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UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ
Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais
Fabrieli Tatiane Lusa
POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE Plinia trunciflora
(JABUTICABA) IN VITRO E EM MODELO DE DANO RENAL
INDUZIDO POR CLORETO DE MERCÚRIO EM ROEDORES
Chapecó-SC, 2014.
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UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ
Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais
POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE Plinia trunciflora
(JABUTICABA) IN VITRO E EM MODELO DE DANO RENAL
INDUZIDO POR CLORETO DE MERCÚRIO EM ROEDORES
Fabrieli Tatiane Lusa
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
da
Universidade
Comunitária da Região de Chapecó,
como parte dos pré-requisitos para
obtenção do título de Mestre em
Ciências Ambientais.
Orientadora: Profª. Drª. Greicy M. M.
Conterato.
Co-orientador: Prof. Dr. Jacir Dal
Magro.
Chapecó-SC, setembro, 2014.
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"A batalha mais difícil de ser travada ocorre no teu
mundo íntimo. Ninguém a vê, a aplaude ou a censura.
É tua. Vitória ou derrota pertencerá a ti em silêncio.”
Joanna de Ângelis
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AGRADECIMENTOS
Em dois anos muitos fatos são passíveis de acontecimento. E acontecem! Alguns nos trazem
felicidade, outros nos obrigam a crescer e evoluir e até mesmo, repensar nossas decisões.
Alguns são fáceis de explicar e outros, por enquanto, ficam sem resposta. O importante de
tudo, é que apesar de qualquer acontecimento, ao voltar para casa, sempre encontrei o apoio e
incentivo para que tudo saísse da melhor maneira, por isso, não tenho palavras para agradecer
minha família e nela estão inclusos nossos cães, Bibbo, Bob Tob e Fred e gatos, Narcisa,
Bolinha e Lelo, por simplesmente tudo, por suportarem meus “pitis” nesses últimos meses,
por ficarem sem os passeios diários, pela ausência... Juntos, somos fortes!
À Dra. Elis Fernanda Archer, por estar nos meus plantões e cuidar dos meus pacientes.
Sempre soube que estariam em ótimas mãos! Mais, pelo incentivo, pela confiança, por sair
sempre em minha defesa. Amigas como você são raras!
À professora Greicy Conterato, minha orientadora, a quem muito devo, por não medir
esforços para a finalização da dissertação. Obrigada por me ensinar tanto em tão pouco
tempo! Quando crescer, quero ser como você!
Ao professor Jacir Dal Magro, meu primeiro orientador, que apesar de suas atividades, jamais
deixou de me atender e auxiliar, desde a elaboração do pré-projeto para a prova do mestrado
até hoje. Tenho muito a lhe agradecer, por confiar a mim um projeto tão importante e por
todas as oportunidades que me foram proporcionadas.
Às professoras Arlene Renk, Silvana Winckler, Gilza Franco e Elaine Gonsales, por todo o
conhecimento compartilhado, pela descontração nas aulas e principalmente por não medirem
esforços para tornar cada um melhor.
À professora Leila Zanatta, pelo auxílio na qualificação do projeto. Também quero ser como
você, quando crescer!
Ao professor Angelo Piato, “orientador de coração”, pelo tempo destinado a mim e minhas
dúvidas, por todos os artigos, sempre enviados “beeemmm” cedo e o mais importante, pelo
incentivo.
Ao professor Denis Rosemberg, que sempre teve uma palavra de apoio. Aprendi muito com
você!
À professora Cristiane Dalla Corte, por todo auxílio na qualificação da dissertação. Muito
obrigada!!!
À professora Sônia da Luz e à mestranda Emily Waczuk (que certamente já será mestre), do
Departamento de Patologia/UFSM, pela colaboração e dedicação com o projeto.
Ao professor Adriano Toni Ramos e equipe (UFSC), pela contribuição nas análises
histológicas.
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À mestranda Cátia Capeletto, quem muito me auxiliou com a metodologia dos testes
antioxidantes.
Aos alunos de iniciação científica Mayara Schäfer Copini, Andrigo Lorenzoni e Rafael
Chitolina, pelo envolvimento com esse trabalho, auxiliando-me em tantos momentos e até
mesmo, ensinando-me técnicas que desconhecia.
Às funcionárias do Biotério da Unochapecó, Silvia Zanini e Siluana Lunardi, por serem meus
olhos com o cuidado dos animais, quando lá não estava. Esse trabalho teria sido mais difícil
sem a dedicação de vocês! Ainda, pelas conversas, conselhos e incentivo.
À Luciana Lunelli, “mãe” de todos os mestrandos, sempre envolvida e dedicada com todas as
nossas dúvidas e aflições. Obrigada por sempre me ouvir, pelos conselhos e por todo o apoio.
Sou-lhe muito grata!
À minha amiga Lucile Francescato, quem providenciou os livros indicados para a prova e
com quem “choro e ouço as pitangas” nos corredores.
À Michele Guarnieri, pela dedicação em me ajudar com as imagens das jabuticabeiras e por
todo apoio.
À mestranda Fernanda Kuhn, que no dia da prova já sabia que seríamos aprovadas e seria
minha amiga. Muito obrigada pela ajuda com uma grande parte desse trabalho, a elaboração
do extrato. Mais que isso, pelas conversas, por sempre me ouvir e incentivar. Tenho muita
admiração por você!!!
À Cassia Lopes Sacchet, minha segunda amiga mestre, que mesmo chegando mais tarde,
tornou-se imediatamente uma grande amiga. Obrigada por sempre sair em minha defesa, por
confiar em mim e principalmente, por estar sempre pronta a ouvir e aconselhar. Admiro-a
muito!
Ao mestrando Juliano Brustolin, por quem tenho profunda admiração, pelo ser humano que é,
pela sua determinação, que com seu bom humor tornava tudo muito divertido, era sentar ao
seu lado e as aulas se transformavam na “aula do Chaves”. Obrigada por confiar que eu seria
capaz de auxiliar em seu projeto! Sentirei saudade da convivência...
Por fim, mas não menos importante, a cada animalzinho que fez parte desse trabalho. Espero
tê-los tratado da maneira mais humana possível e que eu não tenha provocado-lhes
sofrimento.
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RESUMO
Lusa, Fabrieli Tatiane. Potencial antioxidante de extratos de Plinia trunciflora in vitro e em
modelo de dano renal induzido por cloreto de mercúrio em roedores. Universidade
Comunitária da Região de Chapecó – UNOCHAPECÓ, 2014.82p.
