UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
BIOTECNOLOGIA
CATIANE DO SACRAMENTO SOUZA
SINTASE DA QUITINA DE MONILIOPHTHORA
PERNICIOSA (STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA:
CARACTERIZAÇÃO GÊNICA E MODELAGEM DO
PROVÁVEL SÍTIO CATALÍTICO.
Feira de Santana, BA
Julho. 2007
CATIANE DO SACRAMENTO SOUZA
SINTASE DA QUITINA DE MONILIOPHTHORA
PERNICIOSA (STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA:
CARACTERIZAÇÃO GÊNICA E MODELAGEM DO
PROVÁVEL SÍTIO CATALÍTICO.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana
como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Julio Cezar de Mattos Cascardo
Co-Orientador: Prof. Dr. Aristóteles Góes-Neto
Feira de Santana, BA
Julho. 2007
BANCA EXAMINADORA
Feira de Santana – BA
2007
Aos meus pais, que em todos os momentos foram
os
melhores
pais
de
mundo.
Um
exemplo
inesgotável de amor, companheirismo, paciência,
caráter e todas as coisas boas que eu posso
imaginar. Vocês são meus “moldes” de seres
humanos.
AGRADECIMENTOS
Por chegar aqui agradeço primeiramente a A. Góes-Neto e J. C. M. Cascardo, pela
confiança, orientação, presença e apoio em minhas dúvidas e desesperos. Ao B. T. HoraJunior, B. M. Oliveira e M.C. Santos-Junior, por me revelar os primeiros segredos da
Biologia Molecular e Química Computacional. C. V. Dias, M. Lopes e C. P. Pirovani, pelo
pronto apoio sempre que solicitados. Ao pessoal do LAMOL, em especial ao R. Vilas-Boas
e A. K. Santos. À R. Galante pelas leituras que me proporcionou e pelo presença, pelos
puxões de orelha e por “tentar” polir umas arestas. Ao A. C. S. Rocha, I. K. C. Nobre, W. R.
A. Soares, R. Q. Oliveira et al. pela troca de conhecimento e pelo apoio nas “Atividades
Complementares” e afins. B. S. Andrade (uma ótima pessoa para trabalhar junto) foram
fantásticas e valiosas suas dicas em bioinformática e os riso (todos eles!!!) G. J. Bulos e M.
L. C. Pontes pelo modo novo de ver velhas fotografias e pelas intensivas experimentações
do resultado da fermentação de Vitis spp; a C. E. L. Fiuza, O. F. Paixão, J. Rodrigues, A.
Estrela, G. M. A. Aires e H. R. Carneiro-Junior pelos cafés, vinhos, ombros, ouvidos e
afins. Não poderia esquecer de agradecer a Klb. Gomes e F. José pela simples
objetividade, P. Drumond (também o poeta, mas aqui me refiro a “pessoinha”) pela
delicadeza com todas as coisas e pela presença (ainda que via-Graham Bell). À S. V.
Oliveira, Sr. Falcão e M. Camargos, por me devolver à pesquisa. A D. Sampaio por sua
insubstituível e “imaginativa” contribuição. Aos Amigos do LAPEM, em especial àqueles da
BioMol, pelos géis, pelos risos, por tudo... Aos meus pais por entenderem minha ausência.
Ao CNPq/FINEP e à PPGBiotec, pela logística, e em especial ao Mississipi Center for
Supercomputing Research pelo acesso ao Amber, e principalmente a Sra. Sônia, por ter
facilitado muita coisa.
E ao Deus, claro, por ter nos proporcionado um maravilhoso mundo codificado por genes
(que ocupam nosso tempo e enchem de significado nossas vidas), mas principalmente,
pela Cachoeira da Fumaça, pelas estrelas que reservou para o céu de lá e por ter posto
em meu caminho incríveis pessoas como, L. C. Pereira e D. M. Novaes, com quem eu
pude caminhar naquelas trilhas: Amiguinhos, amo vocês de “montanha”!!!!!
Agradecimento Especial
Pelo modo empolgante com que orienta, pela atenção, incentivo e, principalmente, por seu
envolvimento em cada passo que dei à frente, agradeço a Aristóteles Góes Neto, que foi
mais que um orientador, foi um exemplo, o melhor.
“... um passo à frente e você não está mais no mesmo lugar”.
Chico Science
SUMÁRIO
1.
2.
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
3.
3.1.
3.2.
4.
4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
4.5.
4.6.
4.7.
4.8.
4.9.1.
4.9.2.
4.9.3.
5.
5.1.
5.2.
6.
7.
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
INTRODUÇÃO
REVISÃO DA LITERATURA
O fungo Moniliophthora perniciosa
Parede Celular
A sintase da quitina
Determinação e caracterização de gene por primer walking
A busca pelo controle da doença
MÉTODOS EM BIOLOGIA COMPUTACIONAL
Química computacional
Emprego da química computacional na modelagem
comparativa
MATERIAL E MÉTODOS
Busca e anotação das prováveis seqüências do gene da
sintase da quitina do Banco de Dados do Projeto Genoma do
M. perniciosa
Desenho de oligonucleotídeos iniciadores
Extração e purificação do DNA total de M. perniciosa
Amplificação de fragmentos de DNA genômico
Seqüenciamento
Análise das seqüências
Análise filogenética
Determinação da estrutura 3D: Modelagem da região
conservada contendo o sítio ativo
Identificação e alinhamento seqüencial da proteína molde
Construção e refinamento do modelo
Validação
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Seqüenciamento do gene da sintase da quitina
Resultados em Química Computacional
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS
07
08
09
13
14
15
18
18
22
25
28
29
31
34
38
49
50
53
54
54
74
98
100
APÊNDICES
112
41
42
43
43
44
46
47
48
49
RESUMO
A sintase da quitina (CHS) converte UDP-N-acetilglicosamina em quitina, o
principal componente da parede celular de fungos. Esta glicosiltransferase tem
cinco diferentes níveis de expressão, dependendo do estádio do ciclo da vida do
fungo. A sintase da quitina classe III age diretamente na formação da parede
celular, são responsáveis por muitas das quitinas na célula e é, por isso, um alvo
molecular altamente especifico para fármacos que podem inibir o crescimento e
desenvolvimento do fungo patogênico, pois a CHS é um precursor imediato da
quitina e cataliza uma reação irreversível. Este trabalho objetivou a caracterização
molecular experimental e in silico do gene da sintase da quitina de Moniliophthora
perniciosa, (MopCHS), um provável homólogo do gene chs1 do Agaricus bisporus.
Os contigs de M. perniciosa foram mapeados com, uma cobertura de
aproximadamente 80% no produto gênico de A. bisporus com alta significância
estatística, e pares de oligonucleotideos iniciadores foram produzidos para garantir
a amplificação para o seqüenciamento de dois intervalos do provável gene
MopCHS por primer walking. Após o sequenciamento completo do gene, que
compreende 3443 pb (14 éxons e 13 íntrons), constituindo um cDNA com uma fase
de leitura aberta com 2739 pb e codificando uma proteína com 913 aa, um modelo
do provável sitio ativo foi construído pelo método de modelagem por homologia.
Um dos homólogos utilizado, o 1Z3X, apresentou 61% de identidade. O modelo foi
construído pelo Swiss Model e refinado por cálculos de Mecânica e Dinâmica
Molecular executados pelos campos de força presentes no BioMediCache 6.1
(MM3) e Amber 8.0 (ff99). A qualidade do modelo resultante foi testada pelo
programa Procheck 3.0 e ANOLEA. O gráfico de Ramachandran produzido
mostrou que o modelo proposto tem cerca de 94,5% de seus resíduos nas regiões
favoráveis. O completo conhecimento da geometria do sítio ativo de MopCHS será
útil para desenvolver inibidores contra a doença vassoura-de-bruxa.
Palavras-chave: Moniliophthora perniciosa, sintase da quitina, seqüenciamento,
estrutura 3D, homologia.
ABSTRACT
Chitin synthases (CHS) converts UDP-N-acetylglycosamine into chitin, the
main component of the fungal cell wall. These glycosyltransferases have five
different expression levels depending on the fungal life cycle stage. Class III chitin
synthases act directly in the formation of the cellular wall, are responsible for most
of the chitin synthesis in the cell, and are, therefore, a highly specific molecular
target for drugs that could inhibit the growth and development of pathogenic fungi,
since CHS is the immediate precursor of chitin and catalyzes an irreversible
reaction. This work aims to an in silico and experimental molecular characterization
of Moniliophthora perniciosa chitin synthase gene (MopCHS), a putative
homologous of Agaricus bisporus chs1 gene. M. perniciosa contigs were
successfully mapped onto A. bisporus CHS gene product, with a coverage of
approximately 80% with high statistical significance, and pairs of primers were
produced to generate amplicons for sequencing two gaps inside the putative M.
perniciosa gene by primer walking. After the complete sequencing of the gene,
which has 3443 pb (14 exons and 13 introns), a cDNA ORF with 2739 pb and
codes for a protein with 913 aa, a model of active site was constructed using
Homology Modeling approach. The homologous 1Z3X, with 61% identity, was used
as one of the templates. The model was constructed using Swiss Model and refined
by a set of Molecular Mechanics and Molecular Dynamics calculation, both using
MM3 force field in BioMedCache 6.1. and ff99 from Amber 8.0. The quality of
resultant model was evaluated by Procheck 3.0 and ANOLEA. Ramachandran plot
indicated that the model has 94,5% of residues in the most favored regions. The
complete knowledge about the geometry of active site of MopCHS will be useful to
develop new inhibitors against witches’ broom disease.
Keywords: Moniliophthora perniciosa, sequencing, chitin synthase, 3D structure,
homology.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Aspecto da doença vassoura-de–bruxa nos botões florais e nos frutos de cacau
causados pelo M. perniciosa (Fonte: AIME, PHILLIPS-MORA, 2005).
19
Figura 02: Ciclo de vida do M. perniciosa. As partes em azul e laranja do ciclo
correspondem às fases biotrófica e saprofítica, respectivamente. Em verde, está delimitada
à parte do ciclo do fungo na sua interação com a planta do cacau, e em amarelo, está a
parte do ciclo que ocorre fora do hospedeiro (Adaptado de LOPES, 2005).
21
Figura 03: Polimerização da UDP-GlcNAc pela sintase da quitina para formar a quitina
(Fonte: YEAGER, FINNEY, 2004).
24
Figura 04: Representação da parede celular de A. fumigatus Fresen, com destaque para a
biossíntese de α-1-3-glicano e quitina que são sintetizados por diferentes famílias de genes
com diferentes funções, entre eles está a sintase da quitina (Fonte: BEAUVAIS, 2003).
24
Figura 05: Rota metabólica da sintase da quitina na síntese da parede celular. (1)
Glutamina-frutose-6-fosfato amidotransferase (EC 2.6.1.16); (2) Glicosamina fosfato Nacetiltransferase (EC 2.3.1.4); (3) fosfo-N-acetilglicosamina mutase (EC 5.4.2.3); (4) UDPN-acetilglicosamina pirofosforilase (EC 2.7.7.23) e (5) Sintase da quitina (EC 2.4.1.16)
(Fonte: LAGORCE et al., 2002; HOGENKAMP, 2006).
27
Figura 06: Movimentos atômicos de estiramento de ligação, de deformação angular, de
torção e interação entre átomos não ligados.
35
Figura 07: Superfície de Energia Potencial.
38
Figura 08: Fluxograma da metodologia utilizada para a determinação da seqüência primária
do gene da sintase da quitina do fungo M.perniciosa e posterior construção do modelo 3D
do provável produto gênico.
41
Figura 09: Esquema representativo do gene da sintase da quitina, com destaque para os
fragmentos amplificados e seqüenciados neste trabalho. O icontig5 está representado em
amarelo, icontig3 em azul e o contig4 em vermelho. Em branco estão as regiões
inicialmente desconhecidas que foram determinadas por primer walking.
44
Figura 10: Processo de alinhamento da seqüência problema com o molde. A: em verde,
fragmento da estrutura primária da seqüência de sintase da quitina de M. Perniciosa, em
vermelho está a região da seqüência que apresenta identidade com o molde, e em laranja,
a região do molde que tem identidade com a seqüência; B: Estrutura e molde alinhados,
com a estrutura molde sobreposta pela seqüencial problema (Fonte: Swiss PDB Viewer
3.7).
50
Figura 11: Fluxograma da metodologia para construção do modelo.
52
Figura 12: Chs1 de Agaricus bisporus (909aa). Destaque para a delimitação das regiões de
similaridade, obtida por BLAST, com contigs de M. perniciosa. Amarelo: icontig 5 - Fase de
leitura +1: Valor-E = 1e-88, Identidade = 55%, Positividade = 63%, Gaps = 12%, Fase de
leitura +2: Valor-E = 1e-37, Identidade = 91%, Positividade = 98%, Gaps = 0% e Fase de
leitura +3: Valor-E = 1e-37, Identidade = 83%, Positividade = 91%, Gaps = 0%; Azul: icontig
3 - Valor-E = 6e-37 Identidade = 78%, Positividade = 81%, Gaps = 0%; Verde: icontig 4 Valor-E = 1e-82, Identidade = 58%, Positividade = 66%, Gaps = 24%, 690 aminoácidos
(aprox. 76% do total de 909 aa). Aminoácidos em negrito correspondem ao alvo do par de
primers Pchsic13.3 e Pchsic34, respectivamente; Aminoácidos grifados
54
Figura 13: Alinhamento entre o icontig5 de M. perniciosa e a região inicial da seqüência
codante do cDNA da CHS de M. perniciosa com A. Bisporus (emb|CAB96110.1), P.
ostreatus (dbj|BAF37219.1) e P. graminis
(gb|ABB70409.1) (Fonte: Resultados
experimentais, http://tcoffee.vital-it.ch/).
56
Figura 14: A - Tradução da região inicial do iContig5 na fase de leitura +1. A - Os
aminoácidos em azul representam o início da similaridade, por BLASTX, com A. bisporus;
destaque, em verde, para o provável códon de iniciação que está situado a sete
aminoácidos antes do início do BLAST, com o sexto aminoácido da referida enzima. Em
vermelho, provável região promotora (TATA BOX), B - Cromatograma do sequenciamento
56
da placa CP02-S1-000-015-C08-EM-F na região do provável TATA BOX, disponível no
banco de dados do genoma do M. perniciosa (Fonte: Resultado experimental gerado pelo
programa FinchTV).
Figura 15: Alinhamento mostrando a região do domínio característico das sintases da
quitina e provável sítio catalítico em Basidiomycota.
57
Figura 16: Análise eletroforética dos produtos de amplificação do DNA total do M. perniciosa via
PCR. No gel de agarose a 1,0% foi aplicado 3 µL do produto da reação de amplificação em
cada poço. A eletroforese ocorreu por 90 min., 60 v e 50 mA. M - Marcador de massa molecular
100 base pair Ladder da Fermentas®. Condições experimentais: 2,5 µL de tampão de
amplificação a 10x; 0,5 µL do mix de dNTPs a 10 mM; 0,8 µL de MgCl2 a 50 mM; 1,0 µL de cada
oligonucleotídeo específico a 10 pMol; 1,0 µL de gDNA de M. perniciosa (12,5 ng); 0,13 µL de
Taq DNA Polymerase (5U/µL) da Phoneutria® e água ultrapura (q.s.p. 25 µL). 1 e 2 Fragmentos de cerca de 290 pb obtido com o par de oligonucleotideo Pchsic34F e Pchsic34R.
A desnaturação procedeu-se a 94 ºC por 1 min, anelamento a 59,7 ºC por 1 min. e extensão a
72 ºC por 2 min., perfazendo 34 ciclos com extensão final de 72 ºC por 1 min. 3 e 4 - Fragmento
de cerca de 480 pb obtido com o par de oligonucleotideo CHSiC13.3F e CHSiC13.3R. A
desnaturação procedeu-se a 94 ºC por 1 min, anelamento a 61,6 ºC por 1 min. e extensão a 72
ºC por 2 min., perfazendo 34 ciclos com extensão final de 72 ºC por 2 min.
58
Figura 17: Análise eletroforética dos produtos de amplificação do DNA total do M. perniciosa por
PCR. Condições experimentais: 2,5 µL de tampão de amplificação a 10x; 0,5 µL do mix de
dNTPs a 10 mM; 0,8 µL de MgCl2 a 50 mM; 1,0 µL de cada oligonucleotídeo específico a 10
pMol; 1,0 µL de gDNA de M. perniciosa (12,5 ng); 0,13 µL de Taq Platinum DNA Polymerase
(5U/µL) da Invitrogen® e água ultrapura (q.s.p. 25 µL). A desnaturação procedeu-se a 94 ºC por
3 min, anelamento a 65,0 ºC por 1 min. e extensão a 72 ºC por 2 min., perfazendo 34 ciclos com
extensão final de 72 ºC por 10 min. Análise de 3 µL do produto da reação de amplificação em
gel de agarose a 1,2%, por 120 min., 60 v e 50 mA. M - Marcador de massa molecular DNA
Step Ladder Promega®; 1 e 2 - Pchs54-F/Pchsic13.3-R, com fragmento de 1700 pb; 3 e 4 Pchsic13.3F/PchsiC34R, com fragmento de 1400 pb; 5 e 6 - PchsiC34F/Pchs54F, com
fragmento de 1100 pb e 7 e 8 – Pchs54F/Pchs54R, com fragmento de aproximadamente 4000
pb.
59
Figura 18: Esquema representativo demonstrando a organização do gDNA da sintase da
quitina de M. perniciosa. As linhas representam os éxons e as barras verticais os íntrons.
60
Figura 19: Predição da topologia de hélices transmembranares na sintase da quitina
(Fonte: TMHMM).
61
Figura 20: Localização dos domínios que são considerados consenso e que identificam a
sintase da quitina e caracterizam a Classe III e a Divisão 1.
63
Figura 21: Domínios conservados da sintase da quitina de M. perniciosa nos bancos de
e-62
e-25
dados: pfam01644, com Valor-E 2 , pfam08407 com valor-E 7 , COG1215 com Valor-E
e-22
e-19
2
e pfam03142 com Valor-E 4 .
64
Figura 22: Método de inferência bayesiana. A identificação completa dos fungos utilizados
está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por
valores percentuais de probabilidade posterior.
66
Figura 23: Método de distância. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita
na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores
percentuais de bootstrap.
67
Figura 24: Máxima Verossimilhança. A identificação completa dos fungos utilizados está
descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por
valores percentuais de bootstrap.
68
Figura 25: Método da Parcimônia. A identificação completa dos fungos utilizados está
descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por
valores percentuais de bootstrap.
69
Figura 26: Consenso de maioria dos quatro diferentes métodos. A identificação completa
dos fungos utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem
aos valores percentuais de ocorrência dos grupos formados nos quatro diferentes métodos.
70
Figura 27: A - Esquema representativo do gene da sintase da quitina de M. perniciosa, a
porção em vermelho corresponde à região conservada utilizada na construção da estrutura
tridimensional; B: Alinhamento da seqüência da sintase da quitina de M. perniciosa com A.
bisporus (CAB96110.1), C. cinerea (EAU84753.1), P. ostreatus (BAF37219.1), C.
neoformans (AAW43575.2) e P. graminis (ABB70408.1), com destaque para a região
conservada. Os aminoácidos em negrito correspondem àqueles utilizados no modelo
proposto (Fonte: Notradame et al., 2000 <http://www.tcoffee.org>).
75
Figura 28: PSI-BLAST contra o banco de dados do PDB, mostrando o alinhamento dos
fragmentos com os moldes das estruturas correspondentes.
76
Figura 29: Resultado da submissão dos projetos dos fragmentos com os moldes da
estrutura correspondentes (Fonte: Swiss PDB Viewer 3.7).
77
Figura 30: Modelos construídos a partir das seqüências fragmentadas. Em A: Estrutura
resultante da submissão do fragmento achs1 com o molde 2D4W; B: fragmento achs2 com
o molde 2BYT; C: fragmento achs3 com o molde 1Z3X; D: fragmento achs4 com o molde
2HY5 e E: modelo 0CSM, resultante da junção dos modelos iniciais gerados no Swiss
Model, sem refinamento, para a região conservada da sintase da quitina (Fonte: VMD
1.8.6).
79
Figura 31: Validação representada pelo gráfico de Ramachandran (Procheck 3.0) dos
fragmentos que compõem o modelo 3D da região conservada da sintase da quitina. Em A fragmento achs1; B - fragmento achs2; C: fragmento achs3 e D: fragmento achs4.
80
Figura 32: Destaque para as α-hélices (A) e folhas-β (B) que compõem o modelo proposto.
81
Figura 33: Gráfico de Ramachandran (Procheck 3.0) do modelo 0CSM da região
conservada da sintase da quitina. Em A: Ramachandran da estrutura; B: Ramachandran da
Glicina e C: Ramachandran da Prolina, onde se pode notar, em destaque o resíduo Pro211 em região desfavorável (Fonte: Procheck 3.0).
83
Figura 34: De A até N- Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos. Os números de resíduos são
mostrados entre parênteses, e a coloração vermelha representa o resíduo que está com o
ângulos desfavoráveis; as regiões sombreadas representam a áreas favoráveis (Fonte:
Procheck 3.0).
84
Figura 35: Qualidade da cadeia principal do modelo 0CSM: A - avaliação do gráfico de
Ramachandran; B - planaridade da ligação peptídica; C - interações ruins; D - distorção dos
carbonos alfa; E - energia das ligações de hidrogênio.O eixo das abscissas está descrito
em graus, e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
85
Figura 36: Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para o modelo 0CSM região
conservada da sintase da quitina: A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans;
C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E:
Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das abscissas está descrito em
graus, e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0)
86
Figura 37: Gráfico do ANOLEA (energia potencial de cada átomo na cadeia de proteína).
As projeções em vermelho referem-se a um valor positivo de energia potencial para cada
resíduo, e as projeções em verde identificam os valores de energia que são satisfatórios,
ou seja, os valores negativos (Fonte: Swiss Model).
87
Figura 38: Mapas gerados pela dinâmica realizada pelo BioMedCache 6.1. Os pontos em
cinza indicam a posição das moléculas de menor energia. Em A: Dinâmica Molecular
realizada para a Hélice h3; B: Dinâmica Molecular realizada para a Hélice h4, C: Dinâmica
Molecular realizada para a Hélice h5 e D: Dinâmica Molecular realizada A Hélice h6.
89
Figura 39: Mapa gerado pela dinâmica molecular de 200 ps realizada pelo Amber 8.0.
90
Figura 40: Representação gráfica da validação dos modelos do gene da sintase da quitina
após a realização da dinâmica molecular. A e B – Modelos CHS-a1 e CHS-a2, submetidos
ao campo de força MM3 (BioMedCache), C, D, E, F e G – Modelos 1csm, 2csm, 3csm,
4csm e 5csm, respectivamente, resultantes do campo de força ff99 (Amber). Destaque, em
vermelho, para o grafico que a presentou o melhor valor de energia (Fonte: ANOLEA).
91
Figura 41: Gráfico de Ramachandran para o modelo 4csm proposto para a região
93
conservada da sintase da quitina do M. perniciosa.
Figura 42: Analise da cadeia principal do modelo 4csm: A - avaliação do gráfico de
Ramachandran; B - planaridade da ligação peptídica; C - interações ruins entre os átomos
não-ligados; D - distorção dos angulos tetraedricos dos carbonos alfa; E - energia das
ligações de hidrogênio.O eixo das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
94
Figura 43: Análise da cadeia lateral do modelo 4CSM da região conservada da sintase da
quitina: A - Conformação gauche menos; B - Conformação trans; C - Conformação gauche
mais; D - Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E - Conformação trans para o
ângulo torcional Chi2. O eixo das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
95
Figura 44: Modelo 4CSM final. A - Destaque para a região do provável domínio catalítico
do gene da sintase da quitina do Moniliophthora perniciosa; B - Região do provável domínio
catalítico em destaque e C – Representação tridimensional do modelo 4CSM (Amber)
gerado pelo VMD 1.8.6. Os hidrogênios dos átomos de carbono foram suprimidos para
uma melhor visualização.
97
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para determinar as regiões
desconhecidas do gene da sintase da quitina do fungo causador da vassoura-de-bruxa.
45
Tabela 02: Seqüências do M. perniciosa relacionados aos genes da sintase da quitina em
Agaricus bisporus (emb|CAB96110.1) identificados por BLASTx.
55
Tabela 03: Característica da organização dos éxons e íntrons do gene da sintase da quitina
de M. perniciosa.
60
Tabela 04: Predição de Hélices transmembrana para o gene MopCHS.
61
Tabela 05: Predição das topologias transmembranares das sintase da quitina de
Basidiomicota, obtida em análise realizada pelo TMHMM.
62
Tabela 06: Alinhamento com pontuação de alta significância do provável produto gênico
(sintase da quitina) de M. perniciosa contra a base de dados do Pfam.
64
TABELA 07: Seqüências de sintase da quitina (CHS) de Basidiomycota e Ascomycota com
valor esperado (E) = 0,0 e identidade = ou > que 50%.
71
Tabela 08: Identificação dos moldes utilizados para construção do modelo 3D da sintase da
quitina de M. perniciosa.
77
Tabela 09: Sumário dos gráficos de Ramachandran para os fragmentos que compõem o
modelo 3D da região conservada da sintase da quitina.
80
Tabela 10: Sumário dos modelos gerados para a região conservada do gene da sintase da
quitina destacando o resultado da validação representada pelo gráfico de Ramachandran
realizada pelo Procheck 3.0
88
Tabela 11: Sumário dos resíduos de aminoácidos que apresentaram valor de energia
positiva na análise do ANOLEA.
