Programa de Pós-Graduação em Genética
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências Biológicas
Departamento de Genética
Análise dos padrões de utilização de códons
sinônimos no genoma da bactéria
Chromobacterium violaceum
Catarina Paula da Silva Ramos
Recife, Pernambuco
Julho de 2006
Catarina Paula da Silva Ramos
Análise dos padrões de utilização de códons
sinônimos no genoma da bactéria
Chromobacterium violaceum
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
em
Genética
da
Universidade Federal de Pernambuco,
como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do grau de Mestre em Genética.
Orientador:
Prof. Dr. Paulo Paes de
Andrade, Departamento de Genética, Centro
de Ciências Biológicas, Universidade Federal
de Pernambuco.
Co-Orientador:
Queiroz
Genética,
Prof.
Balbino,
Centro
de
Dr.
Valdir
Departamento
Ciências
Julho, 2006
de
Biológicas,
Universidade Federal de Pernambuco.
Recife, Pernambuco
de
Ramos, Catarina Paula da Silva
Análise dos padrões de utilização de códons sinônimos no
genoma da bactéria Chromobacterium violaceum / Catarina Paula da
Silva Ramos. – Recife: A Autora, 2006.
70 folhas : il.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco.
CCB. Ciências Biológicas. Genética.
1. Genética 2 Chromobacterium violaceum I. Título.
576.5
575
CDD (22.ed.)
CDU (2.ed.)
UFPE
CCB - 2006 - 073
Universidade Federal de Pernambuco
Programa de Pós-Graduação em Genética
PARECER DA COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE DISSERTAÇÃO DO MESTRADO
Catarina Paula da Silva Ramos
“Análise dos padrões de utilização de códons
sinônimos no genoma da bactéria Chromobacterium
violaceum”
Área de Concentração: Genética e Evolução
A comissão examinadora, composta pelos professores abaixo, sob a presidência do primeiro,
considera a aluna Catarina Paula da Silva Ramos como aprovada.
Recife, 24 de outubro de 2006.
________________________________________
Orientador: Prof. Dr. Paulo Paes de Andrade (UFPE)
________________________________________
Titular Externo: Profa. Dra. Marise Sobreira Bezerra da Silva
(Fiocruz/CPqAM)
________________________________________
Titular Externo: Prof. Dr. Antônio Basílio de Miranda (Fiocruz)
________________________________________
Titular Interno: Profa. Dra. Ana Maria Benko Iseppon (UFPE)
________________________________________
Coordenador do Programa: Prof. Dr. Marcos Antônio de Morais (UFPE)
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus, o autor da minha vida, pai
e amigo fiel que me deu toda a força e sabedoria necessária para a
realização deste trabalho. Obrigada Senhor.
À minha família por todo o apoio e amor. Em especial aos
meus pais, por toda a educação, instrução e amor durante minha
vida.
Ao meu esposo Rodrigo, que sempre me apoiou em todos os
momentos difíceis.
Aos meus orientadores Dr. Paulo Andrade e Dr. Valdir
Balbino,
pelo
estímulo,
amizade,
ensinamento,
dedicação,
sinceridade, paciência e incentivo; por me fazerem acreditar que sem
o esforço da busca é impossível a alegria da vitória;
Aos meus colegas de mestrado, pelo convívio alegre e
descontraído, especialmente a Pollyanna, Juliana, Kyria, Ebenézer,
Helen, Jemima, Dalmo, Adriana e Iliano.
A todos do Laboratório de Biologia Molecular do Hemope
pela
amizade,
incentivo
e
por
tudo
que
passamos
juntos,
especialmente, a Júlia e a Camilla.
A todos da Igreja Batista Corpo de Cristo pela amizade e
orações.
Às ex-coordenadoras, Dra. Ana Benko Iseppon e Dra. Aline
Alexandrino, pelo esforço em melhorar o curso.
Aos novos coordenadores, Dr. Marcos Morais e Dra. Tânia
Rieger, por manterem a boa qualidade do curso.
Aos professores do curso, por todas as oportunidades de
desenvolvimento pessoal.
Ao secretário do curso, Arismar Lobo, pela atenção em
todos os momentos necessários.
Aos
integrantes
do
Laboratório
de
Bioinformática
do
Hemocentro da USP de Ribeirão Preto pelo incentivo e ajuda na busca
de artigos e principalmente pela amizade.
À CAPES, por me ceder uma bolsa de estudos durante a
realização deste trabalho.
A todos, Muito Obrigada !
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Ao meu esposo Rodrigo, a
maior
motivação
de
minha
vida!
6
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Sumário
Página
Lista de Tabelas
Lista de Figuras
Lista de Abreviaturas
Resumo
11
1. Introdução
12
2. Objetivos
16
2.1. Geral
16
2.2. Específicos
16
3. Revisão de Literatura
17
3.1. Origem do Código Genético
17
3.2. Propriedades do Código Genético
21
3.3. Seleção Natural e a Utilização de Códons
24
3.4. Seleção de Códons Ótimos e a Eficiência Traducional
27
3.5. Códons Sinônimos
39
3.6. Métodos Usados na Análise de Códons Sinônimos
43
3.7. Proteobactérias:Morfologia,Fisiologia,Ecologia,Diversidade Filogenética
52
3.8. Chromobacterium violaceum
61
4. Referências Bibliográficas
70
5. Manuscrito de Artigo Científico
Analysis Codon Usage of Chromobacterium violaceum
89
6. Abstract
119
7. Conclusões
120
8. Anexos
121
8.1.
Instruções para Autores (Genetics and Molecular Biology)
122
8.2.
Instruções para Autores (Genetics and Molecular Research)
126
9. Apêndice
9.A
Classificação filogenética de proteínas codificadas em genomas
completos (Clusters of Orthologous Groups - COGs).
130
7
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Lista de Tabelas
Tabela
Página
Manuscrito
Table 1:
Comparison of codon usage on leading and lagging strands
99
in C. violaceum genome.
8
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Lista de Figuras
Figura
Página
Revisão de Literatura
Figura 1:
Estrutura de um RNA transportador (RNAt)
17
Figura 2:
Tabela do Código Genético Universal
22
Figura 3:
Árvore
filogenética
simplificada
de
proteobactérias
baseadas nas seqüências de DNAr 16S da maioria do
53
gênero das proteobactérias.
Figura 4:
Chromobacterium violaceum
62
Manuscrito
Figure 1:
(A) Distribution of C. violaceum genes in the plane defined
97
by the first two main axes of the CoA of RSCU values; (B)
Correlation between first axis values and G+C content; (C)
Correlation
between
second
axis
values
and
hydrophobicity (Gravy score).
Figure 2:
Gene frequencies on the 18 COG categories for the two C.
98
violaceum gene subsets generated by CoA second axis/
hydrophobicity values. Letters on the x-axis denote COG
categories.
Figure 3:
Correlation between ENc and GC3s values for all C.
102
violaceum ORFs. A strong inverse correlation can be
observed.
Figure 4:
Codon bias index in C. violaceum genome. There is a
103
trend toward CBI values higher than 0.2.
Figure 5:
Correlation between CAI and ENc on RSCU values for all C.
104
violaceum genes.
Figure 6:
Distribution of codons along the first two main CoA axes
105
for C. violaceum.
9
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Lista de Abreviaturas
A
Adenina
AS
Antisense (Fita)
C
Citosina
CAI
Codon Adaptation Index - Índice de Adaptação de Códons
CBI
Codon Bias Index - Índice de Desvio de Códons
CoA
Correspondence Analysis - Análise de Correspondência
DNA
Ácido Desoxirribonucléico
ENc
Effective Number of Codons - Número Efetivo de Códons
Fop
Frequency of Optimal Codons - Freqüência de Códons Ótimos
G
Guanina
GC
Guanina/Citosina (Conteúdo)
GC3s
Guanine Citosine Content of third position - Guanina/Citosina de terceira
posição
GRAVY
Protein hidrophobicity - Hidrofobicidade da Proteína
RNA
Ácido Ribonucléico
RNAm
RNA mensageiro
RNAr
RNA ribossômico
RNAt
RNA transportador
RSCU
Relative Synonymous Codon Usage - Freqüência Relativa de Códons
Sinônimos
SS
Sense (Fita)
T
Timina
U
Uracil (a)
10
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Resumo
Desvios no uso de códons podem ocorrer devido a vários fatores. Entre
procariotos, o uso de códons sinônimos é atribuído ao equilíbrio
existente entre mutação e seleção natural. Um determinado
subconjunto de códons pode freqüentemente ser observado nas regiões
do genoma onde uma alta eficiência traducional é requerida. O uso de
códons de uma β-proteobactéria, Chromobacterium violaceum, é
descrito aqui pela primeira vez. O presente estudo teve como objetivo a
identificação das principais causas da variação do uso de códons no
genoma da C. violaceum ATCC 12472. Uma análise de correspondência
(CoA) da utilização relativa de códons sinônimos (RSCU) foi empregada
para investigar a variação do uso de códons sinônimos entre os genes.
Os resultados mostraram que um dos maiores determinantes desta
variação é o conteúdo GC que mostrou correlação direta com o primeiro
eixo principal da CoA. Observou-se também uma forte correlação
inversa entre o número efetivo de códons (ENc) e o conteúdo
guanina/citosina de terceira posição (GC3s), mostrando que o uso de
códons também sofre influência da composição em nucleotídeos. A
hidrofobicidade de cada proteína foi a segunda maior fonte de variação
e esteve significantemente correlacionada ao segundo eixo principal da
CoA. Os eixos 1 e 2 separaram o genoma em dois grupos de genes. O
grupo menor, formado majoritariamente por proteínas de transporte,
refletiu uma provável utilização diferencial de códons sinônimos destes
genes em relação aos demais. Isto pode ser devido à composição da
parede celular da bactéria e do meio em que vive para uma melhor
adaptação às variações do ambiente. Além disso, foi mostrada uma
forte correlação negativa do índice de adaptação de códons (CAI) com o
ENc, refletindo a “escolha” pelo uso de códons ótimos. Correlações
semelhantes foram vistas para a freqüência de códons ótimos (Fop) e
índice de enviezamento de códons (CBI). A composição dos
aminoácidos não pareceu influenciar a utilização de códons sinônimos
neste organismo. Ao contrário do observado em α-proteobactérias, a
assimetria das fitas não pareceu influenciar a composição de
aminoácidos ou o número de genes, por outro lado o uso do códon teve
alguma influência. A distribuição semelhante dos genes nas fitas
contínua e descontínua apontou para ausência de conflito entre
transcrição e replicação, provavelmente devido a uma tradução
otimizada e a uma replicação muito lenta. A generalidade destas
observações entre β-proteobactérias dependerá de novos estudos com
este grupo de microrganismos.
Palavras-chave: Análise de correspondência, assimetria das fitas,
hidrofobicidade, transporte de proteínas, adaptação ao ambiente, βproteobactéria.
11
Ramos, C.P.S.
1.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Introdução
Em decorrência da redundância do código genético, a maioria
dos 20 aminoácidos naturais é codificada por mais de um códon. Desde
que as primeiras seqüências de nucleotídeos foram depositadas nos
bancos de dados públicos, tem sido observado que nem todos os
códons que codificam para um mesmo aminoácido são usados com a
mesma freqüência. As freqüências de utilização de códons sinônimos
variam tanto entres os genes de um mesmo genoma quanto entre
genomas de organismos distintos. As diferenças nos padrões de
utilização de códons podem resultar, por exemplo, de restrições locais
na composição dos genomas conforme já foi observado em genomas
ricos nos nucleotídeos guanina e citosina.
A seleção traducional parece ser a principal responsável pela
variação na utilização diferencial de códons entre os diferentes genes. O
emprego de códons sinônimos também parece sofrer a influência direta
de
restrições
seletivas
e
da
existência
de
padrões
mutacionais
diferenciados. O estudo da utilização de códons possibilita a detecção
de alterações nestas duas forças e das suas possíveis implicações
evolutivas. A maior variação na utilização de códons em um genoma
ocorre principalmente nos genes que são altamente expressos, em
função da necessidade de utilização de trincas que maximizem a
eficiência traducional. Em bactérias, por exemplo, o uso de códons
parece estar intimamente relacionado com o seu nível de expressão.
12
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Outra fonte de variação importante consiste na transferência horizontal
de genes, pois os genes transferidos tendem a exibir padrões de
utilização de códons diferentes daquele observado no organismo
hospedeiro. Diferenças nos padrões de utilização de códons em genes
heterólogos e no organismo hospedeiro podem afetar diretamente os
seus níveis de expressão.
Existem
vários
índices
voltados
para
a
verificação
de
distorções na utilização de códons sinônimos. Como exemplos podemos
citar: conteúdo guanina/citosina de terceira posição (GC3s); freqüência
de códons ótimos (Fop); número de códons sinônimos (L_sym); número
total de códons sinônimos e não sinônimos (L_aa); hidrofobicidade das
proteínas (Gravy) calculado como a soma dos índices de hidrofobicidade
de cada aminoácido; índice de desvio do uso de códons (CBI); número
efetivo de códons (ENc), considerado o método que fornece a melhor
estimativa da utilização diferencial de códons de um conjunto de genes;
utilização relativa de códons sinônimos (RSCU) cujos valores fornecem
uma primeira estimativa do nível de distorção na utilização de códons
de um determinado aminoácido e o índice de adaptação de códons
(CAI) que estima o grau de extensão da utilização diferencial de códons
sinônimos em genes altamente expressos. Estes índices podem ser
empregados, por exemplo, na análise de correspondência (CoA) que é
um dos métodos que permite estudar a diferença entre os códons ou
examinar tendências na composição dos aminoácidos.
13
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
O estudo dos fatores envolvidos na determinação da utilização
diferencial de códons tem sido facilitado pela disponibilidade de um
grande
número
de
genomas
completos
cujas
seqüências
já
se
encontram depositadas em bancos de dados públicos. Em função do
tamanho relativamente pequeno dos genomas bacterianos, os métodos
de análise dos padrões de utilização de códons sinônimos puderam ter
sua eficácia comprovada e passaram a ser utilizadas de forma rotineira
nos estudos de expressão gênica e evolução destes organismos.
O crescimento da genômica no Brasil resultou na produção de
uma grande quantidade de informações derivadas dos vários programas
de sequenciamento de nucleotídeos conduzidos nos últimos anos. Temse observado, no entanto, que o número de pesquisadores devidamente
habilitados para a análise das informações advindas dos programas de
sequenciamento ainda é bastante limitada e evidencia a necessidade de
investimentos maciços na formação de recursos humanos, a exemplo
do que ocorre nos países desenvolvidos.
Neste
trabalho,
utilizamos
a
bactéria
Chromobacterium
violaceum como microorganismo modelo pelo fato de ter tido seu
gemoma completamente seqüenciado no Brasil e também devido a
pouca exploração do seu genoma no que diz repeito ao uso de códons.
Além disso, observou-se que as análises sobre o uso de códons
sinônimos
em
bactérias
têm
se
restringido
a
classe
das
alfaproteobactérias, surgindo a necessidade de estudos com outras
classes de proteobactérias para fins de comparação. Este estudo foi o
14
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
primeiro a demonstrar principais causas da variação na utilização de
códons sinônimos em uma betaproteobactéria.
Em
bactéria,
variabilidade
entre
sabe-se
espécies
que o
é
fator
mais
seu
conteúdo
o
importante
de
genômico
guanina/citosina (GC), em contraste com a baixa variabilidade de
conteúdo GC intra-espécies. A ampla variação entre espécies e a
estreita heterogeneidade do conteúdo GC dentro do genoma foi
interpretada como resultado de taxas de mutação bidirecional entre
pares AT e GC. Apesar da seleção para otimização da tradução ter sido
evidenciada como o maior fator para a variabilidade intra-espécies de
bactérias, apenas recentemente foi encontrada uma ligação entre
conteúdo genômico GC de bactérias e um fator ambiental aumentando
a interessante possibilidade de um impacto não zero de conteúdo GC
genômico no funcionamento da bactéria.
Um outro fator que tem mostrado influenciar a utilização de
códons sinônimos em bactérias é a hidrofobicidade dos aminoácidos,
que apesar de ser uma característica físico-química importante, é pouco
explorada.
Em
bactérias,
parece
estar
relacionada
com
algum
mecanismo de adaptação ao meio ambiente, formando na maioria das
vezes, um grupo de genes bem diferente do habitual. Com base nestas
características,
espera-se
que
a
utilização
diferencial
de
códons
sinônimos seja diferente entre as classes de proteobactérias alfa e beta,
uma
vez
que
a
C.
violaceum
possui
características
bastante
particulares.
15
Ramos, C.P.S.
2.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Objetivos
2.1 Geral
ƒ
Identificar aspectos estruturais e funcionais envolvidos na
determinação do uso de códons sinônimos no genoma da
Chromobacterium violaceum.