Plinia trunciflora (O. Berg) Kausel pertence à família Mirtaceae, cujas espécies vegetais são
amplamente utilizadas pela medicina popular brasileira para o tratamento de enfermidades
respiratórias, gastrintestinais e circulatórias. Entre as espécies conhecidas como “jabuticaba”,
a P. trunciflora permanece com a composição e efeitos biológicos ainda pouco estudados. O
objetivo geral deste trabalho foi caracterizar a fitoquímica e avaliar a atividade antioxidante
de extratos de Plinia trunciflora in vitro e seu efeito protetor em modelo de dano renal
induzido pelo cloreto de mercúrio (HgCl2) em ratos. Inicialmente, foi avaliada a composição
de antocianinas por HPLC-DAD, seguido do potencial antioxidante in vitro e a toxicidade
oral aguda do extrato etanólico das cascas de P. trunciflora (EEPT). Para isso, camundongos
machos, Swiss, receberam quatro doses crescentes (5 a 2.000 mg/kg) do extrato, por via oral
(VO) e foram mantidos em observação durante 7 e 15 dias. Após esse período, os animais
foram eutanasiados e o sangue e os tecidos (baço, rins e fígado) foram coletados para análises.
A caracterização e a quantificação de antocianinas revelaram que a cianidina (~32%), a
cianidina -3-O-glicosídeo (~29%) e a malvidina-3-O-glicosideo (~22%) foram as antocianinas
majoritárias, seguidas pela malvidina (~13%) e delfinidina-3-O-glicosídeo (3,9%). O estudo
mostrou que o EEPT não foi tóxico até a dose máxima administrada, não ocorrendo óbitos,
nem alteração em parâmetros de toxicidade (peso dos órgãos, peso corporal, índice peso do
órgão/peso corporal, quantidade de excretas, consumo de água e alimentos, parâmetros
hematológicos e comportamentais). Além disso, a atividade antioxidante in vitro de EEPT
apresentou poder antioxidante pelo teste do poder redutor de ferro (FRAP), bem como
atividade scavenger de radicais livres (DPPH, hidroxil e superóxido), efeitos que
provavelmente estejam relacionados aos compostos bioativos quantificados nesse extrato
(2095,83 ± 18,09 mg de equivalente de ácido gálico/100 g de extrato seco e 449,87 ± 12,75
mg de equivalente de cianidina 3-O-glucosídeo/100g extrato seco, respectivamente). Em
nosso segundo estudo foi avaliado o efeito protetor do extrato aquoso de frutos de Plinia
trunciflora (EAPT) em modelo de nefrotoxicidade aguda induzida por HgCl2 em ratos.
Assim, ratos machos, Wistar, adultos foram previamente tratados com EAPT (0, 200 e
800mg/kg), VO. Seis horas depois, receberam 5 mg/kg de HgCl2 por via subcutânea (s.c) e
após 12 horas, foram eutanasiados para a coleta do sangue e dos rins. Nossos resultados
mostraram que a maior dose de EAPT (800 mg/kg) protegeu parcialmente contra a
peroxidação lipídica, bem como restabeleceu parcialmente a atividade das enzimas
antioxidantes no rim de ratos expostos ao Hg. EAPT também atenuou as alterações
histopatológicas renais causadas pelo Hg. No entanto, não preveniu a inibição da enzima δaminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) renal, nem as alterações nos marcadores de função
renal (creatinina e uréia) induzidas pelo Hg. Em geral, nossos resultados indicam que a P.
trunciflora apresenta potencial antioxidante in vitro e in vivo e pode prover proteção contra a
nefrotoxicidade induzida pelo Hg em populações expostas.
Palavras-chaves:
nefrotoxicidade
compostos
bioativos;
Mirtaceae;
jabuticaba;
metais
pesados
7
ABSTRACT
Lusa, Fabrieli Tatiane. Antioxidant activity of extracts of Plinia trunciflora in vitro and in
renal damage induced by mercuric chloride in rodent model. Universidade Comunitária da
Região de Chapecó – UNOCHAPECÓ, 2014.82p.
Plinia trunciflora (O. Berg) Kausel belongs to Myrtaceae family, which species are widely
used in Brazilian folk medicine for the treatment of respiratory, gastrointestinal and
circulatory diseases. Among the species known as "jaboticaba", P. trunciflora remains with
the composition and biological effects still poorly studied. The aim of this study was to
characterize the fitochemistry and to evaluate the antioxidant activity of Plinia trunciflora
extracts in vitro and its protective effect in renal damage induced by mercuric chloride
(HgCl2) in rats. Initially, it was evaluated the anthocyanin composition by HPLC-DAD,
followed by the in vitro antioxidant potential and acute oral toxicity of the ethanolic extract of
P. trunciflora (EEPT) peels. To reach this goal, male adult mice, Swiss, received orally four
increasing doses (5 to 2,000 mg/kg) of the extract and were kept under observation for 7 and
15 days. After this period, the animals were euthanized and blood and tissues (spleen, kidneys
and liver) were collected for analysis. The characterization and quantification of
anthocyaninas revealed that the cyanidin (~32%), cyanidin-3-O-glucoside (~29%), malvidin 3-O-glucoside (~22%) were the major anthocyanin, followed by the malvidin (~13%) and
delphinidin-3-O-glucoside. The study showed that EEPT was not toxic until the highest dose
and no death or change occurred in the toxicity parameters (organ weights, body weight,
organ weight /body weight index, amount of excreta, food and water consumption,
hematological and behavioral parameters). Moreover, the in vitro antioxidant activity of
EEPT showed reducing power by the ferric reducing antioxidant assay (FRAP) and free
radical scavenging activity (DPPH, superoxide and hydroxyl radicals), which effects are
probably related to the bioactive compounds quantified in the extract (2095.83 ± 18.09 mg
gallic acid equivalent/100 g dry extract and 449.87 ± 12.75 mg equivalent of cyanidin 3-Oglucoside/100g dry extract, respectively). The other paper evaluated the protective effect of
aqueous extract of Plinia trunciflora (EAPT) in HgCl2-induced acute nephrotoxicity in rats.
Thus, male adult rats, Wistar, were orally pretreated with EAPT (200, 400 and 800 mg/kg) by
gavage. Six hours later, they received subcutanously (s.c.) 5 mg/kg HgCl 2 and after 12 hours,
were euthanized for collection of blood and kidneys. Our results showed that the highest dose
of EAPT (800 mg/kg) partially protected against lipid peroxidation, and partially recovered
the antioxidant enzyme activities in Hg-exposed rat kidneys. EAPT also attenuated the
histopathological alterations caused by Hg. However, it did not prevent the δ-aminolevulinate
dehydratase (δ-ALA-D) activity inhibition or renal function biomarkers changes (creatinine
and urea) induced by Hg. Overall, our results indicate that P. trunciflora presents antioxidant
potential in vitro and in vivo and may provide protection against Hg- induced nephrotoxicity
in exposed populations.