92
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% - Percentagem
µL - Microlitros
10X - Dez vezes concentrado
1X - Concentração para uso normal
CCMB – Coleção de cultura microbiológica da Bahia
CEPLAC - Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira
CHS – Gene da sintase da quitina
DFT - Teoria do funcional de densidade
DM – Dinâmica Molecular
DNA - Ácido desoxirribonucléico
dNTP - Desoxirribonucleotídeo
EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético
EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
K – Graus Kelvin
Kb - Kilobases
KDa – Kilodaltons
M - Molar
mA - Miliamper
min - Minutos
mL - Mililitros
mM – Milimolar
MpCHS – Gene da sintase da quitina de Moniliophthora perniciosa
ng - Nanogramas
nº - Número
ºC - Graus centígrados
pb - Pares de bases
PCR - Reação em cadeia da polimerase
pH - Potencial hidrogeniônico
pI – Ponto isoelétrico
pmol - Picomoles
ps - picossegundos
q.s.p. - Quantidade suficiente para
QM/MM – Quantum-Mecanical/Molecular-Mecanical
RMS - Rout mean square
RNAse - Ribonuclease
SDS - Sódio dodecil sulfato
seg - Segundos
SEP – Superfície de Energia Potencial
TAE - Tampão Tris, Acetato e EDTA
Tris - Tri(hidroximetil)aminometano
U - Unidade de atividade enzimática
UEFS - Universidade Estadual de Feira de Santana
UESC - Universidade Estadual de Santa Cruz
UFBA - Universidade Federal da Bahia
UNICAMP - Universidade Estadual de Campinas
UV - Ultravioleta
v/v - Volume por volume
15
1. INTRODUÇÃO
Nativa da Amazônia, a planta do cacau (Theobroma cacao L.) é uma
espécie arbórea, que tem como principal produto comercial suas amêndoas, a
matéria-prima do chocolate (SANTOS, 2005). No início do século 20 as maiores
regiões produtoras de cacau do mundo eram o litoral do Equador e o Estado da
Bahia no Brasil (LASS, 1985). Na década de 70, cerca de 90% da produção de
cacau no Brasil era destinada a exportação (BASTOS, 1987). Deste total 80% era
produzido na Bahia, que nos anos 80 chegou a produzir cerca de 400.000
toneladas. Os maiores problemas da cultura cacaueira são os fungos patogênicos,
principalmente o Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora, o
causador da vassoura-de-bruxa, considerado como o mais devastador deles
(ALMEIDA, ANDEBHAN, 1987).
No sul da Bahia a cacauicultura sofreu prejuízos econômicos de grande
escala devido à propagação deste patógeno, que foi detectada na Bahia em 1989.
No ano 2000 a produção baiana foi reduzida em cerca de 50% (FAO, 2002) devido
à presença da vassoura-de-bruxa, que retirou o Brasil do grupo dos paises
exportadores de cacau, e trouxe complexos problemas de caráter social,
econômico e ecológico para as regiões produtoras (ANDEBRHAN et al., 1999;
BASTOS, 1990). O fungo infecta os lançamentos foliares novos, os frutos em
desenvolvimento e as almofadas florais, podendo até provocar a morte da planta
quando afetada por sucessivos ciclos do patógeno associados a fatores abióticos
(QUEIROZ et al., 2003).
Com base nessas implicações, foi estruturada a Rede de Genômica do
Estado da Bahia e implantado o Projeto Genoma do M. perniciosa, o fungo
causador da vassoura-de-bruxa, com o objetivo de fornecer dados para o
desenvolvimento e controle da doença. A rede conta com seis laboratórios, dos
quais cinco estão situados no estado da Bahia (UESC, UEFS, UFBA e CEPLAC).
O Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) da Universidade Estadual de
Feira de Santana é um dos laboratórios desta rede. Mais de 155.900 seqüências já
foram obtidas e inúmeros genes de interesse têm sido identificados (PEREIRA,
2004).
16
Os estudos do genoma da vassoura-de-bruxa buscam soluções para este
problema, sendo que o seqüenciamento gênico, seguido dos estudos de
proteômica, possibilita um avanço considerável na compreensão da biologia do
fungo. Interações moleculares e transformações químicas têm sido a base da
biologia, e todo fenômeno biológico que pode ser atualmente analisado pode ser
traçado por processos químicos (GOLDSMITH-FISCHMAN, HONIG, 2003).
Na busca por um controle efetivo da doença, a caracterização bioquímica e
funcional de produtos gênicos (PIROVANI et al., 2005), a prospecção e o
desenvolvimento de inibidores específicos são de importância fundamental. Os
genes codificadores de enzimas associadas ao metabolismo dos principais
carboidratos da parede celular, quitina e glicanos, quando bem caracterizados
quanto à forma de regulação da expressão e quanto à ação dos produtos gênicos,
podem ser alvo de interferência, e promover a instabilidade das paredes celulares
do fungo, que podem levar à autodestruição das hifas e, conseqüentemente, a
inibição do crescimento do patógeno (GEORGOPAPADAKOU, TKACZ, 1995). A
inibição da enzima sintase da quitina, responsável pelo metabolismo de quitina, por
exemplo, é uma estratégia de controle de vários fungos patogênicos (COLE,
HUNG, 2001). O entendimento do funcionamento do metabolismo do fitopatógeno
a partir dos dados moleculares poderá levar ao desenvolvimento de diversas
estratégias de controle da doença.
A sintase da quitina constitui-se essencialmente por folhas-β. É classificada
como uma enzima da família glicosiltransferase, sendo oficialmente denominada de
UDP-N-acetil-D-glicosamina: quitina 4-β-N-acetilglicosamina-transferase. Outras
demoninações também encontradas na literatura científica são: quitina-UDP-Nacetilglicosaminatransferase, quitina-uridina difosfato acetilglicosaminatransferase
ou trans-N-acetilglicosaminasilase (DBGET, 2005).
Os antibióticos nucleosídios-peptídios, polioxina e nicomicina são inibidores
competitivos da sintase da quitina (GEORGOPAPADAKOU, TKACZ, 1995) e, ao
menos em sistemas animais, como mamíferos, não apresentam toxicidade,
representando um modelo potencial para o tratamento de infecções causadas por
fungos (ZHANG, MILLER, 1999). Quanto mais seletivo for o fármaco ou pesticida
para seu alvo, menos chance terá de interagir com diferentes alvos ou de causar
reações adversas indesejáveis (PATRICK, 2001), e, considerando que a quitina é
essencial para a constituição da parede celular do fungo, e está ausente em
17
plantas, é um potencial alvo antifúngico (GEORGOPAPADAKOU, TKACZ, 1995).
Por ser exclusiva do fungo no patossistema Moniliophthora perniciosa/Theobroma
cacao, a sintase da quitina constitui-se, portanto, em um alvo potencial para
compostos inibidores do desenvolvimento da parede celular deste fitopatógeno. A
construção
de
um modelo
refinado e
validado para posterior uso no
desenvolvimento de inibidores através da metodologia de docking, que consiste na
aplicação de metodologias computacionais para estudar a interação entre o
complexo proteína-ligante (TAUFER, 2004), é uma estratégia que pode ser usada
para encontrar um agente químico eficaz contra a vassoura-de-bruxa do cacaueiro.
Este trabalho teve como objetivos: (i) identificar e caracterizar, no M.
perniciosa, a seqüência primária do gene da sintase da quitina em DNA genômico,
e (ii) caracterizar a estrutura tridimensional da região filogeneticamente conservada
desta enzima, contendo o sítio catalítico, por modelagem comparativa.
18
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1.
O fungo Moniliophthora perniciosa
O fungo considerado o agente etiológico da doença do cacaueiro
(Theobroma cacao L.), popularmente conhecida, a vassoura-de-bruxa, foi
inicialmente descrito como Marasmius perniciosa Stahel. Após a revisão do gênero
Marasmius por Singer, a espécie foi transferida para o gênero Crinipellis sobre o
binômio C. perniciosa (Stahel) Singer (GRIFFITH, et al., 2003; PURDY, SCHMIDT,
1996), e, atualmente, como resultado de estudos de filogenia molecular de
representantes de Marasmiaceae, realizados por AIME, PHILLIPS–MORA (2005) é
validamente reconhecido como Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & PhillipsMora.
A primeira descrição da doença vassoura-de-bruxa foi feita pelo naturalista
brasileiro Alexandre Rodrigues Ferreira, por volta de 1785, mas esta patologia
somente se tornou conhecida quando os sintomas de um surto ocorrido no
Suriname em 1895 foram descritos em 1904 por Went (GRIFFTH et al., 1994).
Trata-se de um Basidiomycota, Agaricales, com característicos filamentos
pseudoamilóides no píleo (SINGER, 1986). O M. perniciosa não é um parasita
exclusivo do cacaueiro, podendo ocorrer em outras Malvaceae, como T.
grandiflorum Schum. (cupuaçu) e T. speciousum Willd. (cacauí) (BASTOS, EVANS,
1985). Ocorre ainda, em representantes de outras famílias, como Bignoniaceae,
Bixaceae e Malpighiaceae que não são filogeneticamente próximos ao cacaueiro
(GRIFFITH, et al., 2003). Segundo a classificação de BASTOS (1988) apresenta-se
em quatro diferentes biótipos que se distinguem por seus grupos de hospedeiros, e
nos quais sintomas similares aos do cacaueiro infectado podem ser encontrados. O
biótipo C afeta T. cacao e espécies filogeneticamente próximas, como espécies do
gênero Theobroma (BASTOS, EVANS, 1985). Os biótipos S e B afetam,
respectivamente, plantas das famílias Solanaceae e a espécie Bixa orellana L.,
enquanto o biótipo L afeta plantas da família Bignoniaceae (principalmente
Arrabidaea verrucosa (Standl.) A. H. Gentry), mas não causa os sintomas da
doença no hospedeiro. O biótipo L é heterotálico (auto-estéril) e apresenta uma
distribuição geográfica restrita (GRIFFITH, HEDGER, 1994). Evidências culturais e
19
moleculares sugerem uma maior identidade entre os biótipos B e C enquanto que
perfis isoenzimáticos e o DNA mitocondrial diferenciam os biótipos S e C
(GRIFFTH et al., 1994). O biótipo C é tipicamente homotálico (auto-fértil) e
apresenta um ciclo de vida hemibiotrófico, no qual o fungo invade os tecidos
meristemáticos
da
planta
hospedeira
como
um
parasita
biotrófico, mas
posteriormente cresce saprofiticamente sobre os tecidos mortos.
O M. perniciosa provavelmente se originou na bacia amazônica e é o único
patógeno do cacau que se desenvolve concomitantemente à planta (FIGURA 01).
Seu surgimento na Bahia em 1989 foi responsável por 95% de perda na produção
do cacau (PEREIRA et al., 1990; ISAAC et al. 1993), porém são conhecidas
algumas variedades resistentes à doença em seu habitat natural (PURDY,
SCHMIDT, 1996).
Figura 01: Aspecto da doença vassoura-de–bruxa nos botões florais (a) e nos frutos de cacau (b)
causados pelo M. perniciosa (Fonte: AIME, PHILLIPS-MORA, 2005).
As estruturas capazes de infectar o cacaueiro em condições naturais são os
basidiósporos uninucleados, produzidos em lamelas na parte inferior do píleo do
basidioma onde os dois núcleos dos compartimentos hifais da hifa dicariótica da
camada do himênio migram para dentro do basídio onde ocorre a fusão nuclear
(LOPES, 2006). A penetração dos basidiósporos no hospedeiro se dá por meio de
estômatos e ferimentos nas bases de tricomas lesados (SREENIVASAN,
20
DABYDEEN, 1989). A infecção se inicia com o crescimento dos tubos germinativos
dos basidiósporos em tecidos meristemáticos da planta, como os brotos apicais, as
flores e os frutos (MUSE et al., 1996; ORCHARD et al., 1994). O patógeno causa
uma desordem fisiológica na planta, provavelmente alterando o seu balanço
hormonal, o que resulta na hipertrofia e hiperplasia das células dos tecidos
infectados. O brotamento de gemas laterais dos ramos é aumentado, dando o
aspecto de uma vassoura, na qual os ramos são visivelmente mais espessos que o
ramo original (LOPES, 2005 citando BAKER, CROWDY, 1943).
A liberação dos basidiósporos ocorre quando as condições ambientais são
de umidade próxima da saturação (>99% de umidade relativa) e a temperatura
entre 20 a 30 °C (ROCHA, WHELLER, 1985). São libera dos à noite e sua
dispersão se dá pela chuva e pelo vento. A altura em que os basidiósporos são
produzidos é importante no desenvolvimento da doença (COSTA, 1993). Na
superfície do solo as vassouras produzem poucos basidiomas e há uma menor
chance dos basidiósporos atingirem os órgãos suscetíveis. Já nas áreas mais
altas, a disseminação atinge maiores distâncias (ANDERBRHAN et al., 1993) de
modo que as principais fontes de inóculo são as vassouras localizadas na copa
(ANDEBRHAN et al., 1985; COSTA, 1993). É improvável que os basidiósporos se
dispersem por distâncias superiores a 60 km, pois são sensíveis as radiações UVB e podem perder sua capacidade de germinação devido à dessecação (FRIAS et
al., 1991; ANDEBRHAN et al., 1993).
Estes basidiósporos penetram no hospedeiro ao atingirem os tecidos
meristemáticos dos órgãos de plantas sadias e ocorre o desenvolvimento de hifas
espessas, não-fibuladas localizadas intercelularmente nos tecidos infectados que
caracterizam o micélio primário ou biotrófico. A dicariotização do micélio ocorre
após um período que varia de três a nove semanas, ocorrendo a formação de um
micélio secundário, com hifas mais delgadas (1-3 µm de diâmetro) e apresentando
fíbulas (ansas ou grampos de conexão), que invade as células do tecido
hospedeiro, levando à morte dos ramos. Esta é a fase saprofítica da doença
denominada “vassoura seca”. Duas hipóteses explicam a morte da vassoura: a
primeira, segundo Orchard et al. (1994), afirma que as células morreriam devido à
infecção primária, induzindo a dicariotização do fungo enquanto que na hipótese
formulada por Evans (1980), primeiro ocorreria a dicariotização, responsável pela
fase saprofítica e, posteriormente, a morte da vassoura. Da quarta a oitava
21
semanas após o início das chuvas, os basidiomas se desenvolvem do micélio
dicariótico dos tecidos necróticos, e produzem basidiósporos. As vassouras, agora
necróticas e de coloração amarronzada, podem permanecer presas à planta ou se
destacar e cair ao solo (ISAAC et al., 1993; PURDY, SCHMIDT, 1996). BAKER,
CROWDY (1943) citados por Lopes (2005) descrevem que em locais onde a
estação seca é bem definida, o fungo sobrevive de forma latente nas vassouras
secas e frutos mumificados até o início da estação chuvosa, quando ocorre, então,
novamente, a formação dos basidiomas (Figura 02).
Figura 02: Ciclo de vida do M. perniciosa. As partes em azul e laranja do ciclo correspondem às
fases biotrófica e saprofítica, respectivamente. Em verde, está delimitada à parte do ciclo do fungo
na sua interação com a planta do cacau, e em amarelo, está a parte do ciclo que ocorre fora do
hospedeiro (Adaptado de LOPES, 2005).
22
2.2. Parede Celular
A parede celular é uma estrutura externa a membrana plasmática da qual
depende a vida da hifa ou célula fúngica. É um arcabouço que sustenta a célula do
fungo e ao mesmo tempo interage com o ambiente. Sua integridade é essencial à
sobrevivência de suas hifas em ambientes hostis, e está presente nas hifas (fungos
filamentosos) ou células (leveduras) dos diferentes grupos fúngicos (RONCERO,
2002). É ela que protege a célula fúngica contra variações osmóticas, químicas e
biológicas, e está envolvida em várias outras funções incluindo morfogênese,
expressão antigênica, adesão e interação célula-célula, e ainda desempenha papel
fundamental no crescimento, desenvolvimento e interações dos fungos com o
ambiente e com outras células (WESSELS, 1993). É uma estrutura onde a
arquitetura e composição é regulada de forma coordenada com o crescimento da
célula (CABIB, SBURLATI, 1989), tendo polissacarídeos e glicoproteínas como
seus principais componentes (KOLLÁR et al., 1997). É altamente dinâmica e está
sujeita às constantes mudanças, como, por exemplo, durante a expansão e divisão
celular nas leveduras, e durante a germinação de esporos e formação de septos e
crescimento apical de hifas em fungos filamentosos (ADAMS, 2004).
Pesquisas de genômica e proteômica têm demonstrado que em ascomicetos
há incorporação altamente controlada de um grande número de diferentes
proteínas em suas paredes. A composição destas proteínas de parede celular pode
variar dependendo da fase do ciclo celular em que se encontram, condições
ambientais e o estádio de desenvolvimento (DE GROOT, et al., 2005). Na levedura
Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen, a parede contém áreas
representativas onde os quatro maiores componentes, quitina, β-(1,3)-D-glicano
(Figura
03),
β-(1,6)-D-glicano
e
manoproteínas,
encontram-se
ligados.
A
descoberta da existência dessas ligações covalentes entre estes diferentes
constituintes confirma que os polissacarídeos têm uma função estrutural,
conferindo a forma e a alta resistência da parede celular dos fungos (KOLLÁR et
al., 1997) (Figura 04).
Segundo Cabib et al. (2001), em leveduras, o β-(1,3)-D-glicano é o maior
componente estrutural da parede celular, β-(1,6)-D-glicano está relativamente em
menor quantidade, mas é muito importante para a formação de ligações cruzadas.
23
As manoproteínas formam uma camada localizada na superfície externa, e agem
como um filtro para moléculas de grande peso. O polissacarídeo quitina é o que
está presente em menor quantidade (1-3%), estando concentrado na região do
septo, embora possa estar disperso através da parede. Ainda que esteja em menor
quantidade, a quitina é essencial para a sobrevivência das leveduras,
provavelmente devido ao seu papel central na formação do septo.
Alguns autores consideram que a quitina é derivada da celulose, pois ambos
os polímeros compartilham grande similaridade em estruturas moleculares e na
função (MERZENDORFER, 2006). A quitina é um polímero linear de N-acetilglicosamina cristalino, cuja resistência se deve às ligações hidrogênio ao longo da
cadeia enquanto está sendo formada (RONCERO, 2002).
Análises de difração de raio-X mostram que a quitina é polimórfica,
ocorrendo em três formas cristalinas, quitina-α, quitina-β e quitina-γ, que diferem
principalmente no grau de hidratação, tamanho e números de cadeias de quitina na
unidade celular. Na forma-α todas as cadeias têm orientação antiparalela. A
quitina-β exibe um arranjo paralelo, enquanto que a forma-γ alterna duas cadeias
antiparalelas com uma paralela (MERZENDORFER, 2006).
A importância da quitina para a arquitetura da parede celular é bem
documentada, tendo sido descrito várias décadas atrás que a inibição da sintase
da quitina produz a morte celular. Em nível celular, a quitina é o resultado da
atividade da enzima sintase da quitina (CS), descrita nos anos 50 por GLASER e
BROWN (1957), enquanto que o gene correspondente só foi determinado em 1986
(CABIB, 1986). Recentemente a presença do gene codificador de CS foi reportada
para outros grupos como insetos, bactéria, protozoários e vertebrados. O gene que
codifica a sintase da quitina é chamado de chs (RONCERO, 2002).
Segundo Wessels (1993), em Schizophyllum commune Fr., durante o
crescimento da parede celular, novos polímeros de quitina e β-1,3-glicano são
adicionados à parede em formação, interagindo para formar microfibrilas de quitina
e hélices triplas de β-glicano. Em seguida, ligações covalentes entre esses
polímeros são formadas e ocorrem ramificações. Novos polímeros são então
lançados na região apical, mantendo a espessura da parede e determinando a
morfogênese. A parede formada vai se consolidando à medida que ocorre o
crescimento da hifa.
24
UDP-GlcNAc
Sintase da
Quitina
UDP
Quitina
Figura 03: Polimerização da UDP-GlcNAc pela sintase da quitina para formar a quitina (Fonte:
YEAGER, FINNEY, 2004).
GPI
Proteína
Ancora
β-1,3glicano
Polissacarídeos
anamorfos
Quitina
Proteínas
(antígenos)
Enzimas
Transmembrana
(Sintase da quitina)
Figura 04: Representação da parede celular de A. fumigatus Fresen, com destaque para a
biossíntese de α-1-3-glicano e quitina que são sintetizados por diferentes famílias de genes com
diferentes funções, entre eles está a sintase da quitina (Fonte: BEAUVAIS, 2003).
25
A parede celular do fungo foi utilizada como o primeiro alvo para o
desenvolvimento de agentes antifúngicos, assim como para a classificação
taxonômica (RONCERO, 2002). Atualmente, embora esta classificação não seja
muito utilizada, ainda reflete a maior diferença entre os grupos fúngicos. Células
fúngicas destituídas de parede celular só podem sobreviver em condições de
laboratório, onde o suporte osmótico previne a sua lise (RONCERO, 2002). A
seleção da parede celular como alvo na busca de uma defesa efetiva justifica-se
por ela ser essencial aos fungos, uma vez que não está presente em vertebrados e
plantas, de modo que as rotas biossintéticas das moléculas que compõem a
parede são importantes alvos para o desenvolvimento de agentes inibidores do
crescimento
destes
patógenos
(GEORGOPAPADAKOUS,
TKACZ,
1995;
RONCERO, 2002).
2.3. A sintase da quitina
A sintase da quitina (E.C. 2.4.1.16) é uma enzima que desempenha
importantes funções na diferenciação e morfogênese de fungos filamentosos, como
o M. perniciosa, que possuem a quitina como principal componente estrutural de
sua parede celular (RUIZ-HERRERA et al., 2002). Para a sua atividade, essa
enzima utiliza um cátion bivalente (Mn+2 ou Mg+2) (MERZENDORFER, 2006) e o
nucleotídeo UDP-GlcNAc, como doador de açúcar. A sintase da quitina pertence à
família multigênica das glicosiltransferases (MÜLLER, et al., 2002). Com base na
similaridade da seqüência, a sintase da quitina pertence à família 2 (GTF2), que
contém seqüências de fungos, bactérias, plantas e animais. Análises filogenéticas
indicam
que
as
(MERZENDORFER,
enzimas
da
GTF2
derivam
de
2006).
As
glicosiltransferases
um
ancestral
comum
desta
família,
segundo
Campbell et al., (1997), têm seu mecanismo catalítico nos resíduos de Asp e Glu
das cadeias laterais, pois estes apresentam reatividade apropriada para agir como
aceptor da ativação.
A enzima sintase da quitina diferencia-se em cinco classes distintas, as
quais apresentam variados níveis de expressão, a depender do estádio de seu
ciclo de vida e sua localização. A classe III é muito importante no desenvolvimento
dos fungos, pois atua na formação da parede celular, sendo responsável pela
26
síntese de 90% de toda a quitina da célula. Este metabólito é sintetizado em
eucariotos por uma seqüência de cinco reações sucessivas: (i) conversão de Fru-6P em GlcN-6-P por glutamina-Fru-6-P amidotransferase (E.C. 2.6.1.16), (ii)
acetilação de GlcN-6-P gerando GlcNAc-6-P por GlcN-fosfato acetiltransferase
(E.C. 2.3.1.4), (iii) interconversão de GlcNAc-6-P em GlcNAc-1-P por Nacetilglicosamina fosfato mutase (E.C. 5.4.2.3), (iv) uridinação de GlcNAc-1-P por
UDP- GlcNAc pirofosforilase (E.C. 2.7.7.23) e (v) conversão de UDP-GlcNAc no
polímero quitina pela sintase da quitina (E.C. 2.1.4.16) (MIO et al., 1998,
LAGORCE et al., 2002) (Figura 05).
O consenso QRRRW é considerado uma assinatura da sintase da quitina,
por estar presente em todas elas. Os aminoácidos deste motif têm sido apontados
como o local direcionado à metagênese em leveduras, sendo essenciais para a
atividade da enzima. Outras regiões conservadas podem ter importante papel na
catálise (S/TWGTKG) ou no processo de transporte do polímero através da
membrana (S/TWGT(K/R)) (MERZENDORFER, 2006).
Atualmente, mais de 1500 genes Chs estão total ou parcialmente
seqüenciados (NCBI, Acesso: 05.Jul.2007), embora poucos tenham sido
caracterizados
funcionalmente
(RONCERO,
2002).
Muitos
desses
genes,
codificadores de sintase da quitina de diferentes eucariotos, incluindo fungos, vêm
sendo clonados e caracterizados (SREENIVASAPRASAD et al., 2000), tornando
esta enzima um alvo bastante atraente para o desenvolvimento de pesticidas e
inibidores de sua atuação. Estudos da complexidade genética da sintase da quitina
realizados por Roncero (2002), revelaram que os genes chs de insetos e
nematódeos se agrupam com os das classes IV e V, o que sugere uma origem
evolutiva comum para todos os chs. Além disso, o gene nodC de Sinorhizobium
meliloti (Dangeard) De Lajudie também apresenta significativa similaridade com o
gene chs. Com isso é possível propor que a origem do gene chs é muito antiga, e
que ele divergiu de um gene já presente nos ancestrais das bactérias atuais. Em S.
cerevisiae, o gene chs1 provavelmente codifica a maioria da CS in vitro, mas in
vivo isto não foi comprovado. Foi demonstrado que a CS-I está envolvida na
citocinese, ou seja, na divisão celular, sendo responsável pelo reparo da quitina
após a divisão celular. Esta atividade se opõe ao papel da quitinase neste
processo. O chs2 codifica a sintase da quitina que está envolvida na formação do
disco de quitina que separa fisicamente a célula-mãe da célula-filha e constitui o
27
septo primário. Essa atividade é essencial para o crescimento em certas condições
e o homólogo chs1, de Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout, demonstrou ser
essencial para a sobrevivência deste organismo. Scchs3 codifica a CS responsável
por mais de 90% da quitina celular. A maior parte está localizada no anel que forma
o broto embora uma parte menor esteja distribuída uniformemente pela parede
celular. Os fungos filamentosos têm a família CS1 diretamente envolvida na
manutenção da integridade da parede celular, enquanto que a família II está
envolvida na formação da quitina (RONCERO, 2002).
Glicose
Glicolise
Carboidrato de reserva
Glicogênio/Trealose
Glicose-6-P
Frutose-6-P + Glutamina
(1)
Glicosamina-6-P + Glutamato
Acetil-ASH
CoASH
(2)
N-acetil-glicosamina-6-P
(3)
N-acetil-glicosamina-1-P
PPi
(4)
UTP
UDP-N-acetil-glicosamina-6-P
(5)
Quitina + UDP
Parede
Celular
Quitina
(β-1,4-poli-n-acetil-D-glicosamina)
Figura 05: Rota metabólica da sintase da quitina na síntese da parede celular. (1) Glutaminafrutose-6-fosfato amidotransferase (EC 2.6.1.16); (2) Glicosamina fosfato N-acetiltransferase (EC
2.3.1.4); (3) fosfo-N-acetilglicosamina mutase (EC 5.4.2.3); (4) UDP-N-acetilglicosamina
pirofosforilase (EC 2.7.7.23) e (5) Sintase da quitina (EC 2.4.1.16) (Fonte: LAGORCE et al., 2002;
HOGENKAMP, 2006).
