BIOTECNOLOGIA DE CÉLULAS ANIMAIS
Engenharia Biotecnológica – FERN/UALG
2006/2007
DOCENTE: Prof. Doutor José António Belo
Gabinete 3.10; Telefone: #7040
EMAIL: [email protected] ;
Teórica - I
• O desenvolvimento da tecnologia de células animais. (Tab. 1.1)
• Vantagens da Cultura de Células.
-Controlo do ambiente Físico-Químico
A) PH
B) Temperatura
C) Pressão osmótica
D) O2 e CO2
E) Suplementos do meio de cultura
- Caracterização e homogeneidade da amostra
- Economia
a) menores quantidades de amostra para testes
b) experimentação animal pode ser evitada
• Desvantagens. Principais diferenças in vitro.
-Especialização
a) Técnicas de cultura assépticas e complexas
b) Total compreensão do sistema => dignóstico capaz de problemas quando eles
surgem
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-Quantidade
Máximo por batch:
a) 2-3 pessoas -> 1-10 gr células
b) > 5 pessoas -> 10-100 gr células
c) Industria
-> > 100 gr células
-Dediferenciação e Selecção
a) perca de características fenotípicas => sobrecrescimento de células indiferenciadas
b) desenvolvimento de meio sem serum
-Origem das células
a) perca de propriedades características => dificuldade de relacionar as células com o
tecido de onde foram derivadas
-Instabilidade
a) instabilidade na constituição cromossómica
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Teórica - II
• Biologia da célula em cultura.
-O ambiente de cultura
In vitro: proliferação de células e não in vivo;
redução de interacções célula-célula e célula-matriz;
redução da heterogeneidade e arquitectura tridimensional;
Implica a adição no meio de cultura de hormonas, nutrientes, substracto, etc.
-Adesão celular
A maioria das células de tecidos sólidos crescem sob a forma de monocamadas
aderentes a um suporte sólido. Este é necessário para que elas comecem a proliferar.
Adesão celular mediada por receptores celulares de superficie a moléculas na matriz
extracelular (secretadas pelas celulas) => plástico ou vidro préviamente condicionado
pode ser utilizado como superficie para adesão celular.
Classes de proteinas envolvidas em adesão celular:
CAM’s, Ca2+ independentes;
Caderinas, Ca2+ dependentes.
-Iniciação da cultura (Tab. 2.1)
-Evolução das linhas celulares (Fig. 2.1)
-Desenvolvimento de linhas celulares continuas (Fig.2.2)
Capacidade de crescimento continuo em cultura vs. numero limitado de gerações;
Alteração em cultura que origina uma linha celular continua – “transformação in vitro”
Transformação – implica uma alteração nas caracteristicas de crescimento (aderência,
contacto, densidade);
Imortalização – aquisição de um tempo de vida infinito;
-Desdiferenciação (Fig.2.3)
Células diferenciadas perdem as suas caracteristicas in vitro: porque células
indiferenciadas da mesma linhagem sobrecrescem células terminalmente diferenciadas
com reduzida capacidade de proliferação; a ausencia de indutores apropriados causa
readaptação.
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-O que é uma célula em cultura?
Uma célula em equilibrio entre celulas estaminais multipotentes, células precursoras
indiferenciadas mas cometidas e células maduras e diferenciadas, e o equilibrio pode
mudar de acordo com condicões do ambiente de cultura.
A identidade de uma célula em cultura não é apenas definida pela sua linhagem in vivo
mas também pela sua posição nessa linhagem.
-Ambiente funcional
Condições de cultura têm sido adaptadas para para satisfazer dois requisitos principais:
produção de células por proliferação continua;
preservação de funções especializadas.
• Desenho e distribuição do laboratório.
-Planeamento
Distinção de outras instalações devida á elevada necessidade de manter a assepcia.
Novas instalações (a) ou reconversão de pré-existentes (b).
a) Localização dos tubos para ar condicionado e para extracção de ar;
Localização da sala de lavagens e de esterilização; necessidade ou não de
um
elevador;
Sala de cultura acessivel mas não continua com o Biotério.
b) Limitações estruturais significativas; escolha cautelosa para evitar limitações de espaço
e que limitem a flexibilidade do mesmo;
Dimensões das portas e tectos de maneira a não limitarem futura instalação de
equipamento;
Quantas pessoas, por quanto tempo, que tipo de culturas, de incubação e por quanto
tempo;
Espaço necessário para cada área: maior para sala de cultura, seguida das lavagens e
esterilização; armazenamento; incubação (4:2:1:1);
Tipo de instalações para quarentena;
-Construção e distribuição (Tab. 2.2; Fig. 2.4)
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-Área de munipulação estéril
Deverá ser localizada numa parte restrita do laboratório, fora do fluxo de circulaçõa de
pessoas. Melhor usar uma Câmara de Fluxo Laminar (Fig. 2.5).