2.2 Específicos
ƒ
Estruturar um banco de dados contendo informações
básicas acerca das regiões codificantes encontradas no
genoma da C. violaceum, com ênfase especial nos
aspectos
estruturais
e
funcionais
dos
genes
nele
encontrado;
ƒ
Correlacionar os índices de quantificação do emprego
diferencial de códons com características estruturais e
funcionais dos genes estudados, visando verificar a
existência de um padrão que possa ser utilizado como
referência para estudos em bactérias.
ƒ
Analisar o conteúdo GC genômico e a hidrofobicidade dos
aminoácidos que compõem o genoma da C. violaceum e
fazer uma comparação com outras bactérias a fim de
verificar
o
impacto
destas
variáveis
na
utilização
diferencial de códons sinônimos.
16
Ramos, C.P.S.
3.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Revisão de Literatura
3.1 Origem do Código Genético
Estudos na década de 60 sugeriam que todas as formas
existentes de vida deveriam utilizar o mesmo código genético (hipótese
do acidente congelado). Esta hipótese foi proposta por Crick (1968) e
foi finalmente aceita com a definição do RNA transportador (RNAt)
como a molécula adaptadora. Segundo esta teoria, pequenas moléculas
de RNAs citoplasmáticos de cerca de 73 a 93 bases contendo um
grande número de bases modificadas, adquirem uma estrutura globular
compacta decorrente de um dobramento específico em forma de flor de
trevo (Figura 1). Esses RNAts são abundantes e ocorrem normalmente
acilados, ou seja, carregados com um resíduo de aminoácido específico,
existindo pelo menos um tipo de RNAt específico para cada um dos 20
aminoácidos naturais.
Figura 1. Estrutura de um RNA transportador (RNAt). Disponível em:
http://www.designeduniverse.com/articles/Nobel_Prize/trna.jpg
17
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
O modelo de Crick (1968) assume que as designações dos
códons são acidentes históricos que se fixaram no último ancestral
comum de todos os organismos, mas não explica ou prediz a ordem dos
códons observada. Este modelo tem sido contestado por três hipóteses
que se baseiam em argumentos adaptativos, químicos e históricos,
conforme revisto por Knight et al. (1999).
A hipótese adaptativa sugere que o padrão de atribuições dos
códons é reflexo das adaptações que reduzem os erros causados pela
mutação ou por erros de tradução (Woese, 1965; Freeland & Hurst,
1998; Knight et al., 1999; Ardell & Sella, 2002).
O argumento químico sugere que as atribuições de certos
códons são diretamente influenciadas pelas interações químicas entre
aminoácidos e moléculas de RNA (Sonneborn, 1965; Woese et al.,
1966; Woese, 1967; Knight et al., 1999; Freeland et al., 2000).
A hipótese histórica, por sua vez, propõe que o código
genético canônico se desenvolveu a partir de um ancestral primitivo
durante a evolução. Este código primitivo compreenderia um pequeno
número
de
aminoácidos
codificados
por
64
códons
altamente
degenerados. Esta hipótese assume que poucos (aproximadamente
cinco) aminoácidos seriam precursores. Como os demais aminoácidos
teriam surgido a partir destes, parte ou todos os domínios dos códons
do aminoácido precursor teriam sido repassados para os aminoácidos
produzidos (Wong, 1975; Knight et al., 1999). A teoria histórica propõe
uma evolução gradual de um sistema em que um dado RNAt passou a
18
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
reconhecer uma base para RNAts com especificidades para a primeira e
segunda
bases.
Esta
evolução
poderia
ter
permitido
que
mais
aminoácidos fossem distinguidos e quando a especificidade do sistema
melhorasse, RNAts poderiam expandi-la para as três bases do códon
(Yockey, 2000).
Estas suposições foram recusadas a partir da descoberta de
desvios
no
código
genético
universal
em
procariotos,
genomas
nucleares de eucariotos e genomas mitocondriais. Segundo Knight et al.
(1999) estes argumentos propõem que o código genético atual é de
algum modo ótimo, e reflete a expansão de um código mais primitivo
para incluir mais aminoácidos, ou é conseqüência de interações
químicas
diretas
entre
RNA
e
aminoácidos,
respectivamente.
Entretanto, tais modelos não são mutuamente exclusivos. Eles podem
ser
ajustados
estereoquímicas
pelo
modelo
formaram
o
evolucionário,
código
inicial,
pelo
e
qual
interações
subsequentemente
expandiram através de modificações biossintéticas dos aminoácidos
codificados sendo otimizadas através da redefinição de códon ou codon
reassignment, ou seja, a inserção de um aminoácido em resposta a um
códon de terminação. Alternativamente, as três forças devem ter
atuado para determinar os 20 aminoácidos naturais para as atuais
posições no código genético.
Outras duas teorias evolucionárias podem explicar como o
significado de um códon pode ser mudado sem extinção das espécies:
as teorias da captura (Osawa & Jukes, 1989) e da ambigüidade
19
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
intermediária (Schultz & Yarus, 1994). Experimentos recentes e
análises in silico indicam que, em lugar de aberrações da natureza,
mudanças no código genético também podem ter significado funcional.
Um
ponto
importante
na teoria
da
captura
é
a
suposição
da
neutralidade da redefinição de códon, uma vez que a troca de
aminoácidos é efetuada sem gerar proteínas anormais ou não funcionais
que levem a ruptura do proteoma (Osawa & Jukes, 1989). Por outro
lado, a teoria da ambigüidade intermediária propõe um mecanismo não
neutro em que mutações no RNAt podem expandir a capacidade de
decodificação
daquela
molécula
levando
a
uma
ambigüidade
de
decodificação de um único aminoácido pelos RNAts cognato e mutante
(Schultz & Yarus, 1994).
Quase todas as mudanças no código genético são explicadas
por um efeito sinergista entre as forças evolucionárias postuladas pelas
teorias da captura e ambigüidade intermediária. Entretanto, estes
processos contam com as maquinarias de replicação e/ou reparo do
DNA que mudam a seqüência codificada e o ribossomo.
A diversidade do código genético e da sua conseqüente
expansão para incorporar novos aminoácidos tem enfraquecido o
conceito de que o código genético é universal e “congelado”. Sua
flexibilidade tem sido encontrada especialmente entre microorganismos
e no genoma mitocondrial de várias espécies. O estudo da variação do
código genético fornece novos e importantes critérios acerca de como a
fidelidade de decodificação do RNAm (controlada pela maquinaria
20
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
traducional) modela a composição de bases do genoma, utilização de
códons
e
redefinição
de
códons,
revelando
novos
mecanismos
moleculares que relacionam o meio ambiente com a evolução dos
genomas (Santos et al., 2004).
3.2 Propriedades do Código Genético
O código genético representa uma coleção de seqüências de
bases (códons) que correspondem a cada aminoácido e aos sinais de
tradução. No início da década de 1960, Crick et al. (1961) publicaram a
primeira forte evidência em apoio de um código triplo (três nucleotídeos
por códon). De fato, todos os 64 códons possíveis correspondem a
algum tipo de informação. Além disso, ao traduzir as moléculas de
RNAm, os códons não se sobrepõem, mas são lidos seqüencialmente.
A grande maioria dos aminoácidos corresponde a mais de um
códon, com exceção da metionina (AUG) e do triptofano (UGG).
Portanto o código é dito redundante ou degenerado. Além disso, vários
códons diferem apenas na terceira base e correspondem a um único
aminoácido. Três códons finalizadores indicam o término da síntese de
polipeptídeos: UAA, UAG e UGA. De uma forma geral, observa-se a
mesma relação códon-aminoácido para todos os organismos, o que
mostra a universalidade do código genético. Porém foram observadas
variações em mitocôndrias, no genoma nuclear de algumas leveduras,
ciliados e outros. Estas exceções particulares parecem ser espécie-
21
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
específicas e têm, portanto, grande significado evolutivo. O aspecto
mais marcante da redundância é que, com apenas algumas exceções, a
identidade da terceira base do códon parece não ser importante. Isto é,
XYA, XYB, XYC e XYD freqüentemente correspondem ao mesmo
aminoácido.
Figura 2. Tabela do Código Genético Universal. Disponível em:
http://www.class.unl.edu/biochem/gp2/gx/image_bank/codon.gif.
Em 1965, Crick propôs “a hipótese da oscilação”, que explica
como algumas moléculas de RNAt respondem a vários códons, e
fornece uma compreensão para o padrão de redundância do código. Até
esta época era geralmente suposto que nenhum par de bases que não
GC, AT ou AU fosse encontrado em um ácido nucléico. Isto é verdade
quanto ao DNA, pois a estrutura helicoidal regular da dupla hélice impõe
22
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
duas restrições estéricas: duas purinas não podem parear uma com a
outra, pois não há espaço suficiente para um par planar purina-purina e
duas pirimidinas não podem parear porque não se alcançam (Crick,
1968). Crick propôs que, como o anticódon está situado dentro de uma
alça de RNA unifilamentar, a interação códon-anticódon pode não ser
restrita no mesmo grau que a dupla hélice de DNA. Construindo um
modelo, ele mostrou que as restrições estéricas eram menos rígidas na
terceira posição do códon, o que deveria permitir certa flexibilidade na
estrutura, chamada de “oscilação”.
A redundância do código genético não é aleatória, mas
altamente ordenada a fim de minimizar a letalidade mutacional. Além
disso, os aminoácidos com propriedades químicas semelhantes têm
códons que diferem uns dos outros em apenas uma base, o que
minimiza os efeitos das mutações. O código genético possui muitas
regularidades
(Taylor
&
Coates,
1989)
das
quais
apenas
um
subconjunto tem explicações em termos de função do RNAt (Crick,
1966), contra força de efeitos deletérios de mutação (Sonneborn et al.,
1965; Knight et al., 1999) ou erros na tradução (Woese, 1967; Knight
et al., 1999).
Sabe-se que há uma forte correlação entre as primeiras bases
dos códons e as vias biossintéticas dos aminoácidos que eles codificam
(Wong, 1975; Taylor & Coates, 1989). Códons começando com C, A e U
codificam aminoácidos sintetizados a partir do alfa-cetoglutarato,
oxaloacetato
e
piruvato,
respectivamente.
Essas
correlações
são
23
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
especialmente notáveis tendo em vista a diversidade estrutural dos
aminoácidos cujos códons têm em comum a primeira base (Copley et
al.,2005). Códons que têm U como segunda base estão associados com
aminoácidos mais hidrofóbicos e os que têm A nesta posição, com
aminoácidos mais hidrofílicos.
3.3 Seleção Natural e a Utilização de Códons
O
crescimento
exponencial
do
volume
de
seqüências
armazenadas em bancos de dados durante a década de 1980 facilitou a
análise estatística no que se refere à utilização de códons. Várias
técnicas de análise multivariada foram aplicadas para analisar a
utilização de códons sinônimos em mamíferos, vírus, bacteriófagos,
bactérias, mitocôndrias e genes de pequenos eucariotos (Grantham et
al., 1980a; 1981) demonstrando que os genes poderiam ser agrupados
com base no uso de códons e que estes grupos teriam ampla relação
com a organização taxonômica destes organismos. Conseqüentemente,
foi proposta a teoria genômica que afirma que o padrão de utilização de
códons de um genoma era uma característica específica de um
organismo. Isto sugere que a variação na utilização de códons pode
estar relacionada com a variação na abundância do RNA (Grantham et
al., 1980a) e que isso pode modular a expressão do gene (Grantham et
al., 1981).
24
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
O uso não aleatório de códons e a variação na utilização de
códons entre diferentes espécies sugerem que existe alguma restrição
seletiva na escolha do códon. Um estudo realizado por Grantham et al.
(1981) em 13 genes de Escherichia coli fortemente expressos e 16
menos expressos, usando a técnica de análise multivariada, encontrou
uma forte variação na utilização de códons. Gouy & Gautier (1982)
analisaram 83 genes de E. coli e encontraram que a variação na
utilização de códons era dependente dos níveis de tradução, e genes
com um alto número de cópias de proteínas usavam com maior
freqüência códons de energia intermediária que requeriam menos
discriminações de RNAt por ciclo de elongação.
A utilização de códons difere entre espécies não apenas na
seleção de códons, mas também no grau de preferência. Diferenças na
utilização
de
códons
de
genes
homólogos
não
implicam
necessariamente em mudança nos níveis de expressão, mas sugerem
que o efeito de pressões seletivas não são as mesmas. As preferências
de códons são freqüentemente diferentes no início de um gene quando
comparada com a parte central ou terminal do mesmo (Chen & Inouye,
1994; Karlin et al., 1998).
Muitas espécies de bactérias possuem preferências na escolha
de alguns códons (Sharp & Li, 1987). A seleção natural da utilização de
códons pelos organismos é a ferramenta chave para a caracterização de
todos os genes que, por sua vez, é útil no entendimento da evolução de
espécies alvo, bem como para medir o fluxo horizontal de genes ao
25
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
longo das diferentes espécies de bactérias. A variação na utilização de
códons é representada por dois paradigmas principais. Tanto a
utilização diferencial de códons quanto a seleção determinam o uso de
códons, ou ele é determinado apenas por preferências mutacionais.
Embora a seleção natural voltada para o aumento da eficiência
traducional tenha uma maior influência na utilização de códons em
muitas espécies, nem sempre é possível definir de que forma a seleção
está tomando lugar, assim como não explica toda a variação de uso de
códons observada. Alguns genes têm seu uso de códons determinado
principalmente por mutações, enquanto outros exibem padrões de
utilização de códons que aumentam com o balanço entre preferências
mutacionais e pressões seletivas (Sharp & Li, 1986).
As preferências de códons devem resultar do equilíbrio entre
seleção, que beneficia a fixação de códons favoráveis, e mudanças
genéticas, que aumentam a probabilidade de fixação de códons
desfavoráveis. A manutenção das preferências de códons por posições
sinônimas neutras requer uma lenta, porém constante taxa de fixação
adaptativa (Akashi, 1995). Se a seleção atua independentemente em
cada códon, então diferenças seletivas entre códons sinônimos são
provavelmente muito pequenas, logo a seleção de códons poderia ser
útil apenas em espécies com grande tamanho populacional (Li, 1987). A
seleção é comumente mais forte em genes altamente expressos porque
estes códons são traduzidos mais freqüentemente (Bulmer, 1988).
26
Ramos, C.P.S.
Li
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
(1987)
descreveu
que
as
preferências
de
códons
intermediárias deveriam representar um balanço entre mutação e
seleção, e assumiu que as freqüências relativas de sinônimos seriam
influenciadas pelas tendências mutacionais, coeficiente de seleção e
tamanho efetivo da população. Para selecionar entre códons sinônimos,
a vantagem seletiva deve ser maior do que o inverso do tamanho
efetivo da população. Sítios sinônimos poderiam ser fixados quando a
taxa absoluta de mutação fosse lenta e o tamanho efetivo da população
pequeno, assim o polimorfismo populacional poderia ser dispensável.
Isto assume uma segregação independente de códons e uma ligação
poderia aumentar substancialmente o acúmulo de códons deletérios.
Shields
(1989)
propôs
um
modelo
onde
seleção,
preferências
mutacionais e tamanho efetivo da população construiriam o códon de
preferência. Dessa forma, a utilização de códons era dependente da
magnitude e variabilidade de pressões seletivas.
3.4
Seleção de Códons Ótimos e a Eficiência Traducional
Ikemura (1981a) encontrou uma forte correlação entre o
número de cópias de proteínas e a freqüência de códons cujo RNAt
cognato era mais abundante. Esta correlação pareceu ser ainda mais
forte em genes altamente expressos, que usavam exclusivamente
códons “ótimos” (Ikemura, 1981a; Ikemura, 1981b; Ikemura, 1982;
Ikemura, 1985). Em um outro estudo, Ikemura (1982) sugeriu que a
27
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
utilização diferencial de códons poderia não apenas regular a expressão
do gene, como também atuar como uma ótima estratégia para sua
expressão. As conseqüências práticas desses achados deixam óbvia que
a
expressão
de
genes
heterólogos
poderia
ser
severamente
enfraquecida quando da introdução de um gene contendo códons raros
tais como AGA ou AGG (arginina), enquanto o problema poderia ser
compensado pela mudança de códons raros por códons sinônimos mais
freqüentemente usados ou por proporcionar cópias adicionais que
correspondem a RNAts raros (Ikemura 1981b; Ikemura 1985).
Goetz & Fuglsang (2005) realizaram um estudo sobre a
relação quantitativa entre a utilização de códons e os níveis de RNAm e
subseqüentemente, deste com os níveis de proteínas sintetizadas. Eles
mostraram que a utilização diferencial de códons é um bom parâmetro
de expressividade de genes em E. coli.