28
Células de leveduras com vários defeitos, incluindo mutações em alguns
genes mostram significativo aumento na sintase da quitina, acompanhado por um
aumento na síntese de várias proteínas de parede celular. Esses dados sugerem
que estas células reagem contra os danos da parede celular pela ativação de um
mecanismo compensatório que garante a sua estabilidade (GARCÍA-RODRIGUEZ,
et al., 2000). Devido à integridade estrutural que a quitina provê a parede celular a
sintase da quitina tem sido um excelente alvo para agentes anti-fúngicos
(BOWMAN, FREE, 2006).
2.4. Determinação e caracterização de gene por primer walking
Para seqüênciar um genoma com razoável velocidade, baixo custo (RAJA,
et al., 1997) e confiabilidade, a estratégia empregada é um fator a ser considerado.
Algumas das técnicas propostas são shotgun e primer walking. O shotgun é
utilizado em projetos genomas de larga escala, mas a alta redundância de
seqüências e grandes esforços para fechar intervalos (gaps) podem criar custos e
problemas no processo de montagem dos contigs (HATTORI, et al., 1997). A
estratégia de primer walking minimiza estes problemas, sendo feita com um
mínimo de redundância (RAJA, et al., 1997), embora seja lenta e exija o desenho e
a síntese de um variado número de oligonucleotídeos iniciadores ou primers
(HATTORI, 1997).
A metodologia de primer walking utiliza primers que se ligam em uma porção
conhecida do DNA em estudo para determinar uma região adjacente, onde a
informação da seqüência obtida será usada para o desenho de um novo primer
que, por sua vez, possa seqüênciar uma porção além daquela conhecida. Pela
repetição deste procedimento obtém-se uma extensão da seqüência desejada
(AZHIKINA, et al., 1993). Esta técnica pode ser usada para “caminhar” ao longo da
seqüência de DNA ou para buscar seqüências de nucleotídeos que devem ser
desenhadas (PARKER, et al., 1991).
29
2.5. A busca pelo controle da doença
Em 1957 foi criado pelo Governo Federal a "Comissão Executiva do Plano
da Lavoura Cacaueira" (CEPLAC) para auxiliar os produtores de cacau no manejo
das culturas. Porém, desde que a doença começou a dizimar as culturas de cacau
na Bahia, um dos principais objetivos da CEPLAC tornou-se o estudo e
desenvolvimento de técnicas para controlar a doença. Diferentes formas de
controle vêm sendo empregadas contra a vassoura-de-bruxa, inclusive controle
químico, podas fitossanitárias e seleção de clones resistentes. A eliminação de
todos os tecidos infectados tem sido a principal medida de controle para reduzir a
fonte de inóculo e os danos causados por M. perniciosa.
O controle adequado da vassoura-de-bruxa depende da remoção das partes
infectadas (BASTOS, 2000; RUDGARD, 1987; WHEELER, 1985) que consiste na
remoção de grupos de vassouras infectadas (nas quais os basidiomas são
formados antes da estação chuvosa), aplicação de fungicidas químicos e seleção
de hospedeiros resistentes. Esta última medida tem sido a melhor opção para os
cultivares da Bahia, e cultivares resistentes à doença vêm sendo selecionados a
partir de germoplasmas selvagens. Este método de controle é preferido por seu
baixo custo e por ser de mais fácil manejo do que a poda das partes infectadas,
pois, para ser efetivo, a remoção das fontes de inóculo deve ser feita por todos os
fazendeiros de uma determinada área (GRIFFITH et al., 2003). Estas estratégias
aliadas à aplicação de fungicidas, no entanto, não foram suficientes para reduzir a
disseminação do patógeno (ANDEBRHAN et al., 1995), já que o nível de infecção
da planta determina a eficiência e o custo dessa prática (BASTOS, 1996a). A poda,
por exemplo, só é efetiva quando realizada regularmente ou de forma intensiva.
Embora esta seja eficaz em reduzir as fontes do inóculo, as infecções observadas
em áreas onde foi realizado esse tipo de controle são provenientes das fontes não
removidas ou daquelas localizadas em outras áreas (ANDEBRHAN, 1985).
Portanto, o controle da doença se torna difícil se a poda não for generalizada,
sendo necessária à aplicação de fungicidas para minimizar as perdas
(ANDEBRHAN; BASTOS, 1980).
Fungicidas para o controle químico da vassoura-de-bruxa, como o tebuconazol,
por exemplo, não são suficientes, pois eles não protegem os tecidos em
crescimento ativo, necessitando inúmeras pulverizações. Fungicidas sistêmicos
30
poderiam restringir o número de aplicações necessárias, no entanto, a maioria
avaliada tem demonstrado eficiência somente em testes in vitro, não apresentando
o mesmo comportamento em campo (TOVAR, 1991). Diferentes compostos
químicos têm sido testados na tentativa de prevenir ou erradicar a vassoura-debruxa, porém os resultados não são satisfatórios (MCQUILKEN et al., 1998;
SOBERANIS et al., 1999), pois o rápido crescimento da superfície dos frutos
durante os dois ou três meses de desenvolvimento faz com que o fungicida tenha
de ser aplicado freqüentemente, e isto é especialmente difícil em árvores altas
(SOBERANIS et al., 2000). Como alternativa, tem sido utilizado o controle
biológico, que envolve antagonistas capazes de suprimir a formação ou destruir os
basidiomas de M. perniciosa em vassouras secas. Algumas espécies de
Trichoderma sp. revelaram-se promissoras, não só no controle de fitopatógenos
habitantes do solo (PAPAVIZAS, 1985) como também no controle daqueles que
colonizam as partes aéreas de plantas (ELAD et al., 1993). BASTOS (1996a)
demonstrou a eficiência de T. viridae Pers. no controle de M. perniciosa, com
redução da incidência de frutos infectados, em comparação com os tratamentos
por poda fitossanitária. Foi observada perda da viabilidade do micélio após o
tratamento de culturas e de vassouras secas de cacau com suspensão de conídios
de T. viridae, o qual parasita as hifas do M. perniciosa (BASTOS, 1996b).
A elaboração de novas estratégias de controle através de estudos
moleculares é uma das alternativas mais promissoras para o manejo da vassourade-bruxa. Estudos moleculares do M. perniciosa e sua interação com o T. cacao
têm sido alvos de muitos projetos de pesquisas que visam elucidar a biologia do
fungo e seus diferentes mecanismos de defesa. A partir do seqüenciamento do
gDNA e do cDNAs das fases de desenvolvimento do fungo em sistema artificial e
da interação Theobroma/Moniliophthora, importantes descobertas têm sido feitas,
as quais têm contribuído para elaboração de uma estratégia eficiente no controle
(SANTOS, 2005).
Assim, o presente trabalho representa uma das etapas de um projeto
proteômico que busca contribuir para o controle da doença vassoura-de-bruxa,
tendo como ênfase encontrar um alvo molecular para que seja desenvolvido novos
agentes químicos. A contribuição deste trabalho somado com outros da rede de
genômica do estado da Bahia, poderá contribuir para a reversão do atual quadro
sócio-econômico ligado à produção de cacau, e fazer com que o Brasil possa voltar
31
a ter uma das melhores, senão a melhor, posição entre os produtores da matéria
prima do chocolate no mercado internacional.
3. MÉTODOS EM BIOLOGIA COMPUTACIONAL
Os projetos genomas possuem como principal desafio o conhecimento da
estrutura de novos alvos moleculares, principalmente proteínas e enzimas. A
compreensão molecular de estruturas terá um papel cada vez mais significativo
nos avanços de diagnósticos e tratamentos de doenças (SANTOS-FILHO,
ALENCASTRO, 2003). Os projetos proteômicos possuem como objetivo estudar a
função bioquímica de uma proteína, a qual pode ser definida por suas interações
com outras moléculas, sendo a função biológica conseqüência dessas interações.
Desta forma, a função de uma proteína é geralmente determinada por sua
estrutura tridimensional, que esclarece o mecanismo enzimático e a interação com
inibidores, mensageiros, receptores e transportadores. Por esta razão, é útil
conhecer a estrutura 3D das milhares de seqüências de proteínas que surgem
destes diversos projetos (SÁNCHEZ, ŠALI, 1998; KUNDROTAS, ALEXOV, 2006).
Métodos experimentais para a determinação da estrutura da proteína nem
sempre são bem sucedidos (SÁNCHEZ, ŠALI, 1998). Como exemplo, temos que
proteínas da membrana celular raramente cristalizam, e também dificilmente
podem ser tratadas de modo satisfatório por Ressonância Magnética Nuclear
(RMN) (SANTOS FILHO, ALENCASTRO, 2003). Em 1971 foi estabelecido o
Protein Data Bank (PDB), pelo Brookhaven National Laboratories, para arquivar as
estruturas cristalinas de macromoléculas biológicas, sendo iniciado com apenas
sete estruturas. Na década de 80 o número de deposições começou a crescer
devido a implementos na tecnologia de processos cristalográficos e métodos de
RMN. Grandes progressos vêm sendo realizados no campo de estruturas
experimentais por cristalografia de raio-X e RMN, mas ainda consomem bastante
tempo sem a garantia de sucesso (BERMAN et al., 2000). Assim, o número de
proteínas estruturalmente caracterizadas (43.823 estruturas depositadas no PDB,
até 07 de junho de 2007) é baixo em comparação com o número de proteínas com
32
seqüência conhecida (264.492 depositadas no banco de dados SWISS-PROT)
(SCHWEDE, et al., 2003; SWISS-PROT 2007).
Com
o
objetivo
de
superar
as
limitações
experimentais,
métodos
computacionais foram desenvolvidos com base nos conceitos da Biologia e
Química, os quais destacam-se os métodos ab initio, enovelamento (threading), e
modelagem comparativa. Os métodos de predição ab initio concentram-se na
construção de uma estrutura sem uma informação prévia. Estes métodos possuem
pequenas bibliotecas de segmentos a partir dos quais as estruturas podem ser
construídas, e também assumem que a estrutura nativa corresponde ao mínimo
global de energia livre durante o tempo de vida da proteína. Assim o espaço
estrutural a ser buscado no modelo é restrito. Desta forma, este procura encontrar
uma região de mínimo através da exploração de várias conformações protéicas
possíveis de existir. Ferramentas para a modelagem por este método estão
disponíveis
on
line
em
http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/i-
sites/Isites/download.html e http://www.bioinfo.rpi.edu/~bystrc/hmmstr/server.php.
No entanto, pouco é compreendido sobre o enovelamento de proteínas, o que
torna esta metodologia ainda insipiente (HOLM, SANDER, 1998; YUAN,
BYSTROFF, 2005).
A metodologia de enovelamento (threading) é recomendada quando a
similaridade é pequena entre uma dada seqüência problema com as disponíveis no
PDB, ou quando, embora haja a mesma topologia, ocorram diferenças estruturais
na região não conservada, ou mesmo no tamanho das seqüências (PANCHENKO
et al., 2000). Diferente do método ab initio, em que todas as conformações
possíveis são exploradas, nesta metodologia o espaço de pesquisa limita-se a
conformação de estruturas conhecidas, podendo falhar para qualquer proteína com
uma seqüência completamente nova (BRYANT, 1996). Vários exemplos destes
métodos podem ser encontrados no site do Expert Protein Analysis System –
ExPASy oferecido pelo Swiss Institute of Bioinformatics (http://ca.expasy.org/).
Quanto à modelagem por homologia, esta se baseia no fato de que proteínas
que estão correlacionadas evolutivamente, a partir de um ancestral comum,
possuem função e estrutura semelhante, e por isso são ditas como proteínas
homólogas entre si. Em outras palavras, a seqüência é menos conservada do que
a estrutura. No entanto, o sucesso desta metodologia depende do quanto a
seqüência entre as proteínas são similares entre si. A modelagem por homologia é
33
a ferramenta de predição melhor sucedida (SANTOS-FILHO, ALENCASTRO,
2003). Esta consiste em estudar a geometria e a propriedade das moléculas com
técnicas computacionais, contribuindo para elucidar as interações intra e
intermoleculares, mecanismos de reações químicas, estrutura e função de
proteínas difíceis de serem purificadas em grande escala (FIGUEIREDO et al.,
2005). A modelagem por homologia utiliza-se de dados cristalográficos conhecidos
para determinar a estrutura de uma proteína não conhecida (FIGUEIREDO et al.,
2005) baseando-se na semelhança estrutural e funcional, uma vez que as
proteínas homólogas apresentam regiões internas conservadas, enquanto que
suas principais diferenças estruturais estão nas regiões externas (SANTOS-FILHO,
ALENCASTRO, 2003).
Para realizar a modelagem por homologia costuma-se seguir uma rotina como:
(i) localizar a estrutura de uma proteína conhecida; (ii) produzir o melhor
alinhamento global possível entre a seqüência desconhecida (seqüência problema)
e o modelo; (iii) construir um modelo do arcabouço da proteína, tendo o arcabouço
da estrutura como modelo referência; (iv) nas regiões onde há lacunas (alvo ou
molde), realizar a modelagem de alças para substituir os segmentos de extensão
apropriada; (v) acrescentar cadeias laterais ao arcabouço do modelo; (vi) otimizar
as posições das cadeias laterais e (vii) refinar a geometria obtida (GIBAS,
JAMBECK, 2001) e finalmente, (viii) validar o modelo construído (GOLDSMITHFISCHMAN, HONIG, 2003; SANTOS FILHO, ALENCASTRO, 2003; PATNY, et al.,
2006).
Os moldes para a modelagem podem ser encontrados através de métodos de
comparação de seqüências, tais como PSI-BLAST, ou baseados em métodos de
threading seqüência-estrutura que podem ocasionalmente revelar relações mais
distantes do que as puramente baseadas em seqüências (BAKER, ŠALI, 2001).
Programas como o Swiss Model, um servidor de modelagem por homologia
desenvolvido
pelo
Swiss
Institute
of
Bioinformatics
(SIB
-
http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html), auxiliam na construção do
modelo, utilizando o programa Swiss PDB Viewer, que se trata de um ambiente
gráfico interativo que analisa a proteína e a estrutura do ácido nucléico e,
combinados com o servidor automatizado retornam a estrutura da nova proteína
modelada (GUEX, et al., 2001).
34
Embora existam três distintas metodologias disponíveis para a geração de
estruturas 3D de proteínas, a confiabilidade dos métodos ab initio e threading é
muito pequena para problemas que requerem boa qualidade de informação
estrutural como, por exemplo, o design de fármacos baseado na estrutura do alvo.
Por outro lado, a modelagem por homologia é melhor sucedida em relação às
demais. No entanto, esta somente fornece modelos razoáveis quando o grau de
homologia entre as proteínas molde e alvo está entre 25-30% ou superior. Esta
conclusão é baseada pela competição existente na área denominada de “Critical
Assessment of techniques for protein Structure Prediction (CASP)”, a qual avalia as
diferentes metodologias existentes para a predição de estruturas. (GIBAS,
JAMBECK, 2001; HOLTJE et al., 2001)
3.1. Química Computacional
Como existe uma necessidade de se entender o comportamento de
biomacromoléculas,
modelos
teóricos
são
criados
usando
a
Química
Computacional como ferramenta. A química computacional simula estruturas e
reações químicas numericamente, através de modelos matemáticos baseados em
parte ou completamente nas leis fundamentais da física. Estes modelos permitem o
estudo de fenômenos químicos por meio de cálculos realizados em computador
antes de examinar estes fenômenos experimentalmente. Pode-se, portanto,
“construir fenômenos” que sequer existem naturalmente, mudando a concepção
filosófica de que o processo de fazer ciência está relacionado ao estudo de
fenômenos dados pela natureza. Além da modelagem de moléculas estáveis,
alguns métodos podem ser usados também na modelagem de intermediários de
reação instáveis e mesmo estados de transição, fornecendo informações sobre
moléculas e reações químicas impossíveis de serem obtidas através da
observação. Portanto, a química computacional é tanto uma área de pesquisa
independente quanto um importante complemento a estudos experimentais
(FORESMAN, FRISCH, 1996).
Existem várias metodologias dentro da Química Computacional, que são
utilizadas a depender do fenômeno físico-químico e dos recursos computacionais
disponíveis. Em se tratando de biomacromoléculas, utilizam-se os métodos
35
híbridos quantum-mechanical/molecular mechanical (QM/MM), e de mecânica
molecular (MM).
A metodologia QM/MM foi descrita pela primeira vez por Warshel e Levitt
(1976). Estes métodos envolvem o tratamento de uma pequena região do sistema
onde requer um formalismo mecânico-quântico (QM), por exemplo, onde requer
quebra e formação de ligação, e trata a região remanescente da proteína e do
solvente com um método de mecânica molecular, a qual possui menor custo
computacional (WARSHEL, LEVITT, 1976). Esta metodologia híbrida tem sido
desenvolvida devido ao alto custo computacional requerida pelos métodos QM
quando aplicados a grandes sistemas (MONARD, MERZ, 1999). Neste trabalho,
será dada ênfase aos métodos de mecânica molécula, uma vez que os métodos
híbridos não foram utilizados por não se aplicarem ao problema em questão.
Os métodos de MM usam as leis da mecânica clássica para prever a energia
associada a uma dada conformação (estrutura) e propriedades moleculares. O
modelo considera os átomos como esferas de raios característicos e as ligações
como molas com diferentes elasticidades. A matemática relacionada à deformação
de molas pode ser usada para descrever os movimentos (estiramentos,
deformações e torções) e para calcular a energia potencial associada a eles
(Figura 06) de modo a predizer a energia total associada a uma dada conformação
molecular (FORESMAN, FRISCH, 1996).
Figura 06: Movimentos atômicos de estiramento de ligação, de deformação angular, de torção e
interação entre átomos não ligados.
36
A energia total da molécula, Etotal, é calculada pelo somatório de um conjunto
de equações que descrevem as características atômicas.
E total = Er + Eθ + Eφ + Enl + ....
Onde Er é a energia associada a uma ligação que está sendo estirada ou comprimida em
relação ao seu comprimento de ligação natural. De modo similar, o mesmo formalismo
matemático é aplicado em relação aos ângulos de ligação, ângulos torsionais e a energia
relacionada às interações entre átomos não ligados, Eθ, Eφ e Enl, respectivamente. Outros
parâmetros físico-químicos também podem se adicionados à equação levando a cálculos
mais apurados.
Todas estas funções de energia potencial requerem dados (parâmetros)
para
descrever
os
diferentes
tipos
de
átomos
e
ligações,
obtidos
experimentalmente ou através de cálculos ab initio1, e juntamente com os termos
da equação, definem o que é denominado de campo de força. As equações usadas
são relativamente simples e são desenvolvidas para uma determinada classe de
compostos. Existem diferentes tipos de campos de forças que se diferenciam de
acordo com a forma matemática dos termos de energia e caracterizam os
diferentes métodos de mecânica molecular. Dependendo dos objetivos de estudo,
outros componentes de energia podem ser incluídos (FORESMAN, FRISCH,
1996).
Os métodos de mecânica molecular não consideram explicitamente os
elétrons em um sistema molecular (baseiam-se em interações entre núcleos),
embora os efeitos eletrônicos estejam implicitamente incluídos nos campos de
força através da parametrização.
Esta
aproximação
torna
os
cálculos
de
mecânica
molecular
computacionalmente rápidos, permitindo seu uso em sistemas muito grandes
contendo até milhares de átomos. Entretanto, estes métodos possuem várias
limitações, entre as mais importantes destacam-se:
1
Método ab initio em Química Teórica refere-se aos métodos baseados em aproximações da equação de
Schrödinger, a qual fornece a energia do sistema além de outras propriedades moleculares.
37
a) Cada campo de força permite que se alcance bons resultados somente
para uma classe limitada de moléculas relacionadas com aquelas as quais o
campo de força foi parametrizado;
b) Como não levam em consideração os elétrons, estes métodos não podem
ser aplicados em problemas químicos onde os efeitos eletrônicos são
predominantes como, por exemplo, em processos que envolvam formação
ou quebra de ligações (FORESMAN, FRISCH, 1996; BYSTROFF, et al.,
2004; YUAN, BYSTROFF, 2005; BYSTROFF, SHAO, 2002);
c) Propriedades moleculares que dependem de detalhes da estrutura
eletrônica também não são reprodutíveis pelos métodos de mecânica
molecular (FORESMAN, FRISCH, 1996).
Cálculos de mecânica molecular são preferencialmente usados no estudo de
moléculas grandes, tais como proteínas, enzimas, polímeros, DNA, etc. como, por
exemplo, em problemas que envolvam o reconhecimento molecular, processo
fundamental dos sistemas bioquímicos e importante ponto de partida para a
descoberta de novos fármacos (PATRICK, 2001). O modelo geral de interações
fármaco-receptor molecular é equivalente ao modelo chave-fechadura das
interações enzima-substrato. O alvo molecular ideal para um fármaco seria a de
uma molécula cuja superfície fosse exatamente complementar a superfície do
fármaco, em termos de forma, carga e energia potencial eletrostática. Esta
metodologia é denominada de docking (BYSTROFF, SHAO, 2002), que é o estudo
da interação ligante-enzima por métodos de mecânica molecular (MM) ou através
de métodos híbridos, a qual fornece informações da interação entre o fármaco e o
seu alvo biológico. De posse destas informações pode-se estudar as interações
intermoleculares entre o ligante e a enzima-alvo, podendo, em uma etapa posterior,
propor modificações do composto protótipo2 (BARREIRO, FRAGA, 2001;
BYSTROFF, SHAO, 2002).
Existem vários métodos de MM (campos de força) os quais diferem-se pela
natureza das equações, assim como detalhes de suas parametrizações. Como
exemplos de campos de força pode-se citar: SYBYL, MMX, MM3, ff94, ff99
2
Composto orgânico com desejável atividade biológica. Esta atividade normalmente é otimizada por diferentes
métodos utilizados pela Química Medicinal, incluindo docking.
38
(Amber), UFF, CVFF, CHARMM, GROMOS dentre outros (FORESMAN, FRISCH,
1996).
Ambos os métodos descritos anteriormente calculam a energia de uma
estrutura molecular particular (arranjo espacial de átomos ou núcleos e elétrons),
propriedades relacionadas à energia, e também executam a otimização da
geometria, localizando a estrutura de menor energia próxima da estrutura de
partida especificada. A otimização da geometria depende, primariamente, do
gradiente da energia - a derivada primeira da energia em relação às posições
atômicas (Figura 07), gerando assim a superfície de energia potencial (SEP)
(FORESMAN, FRISCH, 1996).
Figura 07: Superfície de Energia Potencial.
3.2. Emprego da química computacional na modelagem comparativa
Proteínas obtidas, tanto por modelagem comparativa como por cristalografia,
necessitam de refinamento (HOLTJE, et al., 2003). Durante a geração de modelos
de proteínas os loops e as conformações da cadeia lateral, em geral, são criados
aleatoriamente. Conseqüentemente, as conformações não correspondem a
estruturas energeticamente razoáveis. Adicionalmente, estruturas cristalinas
também precisam ser refinadas para remover comprimentos de ligação muito
39
extensos e interações atômicas não favoráveis (átomos muito próximos entre si).
Em ambos os casos, esta desordem na posição dos átomos leva a formação de
forças que resultam em movimentos distantes da estrutura original quando o
processo de minimização se inicia. A metodologia geral para se eliminar esta
condição consiste em “relaxar” o modelo de forma gradativa. Assim, os métodos de
MM utilizam algorítmos para otimizar a geometria encontrando confórmero de
menor energia na SPE. Os algorítmos aplicados para a otimização de geometria
normalmente encontram regiões de mínimo nas SEP próximo as coordenas inicias
(geometria de partida). Dentre os métodos de minimização de energia mais
freqüentemente utilizados estão o Steepest Descent e Gradiente Conjugado,
ambos utilizam técnicas que calculam a primeira derivada da energia (LIPKOWITZ,
BOYD, 1990).
O algorítmo de Steepest Descent calcula a energia da geometria inicial, e
segue aplicando um pequeno movimento nos átomos, conforme parametrizado
pelo campo de força que está sendo utilizado, gerando assim uma nova geometria.
Desta forma, este processo é então repetido sempre buscando uma região de
mínimo na superfície potencial. O processo total somente pára quando condições
pré-estabelecidas, como valores de energia ou número de interações, são
alcançadas. Como este método é lento, próximo às regiões de mínimo, é mais
comumente utilizado somente para gerar uma geometria mais adequada para um
outro algorítmo de minimização de energia mais sofisticado, como o Gradiente
Conjugado (LIPKOWITZ, BOYD, 1990).
O Gradiente Conjugado acumula a informação da função de uma interação
anterior, calculando um novo vetor em direção à região de mínimo, gerando uma
nova estrutura que será continuamente refinada. O custo computacional deste
método é maior do que Steepest Descent. No entanto, isso é compensado pela sua
eficiente convergência para a região de mínimo (LIPKOWITZ, BOYD, 1990). Dessa
forma, para estruturas longe do mínimo são utilizados algorítmos como Steepest
Descent para as 10-100 primeiras interações, e a seguir, o processo de
refinamento é concluído com o método de Gradiente Conjugado ou um método que
utiliza a segunda-derivada, como por exemplo, Newton-Raphson (HÖLTJE, et al.,
2003).
Se o modelo gerado é baseado somente em técnicas de modelagem
comparativa, os loops e as cadeias laterais necessitam de um refinamento mais
40
apurado. Isto se deve ao fato que a geometria obtida pelo processo de otimização
representa somente uma possível conformação encontrada pelo algorítmo na
região de mínimo local. Sendo assim é necessário investigar o comportamento
conformacional através da SEP para que se possa aproximar o máximo possível
da região de mínimo global, encontrando a estrutura 3D mais favorável
energeticamente. A metodologia para que possa resolver esta questão denominase dinâmica molecular (DM), que é um processo sistemático de busca
conformacional, sendo uma ferramenta bastante útil para se encontrar várias
regiões de mínimo da SEP (HOLTJE et al., 2003).