Criar um “Gradiente de esterilidade” no laboratório (Fig. 2.6).
Incubação
Incubadores de CO2; humidificadores; manutenção.
-Bancada de serviço
De preferência localizada perto da área estéril; necessária para contagem de células,
microscopia, apoio diverso;
-Preparação
Actualmente, aquisição de meios comerciais reduzem a necessidade de uma área
alargada para este fim; no entanto um pequeno espaço deverá ser comtemplado para
pequenas preparações.
-Lavagem
De preferência, situada fora do lab de cultura de tecidos, devido á humidade e calor
produzidos.
-Armazenamento (Tab. 2.2)
• Equipamento necessário (Tab. 2.3).
-Equipamento essencial (Fig. 2.7)
O trabalho não poderá ser feito sem ele
-Equipamento beneficial
O trabalho será feito melhor, mais eficiente e depressa.
-Equipamento adicional útil
Facilita o trabalho, melhora as condições de trabalho, reduz a fadiga, … => produz um
ambiente de trabalho mais atractivo!
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-Materiais consumiveis (Tab. 2.4).
Pipetas, recipientes para cultura, filtros de esterilização, seringas e agulhas.
• Técnicas assépticas.
-Objectivos da técnica asséptica
Area sossegada, limpeza da superficie de trabalho, higiene pessoal, pipetagem.
-Manuseamento em esterilidade.
Desinfecção, tampas de rosca, chama, manuseamento de garrafas e frascos.
-Fluxo Laminar Fig. (2.8)
Dois tipos de câmaras de fluxo laminar: Horizontal e Vertical.
-Procedimento de rotina (Tab. 2.5)
• Normas de segurança e perigos biológicos.
-Normas gerais de segurança (Tab. 2.6, 7)
Operador; equipamento; vidros e objectos cortantes; quimicos; gases; azoto líquido
-Fogo
Usualmente associado á (má) utilização de alcoól.
-Radiação
Ingestão de compostos marcados radioactivamente;
Irradiação por emissores
e
de alta energia como 32P, 125I, 131I
Irradiação por máquinas de Raios-X, U.V.
-Perigos Biológicos
Três niveis de manuseamento e contenção podem ser definidos (Tab. 2.8):
- Cabine selada Classe III
- Câmara Fluxo Laminar Vertical Classe II
- Bancada de trabalho normal
Lixo resultante deve respeitar normas de segurança especificas antes de ser eliminado.
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Teórica - III
• O ambiente de cultura: Substrato, Fase de Gás, Meio e Temperatura.
-O substrato
Vidro; plásticos descartáveis: poliestireno (hidrofóbico, logo tem de ser tratado para
aderência), cloreto de polivinil (PVC), policarbonato, etileno de politetrafluor (PTFE),
teflon, etc.
Substratos permeáveis: tamanhos, materia, porosidade.
Matrizes sintéticas: para estudos de interacção com matriz (Matrigel, Natrigel, Colagénio,
etc).
Revestimento da superfície de cultura com colagénio, gelatina. Em certos casos este
revestimento com camadas “inertes” não e´suficiente de modo que é necessário utilizar
uma monacamada celular para providenciar a matriz correcta (feeder) para a manutenção
de certas células especializadas – fibroblastos são utilizados facilitar e aumentar o
crescimento de outros tipos celulares a baixas densidades.
Matrizes tridimensionais- evitam a perca da arquitectura do tecido e interacções celulares.
Factores a considerar para a escolha dos recipientes de cultura:
A quantidade de células; cultura em suspensão ou monocamada; cultura ventilada ou
selada; o tipo de amostragem e análise a ser feita; custo (Tab. 3.1).
-A fase de gás
Os principais constituintes são O2 e CO2. Certas culturas de orgãos requerem até 95% O2.
A profundidade do meio de cultura pode influenciar a taxa de difusão do O2 para as
células => manter
H2O + CO2
NaHCO3
H2CO3
2-5mm.
H+ + HCO3- (1) ) (Tab. 3.2)
Na+ + HCO3- (2)
NaOH + H2CO3
NaHCO3 + H2O
Na+ + HCO3- + H2O
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-Meios e suplementos
Tentativa de obter meios bem definidos capazes de manter o crescimento celular, para
substituir os “meios naturais” tais como extracto de embrião, hidrolisados de proteína, etc.