Há pelo menos dois mecanismos regulatórios independentes
para genes de RNAts. Alguns RNAts são produzidos em uma taxa
constante relativa à massa celular, enquanto outros são acoplados à
abundância de ribossomos. Os RNAts localizados nos operons de RNAr
são usados preferencialmente como códons principais (Komine et al.,
1990). A taxa de síntese desses RNAts está relacionada à síntese do
RNAr, a qual está, por sua vez, relacionada à taxa de crescimento do
organismo (Jinks-Robertson & Nomura, 1987). Códons secundários não
estão associados aos operons RNAr, embora pelo menos um RNAt
secundário em E. coli aumente em abundância relativa durante altas
28
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
taxas de crescimento. Isto sugere que era a freqüência do códon e não
a abundância dos RNAts cognatos que determinavam a resposta à
mudanças na taxa de crescimento (Kurland, 1991). Independentemente
da alteração das freqüências dos genes RNAts, a natureza da variação
genética que dirige a síntese dos RNAts é desconhecida. Como regra
geral, os RNAts principais estão representados como múltiplas cópias no
genoma enquanto que os RNAts secundários estão representados como
cópia única (Komine et al., 1990).
Embora a correlação entre a freqüência de códons e os RNAts
cognatos sejam um argumento atrativo para definir a forma como
seleção natural optaria entre códons sinônimos, isto poderia explicar
apenas parcialmente as preferências observadas quanto à utilização de
códons. Um códon ótimo é definido como qualquer códon cuja
freqüência de uso seja significantemente mais alta em prováveis genes
altamente expressos (Stenico et al., 1994). Ikemura (1981b), definiu
esses códons como sendo àqueles que ocorrem mais freqüentemente
em genes preferenciais e que sejam traduzidos pelo RNAt cognato mais
abundante.
Códons “ótimos” estariam presumivelmente sob seleção para
alguma forma de eficiência traducional. Embora medidas de taxas de
tradução in vitro possam inicialmente não encontrar diferenças na taxa
de tradução de códons “ótimos” e “não ótimos” (Andersson et al.,
1984), experimentos mais sofisticados detectaram diferenças nessas
taxas. Códons que são reconhecidos por RNAts principais são traduzidos
29
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
de três a seis vezes mais rápido do que seus sinônimos (Sorensen et
al., 1989). Talvez um uso de códons que reflita a seleção por um tempo
de vida muito curto possa responder as rápidas mudanças do ambiente
(Bagnoli & Lio, 1995).
Muitas moléculas de proteínas altamente expressas estão
envolvidas no crescimento e divisão celular. Melhor do que a otimização
de genes individuais, preferências de códon ou utilização diferencial de
códons considerados ótimos pode ser parte de uma estratégia especial
de maximização do crescimento (Kurland, 1991). Este autor sugeriu
que a seleção poderia atuar sobre a maquinaria de tradução para uma
melhor eficiência, o que implicaria na produção de proteína normal pelo
aparato de tradução, sendo a taxa de produção protéica mais
comumente determinada pela taxa de iniciação de tradução. A
conseqüência de uma tradução mais rápida é que os RNAm passariam
menos tempo nos ribossomos, elevando o número de ribossomos livres
e aumentando o número de RNAms traduzidos por ribossomo. Isto é
importante, pois o número dessas organelas freqüentemente é limitado.
É estimado que um terço do peso seco de uma célula de E. coli
crescendo rapidamente seja RNAr e proteína, e que aproximadamente
70% do fluxo de energia em E. coli seja usado no processo celular de
síntese de proteína (Ikemura, 1985). Se a tradução da proteína é
otimizada pela massa investida no aparato de tradução, então a taxa de
tradução de genes individuais não pode ser regulada pelo uso de códons
(Ehrenberg & Kurland, 1984).
30
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Uma análise do uso de códons sinônimos encontrou que a
seleção pela eficiência traducional poderia influenciar a utilização
diferencial de códons observada em genes altamente expressos de
Drosophila (Sharp & Matassi, 1994; Akashi, 1995). Segundo Sharp et
al. (1995) tanto a eficiência quanto a acurácia traducional são
importantes neste organismo.
Os genes que são transcritos mais freqüentemente podem ter
taxas de mutação mais baixas porque estão sujeitos a uma resposta
mais rigorosa de reparo do DNA (Berg & Martelius, 1995). Enquanto
alguns códons são preferencialmente usados em genes altamente
expressos, outros se mostram quase ausentes. Estes códons são citados
na literatura como raros, não favorecidos ou como códons de baixo uso.
O agrupamento de códons raros ou não favorecidos próximos ao códon
de iniciação foi primeiramente identificado por Ikemura (1981b) nos
genes altamente expressos de proteínas ribossomais.
Os
códons
são,
às
vezes,
encontrados
em
contextos
específicos. Fortes correlações entre nucleotídeos na interface do códon
e entre duplas posições de códons adjacentes sugerem que a
degeneração do código genético seja explicada pela organização dos
códons em algum contexto muito favorável (Curran, 1995). O contexto
de códon é diferente para genes muito e pouco expressos (Gouy,
1987). Smith & Smith (1986) fizeram uma análise com os genes gapA e
ompA de 10 gêneros de enterobactérias e encontraram forte preferência
no uso de códons. Além disso, observaram que, surpreendentemente,
31
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
códons sinônimos diferentes preferiam sítios diferentes no mesmo gene.
Com isto, os autores concluíram que a seleção seqüência-específica é
melhor que a mutação seqüência-específica.
A
composição
das
bases
é
uma
característica
mais
freqüentemente relatada no DNA sendo, provavelmente, uma das
influências mais persuasivas no uso de códons. Há uma grande variação
no conteúdo GC genômico de procariotos, variando de menos de 25% a
mais de 75%. O conteúdo GC dos códons sinônimos de terceira posição
pode variar por um fator de 10 entre espécies; esta preferência está
sempre na direção das tendências mutacionais. A composição de bases
é definida a partir de um balanço entre pressão mutacional e pares de
nucleotídeo GC (Sueoka, 1962). Também é o resultado da utilização
diferencial de códons (Sueoka, 1988), ou da seleção natural que tem a
função
de
conduzir
a
fixação
preferencial
de
dinucleotídeos
e
freqüências de bases não aleatórias (Bernardi, 1993). Quase todos os
organismos estão sujeitos a pressões mutacionais direcionadas e, na
ausência de seleção, é esta pressão que forma o uso de códons do gene
(Sueoka, 1988). Uma análise de grandes regiões em seqüências de
humanos e procariotos, usando a análise pela cadeia de Markov,
encontrou regiões que eram atípicas em muitos genomas. Isto pode ser
devido a pressões seletivas desconhecidas, a características estruturais
ou transferência horizontal de genes (Jain et al., 1999; Koonin et al.,
2001).
32
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Uma importante característica da organização genômica é a
presença de zonas ou regiões que diferem significantemente entre si na
freqüência relativa das quatro bases que constituem o DNA. Em
vertebrados e outros organismos, estas regiões foram denominadas
isócoros (Bernardi et al., 1988; Bernardi, 1993; Musto, 2001). O
conteúdo GC de terceira posição (GC3) é a freqüência dos nucleotídeos
G ou C presentes na terceira posição de códons sinônimos (excluindo
Met, Trp e códons de término) e sua variação substancial entre genes
procariotos tem sido usada para inferir a presença de isócoros em
procariotos (Sueoka, 1992). Os genes que têm fraca preferência de
códons exibem variação GC3 associada com a posição do cromossomo,
com
um
GC3
mais
baixo
próximo
ao
terminal
de
replicação
(Deschavanne & Filipski, 1995). Em Saccharomyces cerevisiae, os
genes ricos em GC estão localizados predominantemente no centro dos
dois braços cromossômicos (Sharp & Lloyd, 1993), enquanto regiões
mais pobres em GC são encontradas nos centrômeros e telômeros. Esta
variação de GC é independente da seleção por códons “ótimos”. Os
padrões de códons e aminoácidos diferem significativamente entre
genes codificados pelas fitas senso e anti-senso (Lobry, 1996).
Em E. coli a localização cromossomal influencia as taxas de
substituição. Genes localizados próximos à origem de replicação têm
taxas de substituição mais baixas (Sharp et al., 1989). Isto implica que
tanto a utilização diferencial de códons quanto a seleção natural variam
sistematicamente com a localização do genoma.
33
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Enquanto que em quase todas as espécies o código genético
permanece constante, o uso e a escolha de códons “ótimos” divergem.
Uma análise detalhada e cuidadosa do uso de códons é um pré-requisito
essencial para o entendimento de como e porque padrões de escolha de
códons diferem. Não há uma razão óbvia do porquê de um subconjunto
de códons ótimos diferir entre espécies. A utilização de códons é similar
em espécies proximamente relacionadas, mas diverge com o aumento
da distância filogenética. Quando examinamos o uso de códons é
importante distinguir entre variação intra e interespecífica. Também é
necessário considerar se a variação é causada por uma preferência
mutacional ou através da seleção por um códon traducionalmente
eficiente. Embora isto seja atribuído a uma variação nas tendências
mutacionais do genoma (Nomura et al., 1987), pode ser mais
facilmente explicado como um equilíbrio entre mutação e seleção
(Sharp, 1990).
Um grande interesse na evolução do uso de códons tem sido
em torno dos códons de início e término, composição de bases,
utilização de códons nas fitas senso e anti-senso, assim como da
freqüência
de
aminoácidos
que
exibem
desvios
significantes
na
distribuição aleatória, que é bem acentuada em genes altamente
expressos (Sharp & Bulmer, 1988). A escolha do códon de terminação
está relacionada com o nível de expressão do gene. Em genes
altamente expressos de E. coli há uma forte tendência pelo uso do
códon de terminação UAA (revisado por Jin et al., 2002).
34
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Não se sabe o grau com que recombinações interespécies
ocorrem
entre
procariotos.
A
transferência
de
genes
está
freqüentemente associada com elementos transposons ou seqüências
de inserção (Groisman et al., 1993). Antes que seqüências transferidas
horizontalmente sejam estabelecidas, elas devem conquistar barreiras
que bloqueiem a herança de genes recentemente adquiridos (Matic et
al.,
1995).
Genes
adquiridos
por
transferência
horizontal
freqüentemente têm conteúdo GC atípico, preferências de códons e
elementos repetitivos (Medigue et al., 1991).
Medigue et al. (1991) utilizaram a análise de correspondência
para investigar o uso de códons de 780 genes de E. coli e descreveram
três classes de genes. Os genes da classe III tinham um uso de códons
que não refletia a média da distribuição de RNAts específicos, tendo
consequentemente um baixo valor para o índice de adaptação de
códons (CAI). Os genes da classe I e II eram distribuídos similar e
uniformemente ao agrupamento encontrado por Gouy & Gautier (1982).
A maioria dos genes adquiridos por transferência horizontal em E. coli
apresenta uma vantagem adaptativa imediata, como por exemplo, os
genes que codificam proteínas da superfície celular e genes de
resistência a antibióticos (Matic et al., 1994), o que sugere que esta
transferência possa ter função importante na evolução das bactérias
(Lan & Reeves, 1996).
A divergência no uso de códons está relacionada com a
distância evolucionária, o que sugere que o uso de códons ou uso de
35
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
aminoácidos pode ajudar a elucidar as relações evolucionárias entre
espécies. Embora as análises filogenéticas que se baseiam no uso de
códons pareçam ter aplicação prática, a filogenia é melhor investigada
através da análise comparativa de seqüências homólogas (Sharp,
1986).
A
utilização
evolutivamente
de
distantes
códons
devido
pode
à
convergir
similaridade
em
das
espécies
preferências
mutacionais. Ikemura (1981b), em um estudo com oito genes de E.
coli, notou uma correlação entre composição de aminoácidos e
preferências de códons. Isso foi mostrado depois da hidrofobicidade ser
considerada como a segunda mais forte tendência na composição de
aminoácidos em E. coli. Surpreendentemente esta tendência é mais
significante do que a aromaticidade, volume ou mudança do aminoácido
(Lobry & Gautier, 1994).
A suposição de que a seleção natural poderia influenciar
mudanças silenciosas (Grantham et al., 1980b; Grantham et al., 1981;
Kimura, 1983; Ikemura, 1985), sugeria que em genes de algumas
espécies, sítios silenciosos não sejam neutros (Sharp et al., 1993). A
conseqüência
disso
é
efetivamente
neutras
que
e
algumas
substituições
provavelmente
sinônimas
acumulam
são
seqüências
semelhantes à taxa de mutação (Ikemura 1981a; Ikemura 1981b;
Ikemura, 1985).
Seleções fracas permitem que processos não adaptativos
sejam evidenciados. Com a identificação de códons favoráveis é
possível predizer a vantagem e desvantagem relativa de seqüências
36
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
alternativas e talvez, a de uma seqüência completamente ótima
(Akashi, 1995). Substituições silenciosas ocorrem normalmente com
maior freqüência do que as não sinônimas (Kimura, 1977). As taxas de
evolução de sítios sinônimos são usadas para investigar e validar
algumas das predições da evolução molecular, tais como a hipótese do
relógio molecular (Sharp & Li, 1989). As taxas de substituições
silenciosas são substancialmente mais baixas em genes altamente
expressos do que em genes com baixos níveis de expressão (Ikemura,
1985).
A observação de restrições no uso de códons reduz a taxa de
substituição silenciosa e essa restrição pode variar entre genes, estando
de acordo com as predições da teoria neutra (Kimura, 1983).
Substituições sinônimas podem elevar a taxa de substituição em um
códon adjacente em cerca de 10%; isto parece não estar relacionado
com o nível da expressão do gene e tem uma pequena faixa de
influência, mas pode ser devido a mutagênese direta seqüencial,
recombinação e/ou seleção (Eyre-Walker, 1994).
A relação entre o uso de códons e a taxa de substituição de
sítios silenciosos é mais complexa do que a seleção de códons ótimos.
Enquanto o aumento da expressão aumenta a pressão seletiva em
códons sinônimos e imediatamente reduz as taxas de substituições
observadas, há também uma diminuição na taxa de mutação (Berg &
Martelius, 1995). Em E. coli este declínio na taxa de mutação parece
similar para a família de códons da lisina que parece não ser fortemente
37
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
selecionada pela eficiência traducional, e por códons fenilalanina, que
são selecionados pela tradução (Eyre-Walker & Bulmer, 1995).
A freqüência de códons raros é mais alta em genes raramente
transcritos. Usualmente isto é atribuído a pressões adaptativas que
modulam a expressão do gene. Do mesmo modo que há uma
freqüência mais alta de códons raros próximos ao códon de iniciação de
muitos genes regulatórios há também, próximos a genes altamente
expressos (Eyre-Walker & Bulmer, 1993). Saier (1995) estudou como a
expressão inapropriada de certos genes poderia ser regulada pela
alteração no conjunto de RNAts em diferentes estágios do crescimento.
A diferença de padrões de utilização de códons nesses diferentes
estágios de crescimento não é necessariamente um mecanismo
regulatório. Isto pode simplesmente refletir a diferença nos mecanismos
de controle da abundância do RNAt durante a fase de crescimento
estacionária ou exponencial de alguns procariotos e uma conseqüente
adaptação a diferentes conjuntos de RNAt.
A expressão de genes heterólogos pode ser adversamente
afetada por códons não usuais. A presença de códons raros em um
gene recombinante pode ser compensada pela adição de um RNAt
apropriado ou pela síntese de um gene para remover códons raros
(Kane, 1995).
38
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
3.5 Códons Sinônimos
O uso de códons “ótimos” está relacionado com a composição
do conjunto de RNAt, sugerindo que a seleção por uma eficiência
traducional favorece o uso de códons que correspondem aos RNAts
mais abundantes uma vez que o uso desses códons poderia minimizar o
número de RNAts incorretos que são rejeitados antes da chegada do
RNAt correto (Akashi, 1994).
Em bactérias o conteúdo de guanina/citosina (conteúdo GC) é
muito variável e resulta provavelmente de três fatores: (1) tendências
mutacionais diferenciadas entre as fitas senso (SS) e anti-senso (AS),
uma vez que os genes localizados na fita senso tendem a ser mais ricos
em GT (Lobry et al., 1996; McLean et al., 1998); (2) o uso de códons
sinônimos que correspondem aos RNAs transportadores (RNAt) mais
abundantes na célula (Ikemura, 1985); e (3) transferência horizontal de
genes, que tenderiam a exibir padrões de utilização de códons atípicos
quando comparados àqueles do organismo hospedeiro (Nakamura et
al., 2000; Goetz et al., 2005).
Lynn et al. (2002) analisaram os padrões de utilização de
códons em 40 genomas bacterianos e mostraram que o uso de códons
sinônimos sofre influência direta do conteúdo GC e da temperatura
ambiental, demonstrando a existência de uma clara ligação entre um
padrão particular de utilização de códons e uma força externa seletiva.