As simulações de DM usam como estrutura de partida a geometria previamente
refinada a qual aplica, de forma integrada, equações clássicas de movimento
durante um período de tempo para o sistema molecular, em uma determinada
temperatura. A trajetória resultante pode ser utilizada para observar o
comportamento da molécula durante este período de tempo, sendo este o objetivo
desta metodologia. Este método se baseia na MM, assumindo que os átomos
interagem entre si de acordo com a parametrização empregada pelo campo de
força.
Diferentemente dos processos de otimização, dinâmica molecular é capaz de
“vencer” barreiras rotacionais entre diferentes conformações. Dessa forma, é
possível encontrar outras regiões de mínimo além da região próxima da estrutura
de partida. No entanto, se estas barreiras são muito altas ou a estrutura possui um
número muito grande de graus de liberdade, então possíveis confôrmeros podem
não ser encontrados devido ao tempo utilizado pela simulação. Uma estratégia
para contornar este problema é utilizar elevadas temperaturas. Os protocolos de
DM geralmente usam as temperaturas de 300 K, 400 K e 600 K, fornecendo
energia cinética suficiente para que as barreiras rotacionais de energia possam ser
“ultrapassadas” entre diferentes confôrmeros, explorando melhor a SEP (HOLTJE,
et al., 2003).
A dinâmica molecular representa uma ferramenta adicional que pode ser usada
para vasculhar as diferentes conformações possíveis de uma biomacromolécula.
No entanto, o uso necessita de cuidados devido à escolha do método e as
condições de simulação para que se possa assegurar a completa busca
conformacional e a validade dos resultados (PATNY, et al., 2006).
41
4. MATERIAL E MÉTODOS
Os passos seqüenciais utilizados para a identificação e caracterização da
seqüência primária do gene da sintase da quitina em DNA genômico, e a
caracterização da estrutura tridimensional da região filogeneticamente conservada
da enzima, contendo o sítio catalítico, por modelagem comparativa é sintetizado no
fluxograma mostrado na Figura 08.
Busca e anotação de seqüências no
Banco do Proj. Genoma M.
perniciosa
Desenho de
oligonucleotídeos
Extração e purificação
de DNA total
Amplificação dos fragmentos
Sequenciamento
de gDNA
Análise das seqüências e contigs
Análise
filogenética
Identificação
de molde(s)
Modelo
final
Modelagem
comparativa
Modelo
inicial
Refinamento
do modelo
Validação
Figura 08: Fluxograma da metodologia utilizada para a determinação da seqüência primária do gene
da sintase da quitina do fungo M. perniciosa e posterior construção do modelo 3D do provável
produto gênico.
42
4.1. Busca e anotação das prováveis seqüências do gene da sintase da
quitina do Banco de Dados do Projeto Genoma do M. perniciosa
A busca de dados no banco de DNA genômico do Projeto Genoma do
Moniliophthora perniciosa (http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura/) compreendeu
cinco etapas: (i) obtenção dos reads (seqüências) através de buscas textuais e
buscas por similaridade (utilizando seqüências de gene), (ii) triagem dos reads
coletados, (iii) montagem dos reads em contigs, (iv) triagem dos contigs obtidos, (v)
análise comparativa da estrutura primária (seqüência) dos contigs e do provável
homólogo aos níveis gênico e protéico (FAYYAD et al., 1996).
A obtenção dos reads foi realizada através de buscas textuais, utilizando
palavras-chave com os operadores booleanos, e buscas por similaridade,
utilizando seqüências completas de genes e proteínas correspondentes de
basidiomicetos já depositadas no NCBI/EMBL/DDDJ.
Os reads resultantes das buscas textuais e por similaridade foram
inspecionados com a finalidade de eliminar os que continham informações
duvidosas ou espúrias, e apenas aqueles considerados de alta qualidade (valor E <
1 x 10-5, e seqüência com pelo menos 250 bases contíguas com valor Phred acima
de 20) foram considerados como significativos e utilizados para as análises
posteriores.
A montagem do gene a partir de fragmentos derivados de seqüenciamento
genômico do tipo shotgun, que corresponde à união de fragmentos (reads) com
terminações similares (sobreposições) em fragmentos maiores (contigs), foi
efetuada utilizando-se o programa Phrap (GREEN, 2007). Os contigs formados
foram então avaliados através da análise comparativa por similaridade, utilizandose o BLAST (versão 2.2.16) (ALTSCHUL, et al., 1997) e o FastA (versão 3.4)
(PEARSON, et al., 1997), com seqüências completas de genes e proteínas
correspondentes de basidiomicetos já depositadas no NCBI/EMBL/DDDJ para
avaliar as regiões conservadas e variáveis. Utilizou-se ainda o pacote de
programas Lasergene versão 7.1.0 (BURLAND, 2000), para a inspeção e edição
manuais dos contigs gerados, através da comparação com os eletroferogramas
originais, sempre que necessário.
43
4.2. Desenho de oligonucleotídeos iniciadores
Após a análise das prováveis seqüências do gene da sintase da quitina do
Banco de Dados do Projeto Genoma do M. perniciosa, foram desenhados diversos
oligonucleotídeos específicos (senso e anti-senso) que foram usados para
determinar regiões não conhecidas de fragmentos de gDNA. Os oligonucleotídeos
foram desenhados manualmente e verificados utilizando as informações geradas
pela <https://www.operon.com/oligos/toolkit.php?> e a análise comparativa das
seqüências através dos resultados da busca por similaridade com seqüências
gênicas de basidiomicetos já determinadas, através do BLAST e FastA.
4.3. Extração e purificação do DNA total de M. perniciosa
Para a extração do material genético do M. perniciosa utilizou-se o isolado
CCMB 000257, obtido a partir de basidiomas coletados na Estação Experimental
Sósthenes de Miranda (ESOMI) da CEPLAC, localizada no município de São
Sebastião do Passé, Km 62/63 da rodovia Salvador-Feira de Santana, na região do
Recôncavo da Bahia (12º 30’ S, 38º 29’ W). O DNA foi extraído da massa micelial
crescida em meio de cultura líquido, a partir de plugs com micélio retirados de meio
de cultura sólido ágar-batata-dextrose (BDA). O meio líquido era composto por LB
e as culturas foram mantidas a 25 ºC, sob agitação constante de 250 RPM. A
massa micelial (50-60 mg) foi macerada em nitrogênio líquido com um pistilo em
um gral de porcelana. O material pulverizado resultante foi transferido para
microtubos de 1,5 mL, contendo 400-650 mL de tampão de extração aquecido a 65
ºC. Utilizou-se o tampão de extração CTAB (brometo de N-acetil-n-n-ntrimetilamônio) modificado (100 mM Tris-HCl pH 8,1, 4 M NaCl, 2% CTAB, 20 mM
EDTA, 1% PVP) (ROGERS, BENDICH, 1994). O DNA foi extraído duas vezes com
clorofórmio-álcool-isoamílico (24:1), precipitado com isopropanol, e lavado com
etanol 70%. A ressuspensão foi feita com água ultrapura previamente autoclavada.
A análise qualitativa e quantitativa do material extraído foi realizada por meio de
eletroforese (DNA de fago-λ, digerido com Hind III) e de espectrofotometria
ultravioleta nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm.
44
Os géis de agarose foram preparados em TAE 1x (Tris/ ácido acético/ EDTA)
com SYBR Safe (Invitrogen®) a 1:10000, em concentrações de 1% e 1,2%. As
amostras de DNA analisadas foram preparadas com o tampão de corrida
bromofenol. A eletroforese foi feita em TAE 1x a 80 V, 70 mA e 70 W por 90 min. A
visualização dos fragmentos de DNA foi visualizada através de transiluminador de
luz ultravioleta. Após a corrida, os géis foram fotografados com o sistema de
fotografia digital KODAK EDAS 290.
4.4. Amplificação de fragmentos de DNA genômico
A reação em cadeia da polimerase (PCR) simétrica (SAIKI et al., 1988) foi à
técnica empregada para amplificar, pelo método de primer walking, as regiões não
conhecidas a partir de seqüências conhecidas (PARKER et al., 1991), utilizando-se
várias combinações de pares de primers (direto e reverso) (Figura 09 e Tabela 01).
Alvo
Pchsic34
Alvo
Pchsic13.3
Pchs54F
1700pb
Pchsic54F
Pchsic34F
Pchsic13.3R
Pchsic13.3F
Pchsic34R
Pchsic 54R
1100pb
1400pb
Pchsic54R
≈ 4000pb
40
Figura 09: Esquema representativo do gene da sintase da quitina, com destaque para os
fragmentos amplificados e seqüenciados neste trabalho. O icontig5 está representado em amarelo,
icontig3 em azul e o contig4 em vermelho. Em branco estão as regiões inicialmente desconhecidas
que foram determinadas por primer walking.
As amplificações foram realizadas em um volume final de 25 µL, constituído por
tampão de amplificação a 10x; mix de dNTPs a 10mM; MgCl2 a 50 mM;
oligonucleotídeo específico a 10 pMol; DNA genômico de M. perniciosa (12,5 ng);
Taq DNA Polymerase a 0,02 U/µL da Invitrogen® e água ultrapura autoclavada
(q.s.p. 25 µL).
45
Os parâmetros das reações de amplificação foram os seguintes: desnaturação
a 94 oC por 3 min., anelamento a 61,6 ºC por 45 seg., para o par Pchsic13.3F/
Pchsic13.3R; 59,7 ºC por 45 seg. para o par Pchsic34; e 65 oC para os demais
primers, por 60 seg. e a extensão a 72 oC por 45 seg., perfazendo 34 ciclos com
extensão final de 72
o
C por 10 min. Controles negativos, sem DNA, foram
preparados em cada uma das diversas séries de amplificação para se excluir a
possibilidade de contaminação dos reagentes.
Tabela 01: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para determinar as regiões desconhecidas do
gene da sintase da quitina do fungo causador da vassoura-de-bruxa.
Seqüência (5’
3’)
Primer
Posição*
Pchsic34-F
ggT gAA CgT gCA gCA TAC ACg
2352
Pchsic34-R
gCT CCC ACT ggT CCT Tgg AAg
2585
pchsc63-F
CgA Cgg TCT CgA AgC AAT gg
-
pchsc63-R
ggg CTg ATT CTg gCA CAT CCg
1814
Pchsic13.3-F
CCA CCg TTg gTT gTT CAA CgC C
1192
Pchsic13.3-R
gCC AAC gAA TgA TCC CCA Tgg
1644
pchs54-F
CTA CTA Tgg CgA ATC gCC Cg
Pchs54-R
CAT TTA gTT CCg TCT gCA ACA TCT g
3422
ChsHindIII-F(13F)
Agg gcA ACT TCA TCA CCg AgT ATC C
475
ChsXholI-R (13-R)
CgT ggC TCg Agg gTgC ACC AgT Tg
1097
ChsHindIII-F(10F)
ggg TAC gAA AgC TTg CgA TAA AgC C
2936
ChsXholI-R (10-R)
gAA gTA CTC gAg ACA CTg TCA Tgg
3381
1
*Posição no provável gDNA
Após o término da reação, 3,0 µL de cada amostra amplificada foi submetida à
eletroforese em géis de agarose, na concentração de 1% e 1,2%, preparados em
TAE 1x com SYBR Safe Invitrogen a 1:10000. As amostras de DNA para a análise
em gel foram preparadas com o tampão de amostra azul de bromofenol
(SAMBROOCK, RUSSELL, 2001). A eletroforese foi feita em TAE 1x com 70 V, 60
mA e 60 W por 90 min. A separação dos fragmentos de DNA foi visualizada
através de transiluminador de luz ultravioleta e fotografados com o sistema de
fotografia digital KODAK EDAS 290. Os produtos de PCR foram então purificados
46
com kit PureLink Invitrogen, adicionando-se 4x de tampão de ligação (fornecido
pelo fabricante) com isopropanol para cada volume de produto de PCR (50-100 µL)
contidos em uma coluna PureLink acoplada em um tubo de 1,5 mL. Em seguida, o
material foi centrifugado em T.A. por 1 min. a 10.000 g, e a coluna transferida para
um novo tubo. Adicionou-se 650 µL de tampão de lavagem (fornecido pelo
fabricante) com etanol, seguindo para uma nova centrifugação, e após o descarte
da solução filtrada, procedeu-se a uma nova centrifugação, em velocidade máxima
por 3 min. para total remoção do tampão. A coluna foi transferida para um tubo de
1,7 mL, e adicionou-se 50 µL de tampão de eluição (10 mM Tris-HCl, pH 8,5)
fornecido pelo fabricante. O material foi incubado por 1 min. e em seguida
centrifugado por 2 min. à velocidade máxima. A coluna foi descartada e o material
recuperado, contendo a amostra de DNA purificada (48 µL), que foi armazenada a 20 ºC, de acordo com as instruções do fabricante.
4.5. Seqüenciamento
Os produtos de PCR purificados foram seqüenciados diretamente. Os mesmos
iniciadores utilizados para amplificação (Tabela 01) foram também utilizados como
iniciadores nas reações de seqüenciamento.
Os amplicons purificados foram marcados com o Kit Big Dye Terminator Cycle
Sequencing
Ready
Reaction
(Applied
Biosystems)
de
acordo
com
as
recomendações do fabricante. As reações foram realizadas em microtubos de 0,2
mL em um volume total de 12 µL, sendo 4 µL de mistura do kit de seqüenciamento,
5 µL de água ultrapura, 1,0 µL (3,2 pmoles/µl) de solução do iniciador, e 20 ng de
amplicon purificado. Após a reação de seqüenciamento, purificaram-se os produtos
da reação através de precipitação com acetato de sódio 3 M pH 4,6 e etanol 95%
resfriado, com subseqüentes lavagens (mínimo de duas vezes) com etanol 70%,
seguido de secagem e ressuspensão do pellet em 18 µl formamida + EDTA. As
seqüências foram obtidas através da eletroforese capilar em seqüenciador
automático e foram feitas, no mínimo, duas repetições de cada fragmento, em
ambos os sentidos (direto e reverso).
47
4.6 Análise das seqüências
Os eletroferogramas obtidos foram analisados pelo programa FinchTV
(versão 1.4.0) (Geospiza Inc.) e as seqüências correspondentes foram
comparadas pelo SeqMan (versão 4.0) (BURLAND, 2000) e incorporadas aos
contigs previamente analisados.
As seqüências nucleotídicas dos contigs obtidos experimentalmente
foram então traduzidas pelo EditSeq (BURLAND, 2000) em seqüências
aminoacídicas nas seis possíveis fases de leitura e submetidas à análise
comparativa por similaridade com seqüências completas de genes e proteínas
correspondentes de basidiomicetos já depositadas no NCBI/EMBL/DDDJ,
utilizando-se o BLAST (versão 2.2.16) e o FastX (versão 3.46) e Clustal W
(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).
A determinação das bordas de éxons-íntrons, e, conseqüentemente, do
número, tamanho e estrutura primária dos íntrons no provável gene da sintase
da quitina de M. perniciosa foi realizada tanto através da comparação com
seqüências de DNA genômico dos genes homólogos de basidiomicetos como
também através de um algoritmo baseado em redes neurais treinadas com
bordas de éxons-íntrons dos genomas de espécies de Aspergillus
(NetAspGene 1.0 Server) (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAspGene/).
A análise de domínios e regiões conservadas da provável proteína foi
efetuada utilizando-se o InterPro que integra 11 bases de dados proteômicos,
como o UniProt (integra informações sobre proteínas contidas no Swiss-Prot,
TrEMBL e pIR), ProSite (base de dados de famílias e domínios de proteínas),
Pfam (dados de multiplas sequencias alinhadas), SMART (identificação e
anotação de dominios e arquiteturas de domínios de famílias protéicas), o
TMHMM v2.0 e TMPRED (domínios transmembranares) e SignalP v3.0 e
PSORT (localização subcelular e presença de peptídio-sinal), Swiss Model
(servidor de modelagem molecular por homologia), CATH (classificação
estrutural de proteínas) e muitos outros.
48
4.7 Análise filogenética
O conjunto de dados utilizados compreendeu as seqüências aminoacídicas
completas da sintase da quitina, depositadas no NCBI/EMBL/DDDJ, de todos os
táxons do clado fúngico com identidade igual ou superior a 50% (o que
corresponde a um valor-E de 0,0 e score acima de 882 bits) à provável proteína da
sintase da quitina de M. perniciosa, utilizando o programa BLASTp 2.2.17 (24-jun2007), com a matriz BLOSSUM 80.
As árvores resultantes foram enraizadas no ramo cujo terminal é o Ascomycota
Tuber borchii Kauffman (Pezizomycetes), uma vez que os Ascomycota são o
grupo-irmão dos Basidiomycota e, dentro dos Ascomycota, os Pezizomycetes
provavelmente originaram-se anteriormente aos grupos correspondentes às
demais espécies amostradas (HIBBETT et al., 2007).
Foram efetuadas análises filogenéticas nos programas PAUP
4.0b10
(SWOFFORD, 2002), PHYLIP versão (FELSENSTEIN, 2005) e Mr. Bayes 3.1
(RONQUIST, HUELSENBECK, 2003), utilizando métodos de distância, parcimônia
máxima, verossimilhança máxima e bayesianos para os conjuntos de seqüências
protéicas. Na análise pelo método de distância foram utilizadas as distâncias
médias e o algorítmo do vizinho-mais-próximo (Neighbour-Joining ou NJ), enquanto
que no modelo de parcimônia máxima, utilizou-se a parcimônia simples, sem
pesagem, não considerando os indels como um outro caráter. Para a análise de
verossimilhança máxima, utilizou-se o modelo de evolução molecular de proteínas
JTT (Jones-Taylor-Thornton), com amostragem de todos os caracteres com taxas
de evolução heterogêneas entre os caracteres, seguindo uma distribuição gama
(alfa = 0,5). Na análise bayesiana, utilizou-se o modelo de BLOSSUM como
probabilidade anterior, com a amostragem de todos os caracteres com taxas de
evolução heterogêneas entre os caracteres também adotando uma distribuição
gama (alfa = 0,5). A análise foi efetuada com 100.000 gerações, utilizando 4
cadeias distintas.
A avaliação do suporte dos grupos formados nas árvores filogenéticas foi
acessada por valores percentuais de reamostragem aleatória com reposição
(bootstrap), utilizando-se 1000 pseudoreplicações (FELSENSTEIN, 1985), para as
análises de distância, parcimônia e verossimilhança máxima, e valores percentuais
49
de probabilidades posteriores para a análise bayesiana. As árvores geradas foram
editadas utilizando-se o programa TreeView versão 1.6.6 (PAGE, 1996).
4.9 Determinação da estrutura 3D: Modelagem da região conservada
contendo o sítio ativo
A predição da estrutura 3D da região conservada da sintase da quitina foi
realizada por modelagem comparativa (GOLDSMITH-FISCHMAN, HONIG, 2003;
SANTOS FILHO, ALENCASTRO, 2003), utilizando métodos computacionais como
ferramentas do Swiss PDB Viewer (versão 3.7), que permite a submissão de uma
seqüência, retornando respostas por processos automatizados, como no processo
de modelagem por homologia descrito por Gibas, Jambeck (2001).
4.9.1 Identificação e alinhamento seqüencial da proteína molde
Assim, a seqüência primária da região conservada da proteína foi submetida ao
PSI-BLAST (ALTSCHUL et al., 1997) contra as proteínas presentes no Protein
Data Bank (PDB) (BERMAN, et al., 2000). Dessa forma, foram selecionadas
estruturas de proteínas conhecidas como molde(s), que apresentaram grau de
homologia igual ou superior a 25% (GOLDSMITH-FISCHMAN, HONIG, 2003).
Como a busca por um molde para toda a região selecionada não retornou
resposta, seguiu-se para a divisão da região conservada em quatro partes
aleatórias, buscando manter a região do provável sítio ativo em uma única porção.
Os fragmentos da região conservada foram novamente submetidos ao PSI-BLAST,
obtendo-se os moldes esperados. O molde e a seqüência alvo foram alinhadas
pelas ferramentas disponíveis no Swiss PDB Viewer (versão 3.7) e em seguida foi
submetido ao Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), que é um servidor de
modelagem por homologia (Figura 10).
50
A
B
Figura 10: Processo de alinhamento da seqüência problema com o molde. A: em verde, fragmento
da estrutura primária da seqüência de sintase da quitina de M. Perniciosa, em vermelho está a
região da seqüência que apresenta identidade com o molde, e em laranja, a região do molde que
tem identidade com a seqüência; B: Estrutura e molde alinhados, com a estrutura molde sobreposta
pela seqüencial problema (Fonte: Swiss PDB Viewer 3.7).
4.9.2 Construção e refinamento do modelo
O modelo 3D da proteína-problema foi construído através da metodologia de
corpos rígidos (SANTOS FILHO, ALENCASTRO, 2003). Para o seu refinamento,
foram utilizados dois métodos de MM, MM3 (LII, ALLINGER, 1989) e ff99,
conhecido também como Amber (CASE, et al., 2004; PEARLMAN et. al., 1995). Os
cálculos
envolvendo
os
método
MM3
foram
executados
no
programa
BioMedCache 6.1 desenvolvido pela Fujitsu (2005) usando computador tipo PC em
ambiente Windows, presente no Laboratório de Modelagem Molecular da
Universidade Estadual de Feira de Santana, enquanto os cálculos realizados pelo
campo de força ff99 foram executado pelo pacote Amber 8.0 (CASE, et al., 2004;
PEARLMAN et. al., 1995) utilizando a estação de trabalho RedWood, presente no
Mississipi Center for Supercomputing Research (MCSR) da University of Mississipi
via acesso remoto (Figura 11).
Ambos os pacotes possuem rotinas para minimização de geometria e
simulação por dinâmica molecular de biomacromoléculas. No entanto, as proteínas
foram previamente preparadas pelo programa tLEaP, presente no pacote Amber
51
8.0, a qual gerou uma proteína com carga neutra sendo utilizada tanto no
BioMedCache como no Amber 8.0 (CASE, et al., 2004).
Após a neutralização da proteína, foi realizado um prévio estudo cujo o
objetivo foi determinar qual seria a distância das interações de Van der Walls para
átomos não ligados a ser empregado em todos os cálculos a seguir. Esta distância
é denominada de cut-off, e a sua prévia determinação é importante uma fez que
quanto maior é esta distância, maior também é o custo computacional (tempo de
processamento e memória), sendo que isto necessariamente não traduz em uma
alteração significativa na geometria durante o processo de refinamento. Para isso,
variou-se o valor de cut-off entre 3 a 20 Ǻ através de cálculos single point pelo
método MM3.
Para o refinamento do modelo foi feita a sua minimização, que consistiu em
encontrar a melhor conformação da molécula na superfície de energia potencial
através dos algorítmos Steepest Descent e, posteriormente, Gradiente Conjugado.
Ambas as metodologias buscam uma região de mínimo na SEP, sendo o gradiente
conjugado descrito como mais sofisticado (HOLTJE, et al., 2003).
A seguir iniciou-se a etapa de refinamento do modelo através de otimização
de geometria, sempre através dos algorítmos Steepest Descent e, posteriormente,
Gradiente Conjugado, seguido de simulações de dinâmica molecular (DM) nos dois
métodos, a qual foi empregado protocolos distintos entre si. Através do método
MM3 (BioMedCache 6.1), foram executados uma série de cálculos de otimização
com 300 passos, seguidos de simulações de DM. Inicialmente, os átomos da
cadeia principal e das alfa-hélices foram fixos, e a cada ciclo de otimização e DM
as alfa-hélices foram relaxados uma a uma ,sempre a estrutura de menor energia
para o cálculo seguinte, até que se obteve uma estrutura final completamente livre.
O primeiro ciclo foi realizado à 1.000 K, e os ciclos posteriores à 600 K. Todas as
simulações foram realizadas por 50 ps, gerando 2501 estruturas (FUJITSU, 2005).
Paralelamente, a proteína modelo também foi refinada pelo campo de força Amber.
Neste caso, a proteína foi otimizada com 800 ciclos para cada algorítmo descrito
acima. A seguir, a estrutura de equilíbrio foi submetida à simulações de DM, por
300, 1000, e 200 e 3000 ps à 300 K, incluindo uma adicional simulação por 300 ps
à 600 K, obtendo no final do processo 5.000 estruturas diferentes em casa
simulação (CASE, et al., 2004). Dessa forma, no final do processo obteve-se dois
52
modelos por diferentes métodos. As estruturas geradas por ambos os programas
foram descritas graficamente. Este processo permitiu obter uma estrutura refinada,
a qual se encontra em uma região de mínimo na SEP, além de permitir estudar o
movimento atômico, avaliar o comportamento termodinâmico e observar a
estabilidade da proteína.
Swiss Model
Construção
do Modelo
BioMedCache
Neutralização: tLEaP
AMBER
Determinação de cut-off
BioMedCache
AMBER
BioMedCache
Congelamento da cadeia principal
e α-Hélices
Minimização
Minimização
Steepest Decent
Steepest Decent
Gradiente Conjugado
Gradiente Conjugado
Dinâmica
1000 K/50 ps
Minimização
Steepest Decent
Liberação de um turn por vez em cada
α-Hélices
Dinâmica
300 K/300, 1000, 2000, 3000
ps
Dinâmica
600 K/300 ps
Modelo
Proposto
Figura 11: Fluxograma da metodologia para construção do modelo.
53
4.9.3. Validação
O modelo foi avaliado sobre a qualidade do efeito estérico da cadeia
principal (ŠALI, BLUNDELL 1993) utilizando o programa Procheck (Versão 3.0).
Este programa gera variados gráficos que demonstram a qualidade geométrica,
através das coordenadas da estrutura da proteína, estabelecendo uma pontuação
para a qualidade estérica do modelo em estudo. Neste programa é possível gerar o
gráfico de Ramachandran, que determina os ângulos de torção ω (Phi) e φ (Psi)
dos resíduos da estrutura. Separadamente é gerado um Ramachandran para os
resíduos de glicina e prolina, pois estes aminoácidos diferem dos demais em sua
conformação, e conseqüentemente, sua região favorável também é diferente. Em
um terceiro gráfico é representado os ângulos de torsão chi1 e chi2 pra todos os
resíduos. A qualidade do Ramachandran, planaridade das ligações peptídicas, má
interação entre os átomos não-ligados, energia de ligação hidrogênio na cadeia
principal, propriedades da cadeia lateral e outros parâmetros também são
ilustrados pelo Procheck 3.0 (LASKOWSKI et al., 1994).
