replicação do DNA, são cortadas como simples nucleotídeos durante a reparação. Uma base danificada é cortada
como uma simples base livre (reparação por excisão de base) ou como um fragmento de oligonucleotídeo (reparação
de excisão de nucleotídeo). Tais fragmentos são gerados por incisões de cada lado da base danificada. Reparação
por excisão de nucleotídeo pode também ocorrer em alguns organismos por um mecanismo bioquímico distinto,
envolvendo somente uma simples incisão próxima a um local de dano (incisão unimodal). (c) a célula tem uma rede
de caminhos de sinalização complexa que detém o ciclo da célula e pode levá-la à morte programada. Modificado a
partir de Friedberg (2003).
Os mecanismos de reparação de DNA que atuam uma vez que as lesões tenham se instalado
são classificadas em: a) reparação por reversão direta do dano; b) reparação por excisão de base;
c) reparação por excisão de nucleotídeo; d) reparação “mismatch”; e) reparação
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recombinacional; e f) resposta SOS (Friedberg et al., 1995). Estes mecanismos são comuns a
todos os níveis taxonômicos, embora as diferenças no tipo e conjunto de proteínas caracterizam
diferentes organismos. Segue abaixo uma breve revisão sobre estes mecanismos de reparação,
tendo como modelo a bactéria Escherichia coli. Verifica-se que a atuação destes mecanismos em
outros organismos seja em outras bactérias ou seres eucariontes, segue a mesma lógica,
entretanto com outras denominações para genes e proteínas.
2.4.1 Reparação por reversão direta do dano
O mecanismo bioquímico desta reparação baseia-se em uma reação de um único passo, no
qual uma enzima específica reconhece e remove a lesão, deixando o DNA na sua configuração
normal, livre de erro (Friedberg et al., 1995). Dois dos mais bem estudados mecanismos de
reversão direta do dano são a fotorreativação e a reparação de bases alquiladas. Recentemente foi
descrito um terceiro mecanismo, a reparação direta oxidativa (Begley e Samson, 2003).
2.4.1.1 Fotorreativação
O processo de fotorreativação ocorre através da enzima fotoliase, que tem como substrato o
DNA que foi irradiado por luz ultravioleta (UV) de comprimento curto (254 nm) ou UVC
(Figura 4). Esta radiação induz a formação de lesões do tipo dímeros de pirimidinas, que se
caracterizam por ligações covalentes entre pirimidinas adjacentes. A ação da enzima fotoliase,
sob luz visível, remove as lesões, reconstituindo pirimidinas independentes, em uma reação de
reversão da dimerização. Este processo não é puramente uma reação foto-física, é um
mecanismo que se baseia no reconhecimento pela enzima do DNA danificado pela luz UV,
formando assim um complexo enzima-substrato, num processo que ocorre na ausência de luz.
Em seguida, em uma fase que é dependente da presença de luz visível, a enzima reage corrigindo
o dímero e assim dissocia-se do complexo (Sinha e Hader, 2002).
2.4.1.2 Alquitransferência
A reparação de bases alquiladas ocorre através da ação das enzimas O6-metilguaninatransferase codificada pelos genes ada e ogt. Estas enzimas reconhecem a lesão na fita dupla do
DNA e removem o grupamento metil, transferindo-o para uma cisteína do sítio ativo da enzima.
A importância deste mecanismo consiste no fato de que se as bases alquiladas não forem
removidas antes do início da replicação, poderão gerar mutações do tipo transição GC
AT
(Psaround e Kyrtopoulos, 2000).
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Figura 4. Fotorreativação de dano no DNA. DNA exposto à radiação ultravioleta (UV) resulta em dimerização
covalente de pirimidinas adjacentes (dímeros de timina), ilustrado aqui como um triângulo violeta. Estas lesões são
reconhecidas por uma enzima fotorreativante, que absorve luz em comprimentos de ondas > 300 nm (tais como luz
fluorescente ou luz solar) e executa uma reação fotoquímica em dois passos que monomeriza as pirimidinas
dimerizadas, restaurando-as aos seus arranjos naturais. Modificado a partir de Friedberg (2003).
2.4.1.3 Reparação direta oxidativa
O gene envolvido na reparação direta oxidativa em E. coli é alkB, que apresenta ampla
distribuição, com genes homólogos em vários organismos. O gene alkB é regulado pelo produto
do gene ada, envolvido na via de reparação direta de alquitransferência. A enzima alkB da
reparação direta oxidativa atua em uma reação oxidativa, havendo deste modo uma liberação do
grupo metila na forma de formaldeído, revertendo a lesão para a forma de base não modificada
(Begley e Samson, 2003).
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Silva, W.L.S
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2.4.2 Reparação por excisão de bases (REB)
O mecanismo de excisão de bases é responsável por remover uma grande variedade de lesões
nas bases do DNA. Esta reparação se inicia com a ação das enzimas DNA glicosilases, que
reconhecem e removem as bases lesadas da cadeia de DNA pela quebra da ligação N-glicosídica,
a qual mantém a base nitrogenada associada com o esqueleto de açúcar-fostato. Para cada tipo de
lesão nas bases do DNA existe uma enzima DNA-glicolase específica (Mol et al., 1999). Depois
da retirada da base lesada, gera-se no DNA um sítio apurínico ou apirimidínico (AP) que será
reconhecido e clivado por AP-endonucleases. As APs realizam a quebra do esqueleto de açúcar
nas posições 3’ e 5’. A lacuna gerada pela retirada do nucleotídeo contendo a lesão será
preenchida por DNA polimerase envolvida na síntese de DNA após o processo de reparação
(Memisoglu e Samson, 2000).
2.4.3 Reparação por excisão de nucleotídeos (REN)
O processo de reparação por excisão de nucleotídeos remove uma diversidade de lesões que
causam distorções estruturais significativas no DNA, incluindo fotoprodutos induzidos pela luz
UV, adutos químicos e ligações cruzadas internas entre fitas. Este mecanismo de reparação é
altamente conservado ao longo da evolução dos procariotos. O REN consiste no reconhecimento
da lesão no DNA, seguido pela incisão da fita danificada, uma em cada lado da lesão e pela
remoção do oligonucleotídeo em 3’ com a fita existente. Neste modelo, a presença de uma lesão
promove uma parada na transcrição com o recrutamento do complexo TFIIH e outras proteínas
envolvidas na reparação. Após a reparação, o fator TFIIH atua como um fator de iniciação e a
transcrição é retomada (Yumin e Raymond, 2000).
2.4.4 Reparação de bases mal emparelhadas ("Mismatch repair" MMR)
Esse mecanismo atua também em importantes funções na reparação acoplada à transcrição e
à meiose. Sua principal função é a correção de pareamento errôneo de bases ocorrido na
replicação (Buermeyer et al., 1999; Jean et al., 1999). O mecanismo de ação do MMR é
direcionado por metilação de seqüência GATC na fita que é sintetizada após a replicação. As
enzimas Mut reconhecem e se ligam às bases mal pareadas na seqüência GATC. Se somente
uma das fitas é metilada na seqüência GATC, a proteína MutH atua como endonuclease sítioespecífica, clivando a fita não metilada na porção 5’ da seqüência alvo. Uma vez ocorrendo a
clivagem, a DNA polimerase III preenche o espaço que foi retirado e a DNA ligase faz a ligação
fosfodiester. O último passo no processo consiste na metilação dos sítios GATC das fitas recémsintetizadas, pela Dam metiltransferase (Hsieh, 2001).
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2.4.5 Reparação por recombinação
A reparação por recombinação utiliza a maquinaria de recombinação genética mitótica para
restaurar a integridade do DNA após o processo de replicação. Um tipo de dano que pode ser
reparado por recombinação é a dupla quebra das fitas de DNA (DSB), que é a principal ameaça
para a integridade genômica das células (Figura 5). As DSBs podem ser geradas por processos
celulares normais, tais como recombinação, enzimas de restrição bem como por agentes
endógenos e exógenos que causam danos no DNA, tais como estresse oxidativo, radiação
ionizante e luz UV. Quebras de DNA dupla fita podem resultar em fragmentação cromossômica,
translocação e remoção. A persistência do dano ou a reparação incorreta pode resultar na
instabilidade genômica (Ries et al., 2000). Há dois caminhos envolvidos na reparação de duplas
fitas de DNA: a recombinação homóloga, que garante o reparo correto, e a não homóloga, que
está sujeita a erro (Game, 2000).
Figura 5. A reparação de quebras da fita dupla em DNA. Quebras de dupla-fita podem resultar da exposição à
radiação ionizante, dano oxidativo e a quebra espontânea da coluna-fosfato da molécula do DNA. Suas reparações
podem ser efetuadas por uma nova junção dos terminais quebrados (esquerda) ou por recombinação homóloga com
uma molécula irmã (direita). Ambos os processos envolvem diferentes complexos de multi-proteínas. Modificado a
partir de Friedberg (2003).
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2.4.6 Resposta SOS
Quando as células são expostas a condições de estresse elevado, como exposição à radiação
ou altas doses ou concentrações de um agente mutagênico, um sistema peculiar atua: a reparação
sujeita a erro como conseqüência da resposta SOS. A função desse sistema é impedir que a
replicação seja interrompida pelo bloqueio que as várias lesões localizadas na cadeia molde
exercem sobre a atividade catalítica da DNA polimerase. Se esta paralisação ocorrer, há a
produção de cadeias com descontinuidade correspondentes a vários nucleotídeos e, se essas
lesões não forem corrigidas a tempo, a célula morre. Para evitar a morte, a alta precisão da
replicação deixa de ser prioritária e as enzimas envolvidas no sistema de reparação sujeita a erro
adicionam nucleotídeos, com baixa especificidade, frente às lesões. Esse processo é denominado
síntese translesão. A síntese translesão pode ser tanto livre de erro como passível de erros
(mutagênico). Este mecanismo ainda não está demonstrado em células eucariontes, embora já
esteja muito bem documentado em bactérias (Soares Neto e Menck, 2001). A ativação deste
sistema em células da bactéria Escherichia coli envolve inicialmente a ativação da proteína
RecA, que tem a função de clivar a proteína repressora LexA. Assim cerca de quarenta genes são
ativados disparando uma resposta fisiológica protetora do material genético, garantindo a
sobrevivência bacteriana (Fernandez de Henestrosa et al., 2000; Courcelle et al., 2001). Alguns
destes genes estão envolvidos na reparação por excisão de nucleotídeos e na recombinação de
DNA.