39
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Sharp et al. (2005) analisaram os genomas de 80 bactérias
filogeneticamente
diferentes
e
concluíram
que
as
espécies
de
crescimento rápido exibem em maior quantidade operons de RNAr, e
genes para RNAt apresentando uma forte tendência à utilização
diferencial de códons sinônimos.
Ardell (1998) introduziu a carga média de peso como uma
forma geral de função adaptativa que estima a habilidade do código
genético em minimizar os erros durante a replicação, transcrição e
tradução. Baseado neste trabalho, Najafabadi et al. (2005) definiu esta
função adaptativa comparando o uso de códons sinônimos de um
conjunto de 3237 genes de E. coli K12 com o de 106 genes gerados
aleatoriamente e sugeriu que a minimização de erros pode ser um fator
que influencia a preferência de utilização de códons em E.coli.
O código genético padrão é conhecido pela alta eficiência em
minimizar os efeitos deletérios de erros devido a mutações pontuais e
erros de tradução, uma habilidade que, em termos, é denominada
“minimização da carga” (Najafabadi et al., 2005). Sabe-se também que
quando um aminoácido é substituído por outro, devido a um erro, as
propriedades bioquímicas do aminoácido resultante são geralmente
similares àquelas do original. Considerando as freqüências relativas dos
aminoácidos e das cópias do gene de RNAts em seqüências genômicas,
Goodarzi et al. (2005) fizeram uma análise para introduzir uma função
adaptativa que modelasse mais pontualmente as probabilidades de
40
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
erros traducionais em organismos modernos, sugerindo a presença de
uma coevolução da freqüência do RNAt e do código genético.
Knight et al. (1999) mostraram que a principal força que
forma o código genético é a seleção para minimização de distâncias
químicas entre aminoácidos, que é, a minimização de erros no nível da
proteína como proposto por Sonneborn (1965), Woese (1965) e outros.
A utilização diferencial de códons pode afetar o grau de minimização de
erros. Isto é importante, pois supõe que a vida foi originada em altas
temperaturas e durante a origem do código G e C foram provavelmente
mais abundantes que A e T, por causa da maior estabilidade de
conformação devido às três pontes de hidrogênio que ligam GC ao invés
das duas que ligam AT (Woese, 1965; Li, 1997; Najafabadi et al.,
2005).
Archetti (2004) mostrou que o alto grau de minimização de
erros do código genético, aparentemente, é reduzido bruscamente
quando se considera que a preferência na utilização de códons
produzida pelo provável conteúdo GC ocorreu durante a origem do
código
e
há
possíveis
códons
alternativos
que
diferem
apenas
levemente do código padrão. Quando a utilização diferencial de códons
e a mutação são fatores limitantes se considera a freqüência de códons
que melhor representa que o código padrão não é desprezível. Por esta
razão o código genético padrão está longe de ser “ótimo” no que diz
respeito à minimização de erros (Knight et al., 1999; Woese, 1965).
41
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Copley et al. (2005) estudaram um mecanismo quimicamente
aceitável para a associação dos aminoácidos com as duas primeiras
bases de seus códons. Eles projetaram um exemplar mais simples do
código genético e desenvolveram um modelo sugerindo que a ligação
covalente de um aminoácido a um dinucleotídeo poderia levar a síntese
preferencial de aminoácidos específicos devido à catálise de certas
transformações bioquímicas pelo dinucleotídeo.
A utilização de códons sinônimos é um fenômeno que não
ocorre ao acaso, pois sua estrutura reflete as propriedades físicoquímicas dos aminoácidos e suas relações biossintéticas. A preferência
na utilização dos códons pode resultar em desvio na taxa mutacional ou
da ação da seleção atuando sobre as trocas silenciosas no DNA ou de
ambos. A utilização de códons sinônimos reflete a variação na
composição
dos
nucleotídeos,
observada
em
genomas
distintos.
Provavelmente, as bactérias são o modelo onde esse fenômeno tenha
sido
melhor
estudado.
Nesse
caso,
além
da
composição
de
nucleotídeos, pelo menos um outro fator está atuando no uso dos
códons sinônimos: a ligação de RNAts.
Em E. coli, foi demonstrado que alguns códons são bem
reconhecidos pelos tipos de RNAts mais abundantes na célula. Tais
códons
são
preferencialmente
escolhidos.
Estes
conferem
uma
vantagem sob o ponto de vista da tradução (Sharp & Matassi, 1994).
Esses códons “ótimos” são escolhidos preferencialmente nos genes
altamente expressos, em contraposição aos genes com baixos níveis de
42
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
expressão, pois neste caso a utilização de códons é mais uniforme. A
vantagem de usarem códons “ótimos” seria tornar a tradução mais
eficiente. Resultados similares têm sido descritos para o genoma dos
eucariotos.
Atualmente, a seleção para a eficiência no processo da
tradução das proteínas é a hipótese mais aceita para explicar o
enviezamento na utilização dos códons. Postula-se que as substituições
sinônimas em um gene altamente expresso, que resultam em códons
raros no conjunto dos RNAts, sejam eliminadas por seleção natural.
3.6 Métodos Usados na Análise de Códons Sinônimos
O maior avanço na análise do uso de códons sinônimos foi
quando Grantham et al. (1980a) aplicaram a técnica de estatística
multivariada, e logo depois Gouy & Gautier (1982) aplicaram índices
que podiam sumarizar códons ótimos através de variáveis descritivas,
facilitando a comparação dos padrões de utilização de códons. Os
índices de análise de códons sinônimos são usados para ajudar na
tabulação e investigação dos mesmos. Estes índices reduzem os dados
obtidos na análise, porém podem ter certas limitações. Existem vários
métodos voltados para a quantificação de distorções na utilização de
códons.
43
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
O índice GC3s mede a freqüência dos nucleotídeos G e C
presentes
na
terceira
posição
dos
códons
(excluindo
metionina,
triptofano e códons de terminação):
O número efetivo de códons (ENc) foi introduzido em 1990
(Wright, 1990) sendo considerado como o método estatístico que
fornece a melhor estimativa da utilização diferencial de códons em um
determinado conjunto de genes. É análogo ao número efetivo de alelos
usados
em
genética
de
populações.
As
principais
vantagens
apresentadas pelo ENc advêm da possibilidade de inclusão de todo o
conjunto de códons e da constatação de que este parâmetro se mostra
relativamente insensível a variações no comprimento do gene (Comeron
& Aguade, 1998). Adicionalmente, o ENc possibilita a análise de um
grande número de genes sobre os quais não se dispõe de informações
precisas sobre o seu nível de expressão. Os seus valores variam entre
20 e 61, observados nos casos nos quais apenas um códon é utilizado
para cada aminoácido – mínimo, ou quando todos os códons sinônimos
são igualmente empregados – máximo. Em genomas onde o uso de
códons é inteiramente devido a tendências mutacionais o valor
esperado de ENc (dependendo do grau de preferência GC) varia de 31 a
61 (Wright, 1990);
44
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Onde Fˆ = número de códons degenerados; k = número de
códons sinônimos; n = número total de códons para um determinado
aminoácido; pi = número de ocorrências do enésimo códon para um
determinado aminoácido.
O programa CodonW que foi usado para fazer a análise de
correspondência usa uma versão desta equação que é um código
genético independente.
Onde x = número de membros na maior família de sinônimos;
N1 = frequência de códons não sinônimos; Ni = número de famílias de
códons i-vezes degenerados maiores que 0; Nc = é a soma de todas as
famílias de códons sinônimos.
Se aminoácidos são raros ou forem perdidos serão feitos
ajustes.
Para
aminoácidos
ausentes
o
numerador
irá
conter
a
informação apenas dos aminoácidos presentes. Para seqüências onde a
família de aminoácidos sinônimos estiver vazia (nFˆ=0), Nc não é
calculado pois se assume que o gene é muito pequeno.
Uma outra medida empregada na análise da utilização
diferencial de códons sinônimos é a RSCU (acrônimo da expressão
Relative Synonymous Codon Usage ou utilização relativa de códons
45
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
sinônimos) (Sharp, Tuohy & Mosurski, 1986) a qual é calculada como
sendo a razão da freqüência observada de um códon pela freqüência
esperada se a utilização de códons for uniforme (H0*) dentro de um
grupo de códons sinônimos (Hastings & Emerson, 1983). Valores
superiores ou inferiores a uma unidade são interpretados como uma
indicação da utilização diferencial de códons sinônimos em relação ao
que seria esperado na concepção de que todas as trincas fossem
empregadas na mesma proporção (Fulgsang, 2003). Os valores de
RSCU são independentes da composição do aminoácido e fornecem uma
estimativa do nível de utilização de códons de um determinado
aminoácido. Ou seja:
RSCUi = Xi
∑X
n
onde Xi é o número de vezes que o códon foi utilizado e n corresponde
ao número de códons sinônimos, ou seja: RSCU = freqüência do códon
X dividido pela frequência esperada do códon X se o uso de códons for
uniforme. Valores acima ou abaixo de 1,0 indicam que os códons são
utilizados acima ou abaixo daquilo que seria esperado. Por exemplo,
dois códons codificam o aminoácido fenilalanina (Phe). Se um de seus
códons (UUU) for usado 4791 vezes em um determinado genoma de um
total de 23119 fenilalaninas presentes, o valor de RSCU para este códon
será de 2*4791/23119 = 0.41.
46
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Esses índices medem o desvio da utilização de códons
sinônimos observada sobre a esperada. As duas principais hipóteses
nulas usadas para estimar as distribuições esperadas são:
H0: O códon esperado é inteiramente determinado por
tendências mutacionais.
H1: Não presume tendências mutacionais ex. códons são
usados igualmente. H1 é a hipótese nula mais usada porque faz uma
presunção mais simples. Entretanto, o uso igual de sinônimos é uma
exceção à regra. Índices tais como os métodos de estatística-G (Sharp,
Tuohy & Mosurski, 1986) e o qui-quadrado (Shields et al., 1988),
podem ser usados com outros padrões de referência do H1. Outros
índices, tais como, o número efetivo de códons (Wright, 1990), embora
quase que freqüentemente usado para H1, é igualmente aplicável para
H0.
Diversos índices estimam o quanto o uso de códons por um
gene é alterado no que diz respeito ao uso preferencial de códons
“ótimos”. O índice de enviezamento de códons (CBI) é a medida de
preferência de códons que altera um subconjunto de códons “ótimos”
(Bennetzen & Hall, 1982).
Onde Nopt = número de códons ótimos; Nran = número
esperado
de
códons
ótimos
se
os
códons
forem
escolhidos
aleatoriamente (H1); Ntot = número de códons sinônimos.
47
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
O CBI é semelhante ao Fop (Ikemura, 1985), exceto que o
Nran é usado como um fator de escalonamento. Em um gene com
preferências extremas de desvios códons, CBI é igual a 1.0. Com o uso
de códons aleatório CBI pode ser zero. Se Nopt for menor que Nran,
este índice será negativo.
O índice da freqüência de códons ótimos (Fop) em um gene
(Ikemura, 1981a; Ikemura & Ozeki, 1982; Ikemura, 1985) é uma
medida espécie-específica de tendência próxima a códons particulares
que parecem ser transcricionalmente ótimos nas espécies, ou seja, uma
razão simples entre a freqüência de códons ótimos e o número total de
códons sinônimos.
Se códons sinônimos raros forem identificados, há a escolha
de calcular o índice Fop original:
Ou o índice Fop modificado:
Onde N é a frequência com que cada tipo de códon é usado.
Os valores de Fop para o índice original sempre variam de
zero (quando códons não ótimos são usados) a 1,0 (quando apenas
códons ótimos são usados). Quando se calcula o índice Fop modificado,
é possível ocorrer valores negativos, mas estes valores são ajustados
para zero (Ikemura, 1981a; Ikemura & Ozeki, 1982; Ikemura, 1985).
48
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
O Índice de Adaptação de Códons (CAI, acrônimo da
expressão Codon Adaptation Index) estima o grau de extensão da
utilização diferencial de códons em genes altamente expressos (Sharp &
Li, 1987a) e é uma medida muito usada de preferências de códons em
procariotos (Eyre-Walker & Bulmer, 1993; Gutierrez et al., 1994;
Perrière et al., 1994) e eucariotos (Akashi, 1994). O CAI é considerado
como um dos métodos mais eficientes para a determinação teórica do
nível de expressão gênica (Zhuo-Cheng, 2003), sendo freqüentemente
utilizado no estudo de várias espécies de bactérias (Naya et al., 2001;
Hou & Yang, 2002). O CAI de um gene pode ser estabelecido a partir da
obtenção da média geométrica dos valores de adaptabilidade dos seus
códons e pode assumir valores compreendidos entre zero e um. Os
valores máximo e mínimo são encontrados, respectivamente, nos casos
onde os códons sinônimos são utilizados em igual proporção ou quando
apenas códons de maior adaptabilidade são empregados (Hou & Yang,
2002).
Onde ωk é a adaptação relativa do k-enésimo códon e L é o
número de códons sinônimos no gene.
A freqüência do uso de códons em genes altamente expressos
é usada para definir valores de adaptação relativa para cada códon
sinônimo. Esses valores são calculados baseados no RSCU embora
sejam essencialmente independentes da composição do aminoácido. O
49
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
CAI evita a dicotomia inerente ao Fop e CBI onde códons são ótimos ou
não ótimos, mas pequenas mudanças no tamanho da amostra podem
ter efeito indesejado na troca de códons ótimos. Entretanto, os valores
de CAI dos genes de diferentes espécies não são diretamente
comparáveis, porque o valor de adaptação relativa difere. Similarmente,
se houver mudança no conjunto referência de genes altamente
expressos, os valores de adaptação relativa mudam e os valores de CAI
para todos os genes daquelas espécies devem ser recalculados.
Os índices CBI, Fop e CAI medem preferências nos desvios de
códons e podem ser calculados para espécies em que a seleção pela
eficiência traducional supere a mudança mutacional e um conjunto de
códons
ótimos
(ou
de
genes
altamente
expressos)
tenha
sido
identificado. Se estes índices são calculados para genes onde os códons
ótimos são desconhecidos ou onde o uso de códons é determinado por
tendências mutacionais, o valor do índice resultante é essencialmente
sem sentido.
A hidrofobicidade da proteína (Gravy) calcula a média geral
do razão de hidrofobicidade para o produto gênico conceitualmente
traduzido. É calculada como a média aritmética da soma dos índices de
hidrofobicidade de cada aminoácido (Kyte & Doolittle, 1982). Este índice
foi usado anteriormente para quantificar a maior tendência no uso de
aminoácidos em genes de E. coli através da análise de correspondência
(Lobry & Gautier 1994).
50
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Onde N é o número de aminoácidos e Ki é o índice de
hidrofobicidade de cada aminoácido.
A análise de correspondência (CoA) é um tipo de análise
multivariada onde são usadas matrizes retangulares cujas colunas
representam medidas do uso de códons ou de aminoácidos e as linhas,
genes individuais. Este método é utilizado para identificar as maiores
tendências na variação do uso de códons e na composição dos
aminoácidos, e distribui os genes ao longo de eixos contínuos de acordo
com estas tendências (Greenacre, 1984). Apenas os códons que há um
códon
sinônimo
alternativo
(59
códons,
excluindo
metionina
e
triptofano) são incluídos na análise. Cada gene é descrito por um vetor
de 59 variáveis (códons). A CoA plota estes genes em um espaço de 59
dimensões e permite encontrar eixos neste espaço que descrevam as
variações mais importantes quanto ao uso de códons.
A CoA também tem sido usada na investigação dos padrões de
utilização de códons sinônimos em vários organismos (Romero et al.,
2000; Naya et al., 2001; Jenkins et al., 2001). De uma forma geral,
tem-se observado que os genes altamente expressos tendem a usar
códons
correspondentes
aos
RNAs
transportadores
(RNAts)
mais
abundantes da célula (Perrière & Thioulouse, 2002) e também códons
ricos em C3 e pobres em A3. O nível de expressão gênica interfere
decisivamente na utilização dos códons sinônimos.
51
Ramos, C.P.S.
3.7
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Proteobactérias:
Morfologia,
Fisiologia,
Ecologia
e
Diversidade Filogenética
As
proteobactérias
são
uma
classe
de
bactérias
que
compreende as bactérias púrpuras e seus semelhantes, que formam um
ramo
da
árvore
predominantemente
homologia
de
eubacterial.
Gram-negativas
sequências
Este
é
equivalentes
grupo
classificado
de
de
bactérias
com
base
nucleotídeos
de
na
RNA
ribossômico 16S, ou pela hibridização de RNA ribossômico ou DNA com
RNA ribossômico 16S e 23S (http://141.150.157.117:8080/prokPUB
/chaphtm/379/02_00.htm).