Uma outra opção de validação utilizada é o ANOLEA (Atomic Non-Local
Environment Assessment), também disponível pelo Swiss Model. Segundo MELO
e FEYTMANS (1998) este método calcula o somatório da interação dos átomos,
dentro de um raio de 7 Ǻ, para cada um dos aminoácidos (Atomic mean force
potencial - AMFP) obtendo o perfil de energia potencial da estrutura de uma
proteína, demonstrando quanto o ambiente químico ao redor do átomo contribui
para a sua estabilidade. Este cálculo gera uma pontuação para cada aminoácido
que é demonstrado graficamente. As menores pontuações são encontradas em
loops ou regiões de diferença entre o molde e a proteína alvo (GUEX, PEITSCH,
1997; GUEX et al., 2001).
54
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Seqüenciamento do gene da sintase da quitina
A busca no banco de dados do Projeto Genoma do Moniliophthora
perniciosa retornou 72 reads, com os quais foram formados 19 contigs. Nenhum
dos contigs formou o gene inteiro da sintase da quitina, mas alguns deles tiveram
um valor-E consideravelmente negativo, o que significa ser este um alinhamento
altamente significativo e não devido ao acaso, sendo os mais adequados para os
estudos funcionais. Três deles (iContig3, iContig4 e iContig5) apresentaram
significativa identidade à sintase da quitina de Agaricus bisporus, sendo mapeados
com sucesso, no citado produto gênico, com uma cobertura descontínua de 76%,
com dois intervalos na região central do gene (Figura 12 e Tabela 02).
MGDFKPSPNSSQTRIDNYGDPFADRPRQTQFVEPERPYGSSASARPFESSASLPQDLGGGFDDEEYV
EKLPLNTGGNFAGGFYPPGPVDPSAYGDSHIHPGRPSSVVSTSTNGVDSAWRRRQTIKRGVTRKVKL
TQGNFIAEYPVPTPILNAVEDKWKSTNKTEFSHMRYTAATVDPDEFSEENGWSLRTKMYNRDTEILI
AVTSYNEDKTLYARTLHGVMLNIRDICKTKQSKYWRRHAEEGTPGWQKITVALIVDGLEPMDKTVLD
ILATIGVYQDGVMKKQVDGKDTVAHIFEYTTQLSVDATPQLVLPRAEDPNNLVPVQIIFVLKAQNQK
KINSHRWLFNAIGRMLNPEICVLIDAGTKPGHKSIYYLWEAFYNDPHLGGCCGEIHAMIKGGKKLLN
PLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRFQAITGCPLEQYFHGDHSLADRLGPKGIY
GMNIFTKNMFLAEDRILCFELVAKAKDRWTLTYVKPSKAETDVPESAAELIGQRRRWLNGSFAASVY
ALVNFFKLYRSGHGIIRMFFLHIQGLYNVFSLIFSWFALANMWLTFSIIIDLVPSQGIVIFGTETVT
HWVNLSFKWLYLSFLALQFILALGNRPKGERMAYVATLWVYGFLAVYLLVCSFALTIKAFKNIPNEL
SFEGKSAGEIVLQFFEPPVGALIAAMISTYGIYLVASFLYRDPWHMFSSFLQYLCLAPSFTNVLNVY
AFCNLHDVSWGTKGSDKAEALPSVSSSKTKGADMAVVEDTTKIQEDVDAAFKETVTRAITKIESKEV
VEKPTMDDQNKTFRTRLVSLWMLSNATLAIAIENISGLPSKDPSVDADTLQKRQSTYFAIILYSTFG
LAMVRFIGCLFYFFKRNLFRCCRKNRLFQVVNGHDSSF
Figura 12: Chs1 de Agaricus bisporus (909aa). Destaque para a delimitação das regiões de
similaridade, obtida por BLAST, com contigs de M. perniciosa. Amarelo: icontig 5 - Fase de leitura
-88
+1: Valor-E = 1e , Identidade = 55%, Positividade = 63%, Gaps = 12%, Fase de leitura +2: Valor-E
-37
-37
= 1e , Identidade = 91%, Positividade = 98%, Gaps = 0% e Fase de leitura +3: Valor-E = 1e ,
Identidade = 83%, Positividade = 91%, Gaps = 0%; Azul: icontig 3 - Valor-E = 6e-37 Identidade =
78%, Positividade = 81%, Gaps = 0%; Verde: icontig 4 - Valor-E = 1e-82, Identidade = 58%,
Positividade = 66%, Gaps = 24%, 690 aminoácidos (aprox. 76% do total de 909 aa). Aminoácidos
em negrito correspondem ao alvo do par de primers Pchsic13.3 e Pchsic34, respectivamente;
Aminoácidos grifados representam a região de anelamento do Pchsic13.3, em vermelho, e do
Pchsic34, em azul.
55
Tabela 02 – Seqüências do M. perniciosa relacionados aos genes da sintase da quitina em Agaricus
bisporus (Número de acesso: emb|CAB96110.1) identificados por BLASTx.
Reads
Contigs
Valor-E
CP02-S3-000-118-A08-UC.G
CP02-PF-096-002-C08-UC.F
CP02-PF-096-002-C08-UC.G
3
6e-37
CP02-S2-000-036-D04-EM.R
CP02-S2-000-166-A03-CL.F
CP02-S2-000-166-C10-UC.F
4
1e-82
CP02-S1-000-007-A08-CL.F
CP02-S2-038-242-G02-EM.F
CP02-S2-000-180-A03-UC.F
CP02-S2-000-138-A09-EM.R
CP02-S1-000-015-C08-EM.F
CP02-S2-000-032-G09-EM.R
5
1e-88
O resultado do BLASTx do iContig5 mostrou ainda significativa similaridade
com o início do gene da sintase da quitina de Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm.
(6 e-72) e Coprinopsis cinerea (Schaeff.) Redhead, Vilgalys & Moncalvo (2e-69). Na
busca de um provável códon de iniciação para representar a metionina da sintase
da quitina do M. perniciosa, com a região inicial do iContig5, traduzida para a fase
de leitura +1, de acordo com o BLASTx, pôde-se encontrar uma metionina a sete
aminoácidos antes do início do códon encontrado no BLAST do icontig5
comparada à seqüência de AbChs1, mostrando-se como um indício de que esta
seja a região 5’ do provável gene CHS do M. perniciosa. Esta mesma região
também resultou num alinhamento com 100% de identidade, entre as regiões
iniciais dos genes de Puccinia graminis Pers. e P. ostreatus (Figura 13). Outra
evidência para essa suposição é a presença de uma região rica em AT, com 6
nucleotídeos (TTAATT), correspondendo a um sinal de transcrição inicial, a
exatamente 39 nucleotídeos antes do provável códon de iniciação, indicando ser a
região promotora do gene alvo (Figura 14). Isso confirma a informação de que
genes eucarióticos apresentam uma região promotora conhecida como TATA BOX
numa faixa de 35 a 40 nucleotídeos antes do códon de iniciação (SMALE,
KADONAGA, 2003).
56
iC5-MpChs
A.bisporus
P.ostreatus
P.graminis
MANRPPLP------------------SNA--SSSTVNDPYA--DPFADRPRQ
MGDFKPSPN----------------------SSQTRIDNYG--DPFADRPRQ
MSNTPPTPRFDAPRPSTPLSLMPSQGRSGSLSSTPEPSVYGGDDPFGDSRSQ
MSPHRNDPFSDQPNPDL--------GRYHLS--DNDDSFTG--QPPVDNHHY
30
28
52
40
Figura 13: Alinhamento entre o icontig5 de M. perniciosa e a região inicial da seqüência codante do
cDNA da CHS de M. perniciosa com A. Bisporus (emb|CAB96110.1), P. ostreatus (dbj|BAF37219.1)
e P. graminis (gb|ABB70409.1) (Fonte: Resultados experimentais, http://tcoffee.vital-it.ch/).
A
iC5: CCATCTTGCCCTTGCCTCGCTTTCTGTCACGACTCTTGTTGCTTAATTCTT
iC5: TCCTTAGCTTTCAGTTTTTTTCTTCCTTTGACTACTATGGCGAATCGCCCG
+1:
M A N R P
iC5: CCACTCCCTTCAAATGCTTCTAGCTCTACAGTCAATGATCCTTATGCAGAC
+1: P L P S N A S S S T V N D P Y A D
B
Figura 14: A - Tradução da região inicial do iContig5 na fase de leitura +1. A - Os aminoácidos em
azul representam o início da similaridade, por BLASTX, com A. bisporus; destaque, em verde, para
o provável códon de iniciação que está situado a sete aminoácidos antes do início do BLAST, com o
sexto aminoácido da referida enzima. Em vermelho, provável região promotora (TATA BOX), B Cromatograma do sequenciamento da placa CP02-S1-000-015-C08-EM-F na região do provável
TATA BOX, disponível no banco de dados do genoma do M. perniciosa (Fonte: Resultado
experimental gerado pelo programa FinchTV).
A tradução do iContig3, na fase de leitura +2, revelou a presença do domínio
QRRRW, considerado como a assinatura da sintase da quitina em leveduras e
fungos filamentosos. Esta informação foi confirmada também por BLASTx e em
alinhamentos, onde se pode perceber 100% de identidade nas seqüências
completas de sintase de quitina de Basidiomycota (Figura 15). Esta região também
é indicada como provável região do domínio catalítico (TELLAM, et al. 2000).
O DNA total do M. perniciosa foi extraído da massa micelial segundo Rogers
e Bendich (1994) e analisado em gel de agarose 1%. Com a espectrofotometria
57
ultravioleta nos comprimentos de onda de 260 nm determinou-se que o material
extraído apresentava uma massa de 3.972 ng/µL.
A partir das seqüências obtidas no banco de dados foi possível construir
pares de primers com os quais foram feitas as amplificações dos fragmentos
desconhecidos. O fragmento menor com cerca de 290 pb foi obtido com o par de
primers Pchsic34F e Pchsic34R, e o par Pchsic13.3F e Pchsic13.3R originou um
fragmento maior com aproximadamente de 480 pb (Figura 16), como o esperado.
Mperniciosa
Abisporus
Ccinerea824
Postreatus
Ccinerea864
Cneoformans901
Cneoformans931
Umaydis
Pgraminis868
Pgraminis977
GKKLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAILGRPLEQYFHGD
GKKLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRFQAITGCPLEQYFHGD
GKKLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRFKALLGRPLEQYFHGD
GKKLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAILGKPLEQYFHGD
GKRLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPFESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAIQGRPLEQYFHGD
GVKLFNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYKAIQGRPLTQYFHGD
GVKLFNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYKAIQGRPLTQYFHGD
GRKLINPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESTFGYVSVLPGAFSAYRFRAIQGRPLQQYFHGD
GKKLINPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESAFGYVSVLPGAFSAYRFRALSGRPLQQYFHGD
GKKLINPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAILGRPLQQYFHGD
* :*:********************:**:***************::*: * ** ******
461
456
384
479
417
429
464
504
434
495
Mperniciosa
Abisporus
Ccinerea824
Postreatus
Ccinerea864
Cneoformans901
Cneoformans931
Umaydis
Pgraminis868
Pgraminis977
HSLADRLGPKRYYGNEHLHQEHVLAEDRILCFELVAKKNDRWTLTYVKPSKAETDVPESA
HSLADRLGPKGIYGMNIFTKNMFLAEDRILCFELVAKAKDRWTLTYVKPSKAETDVPESA
HSLADRLGPKGIHGMSIFTKNMFLAEDRILCFELVAKKGDRWTLTYVKPSKAETDVPESV
HSLADRLGAKGIHGMSIFTKNMFLAEDRILCFELVAKAGDRWTLTYVKPSKAETDVPESA
HSLADRLGEHGINGMSIFQKNMFLAEDRILCFELMAKRGEKWTLGYVKDSKAETDVPETA
ATLAARLGKKGIYGMGIFTKNMFLAEDRILCFELVAKKGEKWVLQYVKPSKAETDVPEQA
ATLAARLGKKGIYGMGIFTKNMFLAEDRILCFELVAKKGEKWVLQYVKPSKAETDVPEQA
HTLADRLGKKGLHGMDIFTKNMFLAEDRILCFELVAKAGDKWTLTYVKPSKGETDVPEGA
HTLADRLGKKGLNGMGIFTKNMFLAEDRILCFELAAKANDAWLLSYVRAAKGETDVPEQA
HSLSERLGKKGIQGMGIFKKNMFLAEDRILCFELVAKAKSRWVLGYVKPAKGETDVPEQA
:*: *** :
*
: :: .*********** ** . * * **: :*.****** .
521
516
444
539
477
489
524
564
494
555
Mperniciosa
Abisporus
Ccinerea824
Postreatus
Ccinerea864
Cneoformans901
Cneoformans931
Umaydis
Pgraminis868
Pgraminis977
PELIGQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKLYQSGHGIFRMFFFHVQALYNIFSLVFSWFSLA
AELIGQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKLYRSGHGIIRMFFLHIQGLYNVFSLIFSWFALA
AELIGQRRRWLNGSFAASVYALVNFFSFYRSGHGPIRMFFFHIQAIYNVLSLVFSWFALA
AELIGQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKIYKSGHGIIRLFFLHLQALYNSFSLFFTWFALA
PELIGQRRRWLNGSFAASIYALVHFWRVYQSGHNFVRIFFFHIQALFNAFNLFFSWFALA
AELISQRRRWLNGSFAASVYSVFHFFRLYRSGHGPIRMLFLHIQAIYNVFSLIFSWFALA
AELISQRRRWLNGSFAASVYSVFHFFRLYRSGHGPIRMLFLHIQAIYNVFSLIFSWFALA
AELISQRRRWLNGSFAASIYSLVHFFRIYKSNHGIIRLFFLHIQALYNAIVLLFSWFALA
AELISQRRRWLNGSFAASIYATIHFFRFYKSSHNPIRLLMFHVQALFNIFQLIFTWFSLA
AELIGQRRRWLNGSFAAGIYSLAHFSRMYSSSHGIVRMFFLHVQAFYATAGLIMSWFALG
.***.************.:*: :* .* *.*. .*::::*:*.::
*.::**:*.
581
576
504
599
537
549
584
624
554
615
Figura 15: Alinhamento mostrando a região do domínio característico das sintases da quitina e
provável sítio catalítico em Basidiomycota.
Com diferentes combinações dos pares de primers construídos para a sintase
da quitina foi possível também realizar a amplificação de todo o gene, com
extensões diferentes e contínuas (Figura 17). Com os pares Pchs54F/Pchsic13.3R,
58
Pchsic13.3F/Pchsic34R
e
Pchsic34F/Pchs54R
obtiveram-se
amplicons
de
diferentes regiões do gene em estudo que apresentaram, respectivamente, 1700,
1400 e 1100 pb. Com o par Pchs54F/Pchs54R o gene da sintase da quitina foi
amplificado por inteiro, apresentado cerca de 4 kb. Os fragmentos amplificados
foram seqüenciados, confirmando as informações dos experimentos anteriores,
bem como aquelas contidas no banco de dados do projeto. A montagem de
contigs, a partir dos fragmentos amplificados e seqüenciados, sugere que no M.
perniciosa há, pelo menos, um gene da sintase da quitina.
M
1
2
3
4
500 pb
Figura 16: Análise eletroforética dos produtos de amplificação do DNA total do M. perniciosa via PCR. No
gel de agarose a 1,0% foi aplicado 3 µL do produto da reação de amplificação em cada poço. A
eletroforese ocorreu por 90 min., 60 v e 50 mA. M - Marcador de massa molecular 100 base pair Ladder
da Fermentas®. Condições experimentais: 2,5 µL de tampão de amplificação a 10x; 0,5 µL do mix de
dNTPs a 10 mM; 0,8 µL de MgCl2 a 50 mM; 1,0 µL de cada oligonucleotídeo específico a 10 pMol; 1,0 µL
de gDNA de M. perniciosa (12,5 ng); 0,13 µL de Taq DNA Polymerase (5U/µL) da Phoneutria® e água
ultrapura (q.s.p. 25 µL). 1 e 2 - Fragmentos de cerca de 290 pb obtido com o par de oligonucleotideo
Pchsic34F e Pchsic34R. A desnaturação procedeu-se a 94 ºC por 1 min, anelamento a 59,7 ºC por 1 min.
e extensão a 72 ºC por 2 min., perfazendo 34 ciclos com extensão final de 72 ºC por 1 min. 3 e 4 Fragmento de cerca de 480 pb obtido com o par de oligonucleotideo CHSiC13.3F e CHSiC13.3R. A
desnaturação procedeu-se a 94 ºC por 1 min, anelamento a 61,6 ºC por 1 min. e extensão a 72 ºC por 2
min., perfazendo 34 ciclos com extensão final de 72 ºC por 2 min.
59
M
1
2
3
4
5
6
7
8
4000 pb
1000 pb
Figura 17: Análise eletroforética dos produtos de amplificação do DNA total do M. perniciosa por PCR.
Condições experimentais: 2,5 µL de tampão de amplificação a 10x; 0,5 µL do mix de dNTPs a 10 mM;
0,8 µL de MgCl2 a 50 mM; 1,0 µL de cada oligonucleotídeo específico a 10 pMol; 1,0 µL de gDNA de M.
perniciosa (12,5 ng); 0,13 µL de Taq Platinum DNA Polymerase (5U/µL) da Invitrogen® e água ultrapura
(q.s.p. 25 µL). A desnaturação procedeu-se a 94 ºC por 3 min, anelamento a 65,0 ºC por 1 min. e
extensão a 72 ºC por 2 min., perfazendo 34 ciclos com extensão final de 72 ºC por 10 min. Análise de 3
µL do produto da reação de amplificação em gel de agarose a 1,2%, por 120 min., 60 v e 50 mA. M Marcador de massa molecular DNA Step Ladder Promega®; 1 e 2 - Pchs54-F/Pchsic13.3-R, com
fragmento de 1700 pb; 3 e 4 - Pchsic13.3F/PchsiC34R, com fragmento de 1400 pb; 5 e 6 PchsiC34F/Pchs54F, com fragmento de 1100 pb e 7 e 8 – Pchs54F/Pchs54R, com fragmento de
aproximadamente 4000 pb.
Com as informações disponíveis no banco de dados e aquelas resultantes dos
seqüenciamentos dos intervalos desconhecidos, foi possível a determinação da
provável seqüência gênica para a sintase da quitina de M. perniciosa. O gene
MopCHS é composto por 3443 pares de bases, organizados em 13 íntrons e 14
éxons que constituem um cDNA com uma fase de leitura aberta com 2739 pb e
uma proteína com 913 aminoácidos (Figura 18/Tabela 03). Os íntrons seguiram um
padrão característico, tanto para as bordas (GT/AG), sendo o mesmo encontrado
descrito para as bordas da sintase da quitina de Exophiala dermatitidis (LIU et al.,
2004) quanto para o tamanho apresentado que foi entre 51 e 60 pb. Na análise do
número de íntrons e éxons existentes nos genes completamente seqüenciados de
representantes de Basidiomycota, existe uma redução em número nos genes
destas espécies em relação aos grupos considerados filogeneticamente mais
antigos. É possível que este decréscimo seja uma possível tendência evolutiva
dentro de Basidiomycota.
60
A proteína predita apresenta, aproximadamente, 102 KDa, com um pI de 8,43
em pH 7,0, o que a caracteriza como altamente básica em comparação com o
recém-seqüenciado gene MsCHS2 da sintase da quitina de Manduca sexta e
Lentinula edodes que apresentaram pH de 6,06 (HOGENKAMP, 2006) e 5,33
(NISHIHIMA et al., 2007) respectivamente.
1
2
3 4
5
6
7 8 9 10
11 12 13
14
500 pb
Figura 18: Esquema representativo demonstrando a organização do gDNA da sintase da quitina de
M. perniciosa. As linhas representam os éxons e as barras verticais os íntrons.
Tabela 03: Característica da organização dos éxons e íntrons do gene da sintase da quitina de M.
perniciosa.
EXON
INTRON
Tamanho
Tamanho
Nº
Posição
Nº
Posição
(5’ ... 3’)
(pb)
(pb)
GTGAGC...CCTCAG
1
275
1-275
1
53
276-328
GTAAGT...GGCCAG
2
237
329-565
2
55
566-620
GTTTGT...CTATAG
3
391
621-1011
3
52
1012-1063
GTAAGC...CATCAG
4
168
1064-1231
4
55
1232-1286
GTAAGT...CCACAG
5
199
1287-1485
5
55
1486-1540
GTAAGT...TTCTAG
6
350
1541-1890
6
56
1891-1946
GTAAGT...CTCCAG
7
81
1947-2027
7
53
2028-2080
GTAAGT...TTCTAG
8
132
2081-2212
8
52
2213-2264
GTGCGA...GAATAG
9
119
2265-2383
9
51
2384-2434
GTGAGC...ACTTAG
10
200
2435-2634
10
60
2635-2694
GTACGT...CTCTAG
11
29
2695-2723
11
51
2724-2774
GTACGT...TCCTAG
12
102
2775-2876
12
51
2877-2927
GTACGT...TGACAG
13
405
2928-3332
13
57
3333-3389
14
51
3390-3440
(Fonte: Resultados experimentais)
Uma análise da predição da topologia da proteína pelo software TMHMM (v2.0)
(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), revelou um total de oito regiões com
hélices transmembranares, seis delas com probabilidade de aproximadamente 1,0
e duas com probabilidade próximas a 0,6 (Figura 19). A mesma análise foi feita
também pelo software SOSUI da Universidade de Nagoya (http://bp.nuap.nagoyau.ac.jp/sosui/sosui_submit.html) e confirmaram os resultados para algumas das
hélices preditas (Tabela 04). Em ambas as análises nota-se a concentração das
61
hélices transmembranares a partir da segunda metade da proteína, confirmando
que esta é uma região rica em aminoácidos hidrofóbicos. Esta análise sugere que
a provável região do domínio catalítico da enzima em estudo esteja em uma região
intermembranar. Tellam et al. (2000), os primeiros a determinarem a seqüência
completa de cDNA da provável sintase da quitina de artrópodo, utilizando esta
ferramenta de análise, detectaram de 15 a 18 hélices transmembranas, indicando
que a enzima, no artrópodo, é uma proteína integral de membrana. A analise da
topologia transmembranar de outros basidiomicetos filogeneticamente relacionados
ao M. perniciosa relevam semelhanças, principalmente no que se refere a posição
inicial dos aminoácidos transmembranares como pode ser visto na tabela 05.
Figura 19: Predição da topologia de hélices transmembranares na sintase da quitina (Fonte:
TMHMM).
Tabela 04: Predição de Hélices transmembrana para o gene MopCHS.
TMHMM
N-Terminal
SOSUI
C-Terminal
N-Terminal
559
581
554
585
614
636
617
651
673
652
705
727
705
737
759
735
838
860
880
902
(Fonte: Resultado experimental, http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ e
http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html
C-Terminal
576
607
638
674
727
757
-
62
Tabela 05: Predição das topologias transmembranares das sintase da quitina de Basidiomicota,
obtida em análise realizada pelo TMHMM.
Nº de regiões
transmembrana
Nº de regiões
transmembrana
(Prob. > 1.0)
Posição inicial das
prováveis regiões
transmembranas
M. perniciosa
8
6
559
A. bisporus
7
6
526
C. cinerea
7
5
487
C. cinerea2
7
6
454
C. neoformans
7
6
535
C. neoformans2
7
6
389
C. neoformans3
7
6
570
P. ostreatus
7
6
558
P. gaminis
7
6
541
P. graminis2
7
7
593
U. maydis
7
6
574
L. edodes
7
7
919
Basidiomicota
Nº de Acesso
EU154354
SOUZA et al., 2007
CAB96110.1
SREENIVASAPRASAD, et
al., 2000
EAU87177.1
BIRREN, et al., 2003
EAU84753.1
BIRREN, et al., 2003
EAL20616.1
FUNG, et al., 2004
XP_570882.1
LOFTUS, et al., 2005
AAW43575.2
LOFTUS, et al., 2005
BAF37219.1
NISHIHARA, et al., 2007
ABB70408.1
BROEKER, et al., 2006
ABB70409.1
BROEKER, et. Al., 2006
P30598
KAMPER, et al. 2006;
WEBER, et al. 2006 e
BOWEN, et al. , 1992;
AB262360
NISHIHARA, et al., 2007
Motifs altamente conservados podem ser encontrados na seqüência
determinada, tais como EDRXL, QRRRW e QXXEY que são considerados como
assinaturas, pois estão presentes em todos os tipos de sintase da quitina, sendo,
como supracitado, uma possível região catalítica. O motif QXFEY é comum em
fungos e nematódeos, e é descrito como altamente conservado também em
insetos (MERZENDORFER, ZIMOCH, 2003). Sugere-se que o motif (S/T)WGTKG,
também encontrado em MopCHS, possa desempenhar um importante papel na
catálise, sendo que a substituição do triptofano (W) e da segunda treonina (T)
resulte na perda dessa atividade (MERZENDORFER, 2006). A proteína
determinada possui todos os domínios descritos por Ruiz-Herrera et al. (2002)
como
sendo
característicos
(D/E)YPVP(T/S)(A/P)I(Q/L)SA,
da
Classe
III,
RTLHGVM(Q/L)N(V/I)RDI,
quais
sejam:
LNPE(I/V)C,
PLEQYFHG, RMFF, WF(A/S)LA, LQF(I/V)LALGNRPK, FRT(S/R)LV. Apresenta
63
ainda outros 09 domínios referenciados como específicos da Divisão 1, que são:
EF(T/SAK)X(L/M)(T/R)YXA(A/VC)T(C/V/S),
T(M/Y/S)YNE(D/E/N),
LAEDRILC(F/W/Y)(E/D)(L/V)(V/A),
WXK(I/V)XVXX(I/V)XDG,
(L/I)(L/I/V)(D/E)(A/V/C)GT,
F(C/V)(L/M)K(E/Q/A)XNXKK(L/I)NSH)R/L)W, TDVP, PLV(A/Y)XQNFEYK(MI/L)SNILDK(P/T)(L/TV)ESX(F/M)G(Y/F/H)(I/V)(S/T)VLP(G/A)A(F/L)(S/C)AYR,
E(F/L)(I/V)-
XQRRRW(L/I)N(G/Q)X(FL/M)(F/A)A (Figura 20) e, de acordo co Coquer et al.