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Tentativa de iliminar o soro do meio; demorado e esta definição é muito específica de
cada tipo de culturas.
-Proprieddades físicas
pH- maioria das células crescem melhor a pH 7.4; alguns fibroblastos pH 7.4-7.7; células
transformadas pH 7.0-7.4. Fenol vermelho: pH 7.8 – púrpura
pH 7.6 – rosa
pH 7.4 – vermelho
pH 7.0 – laranja
pH 6.5 – amarelo
pH 6.0 – limão
Tampões (Tab. 3.2)- bicarbonato, fraco mas baixa toxicidade, e baixo custo.
HEPES, muito mais forte a pH 7.2-7.6.
Pressão osmótica- 260-320 mOsm/kg, mas depois de selecção, devem ser mantidas ± 10
mOsm/kg.
Temperatura- para além do efeito directo, vai influenciar pH (< temp. => > sol. CO2).
Viscosidade- vai depender principalmente do conteúdo em soro.
-Constituintes dos meios (Tab. 3.3)
Soluções salinas, são utilisadas para diluição, meio de lavagem ou dissecção, periodos de
incubação curtos
-Meios definidos (Tab. 3.4)
Podem variar em coomplexidade desde MEM até mais complexos como F12, 199 e uma
gama alargada de meios sem soro.
Aminoácidos essenciais + glutamina; vitaminas, inversamente dependente da quantidade
de soro no meio; sais, sendo Ca reduzido em culturas em suspensão; glicose, como fonte
de energia; suplementos orgânicos, proteinas, piruvato, lipidos, etc.
-Soro
Os soros mais comuns são os de vitelo, feto de bovino, cavalo e humano.
Proteínas, sendo os principais constituintes do soro, a sua função in vitro permanece
obscura; albumina, fibronectina,
2-macroglobulina.
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Polipéptidos, PDGF, TGF-,
etc; hormonas, GH, IGF, etc; nutrientes, como aminoácidos,
glucose, lipidos, ácido oleico, etanolanina, etc; minerais, selénio, cobre, zinco, ferro;
inibidores, podem ser inactivados por aquecimento.
-Meios sem soro (Tab. 3.5-6).
Vantagens:
1.Conhecimento completo dos constituintes totais do meio
2. Não há variação de stock
3. Mudança de stock involve muitos testes.
4. Facilita a posterior purificação de produtos
5. Evitam-se infecções
6. Custo
7. Standartização dos protocolos.
8. Meio para tipos celulares seleccionados (Tab. 7.7).
Desvantagens:
c) A passagem para um meio sem soro é um processo complexo.
d) O grau de pureza da água e reagentes e´mais complexa.
e) O crescimento é mais lento
Factores de crescimento (Tab. 3.8)
Meios sem soro comerciais (Tab. 3.9)
-Selecção do meio e do soro
Manutenção dos stocks, teste do soro, eficiência de clonagem, curva de crescimento,
manutenção das caracteristicas da cultura, esterilidade.
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Teórica - IV
• Preparação e esterilização.
-Aparelhos (Fig. 4.1; Tab. 4.1,2)
-Reagentes e meios
Água pura (Fig. 4.2);
• Desagregação do tecido e cultura primária.
-Isolamento do tecido (Fig. 4.3)
-Cultura Primária
Técnica de explantes primários (Fig. 4.4,5)
Desagregação enzimática: tripsina fria ou quente (Fig. 4.6; Tab. 4.3)
• Manutenção da cultura: linhas celulares.
-Nomenclatura
Cultura primária heterogenia => linha celular homogenia (Tab. 4.4,5)
-Manutenção de rotina
Renovação do meio, devido a alteração do pH, concentração e morfologia celular.
• Clonagem e selecção de linhas celulares específicas.
-Clonagem
Clonagem por diluição (Fig. 4.6,7).
Eficiência do plateamento: células a baixa densidade a taxa de crescimento e
sobrevivência diminuem;
=> meio mais rico (F12), soro, condicionamento, hormonas.
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Teórica - V
• Caracterização de linhas celulares.
-Introdução
Existem 4 requisitos básicos para caracterisação de linhas celulares (Tab. 5.1):
1) Correlação com o tecido de origem;
2) Monitorização para instabilidade genética e variação fenótipica;
3) Testar para contaminação cruzada e confirmação da espécie de origem:
4) Identificação de linhas celulares específicas dentro de um grupo da mesma origem.
Identificação da espécie, pode ser feito por análise cromossómica; tambem por probes de
DNA espécie-especificas.