52
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Figura 3. Árvore filogenética simplificada de proteobactérias baseadas nas seqüências
de DNAr 16S da maioria do gênero das proteobactérias.
53
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Apenas os nomes das famílias e grupos maiores estão
indicados. As Deltaproteobactérias e Epsilonproteobactérias são as mais
ramificadas do filo; as Alfaproteobactérias estão também claramente
separadas, enquanto que se observa uma relação mais próxima entre
as Betaproteobactérias e Gamaproteobactérias, o que pode indicar uma
origem comum destes dois últimos grupos.
3.7.1 Alfaproteobactérias
O DNAr 16S separa claramente a classe alfa das demais
classes de proteobactérias. Pertencem as alfaproteobactérias cerca de
140
gêneros
e
425
espécies
diferentes
morfologicamente
e
metabolicamente. A Tabela 1 mostra uma revisão dos maiores grupos
filogenéticos e nomes das ordens e famílias de alfaproteobactérias.
Tabela 1. Alfaproteobactérias: Ordens, famílias e número de
gêneros.
Ordem
Família
Número de
Gêneros
Rhodospirillales
Rhodospirillaceae
10
Acetobacteraceae
12
Rickettsiaceae
3
Ehrlichiaceae
5
Holosporaceae
7
Rhodobacterales
Rhodobacteraceae
Sphingomonadales
Sphingomonadaceae
20
9
54
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Caulobacterales
Caulobacteraceae
4
Rhizobiales
Rhizobiaceae
7
Bartonellaceae
1
Brucellaceae
3
Phyllobacteriaceae
6
Methylocystaceae
3
Beijerinckiaceae
3
Bradyrhizobiaceae
8
Hyphomicrobiaceae
19
Methylobacteriaceae
3
Rhodobiaceae
1
Fonte: http://141.150.157.117:8080/prokPUB/figures/normal/p379-108.gif
A maioria das alfaproteobactérias tem a forma de bastão,
sendo que algumas espécies também podem apresentar formas
diferentes deste padrão. Algumas são fototróficas, de cor púrpura e não
sulfurosas (tais como Rhodospirillum e Rhodobacter), enquanto que
outras
são
quimiolitotróficas
(Nitrobacter,
que
oxida
nitrito)
ou
quimiorganotróficas (Sphingomonas e Brucella). Batérias fototróficas
não sulfurosas marinhas e halofílicas parecem estar restritas as
alfaproteobactérias (Imhoff, 2001), enquanto que um notável grupo de
bactérias
contendo
bacterioclorofil,
mas
incapaz
de
crescer
fototroficamente sob condições anaeróbias pertence a várias linhagens
de alfaroteobactérias (Yurkov & Beatty, 1998). Exceto para Roseateles,
todas
as
bactérias
aeróbicas
contendo
bacterioclorofil
são
exclusivamente encontradas dentro das alfaproteobactérias e parecem
estar
relacionadas
filogeneticamente
com
as
bactérias
55
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
quimiorganotróficas puramente aeróbicas. Isto poderia ondicar que a
presença de bacterioclorofil em alguns membros de alfaproteobactérias
(Erythrobacter
e
Roseobacter)
é
uma
peculiaridade
atávica
que
permanece funcional após a bactéria aeróbica evoluir dos seus
ancestrais fototróficos anaeróbios (Stackebrandt et al., 1996). Então
bactérias
aeróbicas
intermediária
da
fototróficas
evolução
poderiam
das
representar
fototróficas
uma
anaeróbias
para
fase
as
quimiotróficas aeróbicas não-fotossintéticas.
Na última década, a classificação das Rhodospirillum e
Rhodopseudomonas, sofreu mudanças consideráveis, que estão de
acordo com os dados das sequencias de DNAr 16S, parâmetros
morfológicos,
estruturas
internas
da
membrana
e
importantes
parâmetros quimiotaxonômicos tais como a composição dos ácidos
graxos celulares, ubiquinonas e estruturas do citocromo-c. Muitas das
bactérias fotossintéticas não-sulfurosas são também capazes de fixar o
nitrogênio.
Quimiorganotróficas clássicas (Sphingomonas), assim como
acidófilas típicas (Acetobacter) e metilotróficas (Methylobacterium)
pertencem as alfaproteobactérias. Um grande número de membros da
classe alfa vive em associação com eucariotas: algumas são patógenos
de humanos e animais (Brucella) ou plantas (Agrobacterium), e outras
desenvolvem um estilo de vida parasita obrigatório, causando doenças
em humanos e mamíferos, sendo transmitidos por mordidas de insetos
ou carrapatos (Rickettsiaceae), ou vivem simbioticamente nas raízes de
56
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
plantas leguminosas (Rhizobium e Bradyrhizobium), e tem função na
fixação do nitrogênio atmosférico. Assim, as alfaproteobactérias se
destacam na grande divergência de habitats e exercem um impacto
significante na biosfera do nosso planeta (Birch, 1997).
3.7.2 Betaproteobactérias
As betaproteobactérias (cerca de 75 gêneros e 220 espécies)
claramente representam um grupo monofilético dentro de um grande
linhagem filogenética composta pelo complexo β-γ proteobactéria,
chamado Chromatibacteria. Do ponto de vista metabólico, morfológico e
ecológico, as betaproteobactérias são muito heterogêneas. Elas contêm
algumas
bactérias
quimiolitotróficas,
fototróficas
algumas
quimiorganotróficas,
púrpuras
metilotróficas,
algumas
bactérias
não-sulfurosas,
um
grande
fixadoras
de
várias
número
nitrogênio
de
e
algumas que são importantes patógenos de plantas, humanos e
animais. Suas morfologias podem variar de bacilos ou cocos a espirais e
células revestidas. Alguns membros são de interesse biotecnológico
devido a suas propriedades biodegradáveis.
Recentemente, uma betaproteobactéria fixadora de nitrogênio
que nodulava as raízes de leguminosas foi descrita (Chen et al., 2001).
Embora a maioria das bactérias fototróficas não-sulforosas pertençam
ao grupo alfa, algumas espécies não-sulfurosas são membros do grupo
Rhodocyclus ou da família Comamonadaceae do grupo beta. Como no
57
Ramos, C.P.S.
grupo
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
alfa,
as
betaproteobactérias
fototróficas
não-sulfurosas
misturam-se filogeneticamente com as não-fototróficas e podem ser
claramente
diferenciadas
daquelas
pertencentes
ao
grupo
das
alfaproteobactérias (Rhodobacter, Rhodobium, etc.) com base na
composição dos ácidos graxos e quinona, bem como das seqüências de
citocromo-c (Imhoff, 2001). A Tabela 2 mostra uma revisão dos
maiores grupos filogenéticos e nomes das ordens e famílias de
betaproteobactérias.
Tabela 2. Betaproteobactérias: Ordens, famílias e número de
gêneros.
Ordem
Família
Número de
Gêneros
Burkholderiales
Burkholderiaceae
4
Ralstoniaceae
1
Oxalobacteraceae
5
Alcaligenaceae
6
Comamonadaceae
15
Hydrogenophilales
Hydrogenophilaceae
2
Methylophilales
Methylophilaceae
3
Neisseriales
Neisseriaceae
Nitrosomonadales
Nitrosomonadaceae
2
Spirillaceae
1
Gallionellaceae
1
Rhodocyclaceae
6
Rhodocyclales
14
Fonte: http://141.150.157.117:8080/prokPUB/chaphtm/379/02_02.htm
58
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
3.7.3 Gamaproteobactérias
As gamaproteobactérias correspondem ao maior grupo de
proteobactérias (cerca de 180 gêneros e 750 espécies) incluindo o
grupo fitopatogênico Xanthomonas como membro limítrofe. O grupo
DNAr das Xanthomonas aparece perifericamente ligado às classes das
betaproteobactérias ou gamaproteobactérias, e pode ser considerado
como um grupo irmão das betaproteobactérias. As gamaproteobactérias
contêm bactérias sulfurosas púrpuras fotossintéticas (Chromatiaceae e
Ectothiorhodospiraceae)
bactérias
juntamente
quimiorganotróficas,
com
tais
um
como
grande
número
de
Enterobacteriaceae,
Legionellaceae, Pasteurellaceae, Pseudomonadaceae, Vibrionaceae e
també, algumas quimiolitotróficas sulfurosas ou ferro-oxidantes. Há
algumas classes que são importantes patógenos humanos e animais.
O gênero Pseudomonas está restrito a todas as espécies
filogeneticamente relacionadas à espécie Pseudomonas aeruginosa, um
membro
da
gamaproteobactéria,
enquanto
às
Pseudomonas
pertencentes às classes alfa e beta foram alocadas a novos gêneros tais
como
Brevundimonas,
Sphingomonas,
Comamonas,
Burkholderia,
Ralstonia, etc. Tiobacilli relacionado à espécie T. thioparus pertence a
betaproteobactéria, enquanto que as espécies Thiobacillus pertencem a
gamaproteobactéria foram reclassificados nos gêneros Acidithiobacillus,
Halothiobacillus e Thermithiobacillus.
59
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
3.7.4 Deltaproteobactérias
Do ponto de vista de estilo de vida e morfologia, a classe delta
é a mais peculiar porque contém bactérias que são típicos predadores
de
outros
procariotos
deltaproteobactérias
(bdellovibrios),
pertencentes
às
enquanto
mixobactérias
outras
desenvolvem
complexos ciclos de vida, formando estruturas muiticelulares produtoras
de
esporos.
Até
o
momento,
não
fora
encontradas
bactérias
fotossintéticas pertencentes à classe delta. Menaquinonas são as
maiores carregadoras de elétrons na cadeia respiratória. Os maiores
subgrupos
de
deltaproteobactérias
são:
1)
as
mixobactérias
desenvolvendo motilidade e formando esporos (Chondromyces); 2) os
bdellovibrios vivendo como predadores de outras bactérias Gramnegativas; 3) as bactérias dissimilatórias redutoras de sulfato e enxofre
(gênero recebe o prefixo Desulfo-); e 4) algumas bactérias sintróficas
que transforma fermento (Syntrophobacter) ou benzoato (Syntrophus)
a acetato, CO2 e hidrogênio em cocultura com metanógenos que
consomem hidrogênio.
Bdellovibrios
e
mixobactérias
são
estritamente
aeróbios,
enquanto que as bactérias sintróficas e redutoras de sulfato e enxofre
são
estritamente
anaeróbias.
O
maior
grupo
filogenético
das
deltaproteobactérias contém atualmente cerca de 60 diferentes gêneros
e 160 espécies.
60
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
3.7.5 Epsilonproteobactérias
Este é o menor e a mais recentemente conhecida linha de
descendentes dentro das Proteobactérias (6 gêneros e cerca de 50
espécies).
Até
o
momento,
bactérias
fotossintéticas
não
foram
repostadas e as chaves representativas são os gêneros Campylobacter
e Helicobacter, que inclui enteropatógenos de humanos e animais.
Muitas
espécies
das
epsilonproteobactérias
são
microaerofílicas,
quimiorganotróficas de forma espiralada não sacarolítica ou bactérias
curvadas, tipicamente móveis com um flagelo polar. Elas obtêm sua
energia principalmente de aminoácidos ou intermediários do ciclo do
ácido tricarboxílico. Algumas espécies requerem fumarato e outras
formam mais fumarato ou hidrogênio mais fumarato para crescimento
em condições microaeróbias. Algumas epsilonproteobactérias ainda não
cultiváveis têm sido reportadas como simbiontes de camarões e
poliquetas.
3.8 Chromobacterium violaceum
A
bactéria
Chromobacterium
violaceum
(Figura
4),
microrganismo modelo utilizado neste estudo foi primeiramente descrita
no
século
XIX
(Boisbaudran,
1882)
sendo
um
organismo
particularmente interessante, uma vez que é β-proteobactéria, Gramnegativa, saprófita não patogênica, aeróbica facultativa presente em
61
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
amostras de solo e água de regiões tropicais e subtropicais de diversos
continentes sendo encontrada em abundância nas águas do Rio Negro,
região da Amazônia Brasileira (Duran & Menck, 2001). A análise de seu
genoma deve fornecer informações importantes sobre adaptação
fisiológica de organismos de vida livre.
Figura 4. Chromobacterium violaceum
Ocasionalmente, pode atuar como um patógeno oportunista
em animais e homens e causar septicemia fatal de lesões na pele com
abscessos no fígado e pulmão. Seu potencial patogênico foi descrito
pela primeira vez por Wooley (1905) (em Rettori, 2000), ao comprovar
que esse organismo causava a morte de búfalo d’água por septicemia,
nas Filipinas. Posteriormente, verificou-se que esta bactéria poderia
causar infecções em outros animais como porcos, macacos, ovelhas e
cães. Alguns casos de infecções sérias e mesmo fatais, em humanos,
foram reportadas em outros países, inclusive no Brasil (Bilton &
Johnson, 2000).
Aparentemente a incidência de infecção por C. violaceum em
humanos é baixa, no entanto, deve-se alertar para o fato de que essa
62
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
bactéria é encontrada com freqüência na natureza e de causar infecções
graves em humanos. Após uma análise de indivíduos infectados e
diagnosticados, nos Estados Unidos, conclui-se que a C. violaceum é um
agente patogênico de baixo grau, capaz de causar infecções severas,
principalmente
em
pacientes
imunodeprimidos.
Entretanto,
essas
generalizações são questionáveis, uma vez que foi descrita uma
infecção severa com C. violaceum em uma criança de 12 anos, que não
apresentava imunodepressão (Bilton & Johnson, 2000).
Outros relatos também associados à C. violaceum são a
granulomatose crônica, a adenite, como complicação degranulomatose
crônica, a osteomielite, a celulite periorbital e a infecção ocular. Todos
os casos citados até agora foram produzidos por bactérias pigmentadas,
mas há também casos de infecções originados por formas não
pigmentadas (ausência de violaceína) (Miller et al., 1988). Portanto, a
patogenicidade associada a essa bactéria parece ser independente de
violaceína.
O genoma completo da C. violaceum compreende um único
cromossomo circular de 4.75 Mb contendo 4.431 matrizes abertas de
leitura (Open Reading Frames - ORFs), destas 2.717 (61,3%) codificam
proteínas com funções hipotéticas, 958 (21,6%) proteínas hipotéticas
conservadas e as demais (17,1%) proteínas hipotéticas. Cerca de 539
ORFs do genoma da C. violaceum codificam proteínas envolvidas no
transporte de metabólitos. Muitas destas ORFs (489, que representam
11% de todas as ORFs anotadas) codificam seqüências de proteínas que
63
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
tem similaridades semelhantes às proteínas de membrana relacionadas
ao transporte de outros organismos (Vasconcelos et al., 2003). O
número significante de proteínas transportadoras em C. violaceum é
certamente um importante fator que marca esta bactéria como um
microorganismo dominante em uma variedade de ecossistemas de
regiões
tropicais
e
subtropicais
e
parece
estar
relacionado
à
necessidade de adaptação às diversas condições externas. Do ponto de
vista biotecnológico, o achado mais importante são os transportadores
de metais pesados, que podem levar à exploração da C. violaceum para
a biorremediação (Grangeiro et al., 2004).
Como um organismo de vida livre, a C. violaceum está exposta
a uma variedade de condições, tais como fontes e abundância de
nutrientes diferentes, mudanças de temperatura e pH, compostos
tóxicos e raios UV. Estas variações e os diversos ambientes requerem
uma grande adaptabilidade e um forte sistema de proteção. O
seqüenciamento do genoma desta bactéria revelou uma variedade de
ORFs associadas a rotas metabólicas alternativas para geração de
energia, proteínas relacionadas ao transporte, transdução de sinal,
mobilidade celular, secreção e metabolismo secundário (Vascondelos et
al., 2003). Adicionalmente, a disponibilidade limitada de ferro em
muitos ambientes pode ser superada por quelantes de ferro, proteínas
de armazenamento de ferro e por diversas proteínas relacionadas ao
metabolismo
do
ferro
no
genoma
da
C.
violaceum.
Proteínas
osmoticamente induzidas, canais transmembrana de água e outras
64
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
porinas podem estar regulando o movimento da água e mantendo o
turgor da célula, atividades que tem função importante na adaptação às
variações de pressão osmótica. Diversas proteínas relacionadas à
tolerância
ao
estresse
contra
compostos
antimicrobianos,
metais
pesados, temperatura, ácidos e luz UV, outros que promovem a
sobrevivência sob condições de inanição e enzimas capazes de
detoxificação
de
espécies
reativas
do
oxigênio
foram
também
detectadas em C. violaceum. Todas estas características juntas ajudam
a explicar a remarcável competitividade e habilidade para sobreviver
sob diferentes tipos de estresse ambiental (Hungria et al., 2004).