(2004), os motifs DAGT e TSYNE apresentam provável função na ligação de
substrato; presume-se que o motif LAEDRIL refere-se a uma base catalítica.
1
456
Consensos da Classe-III
Consensos da Divisão 1
913
Consensos de todas as CS
Figura 20: Localização dos domínios que são considerados consenso e que identificam a sintase da
quitina e caracterizam a Classe III e a Divisão 1.
O BLASTp revelou uma semelhança entre os domínios conservados
presentes nas bases de dados do Pfam e COG (Figura 21), e apresentou um
alinhamento com valor E = 0,0 para as 50 diferentes seqüências que são
apresentadas na Tabela 07. Além do valor de confiança dos alinhamentos, os
valores de cobertura da região alinhada, tanto para a seqüência em estudo
(MopCHS) como para as seqüências depositadas, são bastante significativos,
variando de 81 a 100%. Contra o A. bisporus o valor de identidade foi de 79% e
contra P. ostreatus foi de 67%, com coberturas de, respectivamente, 98 e 100%. A
análise de domínios conservados na base de dados do Pfam08407, pela
ferramenta de pesquisa de proteína (Pfam v21.0/HMMs - http://pfam.janelia.org/)
apresentou três domínios de valores estatísticos altamente significativos, como
pode ser visto na Tabela 06 e Figura 21. Dentre os 41 componentes da base de
dados Pfam08407 encontra-se o A. bisporus (Q9P4U1_AGABI), mais uma vez
corroborando a identidade entre estas proteínas e a proteína em estudo.
64
A
Sintase_quit-1N: domínio 1 de 1, de 129 até 209: Valor-E = 3.2e-42
Pfam08407
*->RRRKTIRRKVKLVNGQGNLVSLDCPVPTKLLNQLPRKYRDERDSDEF
+R ++ RKVKL++ GN++ +++PVPT +L++++ KY++ + + EF
MopCHS
129
IKRGVT-RKVKLTK--GNFI-TEYPVPTPILSATEAKYTA-TSTTEF
Pfam08407
MopCHS
171
THMRYTAVTCDPDDFTVENGYTLRQALYNPPRETELFIVIT<-*
+HMRYTA+TCDPD+F++ NGY+LR+++YN RETEL+I++T
SHMRYTAATCDPDEFSEANGYSLRTKMYN--RETELLIAVT
170
209
B
Figura 21: Domínios conservados da sintase da quitina de M. perniciosa nos bancos de dados:
e-62
e-25
e-22
pfam01644, com Valor-E 2 , pfam08407 com valor-E 7 , COG1215 com Valor-E 2
e
e-19
pfam03142 com Valor-E 4 .
Tabela 06: Alinhamento com pontuação de alta significância do provável produto gênico (sintase da
quitina) de M. perniciosa contra a base de dados do Pfam.
Modelo
Pfam08407
Pfam03142
Pfam01644
Alinhamento
MopCHS
Pfam
129-209
180-739
211-382
1-88
1-548
1-168
Valor-E
Descrição
3.2e-42
5.5e-06
8.3e-93
Sintase da quitina N-terminal l
Sintase da quitina l
Sintase da quitina l
Nº de
representantes
alinhados
41
10
14
O resultado do BLAST das seqüências de proteína com valor-E igual a 0,0 e
identidade igual ou superior a 50% foi utilizado para análise filogenética pelos
métodos de distância, de parcimônia máxima, de verossimilhança máxima e
inferência bayesiana, além de uma última análise na qual foi feito o consenso de
maioria dos resultados dos quatro métodos supracitados (Figuras 22, 23, 24 e
25/Tabela 07). A filogenia das seqüências da sintase da quitina dos fungos citados,
utilizando tanto a análise de parcimônia como a bayesiana, mostraram a separação
dos grupos Basidiomycota e Ascomycota, com medidas de suporte confiáveis,
independente do tipo de análise realizada.
65
A análise de Parcimônia, utilizando seqüências de nucleotídeos, apresentou
índice de consistência (CI) igual a 0,6198, índice de retenção (RI) igual a 0,7256 e
índice de homoplasia (HI) igual a 0,3802. Para a analise de distância utilizou-se
seqüências de nucleotídeos, apresentou índice de consistência (CI) igual a 0,6160,
índice de retenção (RI) igual a 0,7211 e índice de homoplasia (HI) igual a 0,3840.
A proximidade filogenética entre A. bisborus e M. perniciosa foi confirmada
pela semelhança entre seus respectivos genes de sintase da quitina, a qual
facilitou a identificação de regiões conservadas.
66
T.borchii
P. graminis2
P. graminis
1.00
U. maydis
C.neoformans3
0.96
1.00
C.neoformans
0.64
0.62
C.neoformans2
C.cinerea
P.ostreatus
C.cinerea2
0.98
0.98
0.96
0.98
0.98
A.nidulans
N. fischeri2
1.00
1.00
A.niger2
A.oryzae
1.00
1.00
M.perniciosa
A.bisporus
A.niger
1.00
A.terreus
1.00
A.oryzae2
A.clavatus
N. fischeri2
A.fumigatus
0.99
0.99
0.99
0.98 A.fumigatus2
0.97 A.fumigatus3
E.dermatides
B.fuckeliana
M.grisea
1.00
C.globosum
N.crassa
1.00
1.00
N.crassa2
1.00
1.00 N.crassa3
1.00
0.98
G.graminicola
G.zeae
1.00
B.fuckeliana2
1.00
1.00
1.00
0.70
G.zeae2
F.oxysporum
0.58
A.nudulans2
1.00 E.nudulans
P. chrysogenum
A.clavatus2
N.fischeri3
A.fumigatus4
A.fumigatus5
0.98
A.fumigatus6
A.oryzae3
A.niger3
1.00
1.00
A.terreus2
A.capsulatus
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
C.posadasii
1.00 C.immitis
Figura 22: Método de inferência bayesiana. A identificação completa dos fungos utilizados está
descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores
percentuais de probabilidade posterior.
67
T.borchii
Tub
bor
Glo gra
G.graminicola
0.56
Gib zea
G.zeae
Mag gri
M.grisea
0.95
Cha glo
C.globosum
0.90
Neu cra
N.crassa
0.95
0.90
N.crassa2
Neu
cra 2
1.00
N.crassa3
Neu cra 3
0.68
Bot fuc 2
B.fuckeliana2
G.zeae2
Gib
zea 2
0.80
1.00
0.99
Fus oxy
F.oxysporum
E.dermatides
Exo der
B.fuckeliana
Bot fuc
P.
Penchrysogenum
chr
Asp nig 3
A.niger3
1.00
Asp ter 2
A.terreus2
Asp ory 3
A.oryzae3
0.53
0.98
Asp cla 2
A.clavatus2
N.fischeri3
Neo fis 3
0.86
1.00
1.00
Asp fum 4
0.80 A.fumigatus4
0.98 Asp fum 5
A.fumigatus5
0.83
Asp
A.fumigatus6
fum 6
0.74
Asp nid 2
A.nudulans2
1.00
1.00 E.nidulans
Eme nid
1.00
Aje cap
A.capsulatus
C.posadasii
Coc
pos
1.00 Coc
imi
C.immitis
A.terreus
Asp ter
A.oryzae2
Asp ory 2
0.99
A.oryzae
Asp ory
0.54
0.64
A.niger
Asp nig
A.clavatus
Asp cla
N.
Neofischeri
fis
1.00
Asp fum 2
A.fumigatus2
1.00
Asp fum
1.00 A.fumigatus
0.99
1.00
Asp fum 3
A.fumigatus3
A.nidulans
Asp nid
1.00
1.00
Neofischeri2
fis 2
N.
A.niger2
Asp nig 2
P.
Pucgraminis2
gra 2
P.
Pucgraminis
gra
C.cinerea
Cop cin
1.00
P.ostreatus
Ple ost
C.cinerea2
Cop
cin 2
0.99
0.99
1.00
M.perniciosa
Mon per
0.90
0.99
0.97
A.bisporus
Aga bis
U.
Ust maydis
may
0.99
Cry neo 2
C.neoformans2
Cry neo
1.00 C.neoformans
1.00
Cry neo 3
C.neoformans3
10
Figura 23: Método de distância. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na
tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de
bootstrap.
68
T.borchii
Tub bor
B.fuckeliana
Bot fuc
G.graminicola
Glo gra
M.grisea
Mag gri
0.99
Cha
glo
C.globosum
0.84
Neu cra
N.crassa
0.99
Neu cra 2
N.crassa2
1.00
1.00 Neu
cra 3
N.crassa3
G.zeae
Gib zea
0.57
B.fuckeliana2
Bot fuc 2
0.65
G.zeae2
Gib zea 2
F.oxysporum
Fus oxy
0.83
1.00
E.dermatides
Exo
der
P.
Penchrysogenum
chr
1.00
0.52
Asp nig 3
A.niger3
A.terreus2
Asp ter 2
A.oryzae3
Asp ory 3
Asp
cla 2
A.clavatus2
1.00
0.50
Neo
fis 3
N.fischeri3
0.95
1.00
0.72
Asp fum 4
1.00 A.fumigatus4
A.fumigatus5
fum 5
0.98 Asp
A.fumigatus6
Asp
fum 6
Asp nid 2
A.nudulans2
0.91
1.00 E.nidulans
Eme nid
Aje
cap
A.capsulatus
1.00
Coc
pos
C.posadasii
1.00 C.immitis
Coc imi
P.
Puc graminis2
gra 2
P.
Puc graminis
gra
1.00
U.
maydis
Ust may
C.cinerea
Cop cin
P.ostreatus
Ple ost
0.65
0.98
0.70
C.cinerea2
Cop cin 2
M.perniciosa
Mon per
0.99
0.89
0.70
0.58
A.bisporus
Aga bis
C.neoformans3
Cry neo 3
1.00
Cry
neo
C.neoformans
Cry neo 2
C.neoformans2
0.82
A.terreus
Asp ter
A.oryzae2
Asp ory 2
A.oryzae
Asp ory
0.55
0.90
1.00
A.niger
Asp nig
Asp cla
A.clavatus
N.fischeri
Neo fis
0.99
Asp fum
A.fumigatus
1.00
Asp fum 2
0.99 A.fumigatus2
0.70
1.00
A.fumigatus3
Asp fum 3
1.00
0.94
10
Asp nid
A.nidulans
N.fischeri
2
Neo fis 2
A.niger2
Asp nig 2
Figura 24: Máxima Verossimilhança. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na
tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de
bootstrap.
69
T.borchii
Tub bor
Bot fuc
B.fuckeliana
Glo gra
G.graminicola
M.grisea
Mag gri
Cha
glo
C.globosum
Neu cra
N.crassa
0.99
N.crassa2
Neu cra 2
1.00
0.83
0.55
1.00
1.00 N.crassa3
Neu cra 3
Gib zea
G.zeae
B.fuckeliana2
Bot fuc 2
0.66
Gib zea 2
G.zeae2
Fus oxy
F.oxysporum
0.80
1.00
1.00
0.99
E.dermatides
Exo der
P.
Pen chrysogenum
chr
A.niger3
Asp ory 3
0.99
A.terreus2
Asp nig 3
A.oryzae3
Asp ter 2
A.clavatus2
Asp cla 2
0.52
N.fischeri3
Neo fis 3
0.95
Asp fum 4
0.99 1.00 A.fumigatus4
Asp fum 5
0.99 A.fumigatus5
Asp fum 6
A.fumigatus6
Asp nid 2
A.nudulans2
0.91
1.00 Eme
E.nidulans
nid
Aje cap
A.capsulatus
1.00
1.00
Coc pos
C.posadasii
1.00 C.immitis
Coc imi
P.
graminis2
Puc gra 2
P. graminis
Puc gra
1.00
Ust may
U.
maydis
C.cinerea
Cop cin
P.ostreatus
Ple ost
0.62
0.99
0.66
0.99
0.66
0.90
0.59
C.cinerea2
Cop cin 2
M.perniciosa
Mon per
A.bisporus
Aga bis
Cry neo 3
C.neoformans3
Cry neo
1.00 C.neoformans
Cry neo 2
C.neoformans2
A.terreus
Asp ter
A.oryzae2
Asp ory 2
A.oryzae
0.51
Asp
ory
A.niger
Asp
nig
0.91
0.98
A.clavatus
Asp cla
0.82
Neo fis
N.fischeri
1.00
0.97
A.fumigatus
Asp fum
0.99
fum 2
A.fumigatus2
0.71 Asp
A.fumigatus3
Asp fum 3
A.nidulans
Asp
nid
10
N.fischeri2
A.niger2
Asp nig 2
Neo fis 2
1.00
0.93
Figura 25: Método da Parcimônia. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na
tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de
bootstrap.
70
Tub bor
T.borchii
A.nidulans
Asp nid
N.
fischeri2
Neo
fis 2
0.75
0.75
A.niger2
Asp nig 2
Asp nig
A.niger
0.75
1.00
A.oryzae
Asp ory
A.oryzae2
0.75
Asp ory 2
0.75
A.terreus
Asp ter
0.75
A.clavatus
Asp cla
N.
fischeri
Neo
fis
0.75
A.fumigatus
Asp fum
0.75
A.fumigatus2
Asp fum 2
0.75
0.50
A.fumigatus3
Asp fum 3
Exo der
E.dermatides
P.chrysogenum
Pen chr
A.oryzae3
Asp ory 3
A.clavatus2
Asp cla 2
0.75
0.75
N.fischeri3
Neo fis 3
0.75
A.fumigatus4
Asp fum 4
0.50
0.75
A.fumigatus5
Asp fum 6
0.75
0.50
A.fumigatus6
0.75
Asp fum 5
0.50
A.terreus2
Asp ter 2
0.75
A.niger3
Asp nig 3
Eme
nid
E.nidulans
0.75
0.75
A.nudulans2
Asp nid 2
0.75
A.capsulatus
Aje cap
C.posadasii
Coc pos
0.75
0.75
C.immitis
Coc imi
B.fuckeliana
Bot fuc
Glo gra
G.graminicola
M.grisea
Mag gri
0.50
0.50
C.globosum
Cha glo
0.75
N.crassa
Neu cra
0.75
0.50
N.crassa3
Neu cra 3
0.75
0.75
N.crassa2
0.75
Neu cra 2
G.zeae
Gib zea
B.fuckeliana2
Bot fuc 2
0.50
G.zeae2
Gib zea 2
0.75
F.oxysporum
0.75
Fus oxy
P.
graminis2
Puc
gra 2
P.
graminis
Puc
gra
0.75
Ust may
U.maydis
C.cinerea
Cop cin
0.75
P.ostreatus
Ple ost
0.75
0.75
C.cinerea2
Cop cin 2
0.75
M.perniciosa
Mon
per
0.75
0.75
A.bisporus
Aga bis
0.75
C.neoformans3
Cry neo 3
C.neoformans
Cry neo
0.75
0.50
Cry neo 2
C.neoformans2
1
Figura 26: Consenso de maioria dos quatro diferentes métodos. A identificação completa dos fungos
utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem aos valores
percentuais de ocorrência dos grupos formados nos quatro diferentes métodos.
71
TABELA 07: Seqüências de sintase da quitina (CHS) de Basidiomycota e Ascomycota com valor esperado (E) = 0,0 e identidade = ou > que 50%.
Espécie
ID
Agaricus bisporus
(A. bisporus)
Ajellomyces capsulatus
(A. capsulatus)
Aspergillus clavatus NRRL 1
(A. clavatus)
Aspergillus clavatus NRRL 1
(A. clavatus2)
Aspergillus fumigatus
(A. fumigatus)
Aspergillus fumigatus Af293
(A. fumigatus2)
Aspergillus fumigatus
(A. fumigatus3)
Aspergillus fumigatus
(A. fumigatus4)
Aspergillus fumigatus
(A. fumigatus5)
gi|8919410|emb|CAB96110.1|
Provável enzima sintase da quitina
gb|ABQ88371.1|
Sintase da quitina 2
gi|121719536|XP_001276467.1
gi|119404665|gb|EAW15041.1| Sintase quitina C
gi|121706256|XP_001271391.1
gi|119399537|gb|EAW09965.1| Sintase quitina G
gi|1523778|CAA63929.1
Sintase quitina C
gi|70985514|XP_748263.1
gi|66845891|gb|EAL86225.1| Sintase quitina C
gi|83301407|Q92197
Sintase quitina C (Classe-III)
gi|1353638|AAB07679.1
Sintase quitina G (classE III)
gi|1197187|CAA63928.1
Sintase quitina G
gi|70998925|XP_754184.1
gi|6166003|sp|P54267| gi|1353636|gb|AAB07678.1|
gi|66851821|gb|EAL92146.1| Sintase quitina G (Classe III)
gi|67528338|XP_661971.1
gi|40741338|gb|EAA60528.1| Proteína hipotética AN4367.2
gi|67524131|XP_660127.1 gi|40745472|gb|EAA64628.1|
Sintase quitina B
gi|145247670|ref|XP_001396084.1
Proteína hipotética An12g10380
gi|134058200|emb|CAK38392.1|
gi|145235725|XP_001390511.1
Proteína hipotética An03g06360
gi|145242142|XP_001393717.1
gi|134078262|emb|CAK96843.1 Proteína hipotética
gi|83769560|BAE59695.1
Produto de proteína não nomeado
gi|134080824|emb|CAK41385.1|gi|19071963|BAB85683.1
Proteína hipotética An12g10380
gi|13641436|AAK31732.1
gi|83772151|dbj|BAE62281.1 Sintase quitina
Aspergillus fumigatus Af293
(A. fumigatus6)
Aspergillus nidulans FGSC A4
(A. nidulans)
Aspergillus nidulans FGSC A4
(A. nidulans2)
Aspergillus niger
(A. niger)
Aspergillus niger
(A. niger2)
Aspergillus niger
(A. niger3)
Aspergillus oryzae
(A. oryzae)
Aspergillus oryzae
(A. oryzae2)
Aspergillus oryzae
(A. oryzae3)
Proteína
(aa)
cDNA
(nt)
Cobertura
Seqüênciaalvo (query)
(%)
Cobertura
Seqüência
do Banco
(subject)
Score
(bits)
Ident
(%)
Simil.
(%)
Gaps
(%)
909
2730
99
98
1733
79
86
2
905
2715
99
96
1031
51
67
8
896
2688
88
88
976
54
70
4
911
2733
89
91
995
53
68
7
889
2667
87
91
967
53
67
6
856
2568
83
97
957
52
66
5
893
2679
89
91
983
53
68
5
911
2733
89
95
987
51
66
6
911
2733
89
95
990
51
66
6
911
2733
89
95
993
51
66
6
905
2715
85
87
916
53
67
6
916
2748
98
95
1007
51
65
9
884
2652
88
90
815
52
68
4
873
2619
90
92
974
53
68
5
914
2742
98
95
992
50
64
9
876
2628
86
89
931
54
68
4
893
2679
86
99
952
49
63
7
916
2748
97
94
970
50
64
9
72
Aspergillus terreus NIH2624
(A. terreus)
Aspergillus terreus NIH2624
(A. terreus2)
Botryotinia fuckeliana
(B. fuckeliana)
Botryotinia fuckeliana
(B. fuckeliana2)
Chaetomium globosum CBS
148.51
(C. globosum)
Coccidioides immitis RS
(C. immitis)
Coccidioides posadasii
(C. posadasii)
Coprinopsis cinerea okayama
7#130
(C. cinerea)
Coprinopsis cinerea okayama
7#130
(C. cinerea2)
Cryptococcus neoformans var.
neoformans B-3501ª
(Filobasidiella neoformans)
(C. neoformans)
Cryptococcus neoformans var.
neoformans JEC21
(C. neoformans2)
(Cryptococcus neoformans var.
neoformans JEC21
(Filobasidiella neoformans )
(C. neoformans3)
Emericella nidulans
(E. nidulans)
Exophiala dermatitidis
(E. dermatidis)
Fusarium oxysporum f. sp.
Lycopersici
(F. oxysporum)
Gibberella zeae PH-1
(G. zeae)
Gibberella zeae PH-1
(G. zeae2)
Glomerella graminicola
gi|114190488|gb|EAU32188.1|
Sintase quitina C
gi|115390352|XP_001212681.1
gi|114195077|gb|EAU36777.1| Sintase da quitina G
gi|20162483|AAM14606.1 |
Sintase da quitina classe III
gi|22212820|AAM94406.1
Sintase quitina classe III
896
2688
86
90
938
52
66
7
915
2745
99
95
1007
51
66
8
911
2733
89
90
1008
54
68
6
904
2712
87
90
882
49
65
7
906
2718
87
88
967
53
68
6
903
2709
99
96
1039
52
66
7
755
2265
99
96
1039
64
75
7
gi|116504282|gb|EAU87177.1|
Proteína hipotética CC1G_05866
864
2595
89
95
1240
64
76
6
gi|116501858|gb|EAU84753.1| Proteína hipotética
CC1G_00272
824
2475
92
100
1535
76
85
2
gi|134112149|ref|XP_775263.1|
gi|50257918|gb|EAL20616.1| Proteína hipotética CNBE3240
901
2706
86
90
1232
64
75
6
gi|58267452|XP_570882.1
755
2265
81
99
1168
64
75
7
gi|71064312|gb|AAW43575.2|
Sintase da quitina 7
931
2796
98
99
1239
58
70
8
916
2748
98
95
1008
51
65
9
885
2655
84
85
1016
57
71
6
978
2934
89
83
907
52
67
5
905
2715
85
85
924
53
68
4
995
2985
85
77
889
53
68
4
912
2736
97
96
996
51
65
8
gi|88184893|gb|EAQ92361.1| gi|116179936|XP_001219817.1
Sintase quitina 1
gi|119191199|XP_001246206.1| gi|90304992|gb|EAS34623.1
Sintase da quitina G
gi|10436182|AAG16851.1
Sintase da quitina classe III
gi|1091875|prf||2022175B | gi|6166002|Q00757
gi|465391|dbj|BAA04807.1 gi|1732431|dbj|BAA11845.1
Sintase da B (Classe-III)
gi|3582755|gb|AAC35278.1|gi|6165999|P30602
Sintase da quitina 3 (Classe-III)
gi|50429187|AAT77183.1
Sintase quitina class III
gi|46137201|XP_390292.1
Proteína hipotética FG10116.1
gi|46115152|XP_383594.1
Proteína hipotética FG03418.1
gi|19068024|AAL23718.1
73
(G. gramminicola)
Magnaporthe grisea 70-15
(M. grisea)
Neosartorya fischeri NRRL 181
(N. fischeri)
Neosartorya fischeri NRRL 181
(N. fischeri2)
Neosartorya fischeri NRRL 181
(N. fischeri3)
Neurospora crassa
(N. crassa)
Neurospora crassa 80
(N. crassa2)
Neurospora crassa OR74A
(N. crassa3)
Penicillium chrysogenum
(P. chrysogenum)
Pleurotus ostreatus
(P. ostreatus)
Puccinia graminis f. sp. tritici
(P. graminis)
Puccinia graminis f. sp. tritici
(P. graminis2)
Tuber borchii
(T. borchii)
Ustilago maydis
(U. maydis)
Sintase quitina B
gi|145613215|XP_363876.2
gi|145020341|gb|EDK04470.1 Sintase quitina 2
gi|119499407|XP_001266461.1
gi|119414625|gb|EAW24564.1| Sintase quitina C
gi|119474341|XP_001259046.1|
gi|119407199|gb|EAW17149.1|
Sintase quitina
gi|119490296|XP_001263020.1
gi|119411180|gb|EAW21123.1| Sintase quitina G
gi|67476617|P29070
gi|18376397|emb|CAD21286 Sintase quitina 1 (Classe-III).
gi|168773|AAA33568.1
gi|228519|prf||1805248A Sintase quitina: ISOTYPE=1
gi|85102490|XP_961338.1|gi|28922882|gb|EAA32102.1
Sintase quitina 3
gi|6166424|AAF04828.1
Sintase quitina classe III
gi|118420983|dbj|BAF37219.1|
gi|119224834|dbj|BAF41224.1| Sintase da quitina
gi|81296277|gb|ABB70408.1|
Sintase da quitina hipotética classe III
gi|81296279|gb|ABB70409.1|
Sintase da quitina hipotética classeIII
gi|14275780|CAC39621.1 |
Sintase da quitina classe III
gi|122065152|sp|P30598|CHS1_USTMA Sintase quitina 1
(Chitin-UDP acetil-glicosaminiltransferase 1)
929
2787
94
93
979
51
66
7
856
2568
83
89
962
56
70
3
788
2364
86
99
966
54
69
4
911
2733
89
95
993
51
66
6
917
2751
88
88
964962
53
68
5
960
2880
80
87
920
53
68
4
960
2880
83
79
948
55
70
4
915
2745
97
94
989
50
65
9
938
2817
100
100
1472
67
76
7
868
2607
90
93
1160
60
73
6
977
2934
97
99
1027
50
63
13
892
2676
89
90
1025
55
69
6
939
2820
97
95
1217
58
71
7
1 - O cDNA inclui o códon de terminação (tamanho da proteína x 3) +3.
2 - O gDNA inclui o códon de terminação.
3 - Cálculo do percentual da cobertura da seqüência: (posição final – posição inicial do alinhamento) +1 ⁄ tamanho original da seqüência (obs. Somar com
uma unidade corresponde a fórmula matemática do cálculo de intervalos). Obs: arrendondamento quando igual ou superior a metade de uma unidade (0,5).
4 - Em azul estão identificados os Basidiomycota e em preto os Ascomycota.