Keywords: bioactive compounds; Myrtaceae; jaboticaba; heavy metals; nephrotoxicity.
8
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1
Ação das enzimas antioxidantes sobre EROs ...................................................
19
Figura 2
Estrutura química de antocianinas ....................................................................
20
Figura 3
Principais grupos de compostos antioxidantes presentes nas plantas .............. 22
Figura 4
Envolvimento do estresse oxidativo em enfermidades .....................................
24
Figura 5
Jabuticabeira com flores e frutos em diferentes estágios de maturação ...........
26
Figura 6
Jabuticaba. a) polpa esbranquiçada; b) mostra da casca, com a retirada da
polpa, evidenciando as duas sementes presentes .............................................. 27
MANUSCRITO 1
Figure 1
Representative high performance liquid chromatography profile of standards
and Plinia trunciflora extract. Cyanidin chloride (peak 1), malvidin chloride
(peak 2), delphinidin 3-0-glucoside chloride (peak 3), cyanidin 3-0-glucoside
chloride (peak 4) and malvidin 3-0-glucoside chloride (peak 5) …………….. 52
Figure 2
In vitro antioxidant activity of EEPT. A, Ferric reducing antioxidant power
(FRAP). B, DPPH scavenging assay. C, Hydroxil scavenging assay. D,
Superoxide scavenging assay measured by the epinephrine oxidation method
in alkaline pH. Results represent the mean (±S.E.M). n=3 in each assay for
each concentration. *†‡§: Symbols above the bars indicate statistical
difference in comparison with the control (mixture assay without extract).
Bars with different symbols indicate results statistically different.
ANOVA/Tukey (p<0.05) ........……………………………………………….. 53
MANUSCRITO 2
Figure 1
δ-Aminolevulinate dehydratase activity (δ-ALA-D; A), non-protein thiol
groups (SHNP; B) and thiobarbituric acid reactive substances levels
(TBARS; C) in kidneys of rats treated with PT (0, 200 and 800 mg/kg by
gavage) followed by mercuric chloride (5 mg/kg, subcutaneous. Data are
expressed as means ± S.E.M. (n=6-8). Different letters on the bars indicate
statistically different results (p < 0.05, ANOVA/Tukey or Kruskal-Wallis
ANOVA). C: control group (without PT or HgCl2); PT0: HgCl2 group;
PT200: PT (200 mg/kg) + HgCl2; PT800: PT (800 mg/kg) + HgCl2 ………… 77
9
Figure 2
Antioxidant enzyme activity in rat kidneys treated with PT (0, 200 and 800
mg/kg by gavage) followed by mercuric chloride (5 mg/kg, subcutaneous).
(A) Superoxide dismutase (SOD), (B) catalase (CAT), (C) glutathione
peroxidase (GPx) and (D) glutathione s-transferase (GST). Data are
expressed as means ± S.E.M. (n=6-8). Different letters on the bars indicate
statistically different results (p < 0.05), by Kruskal-Wallis ANOVA or
ANOVA/Tukey. C: control group (without PT or HgCl2); PT0: HgCl2 group;
PT200: PT (200 mg/kg) + HgCl2; PT800: PT (800 mg/kg) + HgCl2 ………... 78
Figure 3
Urea (A), creatinine (B) in rat kidneys treated with PT (0, 200 and 800
mg/kg by gavage) followed by mercuric chloride (5 mg/kg, subcutaneous).
Data are expressed as means ± S.E.M. (n = 6–8). *Different from the
respective control group, i.e. without PT or HgCl2 (p < 0.05,
ANOVA/Tukey). C: control group (without PT or HgCl2); PT0: HgCl2
group; PT200: PT (200 mg/kg) + HgCl2; PT800: PT (800 mg/kg) + HgCl2 … 79
Figure 4
Representative histology (A-D) and tubular damage score of renal tissue of
rats. Magnification was 40 X. (A) C: control group, (B) PT0: Hg treated
group, (C) PT200: PT 200 mg/kg + HgCl2 and (D) PT800: PT 800 mg/kg +
HgCl2. In (E) n=8 for C group and n=6 for other groups. *Different letters on
the bars represent results significantly different (p < 0.05, ANOVA/Tukey).
In (A): Presence of preserved architecture and regular epithelial cells. In (B),
there is a large amount of degenerated tubules with lacy cytoplasm and some
necrotic tubules, with picnotic nucleus (dark and small) and eosinophilic
cytoplasm. Presence of loose cells into the tubules. In (C), we can see
degenerated tubules presenting cells with lacy appearance, some necrotic
cells with picnotic nucleus and eosinophilic cytoplasm with loss of tubular
cells. In (D), there are still degenerated tubules with cells with lacy
appearance, but rare necrotic cells with picnotic nucleus and and eosinophilic
cytoplasm, with loss of tubular cells ………..................................................... 80
10
LISTA DE TABELAS
MANUSCRITO 1
Table 1
Phenolics and flavonoids composition of Plinia trunciflora extract …….
Table 2
Data obtained for body weight, organ weight and organ to body weight
index after oral daily administration of EEPT (n = 5) during 7 or 15 days
(mean ± SD) ...……………………………………………………………. 54
Table 3
Hematological parameters obtained from the whole blood of mice after
daily administration EEPT (n = 5) during 7 or 15 days …...……………... 56
51
11
LISTA DE QUADROS
Quadro 1
Fontes endógenas e exógenas de radicais livres ........................................... 17
Quadro 2
Fontes de antocianinas .................................................................................
21
12
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT
Alanina aminotransferase
AST
Aspartato aminotransferase
CAT
Catalase
COX
Cicloxigenase
DA
Doença de Alzheimer
DL50
Dose letal 50
DNA
Ácido desoxirribonucléico
EEPT
Extrato etanólico de Plinia trunciflora
ERMOs
Espécies reativas do metabolismo do oxigênio
EROs
Espécies reativas de oxigênio
ERN
Espécies reativas de nitrogênio
GAE
Ácido gálico equivalente
GPx
Glutationa peroxidase
GR
Glutationa-redutase
GSH
Glutationa
GSSG
Glutationa oxidada
GST
Glutationa S-transferase
LDH
Lactato desidrogenase
NO•
Óxido nítrico
O21
Oxigênio singlet
O2-•
Radical superóxido
•
OH
Radical hidroxila
NADPH
Dinucleotideo de nicotinamida e adenina
NO2
Dióxido de nitrogênio
RL
Radical livre
SHNP
Tióis não proteicos
SOD
Superóxido dismutase
SODCuZn
Superóxido dismutase-cobre-zinco
SODMn
Superóxido dismutase-manganês
TBARS
Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
δ-ALA-D
δ-aminolevulinato desidratase
13
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ........................................................................................................