A bactéria C. violaceum possui a característica marcante de
produzir
um
pigmento
violeta
denominado
violaceína
que
tem
demonstrado o seu potencial como atividade antibiótica (Caldas, 1990),
antitumoral (Ueda et al., 1994), antiparasitária (Duran et al., 1994;
Souza et al., 1999; Leon et al., 2001), antifúngica (Shirata et al., 2000)
e antiviral (Duran & Menck, 2001). Além disso, C. violaceum possui a
capacidade
de
biossíntese
(polihidroxivalerato
ou
do
homopolímero
PHV),
bem
como
de
3-hidroxivalerato
outros
tipos
de
polihidroxialcanoatos (PHA’s) (Steinbüchel et al., 1993; Piemolini et al.,
2003).
Apesar
da
variedade
de
metabólitos
produzidos
por C.
violaceum, de interesse médico, e potenciadores de antibióticos,
antitumorais e enzimas, o potencial biotecnológico dessa bactéria ainda
é pouco estudado, e merece estudos mais aprofundados. Por outro
65
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
lado, é importante relatar que algumas cepas de C. violaceum
mostraram resistência a rifampicina e vancomicina, o que pode
aumentar o potencial patogênico desta bactéria.
Entre os aspectos biológicos interessantes dessa bactéria, já
foi descrita, em 1999, sua capacidade de hidrolisar filmes plásticos de
celulose, devido, provavelmente, à ação de hidrolases. Processos mais
complexos
também
solubilização
de
foram
ouro.
relatados,
Acredita-se
que
como
o
a
desnitrificação
cianeto
produzido
e
por
processos enzimáticos seja um dos elementos responsáveis pela
extração do ouro. Aparentemente, esse método evitaria o uso de
mercúrio e a conseqüente contaminação ambiental. Recentemente foi
verificado que 53% do ouro poderiam ser extraídos de materiais com
baixo teor em ouro (Lawson et al., 1999). Mais uma vez, é importante
destacar que existem atualmente patentes destes tópicos.
Com
o
anúncio
do
seqüenciamento
do
genoma
de
C.
violaceum por um grupo de laboratórios brasileiros, o país se inclui
entre os grupos que realizam clonagem gênica e sequenciamento de
DNA dessa bactéria, em estudos iniciados em 1989. De fato, alguns
trechos do genoma da C. violaceum, com interesse biotecnológico, já
foram
seqüenciados.
Entre
eles,
estão
os
genes
envolvidos
na
biossíntese de violaceína (Pemberton et al., 1991), a hidroxilase de
fenilalanina (Onishi et al., 1991), o ácido polihidroxialquílico sintase
(Kolibachuk et al., 1999), fragmentos genômicos contendo orfD
(homólogo a SoxR de Escherichia coli) (Kolibachuk & Dennis, 1999) e
66
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
seqüências de genes que codificam RNAs ribossomais 16S and 23S
(Dewhirst et al., 1989; Turner et al., 1996).
Em termos biotecnólogicos, o conhecimento da seqüência dos
genes
permite
desvendar
as
etapas
envolvidas
nos
processos
metabólicos e orientar eventuais melhorias na produtividade de
metabólitos. Este conhecimento abre ainda a possibilidade do desenho
de novos fármacos ou de inibidores de processos bioquímicos próprios a
uma determinada patogenicidade. Obviamente, o interesse comercial
desses dados científicos gera a proteção da informação científica por
patentes, fato esse que se aplica aos dados de seqüência dos genes já
descritos de C. violaceum.
Entretanto, ainda há muito por ser descoberto sobre a
seqüência de reações e a correlação genética dos processos que
resultam na síntese desse pigmento. A violaceína de C. violaceum é
codificada por um conjunto único de quatro genes, denominados
vioABCD, encontrados em um fragmento de DNA de cerca de 8 Kbp,
provavelmente arranjados em um operon. O uso desse fragmento de
DNA permitiu a forte expressão heteróloga de violaceína em E.coli e em
várias outras bactérias Gram-negativas (Pemberton et al., 1991).
A análise da seqüência dos genes dessa via de produção de
violaceína indica que vioA, vioC e vioD codificam para monooxigenases
dependentes de nucleotídeos. A mutagênese de transposons resultou
em um número diferente de fenótipos que variaram de ausência da
produção do pigmento (colônias brancas) à formação de pigmentos
67
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
verdes ou violeta claro (e a mesma coloração da colônia). Esses
fenótipos dependem do local de inserção do transposon: enquanto
inativação dos genes vioA ou vioB, bloqueia completamente a formação
do pigmento, a inativação de vioC ou vioD resulta em formação de
pigmentos precursores de violaceína (August et al., 2000).
O gene da hidroxilase de fenilanina (PHA; fenilalanina 4-monooxigenase) de C. violaceum foi também inteiramente seqüenciado e
expresso em E. coli. Curiosamente, a proteína deduzida da seqüência
de DNA apresenta muitas características de enzimas de fígado de
mamíferos, o que indica um alto grau de conservação desses genes.
Entretanto, PHA da C. violaceum é uma enzima monomérica que
contém um mol de cobre no sítio ativo, enquanto as enzimas de
mamíferos são ativas como um tetrâmero e contém um mol de
ferro/subunidade (Onishi et al., 1991).
Os ácidos polihidroxilalquílicos são reservas de carbono e
energia produzidos em algumas bactérias, quando as fontes de
nutrientes chegam a ser limitantes. Alguns desses poliácidos e seus
poliésteres têm propriedades físicas similares às de polipropilenos,
fazendo eles importantes como fonte de plásticos biodegradáveis de
fontes renováveis (por exemplo, o BIO-POL) (Sherwood, 1983).
A seqüência do gene responsável pela síntese do RNA
ribossomal 16S foi realizada 12 anos atrás (Dewhirst et al., 1989),
sendo que, recentemente, foi determinada a seqüência do gene do
RNAr 23S (Harmsen & Singer, 1999). Esses genes têm grande
68
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
interesse, pois confirmam a posição filogenética da bactéria C.
violaceum
dentro
do
ramo
das
beta-proteobactérias,
da
família
Neisseriaceae.
Outro aspecto interessante da C. violaceum, diz respeito ao
fato de ser uma bactéria encontrada livre no meio ambiente. Este fato
permite seu contato com outras espécies de bactérias, podendo haver
transferências genéticas entre elas. Assim, desvendar o código genético
de C. violaceum poderá revelar aspectos não só da história evolutiva da
bactéria como um todo, mas também da evolução específica dos seus
genes.
69
Ramos, C.P.S.
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Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
5. Manuscrito de Artigo Científico
Protein hydrophobicity and codon usage
patterns in Chromobacterium violaceum
Manuscrito submetido à revista
Genetics and Molecular
Research
ISSN: (1676-5680)
(v.6, n. 1, 2007)
Submissão em Setembro/2006
89
Ramos, C.P.S.
Protein
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
hydrophobicity
and
codon
usage
patterns
in
Chromobacterium violaceum
Catarina Paula da Silva Ramos1, Tetsuo Tashiro2, Enivaldo Carvalho da
Rocha3, Valdir de Queiroz Balbino1, Paulo Paes de Andrade1*.
Addresses:
1.
Departamento
de
Genética,
Centro
de
Ciências
Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária,
Recife, Pernambuco, Brasil;
2.
Departamento
de
Educação
Física,
Universidade
Federal
de
Pernambuco, Cidade Universitária, Recife, Pernambuco, Brasil;
3. Departamento de Ciências Sociais, Centro de Filosofia e Ciências
Humanas, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária,
Recife, Pernambuco, Brasil.
Running title: Codon usage and hidrophobicity in Chromobacterium
violaceum
90
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Abstract
Biased codon usage may result from various factors. Among
prokaryotes, it appears that the influences of natural selection and
mutational biases are different if the genome is skewed towards AT or
GC. A particular codon subset can often be observed in those genome
regions where a maximized translational efficiency is required. Codon
usage of a β-proteobacterium, Chromobacterium violaceum, is for the
first time reported. The present study was aimed at the identification of
the main cause of codon usage variation in C. violaceum ATCC 12472
genome. Correspondence analysis (CoA) on relative synonymous codon
usage (RSCU) was used to examine the synonymous codon usage
variation among the genes. The results have shown that one of the
major determinants of codon bias trends in C. violaceum is, as
expected, the G+C content. It shows a direct correlation with the first
principal CoA axis. A strong inverse correlation between the effective
number of codons (ENc) and GC3s content was also observed, showing
that the codon usage was affected by gene nucleotide composition.
Hydrophobicity was the second major source of variation and was
significantly correlated to the second principal CoA axis. Axis 1 and 2
separated the genome in two gene groups. The minor group seems to
be formed mostly by transport proteins, reflecting a putative codon
usage bias of these genes. This unusual grouping may reflect the
particular environment in which this bacterium dwells (river water) and
is possibly related to the special features of α-proteobacterial cell walls
and to a proper adaptation to environment variations. Moreover, the
strong negative correlation between CAI and ENc reflected the regular
use of optimal codons among these genes. Amino acid composition does
not have any influence in selecting the codon usage in this organism
and does not affect either Fop or CBI. In contrast to what has been
observed in α-proteobacteria, strand asymmetry does not seem to
influence on amino acid composition or in the number of genes, in the
other hand codon usage may have some influence. The similar
distribution of genes between leading and lagging strands is possibly
due to an optimized translation and a very slow replication, reducing
the expected conflict between transcription and replication. The
generality of these observations among β-proteobacteria will depend on
new studies on this group of microorganisms.
Key-words:
Correspondence
analysis,
strand
asymmetry,
hydrophobicity, transport proteins, adaptation to environment, βproteobacterium.
91
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
*Corresponding author:
Paulo
Paes
de
Andrade,
Universidade
Federal
de
Pernambuco,
Departamento de Genética, Av. Prof. Moraes Rego S/N, Cidade
Universitária, Recife, Pernambuco, Brazil, ZIP 50732-970, Fone/fax:
(55) 8121268569; E-mail: [email protected]
Introduction
Most of the 20 natural amino acids are coded by more than
one codon, with the exception of methionine and tryptophan. Codon
usage for a single amino acid varies both between genes from the same
genome as well as among different organisms (Grantham et al., 1980;
Ikemura, 1985). The guanine/citosine content (C+C content) in bacteria
is rather variable and results from three main factors: (1) different
mutation rates between sense and anti-sense DNA strands, since genes
on the first strand are GT richer than those from on the latter (Lobry et
al., 1996; McLean et al., 1998); (2) codon usages that mirror the
aminoacyl-tRNA abundance in a given species (Ikemura, 1985);
and
(3) horizontal gene transfer, allowing the existence of an atypical
skewed codon usage for a specific set of genes when compared to the
overall codon usage pattern for the whole genome (Nakamura et al.,
2000; Goetz et al., 2005).
The higher gene density in the leading strand is commonly
observed in most bacterial genomes and especially in rDNA and
92
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
ribosomal protein encoding segments (reviewed by McLean et al.,
1998). A particular codon subset can often be observed in those
genome regions where a maximized translational efficiency is required
(Gouy and Gautier, 1982; Sharp and Li, 1987).
Lynn et al. (2002) studied codon usage patterns from 40
bacterial genomes and showed that codon usage was under direct
influence of the G+C content and the environment temperature,
demonstrating therefore the existence of a clear connection between a
particular codon usage pattern and an external selective pressure.
Chromobacterium violaceum (Boisbaudran, 1882) is a freeliving
Gram-negative
β-proteobacteria,
belonging
to
the
family
Neisseriaceae (Garrity et al., 2001), found in water and soil samples
from tropical and sub-tropical regions worldwide (Caldas, 1990). Its
most conspicuous product is violacein, a pigment used for therapeutic
purposes in dermatological products (Caldas et al., 1978). Violacein also
exhibits anti-parasitic activity against important tropical pathogens, as
Mycobacterium tuberculosis (Souza et al., 1999), Trypanosoma cruzi
(Duran et al., 1994) and Leishmania sp. (Leon et al., 2001), as well as
anti-bacterial (Caldas, 1990), anti-viral (Duran and Menck, 2001) and
anti-cancer (Ueda et al., 1994) activities.
The C. violaceum ATCC 12472 strain genome consists of a
single circular 4.57 Mb chromosome containing 8 rRNA operons, 98
tRNA genes and 4,431 ORFs, from which 2,717 (61.3%) code for
proteins
with
putative
functions,
958
(21.6%)
for
hypothetical
93
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
conserved proteins and the rest (17.1%) for hypothetical proteins
(Vasconcelos et al., 2003). These ORFs encompass 89% of the genome
and must be expressed in such a way as to guarantee the bacteria
adaptative success in a wide spectrum of different environmental
conditions. C. violaceum genes have a mean length of 954 bp and a
64.83% G+C content (Vasconcelos et al., op. cit.).
The present study is the first aimed at the identification of the
main
causes
of
codon
usage
variation
in
a
β-proteobacteria,
Chromobacterium violaceum.
Material and Methods
The
sequence
C.
was
violaceum
obtained
ATCC
from
12472
GenBank
(NC_005085)
genomic
(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/
genomes/Bacteria). Codon usage analysis was performed with the
software CodonW v. 1.4.2 available at http://bioweb.pasteur.fr/seqanal
/interfaces/codonw.html.
Correspondence analysis (CoA) on relative synonymous codon
usage (RSCU) was used to examine the synonymous codon usage
variation among the genes without any confounding influence of amino
acid composition. All annotated genes with complete ORFs and without
internal stop codons were included in the present analysis. For each
gene
the
following
features
were
considered:
length,
functional
categories (according to COG, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG), G+C
94
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
content (in categories ranging from < 21% to > 80%, in 10% intervals)
and strand position (SS - sense strand or AS - antisense strand).
The number of codons used in each gene sequence was
determined by direct counting from amino acid sequence tables
generated by conceptual translation. The following CodonW output
indexes were analyzed: G+C content at the third codon position
(GC3s); frequency of optimal codons (Fop); number of synonymous
codons and total number of synonymous and non-synonymous codons
(L_sym and L_aa, respectively); protein hydrophobicity (Gravy
score), calculated as the sum of hydrophobicity indexes of each amino
acid (Kyte and Doolittle, 1982); effective number of codons (ENC)
(Wright, 1990); codon adaptation index (CAI), estimated from codon
usage pattern among E. coli ribosomal and elongation factors genes;
codon bias index (CBI), as defined by Bennetzen and Hall (1982). The
overall information was compiled in a tabulated form and analyzed the
help
of
the
SPSS
software
for
Windows
(v.11.0)
available
at
http://www.spss.com.
In order to analyze the influence of gene strand position in
codon usage genes were separated according to their location in the
leading (total 2101 genes) and lagging (total 2306 genes) strands in a
cumulative codon usage table. The correlation between codon usage
and amino acid usage indexes (ENc, GC3s, GC, Gravy, CBI, Fop, CAI), as
well
as
the
principal
axes
contributions
generated
by
the
correspondence analysis were graphically displayed.
95
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Square 2 X 2 contingency tables were produced with the total
number of occurrences for each codon in the first column and total
number of available synonymous codons in the second column.
Significance was evaluated by the χ-square test for the 59 codons at
5% level.
Results
The total number of codons in the lagging and leading strands
were 736,495 and 665,853, summing up 1.402,348 codons. A CoA of
RSCU values was conducted, in which the first four axes accounted for
49.4% of the total inertia of the 59-dimensional space. The first axis
accounted for 20.1%, whereas the second axis only accounted for
12.2% and the two next axes for 17%. The position of each gene on the
plane defined by the two first axes is displayed in Figure 1A. Two sets of
genes were clearly demonstrated, a larger set and a smaller one,
separated by second axis values. There was a strong positive
correlation between gene position along the first axis and G+C content
(r = 0.610, p<0.0001) (Figure 1B). The second axis displayed a strong
correlation (r = - 0.720, p<0.0001) to protein hydrophobicity and was
responsible for the separation of the two gene sets (Figure 1C).
96
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Figure 1. (A) Distribution of C. violaceum genes in the plane defined by
the first two main axes of the CoA of RSCU values; (B) Correlation
between first axis values and G+C content; (C) Correlation between
second axis values and hydrophobicity (Gravy score).
The
smaller
set
of
genes
is formed
mostly
by
genes
responsible for the synthesis of transport proteins (53.3%), mainly of
inorganic ions, carbohydrates and amino acids. On the other hand,
genes for proteins involved in replication, transcription and translation
were scarce, accounting for only 0.41%. When the COG categories for
the genes belonging to the larger or the smaller groups were compared,
97
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
there was a patent difference of gene frequencies corresponding to
transport-related proteins in the two sets (Figure 2).