2.5 Reparação de Lesões no DNA de S. cerevisiae
Em leveduras, os estudos dos mecanismos de reparação de lesão no DNA foram iniciados
com o isolamento de uma série de mutantes sensíveis aos efeitos da radiação UV (Nakai e
Matsumoto, 1967; Resnick, 1969) e radiações ionizantes (Resnick, 1969). Os genes requeridos
para reparação de danos provocados por radiação UV foram identificados por Cox e Parry
(1968), que definiram 22 grupos de complementação, correspondentes a 22 loci genéticos
independentes, sugerindo a presença de múltiplas vias para a reparação de lesões induzidas por
radiações UV. Estes mutantes foram denominados mutantes rad. Estudos de interações do tipo
epistático e sinergístico determinaram três grupos genéticos denominados pelo locu mais
representativo que regulam a reparação de lesões: o grupo RAD3, envolvido na reparação por
excisão, o grupo RAD6, necessário para a reparação pós-replicação, e o grupo RAD52,
envolvido em mecanismos semelhantes à recombinação (Game e Cox, 1973; Game e Mortimer,
1974). Esta classificação tornou evidente que mutantes rad apresentam sensibilidade a outros
agentes, demonstrando a complexidade de interação dos mecanismos de reparação dependendo
do tipo de lesão.
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2.5.1 Grupo RAD3
Os mutantes do grupo epistático RAD3 demonstram uma sensibilidade variável à luz UV que
caracteriza uma deficiência no sistema REN (Friedberg, 1988). O sistema REN, bastante
conservado ao longo da evolução, é capaz de remover uma diversidade de lesões que causam
distorções estruturais significativas no DNA, incluindo remoção de ligações cruzadas internas
entre fitas, fotoprodutos induzidos por UV e adutos químicos (Seroz et al., 2000).
As proteínas do grupo RAD3 formam um complexo que atua no processo de reparação de
excisão e na recombinação mitótica. A proteína Rad1 tem função de nuclease, removendo
regiões não homólogas terminais 3’ de moléculas recombinantes de DNA, semelhante ao da
excisão de dímeros de pirimidina durante a reparação por excisão em bactérias (Fishman-Lobell
e Haber, 1992; Bardwell et al., 1993; Siede et al., 1993). A proteína Rad3 apresenta uma função
de helicase 5’- 3’ que age em DNA fita dupla e híbridos de DNA-RNA (Sung et al., 1992;
Deschavanne e Harosh, 1993). A proteína Rad3 está também envolvida em diferentes complexos
multiprotéicos relacionados com metabolismo do DNA, REN, correção pós-replicação, iniciação
da transcrição e replicação do DNA (Friedberg et al., 1991). Já a proteína Rad10 liga-se às
seqüências de DNA de cadeia simples e acelera a renaturação do DNA (Sung et al., 1992). A
proteína Rad14 está envolvida no processo de incisão em leveduras (Prakash et al., 1993),
reconhecendo lesões no DNA por conter regiões de ligação ao DNA de cadeia simples e dupla,
com particular afinidade por DNA irradiado com UV de 254 nm (Bankmann et al., 1992;
Banerjee e Zhang, 2003). A proteína Rad25 contém motivos conservados entre duas
superfamílias de DNA e RNA helicase que são essenciais para sua função, daí o motivo de ser
também conhecida como helicase (Park et al., 1998). O gene RAD25 é alelo de SSL1, o qual foi
descrito como envolvido no metabolismo de RNA. Desta forma, a proteína Rad25/Ssl1 está
envolvida no processo de regulação gênica ao nível de transcrição (Gulyas e Donahue, 1992).
2.5.2 Grupo RAD6
As proteínas do grupo de epistasia RAD6 compõem a mais complexa e menos compreendida
das vias de reparação em S. cerevisiae. Mutantes deste grupo apresentam uma variada
sensibilidade a diferentes agentes químicos e físicos (Friedberg et al., 1991), apesar de não serem
deficientes em reparação por excisão de nucleotídeos (Reynolds e Friedberg, 1981). Estes
mutantes apresentam uma redução ou bloqueio na freqüência de mutação espontânea ou induzida
por diversos agentes (Lawrence et al., 1982). O grupo RAD6 por ter estas características foi
definido como uma via responsável pela reparação mutagênica ou reparação sujeita a erros.
Alguns destes mutantes apresentam alterações nas freqüências de recombinação meiótica e
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mitótica e na esporulação (Montelone et al., 1981). O gene RAD6 codifica uma proteína
conjugadora de ubiquitina (Jentsch et al., 1987), que promove modificações na atividade de
enzimas que participam da mutagênese induzida (Sung et al., 1990).
Em leveduras, a reparação pós-replicação (Post Replication Repair – PRR) do DNA e o
mecanismo de mutagênese são dependentes dos genes RAD5 (REV2), RAD6 (UBC2), RAD18,
REV1, REV2 e REV7 (Friedberg et al., 1995). A proteína de ligação Rad18 (Bailly et al., 1994) e
a enzima conjugada de ubiquitina de Rad6 (Jentsch et al., 1987), que são requeridas tanto para o
PRR como para mutagênese, formam um complexo estável (Bailly et al., 1997a; Bailly et al.,
1997b). O gene REV2 (RAD5) codifica uma proteína que apresenta uma seqüência conservada
presente em várias helicases e domínios de ligação dedo de zinco como também uma atividade
ATPase DNA dependente (Johnson et al., 1992; Johnson et al., 1994). O produto do gene REV3
apresenta alta similaridade a várias DNAs polimerases eucarióticas não essenciais para a
viabilidade celular, sugerindo ser seu produto protéico uma DNA polimerase que atua no
processo de síntese translesão (Morrison et al., 1989; Nelson et al., 1996). Portanto, a PRR e o
mecanismo mutagênico em S. cerevisiae dependem de uma polimerase especializada e, portanto,
de um mecanismo capaz de remover blocos de replicação no DNA ao custo do aumento de
mutações (Prakash et al., 1993).
2.5.3 Grupo RAD52
Os dez mutantes que fazem parte do grupo RAD52 (Rad50, Rad51, Rad52, Rad54, Rad55,
Rad57, Rad59, Rfa1, Mre11 e Xrs2) são sensíveis às radiações ionizantes (IR) (Petes et al., 1991;
Game, 1993; Friedberg et al., 1995; Bai e Symington, 1996; Hays et al., 1998). Os produtos dos
genes do grupo RAD52 estão concomitantemente envolvidos na reparação de dupla quebra da
fita de DNA (DSB), bem como em recombinação mitótica e meiótica (Petes et al., 1991; Game,
1993). Vários mutantes foram isolados pelo defeito nos processos de recombinação, associados
ou não com reparação, mas nenhum destes mutantes é completamente bloqueado nos diferentes
tipos de recombinação. Isto indica a presença de diferentes mecanismos que controlam os
diferentes eventos de recombinação (Petes et al., 1991). Em S. cerevisiae, o gene RAD52 é
essencial para recombinação homóloga eficiente (Bai e Symington, 1996). Sua conservação na
estrutura primária e propriedades bioquímicas são bastante grandes, desde leveduras a
eucariontes superiores como os humanos, tornando-o o marcador mais freqüentemente usado
para definir o processo de recombinação homóloga (Sung et al., 2000; Shen et al., 1996).
Bioquimicamente, a proteína Rad52 demonstra ligar-se a DNA de fita dupla e simples, com uma
preferência por terminais de DNA (Mortensen et al., 1996; Parsons et al., 2000). O RAD52
também favorece a ligação física entre o complexo protéico RP-A de ligação a DNA fita simples
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e a proteína Rad51, sua homóloga (Hays et al., 1998). Os membros deste grupo também
codificam para proteínas que estão na etapa de recombinação central e inicial. As proteínas
Rad55p e Rad57p têm demonstrado participar em pareamento de DNA (Sung, 1997), mas
parecem apenas auxiliar as proteínas Rad51p, Rad52, Rad54p. Em S. cerevisiae foram
identificados homólogos ao gene de E. coli RecA pertencentes ao grupo RAD52. São os genes
RAD51 (Shinohara et al., 1992), RAD55 (Lovett, 1994) e RAD57 (Kans e Motimer, 1991), que
são expressos em células mitóticas e meióticas (Mcdonald e Rothstein, 1994; Rattray e
Symington, 1995; Sugawara et al., 1995).
2.6 Regulação da expressão de genes de reparação
Vários genes de reparação em S. cerevisiae são induzidos em resposta a agentes que
danificam o DNA, tais como RAD2, RAD7, RAD18, RAD23, RAD51, RAD54, PHR1 e MAG1,
bem como genes envolvidos no metabolismo do DNA e em modificações protéicas, tais como
RAD6, RNR1, RNR2, RNR3, CDC9, POL1 e UBI4 (Friedberg et al., 1995). Adicionalmente,
quatro genes DIN (Damage Inducible) e seis genes DDR (DNA Damage Responsive) foram
identificados (Mcclanahan e Mcentee, 1984; Ruby e Szostak, 1985). A indução de tais genes
depende da ação de um grupo de elementos regulatórios presentes nas regiões promotoras (cisregulatory elements), dos quais os mais estudados são aqueles dos genes RAD2 e RNR2. O
promotor do gene RAD2 contém duas seqüências ativadoras a montante, conhecidas como
elementos DRE1 (TTAAAGGGATTGAAA) e DRE2 (GTGGAGGCATTAAAA) (Damage
response element), essenciais para a indução a partir de danos no DNA (Siede e Friedberg,
1992). O promotor do gene RNR2 contém três elementos Upstream Activator Sequence (UAS),
um dos quais é reconhecido pela proteína Rap1p, e um elemento repressor Upstream Repressor
Sequence (URS) (Elledge e Davis, 1989).
