AULA
PRÁTICA
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO
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Apesar do desenvolvimento de técnicas modernas e sofisticadas de diagnóstico,
a identificação de vírus através de seu isolamento em um sistema biológico permanece
sendo um método de diagnóstico clássico.
SISTEMAS BIOLÓGICOS
DE ISOLAMENTO VIRAL
Inoculação em:
Cultivo Celular
Ovos embrionados
Animais
Isolamento em Cultivo Celular:
Método direto mais utilizado em diagnóstico virológico. É aplicado a quase
todos os vírus de interesse veterinário [com raras exceções] e possui grande
sensibilidade.
O material suspeito é inoculado em células animais cultivadas in vitro e a
replicação do vírus é evidenciada pela produção de efeito citopático ou pela detecção de
proteínas ou ácidos nucléicos virais nas células infectadas.
O material enviado ao laboratório deve ser acompanhado de um histórico clínico que permita
a formulação de hipóteses sobre os possíveis vírus suspeitos. Com base nesse histórico e no
conhecimento do virologista, é possível estabelecer qual o agente suspeito, facilitando a decisão
com relação ao tipo de célula e da técnica utilizada para identificação do agente.
ESCOLHA DAS CÉLULAS
TIPOS DE CÉLULAS
[PRIMÁRIAS/LINHAGENS]
ESPÉCIE ANIMAL
DE ORIGEM/VÍRUS
Geralmente utiliza-se células de mesma
espécie da qual o material é originado.
TIPO E PREPARAÇÃO DO MATERIAL
Alguns vírus podem ter dificuldades, ou
mesmo ser incapazes de replicar em algumas
células de linhagens, mesmo sendo essas
mesmas espécie de origem do material.
INOCULAÇÃO
Os materiais mais frequentemente
enviados são tecidos, secreções, fezes,
conteúdo intestinal, líquidos
vesículares, soro e sangue integral.
TECIDOS
Macerados para romper células e liberar as partículas virais.
FLUÍDOS E SECREÇÕES
São centrifugados para remoção de sujidades, bactérias e
restos celulares.
FEZES
São filtradas para retenção de bactérias e centrifugadas.
SANGUE INTEGRAL
Pode ser inoculado diretamente ou centrifugado para a
separação de leucócitos.
DETECÇÃO
- A presença de ECP é indicativo da presença
de vírus no material. Em geral, cada família de
vírus produz um tipo de ECP característico.
- A escolha da placa de cultivo depende do
número de amostras a serem examinadas.
- As células devem estar em fase exponencial
de multiplicação, com uma confluência de 70%.
1
2
3
Remover o meio de cultivo, e adicionar
o material suspeito;
Controle negativo
MDBK.
ECP de BHV-1
em MDBK
- Alguns vírus replicam e não produzem ECP,
podendo ser identificados através de técnicas
de detecção de antígeno.
Incubar em estufa de CO2 a 37ºC por 1 a
2h, essa fase é denominada adsorção;
Imunofluorescênica [IF]
Repor o meio e incubar na estufa, monitorar
diariamente ao microscópio invertido.
Imunoperoxidase [IPX]
- Em caso de resultado negativo na primeira passagem,
procede-se uma segunda e terceira passagem. Somente
considera-se negativo após 3 passagens sem detecção de
produtos virais específicos.
Aula 02: Virologia Veterinária, Professor Titular: Paulo Michel Roehe. Colaboradores: Fabrício Souza Campos [pós-doutorando] e Helton Fernandes dos Santos [pós-doutorando]
LabVir - ICBS - UFRGS
DIFICULDADES DA TÉCNICA
TOXICIDADE
CONTAMINAÇÃO
- Alguns materiais clínicos podem ser tóxicos
para ás células, ocasionando alterações
morfológicas que podem ser confundidas com ECP.
- O material clínico coletado a campo frequentemente
contém contaminação bacteriana e/ou fúngica,
causando alteração ou morte celular do cultivo.
- Diluir o material em MEM ou soro.
- Lavagem do tapete celular após a adsorção.
Isolamento em Ovos Embrionados:
Ovos embrionados de galinha
são muito apropriados para o cultivo
de certos vírus. O material suspeito,
dependendo do vírus que procura,
pode ser inoculado por diversas vias em
diferentes idades do embrião.
Membrana
corioalantóide
Câmara
de ar
Cavidade
Aminiótica
Casca
Inoculação na
Membrana
corioalantóide
- Coleta do material com a máxima assepsia possível.
- Utilizar meio de cultivo com alta concentração de
antibiótico ou antifúngicos para resuspensão do inóculo.
- Filtragem do material antes de inocular.
Isolamento em Animais:
Com o advento dos sistemas de ovo
e m b r i o n a d o e c u l t i v o c e l u l a r,
a inoculação de animais para
isolamento de vírus com
fins diagnósticos foi gradativamente
sendo substituída. No entanto, essa
técnica ainda tem alguma utilidade,
sobretudo como forma de confirmação
de diagnósticos específicos, quando
executada em paralelo à outras
técnicas.
Inoculação
Aminiótica
Saco da
gema
Membrana Albumina Cavidade
alantóica
da casca
VANTAGENS
DESVANTAGENS
Inoculação
Alantóica
Inoculação no
saco da gema
- Boa sensibilidade;
- Fácil manipulação;
- Custo baixo.
- Risco de contaminação;
- Restrito a alguns vírus.
DIAGNÓSTICO DA RAIVA
- Utiliza-se a imunofluorescência
direta seguida de inoculação
em camundongos, para ter a
confirmação do diagnóstico.
Aula 02: Virologia Veterinária, Professor Titular: Paulo Michel Roehe. Colaboradores: Fabrício Souza Campos [pós-doutorando] e Helton Fernandes dos Santos [pós-doutorando]
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