Figure 2. Gene frequencies on the 18 COG categories for the two C.
violaceum gene subsets generated by CoA second axis/hydrophobicity
values. Letters on the x-axis denote COG categories.
In order to evaluate the influence of replication associated to
mutational pressures on the amino acid composition of C. violaceum
proteins, values of the relative amino acid usage were compared
between proteins coded by genes on the leading and lagging strands.
There were no significant differences (p<0.0001) between amino acid
usage on both strands (data not shown).
98
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
The mean GC3s values on the leading and lagging strands
were respectively 83.52% and 83.21%, while mean ENc values were
34.45 and 34.40, respectively, again without significant differences.
The codon usage patterns for the two strands are shown in Table 1.
Differences on codon usage were highly significant for only 13 codons:
on the leading strand ACG (coding for threonine) had an increased use
in relation to the lagging strand, whereas 12 codons ending on A or on
U had an increase used in relation to the leading strand. As for the
whole set of codons in the genome, as expected by the C. violaceum
G+C content, there is a preference for codons terminated by C or G on
both strands.
Table 1. Comparison of codon usage on leading and lagging
strands in C. violaceum genome.
AA
Phe
Leu
Ile
Codon
Leading
Lagging
Strand
Strand
N
RSCU
1/1000
N
RSCU
1/1000
UUU
3054
0.266
04.6
3490
0.278
04.7
UUC*
19895
1.734
29.9
21642
1.722
29.4
UUA+
552
0.043
0.80
805
0.057
1.10
UUG
8538
0.671
12.8
9540
0.676
13.0
CUU
1954
0.153
02.9
2263
0.160
03.1
CUC
5668
0.445
08.5
6545
0.464
08.9
CUA
1002
0.079
01.5
1156
0.082
01.6
CUG*
58668
4.609
88.1
64382
4.561
87.4
AUU+
3194
0.325
04.8
3713
0.345
05.0
AUC*
23975
2.439
36.0
26002
2.419
35.3
AUA
2321
0.236
03.5
2532
0.236
03.4
99
Ramos, C.P.S.
AA
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Codon
Leading
Lagging
Strand
Strand
N
RSCU
1/1000
N
RSCU
1/1000
Met
AUG
15915
1.000
23.9
17629
1.000
23.9
Val
GUU
2303
0.206
03.5
2707
0.217
03.7
GUC
13855
1.237
20.8
15463
1.241
21.0
GUA
1771
0.158
02.7
2076
0.167
02.8
GUG*
26855
2.399
40.3
29595
2.375
40.2
UAU
4518
0.539
06.8
4864
0.543
06.6
UAC*
12246
1.461
18.4
13067
1.457
17.7
UAA
497
0.710
00.7
567
0.738
00.8
UAG
276
0.394
00.4
293
0.381
00.4
CAU
5134
0.701
07.7
5680
0.711
07.7
CAC*
9508
1.299
14.3
10305
1.289
14.0
CAA+
5449
0.377
08.2
6425
0.396
08.7
CAG*
23434
1.623
35.2
26022
1.604
35.3
AAU
5090
0.539
07.6
5919
0.559
08.0
AAC*
13807
1.461
20.7
15272
1.441
20.7
AAA+
4892
0.411
07.3
5875
0.445
08.0
AAG*
18909
1.589
28.4
20521
1.555
27.9
GAU
8526
0.472
12.8
9681
0.484
13.1
GAC*
27573
1.528
41.4
30287
1.516
41.1
GAA
14627
0.815
22.0
16081
0.819
21.8
GAG*
21278
1.185
32.0
23206
1.181
31.5
UCU+
1143
0.184
01.7
1411
0.203
01.9
UCC
9923
1.598
14.9
10903
1.570
14.8
UCA
924
0.149
01.4
1005
0.145
01.4
UCG
8702
1.401
13.1
9769
1.407
13.3
CCU
1896
0.228
02.8
2184
0.242
03.0
CCC
8466
1.019
12.7
9057
1.003
12.3
CCA+
1559
0.188
02.3
1827
0.202
02.5
CCG*
21316
2.565
32.0
23036
2.552
31.3
Tyr
Ter
His
Gln
Asn
Lys
Asp
Glu
Ser
Pro
100
Ramos, C.P.S.
AA
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Codon
Leading
Lagging
Strand
Strand
N
RSCU
1/1000
N
RSCU
1/1000
ACU
1443
0.204
02.2
1700
0.219
02.3
ACC*
18153
2.566
27.3
20103
2.586
27.3
ACA+
962
0.136
01.4
1163
0.150
01.6
ACG+
7741
1.094
11.6
8129
1.046
11.0
GCU+
3944
0.192
05.9
4654
0.201
06.3
GCC*
42830
2.087
64.3
48152
2.083
65.4
GCA+
3092
0.151
04.6
3754
0.162
05.1
GCG
32239
1.571
48.4
35910
1.553
48.8
UGU
715
0.207
01.1
759
0.203
01.0
UGC*
6201
1.793
09.3
6737
1.797
09.1
Ter
UGA*
1328
1.896
02.0
1446
1.881
02.0
Trp
UGG
9802
1.000
14.7
10715
1.000
14.5
Arg
CGU+
2679
0.350
04.0
3149
0.377
04.3
CGC*
29117
3.803
43.7
31558
3.776
42.8
CGA
1419
0.185
02.1
1643
0.197
02.2
CGG
9668
1.263
14.5
10217
1.223
13.9
AGU
1137
0.183
01.7
1325
0.191
01.8
AGC*
15437
2.485
23.2
17245
2.484
23.4
AGA+
776
0.101
01.2
1001
0.120
01.4
AGG
2274
0.297
03.4
2572
0.308
03.5
GGU+
2813
0.202
04.2
3444
0.223
04.7
GGC*
45239
3.250
67.9
49856
3.229
67.7
GGA
3085
0.222
04.6
3519
0.228
04.8
GGG
4546
0.327
06.8
4947
0.320
06.7
Thr
Ala
Cys
Ser
Arg
Gly
An asterisk (*) indicates that the codon is more often used by the amino acid on the
leading and lagging strands. A plus (+) represents the 13 codons which presented a
significant difference in face of the strands use (p<0.05). N is the codon frequency
and RSCU is the relative synonymous codon usage. The total number of codons to the
leading strand is 665853 and to the lagging strand 736495. The absence of any
101
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
symbol after a codon indicates that there is no significant difference in usage of that
particular codon on either strand. AA, amino acid.
The relation between GC3s and ENc for the complete C.
violaceum gene set is displayed in Figure 3. GC3s values were inversely
correlated to the differential use of codons (r = -0.836, p<0.0001). The
majority of the genes have Enc values varying from 25 to 45, and GC3s
values between 0.75 and 0.98, reflecting the C. violaceum high GC
content.
Figure 3. Correlation between ENc and GC3s values for all C. violaceum
ORFs. A strong inverse correlation can be observed.
Codon usage bias is frequently related to expression patterns
of the related gene products. Highly expressed proteins have usually a
CBI value > 0.2. Figure 4 displays the codon bias for all C. violaceum
102
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
genes. Most of the genes have CBI values larger than 0.2, suggesting
that also for C. violaceum the most used codons are those found in
highly expressed genes.
Figure 4. Codon bias index in C. violaceum genome. There is a trend
toward CBI values higher than 0.2.
The pairwise analysis of CAI, Fop and CBI indexes showed that
they are closely related to each other.
To investigate if the translational selection has any influence
on C. violaceum codon usage, a CoA between CAI expression values
and the effective number of codons was performed for all 4,407 genes.
CAI and Enc displayed a strong inverse correlation (r = -0.746,
103
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
p<0.0001), as displayed in Figure 5, reflecting the choice for optimal
codons in C. violaceum genome.
.7
.6
.5
.4
.3
CAI
.2
.1
20
30
40
50
60
70
ENc
Figure 5. Correlation between CAI and ENc on RSCU values for all C.
violaceum genes.
When the distribution of synonymous codons along the two
principal CoA axes was examined, it was clear that codons ending in A
or U clustered at the left side of the plane (with the exception of GAA,
coding for glutamine), while those ending in G or C clustered at the
right side (with the exceptions of AGG, UUG and GGG, coding for lysine,
leucine and glycine, respectively) (Figure 6).
104
Ramos, C.P.S.
.8
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
UUA
.6
AAA
ACA
AAG
AAC
UCA
.4
ACU
AUU
AAU
CUA
UCU
AGU
.2
GUA
AUA
GCA
GUU
UAU
CAA
AGA
0.0
UUU
GGU
CUU
GCU
CCA UGUCCU
-.2
GGA
GAU
CGU
AUC
UAC
GAAUCC
GAC
UUC
GUC
AGC
GUG
CAC
GGC
GCC
UCG
CAG
GAG
ACG
CUC
CCG
CGC
CCC
CUG
UGC
CAU
GCG
UUG
-.4
CGA
Axis 2
ACC
-.6
-.8
-3.0
GGG
AGG
CGG
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-.5
0.0
.5
Axis 1
Figure 6. Distribution of codons along the first two main CoA axes for C.
violaceum.
Discussion
Analysis of synonymous codon usage in bacteria have been
restricted to alpha-proteobacteria and this is, to the best of our
knowledge, the first report on such a study in a beta-proteobacterium,
C. violaceum. In the present study, two gene groups were separated by
correspondence analysis of codon usage, in the plane determined by the
first two axes. Lynn et al. (2002) found a strong correlation between
the first CoA axis and the G+C content in GC-rich genomes, like
Mycobacterium tuberculosis and Pseudomonas aeruginosa.
105
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
This is also the case of C. violaceum, as a clear direct
correlation between horizontal axis values and G+C content was
observed for the whole genome. On the other hand, the second axis is
related to protein hydrophobicity, as observed for other bacteria
(Peden, 1999; Banerjee et al., 2004; Gupta et al., 2004; Liu et al.,
2004; Das et al., 2006). These results suggest that the smaller gene
group, generated by the CoA, contains a large proportion of highly
hydrophobic proteins. When the COG categories for a randomly selected
set of genes belonging to both groups were compared, the smaller
group was clearly enriched in genes encoding transport proteins, mostly
for inorganic ions, carbohydrates and amino acids, while the larger
group was richer in soluble proteins related to replication, transcription
and translation processes and to general metabolic functions. Moreover,
also the R category, listed at COG as of general function, but described
at the NCBI as related to transport, is also increased in the smaller
group.
A possible explanation for the existence of this particular
subset of genes may be the composition of C. violaceum cellular wall,
rich in peptidoglycans, that confers a highly stable cell form and
protects the cytoplasm from changes in osmotic pressure. The
petidoglycan is localized in the peri-plasmic space, between the
cytoplasmic membrane and the external membrane. In the peri-plasmic
membranes there is also a set of important proteins either hydrolytic
(phosphatases, nucleases, proteases, etc.) or involved in the binding
106
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
and transport of nutrients, as well as enzymes able to inactivate
antibacterial compounds (Burnett and Schuster, 1982; Nisengard and
Newman, 1994).
The
presence
of
transport
proteins
among
the
most
hydrophobic proteins in the bacterial genome was observed in other
organisms (Peden, 1999). In effect, irrespective of their G+C content
and phylogenetic relationship, bacteria usually display two sets of
proteins, the smaller one constituted mainly of membrane-associated
proteins, and coded by T2- rich and A2-poor codons and, therefore,
more hydrophobic (Das et al., 2005b). However, in C. violaceum
transport proteins constitute a separate group in the correspondence
analysis, clearly separated from the rest of the proteins, what may
reflect a special adaptative mechanism to environmental conditions.
Opposite to what was observed in other bacterial genomes,
the amino acid usage in the two strands in C. violaceum genome does
not differ. Das et al. (2005a) demonstrated that amino acid usage was
influenced by the asymmetric composition of bases in the leading and
lagging
strands
in
two
Bartonella
species.
Borrelia
burgdorferi
(McInerney, 1998) and Treponema pallidum (Lafay et al., 1999)
displayed significant differences in both codon and amino acid usages
when the genes from the two strands were compared, the differences
being originated by strand-specific mutational biases. On the other
hand, the same authors could not demonstrate any influence of
translational selection on the use of synonymous codons in highly
107
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
expressed gene in both species, suggesting that the asymmetric
replication, together with the transcription selection, are probably the
main source of variation of codon usage variation. In fact, DNA
replication is semi-conservative and asymmetric, since one new strand
has an uninterrupted synthesis (the leading strand), while the other is
completed in short consecutive fragments (the lagging strand) (Alberts,
2003).
Brewer (1988) proposed that gene density in a given strand is
the result of a demand to optimize the replication fork speed along the
DNA: highly expressed genes would tend to be positioned over the
leading strand, favoring an increased fork speed and less transcript
loss. An alternative hypothesis states that a selective pressure is
exerted by the conflict of the replication and transcription antagonic
directions, in particular in multigenic operons (Price et al., 2005). Both
hypotheses may be true for Borrelia and Treponema. Also in the
endosymbiotic
bacterium
Blochmannia
floridanus
replication
and
transcription answer for most codon usage variation, while the use of
GC rich codons in highly expressed amino acids and the hydrophobicity
of gene products are the main source of variation in the amino acid use
(Banerjee et al., 2004).
Miranda et al. (2000) analysed the Mycobacterium tuberculosis
and Mycobacterium leprae and saw that they have a very low growth
rate, and translational selection could not be as determinant in their
codon preferences as it is in other fast-growing bacteria. Indeed,
108
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
principal components analysis of codon usage from the set of
homologous genes revealed that the codon choices in M. tuberculosis
and M. leprae are correlated not only with compositional constraints and
translational selection, but also with the degree of amino acid
conservation and the hydrophobicity of the encoded proteins.
Smolka et al. (2003) analyzed the Xylella fastidiosa proteome
and related its very slow growth to the lack of an optimized use of its
tRNAs, evidenced by very low CBI values for most genes.
A previous study of the X. fastidiosa genome from our group
has show that the codon usage on RSCU values on both strands has
differences for 32 codons in 59 codons (data not shown). In a different
way, C. violaceum has only 13 codons differentially used in either the
leading or the lagging strands, 12 of them more frequently used in the
lagging strand. A possible explanation is that, although C. violaceum is
a slow growing bacterium, like X. fastidiosa, it has a codon usage
pattern corresponding to the most abundant tRNAs and, therefore, can
ensure a faster, more effective translation that X. fastidiosa, which has
CBI values below zero for most of their genes (Smolka et al., 2003).
The slow translation rate would force X. fastidiosa to more frequently
transcribe its genes to ensure a proper protein level, what would led to
a conflict between transcription and translation, and hece strand
asymmetry, while this conflict would be avoided by C. violaceum due to
its optimized codon usage.
109
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
The correlation between GC3s and ENc was observed in many
bacterial genomes (Liu et al., 2004; Das et al., 2006). The correlation
for C. violaceum fits well to the expected theoretical curve, particularly
for GC-rich genes displaying a low ENc. Most of the genes fit this curve
and those outside the expected curve are possibly those with low CBI
values, pointing towards heterogeneity in the adaptation of codon
usage.
In many bacterial genomes it was observed that the codon
bias is related to expression patterns (Gouy and Gautier, 1982; Sharp
et al., 1986; Gygi et al., 2000), highly expressed genes having CBI
values > 0.2. Most C. violaceum genes have CBI values > 0.2,
reflecting a co-adaptation between codon usage and tRNA abundance in
order to optimize the efficiency of protein synthesis, as observed in
other bacterial genomes (Moriyama and Powell, 1997; Kanaya et al.,
1999; Duret, 2000). According to Sharp et al. (1993), highly expressed
genes tend to use optimal codons to increase translational accuracy and
efficiency. In C. violaceum, the first axis of RSCU CoA separates codons
in two groups, and the G or C-ending codons group together and are
possibly used in the most expressed genes. Codon optimization can only
be successful if a strong correlation between CAI and ENc exists and
highly expressed genes usually use G or C-ending codons (Fuglsang,
2003; Liu et al., 2004). C. violaceum displays a strong correlation
between CAI and ENc.
110
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
In conclusion, the codon usage pattern in C. violaceum
contrasts to other patterns described for alpha-proteobacteria. This
study demonstrated the existence of a group of genes coding for highly
hydrophobic
proteins
that
may
be
related
to
the
particular
environmental stress faced by the bacterium in river waters and other
water collections. There were no differences in gene distribution or
codon usage among the leading and lagging strands, pointing towards
the absence of a conflict between transcription and replication, possibly
solved by an optimized translation coupled to a very slow replication.
The generalization of these conclusions to other beta-proteobacteria
depends on new studies with this group of prokaryotes.
