Área de Ciências da Saúde – Curso de Farmácia
Disciplina: Biotecnologia Farmacêutica
Professora: Dra. Juliana C. Schmidt
TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
Organismos geneticamente modificados são aqueles que receberam gene ou genes de outros organismos
ou que tiveram alguma modificação em algum gene específico, passando, então, a expressarem uma nova
característica. Essa modificação genética é realizada por introdução de dna no organismo específico de diversas
formas:
A conjugação é um dos tipos de recombinação microbiana com vistas a aumentar a variabilidade
genética pela transferência do plasmídeo de uma célula à outra, após contato célula a célula através de
uma ponte de conjugação (pilli).
A transdução consiste na transferência, por meio de um vetor viral, de uma seqüência de DNA entre
células bacterianas.
A transfecção consiste na infecção de uma célula hospedeira por DNA ou RNA viral.
A microinjeção consiste na introdução de DNA, RNA, enzimas ou agentes citotóxicos em um tecido ou
com célula o auxílio de uma agulha, monitorada ao microscópio.
A biobalística é técnica para produzir células transformadas, na qual o DNA é aderido a esferas de
tungstênio ou ouro que são impelidas para perfurar um tecido-alvo.
O termo Transgênese é utilizado para se referir a introdução de um gene exógeno em células animais ou
vegetais. A Transformação é a introdução de moléculas de DNA em uma célula hospedeira (bactérias e células
eucarióticas, incluindo células vegetais e animais).
Várias técnicas têm sido descritas para a introdução de DNA em células bacterianas, como choque térmico
e eletroporação.
a)
Choque térmico: as células hospedeiras (preparadas com cloreto de cálcio) são misturadas com
moléculas de DNA e submetidas a um choque térmico que resulta num aumento da eficiência da
transformação. Os mecanismos envolvidos na transformação de DNA não são completamente
conhecidos. Mas os requerimentos essenciais para uma transformação eficiente são a presença
de cátions multi-valentes, incubação a 0°C e controle rigoroso do choque térmico a 42°C. A
proporção de células que se tornam “competentes” para transformação é de aproximadamente
10% da população total. Eficiência: 105 - 106 colônias transformadas/µg de DNA plasmidial.
b)
Eletroporação: é um processo físico que transitoriamente permeabiliza membranas de células
procarióticas e eucarióticas a partir de um pulso elétrico. Eficiência: 109 - 1010 colônias
transformadas/µg de DNA plasmidial. A eletroporação é feita a baixa temperatura (0-4°C), pois a
eficiência é reduzida em cerca de 100 vezes à temperatura ambiente.
O processo de transformação constitui um evento de alta importância na técnica de manipulação gênica. A
transformação natural descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro. No
entanto, em 1970, Mandel e Higa encontraram que a E.coli tornou-se marcadamente competente para
transformação com DNA exógeno, quando a bactéria foi suspensa em cloreto de cálcio gelado e submetida a um
curto choque térmico à 42oC. Estes mesmos autores também verificaram que as bactérias crescidas até a fase log
eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estágios do crescimento.
O procedimento do cloreto de cálcio que é usado até hoje produz uma eficiência de transformação da
ordem de 105 a 107 transformantes por micrograma de DNA (a eficiência de transformação é geralmente expressa
como o número de células transformadas, obtido a partir de um micrograma de DNA plasmidial intacto).
O tamanho e a conformação da molécula do DNA, afetam o processo de transformação. Plasmídeos
pequenos são mais facilmente incorporados pela célula bacteriana competente; DNA linear é pobremente
incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradação pelas enxonucleases presentes no espaço periplasmático.
Mecanismos de captação do DNA
O mecanismo de captação da molécula do DNA pela bactéria competente ainda é desconhecido. Uma
hipótese é que as moléculas do DNA passam através de canais situados nas chamadas zonas de adesão, que são
locais onde a membrana interna e externa da célula bacteriana unem-se formando poros. Estes poros só estão
presentes durante o crescimento bacteriano (fase de crescimento exponencial).
Em condições naturais, a captação do DNA torna-se difícil devido a repulsão eletrostática existente entre as
cargas negativas da camada de fosfolipídeos da membrana bacteriana e dos grupos fosfato da molécula do DNA.