13
2
OBJETIVOS...............................................................................................................
15
2.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................................
15
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .....................................................................................
15
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................
16
3
3.1 SPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO: AÇÃO NO ORGANISMO ......................... 16
3.2 SISTEMAS DE DEFESAS ANTIOXIDANTES.......................................................
18
3.2.1 Defesas antioxidantes enzimáticas ...................................................................
18
3.2.2 Defesas antioxidantes não -enzimáticas ............................................................
19
3.3 ESTRESSE OXIDATIVO E SEU ENVOLVIMENTO EM PATOLOGIAS
HUMANAS................................................................................................................. 23
3.4 PLANTAS MEDICINAIS..........................................................................................
25
3.5 JABUTICABA ...........................................................................................................
26
3.5.1 Descrição botânica ..........................................................................................
26
3.5.2 Composição fitoquímica e atividades biológicas..............................................
28
3.6 MERCÚRIO ...............................................................................................................
29
3.6.1 Aspectos gerais: ocorrência, formas química e propriedades ...........................
29
3.6.2 Fontes de exposição e usos ...............................................................................
30
3.6.3 Toxicocinética e toxicodinâmica .......................................................................
31
3.6.4 Nefrotoxicidade do Hg ......................................................................................
33
4
REFERÊNCIAS DA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................
34
5
MATERIAIS E MÉTODOS, RESULTADOS E DISCUSSÕES .........................
45
5.1 MANUSCRITO 1 .....................................................................................................
46
5.1.1 Evaluation of in vitro antioxidant activity and acute oral toxicity of an
ethanolic extract of jabuticaba (Plinia trunciflora) in mice ………………………... 47
5.2 MANUSCRITO 2 ......................................................................................................
61
5.2.1 Effect of the aqueous extract of Plinia trunciflora (jaboticaba) on the renal
function impairment and oxidative stress induced by mercury chloride in rats …….. 62
6
CONCLUSÕES .......................................................................................................... 81
7
PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 82
14
1 INTRODUÇÃO
Embora alguns radicais livres (RLs) tenham contribuição fundamental para a
manutenção do organismo (RAHMAN, 2007) e sejam produzidos naturalmente, através de
disfunções biológicas (BARREIROS; DAVID, 2006), evidências os indicam como os
responsáveis pelo envelhecimento e enfermidades associadas a esse processo (ANGELO;
JORGE, 2007). Devido à sua contínua produção, o organismo desenvolveu mecanismos para
se defender dos danos provocados por tais moléculas (LIOCHEV, 2013), os quais são
denominados sistemas de defesa antioxidante.
Antioxidantes podem ser definidos como substâncias com a capacidade de inibir ou
atrasar as lesões provocadas pelos RLs presentes no organismo através de um mecanismo
redox do sistema de defesa antioxidante enzimático, como as enzimas superóxido dismutase,
catalase e glutationa peroxidase (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2000; SOUSA et al., 2007).
Substâncias obtidas através da dieta também apresentam potencial antioxidante, como as
vitaminas C e E e alguns minerais (zinco, selênio e magnésio) (BARBOSA et al., 2010).
Muitos frutos, especialmente aqueles com coloração mais escura, possuem compostos
bioativos como os compostos fenólicos (SCHRECKINGER et al., 2010), que tem atividade
antioxidante e atuam na prevenção de diversas enfermidades (WU et al., 2012), despertando o
interesse das indústrias alimentícia e farmacêutica, na tentativa de obter produtos com a
capcidade de aumentar as defesas do organismo contra os radicais livres e seus danos.
Na área farmacêutica, as plantas medicinais, continuam sendo de grande relevância,
uma vez que suas substâncias ativas são utilizadas como matérias-primas para a obtenção de
fármacos (SHENKEL et al., 2001).
Baseado nesse exposto, sabe-se que o Brasil possui a maior cobertura de florestas
tropicais e dentre os frutos silvestres comestíveis brasileiros, destaca-se a jabuticaba
(CASAGRANDE JR et al., 2000), que apresenta um considerável teor de flavonóides (uma
das classes dos compostos fenólicos), compostos que vêm sendo estudados devido aos seus
efeitos farmacológicos (CAZAROLLI et al., 2008). Alguns estudos já identificaram
antocianinas (pertencente à classe dos flavonóides) no fruto, as quais possuem potencial de
atuar na redução do estresse oxidativo e prevenção de algumas desordens inflamatórias,
dentre outras (BRITO et al., 2007; LEITE-LEGATTI et al., 2012).
Estudos têm sido desenvolvidos na tentativa de demonstrar a capacidade de espécies
vegetais em proteger o organismo dos danos promovidos pelo estresse oxidativo. Esse por sua
vez, além de estar envolvido em diversas doenças humanas, também pode estar relacionado
15
aos efeitos prejudiciais decorrentes da exposição a elementos tóxicos, como os metais
pesados. Entre esses, pode-se citar o mercúrio (Hg), metal ainda utilizado em equipamentos
eletrônicos e tintas, além das amálgamas odontológicas (compostas por 50% do metal),
lâmpadas e termômetros (VANDEVEN; MCGINNIS, 2005). Portanto, no presente trabalho,
buscou-se caracterizar as atividades biológicas de diferentes extratos de Plinia trunciflora,
avaliando sua atividade antioxidante in vitro e seu efeito protetor em modelo de
nefrotoxicidade aguda induzida por cloreto de mercúrio em ratos.
16
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar as atividades antioxidante e nefroprotetora de diferentes extratos obtidos
dos frutos de jabuticaba (Plinia trunciflora) em modelos in vitro e in vivo.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Realizar a caracterização fitoquímica do extrato etanólico das cascas de Plinia
trunciflora.

Avaliar a atividade antioxidante do extrato etanólico das cascas de Plinia
trunciflora in vitro;

Realizar a avaliação toxicológica aguda do extrato etanólico das cascas de
Plinia trunciflora em camundongos;

Avaliar a atividade antioxidante e o efeito protetor do extrato aquoso dos frutos
de Plinia trunciflora em modelo de nefrotoxicidade aguda induzida por HgCl2
em ratos.
17
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO: AÇÃO NO ORGANISMO
O evento conhecido como “paradoxo do oxigênio”, refere-se a situação que, mesmo
sendo essencial para a vida aeróbia, o oxigênio (O2) pode se tornar tóxico em algumas
situações (GILBERT, 2000), promovendo a geração de radicais livres (RLs).
