PCR MULTIPLEX PARA IDENTIFICAÇÃO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
ENTEROTOXIGÊNICOS
Edna Froeder Arcuri1, Gilmara Benevenuto de Paula3, Maria de Fátima Borges2 ,
Fabíola Fonseca Ângelo4, Carla Christine Lange1, José Renaldi Feitosa Brito1
1
Pesquisador(a), Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG; 2Pesquisadora, Embrapa
Agroindústria Tropical, Fortaleza, CE; 3Estagiária Embrapa gado de Leite, Graduanda em
Farmácia Bioquímica, UFJF; 3Estagiária Embrapa Gado de Leite, doutoranda em Ciência
e Tecnologia de Alimentos, UFV. e-mail: [email protected]
Introdução
Staphylococcus aureus é ubíquo na natureza, sendo os humanos e os animais os
seus reservatórios primários. O leite e produtos lácteos são considerados veículos comuns
deste microrganismo, o que representa um problema de saúde pública, pois algumas
estirpes de S. aureus podem produzir um ou mais tipos de enterotoxinas nestes alimentos,
os quais depois de ingeridos poderão causar intoxicação estafilocócica.
As enterotoxinas estafilocócicas são proteínas extracelulares, hidrossolúveis,
resistentes à ação de enzimas proteolíticas do sistema digestivo e termoestáveis, sendo
resistentes à pasteurização. Até o momento, já foram identificados 20 tipos de
enterotoxinas, que são sorologicamente distintas, incluindo os tipos clássicos SEA, SEB,
SEC1, 2, 3, SED e SEE e as novas enterotoxinas SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM,
SEN, SEO, SEP, SEQ, SER, e SEU, cujos genes correspondentes estão descritos na
literatura (Blaiotta et al., 2004; Omoe et al., 2005).
A detecção de enterotoxinas estafilocócicas no sobrenadante de culturas pelos
métodos clássicos de imunodifusão, aglutinação e ELISA é demorado, nem sempre detecta
concentrações baixas de toxinas e estão disponíveis comercialmente apenas kit/antisoros
para SEA, SEB, SEC, SED e SEE. Testes experimentais foram desenvolvidos para algumas
das novas toxinas (SEG, SEH e SEI) devido às dificuldades de purificação e a preparação
dos anticorpos específicos (Cremonesi et al., 2005).
A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem se revelado uma
alternativa rápida, sensível e específica na identificação de patógenos e seus genes de
enterotoxinas (Munson et al., 1998; Rosec e Guiraud, 2002). A identificação de S. aureus
por PCR é baseada na amplificação de um gene-alvo altamente conservado dentro da
espécie, como por exemplo o gene femA (Mehrotra et al., 2000). Vários métodos de PCR
multiplex, que amplificam simultaneamente mais de um gene na mesma reação, têm sido
descritos na literatura para detecção de S. aureus enterotoxigênicos em leite e queijos
(Tamarapu et al., 2001; Rosec e Guiraud, 2002; Najera-Sanchez et al., 2003; Cremonesi et
al., 2005), mas freqüentemente estes métodos não são reprodutíveis, sendo necessário que
cada laboratório padronize suas reações. Neste estudo estabaleceu-se um método de PCR
multiplex para o gene femA, que identifica S. aureus e para os genes de enterotoxinas sea,
seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej e sel, para pesquisa de S. aureus enterotoxigênicos
contaminantes de leite e derivados.
Material e Métodos
Este estudo foi realizado nos laboratórios de Microbiologia do Leite e de Genética
Molecular da Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG. Nove estirpes padrão, com
genótipo conhecido foram utilizadas para padronização das reações PCR: S. aureus ATCC
19095 (sec, seh, seg, sei e sel), S. aureus ATCC 23235 (sed, seg, sei, sej), S. aureus ATCC
13565 (sea), S. aureus ATCC 14458 (seb), S. aureus ATCC 27664 (see), S. aureus 954776B (sea), S. aureus 91-2415D (seb), S. aureus 92-2221 (sed, sej) e S. aureus 95-2806
(seh). Além disso, estirpes de S. intermedius, S. haemolyticus e S. hyicus, pertencentes ao
banco de culturas do Laboratório de Microbiologia do Leite foram utilizadas como
controles negativos.
O DNA celular foi extraído conforme descrito por Hesselbarth e Schwarz (1995)
após cultivo em caldo infusão de cérebro e coração (Difco) com incubação a 35ºC por 18
horas. Para o gene femA, foram utilizados os primers descritos por Mehrotra et al. (2000);
para o gene sel, foram utilizados os primers descritos por Cremonesi et al. (2005) e para os
demais genes (sea a sej) foram utilizados os primers descritos por Rosec e Gigaud (2002).