O papel do cálcio é explicado pela hipótese de que a 0oC a fluidez da membrana celular é cristalizada,
estabilizando a distribuição dos fosfatos carregados. Os íons Ca
+2
formam um complexo com este grupamento,
cobrindo as cargas negativas e assim facilitando a atração eletrostática com as moléculas do DNA na zona de
adesão. O choque térmico, complementa este processo de captação, provavelmente criando um desbalanço
térmico entre o interior e o exterior da célula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA através da zona de
adesão. A figura a seguir ilustra este processo.
DNA genômico
-
Zona de adesão
-
-
-
-
-
-
- -
-
Bicamada lipídica
(interna)
- - - -- - Plasmídeo
- - - -
Camada peptido
glucan
Bicamada lipídica
(externa)
Fosfolipídeos
Íon de cálcio
-
-
-
Célula
Bacteriana
-
-
-
-
-
-
--
Mecanismo molecular proposto para explicar a transformação de E. coli com uma molécula de DNA exógeno.
TRANSFORMAÇÃO DE E.coli COM pGLO
VETOR DE EXPRESSÃO pGLO
GFP
Beta Lactamase resistência à Ampicilina
Green Fluorescent Protein (GFP) gene da água
viva Aequorea victoria
Proteína reguladora araC Regula a transcrição de
GFP
Betalactamase
Ampicillin
Resistanc
e
ALGUMAS APLICAÇÕES NA ÁREA DA SAÚDE
Terapia gênica por transfecção de células retiradas do próprio paciente com retrovírus, ou outros tipos de
vírus, com o intuito de repor um gene mutante ou para o tratamento de doenças multi-fatoriais como câncer e
doenças cardíacas. A primeira terapia gênica realizada para substituir um gene mutante único, iniciada em
1990, foi a terapia para a deficiência da adenosina desaminase (ADA), a qual consiste em implantar linfócitos
T transfectados com retrovírus expressando a proteína ausente nos portadores desta doença.
Produção de produtos para uso terapêutico, como por exemplo hormônios, fatores de coagulação, entre
outros.
Produção de antígenos específicos para uso em vacinas de subunidades ou para uso em kits para
imunodiagnóstico.
Área de Ciências da Saúde – Curso de Farmácia
Disciplina: Biotecnologia Farmacêutica
Professora: Dra. Juliana C. Schmidt
TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE BACTÉRIAS
OBJETIVO
Promover a transformação bacteriana da cepa HB101 de Escherichia coli com o plasmídeo pGLO.
MATERIAIS
Solução contendo o plasmídeo pGLO (preparada na
hora)
-
placas contendo colônias da cepa HB101 de
Escherichia coli
-
Solução de CaCl2 50mM pH6.1
-
micropipetas de 2-20µL e 20-200µL
-
meio líquido LB e placas de petri com meio LA
-
ponteiras de 200µL
-
Água ultrapura estéril
-
Banho Maria a 42°C
-
Microtubos de 2mL estéreis
-
Isopor com gelo picado
-
Alças bacteriológicas estéreis
-
Câmara UV
-
Cabine de segurança biológica
-
Estufa bacteriológica a 37°C
PROCEDIMENTO
1.
Manter a cultura por aproximadamente 30 minutos em banho de gelo;
2.
Coletar 1mL da cultura, transferir para um microtubo estéril e centrifugar a 6000rpm por 1 minuto;
3.
Descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 500µL de CaCl2 0,1M e centrifugar a 6000rpm por 1 minuto;
4.
Descartar o sobrenadante e ressuspender em 20µL de CaCl2 0,1M e adicionar mais 9µL de glicerol (30%);
5.
Adicionar 4µL da solução contendo o plasmídeo pGLO e incubar em banho de gelo por 30 minutos;
6.
Colocar os tubos no banho-maria a 42°C por 1 minuto e depois devolve-los rapidamente ao gelo, e incubar por mais 2
minutos;
7.
8.
Adicionar 200µL de meio LB líquido a cada tubo e incubar a 37’C por 30 minutos;
Distribuir o conteúdo de cada tubo conforme esquema a seguir, 100µL por placa, e incubar em estufa a 37°C ;
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TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE BACTÉRIAS
Relatório de aula prática – Data:____/____/____ - Turma:____
Nota:
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QUESTÕES
1) Qual a finalidade de se utilizar Ampicilina em algumas placas de petri?
2) Se algumas bactérias foram transformadas geneticamente, em quais placas elas poderão ser observadas? Por
que?
3) Caso ocorra crescimento bacteriano na placa LB/ampicilina em que foi semeada HB101 sem pGLO, como posso
interpretar esse resultado?