O gene SNM1 (PSO2), que pertence à via de reparação por excisão de nucleotídeos (grupo
RAD3), atua na reparação de lesões causadas por agentes intercalantes do tipo bifuncionais
(Henriques e Brendel, 1990). A expressão deste gene é induzida por estes agentes, além de
radiação ultravioleta (Wolter et al., 1996). Remoções seriais na região promotora deste gene
demonstraram que uma seqüência de 15 pares de bases homólogas ao elemento DRE2 do gene
RAD2, (GGAAACGGACTGAAA) é essencial para a indução de SNM1 (Wolter et al., 1996).
Seqüências similares ao elemento DRE2 têm sido encontradas em outros genes envolvidos na
reparação de lesões no DNA e no metabolismo de síntese de nucleotídeos (Siede e Friedberg,
1992). Como a expressão do gene SNM1 é bastante controlada em células de levedura, este
oferece uma excelente plataforma para o estudo de circuitos regulatórios que podem ser preditos
por ferramentas computacionais utilizadas para análise de genômica funcional.
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2.7 Ferramentas Computacionais e Fatores de Transcrição
A finalização do seqüenciamento genético de S. cerevisiae trouxe uma nova visão da
arquitetura genética em termos de redes regulatórias, especialmente pelo desenvolvimento de
ferramentas computacionais. Isto tem possibilitado a identificação de novos elementos cis com
base na comparação com elementos regulatórios conhecidos, permitindo o desenvolvimento de
novos algoritmos de predição de motivos na seqüência de DNA (Tavazoie et al., 1999). Isto
consiste na habilidade de reconhecer padrões de seqüências de nucleotídeos por algoritmos
combinatórios baseados em sistemas de busca utilizando a codificação IUPAC (International
Union of Pure and Applied Chemistry). Contudo, matrizes de distribuição de nucleotídeos
parecem ser mais precisas por conferir um valor de qualidade àquela posição da seqüência que
está sendo analisada, enquanto que buscas diretas do tipo IUPAC baseiam-se na decisão “tudoou-nada”. Um destes métodos matriciais é o algoritmo MatInd, o qual cria uma biblioteca de
padrões-consenso com uma matriz de descrição a partir de pequenas seqüências geradas pela
análise em IUPAC (Quandt et al., 1995). Esta matriz gerada pode ser posteriormente utilizada
para localizar padrões em outras seqüências a partir do uso de uma segunda ferramenta MatInspector (Quandt et al., 1995), buscando homologias em bancos de dados de elementos
regulatórios, do tipo TRANSFAC (Transcription Factor Database) (Wingender et al., 2000), o
YPD (Yeast Promoter Database) (Cold Spring Harbor Lab., USA), o DBM (DNA Binding
Motifs (Hughes et al., 2000) e o PBS (Promoter Binding Sites) (Tavazoie et al., 1999), entre
outros.
A literatura recente aponta na direção do uso de ferramentas computacionais como forma de
inferir informação a partir de dados genômicos. Alguns exemplos de trabalhos baseados na
análise computacional para identificação de seqüências reconhecidas por fatores de transcrição
são apresentados a seguir.
Hughes et al. (2000) desenvolveu um método de identificação de elementos regulatórios em
cis associados a diferentes grupos de genes com funções relacionadas em S. cerevisiae, baseado
na ferramenta de alinhamento AlignACE (http://atlas.med.harvard.edu/). Aliada a esta
ferramenta, o TRANSFAC, desenvolvido pelo grupo do BIOBASE Biological Databases do
Instituto de pesquisas GBF (Research Group Bionformatics) da Alemanha, foi desenvolvido
como um banco de dados de fatores de transcrição que modela vias regulatórias de forma
automática (Wingender, 2002). Ettwiller et al. (2003) enfocam a descoberta de elementos cisregulatórios usando informação acerca de interações proteína-proteína ou de redes metabólicas
com dados genômicos de S. cerevisiae. O método usado também é baseado na análise in silico.
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Um dos maiores desafios que se segue ao seqüenciamento de genomas é desvendar redes
regulatórias de expressão de genes. A predição in silico de sítios regulatórios potenciais será
fundamental neste processo, pois permitirá a modelagem de interações proteína-DNA que serão
testadas experimentalmente. Este trabalho segue a linha de pesquisa in silico propondo
identificar padrões de seqüências regulatórias em regiões promotoras do genoma da levedura S.
cerevisiae, tendo como base um motivo de 15 pares de base presente na região promotora do
gene SNM1, o qual é homólogo ao elemento DRE2 do gene RAD2 (Wolter et al., 1996). As
seqüências homólogas identificadas neste trabalho sugerem que esta seqüência também está
envolvida na regulação de vários outros genes da levedura.
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
4 Manuscrito
Análise in silico de uma matriz DRE na seqüência promotora de genes da
Levedura Saccharomyces cerevisiae
Manuscrito a ser enviado para a revista DNA Sequence
(Taylor & Francis Group Publishers, Cambridge, UK. ISSN Print 1042-5179)
37
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
In silico analysis of a DRE-matrix motif in the promoter sequences of the
yeast genome
Running title: In silico analysis of a DRE-matrix motif in yeast genes
Walkiria Luckwu de Santana Silva1, Andre Ricardo de Oliveira Cavalcanti3#, Katia Silva
Guimarães1 and Marcos Antonio de Morais Jr2*
1
Centro de Informática and 2Departamento de Genética 3Departamento de Química Fundamental,
Universidade Federal de Pernambuco. Brazil.
Corresponding author:
Departamento de Genética - UFPE
Av. Moraes Rego, s/n, 50732-970 Recife, PE, Brasil.
Tel: +55 81 21268569 Fax: +55 81 21268522 E-mail: [email protected]
#Present address:
Department of Chemistry, University of Princeton, USA.
38
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Abstract
We report an in silico analysis to identify a nucleotide sequence motif in DNA repair genes
that may define a binding site for regulatory proteins during the induction of those genes by the
presence of mutagens. The DRE-matrix weight matrix generated in this analysis was used to
search for homologous sequences in the promoter region of all genes (including putative gene
and hypothetical ORFs) in the Saccharomyces Genome Data Base (SGD). The results
demonstrated that over one third of the yeast genes presented at least one 15-bp sequence in their
promoter region with 85% or more of similarity to the DRE-matrix consensus sequence. The
presence of that sequence in the promoter region of regulatory genes and its high similarity to
other well reported DNA binding sites pointed out for its involvement in general regulation of
yeast genes.
Key words: DNA binding site, DNA repair, Gene promoter, Transfac, weight matrix.
39
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Introduction
Exposure to DNA-damaging agents can increase DNA repair capacity and activate cell-cycle
checkpoints. Cells might respond to specific damages to their genetic material by activating a
cascade of genes involved in cell cycle control and DNA replication (Friedberg, 1991). By
arresting cell cycle at specific checkpoints, erroneous DNA replication and segregation are
avoided (Friedberg, 1991). A variety of Saccharomyces cerevisiae genes transcript levels are
increased in response to DNA-damaging agents including DNA repair genes, such as RAD2,
RAD7, RAD18, RAD23, RAD51, RAD54, PHR1 and MAG1, as well as genes involved in DNA
metabolism and protein modification, like RAD6, RNR1, RNR2, RNR3, CDC9, POL1 and UBI4
(Friedberg, 1991). Moreover, four Damage Inducible (DIN) and six DNA Damage Responsive
(DDR) genes have been so far identified (McClanahan et al, 1984; Ruby and Szostak, 1985). The
induction of such genes is dependent on the presence of a set of cis-regulatory elements in their
promoter region, as it has been shown by detailed studies of RAD2 and RNR2 gene promoters
(Friedberg, 1991). The promoter region of the RAD2 gene contains two Upstream Activation
Sequence (UAS) elements, known as Damage Responsive Elements 1 (DRE1) and 2 (DRE2),
essential for DNA-damage induced expression (Siede and Friedberg, 1992). The RNR2 promoter
contains three UAS elements, one of which binds the Rap1p, and one Upstream Repressor
Sequence (URS) element (Elledge and Davis, 1989).
Besides the presence of those cis-regulatory elements in gene promoters, sensor proteins are
essential to keep DNA integrity along the cell cycle. Kiser and Weinert (1996) demonstrated that
three checkpoint genes have strong and distinct roles in transcriptional induction in four distinct
pathways of regulation (each defined by induction of specific genes). Their study helped
formulate a working model of checkpoint gene regulation in response to different types of DNA
damage, which has been schematically described by Lowndes and Murguia (2000). In brief,
upon the presence of pre-replicative bulk-lesions or double-strand breaks generated by exposure
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
to mutagenic agents, parallel upstream sensor mechanisms are activated and both transcription
and cell cycle are arrested. As a consequence, specific DNA binding proteins are activated by
effector proteins through different modification mechanisms, e.g., phosphorilation, and bind to
their target genes in the UAS or URS elements. Therefore, cell cycle and some metabolic genes
are repressed, while DNA repair, DNA metabolism and other metabolic genes are induced.
Recently, microarray analyses have been employed to survey the whole genome in order to form
a complete picture on the cellular responsiveness to DNA injuries (Jelinsky et al, 2000; Gasch et
al, 2001). However, it seems that the search for such inducible genes is far from complete.
The SNM1/PSO2 gene belongs to the excision repair pathway (RAD3 pathway) and its
product is involved in the repair of interstrand DNA cross-links caused by bifunctional
mutagenes (Henriques and Brendel, 1990). This gene was shown to be induced by cross-linking
agents, as well as by ultraviolet light (Wolters et al, 1996). Serial deletions in the SNM1 gene
promoter region showed that a 15-bp sequence homologous to the RAD2, DRE2, was essential
for the SNM1 inducibility (Wolters et al, 1996). Sequences similar to DRE2 have been found in
other genes involved in DNA repair and nucleotide synthesis (Siede and Friedberg, 1992). Since
the SNM1 gene expression seems to be tightly controlled in yeast cells by the presence of DNA
lesions, it may offer a good platform to study the DNA repair regulatory circuitry that can be
predicted by functional genomics and computational tools.
Similarly to SNM1 (Wolters et al, 1996), deletion of the DRE-like present at the MAG1 gene
promoter decreased five times the level of mutagen induction gene expression (Xiao et al, 1993).
