Departamento de Microbiologia
Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
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Procedimentos básicos em microbiologia: técnicas
assépticas e cultivo de microrganismos
Técnicas assépticas
As técnicas assépticas são instrumentos indispensáveis para o isolamento, cultivo e identificação de
microrganismos. Têm a finalidade de evitar contaminações do meio de cultura ou dos materiais utilizados para determinado procedimento e por microrganismos presentes no meio (ar, água, mãos,
roupas, etc.).
Abaixo tem-se algumas medidas importantes que devem ser observadas pelo manipulador durante a prática de técnicas de crescimento e isolamento de microrganismos, com o fim de preservar
a pureza do cultivo e minimizar os riscos de infecção ou intoxicação para o manipulador e para o
ambiente onde a técnica está sendo realizada.
Zona de esterilidade
As manipulações devem ser feitas dentro de uma
capela microbiológica de fluxo laminar (Figura 1),
que pode ser tanto de fluxo horizontal quanto vertical. O fluxo um ambiente estéril dentro da capela.
Na ausência de uma capela laminar, a manipulação
deve ser feita por trás da chama do bico de gás, de
forma a garantir o estabelecimento de uma zona de
esterilidade. É somente nesta zona estéril, que os
tubos ou recipientes com meios de cultura estéreis
e o material biológico a ser inoculado, deverão ser
abertos ou manipulados. Qualquer outro material
estéril (ex: caixa de ponteiras, seringas, potes contendo microtubos, etc.) utilizado nos procedimentos só pode ser aberto nesta área, para ser preservada a sua esterilidade.
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Figura 1 - Capela de Fluxo Laminar Vertical
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Flambagem
Alças de platina
Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e
depois de qualquer operação de semeadura ou inoculação de microrganismos. Para tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a parte
inferior do cabo deve ser passada na chama 2 a 3 vezes. A posição
correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de
45o em relação à mesa de trabalho (Figura 2). Deve ser utilizado o
cone interno da chama do bico de Bunsen. Para retirar o material,
seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura, esfriar previamente a alça. Deixar esfriar nas proximidades da chama, ou em um
tubo contendo água estéril.
Figura 2 - Posição correta
para a flambagem da alça.
Tubos ou frascos
Toda vez que fizer uma semeadura ou inoculação de microrganismos, utilizando tubos de ensaio,
tubos de rosca ou frascos do tipo Erlenmeyer, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). A tampa deverá ser mantida segura pelo
dedo mínimo da mão. Caso esteja repicando a cultura para outro tubo, o mesmo procedimento
deve ser feito com este outro tubo antes da inoculação dos microrganismos. Incliná-los, sempre,
a aproximadamente 30°. No caso de tubo com ágar inclinado, este deve ficar de preferência na
horizontal. Após a retirada do material com alça ou pipetas, flambar novamente a boca do tubo e
colocar a tampa. Descartar as ponteiras usadas em recipientes, de preferência, contendo soluções
detergentes ou desinfetantes.
Esterilização de materiais
Autoclave
A autoclave é um equipamento eficiente para a esterilização de diversos materiais e meios de
cultura. Consiste no tratamento térmico úmido sob pressão, em geral, a 121°C por quinze minutos. Como exemplos de uso da autoclave têm-se a esterilização de placas de Petri, tubos falcon,
microtubos, ponteiras, meios de cultura líquidos ou contendo ágar, papéis toalha, materiais contaminados, pipetas manuais, etc. No entanto, como medidas de segurança ou para evitar estragos
com os materiais e meios de cultura, alguns cuidados devem ser tomados, como por exemplo:
acomodar bem os materiais e não encher demais a autoclave; deixar sair todo o vapor para então
fechar a válvula de segurança; estar atento à temperatura marcada na autoclave e sempre medir
o tempo transcorrido; assim que desligar a autoclave, esperar a temperatura abaixar para então
abrir a válvula de escape do vapor e, quando todo o vapor sair, a autoclave pode ser aberta e o material que foi esterilizado retirado. A autoclave pode existir de diversos tamanhos e configurações,
dependendo da sua finalidade (Figura 3).
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Figura 3 - modelos de autoclave
Forno de Pasteur
Algumas substâncias e materiais, como instrumentos metálicos, seringas de vidro, vaselinas e
óleos, às vezes não podem ser submetidos ao calor úmido e devem ser esterilizados sob calor
seco. Em geral, são necessárias temperaturas maiores e tempos de exposição mais longos para se
atingir a esterilização do que os empregados na autoclave, uma vez que o poder de penetração do
calor seco é menor que o do calor úmido.
Produtos químicos
Compreende a utilização de produtos do grupo dos aldeídos, glutaraldeídos e formaldeídos. Como
apresentam toxicidade, não são indicados como medida de primeira escolha, no entanto são indispensáveis para a esterilização de materiais termossensíveis, tais como artigos de nylon e teflon,
luvas, tubos de borracha e outros.
Desinfecção e antissepsia
A desinfecção e antissepsia consistem na descontaminação de materiais inertes e tecidos vivos,
respectivamente, por microrganismos em suas formas vegetativas. Para fins de desinfecção e
antissepsia, em geral, faz-se o uso de produtos químicos, Entre estes produtos, são largamente
utilizados o hipoclorito de sódio, álcool etílico a 70%, soluções de iodo e aldeídos.