Cada amplificação foi conduzida em um volume de 50 µl contendo 1X PCR buffer, 2 mM
de cada dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 2,0 U de enzima Ampliteq DNA polimerase, 40 pmol
de cada primer para femA e seb, 20 pmol de cada primer para os demais genes (sea, sec,
sed, see, seg, seh, sei, sej e sel), 100 ng de DNA bacteriano e água bi-destilada para
completar o volume de 50 µl. Foram testadas várias misturas e concentrações dos primers
para os diferentes genes. Todas as amplificações foram conduzidas em termociclador
GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) programado para um ciclo inicial a
94ºC por 3 minutos, seguido de 35 ciclos (desnaturação a 94ºC/30seg. - anelamento a
57ºC/30 seg. - extensão a 72ºC/30seg.), com o término da reação a 72ºC/10 minutos. Os
produtos de PCR foram analisados em gel de agarose a 1,8%, após coloração com brometo
de etídio (0,5µg/ml).
Resultados e Discussão
Para definir as condições da reação de PCR e verificar a especificidade dos primers,
cada par de primers foi testado separadamente usando as estirpes padrão. Na avaliação da
especificidade dos primers para femA foram utilizadas estirpes de outras espécies de
Staphylococcus (S. intermedius, S. hyicus, S. haemolyticus) como controles negativos.
Para cada par de primers foi obtido apenas o produto de PCR de tamanho esperado,
confirmando os dados de suas especificidades relatados por Mehrotra et al. (2000), Rosec e
Gigaud (2002) e Cremonesi et al. (2005). A seguir foram otimizadas as condições da PCR e
concentrações de primers na tentativa de combinar o maior número possível de pares de
primers numa mesma reação, sem afetar a sua eficiência de amplificação. Após várias
tentativas, amplificações eficientes e reproduzíveis foram obtidas com combinações de dois
pares de primers por reação para: 1) sea e sed, 2) seb e sel, 3) sec e see, 4) seg e femA, 5)
seh e sei. Os primers para sej não geraram nenhuma combinação, sendo uma PCR simples.
Estes resultados estão de acordo com outros autores que também tiveram dificuldades em
reproduzir amplificações de vários genes em uma única reação.
Conclusão
Neste estudo foram padronizadas cinco reações de PCR multiplex para identificação
de S. aureus enterotoxigênicos. Estas reações serão utilizadas em estudos futuros de
detecção de estafilococos enterotoxigênicos contaminantes de leite e derivados.
Agradecimentos
À Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG pelo
apoio financeiro (CAG930/04). À Fundação Osvaldo Cruz/INCQS e ao Dr. Jean Philippe
Rosec (Laboratoire Interrégional de la DGCCRF, France) pela doação das estirpes padrão
de Staphylococcus enterotoxigênicos. Ao LABEX França por ter viabilizado a importação
de algumas estirpes padrão.
Referências
1.Blaiotta, G. et al. PCR detection of Staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus
spp. strains isolated from meat and dairy products. Evidence for new variants of seg and sel
in S. aureus AB-08802. J. Applied Microbiol., v.97, p.719-730, 2004.
2. Cremonesi, P. et al. Development of a multiplex PCR assay for the identification of
Staphylococcus aureus enterotoxigenic strains isolated from milk and dairy products. Mol.
Cel. Probes, v.19, p. 299-305, 2005.
3. Hesselbarth, J.; Schwarz, S. Comparative ribotyping of Staphylococcus intermedius from
dog, pigeons, horses and mink. Vet. Microbiol., v.45, p.11-17, 1995.
4. Mehrotra, M. et al. Multiplex PCR for detection of genes for Staphylococcus aureus
enterotoxins, exfoliative toxins, toxic shock syndrome toxin 1, and methicillin resistance.
J. Clin. Microbiol., v.38, n.3. p.1032-1035, 2000.
5. Munson, S. H. M. et al. Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin
type G and I from Staphylococcus aureus. Infect. Immun., v.66, p.3337-3348, 1998.
6. Najera-Sanchez, G. et al. Development of two multiplex Polymerase Chain Reactions for
the detection of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus isolated from food. J.
Food Protec., v.66, p.1055-1062, 2003.
7. Omoe, K. et al. Comprehensive analysis of classical and newly described staphylococcal
superantigenic toxin genes in Staphylococcus aureus isolates. FEMS Microbiol. Lett.,
v.246, p.191-198, 2005.
8. Omoe, K. et al. Detection of seg, seh, and sei genes in Staphylococcus aureus isolates
and determination of the enterotoxin productivities of S. aureus isolates harboring seg, seh,
or sei genes. J. Clin. Microbiol., v.40, n.3, p.857-862, 2002.
9. Rosec, J.P.; Guiraud, O. Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types
detected by PCR in France. Int. J. Food Microbiol., v.77, p.61-70, 2002.
10. Tamarapu, S. et al. Development of a multiplex polymerase chain reaction for detection
and differentiation of Staphylococcus aureus in dairy products. J. Food Prot., v.64, p.664668, 2001.