Radical livre (RL) pode ser definido como todo átomo ou molécula que possui, em sua
última camada eletrônica, um número ímpar de elétrons (HALLIWELL; GUTTERIDGE,
2000). Trata-se de moléculas extremamente instáveis, com meia-vida muito curta e
quimicamente muito reativas (BIANCHI; ANTUNES, 1999). Atualmente se utiliza a
denominação espécies reativas de oxigênio (EROs) para se referir àqueles radicais do
oxigênio que possuem a última camada com elétrons desemparelhados (HALLIWELL et al.,
1995).
Entre os principais RLs e EROs, são encontrados:

Radical superóxido (O2•-): considerado o radical mais abundante na célula
(BOVERIS,
1998),
produzido
principalmente
nas
mitocôndrias
pelo
desacoplamente da cadeia respiratória, pela ação de células fagocitárias como
neutrófilos, monócitos e macrófagos (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2000).

Peróxido de hidrogênio (H2O2): considerado uma ERO, com capacidade para gerar
o radical hidroxil (•OH), quando na presença de metais de transição como o cobre
(Cu) e o ferro (Fe), possuindo meia vida relativamente longa nos sistemas
biológicos. Devido ao seu potencial gerador de radical •OH, é considerado muito
tóxico para as células (GARCEZ et al., 2004).

Radical hidroxil (•OH): é o mais reativo nos sistemas biológicos, uma vez que o
organismo não dispõe de meios de defesa enzimática contra esse radical
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2000). A reatividade elevada lhe confere a
capacidade de provocar mutação no DNA, inativar proteínas e de iniciar a
peroxidação lipídica, tendo por isso, meia vida curtíssima nas células
(HALIWELL et a., 1995; GARCEZ et al., 2004).

Oxigênio singlet (O21): não possui a última camada desemparelhada. Provoca
danos às proteínas por oxidar grupos essenciais de aminoácidos, incluindo o
18
triptofano, a metionina, a histidina e até os resíduos de cisteína (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2000).
Há, também, radicais que possuem nitrogênio, e são denominadas espécies reativas
do nitrogênio (ERN), sendo o óxido nítrico (NO•) a principal entre elas. O NO• atua como
molécula sinalizadora em processos fisiológicos como regulação da pressão sanguínea e
sistema imune, (FRIDOVICH, 1999; GARCEZ et al., 2004). Além disso, pode ser convertido
em dióxido de nitrogênio (NO2), outra ERN, aumentando os danos inflamatórios (GARCEZ
et al., 2004).
Os RLs podem ser encontrados em todos os sistemas biológicos (CAVALCANTE;
BRUIN, 2009), tanto por fontes endógenas como exógenas, conforme exemplificadas no
quadro 1.
Quadro 1: Fontes endógenas e exógenas de radicais livres
Endógenas
Exógenas
Respiração aeróbica
Ozônio
Inflamações
Radiações
Peroxissomos
Medicamentos
Enzimas do citocromo P450
Dieta
Cigarro
Fonte: Adaptado de Bianchi, Antunes (1999).
Quando produzidos de maneira controlada ou em baixas concentrações, apresentam
efeitos benéficos, participando de processos fisiológicos do organismo (FRIDOVICH, 1999)
como produção de energia, ativação de genes (SHAMI; MOREIRA, 2004), defesa contra
microorganismos invasores (OKTYABRSKY; SMIRNOVA, 2007), síntese de hormônios e
enzimas (RAJENDRASOZHAN et al., 2008).
Por outro lado, é sabido que os RLs, bem como outros oxidantes estão envolvidos na
gênese de diversas enfermidades que acometem o organismo, como neoplasias, desordens
cardiovasculares e cerebrais, doenças degenerativas, declínio do sistema imune e
envelhecimento (SOUSA et al., 2007). Além de doenças, estão envolvidos nos mecanismos
de toxicidade de uma série de xenobióticos, incluindo os metais tóxicos. Independentemente
do tipo de agressão ao organismo que leva ao aumento da produção de espécies reativas, elas
19
podem ter como alvos proteínas, carboidratos, lipídeos e também o DNA (EVANS;
DIZDAROGLU; COOKE, 2004). Por outro lado, para prevenir os danos provocados pelos
RLs, o organismo dispõe de defesas antioxidantes, incluindo enzimas e moléculas não
enzimáticas.
3.2 SISTEMAS DE DEFESAS ANTIOXIDANTES
Antioxidante é toda substância que presente em baixas concentrações, quando
comparada a do substrato oxidável, é capaz de prevenir, inibir ou atrasar a oxidação deste
substrato ou regenerá-lo (HALLIWELL et al., 1995; BIANCHI; ANTUNES, 1999). Nesse
contexto, as células apresentam compostos antioxidantes, com mecanismos de defesa
enzimático e não enzimático (FERRARI, 2012).
3.2.1 Defesas antioxidantes enzimáticas
Consiste em sistemas celulares constituídos por enzimas como a superóxido dismutase
(SOD), catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx). Essas atuam na remoção de EROs
antes que oxidantes causem a lesão celular (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2000).
A SOD apresenta como função a dismutação do ânion O2•- a H2O2 e oxigênio. Possui
duas isoformas importantes, a SOD-manganês (SodMn), que reside na mitocôndria e a SODcobre-zinco (SodCuZn), encontrada principalmente no citoplasma e no ambiente extracelular
(HITCHON; EL GABALAWY, 2004).
A CAT localiza-se na matriz do peroxissoma, onde degrada o H2O2 em água e
oxigênio, enquanto o H2O2 produzido no citoplasma e membrana citoplasmática é degradado
pela GPx (FRITZ et al., 2007). A GPx se apresenta nas formas dependente e independente de
selênio, estando no citoplasma ou na mitocôndria (GREEN; BRAND; MURPHY, 2004). A
remoção do H2O2 pela GPx envolve a oxidação da glutationa (GSH) a glutationa oxidada
(GSSG), a qual é posteriormente regenerada à sua forma reduzida (GSH) pela enzima
glutationa redutase (GR) e sua coenzima NADPH.
A GPx também contribui para os
processos de reparação das lesões provocadas pelos radicais livres (BORELLA; VARELLA,
2004). Na figura 1, observa-se a remoção das EROs pelas defesas antioxidantes enzimáticas.
20
Figura 1: Ação das enzimas antioxidantes sobre EROs.
Fonte: Adaptado de Ferrari, 2012.
3.2.2 Defesas antioxidantes não-enzimáticas
A glutationa reduzida (GSH) (CAVALCANTE; BRUIN, 2009), um tripeptídeo
formado por glutamato, cisteína e glicina, atua como o principal antioxidante endógeno,
eliminando os produtos da peroxidação lipídica (HALLIWELL et al., 1995). Em reações
envolvendo a GPx, atua como doadora de elétrons, transformando-se na forma oxidada
(GSSG) e sendo posteriormente reduzida pela GR, com auxílio da coenzima NADPH que
serve como doador de elétrons na reação (figura 1) (SPADA; SILVA, 2004). O local de nova
síntese ocorre no fígado, quando aproximadamente 90% da GSH circulante é transferida para
o plasma e musculatura esquelética (SUN et al., 2010). É o antioxidante endógeno mais
importante, presente em três reservatórios na célula, estando a maior parte no citosol,
enquanto quantidades menores são encontradas nas mitocôndrias e retículo endoplasmático.