This result supports the cis-regulatory function of the 15-bp sequence found in some DNA repair
genes.
Computational analysis of the promoter region of the yeast genes was performed aiming to
identify base sequence patterns that could be targeted by activator or repressor proteins in
response to DNA damage. We used DRE1 and DRE2 motifs found in some well-known DNA
repair genes, such as RAD2 and SNM1, to identify a DRE-like motif in a variety of related and
41
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
unrelated DNA repair genes. It was shown that the DRE-like motifs can be found in almost one
third of the yeast promoters and it has homology to other protein binding motifs described in the
literature. Those results suggest that the DRE-like motif found may be involved in a broader
mechanism for basic transcription in yeast.
Materials and Methods
A. Matrix sequence preparation
The DRE-like sequences in the promoter region of genes SNM1, RAD2, PHR1, RAD18,
RNR3, RAD23 and RAD7 have been described (Wolters et al, 1996) as essential for the
expression of those genes. Those sequences were pairwise aligned by using the MegAlign tool in
DNAStar software package (DNAStar Inc., USA) to identify a consensus sequence. In parallel, a
set of sequences containing the –1000 bp upstream region of other yeast genes described as
related to repair in the Saccharomyces Genome Database (SGD) (www.yeastgenome.org) was
selected. That set and the consensus sequence were used as input to Clustal-W
(http://clustalw.genome.ad.jp/), yielding several 15 bp sequences similar to consensus, the ten
highest scored of which were chosen to produce a new set with the seven original sequences.
This new set was then used to generate a weight matrix by using GEMS (Genome Exploring and
Modelling Software) Launcher (www.genomatix.de/). The matrix generated was first checked
against the whole yeast genome and produced a random expectation of 0.12 matches per 1000
nucleotides. Further, the matrix was used to scan the –500 bp upstream region of the yeast genes,
with core similarity of 0.9, and optimised matrix similarity in MatInspector Professional, that
uses TRANSFAC – The Transcription Factor Database (Quandt et al, 1995; Wingender et al,
2000). The sequences resulting from the search were re-analyzed by increasing the core
similarity to 0.95 and 1.00, to estimate the degree of conservation.
42
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
B. Gene annotation and DNA binding motifs analysis
The genes matching the matrix sequence were first grouped according to their metabolic
families by using MIPS (http://www.mips.biochem.mpg.de/) and YPD (http://www.
proteome.com/database/YPD). The gene clusters and DNA binding motifs used were the ones
available on-line in the web sites: http://arep.med.harvard.edu/network_discovery/ (Tavazoie et
al, 1999) and http://cgsigma.cshl.org/jian/ (zhu and zhang, 1999). The microarray data from
mutagen-treated cells used is the one available at http://www.hsph.harvard.edu/geneexpression/
(Jelinsky et al, 2000) and at http://www-genome.stanford.edu/Mec1/ (Gasch et al, 2001).
Results
A. Identification of DRE-matrix element in yeast DNA repair genes
The DRE-matrix produced has International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC)
code sequence GKRRAKGNATTGAAA (see other details in Fig. 1).
Upon scanning the –500 bp sequence of the yeast genome, many genes were found to contain
at least one DRE-matrix sequence with complete conservation in the core sequence TGAAA at
the 3’ end (Table 1). Other nucleotides also seem to be conserved, which include G at position 1,
A at position 5, G at position 7 and the dinucleotide AT just before the core. All genes identified
in Table 1 were induced by at least one mutagen agent according to microarray data produced by
Jelinsky et al. (2000). However, the induction level and the nature of the mutagen were diverse.
In the search for homologous sequences in the –500 bp promoter region of the genes in SGD,
a total of 1645 matches were identified with at least 85% matrix similarity and with 100%
similarity to the core TGAAA. The term “gene” is used henceforth in this paper to refer to
43
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
identified and putative genes, and in some cases even hypothetical ORFs described in the SGD
web site. Interestingly, two matches were found in the promoter region of YER041w (YEN1
gene) and YEL018w, which have been described as putative DNA repair genes. Those ORFs
were induced upon treatment with MMS and with 4-NQO (Table 1). Moreover, YER041w
(YEN1 gene) presented two DRE-matrix elements in its promoter region (Table 1). The
MatInspector result suggests that this element may be widespread in the promoter regions of the
yeast genome, comprising a third of the total genes described in the SGD.
When the matrix similarity threshold was increased to 95%, the number of matches
substantially decreased to 15 (Table 2). Besides SNM1/PSO2, NIF3 was the only gene in this
group involved in some type of DNA metabolism. Six of the 15 genes were not induced by any
mutagen treatment, including the glutamate 5-kinase encoding PRO1 gene that contains a
complete DRE-matrix consensus sequence (Table 2). This result indicates that, despite its
function in SNM1 gene induction, this element may act as an accessory regulatory element for
other genes.
Additionally, the SNZ1 gene was the only match containing four DRE-matrix elements and it
was one of the most mutagen-induced genes described by Jelinsky et al. (2000), with an
induction factor of 81.8 after MMS treatment. This gene is induced in response to nitrogen
limitation and growth arrest, and its protein product forms a complex with Sno1p with glutamine
amidotransferase activity (Dong et al, 2004). Another 20 matches were found to contain three
DRE-matrix elements presenting from 85% to 95% matrix similarity and none of them was
directly involved in DNA repair (data not shown). Three ORFs containing three DRE-matrix
elements in our analysis have not been induced by any mutagen tested: YLR060W
(phenylalanyl-tRNA synthetase), YLR224W (hypothetical protein) and YLR059C (putative 3’5’exonuclease). Therefore, there was not an exact correlation between the presence or number of
DRE-matrix elements and the gene inducibility by a mutagenic agent.
44
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
It was also possible to identify 19 transcription factor-encoding genes containing highly
homologous DRE-matrix elements in their promoter regions, 15 of which were induced by some
kind of DNA-damage treatment (Table 3). Also most of them encode subunits of the so-called
basal transcription complex, which binds to the TATA box or stands the RNA polimerase
complex at the initiation site during initiation of transcription. Additionally, DRE-matrix
elements were identified at the promoter region of genes encoding specific transcription factors,
such as Gal4p, Leu3p and Gcr3p (Table 3). Therefore, the presence of DRE-elements in the
promoter region of regulatory genes may support the idea of the complex inter-connection of
metabolic networks.
B. Homology between the consensus sequence and known yeast DNA binding sites
Searching for homologous sequences was performed in the Saccharomyces cerevisiae
Promoter Database (SCPD) using the consensus sequence and admitting six possible
mismatches, which correspond to the five ambiguous nucleotide positions in the matrix
GNRRAKGNATTGAAA plus one mismatch at any of the other positions. A total of sixteen
transcriptional factor binding sites were identified by this analysis (Table 4). The Heat Shock
Element (HSE) controls the stress response of several yeast genes encoding heat shock proteins
by binding the Heat Shock transcription Factor, HSF (Sakurai and Fukasawa, 2001). All HSP
genes were induced by mutagenic agents (Jelinsky et al, 2000), with the exception of the HSEcontaining CUP1 gene that is repressed by mutagenic treatment (Jelinsky et al, 2000).
A closer homology was also observed between the consensus sequence and the Stress
Response Element (STRE) that is present at the promoter region of the DDR2 gene (Table 4).
This gene is induced by a variety of mutagenic treatments as well as by heat shock, but the
function of its protein product is still unknown (Treger et al, 1998). A computer generated
pattern also identified a STRE motif for DDR48 gene (Treger et al, 1998). Therefore, we further
performed sequence alignment of the DDR48 gene promoter and identified the presence of the
45
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
homologous element 5’-GGCCAGCACCGGAAA-3’ at the position –318 to -304 at the Crick
strand. As the third member of this group, the polyubiquitin encoding gene UBI4 is induced in
response to a variety of environmental stresses, such as mutagenic treatment and heat shock, due
to the presence of both Heat Shock Element (HSE) and Stress Response Element (STRE) in its
promoter region (Simon et al, 1998). Direct alignment analysis with the consensus sequence
identified the sequence 5’-TAAAAAAGATTGAAC-3’ (conserved nucleotides underlined) at
positions –301 to –315 in the promoter region of the STE12 gene, which encodes a transcription
factor involved in pheromone and pseudohyphal growth signal transduction pathways.
Discussion
The homology-based searches in the promoter regions of the whole yeast genome using a
consensus sequence built upon DRE-matrix sequences led to intriguing results. First it showed
that not all DNA repair genes containing a DRE-matrix element was induced by a mutagen
tested by Jelinsky et al (2000). Obviously, their induction by another mutagen not yet tested
cannot be discarded. However, we are considering this absence of induction as a characteristic
for our analysis. Microarray analysis has revealed intriguing facts in terms of gene regulation.
From 12 genes with significant induction in microarray profile for all mutagen tested only RNR3
is involved in DNA metabolism (Jelinsky et al, 2000). Additionally, it has been demonstrated
that the expression of FUR4 gene was increased by the presence of galactose in the medium,
despite the fact that its promoter region does not contain any Gal4p consensus-binding site. On
the other hand, it has been identified some yeast genes containing Gal4p binding site that were
not induced by galactose (Ren et al, 2000). Therefore, we cannot discard the possibility that our
DRE-matrix sequence is involved in some kind of gene expression regulation. This suggests that
the simple presence of a DRE-matrix sequence alone may not be enough indicator for gene
induction by DNA-damage agents, although its presence has been essential for SNM1/PSO2
(Wolters et al, 1996) and MAG1 (Xiao et al, 1993) gene induction. Ren et al (2000) and Iyer et
46
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
al (2001) have indicated the need for additional empirical data combined and perhaps improved
search algorithms in order for investigators to accurately predict genuine binding sites. DNA
binding activity associated with gene regulation is a complex mechanism that requires protein
association with different binding partners that generate a new binding preference.