Cultivo de microrganismos
Os microrganismos podem ser provenientes de diversas fontes naturais ou então serem adquiridos
de culturas previamente armazenadas, podendo estar refrigerados ou liofilizados. O crescimento
destes microrganismos é otimizado quando inoculados em meios de cultura apropriados e mantidos em condições de temperatura, aeração e tempo de crescimento adequados. Caso não se conheça os microrganismos que estão sendo cultivados, como no caso do estudo da microbiota de
determinado local, normalmente eles são isolados e identificados para então poderem ser adquiridas as culturas puras. Inúmeras técnicas de cultivo e isolamento de microrganismos podem ser
empregadas e no presente texto, somente é abordada uma visão superficial dos procedimentos
básicos utilizados para tais fins.
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Condições de incubação
As técnicas empregadas para o isolamento e cultivo de microrganismos dependem da fonte (alimentos, tecidos vivos, água, ar, etc.) e do tipo de
microrganismo que se deseja isolar (enteropatógenos, bactérias lácticas, fungos filamentosos,
leveduras, etc.). Por exemplo, alguns microrganismos crescem somente ou preferencialmente
em condições de anaerobiose e, portanto, após
o repique em meios de cultura adequados, os
tubos ou placas devem ser acondicionados em
câmaras de anaerobiose (Figura 5). Na ausência desta, existem outros equipamentos com o
fim de manter uma atmosfera livre de oxigênio,
como jarras de anaerobiose e envelope plástico
para anaerobiose.
Para os microrganismos aeróbios, a incubação
das placas ou tubos contendo os inóculos é normalmente feita em estufas bacteriológicas (Figura 6). Tanto em condições aeróbias e anaeróbias,
o controle da temperatura é importante para se
obter o crescimento dos microrganismos na taxa
adequada. Enquanto muitos microrganismos
crescem em temperatura ambiente ou até mesmo em condições extremas, outros têm a melhor
taxa de crescimento a 37°C e, assim, devem ser
mantidos em estufas com a temperatura regulada.
Cultivo em tubos contendo meios de cultura líquidos
Tal procedimento é bastante útil, pois possibilita
a rápida e elevada multiplicação de microrganismos. Se o objetivo for o isolamento, os microrganismos podem ser crescidos nos meios de cultura
líquidos adequados, seguido por semeadura
Figura 4 - Câmara de anaerobiose
Figura 5 - Estufa Bacteriológica
em placas. A inoculação de microrganismos em meios de cultura líquidos pode ser feita com o
auxílio de uma alça de platina previamente flambada ou alça descartável esterilizada, caso os microrganismos sejam provenientes de meios sólidos ou semi-sólidos, ou através de uma pipeta, normalmente quando se está fazendo o repique de uma cultura que está armazenada em meio líquido.
Semeadura em placas
Na maioria dos casos, o microrganismo a ser isolado faz parte de uma população mista, sendo
indispensável o seu isolamento no sentido de obtenção de cultura pura. Uma das maneiras de se
obter uma cultura pura consiste no emprego da técnica de semeadura, em que são obtidas colônias
isoladas de microrganismos. As colônias são caracterizadas por suas características morfológicas e,
dependendo do objetivo, são cultivadas separadamente em meios sólidos ou líquidos para a posterior identificação. A técnica de semeadura também pode ser aplicada em determinados estudos
com o objetivo apenas de cultivo ou para quantificar a população microbiana.
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Inoculação por estrias ou esgotamento em placas de ágar
A técnica de semeadura por estrias múltiplas consiste em espalhar o material com o auxílio de uma
alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até
o esgotamento do material, de modo a obter-se
um perfeito isolamento das bactérias existentes
na amostra, que após a incubação, formarão as
colônias isoladas sobre a superfície do ágar. A execução é simples e devem ser tomados alguns cuidados para que realmente consiga o isolamento
das bactérias. Primeiramente, deve-se flambar a
alça de platina (ou então pode-se utilizar alças de
plástico descartáveis previamente esterilizadas) e
introduzi-la no meio contendo as bactérias. Fazer
então o estriamento na superfície do ágar da placa de Petri Após a primeira estria, flambar novamente a alça, girar a placa cerca de 30˚ e puxar
nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais
2 vezes (Figura 5). Lembre-se de que a quantidade de material a ser inoculada deve ser mínima,
sendo que em muitos casos, é necessário diluir o
meio do qual os microrganismos são provenientes; caso contrário, pode haver a justaposição das
colônias e por isso não se pode isolá-las.
Método de “espalhamento” em placa
Consiste em espalhar o material (suspensão bacteriana na maioria das vezes) com o auxílio de um
swab (para obtenção de tapete uniforme) ou alça
de Drigalski (para obtenção de colônias isoladas
após diluição), fazendo a semeadura por toda a
superfície da placa de Petri (Figura 6). Deve-se
ter o cuidado de garantir que toda a superfície da
placa seja semeada, evitando regiões sem semeadura. Recomenda-se que o procedimento de semeadura com o swab seja feito em três direções
distintas, com diferença de 30 graus, e com a alça
em toda a superfície, girando a placa.
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Figura 6 - Semeadura por esgotamento em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias
Figura 7 - Semeadura por esgotamento em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias
Figura 8 - Semeadura em placa por espalhamento utilizando alça de Drigalski
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Literatura sugerida
RUSSO, E.; RUSSO, E. M. A. Controle de infecção e normas de biossegurança: uma necessidade e uma obrigação. Rev.
odontol. UNICID;13(1):63-72, jan.-abr. 200.
BRASIL. Diretrizes gerais para o trabalho em contenção com agentes biológicos: Ministério da Saúde, Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos. Brasília, DF: Ministério da Saúde, 2006. 50p.
Boop, C.A. Manual of clinical microbiology. 7º Ed., Ed. Murray, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1999.
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