Em avaliações do dano oxidativo em tecidos e órgãos, a quantidade de GSH tecidual é
comumente quantificada como níveis de grupos tióis não proteicos (SHNP), uma vez que
esses tióis são majoritariamente representados pela GSH em diferentes tecidos, mas
principalmente no fígado e rim (ELLMAN, 1959).
Também integram essas defesas compostos como as vitaminas (ácido ascórbico, αtocoferol e β-caroteno), minerais (zinco, selênio e magnésio) (BARBOSA et al., 2010), além
21
de fitoquímicos como os compostos fenólicos e os carotenóides (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2000).
Muitos compostos antioxidantes podem ser consumidos através da dieta alimentar
(SOUSA et al., 2007), especialmente com a ingestão de frutos, que de acordo com Oliveira e
colaboradores (2006), possuem valor nutricional e terapêutico relacionado à presença de
compostos bioativos, considerados compostos não nutricionais, presente em quantidades
pequenas nos alimentos (PATIL et al., 2009). Esses compostos bioativos são metabólitos
secundários produzidos pelos vegetais com funções diversas tais como crescimento e
reprodução, atuando também como agentes antipatogênicos e contribuindo na sua
pigmentação, adstringência e aroma. Entre eles destacam-se os compostos fenólicos
(SCHRECKINGER et al., 2010), como os flavonóides (ANGELO; JORGE, 2007), cujos
efeitos benéficos são descritos na prevenção de desordens cardiovasculares, ação antiinflamatória, capacidade de inibir as enzimas produtoras de EROs, como a lipoxogenase e
cicloxigenase (COX).
As antocianinas (figura 2), compostos pertencentes à classe dos flavonóides
(MALACRIDA; MOTTA, 2005), são responsáveis pela coloração das plantas (frutos, flores,
folhas e caules), variando de tons de vermelho a azul (LEITE et al., 2011) e até mesmo
ocorrendo a fusão de dois tons, conferindo-lhe aspecto de roxo-preto (COSTA et al., 2013).
Além do potencial antioxidante, também são atribuídas às antocianinas, as atividades antiinflamatória
e
quimioprotetora,
reduzindo
o
risco
de
desordens
neurológicas,
cardiovasculares, diabetes, cânceres e ainda, potencial hepatoprotetor (STINTZING; CARLE,
2004; DU et al., 2008).
Figura 2: Estrutura química de antocianinas.
Fonte: Bobbio, Bobbio, 2003.
22
As propriedades biológicas das antocianinas são atribuídas ao seu potencial de reagir
com RLs (atividade antioxidante) e embora seus mecanismos antioxidantes não estejam
estabelecidos, acredita-se que essa atividade se deva a quelação de metais ou doação de
hidrogênio aos RLs, interrompendo a reação em cadeia de oxidação, convertendo-os em
produtos estáveis (DA COSTA; HORTON; MARGOLIS, 2000; MELO et al., 2008).
Embora as antocianinas estejam largamente distribuídas na natureza, encontram-se
poucas fontes que possam ser utilizadas pelas indústrias farmacêutica, alimentícia e
cosmética, como podem ser vistos exemplos no quadro 2:
Quadro 2: Fontes de antocianinas.
Antocianina
Fonte
Cianidina 3-O-glicosídeo
Uva, cereja, jambolão,
morango, amora, maçã.
Delfinidina 3,5-diglicosídeo
Berinjela, feijão, uva,
romã.
Malvidina 3-glicosídeo
Uva, vinho.
Pelargonidina 3-glicosídeo
Morango, tamarindo.
Peonidina 3-glicosídeo
Uva, cereja, jabuticaba.
Petunidina 3-glicosídeo
Uva,
feijão,
mirtilo,
laranja.
Fonte: Malacrida, Motta (2006).
Os carotenóides representam um grupo de pigmentos presentes em plantas, algas,
fungos, bactérias e alguns animais, sendo responsáveis pelas pigmentações compreendidas
entre o amarelo e vermelho (UENOJO; MARÓSTICA JUNIOR; PASTORE, 2007). São
conhecidos como precursores da vitamina A, tendo entre eles o β-caroteno, α-caroteno,
luteína e licopeno (GOMES, 2007). Apresentam atividade antioxidante, reagindo com o O21,
protegendo as células dos danos provocados pelas espécies reativas (SHAMI; MOREIRA,
2004). Ainda, atuam na prevenção de doenças associdas pelo estresse oxidativo como retardo
do envelhecimento, degeneração macular (RIBEIRO; SERAVALLI, 2004), redução do risco
de câncer (próstata e pulmão) e doenças cardiovasculares como aterosclerose (GOMES,
2007).
23
A figura 3 apresenta um resumo dos principais grupos de compostos antioxidantes
presentes em vegetais.
Figura 3: Principais grupos de compostos antioxidantes presentes nas plantas.
Fonte: Adaptado de Ferreira, Abreu (2007).
A vitamina C (ácido ascórbico) apresenta atividade antioxidante contra RLs que
tenham sido gerados em meio hidrofílico (BARBOSA et al., 2010). Quando na presença de
metais de transição, como o ferro, essa vitamina pode atuar como pró-oxidante, com a
capacidade de produzir •OH e H2O2 (BIANCHI; ANTUNES,1999). Além de ser um agente
redutor, participa de processos de cicatrização, estimula o sistema imunológico e auxilia na
redução da progressão da aterosclerose (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2000).
A atividade antioxidante da vitamina E está relacionada com sua capacidade para atuar
contra os radicais livres, impedindo que promovam danos nas membranas biológicas
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2000; BIANCHI; ANTUNES, 1999). Atua em interação
com a vitamina C, inibindo a peroxidação lipídica e conferindo proteção contra os danos
oxidativos que atingem o DNA (BIANCHI; ANTUNES, 1999). Ainda, previne enfermidades
associadas ao estresse oxidativo, como desordens neurológicas, tumores e inflamação crônica
(BRIGELIUS-FLOHÉ et al., 2002).