Tavazoie et al (1999) has proposed transcriptional regulatory networks based on clustering
yeast genes according to the presence of putative cis-regulatory elements in their promoter
regions. In that work, the STRE is more frequent in genes belonging to cluster 8, which is rich in
genes of the carbohydrate and TCA metabolism. Intriguingly, the only genes in our analysis
belonging to Tavazoie’s cluster 8 are RAD14 and UBI4, and no other stress or DNA damage
responsive genes. Genes involved in DNA synthesis and replication, cell cycle control and
mitosis, recombination and DNA repair were allocated in cluster 2, while genes responsive to
stress and involved in cell rescue, defense and cell death were allocated in cluster 5 (Tavazoie et
al, 1999). Gene cluster 2 is characterized by the presence of sequence motifs called MCB and
SCB, and in less extension M13 motif, that were all also recognized as homologous to DREmatrix motif (Table 4). The presence of MCB binding sites was reported to confer irradiationreplication specific regulation of many DNA repair genes (Mercier et al, 2001). Genes of cluster
5, to which MAG1 and RAD10 DNA repair genes belong, also contain mainly M13 motifs
(Tavazoie et al, 1999). The nucleotide sequence recognised by the Adr1p transcriptional factor,
which was homologous to the DRE-matrix motif (Table 4), are part of the M13 and M13s motifs
that contains the pentanucleotide TGAAA. On the other hand, the binding site for Dal82p and
Abf1p do not represent any motif proposed by Tavazoie’s work. From all the genes regulated by
Adr1p, Dal7p or Abf1p, only ADH2 was induced by mutagenic treatment (Jelinsky et al, 2000).
Similarly, Ettwiller et al (2003) combined information from metabolic networks with genome
information to predict cis-regulatory elements in yeast promoters. Their analysis produced 42
motifs, and the Motif 19 showed similarity to our DRE-matrix motif. This Motif 19 was not
47
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
recognized as a well known motif that binds transcription factor in yeast, which argues for the
possibility that it represents a new binding site for regulatory proteins.
In an attempt to describe a new method for identification of regulatory sequences, Harrison
and DeLisi (2001) identified the consensus sequence for binding the Ste12 transcription factor by
their anchor motif generation method as being AWGAAA, which was close to those described in
TRANSFAC (ATGAAC) and in the SCPD (ATGAAA). Indeed, this sequence was highly
homologous to the core sequence of our DRE-matrix matrix (ATGAAA). (Errede and Ammerer,
1989). Therefore, it is also involved in cell cycle control similar to other genes and binding
motifs described in Table 4.
The sequence homology found between our DRE-matrix motif and the previously identified
regulatory motifs, either experimentally or by in silico analysis, suggests that they belong to a
family of regulatory elements. The differences in nucleotide positions within the elements of the
family, generated by point mutations during the evolution of the yeast, might be responsible for
the differences in binding to different transcription factors. The lack of complete correlation
between the presence of DRE-matrix motif and the gene induction, together with the presence of
conserved and non-conserved base pair substitution and the homology between DRE-matrix
motif and known regulatory motifs, reveals that the regulatory circuit is even more complex and
involves a fine balance among the presence of a certain regulatory element, the affinity of a
certain or a group of regulatory proteins, and the physiological state of the cell. Small changes in
binding sites, such as base pair substitutions, should affect the binding constant of regulatory
proteins to the promoters of their target genes. This suggests that variations of the consensus
sequence that are not easily recognized by search algorithms may also serve for binding, or that
the factor of interest is modified or associated with binding partners that generate a new binding
preference (Hughes et al, 2000).
The In silico analysis of the promoter regions in the Saccharomyces cerevisiae genome
showed that a consensus sequence based on DRE-matrix sequences can actually be found in one
48
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
third of the genes in SGD. Moreover, all twenty genes found to have three occurrences of that
consensus sequence in their promoter regions did not have a reported direct involvement in DNA
repair. Those results suggest that the consensus sequence found may be involved in a broader
mechanism for basic transcription in yeast.
The consensus sequence found also presents reasonable homology with several
transcriptional factor binding sites, suggesting that small changes in binding sites should affect
the binding constant of regulatory proteins to the promoters of their target genes, while eluding
comparison-based search algorithms.
A new approach should focus on the search for proteins that bind to the motifs analyzed here
in order to identify a pattern of amino acids-nucleotide interactions and the differences in their
affinity constants. It could reveal the possibility of cross-binding reaction between different
transcription factors and DNA binding motifs according to the metabolic moment of the cell.
Acknowledgements
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Legend to Figure
Figure 1. Matrix sequence output by MatDefine from GEMS Launcher suite v3.6 using DREmatrix elements identified from yeast DNA repair genes. Capital letters in DNA sequence
represent nucleotide positions with high consensus index score (Ci-value > 60) as indicated by
MatInspector. Ci-values are shown above the gray bars.
53
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
100
100
86
90
Consensus Index
80
100 100
86
72
70
58
60
55
55
50
40
30
20
29 29
25
29
32
16
10
0
g k r r a k g n a t Tg AAa
Matrix sequence
54
Gene/SGD Access
Biological Functiona
Upstream
DNA
Matriz
Positionb
strandb
similarityc
Sequence (5’-3’)
Induction
factord
Strand-break repair protein
213-227
(-)
0.852
GGCAAAGC CGTGAAA
2.5 (BCNU)
PSO2/YMR137C
ICL repair protein
384-398
(+)
0.957
GGAAACGG ACTGAAA
3.4 (8-MOP)e
MGT1/YDL200C
O6-Methyltransferase
182-196
(-)
0.862
TCAGATGT AATGAAA
3.3 (MMS)
RAD16/YBR114W
NER protein
482-496
(+)
0.906
GTGTACCA ACTGAAA
3.4 (t-BuOOH)
RAD18/YCR066W
Error-prone repair protein
22-36
(-)
0.924
GAAAAGAA AATGAAA
2.9 (MMS)
RAD23/YEL037C
NER protein
207-221
(+)
0.907
GTGGCGAA ATTGAAA
2.5 (BCNU)
YEN1/YER041W
Weak similarity to Rad2p
93-107
(-)
0.872
TCAGAGGT AATGAAA
432-446
(+)
0.905
GTCCATCC AATGAAA
EAF5/YEL018W
Weak similarity to Rad50p
39-53
(+)
0.850
GAGGATTG TTTGAAA
a
3.3 (MMS)
2.5 (4NQO)
GKRRAKGN ATTGAAA
ICL: inter-strand cross link; NER: nucleotide excision repair.
Upstream nucleotide position relative to +1 and Watson (+) or Crick (-) strands relative to SGD.
c
DRE-matrix sequence similarity relative to the matrix.
d
Microarray data published by Jelinsky et al (2000), considering the highest induction value with a specific mutagen in brackets.
Abbreviations: MMS (methyl metanosulfonate), BCNU (1.3-bis-2-chloroethyl-1-nitrosourea), t-BuOOH (tert-buthyl hydroperoxide), 4-NQO
(4-nitroquinoline 1-oxide) and 8-MOP (8-methoxypsoralen).
e
Data from Wolters et al. (1996) using SNM1-lacZ fusion.
f
Highly conserved nucleotide sequences are in bold. Ambiguous codes are according to IUPAC: N (any), R (A or G) and K (G or T).
b
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
RAD50/YNL250W
Matrixf
Silva, W.L.S
Table 1. Computational analysis of DNA repair genes from S. cerevisiae identified by MatInspector algorithm containing DRE-matrix elements
in their promoter regions.
55
DNA
Matrix
position
strand
similarity
ICL repair protein
384-398
(+)
0.957
GGAAACGG ACTGAAA
3.4 (8-MOP)e
PAC11/YDR488C
Required in the absence of Cin8p
479-493
(+)
0.952
GAAGAAGG ATTGAAA
5.5 (4-NQO)
PIN4/YBL051C
Similar Z66568Cp of S.pombe
109-123
(-)
0.958
GTAGAGTT ATTGAAA
not induced
396-410
(+)
0.967
GGAAAAGC ATTGAAA
4.9 (t-BuOOH)
Biological Function
PSO2/YMR137C
PRE3/YJL001W
Endopeptidase multicatalytic complex
subunit
Sequence (5’- 3’)
Induction
factor
RTS1/YOR014W
Phosphatase A regulatory subunit
318-332
(-)
0.962
GGGAAGGA AATGAAA
2.5 (t-BuOOH)
YLR282C
questionable ORF
446-460
(-)
0.962
GGCAATGG ATTGAAA
not induced
OST1/YJL002C
Oligosacaryltransferase alfa subunit
80-94
(-)
0.967
GGAAAAGC ATTGAAA
not induced
NIF3/YGL221C
Ngg1p-interacting factor 3
399-413
(-)
0.968
GTGAAAGA ATTGAAA
2.0 (4-NQO)
PUF6/YDR496C
Similar to hypothetical human protein
141-155
(+)
0.962
GTTCATGA ATTGAAA
not induced
PEX22/YAL055W
Hypothetical protein
235-249
(-)
0.970
GTGAAAGC ATTGAAA
2.9 (t-BuOOH)
MUB1/YMR100W
Hypothetical protein
393-407
(-)
0.976
GGAAATGA ATTGAAA
5.5 (4-NQO)
59-73
(+)
0.974
GAAAAGGC ATTGAAA
3.5 (MMS)
92-106
(-)
0.974
GTAAAAGA ATTGAAA
not induced
CLP1/YOR250C
DRS2/YAL026C
Similar to SPAC22H10.05c protein of
S.pombe
Type-P amino-phospholipid-ATPase
transmembrane
CFT1/YDR301W
Pre-mRNA 3’-terminal processing factor
126-140
(-)
0.995
GTAAAGGA ATTGAAA
4.9 (4-NQO)
PRO1/YDR300C
Glutamate 5-kinase
301-315
(+)
0.995
GTAAAGGA ATTGAAA
not induced
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Upstream
Gene/SGD access
Silva, W.L.S
Table 2. List of the yeast genes showing 95% or more sequence homology to DRE-matrix and its characteristics.
56
sequence.