Marcadores de linhagem/tecido celular:
Antigénios de superficie, particulamente para células hematopoiéticas.
Proteínas intermediárias de filamentos, GFAP para astrócitos; desmina para músculo, etc.
Produtos diferenciados, hemoglobina para eritrócitos; miosina para musculos, etc.
Enzimas, creatina quinase BB isoenzima para células neuronais.
-Morfologia (Fig. 5.1)
-Conteúdo cromossómico (fig. 5.2, 3)
Permite identificar espécie, sexo, células normais ou tumorais, etc.
Hibridação in situ com fluorescência.
-Conteúdo em DNA
Hibridação ao DNA, com probes específicas, análise por Southern.
DNA fingerprinting, hibridação a regiões satélites, corte com endonucleases e posterior
análise
-RNA e Proteínas
-Actividade enzimática
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In vivo, enzimas do ciclo da ureia em fígado, fosfatase alcalina em endotélio. No entanto
in vitro muitas desta actividades são perdidas.
Izoenzimas, por zimogramas podemos reconhecer polimorfismos entre linhas, espécies,
etc. (Fig. 5.4)
-Marcadores antigénicos
Anticorpos monoclonais conjugados com fluorescência.
• Disponibilidade e obtenção de linhas celulares.
-Diversidade e selecção (Tab. 5.2,3,4)
-Nomenclatura
Ex: MCF-7, Michigan Cancer Foundation, linha 7 cancro da mama; WI-38, Wistar Institute
linha celular pulmonar numero 38.
-Utilidade comercial (Tab. 5.5)
Produçaõ de vacinas, anticorpos monoclonais, produtos biofarmacêuticos, etc.
-Exemplos de linhas celulares desenvolvidas (Tab. 5.6)
-Criopreservação e autenticação de linhas celulares (Fig. 5.5)
Tabela 5.7
• Estabelecimento de linhas celulares: imortallização por transfecção.
Linhas celulares em cultura que mantêm características diferenciadas específicas têm
sido ferramentas indispensáveis em Biologia Celular. Progressos na compreensão da
função de células diferenciadas in vivo podem ser facilitados pela criação de linhas
celulares por imortalização via transdução genética, se estas retêem as características
diferenciadas essenciais das mesmas células in vivo.
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Células de rodentes imortalizam expontâneamente com uma frequência de 10-5 a 10-6.
Certos “genes imortalizantes” podem ser utilizados para aumentar esta frequência para
100%.
-Genes utilisados para imortalização celular
Simian Virus 40 (SV40):
Em células humanas e de rodentes, infecção com SV40 leva a uma integração
aleatória do DNA viral no genoma do hospedeiro. O antigénio T grande codificado pela
região proximal do genoma do SV40 está relacionado com a imortalização celular. Linhas
celulares foram estabelecidas usando o vírus ou vectores de expressão contendo o
antigénio T grande e o antigénio T pequeno do SV40.
Papillomavirus:
Papillomavirus humanos (HPV) são vírus tumorais com reduzido DNA que induzem
proliferação epitelial e causam lesões benignas e possivelmente tumores malignos do
epitélio cutâneo e mucoso. Duas das proteínas do HPV, E6 e E7, parecem ser
necessárias para a imortalização de pele e queratinócitos humanos. Uma explicação para
esta actividade do E6 pode ser por ligação e inactivação à proteína p53, e a do E7 por
ligação a Rb.
Oncogenes:
Muitos dos protooncogenes celulares codificam para factores de crescimento e outras
proteínas que regulam a proliferação e diferenciação celular normal. Transferência
genética mediada por DNA de um número de oncogenes resulta na imortalização das
células alvo. Oncogenes tipo são myc, c-jun, c-ras e v-src.
p53:
O produto do gene p53 é conhecido por funcionar como um supressor de tumores. A
forma mutada de p53 e´capaz de imortalizar culturas primárias de células de rodente.
-Gene Delivery
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Vários metodos têm sido utilisados. Genes imortalizantes têm sido transfectados nas
células alvo por electroporação, por precipitação por fosfato de cálcio ou usando vectores
retrovirais com replicação diminuida.
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Teórica - VI
• Contaminação (Tab. 6.1)
Bactérias, leveduras, fungos, todos podem aparecer como contaminantes em culturas
celulares. Usualmente a espécie e/ou tipo de infecção não é importante a não ser que se
torne frequente. (Fig. 6.1).
Características de infecções microbianas serão:
Variacão súbita no pH do meio;
Turbidez do meio;
Espaços livres de crescimento celular.