24
3.3 ESTRESSE OXIDATIVO
PATOLOGIAS HUMANAS
E
SEU
ENVOLVIMENTO
EM
O desequilíbrio gerado entre a produção de EROs e as defesas antioxidantes é
conhecido como estresse oxidativo. Esse processo ocorre quando a capacidade antioxidante é
insuficiente para controlar a produção dos agentes oxidantes (ATASHAK et al., 2014). Pode
ser classificado como leve, quando os tecidos são expostos de maneira constante; moderado,
proveniente do estresse provocado por fontes externas, como a radiação; e intenso, resultando
em dano permanente (FLOYD, 1997).
Em uma situação de desequilíbrio, as macromoléculas biológicas como ácidos
nucleicos, lipídeos e proteínas são afetadas, resultando em danos (figura 4) que promovem a
interrupção das suas funções (OZATA et al., 2002). As proteínas são afetadas, por exemplo,
pelo ataque do radical •OH, modificando a estrutura de seus aminoácidos componentes,
preferencialmente na cisteína, triptofano, histidina e metionina. Essas modificações podem ser
irreversíveis, e possivelmente levarão à perda da atividade enzimática, dificuldades no
transporte através das membranas celulares e, em última instância, à morte celular
(BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; HATEM et al., 2014). A oxidação dos lipídeos pode
propiciar o seu acumulo nas paredes dos vasos arteriais e venosos, facilitando o surgimento de
enfermidades cardiovasculares como aterosclerose, infartos e até mesmo, acidente vascular
cerebral (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). Além disso, o ataque de RL aos lipídeos de
membranas pode causar uma reação em cadeia de formação RL denominada de peroxidação
lipídica. Esse processo conduz a transtornos de permeabilidade da membrana celular,
causando uma sequência de lesões às biomoléculas celulares, incluindo o DNA
(NORDBERG; ARNÉR; 2001). Os danos mais graves acometem o DNA e RNA, os quais se
manifestam principalmente pelo ataque do radical •OH, com consequente quebra das suas
cadeias, mutações e possivelmente, o desenvolvimento de neoplasias (BARREIROS;
DAVID; DAVID, 2006).
As EROs também exercem papel fundamental no processo de envelhecimento, uma
vez que a capacidade para responder ao estresse provocado por sua geração é reduzido com a
idade (YU; CHUNG, 2006). Com o passar do tempo, as enfermidades relacionadas a esse
processo surgem, entre elas a doença de Alzheimer (DA) e Parkinson. O envolvimento do
estresse oxidativo está ligado à formação de RLs e inflamação que ocorre na DA (ZHI-YOU;
YONG, 2007), pois o encéfalo consome quantidades consideráveis de oxigênio, ocasionando
a formação excessiva de radical O2.- e H2O2, que se sobrepõe às defesas antioxidantes
25
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2000). Na doença de Parkinson, onde há degeneração dos
neurônios da substância negra, é possível encontrar níveis elevados de ferro total, que
possivelmente propicia a geração de RLs (SALVADOR et al., 2004).
Outra enfermidade relacionada ao estresse oxidativo consiste na diabetes, que mesmo
sem ter a importância dos RLs totalmente esclarecida para sua ocorrência, ensaios in vivo
sugerem que a hiperglicemia desempenha papel fundamental para a geração do desequilíbrio
entre oxidantes e antioxidantes. Além da geração de EROs, como o H2O2, é também
observada a redução na capacidade antioxidante, incluindo as vitaminas C e E, bem como o
tripeptídeo GSH (SALVADOR et al., 2004).
Tendo em vista buscar alternativas para reduzir os danos provocados pelo estresse
oxidativo e até mesmo combatê-lo, pesquisas envolvendo plantas medicinais têm sido
intensificadas, buscando aliar seu conteúdo antioxidante, proveniente dos seus compostos
bioativos, ao seu potencial terapêutico.
Coração
Olhos
Hipertensão, choque,
aterosclerose
Catarata,
disfunções retinianas
Outros órgãos
Estresse
oxidativo
Cérebro
Neoplasia,
inflamação, diabete,
lesão hepática,
doença pulmonar
obstrutiva crônica
Alzheimer, Parkinson,
acidente vascular cerebral
Rins
Insuficiência renal,
glomerulonefrite
Figura 4: Envolvimento do estresse oxidativo em enfermidades.
Fonte: Adaptado de Rao et al, 2011.
26
3.4 PLANTAS MEDICINAIS
O ser humano utiliza os vegetais há milhares de anos para o tratamento dos males que
o acometem (COSENZA, 2010). No Brasil, o uso das plantas medicinais tem seu maior
destaque entre a população de baixa renda, bem como aquela residente no meio rural,
principalmente onde há dificuldade para o acesso aos serviços médicos (RODRIGUES,
CARVALHO, 2001; BESSA et al., 2013).
Muitas espécies vegetais vêm sendo estudadas quanto ao seu potencial terapêutico,
utilizando como base a sua capacidade em reduzir o estresse oxidativo e prevenir ou tratar as
enfermidades onde o mesmo está envolvido. Nesse contexto, efeitos benéficos tais como a
redução dos níveis de lipídeos plasmáticos, a melhora da resistência à insulina e os efeitos
antioxidantes têm sido descritos em modelos de animais hipercolesterolêmicos ou obesos para
a polpa do fruto de açaí (Euterpe oleraceae Martius), suco de berinjela (Solanum melongena)
e para as cascas de jabuticaba (Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg) (RIBEIRO et al., 1998;
SILVA et al., 2011; LENQUISTE et al., 2012).
Além da avaliação do potencial para prevenir e/ou tratar enfermidades humanas cuja
fisiopatologia envolve o estresse oxidativo, muitos estudos têm demonstrado efeitos
protetores de espécies vegetais em modelos de toxicidade induzidos por agentes tóxicos como
os metais pesados. Sener et al. (2007) demonstrou o efeito protetor do Ginkgo biloba contra
os danos oxidativos induzidos pelo cloreto de mercúrio (HgCl2) no encéfalo, pulmões, fígado
e rins de ratos. Além disso, preveniu o aumento de marcadores bioquímicos séricos de dano
tecidual, tais como as enzimas alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase
(AST) e lactato desidrogenase (LDH). Efeitos protetores contra a nefrotoxicidade induzida
pelo HgCl2 em roedores foram demonstrados para os extratos dos frutos de Tribulus terrestris
(Linn.), das sementes de Eruca sativa, bem como para o extrato de Juglans sinensis Dode,
uma planta medicinal oriental (AHN et al., 2002; KAVITHA; JAGADEESAN; 2006;
SARWAR et al., 2006). Plantas medicinais como Ocimum sanctum, Ginkgo biloba e Tribulus
terrestris
(Linn.)
também
demonstraram
proteção
contra
a
hepatotoxicidade
e
cardiotoxicidade induzidas pelo HgCl2 em roedores (SHARMA et al., 2002; JAGADEESAN;
KAVITHA; 2006; TUNALI-AKBAY et al., 2007).