Gene/SGD access
TFIIS elongation factor
GAL4/YPL248C
Galactose induction factor
GCR3/YMR125W
Glycolytic genes induction factor
LEU3/YLR451W
Branched-chain amino acids genes induction
factor
Upstream
DNA
Matrix
positiona
strandb
similarityd
75-89
(-)
0.86
ATCAATAC ATTGAAA
358-372
(-)
0.87
GGGTAAGA GTTGAAA
415-429
(+)
0.92
GACTACGT ATTGAAA
209-223
(-)
0.87
GCGGACGT TTTGAAA
279-293
(-)
0.88
GTAAATAC TTTGAAA
457-471
(-)
089
GTAATTTG AATGAAA
2.7 (4-NQO)
342-356
(+)
0.89
GAGCAAAA AATGAAA
4.0 (MMS)
Sequence (5’-3’)
Induction
factorc
3.4 (MMS)
not induced
MBP1/YDL056W
MBF complex subunit
330-344
(+)
0.86
GATGAAAA AATGAAA
2.0 (MMS)
MGA1/YGR249W
Similar to heat shock factor
153-167
(-)
089
GGTCAACA ACTGAAA
not induced
REB1/YBR049C
Transcription factor
150-164
(-)
0.89
TTCAATGT ATTGAAA
151-165
(+)
0.86
TTCAATAC ATTGAAA
RFA2/YNL312W
36kDa DNA replication factor
180-194
(-)
0.85
GTAGAATC TCTGAAA
5.1 (MMS)
373-387
(+)
0.86
GCGAATGT CATGAAA
3.5 (MMS)
RRN10/YBL025W
RNA polimerase I-specific initiation
transcription factor
2.6 (MNNG)
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
DST1/YGL043W
Biological function
Silva, W.L.S
Table 3. Yeast transcription factor-encoding genes identified by MatInspector for the presence of a DRE-matrix motif in their –500 bp promoter
57
RRN6/YBL014C
63-77
(+)
0.89
GAGAAATT ACTGAAA
transcription factor
210-224
(-)
0.89
GTGAGAAG ATTGAAA
346-360
(+)
0.87
TTAAAAAA ATTGAAA 2.6 (BCNU)
RNA polimerase I-specific initiation
transcription factor
2.3 (4-NQO)
SKN7/YHR206W
Similar to heat shock factor
207-221
(+)
0.89
GTGACAAG ATTGAAA
not induced
TAF40/YML015C
TBP-associated 40 kDa TFIID subunit
407-421
(+)
0.88
TGAAAGAA ATTGAAA
4.0 (MMS)
TAF61/YDR145W
TBP-associated 61 kDa TFIID subunit
34-48
(+)
0.87
AATAAGGT ATTGAAA 5.2 (4-NQO)
TAF67/YMR227C
TBP-associated 67 kDa TFIID subunit
114-128
(-)
0.86
CCAGAAGA ATTGAAA
8.8 (MMS)
TAF90/YBR198C
TBP-associated 90 kDa TFIID subunit
241-255
(-)
0.86
CTGCATGT AGTGAAA
3.2 (MMS)
TFB1/YDR311W
TFIIH subunit
256-270
(+)
0.86
GGGAAAGA TATGAAA 2.6 (4-NQO)
TFC1/YBR123C
TFIIIC subunit
401-415
(+)
0.88
AGACAGGA ACTGAAA
3.2 (MMS)
TFC2/YPR186C
TFIIIA subunit
383-397
(-)
0.86
GATATTTA ATTGAAA
not induced
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
RRN7/YJL025W
RNA polimerase I-specific initiation
Silva, W.L.S
Table 3. (Continue)
58
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Table 4. Homology between known regulatory motifs in the yeast genome and the DRE-matrix
motif.
Transcription
Binding motif
Sequence (5’-3’)
--
DRE
GKRRAKGN ATTGAAA
Hsfp
HSE
GGAACGTT CTGGAAA
Stress response
Msn2/4p
STRE
ATAAGGGG TGAGAAA
Cell death and aging
Ime1p
IRE
GGGAAAGG ATCAAAG
Pre-meiotic DNA synthesis
factor
Cell metabolism
CA TGTGAAA
Ino2p/Ino4p
--
Dal82p
--
GAAAAGCA AACGCAA
Purine biosynthesis
Abf1p
--
GTAAGGCG CTATCAA
DNA replication
Adr1p
--
GTGACAGA ATTGGAG
Cell aging and fermentation
Mot3p
--
GTAATAGG GATCAAT
Mating and transposition
Rap1p
--
CCATACTT TTTGAAA
Chromatin maintenance
Cbf1p
--
AATGATTC ATTGAAA
Chromosome segregation
--
MCB
GGGTAACG CCTGAAA
Cell cycle control
--
ECB
GGAAACGT AATGAAA
Cell cycle control
--
SCB
---TGTAA ATTGAAA
Cell cycle control
--
M13
ACCGAACA AATGAAA
n.d.
--
M27
GAAAGAAA TTTGAAA
n.d.
--
M3a
TAAAGAAA ATTGAAA
n.d.
AA TGTGAAA
Phospholipid biosynthesis
n.d.: not defined within a recognizable pathway.
59
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
5 Abstract
In this work, we computationally identified a nucleotide sequence pattern in several DNA
repair genes that may define a binding site for regulatory proteins during the induction of those
genes by the presence of mutagens. The DRE-like weight matrix generated in this analysis was
used to search for homologous sequences in the promoter region of all genes (also including
putative gene and hypothetical ORFs) in the Saccharomyces Genome Data Base (SGD). The
results demonstrated that over one third of the yeast genes presented at least one 15-bp sequence
in their promoter region with 85% of similarity or more to DRE-like consensus sequence. The
presence of that sequence in the promoter region of regulatory genes and its high similarity to
other DNA binding sites experimentally described pointed out for its involvement in general
regulation of yeast genes.
60
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
6 Conclusões
A partir dos resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que:
i) Uma alta homologia foi verificada entre os elementos DRE presentes na região promotora
dos genes SNM1/PSO2 e RAD2 e seqüências de 15 pb presentes na região promotora de
outros genes de reparação de S. cerevisiae;
ii) Verificou-se a presença deste elemento na região promotora de cerca de um terço dos genes
(incluindo prováveis genes e genes hipotéticos) depositados no banco de dados do genoma de
S. cerevisiae, o que a torna de presença ubíqua no genoma da levedura;
iii) A simples presença deste elemento não foi suficiente para assegurar a indução destes genes a
partir de tratamentos com agentes mutagênicos, pelo menos daqueles citados nos bancos de
dados de microarrays;
iv) Esta seqüência semelhante ao elemento DRE apresentou alta homologia com elementos
regulatórios de S. cerevisiae descritos na literatura, identificados tanto a partir de dados
experimentais como por análises in silico;
v) Os dados computacionais sugerem fortemente que esta seqüência deve estar relacionada com
mecanismos regulatórios gerais da expressão gênica em S. cerevisiae, também atuando na
indução de alguns genes a partir de lesões no DNA da levedura;
vi) Novas investigações deverão focalizar a identificação de padrões de interação aminoácidosnucleotídeos, de acordo com diferentes constantes de afinidade calculadas, e a possibilidade
de ligação cruzada entre diferentes fatores de transcrição e motivos de ligação de DNA para
que se possa compreender esta alta homologia entre os diferentes elementos regulatórios
presentes no genoma da levedura.
61
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
7 Anexos
62
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
7.1 Anexo 1
Instruções aos Autores da revista GENETICS AND MOLECULAR BIOLOGY
Sociedade Brasileira de Genética (SBG)
ISSN 1415-4757 printed version
http://www.scielo.br/revistas/gmb/iinstruc.htm
63
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
GENETICS AND MOLECULAR BIOLOGY
INSTRUCTIONS TO AUTHORS
Scope and policy
Genetics and Molecular Biology (formerly named Revista Brasileira de Genética/Brazilian
Journal of Genetics - ISSN 0100-8455) is published quarterly by the Sociedade Brasileira de
Genética (Brazilian Society of Genetics).
The Journal considers contributions that present the results of original research in genetics,
evolution and related scientific disciplines.
Although Genetics and Molecular Biology is an official publication of the Brazilian Society of
Genetics, contributors are not required to be members of the Society.
It is a fundamental condition that submitted manuscripts have not been and will not be published
elsewhere. With the acceptance of a manuscript for publication, the publishers acquire full and
exclusive copyright for all languages and countries.
The use of registered names and trademarks does not imply, even in the absence of a specific
statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations and
therefore free for general use.
Submission of papers
1. Manuscripts should be submitted to:
Fábio de Melo Sene, Editor-in-Chief
Genetics and Molecular Biology
Rua Capitão Adelmio Norberto da Silva, 736
14025-670 Ribeirão Preto, SP - Brasil
2. A submission package sent to the Editorial Office must contain:
1. A cover letter signed by all authors stating that they have approved the submission of the
manuscript and that the findings have not been published or are not under consideration for
publication elsewhere;
2. Three copies of the manuscript and figures.
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
3. Two copies of any unpublished or in-press companion articles referred to in the submission.
4. A copy of the text, tables and figures on a disk. Be sure that the disk is adequately protected;
if a disk arrives damaged, a new disk will be requested, causing delays in publication. Formats
for text are Word or RTF, in Windows platform. Images in TIF or JPG formats should be sent in
separate files (For Figures, see detailed instructions in 3.1.g). Disk must be labeled with the first
author’s last name, platform and software. (See detailed instructions below). Failure to adhere to
these guidelines can delay the handling of your contribution, and manuscripts may be returned
before being reviewed.
3. Categories of Contribution:
3.1.Research Articles
Manuscripts must be written in English in double-spaced, 12-point type throughout,
including the References Cited section, appendices, tables and legends; printed on one side only
of A4 paper with 2.5 cm margins; marked with consecutive page numbers, beginning with the
cover page.
The following elements must start on a new page and be ordered as they are listed below:
a) The title page must contain: a concise and informative title; the authors’ names (first
name at full length); the authors’ institutional affiliation, including department, institution, and
city, state or province, and country; different affiliations indicated with superscript numbers; a
short running title of about 35 characters, including spaces; up to five key words; the
corresponding author’s name, postal address, phone and fax numbers and email address. The
corresponding author is the person responsible for checking the page proofs, and arranging for
the payment of color illustrations and author alterations charges.
b) The Abstract must be a single paragraph that does not exceed 200 words and
summarizes the main results and conclusions of the study. It should not contain references.
c) The text: must be as succinct as possible. Text citations: articles should be referred to by
authors’ surnames and date of publication; citations with two authors must include both names;
in citations with three or more authors, name the first author and use “et al”. Only articles that
are published or in press should be cited. In the case of personal communications or unpublished
results, all contributors must be listed by initials and last name (“et al” should not be used).