74
5.2. Resultados em Química Computacional
Após a determinação da seqüência de nucleotídeos e posterior tradução para
aminoácido, optou-se por selecionar apenas uma região para a construção da
estrutura 3D (Figura 27). Esta decisão justifica-se pela dificuldade em modelar
proteínas de membrana celular, descrita em literatura (SALI, SANCHEZ, 1998) e
pela ausência de moldes que contemplassem todo o gene descrito. A escolha da
região a ser modelada considerou o fato desta ser uma região de grande
similaridade com o gene de outros fungos como, por exemplo, dos Basidiomycota
com seqüências completas da sintase da quitina e, principalmente, pela presença
do motif QRRRW, provável região do sítio catalítico do produto gênico em estudo.
Sendo assim, a região escolhida compõe-se por 281 resíduos, estando eles na
posição 325-606 da provável sintase da quitina de M. perniciosa. Uma análise
realizada pelo EditSeq/Lasrgene (BURLAND, 2000) mostrou que o fragmento
apresenta uma massa molecular de cerca de 32,08 KDa. Dos aminoácidos que o
compõem, 31 são básicos (Lys, Arg), 22 ácidos (Asp, Glu), 118 hidrofóbicos (Ala,
Ile, Leu, Phe, Trp, Val) e 63 polares (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr).
Para
esta
região
foi
feito
o
PSI-BLAST
contra
o
PDB
(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) para buscar estruturas que pudessem
servir de molde para a construção do modelo proposto. A ferramenta de busca de
moldes disponível no Swiss PDB Viewer (SPDBV) (versão 3.7) e o BLAST de
proteínas, utilizando a base de dados do PDB, não retornaram resultados
satisfatórios. Por este motivo, a estratégia foi, mais uma vez, fragmentar a
seqüência e, retornar para o BLAST de proteínas contra a base de dados do PDB.
Os fragmentos da seqüência resultaram, para algumas regiões, em diversos
possíveis moldes, sendo escolhido aquele com melhor valor de identidade,
baseado no alinhamento local (Figura 28/Tabela 08).
75
A
1
B
325
606
1
281
913aa
M.perniciosa
A.bisporus
C.cinerea
C.neoformans
U.maydis
P.ostreatus
P.graminis
P.graminis2
VGVYQDGVMKKQVDGKDTVAHIFE-YTTQLSVDATPQLVLP--QANDP-NNLVPVQIIFV
IGVYQDGVMKKQVDGKDTVAHIFE-YTTQLSVDATPQLVLP--RAEDP-NNLVPVQIIFV
VGVYQDGIMKKKVDGKDTVAHIFE-YTTQLSVDDKPQLVLP--QENDDGSNLVPVQIILV
IGVFQDGILKKEVDGKKTAAHIFEQYTTQLSIDATPQLVQP--HPGEP-NNLVPVQIIFV
VGVYQDGVMKRKVDGKDTVAHLFE-YTTQLSVDPTPALIQP--HADDA-SNLVPVQMIFC
VGVYQDGVMKKDVDGKDTVAHIFE-YTTQLSVDAKPQLVLP-TEGNDA-LNLVPVQIIFV
VGVYQDGLMKKEIDGKETVAHIFE-YTTQLSVDHKPSLVVPTQDGDSK-TNLVPVQMIFC
IGLYQDGIMKRQVDGKETQAHVFE-YTTLLSVSPKPELIQP-H-ANDP-ANLVPVQMTLV
:*::***::*:.:***.* **:** *** **:. .* *: *
.
******: :
333
328
291
301
376
351
306
367
M.perniciosa
A.bisporus
C.cinerea
C.neoformans
U.maydis
P.ostreatus
P.graminis
P.graminis2
LKAKNQKKINSHRWLFNAIGKILNPEVCVLIDAGTKPGHKSIFYLWKAFYNDPHLGGCCG
LKAQNQKKINSHRWLFNAIGRMLNPEICVLIDAGTKPGHKSIYYLWEAFYNDPHLGGCCG
VKAKNQKKINSHRWLFNALGRQLNPEICVLIDAGTKPGYKAIYHLWEAFYNNENLGGCAG
LKQENSKKINSHRWLFNALGRQLQPEICVLLDAGTKPGHKAIYHLWEAFYNNRNLGGACG
LKQKNSKKINSHRWLFNALGRHLQPELCVLIDAGTKPGHKSLYYLWEAFYNNANLGGACG
LKAKNQKKINSHRWLFNAIGRMLEPETCVLIDAGTKPGHKSIYYLWEAFYNDRNMGGCCG
LKQKNSKKINSHRWLFNAIGRQLDPEVCILIDAGTKPGKRSLYYLWQAFHNDRNLGGACG
LKQKNAKKINSHRWLFNAVAAHLEPEVCILIDAGTKPGTRSLYYLWEAFHHNPHMGGACG
:* :* ************:. *:** *:*:******* :::::
*..*
393
388
351
361
436
411
366
427
M.perniciosa
A.bisporus
C.cinerea
C.neoformans
U.maydis
P.ostreatus
P.graminis
P.graminis2
EIHAMIKGGKKLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAILGRP
EIHAMIKGGKKLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRFQAITGCP
EIYAM--GGKRLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPFESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAIQGRP
EIHAMIKKGVKLFNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYKAIQGRP
EIHAMIKNGRKLINPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESTFGYVSVLPGAFSAYRFRAIQGRP
EIHAMIKGGKKLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAILGKP
ETYAMLKGGKKLINPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESAFGYVSVLPGAFSAYRFRALSGRP
EIHAMLSRGKKLINPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAILGRP
* :**
* :*:********************:**:***************::*: * *
453
448
409
421
496
471
426
487
M.perniciosa
A.bisporus
C.cinerea
C.neoformans
U.maydis
P.ostreatus
P.graminis
P.graminis2
LEQYFHGDHSLADRLGPKRYYGNEHLHQEHVLAEDRILCFELVAKKNDRWTLTYVKPSKA
LEQYFHGDHSLADRLGPKGIYGMNIFTKNMFLAEDRILCFELVAKAKDRWTLTYVKPSKA
LEQYFHGDHSLADRLGEHGINGMSIFQKNMFLAEDRILCFELMAKRGEKWTLGYVKDSKA
LTQYFHGDATLAARLGKKGIYGMGIFTKNMFLAEDRILCFELVAKKGEKWVLQYVKPSKA
LQQYFHGDHTLADRLGKKGLHGMDIFTKNMFLAEDRILCFELVAKAGDKWTLTYVKPSKG
LEQYFHGDHSLADRLGAKGIHGMSIFTKNMFLAEDRILCFELVAKAGDRWTLTYVKPSKA
LQQYFHGDHTLADRLGKKGLNGMGIFTKNMFLAEDRILCFELAAKANDAWLLSYVRAAKG
LQQYFHGDHSLSERLGKKGIQGMGIFKKNMFLAEDRILCFELVAKAKSRWVLGYVKPAKG
* ****** :*: *** :
*
: :: .*********** ** . * * **: :*.
513
508
469
481
556
531
486
547
M.perniciosa
A.bisporus
C.cinerea
C.neoformans
U.maydis
P.ostreatus
P.graminis
P.graminis2
ETDVPESAPELIGQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKLYQSGHGIFRMFFFHVQALYNIFSL
ETDVPESAAELIGQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKLYRSGHGIIRMFFLHIQGLYNVFSL
ETDVPETAPELIGQRRRWLNGSFAASIYALVHFWRVYQSGHNFVRIFFFHIQALFNAFNL
ETDVPEQAAELISQRRRWLNGSFAASVYSVFHFFRLYRSGHGPIRMLFLHIQAIYNVFSL
ETDVPEGAAELISQRRRWLNGSFAASIYSLVHFFRIYKSNHGIIRLFFLHIQALYNAIVL
ETDVPESAAELIGQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKIYKSGHGIIRLFFLHLQALYNSFSL
ETDVPEQAAELISQRRRWLNGSFAASIYATIHFFRFYKSSHNPIRLLMFHVQALFNIFQL
ETDVPEQAAELIGQRRRWLNGSFAAGIYSLAHFSRMYSSSHGIVRMFFLHVQAFYATAGL
****** ..***.************.:*: :* .* *.*. .*::::*:*.::
*
573
568
529
541
616
591
546
607
M.perniciosa
A.bisporus
C.cinerea
C.neoformans
U.maydis
P.ostreatus
P.graminis
P.graminis2
VFSWFSLANIWLTFSIIIDLLPNL--------------------PGDTAIIVFGTKAVTH
IFSWFALANMWLTFSIIIDLVPSQ------------------------GIVIFGTETVTH
FFSWFALANLWLTFSIIIDLLPAN--------------------------IKGANLVFFH
IFSWFALANLWLTFSIIIELLPE-----------------------SANINLFGTADVTH
LFSWFALANLWLTFSIIIEFLPDEL-------LKNS---------------SHTTLVVFH
FFTWFALANLWLTFSIIIDLLPSQG-------VVIISRAFVRLAPSDVNWADFGS-LQAH
IFTWFSLANLWLTFSIIIELLPQN------------------------GVFLFKDEVITH
IMSWFALGNWFTTFSAIIDIIAENWRDPFLAAGISN--YTLTPPP-SPPNSSEGAQALVA
.::**:*.* : **: **:::.
613
604
563
578
654
643
582
664
Figura 27: A - Esquema representativo do gene da sintase da quitina de M. perniciosa, a porção em
vermelho corresponde à região conservada utilizada na construção da estrutura tridimensional; B:
Alinhamento da seqüência da sintase da quitina de M. perniciosa com A. bisporus (CAB96110.1), C.
cinerea (EAU87177.1), , C. neoformans (EAL20616.1), U. maydis (sp|P30598) P. ostreatus
(BAF37219.1) e P. graminis (ABB70408.1 e ABB70409.1 ), com destaque para a região
conservada. Os aminoácidos em vermelho correspondem àqueles utilizados no modelo proposto
(Fonte: NOTRADAME et al., 2000 <http://www.tcoffee.org>).
76
Achs1
pdb|2D4W|B
Cadeia B, Estrutura Cristal da Glicerol quinase
de Cellulomonas sp. Nt3060
Extensão = 504
Identitidade = 12/27 (44%), Positividade = 16/27 (59%), Gaps = 0/27 (0%)
Query
110
Sbjct
110
VSVLPGAFSAYRYRAILGRPLEQYFHG
V L G
A +Y++I+G PL YF G
VDELGGDEGAEKYKSIVGLPLATYFSG
136
136
Achs2
pdb|2BYT|D
Cadeia D, Thermus thermophilus Leucyl-tRNA
Synthetase Complexed With A Trnaleu Transcript
Length=878
Identities = 13/33 (39%), Positives = 20/33 (52%), Gaps = 0/38 (0%)
Query
6
Sbjct
260
VLAEDRILCFELVAKKNDRWTLTYVKPSKAETD
VLA + L EL A +
L YV+ +K +T+
VLAPEHPLTLELAAPEKREEVLAYVEAAKRKTE
38
292
Achs3
pdb|1Z3X|A
Cadeia A, Estructura de Gun4-1 de
Thermosynechococcus elongatus
Length=238
Identidade = 8/13 (61%), Positividade = 9/13 (69%), Gaps = 3/13 (23%)
Query
7
Sbjct
126
Achs4
pdb|2HY5|A
Length=130
ELIG---QRRRWL
EL G
Q+RRWL
ELAGPLAQKRRWL
16
138
Cadeia A, Estructura Cristal de Dsrefh
Identidade = 8/13 (61%), Positividade = 11/13 (84%), Gaps = 0/13 (0%)
Query
10
Sbjct
29
QSGHGIFRMFFFH
+ GH IFR+FF+H
EKGHEIFRVFFYH
22
41
Figura 28: PSI-BLAST contra o banco de dados do PDB, mostrando o alinhamento dos fragmentos
com os moldes das estruturas correspondentes.
77
Tabela 08: Identificação dos moldes utilizados para construção do modelo 3D da sintase da quitina
de M. perniciosa.
Fragmento
Achs1
Achs2
Achs3
Achs4
Molde
Identidade
Estrutura
2D4W
44
Transferase
39
Sintetase
61
Ativador de transferase
61
Transferase
(IMADA, et al., 2005)
2BYT
(TUKALO, et al., 2005)
1Z3X
(DAVISON, et al., 2005)
2HY5
(SHIN, et al., 2006)
(Fonte: Resultado experimental – PSI-BLAST/PDB)
Em resposta à submissão dos projetos (seqüências problemas alinhadas
estruturalmente aos seus respectivos moldes) ao Swiss Model, obtém-se o
resultado finalizado da modelagem por homologia (Figura 29) (GUEX et al., 2001).
Foi necessária a construção de quatro estruturas que contemplaram diferentes
extensões de toda a região conservada (Figura 30).
A
C
B
D
Figura 29: Resultado da submissão dos projetos dos fragmentos com os moldes da estrutura
correspondentes. A – achs1; B – achs2; C – achs3 e D – achs4. (Fonte: Swiss PDB Viewer 3.7).
78
Os modelos foram construídos pelas ferramentas do Swiss PDB Viewer e
foram validados inicialmentepelo Procheck 3.0, o qual gerou o gráfico de
Ramachandran apresentado na Figura 31 e Tabela 09. Nos parâmetros do
Ramachandran, considera-se um modelo satisfatório quando este possui 90% dos
resíduos
dentro
representação
de
das
regiões
favoráveis
Ramachandran
é
o
(LASKOWSKI
melhor
et
al.,
1994).
A
indicativo
da
qualidade
estereoquímica do modelo de uma proteína (LASKOWSKI, et al., 1993).
Posteriormente utilizou-se o BioMedCache 6.1, para construiu as ligações
peptídicas, formando uma única proteína onde a seqüência primária foi respeitada.
Em seguida, a molécula foi neutralizada pelo programa tLEaP, presente no pacote
Amber 8.0, sendo adicionados 09 íons cloretos (Cl-) a estrutura. Após a construção
partiu-se para determinação do valor de cutoff através do BiomedCache 6.0, onde
foi calculado valores de 3 a 20 Å . Os resultados obtidos apontaram o cutoff 14 com
sendo o valor ideal para posteriores cálculos da estrutura resultante.
O modelo inicial da região conservada da sintase da quitina de M.
perniciosa, denominado de 0CSM, é composto por 281 aminoácidos, formados por
4.571 átomos, unidos por 4.630 ligações químicas. Em análise realizada pelo VDM
(Versão 1.8.6), com um cutoff padronizado para 3,2 Ǻ, o modelo possui 03 ligações
salinas (Asp-100-Arg206; Asp192-Lys94 e Glu158-Arg143), que são elementos que
influenciam positivamente em sua estabilidade.
Em sua extensão, este modelo apresenta 10 α-hélices, 11 folhas-β e 22
turns. As α-hélices são as estruturas mais facilmente reconhecidas e ocorre devido
à semelhança nos ângulos de torção dos carbonos-α (Figura 32). Nas α-hélices do
modelo 3D gerado ocorrem 03 prolinas (Pro62, Pro114 e Pro186) em diferentes
hélices. De acordo com Höltje et al., (2003) o aminoácido prolina normalmente não
ocorre nas α-hélices devido a sua incompatibilidade estrutural (forma cíclica com
presença de nitrogênio), mas pode aparecer nas proteínas transmembranares,
como é o caso da sintase da quitina. A presença da prolina pode gerar distorções
locais na geometria da hélice.
79
A
B
C
D
E
Figura 30: Modelos construídos a partir das seqüências fragmentadas. Em A: Estrutura resultante
da submissão do fragmento achs1 com o molde 2D4W; B: fragmento achs2 com o molde 2BYT; C:
fragmento achs3 com o molde 1Z3X; D: fragmento achs4 com o molde 2HY5 e E: modelo 0CSM,
resultante da junção dos modelos iniciais gerados no Swiss Model, sem refinamento, para a região
conservada da sintase da quitina (Fonte: VMD 1.8.6, HUMPHREY et al., 1996).
80
A
B
C
D
Figura 31: Validação representada pelo gráfico de Ramachandran (Procheck 3.0) dos fragmentos
que compõem o modelo 3D da região conservada da sintase da quitina. Em A - fragmento achs1; B
- fragmento achs2; C: fragmento achs3 e D: fragmento achs4.
Tabela 09: Sumário dos gráficos de Ramachandran para os fragmentos que compõem o modelo 3D
da região conservada da sintase da quitina.
Posição dos resíduos (%)
Fragmento
A - achs1
B - achs2
C - achs3
D - achs4
Favorável
87,8
84,6
89,5
93,0
Permitido
9,6
15,4
5,3
5,3
Aceitável
2,6
0,0
0,0
1,8
Desfavorável
0,0
0,0
5,3 *
0,0
*Representa a apenas 01 aminoácido (Glu7, correspondente ao Glu199 do modelo integral).
81
Sete folhas-β paralelas e 4 antiparalelas podem ser encontradas no modelo
proposto. Em geral, as folhas paralelas (4 ou mais) são mais comuns que as
antiparalelas (2 a 3) (HÖLTJE et al., 2003). Este também é um outro tipo estrutural
facilmente reconhecido e é parte de um sistema mais complexo, pois, ao contrário
das α-hélices, neste arranjo as ligações de hidrogênio não são estabelecidas de
forma intramolecular, mas sim, intermolecular, o que faz com que elas sejam
energeticamente menos favoráveis. As folhas antiparalelas podem ser compostas
por várias cadeias que podem se distribuir por várias partes da seqüência,
podendo ser composto por aminoácidos hidrofílicos, como os resíduos Asn14,
Gln15, Ser20, Gly29 e Thr44, ou hidrofóbicos, (Val9, Phe8, Ala12, Ile18, e Leu32),
que compõe o modelo proposto (HÖLTJE et al., 2003).
Neste modelo têm-se ainda turns, que são as estruturas que revertem a
direção da cadeia do polipeptídio e podem conectar as folhas-β. Um terço dos
resíduos de uma proteína geralmente estão envolvidos com a formação de turns,
que são predominantemente constituídos por aminoácidos polares com cargas,
como os resíduos Glu70, His72, Lys101, Asp192 e Arg234 (SIBANDA,
THORNTON, 1985) deste modelo.
A
B
Figura 32: Destaque para as α-hélices (A) e folhas-β (B) que compõem o modelo proposto.
A qualidade geométrica do modelo 0CSM foi avaliada pelo programa
Procheck (Versão 3.0), como pode ser observado nas figuras 33-36 e,
adicionalmente, pelo software ANOLEA, disponível no Swiss Model. O gráfico de
82
Ramachandran (Figura 33A) tem 93,5% dos resíduos na região favorável e 6,5%
em área desfavorável, o que significa apenas um resíduo (Glu199). De forma
semelhante, o Procheck analisa separadamente os resíduos de glicina e prolina,
conforme é mostrado pelas figuras 33B e 33C, respectivamente. Esta separação é
necessária, pois estes aminoácidos apresentam diferenças estereoquímicas, e isso
requer diferentes características em suas regiões favoráveis ou desfavoráveis
(LASKOWSKI et al., 1993). A figura 36 (A –Q) mostra a qualidade estereoquímicas
dos ângulos de torção da cadeia lateral de todos os aminoácidos. A figura 35 avalia
a qualidade do gráfico de Ramachandran obtido, planaridade das ligações
peptídicas, má interação entre os átomos não-ligados e energia de ligação de
hidrogênio na cadeia principal. Nestas representações o desejado é que o modelo
em estudo, representado pelo ponto em preto, atinja o núcleo da região sombreada
(LASKOWSKI et al., 1994).
83
A
B
C
Figura 33: Gráfico de Ramachandran (Procheck 3.0) do modelo 0CSM da região conservada da
sintase da quitina. Em A: Ramachandran da estrutura; B: Ramachandran da Glicina e C:
Ramachandran da Prolina, onde se pode notar, em destaque vermelho para os resíduos em região
desfavorável (Fonte: Procheck 3.0).
84
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
Figura 34: De A até N - Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos. Os números de resíduos são
mostrados entre parênteses, e a coloração vermelha representa o resíduo que está com o ângulos
desfavoráveis; as regiões sombreadas representam a áreas favoráveis (Fonte: Procheck 3.0).
85
A
C
B
D
E
Figura 35: Analise da cadeia principal do modelo 0CSM: A - avaliação do gráfico de Ramachandran;
B - planaridade da ligação peptídica; C - interações ruins entre os átomos não-ligados; D - distorção
dos angulos tetraedricos dos carbonos alfa; E - energia das ligações de hidrogênio.O eixo das
coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
86
A
B
C
D
E
Figura 36: Análise da cadeia lateral do modelo 0CSM da região conservada da sintase da quitina: A
- Conformação gauche menos; B - Conformação trans; C - Conformação gauche mais; D Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E - Conformação trans para o ângulo torcional
Chi2. O eixo das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
87
Em todas as validações citadas obteve-se um resultado satisfatório para o
modelo inicial proposto. No entanto, a análise de energia obtida através da
representação do gráfico de ANOLEA (MELO, FEYTMANS, 1998), que calcula o
desempenho de cada residuo da cadeia de proteína apresentou um resultado
insatisfatório para uma maioria, como pode ser observado no gráfico da figura 37.
Por esta análise apenas os resíduos Pro3 (-5,803), Val4 (-17,803), Gln5 (-23,381),
Ile6 (-24.101), Ile7 (-19.781), Phe8 (-11,351), Val9 (-8,798), Leu10 (-6,707), Lys11
(-4,274), Ala12 (-5,642), Lys13 (-8,093), Asn14 (-3,671), Gln15 (-1,145), Lys16 (5,567), Lys17 (-4,084), Ile18 (-3,045), Asn18 (-5,611), Ser20 (-4,692) Ile28 (-2.793),
Gly29 (-7.187) Lys30 (-8.932), Ile31 (-8.574), Leu32 (-5.811), Asn33 (-3.815),
Met74 (-8.124), Ile75 (-9.170), Lys76 (-15.529), Gly77 (-12.857), Gly78 (-7.355)
Lys79 (-2.072), Arg128 (-1.980), Pro129 (-1.987), Leu130 (-2.345) apresentaram
um valor de energia negativo, sendo que a maior parte deles (80,43%) obteve um
valor positivo e, portanto, insatisfatório. Esta validação apresentou um valor total de
energia de 16910,907 E/kT. A energia do gráfico do ANOLEA é dada pela razão
entre a energia (E) e a constante de Boltzmann (k = 0,582 kcal/mol) pela
temperatura (MELO, FEYTMANS, 1998).
Figura 37: Gráfico do ANOLEA (energia potencial de cada átomo na cadeia de proteína). As
projeções em vermelho referem-se a um valor positivo de energia potencial para cada resíduo, e as
projeções em verde identificam os valores de energia que são satisfatórios, ou seja, os valores
negativos (Fonte: Swiss Model).
88
A estratégia para melhorar a qualidade da estrutura 3D e torná-la
energeticamente mais favorável cosistiu em submeter o modelo gerado à dinâmica
molecular. O processo foi desenvolvido em dois diferentes campos de força, o
MM3 que foi realizado no BioMedCache e o ff99, no Amber, sendo que esse
processo utilizou os seguintes parâmetros: i) imin=1, realiza a otimização da
estrutura; ii) maxcyc=600, número máximo de ciclos; iii) ncyc=300, números de
ciclos necessários para a mudança de Steeptest Descent para Gradiente
Conjugado; iv) cut=14, valor de cutoff; v) ntb=0, manter volume constante; vi)
igb=0, não incluir modelo de solvatação. Ao fim do processo foram obtidos 08
modelos que estão sumarizados na tabela 10. No BioMedCache seguiu-se um
protocolo que consiste em submeter a molécula a uma dinâmica seriada, levandose em conta o número de α-hélices presentes no modelo. Para o cálculo de
dinâmica de cada hélice, a molécula de menor energia de superfície gerada
durante a dinâmica foi utilizada no passo seguinte. Alguns dos gráficos gerados
pela dinâmica molecular realizada no Amber e no BioMedCache 6.1 podem ser
visualizados, respectivamente nas Figuras 38 e 39.
Tabela 10: Sumário dos modelos gerados para a região conservada do gene da sintase da quitina
destacando o resultado da validação representada pelo gráfico de Ramachandran realizada pelo
Procheck 3.0
Software
utilizado
Modelo
AMBER 8.0 e
BioMedCache 6.1
Posição dos
resíduos (%)
Metodologia
Aplicada
Favorável
Não
favorável
0csm
93,5
6,5
Modelo inicial gerado por homologia
neutralizado
BioMedCache 6.1
csc1
86,5
13,5
Após a DM + Otimização travada
BioMedCache 6.1
csc2
86,6
13,4
Após a DM + Otimização “relaxada”
AMBER 8.0
1csm
96,3
3,7
Modelo otimizado por 800 ciclos/300 K
AMBER 8.0
2csm
91,0
9,0
Dinâmica Molecular 300 ps/300 K
AMBER 8.0
3csm
94,1
5,9
Modelo gerado por homologia
Dinâmica Molecular 1000 ps/300 K
AMBER 8.0
4csm
94,5
5,5
Modelo gerado por homologia
Dinâmica Molecular 2000 ps/300 K
AMBER 8.0
5csm
92,3
7,7
Modelo gerado por homologia
Dinâmica Molecular 3000 ps/300 K
89
Como pode ser observado pela figura 38 e 39, o valor de rms, determinado
sempre em relação à estrutura de partida, torna-se praticamente constante. Na
figura 39, após atingir 600 x (103) Kcal/mol não há variação significativa em sua
geometria, atingindo uma estrutura de equilíbrio.
A
B
C
D
Figura 38: Mapas gerados pela dinâmica realizada pelo BioMedCache 6.1. Os pontos em cinza
indicam a posição das moléculas de menor energia. Em A: Dinâmica Molecular realizada para a
Hélice h3; B: Dinâmica Molecular realizada para a Hélice h4, C: Dinâmica Molecular realizada para
a Hélice h5 e D: Dinâmica Molecular realizada A Hélice h6.
Nesta figura, pode ser observado que a cada simulação a proteína assume
uma conformação de menor energia na SPE, a qual é indicado por um ponto nos
gráficos de energia potencial pelo tempo. As simulações iniciais, mostradas através
das figuras 38 A e B, possuem estruturas com alto valor de energia, sendo
mostrado pelas cores verde, amarelo e vermelho. No entanto, durante as
simulações seguintes, figuras 38C e D, a proteína atinge o seu equilíbrio
termodinâmico, não havendo variações nos valores da energia potencial (cor azul).