111
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
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Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Abstract
Biased codon usage may result from various factors. Among
prokaryotes, it appears that the influences of natural selection and
mutational biases are different if the genome is skewed towards AT or
GC. A particular codon subset can often be observed in those genome
regions where a maximized translational efficiency is required. Codon
usage of a β-proteobacterium, Chromobacterium violaceum, is for the
first time reported. The present study was aimed at the identification of
the main cause of codon usage variation in C. violaceum ATCC 12472
genome. Correspondence analysis (CoA) on relative synonymous codon
usage (RSCU) was used to examine the synonymous codon usage
variation among the genes. The results have shown that one of the
major determinants of codon bias trends in C. violaceum is, as
expected, the G+C content. It shows a direct correlation with the first
principal CoA axis. A strong inverse correlation between the effective
number of codons (ENc) and GC3s content was also observed, showing
that the codon usage was affected by gene nucleotide composition.
Hydrophobicity was the second major source of variation and was
significantly correlated to the second principal CoA axis. Axis 1 and 2
separated the genome in two gene groups. The minor group seems to
be formed mostly by transport proteins, reflecting a putative codon
usage bias of these genes. This unusual grouping may reflect the
particular environment in which this bacterium dwells (river water) and
is possibly related to the special features of α-proteobacterial cell walls
and to a proper adaptation to environment variations. Moreover, the
strong negative correlation between CAI and ENc reflected the regular
use of optimal codons among these genes. Amino acid composition does
not have any influence in selecting the codon usage in this organism
and does not affect either Fop or CBI. In contrast to what has been
observed in α-proteobacteria, strand asymmetry does not seem to
influence on amino acid composition or in the number of genes, in the
other hand codon usage may have some influence. The similar
distribution of genes between leading and lagging strands is possibly
due to an optimized translation and a very slow replication, reducing
the expected conflict between transcription and replication. The
generality of these observations among β-proteobacteria will depend on
new studies on this group of microorganisms.
Key-words:
Correspondence
analysis,
strand
asymmetry,
hydrophobicity, transport proteins, adaptation to environment, βproteobacterium.
119
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
7. Conclusões
1. As características encontradas no uso de códons em C. violaceum
contrastam com aquelas observadas em alfa-proteobactérias;
2. O estudo do uso de códons da C. violaceum demostrou a existência
de um conjunto de genes de proteínas transportadoras e parece
estar relacionado com o mecanismo de adaptação da bactéria ao
meio ambiente (água);
3. Não houve distribuição desigual dos genes nas fitas contínua e
descontínua,
o
que
aponta
para
ausência
de
conflito
entre
transcrição e replicação, provavelmente devido a uma tradução
optimizada e a uma replicação muito lenta;
4. A
generalidade
destas
observações
entre
beta-proteobactérias
dependerá de novos estudos com este grupo de microrganismos.
120
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
8. Anexos
121
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
8.1. Instruções para Autores
Revista
Genetics and Molecular Biology
ISSN 1415-4757
Ribeirão Preto, Brasil
Genetics and Molecular Biology (Instructions to authors)
ISSN 1415-4757 (printed version)
ISSN 1678-4685 (online version)
Scope and Policy
Genetics and Molecular Biology (formerly named Revista Brasileira de Genética/Brazilian
Journal of Genetics - ISSN 0100-8455) is published quarterly by the Sociedade Brasileira de Genética
(Brazilian Society of Genetics).
The Journal considers contributions that present the results of original research in genetics,
evolution and related scientific disciplines.
Although Genetics and Molecular Biology is an official publication of the Brazilian Society of
Genetics, contributors are not required to be members of the Society.
It is a fundamental condition that submitted manuscripts have not been and will not be
published elsewhere. With the acceptance of a manuscript for publication, the publishers acquire full and
exclusive copyright for all languages and countries.
Manuscripts considered in conformity with the scope of the journal as judged by the Editor in
conjunction with the Editorial Board are reviewed by the Associate Editors and two or more external
reviewers. Acceptance by the Editor is based on the quality of the work as substantial contribution to the
field and on the overall presentation of the manuscript.
Submission of Papers
1. Manuscripts should be submitted to Fábio de Melo Sene, Editor-in-Chief in the address
below.
2. A submission package sent to the Editorial Office must contain:
a) A cover letter signed by all authors stating that they have approved the submission of the
manuscript and that the findings have not been published or are not under consideration for publication
elsewhere;
b) A copy of the manuscript, including original figures.
c) A copy of any unpublished or in-press companion articles referred to in the submission.
d) A copy of the text, tables and figures on a disk. Be sure that the disk is adequately
protected. Formats for text are Word or RTF, in Windows platform. Images in TIFF or JPEG formats should
be sent in separate files (For Figures, see detailed instructions in 3.1.g). Disk must be labeled with the first
author's last name, platform and software. (See detailed instructions below). Failure to adhere to these
122
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
guidelines can delay the handling of your contribution, and manuscripts may be returned before being
reviewed.
3. Categories of Contribution
3.1. Research Articles
Manuscripts must be written in English in double-spaced, 12-point type throughout, including
the References Cited section, appendices, tables and legends; printed on one side only of A4 paper with 2.5
cm margins; marked with consecutive page numbers, beginning with the cover page. The following
elements must start on a new page and be ordered as they are listed below:
a) The title page must contain: a concise and informative title; the authors' names (first name
at full length); the authors' institutional affiliation, including department, institution, city, state or province
and country; different affiliations indicated with superscript numbers; a short running title of about 35
characters, including spaces; up to five key words; the corresponding author's name, postal address, phone
and fax numbers and email address. The corresponding author is the person responsible for checking the
page proofs, arranging for the payment of color illustrations and author's alteration charges.
b) The Abstract must be a single paragraph that does not exceed 200 words and summarizes
the main results and conclusions of the study. It should not contain references.
c) The text must be as succinct as possible. Text citations: articles should be referred to by
authors' surnames and date of publication; citations with two authors must include both names; in citations
with three or more authors, name the first author and use "et al". Only articles that are published or in
press should be cited. In the case of personal communications or unpublished results, all contributors must
be listed by initials and last name ("et al" should not be used). Numbers: In the text, numbers nine or less
must be written out except as part of a date, a fraction or decimal, a percentage, or a unit of measurement.
Use Arabic numerals for numbers larger than nine. Avoid starting a sentence with a number. Binomial
Names: Latin names of genera, species and intraspecific taxa in the text must be printed in italics; names of
orders and families should be in the Title.
The text includes the following elements:
Introduction - Description of the background that led to the study.
Material (or Subjects) and Methods - Details relevant to the conduct of the study. Statistical
methods should be explained at the end of this section.
Results - Undue repetition in text and tables should be avoided. Comment on significance of
results is appropriate but broader discussion should be part of the Discussion section.
Discussion - The findings of the study should be placed in context of relevant published data.
Ideas presented in other publications should not be discussed solely to make an exhaustive presentation.
Some manuscripts may require different formats appropriate to their content.
d) The Acknowledgments must be a single paragraph that immediately follows the discussion
and includes references to grant support.
e) The References Section: citations must be ordered alphabetically by the first author; only
articles that are published or in press should be included; personal communications must be cited within the
text; journal titles must be abbreviated according to Medline (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/jrbrowser
.cgi).
Sample journal article citation:
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at different stages of larval development. Chromosoma 7:371-386.
Bertollo LAC, Takahashi CS and Moreira-Filho O (1978) Cytotaxonomic consideration on
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Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
Salzano FM and Freire-Maia N (1967) Populações Brasileiras. Companhia Editora Nacional and
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de Rhyncosciara. Ciênc e Cult 25 (suppl): 248. XXV Reunião Anual da SBPC, Rio de Janeiro, Brazil.
Sample Thesis/Dissertation citation:
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Sample Electronic Database citation:
Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM
f) Tables each table must start on a new page. A concise title should be provided above the
table. Tables must be numbered consecutively in Arabic numerals. Each column must have a title in the box
head. Footnotes typed directly below the table should be indicated in lowercase superscript numbers.
g) Figures must be numbered consecutively in Arabic numerals. Legends should be typed on a
separate sheet. A set of original illustrations of the highest quality must be provided in glossy paper. If you
have created figures electronically submit them also as hard copies. Scanned figures should not be
submitted. Images should be in TIFF or JPEG format and provided in separate files. Figures in Word format
cannot be published. Journal quality reproduction will require grayscale and color at resolution yielding 300
dpi. Authors should submit bitmapped line art at resolution yielding 600-1200 dpi. These resolutions refer to
the output size of the file; if it is anticipated that images will be enlarged or reduced, the resolutions should
be adjusted accordingly. Identify each illustration by affixing on the back a label containing: the number of
the figure, the name of the first author and an arrow indicating top of illustration. Illustrations supplied on
disks must follow instructions in item 2 (Submission package). Color illustration can be accepted, but
authors are asked to defray the cost. For costs of color figures, check with the Editorial Office.
h) Nomenclature: current standard international nomenclature should be adhered to.
i) Sequences may appear in text or in figure. DNA, RNA and protein sequences equal to or
greater than 50 units must be entered into public databases. The accession number must be provided and
released to the general public together with publication of the article. Long sequences requiring more than
two pages to reproduce will not be published unless the Editorial decision is that the publication is
necessary. Complete mtDNA sequence will not be published.
j) Data access: reference should be made to availability of detailed data and materials used
for reported studies.
k) Ethical issues: Reports of experiments on live vertebrates must include a brief statement
that the work was approved by the institutional review board. For experiments involving human subjects,
authors must also include a statement that informed consent was obtained from all subjects. If photos or
any other identifiable data are included, a copy of the signed consent must accompany the manuscript.
3.2 Short Communications present brief observations that do not warrant full-length articles.
They should not be considered preliminary communications. They should be 15 or fewer typed pages in
double spaced 12-point type, including literature cited. They should include an Abstract no longer than five
124
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
percent of the paper's length and no further subdivision with introduction, material and methods, results
and discussion in a single section. Up to two tables and two figures may be submitted. The title page and
reference section format is that of full-length article.
3.3 Letters to the Editor relate or respond to recent published items in the journal.
Discussions of political, social and ethical issues of interest to geneticists are also welcome in this form.
3.4 Review Articles are welcome.
3.5 Book Reviews: publishers are invited to submit books on Genetics, Evolution and related
disciplines, for review in the journal. Aspiring reviewers may propose writing a review.
3.6 History, Story and Memories: accounts on historical aspects of Genetics relating to Brazil.
4. Proofs: Page proofs will be sent to the corresponding author. Changes made to page
proofs, apart from printer's errors, will be charged to the authors. Notes added in proof require Editorial
approval.
5. Reprints are free of charge and provided as a pdf-file. [email protected]
© 2002-2004 Sociedade Brasileira de Genética
125
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
8.2. Instruções para Autores
Revista
Genetics and Molecular Research
ISSN 1676-5680
Ribeirão Preto, Brasil
Genetics and Molecular Research (Instructions to authors)
ISSN 1676-5680 (online version)
Genetics and Molecular Research (GMR) publishes research articles, research reports,
technical notes, scientific commentaries, news, views, and review articles on Genetics, Evolution and
Molecular Biology. It is an exclusively online journal.
Genetics and Molecular Research is maintained by a not-for-profit scientific foundation
Ribeirão Preto Foundation for Scientific Research (FUNPEC-RP). There has been no institutional support for
publication since 2003, so we are obliged to recover part of the costs of publishing. The Journal will bill
authors for all "papers" accepted and submitted after February 1, 2005. The cost per accepted submission
will be R$500.00 for Brazilian authors and US$250.00 for authors outside Brazil. This fee covers part of the
expenses for language and technical revision, and for page setup, for publishing online in pdf and html.
Authors of all papers are expected to pay "page charges", which will be billed to the author for
correspondence at the time the galley proofs of the paper are sent. Payment, both from within or outside
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and significance, and the research reported should make substantial advances. As a journal serving a wide
and varied scientific community, article abstracts, introductions and conclusions should be accessible to the
non-specialist, stressing any wider implications of the work. However the papers should not compromise on
the scientific rigor and detail demanded by an international research journal. The broad readership that GMR
126
Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
attracts gives authors an opportunity to convey to a wider audience, as well as to specialists, the
importance of their work.
Contributions should be sent either by e-mail as attachments to [email protected], or on
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14020-260 Ribeirao Preto, SP
BRAZIL
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manuscript will be considered officially received when the corrected version is ready to be sent to the
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1991.
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Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
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and reports and should be arranged in one paragraph. The following information (without headings) should
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Illustrations. Illustrations/figures (photographs, drawings, diagrams, and charts) should
each be in a single file, numbered in one consecutive series of Arabic numerals in the order in which they
are cited in the text. Illustrations must be submitted as separate files. All illustrations are to be supplied in
JPEG (jpg) format in either color or black and white. Images must be saved as separate, stand-alone files.
The image resolution should be 300 dpi. Do not embed images within the text file. The placing of graphics in
the paper should be indicated in the text and should include the captions for the figures. The authors should
also send, by mail, a printed version of the figures. These should be at least 10 x 15 cm, up to size A4, so
that figures can be scanned to guarantee good quality for publishing online.
Reference style: References in the text should include the name of the author and the year
in parentheses, e.g. (Searle, 1961) or (King and Wilson, 1975). When a reference with more than two
authors is cited, only the first author is named, e.g. (Comstock et al., 1958). The references must be cited,
in the text, in chronological order, e.g., (Ideber, 2001; Uetz, 2002; Ottavai, 2004). References to
“unpublished results” and “submitted papers” should appear in the text in parentheses following the
individual name(s). Example: (Pereira KS, Martins PK and Silva TM, unpublished results).
Abbreviations: Try to use abbreviations sparingly. When used extensively, provide a list of
all nonstandard abbreviations on a separate page before the reference section. Use the metric system for all
measurements without periods (cm, mL, s). Define all symbols used in equations and formulas. Do not
abbreviate the word “Figure” or “Table” in titles or text.
Acknowledgments: All acknowledgments (including those for grant and financial support)
should be typed in one paragraph directly preceding the reference section. Authors of manuscripts
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Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
submitted to GMR are requested to state the source of all funding that enabled the described research to be
undertaken.
Bibliography: The bibliography should include only works referred to in the text. It should be
arranged in alphabetical order under the first author’s last name. References should be cited as follows:
journal papers - names and initials of the four first authors (after that use et al.), year, full title, journal
abbreviated according to Index Medicus, volume number, first and last page numbers; books - names of
authors, year, full title, edition, publishers, address (city, state and country); articles published in symposia
- names of authors, year, full title of book, name(s) of editor(s) in parentheses, publisher, address (city,
state and country), first and last page numbers.
Examples of Bibliographic style:
Journal article
Searle SR (1961). Variance components in the unbalanced 2-way nested design. Ann. Math.
Statist. 32: 1161-1166.
Comstock RE, Kellcher T and Morrow EB (1959). Genetic variation in an asexual species, the
garden strawberry. Genetics 43: 634-646.
Book
Mather K (1949). Biometrical Genetics. 1st edn. Methuen, London, England.
Chapter in book
Rhoades MM (1968). Studies on the cytological basis of crossing over. In: Replication and
Recombination of Genetic Material (Peacock WJ and Brock RD, eds.). Australian Academy of Science,
Canberra, Australia, pp. 229-241.
Thesis abstracts
Thesis abstracts should be submitted in English and in the original language (if the author is
not a native speaker). Bibliographic data (original title, year, institution, address, number of pages and
major (orienting) professor) should be included.
Authors using GMR may view, reproduce or store copies of the Journal providing the
information is not used for profit purposes.
Copies of this Journal, in whole or in part, must include the copyright notice.
Any use of this Journal in whole or in part should include the customary bibliographic citation,
including author attribution, date, article title, Genetics and Molecular Research, and the URL
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and Molecular Research.
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Ramos, C.P.S.
Análise de códons sinônimos em Chromobacterium violaceum
9. Apêndice - Classificação filogenética de proteínas codificadas
em genomas completos (Clusters of Orthologous Groups-COGs).
COG
Domínios
Descrição
J
6449
Tradução, estrutura ribossomal e biogênese
K
5438
Transcrição
L
5337
Replicação do DNA, recombinação e reparo
D
842
O
3165
Divisão celular e particionamento do cromossomo
Modificação pós-traducional, turnover de proteínas,
chaperones
M
4079
Biogênese do envelope celular, fora da membrana
N
3110
Mobilidade celular e secreção
P
5112
Transporte e metabolismo de íons inorgânicos
T
3627
Mecanismos de transdução de sinal
C
5594
Produção e conversão de energia
G
5262
Transporte e metabolismo de carboidratos
E
8383
Transporte e metabolismo de aminoácidos
F
2364
Transporte e metabolismo de nucleotídeos
H
4057
Metabolismo de coenzimas
I
2609
Metabolismo de lipídeos
Q
2754
Biossíntese de metabólitos secundários, transporte e
catabolismo
R
11948
S
6416
Apenas predição de função geral
Função desconhecida
Fonte: (www.ncbi.nlm.nih.gov/COG)
130