Numbers: In the text, numbers nine or less must be written out except as part of a date, a fraction
or decimal, a percentage, or a unit of measurement. Use Arabic numerals for numbers larger than
nine. Avoid starting a sentence with a number. Binomial Names: Latin names of genera, species
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
and intraspecific taxa in the text must be printed in italics; names of orders and families should
be in the Title.
The text includes the following elements:
Introduction – Description of the background that led to the study.
Material (or Subjects) and Methods – Details relevant to the conduct of the study.
Statistical methods should be explained at the end of this section.
Results – Undue repetition in text and tables should be avoided. Comment on significance
of results is appropriate but broader discussion should be part of the Discussion section.
Discussion – The findings of the study should be placed in context of relevant published
data. Ideas presented in other publications should not be discussed solely to make an exhaustive
presentation.
Some manuscripts may require different formats appropriate to their content.
d) The Acknowledgments must be a single paragraph that immediately follows the
discussion and includes references to grant support.
e) The References Section: citations must be ordered alphabetically by the first author;
only articles that are published or in press should be included; personal communications must be
cited
within
the
text;
journal
titles
must
be
abbreviated
according
to
Medline
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/jrbrowser.cgi).
Sample journal article citation:
Breuer ME and Pavan C (1955) Behaviour of polytene chromosomes of Rhynchosciara angelae
at different stages of larval development. Chromosoma 7:371-386.
Bertollo LAC, Takahashi CS and Moreira-Filho O (1978) Cytotaxonomic consideration on
Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Rev Bras Genet 1:103-120.
Sample book citation
Salzano FM and Freire-Maia N (1967) Populações Brasileiras. Companhia Editora Nacional and
EDUSP, São Paulo, 178 pp.
Dobzhansky T (1951) Genetics and Origin of Species. 3rd edition. Columbia University Press,
New York, 364 pp.
Sample chapter-in-book citation:
Carvalho A, Monaco LC and Krug CA (1966) Melhoramento genético das plantas e sua
repercussão econômica. In: Pavan C and da Cunha AB (eds) Elementos de Genética. 2nd ed.
EDUSP and Companhia Editora Nacional, São Paulo, pp 587-653.
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Sample abstracts in meeting citation:
Basile R (1973) Cromossomos Politênicos em células nutritivas de ovócitos de ovário atrofiado
de Rhyncosciara. Ciênc e Cult 25 (suppl): 248. XXV Reunião Anual da SBPC, Rio de Janeiro,
Brazil.
Sample Thesis/Dissertation citation:
Frota-Pessoa O (1953) Revision of the Tripunctata group of Drosophila with description of
fifteen new species. PhD Thesis, Universidade do Brasil, Rio de Janeiro.
f) Tables each table must start on a new page. A concise title should be provided above the
table. Tables must be numbered consecutively in Arabic numerals. Each column must have a
title in the box head. Footnotes, typed directly below the table, should be indicated in lowercase
superscript numbers.
g) Figures must be numbered consecutively in Arabic numerals. Legends should be typed on a
separate sheet. Three sets of illustrations of the highest quality must be provided, one original
and two copies in glossy paper. If you have created figures electronically, submit them also as
hard copies. Scanned figures should not be submitted. Images should be in TIF or JPG format
and provided in separate files. Figures in Word format cannot be published. Journal quality
reproduction will require grayscale and color at resolution yielding 300 ppi. Authors should
submit bitmapped line art at resolution yielding 600–1200 ppi. These resolutions refer to the
output size of the file; if it is anticipated that images will be enlarged or reduced, the resolutions
should be adjusted accordingly. Identify each illustration by affixing on the back a label
containing: the number of the figure, the name of the first author, and an arrow indicating top of
illustration. Illustrations supplied on disks must follow instructions in item 2 (Submission
package). Color illustration can be accepted, but authors are asked to defray the cost. For costs of
color figures, check with the Editorial Office.
h) Nomenclature: current standard international nomenclature should be adhered to.
i) Sequences may appear in text or in figure. DNA must be sequenced on both strands. DNA,
RNA, or protein sequences equal to or greater than 50 units must be entered into appropriate data
bank and the accession number must be provided before publication of the article. Long
sequences requiring more than two pages to reproduce will not be published unless the Editorial
decision is that the publication is necessary. Complete mtDNA sequence will not be published.
j) Data access: reference should be made to availability of detailed data and materials used for
reported studies.
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
k) Ethical issues: Reports of experiments on live vertebrates must include a brief statement
that the work was approved by the institutional review board. For experiments involving human
subjects, authors must also include a statement that informed consent was obtained from all
subjects. If photos or any other identifiable data are included, a copy of the signed consent must
accompany the manuscript.
3.2 Short Communications present brief observations that do not warrant full-length articles.
They should not be considered preliminary communications. Their format is that of full-length
article. The text must be kept to a minimum.
3.3 Letters to the Editor relate or respond to recent published items in the journal. Discussions of
political, social and ethical issues of interest to geneticists are also welcome in this form.
3.4 Review Articles are welcome.
3.5 Book Reviews: publishers are invited to submit books on Genetics, Evolution and related
disciplines, for review in the journal.
3.6 History, Story and Memories: accounts on historical aspects of Genetics relating to Brazil.
4. Proofs: Page proofs will be sent to the corresponding author. Changes made to page proofs,
apart from printer’s errors, will be charged to the authors. Notes added in proof require Editorial
approval.
[Home] [About the journal] [Editorial board] [Subscription]
© 2002
Sociedade Brasileira de Genética
Rua Capitão Adelmio Norberto da Silva, 736
14025-670 Ribeirão Preto SP Brazil
Tel./Fax: +55 16 621-8540
[email protected]
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7.2 Anexo 2
Instruções aos Autores da revista DNA Sequence (The Journal of DNA Mapping,
Sequencing, and Analysis)
Editor-in-Chief: Stephan Beck, Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, CB10
1SA, UK
ISSN Print 1042-5179
http://www.tandf.co.uk/journals/titles/10425179.html
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
DNA Sequence
Aims and Scope:
DNA Sequence will accept original high quality reports based on mapping, sequencing and
analysis of DNA and RNA, irrespective of supporting biological or functional data. Acceptable
reports may describe coding or non-coding features of a single locus or whole genomes. Features
of interest include e.g. genes (incl. RNA genes), variation, promoters, epigenetic modifications
and any features affecting DNA/RNA function, structure and evolution. Experimental and
computational method reports on the above topics are equally acceptable.
Instructions for Authors:
TYPES OF CONTRIBUTIONS
Full-length research papers - As a guide full length research papers should normally occupy six
to ten printed pages (approximately 4000-7000 words) but may be longer depending on the
length of the sequence figures.
Short communications - between one and four pages (not more than 2500 words) including up to
4 figures and tables and twenty references. They are expected to be reports of complete, not
preliminary studies.
Scientific correspondence - designed to provide a mechanism for the exchange of practical
information, advice and opinions. The opinions and advice expressed are not necessarily those of
the editors or the Journal and are published at the discretion of the editors.
Review articles - commissioned, or submitted on topics of current interest. Suggestions are
welcomed but where submission is without prior invitation, authors should send a summary of
the article for consideration by the Editor-in-Chief before commencing detailed work on the
manuscript. The format of the review is left to the author's discretion but should include a
suitable list of key words or phrases and should not exceed 10 printed pages.
SUBMISSION OF MANUSCRIPTS
All manuscripts should be submitted to the Editor-in-Chief, Dr Stephan Beck, DNA Sequence
Editorial Office, Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, CB10 1SA, UK (Email:
[email protected]; Fax +44 01223 494919) All manuscripts should preferably be sent
in pdf format, converted from Word doc.
70
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Authors are encouraged to submit their papers on disk. Disks must be accompanied by four hard
copies (the original plus three copies). The publisher cannot return disks after use. Manuscripts
should be of letter quality, in double spacing throughout, using only one side of the paper.
Submission of a paper to DNA Sequence will be taken to imply that it represents original work
not previously published, that it is not being considered elsewhere for publication, and that if
accepted for publication it will not be published elsewhere in the same form, in any language,
without the consent of the editor and Publisher. If previously published tables, illustrations or
more than 200 words of text are to be included, then the copyright holder's permission should be
obtained. Copies of any such permission letters must accompany the manuscript.
FORMAT AND PRESENTATION
Papers should be written concisely in English. They should be typed double-spaced, with wide
margins on one side of A-paper. Non-standard abbreviations should be defined in the text when
first used. SI units and abbreviations are preferred as recommended by the IUPAC-IUB
Commission on Biochemical Nomenclature (Biochemical Nomenclature and Related
Documents, Biochemical Society, UK). Enzyme nomenclature should follow that given in
Enzyme Nomenclature (1980), Academic Press: New York, Genetic loci and the first three
letters of restrictions enzymes should be underlined to indicate italics.
Short communications should include an abstract but contain no headings. Experimental detail
should be given in figure legends. If new experimental procedures are reported they can be
presented in the form of a figure or table. Research papers should be presented in the following
order.
(a) Title Page - This initial page should contain the full paper title plus a shortened version for
running heads. Authors' names and affiliations should appear exactly as required in the final
paper and the author for correspondence should be indicated with a full postal address, telephone
and fax numbers, and email address where possible.
(b) Abstract - Each paper requires an abstract of 100-150 words summarizing the significant
coverage and findings. There should also be up to six indexing key words.
(c) Introduction, Materials and methods, Results, Discussion, Acknowledgements - Main text
should be typed without design (no bold or italic) flush left and unjustified. Italics within the text
may be indicated by underlining. First, second and third level headings can be differentiated by
marking them with A, B or C respectively in the margin by the heading. Headings should be
separated from the main body of the text by one line. Personal acknowledgements should
precede those for institutions or agencies. (d) References - References and notes should be
indicated in the text by the Harvard system. The full list should be collected and typed at the end
71
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
of the paper in alphabetical order. References should be complete in all details and follow the
style below for a journal article (Kouzarides et al, 1987) or book chapter (Bankier et al., 1988).