Conclusões:
Verificar regularmente as culturas para contaminações
Não manter todas as culturas (por rotina) em antibióticos.
Não tentar descontaminar uma cultura a não ser que seja insubstituivel.
• Quantificação e desenho experimental
A selecção da linha celular a utilizar, é a decisão chave no início da programação de um
conjunto de experiências envolvendo cultura de células animais. Isto deverá ser regido
nomeadamente pelas propriedades específicas que serão necessárias para o trabalho em
questão, mas existem outras considerações gerais a ter em conta:
(1) a disponibilidade ou não de uma linha celular continua que expressa as funções
requeridas;
(2) a relevância ou não se a linha em questão é transformada malignamente ;
(3) a relevância para o trabalho da espécie de onde a linha celular foi inicialmente
derivada;
(4) quais as características de crescimento que são necessárias;
(5) se uma linha finita será a utilizada, qual a disponibilidade de stocks, se são
suficientes para a experiência em questão ou não;
(6) a capacidade da linha celular ser feita para expressar as características adquadas;
(7) quão bem caracterizada é a linha celular;
(8) qual é o grau de estabilidade da linha celular.
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Fase de crescimento – necessário distinguir o estado da cultura no início da experiência,
na altura da colheita da amostra e na duração da experiência. Importante na manutenção
de rotina.
Contagem de células:
a) hematócitometro (Fig. 6.2)
b) contador de Coulter (Fig. 6.3)
c) monocamadas coradas (violeta de cristal, Coomassie blue)
Tamanho e peso celular – (Tab. 6.2)
Conteúdo em DNA – utilização do corante Hoechst 33258. A 458 nm, a flourescência de
emissão do Hoechst 33258 é aumentada pela associação com o DNA a pH 7.4 e em
presença de elevada concentração de sal. Sensibilidade até 10ng/mL.
Ciclo de crescimento:
Após subcultura, células progridem num padrão de crescimento característico: fase de
“lag”, seguido por uma fase de crescimento expponencial, “log”, até atingir um fase
estacionária de “plateau”. Fig. 6.4. Informação de :
a) tempo de duplicação populacional (TDP); é um valor médio da população.
b) densidade de saturação.
Tempo de geração ou tempo de ciclo celular:
É medido desde um ponto do ciclo celular até que esse ponto é atingido de novo.
Diferente de TDP. (Fig. 6.5)
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Teórica - VII
• Hibridação celular e hibridomas.
Hibridação celular é uma das citotecnologias mais básicas (Tab. 7.1).
Os seus métodos são classificados em 3 categorias, de acordo com o tipo de técnica
utilizada (Fig. 7.1):
-HVJ (hemagglutinating virus of Japan), que possui actividade de fusão celular perto de
valores de pH neutroe com uma vasta gama de tipos celulares.
-Substâncias quimicas como o PEG, que dedvido à sua simplicidade e´um dos
métodos mais usado actualmente.
-Pulsos eléctricos. Vantajoso pois requer menores quantidades de células mas requer
material muito especifico.
Selecção de células híbridas entre humanos e ratinho (Fig. 7.2)
Aplicações desta técnica a várias áreas de pesquisa:
f) Preparação de mapas cromossómicos em mamíferos.
g) Testes genéticos de complementação.
h) Regulaçaõ da expressão genética ao nível celular.
i) Análise de mecaniosmos de fusão celular e funções das membranas.
j) Introdução de biomacromoléculas em células.
k) Produçãode anticorpos monoclonais por hibridomas.
l) Produçaõ de animais quiméricos, transgénicos ou clonados.
• Produção de anticorpos monoclonais (Fig.7.3).
Normalmente, linfócitos B (células de plasma) produzem e secretam anticorpos antigénioespecíficos mas não conseguem proliferar indefenidamente in vitro; por outro lado, células
de mieloma (células tumorais) proliferam indefenidamente. Hibridizando ambas as células
por PEG, consegue-se produzir hibridomas que são células imortais fundidas que
produzem um único específico anticorpo.
1 linfócito => 1 anticorpo => 1 antigénio (1 CDR)
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Teórica - VIII
• Embryonic Stem (ES) Cell Technology – alteração dirigida e estável do património
genetico de ratinho.
-Isolamento de Células Estaminais Embrionárias de ratinho.
-Produção de quimeras por 1) injecção de células ES em blastocistos ou 2) por
agregação de mórulas.
-Inactivação dirigida de genes usando estas células.
Teórica - IX
• Isolamento de Células Estaminais Embrionárias apartir de blastocistos humanos.
Utilização em engenharia de tecidos humanos.
Considerações científicas, biomédicas e éticas.
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