90
600
500
400
300
200
100
485.40
462.40
439.40
416.40
393.40
370.40
347.40
324.40
301.40
278.40
255.40
232.40
209.40
186.40
163.40
140.40
117.40
94.40
71.40
48.40
25.40
0
2.40
Energia Relativa (101000 Kcal/mol)
700
Figura 39: Mapa gerado pela dinâmica molecular de 200 ps realizada pelo Amber 8.0.
Os modelos resultantes das dinâmicas realizadas pelo campo de força MM3
apresentaram incongruências na posição de alguns resíduos demonstrados pela
validação do Procheck e também do ANOLEA. No entanto, os modelos gerados
pela dinâmica molecular (300, 1000, 2000 e 3000 picossegundos) no campo de
força ff99 do Amber resultaram em um melhor arranjo espacial da cadeia principal
na representação de Ramachandran (91,0, 94,1, 94,5 e 92,3%, respectivamente), e
mesmo tendo havido uma redução da qualidade dos parâmetros da cadeia
principal, pode-se perceber um um aumento da qualidade do modelo nas cadeias
laterais. Considerando a análise feita no ANOLEA, obteve-se uma melhor energia
total (-1006,215 /kT) para o modelo submetido à dinâmica do Amber com 2000 ps,
denominado 4CSM, como pode ser visualizado na figura 40, sendo que, neste
modelo, apenas 14,84% dos resíduos (Tabela 11) apresentaram uma energia
positiva.
91
A
B
C
D
E
F
G
Figura 40: Representação gráfica da validação dos modelos do gene da sintase da quitina após a
realização da dinâmica molecular. A e B – Modelos CHS-a1 e CHS-a2, submetidos ao campo de
força MM3 (BioMedCache), C, D, E, F e G – Modelos 1csm, 2csm, 3csm, 4csm e 5csm,
respectivamente, resultantes do campo de força ff99 (Amber). Destaque, em vermelho, para o
grafico que a presentou o melhor valor de energia (Fonte: ANOLEA).
92
Tabela 11: Sumário dos resíduos de aminoácidos que apresentaram valor de energia positiva na
análise do ANOLEA gerado para o modelo 4csm.
Identidade
do
Resíduo
Leu1
Val2
Val38
Phe107
Gly108
Tyr109
Val110
Ser111
Ser118
Leu144
Gly145
Pro146
Energia
(E/kT)*
0,000
0,000
0,058
30,186
32,280
34,719
36,003
35,366
0,030
0,365
25,375
27,044
Nº de
contatos
190
66
11
190
113
503
130
128
41
165
87
145
Identidade
do
Resíduo
Lys147
Arg148
Tyr149
Ala173
Asp177
Trp179
Gly231
Ile259
Pro271
Ile280
Val281
Energia
(E/kT)*
25,723
27,123
26,800
0,076
0,169
0,162
4,406
0,252
0,535
0,000
0,000
Nº de
contatos
284
246
184
0
0
44
59
140
285
69
232
*E/kT: E = Energia; kT = Constante de Boltz-mann que corresponde a 0,582 kcal/mol
(MELO, FEYTMANS, 1998).
Comparando os métodos utilizados para o refinamento do modelo, podemos
observar que a qualidade dos modelos gerados pelo Amber foram melhores do que
os modelos obtidos pelo MM3. Isto pode ser explicado por dois fatos. Primeiro, o
Amber é executado utilizando sempre dois arquivos (topológicos e coordenadas)
como inputs, tornando assim os cálculos mais eficientes por incluir maiores
informações sobre a proteína. Segundo, os termos de parametrização no campo de
força e da equação podem estar influenciando de forma intrínseca ao sistema
(CASE, et al., 2004). Assim, o Amber foi capaz de gerar um modelo a qual foi
capaz em satisfazer as exigências de duas metodologias de validação distintas,
Procheck e ANOLEA.
Após o refinamento do modelo, pôde-se chegar a uma estrutura protéica
cuja energia potencial de -1498,6502 Kcal/mol pelo Amber. De acordo com o
gráfico de Ramachandran (Figura 41), 94,5% dos resíduos encontram-se em
regiões energeticamente favoráveis. Na validação da cadeia principal e da cadeia
lateral, verificados pelo Procheck (Figura 42 e 43), nota-se que o modelo
submetido ao refinamento e a dinâmica molecular, 4csm, possui uma melhor
qualidade em relação ao modelo 0csm (Figuras 33-36), e também foi o que melhor
respondeu às análises do ANOLEA sendo, portanto, o modelo 3D proposto para o
estudo da região do provável sítio catalítico sintase da quitina de M. perniciosa.
93
A
B
C
Figura 41: Gráfico de Ramachandran para o modelo 4csm proposto para a região conservada da
sintase da quitina do M. perniciosa.
94
A
B
C
D
E
Figura 42: Analise da cadeia principal do modelo 4csm: A - avaliação do gráfico de Ramachandran;
B - planaridade da ligação peptídica; C - interações ruins entre os átomos não-ligados; D - distorção
dos angulos tetraedricos dos carbonos alfa; E - energia das ligações de hidrogênio.O eixo das
coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
95
A
B
C
D
E
Figura 43: Análise da cadeia lateral do modelo 4CSM da região conservada da sintase da quitina: A
- Conformação gauche menos; B - Conformação trans; C - Conformação gauche mais; D Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E - Conformação trans para o ângulo torcional
Chi2. O eixo das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
96
Após a DM, em análise realizada pelo VDM (Versão 1.8.6), com um cutoff
padronizado para 3,2 Ǻ, o modelo possui que inicialmente apresentou apenas 3
pontes salinas, passou a presentar 16 ligações salinas (Glu153-Arg121; Asp177Lys174; Asp41-Arg204; Asp100-Arg206; Glu195-Lys94; Glu170-Arg128; Glu35Arg206; Glu158-Arg143; Glu104-Arg148; Glu35-Lys45; Asp164-Lys79; Glu35Lys11; Asp100-Lys80; Asp100-Lys11; Asp192-Lys49 e Glu163-Lys79). A região
descrita como provável sítio catalítico foi construída a partir do molde 1Z3X. Este
sítio compreende os resíduos 190-194. Os aminoácidos 190-192 e 193-194
assumem uma conformação α–hélice e turn, respectivamente. Como pode ser
observado
pela
figura
43A,
estas
estruturas
secundárias
localizam-se
essencialmente em uma região mais externa da proteína, ou seja, estão expostos
ao solvente. A figura 43B mostra detalhes do arranjo espacial do sítio ativo, o qual
as cadeias laterais dos aminoácidos Arg191, Arg193 e Trp194 estão direcionados
para a parte externa da proteína, enquanto que nos aminoácidos Gln190 e Arg192
estas estão direcionados para o interior. Neste ambiente enzimático, o ligante pode
complexar-se com os nitrogênios protonados das argininas 191 e 193 através de
ligação de hidrogênio. Adicionalmente o ligante pode realizar uma interação com o
Trp194, através de uma outra ligação de hidrogênio e/ou com uma interação
hidrofóbica. Com isso, têm-se indicações para o design de ligantes inibidores da
sintase da quitina. A figura 43C mostra em destaque as estruturas secundárias
presentes na proteína resultante.
97
A
B
C
Figura 44: Modelo 4CSM final. A - Destaque para a região do provável domínio catalítico do gene
da sintase da quitina do Moniliophthora perniciosa; B - Região do provável domínio catalítico em
destaque e C – Representação tridimensional do modelo 4CSM (Amber) gerado pelo VMD 1.8.6. Os
hidrogênios dos átomos de carbono foram suprimidos para uma melhor visualização.
98
6. CONCLUSÃO
As análises das seqüências do banco de dados do Projeto Genoma, a
amplificação dos fragmentos alvo por PCR, que atenderam aos tamanhos
esperados e cobriram os intervalos existentes, e o posterior seqüenciamento
completo por primer walking, indicam que um gene da sintase da quitina de M.
perniciosa foi totalmente identificado e caracterizado.
Este gene compreende 3443 pb, organizado em 14 éxons e 13 íntrons,
compreendendo um cDNA com uma fase de leitura aberta com 2739 pb e
codificando uma proteína com 913 aa.
O produto gênico obtido apresenta extensas regiões conservadas e
significativa similaridade com as seqüências das sintases da quitina de outros
Basidomycota (principalmente) e Ascomycota, com a ocorrência de motifs que o
caracterizam como pertencente à Classe III e Divisão 1 das sintases da quitina,
assim como a maioria das sintases da quitina de fungos.
De posse da seqüência primária da sintase da quitina, foi construído um
modelo 3D da sintase da quitina (0csm) por modelagem comparativa. Esta foi
submetida a diferentes processos de refinamento, usando dois métodos MM bem
distintos, gerando 06 modelos finais. Estes foram respectivamente validados sendo
o modelo denominado de 4csm, obtido a partir do Amber, o que apresentou os
melhores resultados frente ao Procheck e ANOLEA, embora a identidade entre a
seqüência problema e os moldes tenha sido inferior à 30%. Isso também mostra
que a intervenção humana é melhor sucedida para a construção de modelos
protéicos do que os processos automatizados por homologia.
Como perspectivas futuras, sugerem-se: (i) a identificação do número de
cópias do gene por Southern Blot, (ii) o isolamento e clonagem do cDNA deste
gene, (iii) expressão heteróloga, purificação e caracterização da proteína
recombinante e (iv) a seleção e teste de inibidores específicos da sintase da quitina
de M. perniciosa in vitro e in vivo.
A continuação destes estudos, in silico e experimentalmente, é uma
estratégia essencial para desenvolvimento de inibidores específicos para o
fitopatógeno do cacau. O modelo 3D proposto, não somente possui um sítio ativo
bem definido, mas também outros elementos que compõe o ambiente protéico e
pode ser utilizado em posteriores estudos de interação ligante-receptor por
99
metodologias
de docking,
QM/MM e
considerando o efeito do solvente.
simulações
Car-Parrinello,
inclusive
100
7. REFERÊNCIAS
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112
Apêndices
113
Apêndice I
>Provável protéina da sintase da quitina de Moniliophthora perniciosa com
913 aa
MANRPPLPSNASSSTVNDPYADPFADRPRQTHFTEPQHPYPSQASIPRPFESATSLPQEFGARDQQFEEDDYVE
KQPLTGGQAFAGGFYPPGPVDPEAYGDPYAGSRPASVVSSSTGGEKSAWRRRQTIKRGVTRKVKLTKGNFITEY
PVPTPILSATEAKYTATSTTEFSHMRYTAATCDPDEFSEANGYSLRTKMYNRETELLIAVTSYNEDKTLYARTL
HGVMLNIRDICKTKQSKYWRRQAEEGNPGWQKITVALIVDGLEPMDKSVLDILATVGVYQDGVMKKQVDGKDTV
AHIFEYTTQLSVDATPQLVLPQANDPNNLVPVQIIFVLKAKNQKKINSHRWLFNAIGKILNPEVCVLIDAGTKP
GHKSIFYLWKAFYNDPHLGGCCGEIHAMIKGGKKLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAY
RYRAILGRPLEQYFHGDHSLADRLGPKRYYGNEHLHQEHVLAEDRILCFELVAKKNDRWTLTYVKPSKAETDVP
ESAPELIGQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKLYQSGHGIFRMFFFHVQALYNIFSLVFSWFSLANIWLTFSIIID
LLPNLPGDTAIIVFGTKAVTHWVNFGFKWIYLAFLALQFVLALGNRPKGERAAYTVTLWVYAILALYLLVVYAI
LALYLLVCSFWLTIQAFQNIPKLVQANGGDAIKTLFQGPVGALIAAMFSTYGIYIIASFLYRDPWHMFSSFFQY
LLLAPSFTNVLNVYAFCNLHDVSWGTKGSDKAEALPSVSSSKAKDADVAVVEDTAKVQEDVDAAFKETVTRAVT
KIETKEEIEKPTMDDQNKTFRTRLVAFWMLSNASLAVAISNLNGLPSSNPAQDEKDLADKQSTYFNIILYSTFG
LAFVRFIGCLWYFFKRNLFRCCRRN
>Provável cDNA da sintase da quitina de Moniliophthora perniciosa 2739 pb
(gDNA = 3440 + códon de terminação, 14 exons, 13 introns)
ATGGCGAATCGCCCGCCACTCCCTTCAAATGCTTCTAGCTCTACAGTCAATGATCCTTATGCAGACCCGTTTGC
AGACCGTCCTCGGCAGACCCACTTTACTGAACCCCAGCACCCTTATCCTTCACAAGCCAGCATTCCTCGTCCTT
TCGAGAGCGCGACTTCTCTGCCGCAGGAGTTTGGAGCACGGGACCAGCAGTTCGAAGAAGATGACTACGTAGAA
AAGCAACCGTTGACAGGCGGACAAGCGTTCGCTGGCGGGTTCTATCCACCAGGTCCTGTTGATCCTGAGGCCTA
TGGCGATCCTTATGCTGGGAGTCGCCCTGCTTCCGTCGTGTCATCGTCGACAGGCGGTGAAAAAAGTGCATGGC
GACGACGACAGACCATCAAGCGTGGTGTTACCCGCAAGGTCAAACTGACCAAGGGCAACTTCATCACCGAGTAT
CCAGTCCCTACACCTATTCTCAGCGCGACAGAAGCCAAATATACTGCCACGTCCACAACCGAGTTTTCGCATAT
GCGATACACAGCTGCAACATGCGATCCGGATGAATTTTCAGAGGCCAACGGTTACTCACTGCGAACAAAGATGT
ACAACCGTGAGACCGAGCTTCTTATTGCCGTTACGTCATACAACGAAGACAAGACGCTCTACGCCCGTACTCTG
CATGGCGTCATGCTGAACATTCGTGACATTTGCAAGACAAAGCAATCCAAATACTGGCGTCGACAGGCCGAGGA
AGGCAATCCAGGGTGGCAAAAGATCACCGTTGCGTTGATTGTAGATGGACTTGAACCAATGGACAAGAGTGTAC
TGGATATCCTGGCCACCGTGGGCGTATACCAGGACGGCGTCATGAAGAAGCAAGTCGATGGAAAAGACACCGTC
GCCCATATTTTCGAGTACACCACTCAATTATCAGTGGATGCCACTCCTCAACTGGTGCTTCCTCAGGCCAACGA
TCCAAACAACCTGGTTCCTGTTCAAATCATTTTTGTCTTGAAGGCTAAGAATCAGAAGAAGATCAACTCCCACC
GTTGGTTGTTCAACGCCATCGGCAAGATTCTCAACCCCGAAGTTTGTGTCTTGATTGATGCGGGTACGAAGCCC
GGCCACAAATCAATCTTCTACCTCTGGAAGGCTTTCTATAATGACCCTCACCTCGGTGGTTGCTGTGGTGAAAT
TCATGCCATGATCAAGGGTGGAAAGAAGCTTCTGAATCCATTGGTTGCCGCTCAAAATTTTGAGTACAAGATGT
CCAATATCTTGGACAAACCTCTGGAAAGTAGTTTCGGCTACGTCTCTGTGTTACCTGGTGCTTTCTCAGCGTAC
CGTTATCGTGCCATCCTCGGACGTCCATtGGAGCAATATttCCATGGGGATCATTCGTTGGCAGACCGGCTCGG
ACCCAAAAGGTATTACGGAAATGAACATCTTCACCAAGAACATGTCTTGGCCGAAGATCGTATTCTGTGCTTCG
AGCTGGTGGCAAAGAAGAATGATAGATGGACGCTGACATACGTGAAACCAAGTAAAGCAGAAACGGATGTGCCA
GAATCTGCCCCCGAATTAATCGGTCAGCGTCGTCGTTGGTTGAACGGTTCTTTCGCTGCCTCAGTGTACGCTCT
GGTCAATTTCTTCAAACTCTACCAATCTGGCCATGGCATTTTCCGCATGTTCTTCTTCCATGTTCAGGCTTTAT
ACAACATCTTTTCGCTGGTCTTCTCTTGGTTTTCTCTTGCCAACATCTGGTTGACATTTAGTATCATCATCGAC
TTGCTTCCCAACCTGCCCGGTGATACTGCCATTATAGTGTTTGGCACAAAGGCAGTTACACACTGGGTCAACTT
TGGTTTCAAATGGATCTACCTGGCTTTCCTTGCTTTACAATTCGTCCTCGCCCTCGGGAACCGGCCGAAAGGTG
AACGTGCAGCATACACGGTTACTTTATGGGTATATGCCATACTCGCTCTTTACTTGCTTGTTGTATATGCCATA
CTCGCTCTTTACTTGCTTGTTTGCTCTTTCTGGCTTACCATTCAAGCCTTTCAGAACATACCCAAACTGGTCCA
GGCAAACGGTGGCGATGCAATCAAGACGCTCTTCCAAGGACCAGTGGGAGCTTTGATCGCAGCCATGTTTTCGA
CTTATGGTATCTATATCATCGCTTCCTTCCTCTACCGTGATCCTTGGCACATGTTCTCGAGTTTCTTCCAATAT
CTCTTGTTGGCGCCCAGCTTCACCAATGTACTCAACGTCTATGCGTTCTGCAATCTCCACGATGTCTCGTGGGG
TACGAAAGGTAGCGATAAAGCCGAAGCACTACCTTCAGTGTCATCTTCCAAAGCAAAAGACGCTGATGTGGCTG
TTGTCGAGGATACCGCAAAGGTCCAAGAGGATGTTGACGCTGCATTCAAGGAAACCGTCACAAGAGCCGTCACC
AAAATCGAAACCAAGGAGGAAATTGAAAAGCCTACGATGGACGACCAGAACAAGACATTCCGTACTCGTCTCGT
CGCGTTCTGGATGTTGTCCAATGCATCGCTTGCCGTTGCTATTTCAAACTTGAATGGTCTGCCTAGTTCAAACC
CTGCCCAAGACGAAAAAGACTTGGCCGACAAGCAGAGCACATATTTCAACATCATCTTGTATTCAACATTTGGT
CTTGCTTTCGTTCGTTTCATTGGATGTCTCTGGTACTTCTTCAAGCGCAACCTCTTCAGATGTTGCAGACGGAA
CTAA
114
>Provável gDNA da sintase da quitina de Moniliophthora perniciosa 3440 +
códon de terminação, 14 exons (1-275; 329-565; 621-1011; 1064-1231; 12871485; 1541-1890; 1947-2027; 2081-2212; 2265-2383; 2435-2634; 2695-2723;
2775-2876; 2928-3332 e 3390-3440) e 13 íntrons (276-328; 566-620; 10121063; 1232-1286; 1486-1540; 1891-1946; 2028-2080; 2213-2264; 2384-2434;
2635-2694; 2724-2774; 2877-2927; 3333-3389).
ATGGCGAATCGCCCGCCACTCCCTTCAAATGCTTCTAGCTCTACAGTCAATGATCCTTATGCAGACCCGTTTGC
AGACCGTCCTCGGCAGACCCACTTTACTGAACCCCAGCACCCTTATCCTTCACAAGCCAGCATTCCTCGTCCTT
TCGAGAGCGCGACTTCTCTGCCGCAGGAGTTTGGAGCACGGGACCAGCAGTTCGAAGAAGATGACTACGTAGAA
AAGCAACCGTTGACAGGCGGACAAGCGTTCGCTGGCGGGTTCTATCCACCAGGGTGAGCTCTTTTTTTCAGTTA
TACGTGTTTTATCAGCTCACCTTTGACCTCAGTCCTGTTGATCCTGAGGCCTATGGCGATCCTTATGCTGGGAG
TCGCCCTGCTTCCGTCGTGTCATCGTCGACAGGCGGTGAAAAAAGTGCATGGCGACGACGACAGACCATCAAGC
GTGGTGTTACCCGCAAGGTCAAACTGACCAAGGGCAACTTCATCACCGAGTATCCAGTCCCTACACCTATTCTC
AGCGCGACAGAAGCCAAATATACTGCCACGTCCACAACCGAGTTTTCGTAAGTCCAACTGTCAATCGATCATGT
TCTTTTCTTTCTCATTACCCTTGGCCAGGCATATGCGATACACAGCTGCAACATGCGATCCGGATGAATTTTCA
GAGGCCAACGGTTACTCACTGCGAACAAAGATGTACAACCGTGAGACCGAGCTTCTTATTGCCGTTACGTCATA
CAACGAAGACAAGACGCTCTACGCCCGTACTCTGCATGGCGTCATGCTGAACATTCGTGACATTTGCAAGACAA
AGCAATCCAAATACTGGCGTCGACAGGCCGAGGAAGGCAATCCAGGGTGGCAAAAGATCACCGTTGCGTTGATT
GTAGATGGACTTGAACCAATGGACAAGAGTGTACTGGATATCCTGGCCACCGTGGGCGTATACCAGGACGGCGT
CATGAAGAAGCAAGTCGATGGAAAAGACACCGTCGCCCATATTTTCGAGGTTTGTACAAGAGTAATCGTGGCCA
AGTTTACAATACTTATTCTACCTATAGTACACCACTCAATTATCAGTGGATGCCACTCCTCAACTGGTGCTTCC
TCAGGCCAACGATCCAAACAACCTGGTTCCTGTTCAAATCATTTTTGTCTTGAAGGCTAAGAATCAGAAGAAGA
TCAACTCCCACCGTTGGTTGTTCAACGCCATCGGCAAGATTCTCAACGTAAGCTTGTTTCTTCGTTGCTATCTG
TATACGTGTCTTGATTCGGTATCATCAGCCCGAAGTTTGTGTCTTGATTGATGCGGGTACGAAGCCCGGCCACA
AATCAATCTTCTACCTCTGGAAGGCTTTCTATAATGACCCTCACCTCGGTGGTTGCTGTGGTGAAATTCATGCC
ATGATCAAGGGTGGAAAGAAGCTTCTGAATCCATTGGTTGCCGCTCAAAATTTTGAGTACAAGATGTCCAATAT
CTTGGGTAAGTTGCACCACTACCACATTGTGTTTGTTCACTCATTCCGTCATCACCACAGACAAACCTCTGGAA
AGTAGTTTCGGCTACGTCTCTGTGTTACCTGGTGCTTTCTCAGCGTACCGTTATCGTGCCATCCTCGGACGTCC
ATtGGAGCAATATttCCATGGGGATCATTCGTTGGCAGACCGGCTCGGACCCAAAAGGTATTACGGAAATGAAC
ATCTTCACCAAGAACATGTCTTGGCCGAAGATCGTATTCTGTGCTTCGAGCTGGTGGCAAAGAAGAATGATAGA
TGGACGCTGACATACGTGAAACCAAGTAAAGCAGAAACGGATGTGCCAGAATCTGCCCCCGAATTAATCGGTCA
GCGTCGTCGTTGGTTGAACGGTTCTTTCGCTGCCTCAGTGGTAAGTTTCCGTGTTTGTCTTTATAATGAGTTGC
TGTAATCAAGATGGCTTTCTAGTACGCTCTGGTCAATTTCTTCAAACTCTACCAATCTGGCCATGGCATTTTCC
GCATGTTCTTCTTCCATGTTCAGGCTTTAGTAAGTCGCATCTTATTCTACTTTCTGATCATAGATATTCATGCT
GTCTCCAGTACAACATCTTTTCGCTGGTCTTCTCTTGGTTTTCTCTTGCCAACATCTGGTTGACATTTAGTATC
ATCATCGACTTGCTTCCCAACCTGCCCGGTGATACTGCCATTATAGTGTTTGGCACAAAGGCAGTTGTAAGTGC
TATGCGTTCGCGATTGACAGGACGAAATTGAAAGCGTCTTCTAGACACACTGGGTCAACTTTGGTTTCAAATGG
ATCTACCTGGCTTTCCTTGCTTTACAATTCGTCCTCGCCCTCGGGAACCGGCCGAAAGGTGAACGTGCAGCATA
CACGGTTACTTTATGGTGCGACACACTATAGCTACGTGGATCGAGCTAACATTAATCATGGAATAGGGTATATG
CCATACTCGCTCTTTACTTGCTTGTTGTATATGCCATACTCGCTCTTTACTTGCTTGTTTGCTCTTTCTGGCTT
ACCATTCAAGCCTTTCAGAACATACCCAAACTGGTCCAGGCAAACGGTGGCGATGCAATCAAGACGCTCTTCCA
AGGACCAGTGGGAGCTTTGATCGCAGCCATGTTTTCGACTTATGGTGAGCCTTTCAGGTTCTTGGCTTGCTGTC
TGGTTGGGCTAACCTGTGAACAACACTTAGGTATCTATATCATCGCTTCCTTCCTCTACGTACGTTGCAGACCT
GCGCTTGATGACTACCGTATTCACCGTTGCCTCTAGCGTGATCCTTGGCACATGTTCTCGAGTTTCTTCCAATA
TCTCTTGTTGGCGCCCAGCTTCACCAATGTACTCAACGTCTATGCGTTCTGCAATCTCCACGATGTACGTATAT
GTGTATCTTTTACATTTAAGGTTCTAAGAGCCCTTTCCTAGGTCTCGTGGGGTACGAAAGGTAGCGATAAAGCC
GAAGCACTACCTTCAGTGTCATCTTCCAAAGCAAAAGACGCTGATGTGGCTGTTGTCGAGGATACCGCAAAGGT
CCAAGAGGATGTTGACGCTGCATTCAAGGAAACCGTCACAAGAGCCGTCACCAAAATCGAAACCAAGGAGGAAA
TTGAAAAGCCTACGATGGACGACCAGAACAAGACATTCCGTACTCGTCTCGTCGCGTTCTGGATGTTGTCCAAT
GCATCGCTTGCCGTTGCTATTTCAAACTTGAATGGTCTGCCTAGTTCAAACCCTGCCCAAGACGAAAAAGACTT
GGCCGACAAGCAGAGCACATATTTCAACATCATCTTGTATTCAACATTTGGTCTTGCTTTCGTTCGTTTCATTG
GAGTACGTTTTATCTACTCGCGTTGTGCAAGGAGTTGATTGACATTACATCCATGACAGTGTCTCTGGTACTTC
TTCAAGCGCAACCTCTTCAGATGTTGCAGACGGAACTAA
115
Seja gentil com a natureza,
Imprima apenas o indispensável.