Note that the full titles of journals should be given.
Bankier A.T., Weston K.M., and Barrell B.G. (1988). Random cloning and sequencing by the
M13/dideoxynucleotide chain termination method. In Wu R. (ed). Methods in Enzymology
(London: Academic Press), pp. 51-93.
Kouzarides T., Bankier A.T., Satchwell S.C., Weston K. M. Tomlinson P. and Barrell B.G.
(1987). Large-scale Rearrangement of Homologous Regions in the Genomes of HMCV and
EBV. Virology 157, 397-413.
Unpublished results (including articles submitted for publication) or personal communications
should be cited as such within the text and substantiated by a letter of permission. Abstracts of
papers presented at meetings may not be cited.
It is assumed that, with the development of the World Wide Web (WWW), authors and/or the
publisher will propose distribution of articles or parts of articles on the WWW. If the author
knows the HTTP address of a referenced article on the WWW, this information should be added
at the end of the reference. Please use the following style
where http://www.blouk.com/article.html is the HTTP address.
(e) Tables - These should be numbered consecutively with Arabic numerals and given a clear
caption. The use of vertical lines should be avoided. Table footnotes should be typed below the
table and designated by superior lower case letters. An indication should be placed in the margin
of the manuscript at a point appropriate for insertion of the table.
(f) Figures - All figures should be numbered with consecutive Arabic numbers, have descriptive
legends printed separately from the figure. All figures should be referred to in the text (see
paragraph on Text Call-outs) and an indication should be placed in the manuscript margin near
the ideal site for the figure.
Preparation: All original figures, including chemical formulae, should be of a high quality,
suitable for direct reproduction. These should accompany the first copy of the manuscript, those
in the second and third replicas of the manuscript may be photocopies. Line drawings should be
in black on white paper, with all lettering and symbols included. Alternatively, good, sharp
photoprints ('glossies') are acceptable. Photographs intended for halftone reproduction must be
high-quality, glossy original prints of maximum contrast. Each figure should be clearly labelled
with the figure number and author name. The top should be labelled in cases which may cause
confusion. Redrawing or retouching of unusable figures will be charged to authors.
72
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Size: Figures should be planned so that they reduced to 8 cm column width. The preferred width
of line drawings is 16.5 cm with capital lettering 4 mm high, for reduction by one-half.
Photographs for halftone reproduction should be about twice the desired size.
Colour: The journal has a limited number of free colour pages within its annual page allowance.
Authors should consult the editorial office with respect to colour reproduction at submission
stage. Any figure submitted as a colour original may appear in a colour within the journal's
online edition. Colour reproduction in excess of the journals budget will only be considered on
condition that authors contribute to the associated costs.
Sequence Figures: Sequence figures may occupy one column width (80 mm) or double column
width (165 mm). Nucleoticle sequences with a translation of amino acid sequences in the one
letter code should be of 60 or 120 characters respectively. All sequences should be numbers
beginning at one (1). Sequences should not contain negative numbers. Where the coding
sequence is only one strand then only that strand need be shown. When coding is on both strands
then both strands should be shown with the amino acid sequence displayed above or below the
nucleoticle sequence as appropriate. Amino acid sequences should be displayed in the one letter
code. Sequences should not be split up into groups eg, groups of ten, but should be evenly
spaced. Long sequence figures may need to be in the form of an appendix at the end of the paper
in order not to interrupt the text.
Feature Table: Where a number of features in the sequence are discussed in the text then a
simple feature table should be included which summarizes the relevant features and their
position in the sequence.
This table should be in the form:
Feature
From To
Stand Comments
Features should show for example the position of transcription signals, coding regions including
the boundaries of introns and exons, variation, conflicts with previously published sequences and
any other biologically significant feature of the sequence which is discussed in the text. To
distinguish between strands, use C for complementary strand in the table
Text call-outs to figures, tables and other elements are the basis for searching articles on
electronic delivery. Therefore, proper designation of text call-outs to figures and other elements
is essential to the success of electronic delivery. When referring to a figure, table or other
element within an article, always call the element by its full name: "See Table 1", "Figure 1
illustrates", "Refer to Scheme 1". Do not use ambiguous call-outs (for example, "1 illustrates_")
that do not clearly denote the element being referred to.
73
Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
DATABASE SUBMISSION OF SEQUENCE
It is a prerequisite that the sequence must be submitted to the EMBL, Genbank or DDBJ
database and an accession number obtained before it can be published by the Journal. The
databases require a sequence to be submitted in computer readable form. This can be done by
electronic file transfer (email), floppy disk or by using a submission system through the World
Wide Web at http://www.ebi.ac.uk/
Sequence Data Submission forms are obtained by:
1. Sending an email message containing the command 'GET DOC: DATASUB.TXT’ to
[email protected]
2. Sending a mail or fax request to: EMBL Nucleoticle Sequence Submissions, European
Bioinformatics Institute, Hinxton Hall, Hinxton, Cambridge CB10 1RQ, UK, Fax: (+44) 1223
494468. Tel: (+44) 1223 494437.
The filled submission forms should be mailed to the above address, or (preferably) sent by email
to [email protected]. The information will be shared among the following databases:
EMBL Data Library (Heidelberg, Germany)
DNA DataBank of Japan (DDBJ; Mishima, Japan)
GenBank (Los Alamos, NM, USA and Mountain View, CA, USA)
Institute for Protein Sequence Data Resource (NBRF-PIR; Washington, D.C. USA)
International Protein Information Database in Japan (JIPID; Noda, Japan) National
Biomedical Research Foundation Protein Identification Martinsried (MIPS; Martinsried,
Germany)
The EMBL Data Library has established a PCR primers database. This information is not
mandatory but EMBL Data Library has requested that we recommend to authors that they supply
this information.
There are currently two ways for submitting information to the PCR primers database; the easier
and much preferred way is through the WWW, by using a client that supports forms (e.g. Mosaic
or Netscape). The submission system may be accessed from the PCR primers database home
page at, http://www.ebi.ac.uk/dbases/primers/primers_home.html. Users who do not have access
to the WWW but do have email may fill in an electronic submission form which can be sent by
email or on a disk to the database. Users who know how to use the ftp protocol, can download
the form by anonymous ftp to ftp.ebi.ac.uk. Users who are limited to using only email, can send
an email that contains the command 'GET PRIMERS: SUBMISSION FORM' to the address
[email protected]. The submission form will be sent as a response.
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
ACCURACY OF THE SEQUENCE
All sequences must be determined on both strands (or equivalent) and a statement to this effect
must be included in the paper. Large sequences which contain short regions of sequence only
determined on one strand may be accepted at the editors' discretion if they feel that there is a
legitimate reason and that they do not compromise the results reported in the paper. The
sequences in question should be clearly marked on the figure and the exact regions stated in the
legend.
GENE NOMENCLATURE
Where applicable, all gene names must be in accordance to the officially approved gene symbols
as described at:
* http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/ (human genes)
* http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/ (mouse genes)
* http://rgnc.gen.gu.se/RGNChem.html (rat genes)
* http://zfin.org/zf_info/nomen.html#1.2 (zebrafish genes)
SUBMISSION OF ANIMATION
Author-supplied animation related to articles accepted for publication will be included in the
journal CD-ROM at no cost to authors. Animations are limited to a time duration of 30 seconds.
Animation should be submitted to the journal editor with the final manuscript, after it has
completed the refereeing process. Animation should be mentioned in the text. Indicate an
approximate location for the animation call-out in the margin.
Animations in the following forms (in order of preference) can be accepted from authors:
-Video tape
-AVI or Quick Time files
-A sequence of still images
The following formats can be accepted:
-all uncompressed formats widely used on PC, Mac and UNIX
-JPEG for coloured and compressed images
-TIFF with a group IV compression for black and white compressed images
-FLI and FLC format from AutoDesk.
Authors who submit animations are requested to provide the following information:
-Video tape - format used
-AVI or QuickTime files - version used, and system used for disk file creation.
-Sequence of still images - format used, version and system used for disk file creation.
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Silva, W.L.S
Análise computacional de um suposto sítio de ligação...
Authors who are unable to supply video tape, AVI or QuickTime files may provide the publisher
with a set of sequential still images. Note that an animated sequence will consist of 13 to 15 still
images per second of animation; e.g., if an animated sequence is 10 seconds in duration, it is
made up of 130 images. Authors who are unable to submit in any of the above mentioned
formats are advised to contact the publisher to discuss other options with the Publisher prior to
submission.
PROOFS
Authors will receive page proofs (including figures) by air mail for correction, which must be
returned to the typesetter within 48 hours of receipt. Please ensure that full postal address,
including fax/email, is given on the first page of the typescript, so that proofs are not delayed in
the post. Authors' alterations in excess of 10% of the original composition cost will be charged to
authors.
Early Electronic Offprints:
Corresponding authors can now receive their article by e-mail as a complete PDF. This allows
the author to print up to 50 copies, free of charge, and disseminate them to colleagues. In many
cases this facility will be available up to two weeks prior to publication. Or, alternatively,
corresponding authors will receive the traditional 50 offprints. A copy of the journal will be sent
by post to all corresponding authors after publication. Additional copies of the journal can be
purchased at the author's preferential rate of £15.00/$25.00 per copy.
REPRINTS
Twenty-five free reprints will be provided to the first-named author of each paper. Additional
reprints may be ordered by completing the appropriate form sent with proofs.
PAGE CHARGES
There are no page charges to individuals or institutions. See journal inside cover for information
on the Publisher's negative page charge voucher and voluntary page charge programs.
ABSTRACTING
DNA Sequence is abstracted in: Current Contents®/Life Sciences; Science Citation Index®;
SciSearch®; Research Alert®, Biochemistry and Biophysics Citation Index™; Current
Awareness
in
Biological
Science
(CABS);
Chemical
Abstracts;
Index
Medicus/Medline/Genbank and Zoological Record, UK
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