De forma muito interessante, os efeitos protetores de plantas medicinais tanto em
patologias quanto em modelos de toxicidade induzidos por agentes tóxicos parecem estar
relacionados à sua habilidade em prevenir danos oxidativos às biomoléculas. Essa ação
27
antioxidante por sua vez, parece ser devido à atividade dos compostos bioativos presentes nos
extratos vegetais dos estudos acima citados.
3.5 JABUTICABA
3.5.1Descrição botânica
A jabuticaba é uma espécie vegetal da Mata Atlântica brasileira, pertencente à família
Myrtaceae, (COSTA et al., 2013), podendo ser encontradas do Pará ao Rio Grande do Sul,
porém os locais de maiores produções são os estados da região sudeste (CITADIN;
DANNER; SASSO, 2010). Além da sua dispersão pelas regiões brasileiras, as jabuticabeiras
(figura 5) também se encontram em países como Argentina, Bolívia, Paraguai, Peru e Uruguai
(ASCHERI; ASCHERI; CARVALHO, 2006).
Figura 5: Jabuticabeira com flores e frutos em diferentes estágios de maturação.
Fonte: Autora.
A jabuticabeira possui frutos com baga globosa, coloração roxo-escura, quase preta
quando maduros, com casca grossa e lisa, polpa esbranquiçada a translúcida, mucilaginosa,
contendo de 1 a 4 sementes (figura 6) (PEREIRA, 2003; LIMA et al., 2008). Esses frutos,
assim como suas flores de coloração branca, surgem no tronco e nos principais galhos da
28
árvore (REYNERTSON et al., 2006; ARAÚJO, 2011). O período para o amadurecimento dos
seus frutos está compreendido entre 40-60 dias (WU; LONG; KENNELLY, 2013).
a
b
Figura 6: Jabuticaba. a) polpa esbranquiçada; b) mostra da casca, com a retirada da polpa,
evidenciando as duas sementes presentes.
Fonte: Autora.
Por possuírem elevado teor de açúcares na polpa (ASCHERI; ASCHERI;
CARVALHO, 2006), as jabuticabas são consumidas tanto in natura, como em preparações na
forma de geleias, licores, sucos, sorvetes e vinhos. Na medicina popular brasileira, a casca é
utilizada como adstringente, com indicação em casos de doença inflamatória do intestino,
diarreia, asma (REYNERTSON et al., 2006; LIMA et al., 2008) e estados hemorrágicos.
Além da casca, folhas e frutos também são utilizados para os tratamentos (CRUZ; KAPLAN,
2004).
É válido salientar que ocorreu uma proposta de alteração na nomenclatura do gênero
Myrciaria, sendo esta feita por Sobral (1985), uma vez que o autor utiliza como argumentos
as características encontradas na planta, como as sementes com cotilédones separados, sendo
característica em Plinia, enquanto que em Myrciaria estes geralmente estão unidos. Outro
fator considerado são as inflorescências congestas e caulifloras, também características de
Plinia.
Este trabalho teve como enfoque a utilização de Plinia trunciflora (O. Berg.) Kausel,
que apresenta os sinônimos Plinia peruviana (Poir.) Govaerts (SOBRAL, 1985), Myrciaria
trunciflora O. Berg. Myrciaria peruviana (Poir.) Mattos e Eugenia cauliflora O. Berg.
(ANGELY, 1970; ZULOAGA et al., 2008).
29
3.5.2 Composição fitoquímica e atividades biológicas
Assim como ocorre com outros frutos de coloração escura, a jabuticaba é considerada
uma importante fonte de compostos fenólicos, os quais possuem dentre outras atividades, a
antioxidante (WU et al., 2012). Esses compostos estão em quantidades significativas tanto na
casca como nos frutos inteiros (ROSA et al., 2010). De Assis e colaboradores (2009)
encontraram na espécie Myrciaria cauliflora, 460,80 mg de compostos fenólicos/100g do
fruto. Por sua vez, Leite-Legatti e colaboradores (2012) obtiveram um total de 556,3g GAE
de compostos fenólicos em pó liofilizado de Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg.
Na sua composição há também antocianinas, com teor de cerca de 314mg/100g do
fruto, encontradas na espécie Myrciaria cauliflora, valor alto quando comparado com frutos
reconhecidos por apresentarem esses flavonóides como a amora (292mg/100g), a uva
(227mg/100g) e os cultivares de mirtilo (292mg/100g) (TERCI, 2004). Teixeira e outros
(2008), obtiveram valores de antocianinas compreendidos entre 492,74mg e 641mg/100g de
casca da Myrciaria jaboticaba. Essas variações podem ter origem nas condições e locais de
cultivo bem como nos métodos de extração, análise e fração estudada (TEIXEIRA, 2011).
Em estudo realizado por Rufino e colaboradores (2011) que também utilizaram a Myrciaria
cauliflora, foi possível obter um total de 58,1mg de antocianinas/100g de jabuticaba.
Cinco antocianinas já foram identificadas nos frutos de Myrciaria cauliflora sendo
elas a peonidina, peonidina-3-O-glicosídeo, cianidina-3-O-glicosídeo, delfinidina-3-Oglicosídeo e pyranocyanin B (WU; LONG; KENNELLY, 2013).
Lima e colaboradores
(2011) mostraram que a cianidina-3-O-glicosídeo é a principal antocianina na casca das
espécies Myrciaria cauliflora e Myrciaria jaboticaba, estando a delfinidina-3-O-glicosídeo
em segundo lugar. Abe e colaboradores (2012) detectaram a cianidina como a principal
antocianina da Myrciaria jaboticaba.
Estudos demonstram que devido a sua composição fitoquímica, a jabuticaba tem
demonstrado potenciais efeitos protetores em diversas enfermidades. Nesse contexto, um
estudo demonstrou que o vinho de jabuticaba apresentou maior potencial inibidor da oxidação
quando comparado ao vinho de uva, apresentando efeitos benéficos na regeneração de vasos
arteriais lesionados (BARROS et al., 2010). Leite-Legatti e colaboradores (2012),
identificaram efeitos anti-proliferativos in vitro e in vivo do liofilizado da casca de Myrciaria
jaboticaba (Vell.) Berg. O mesmo estudo também demonstrou que essa espécie vegetal não
exerceu atividade citotóxica, nem mutagenicidade em células da medula óssea de
camundongos. Dragano et al. (2013) demonstraram que o liofilizado da casca de Myrciaria
30
jaboticaba (Vell.) Berg influenciou na melhora da resistência à insulina, bem como protegeu
contra o ganho de peso em camundongos submetidos a um modelo de obesidade. De forma
semelhante, foram observados, em ratos obesos, que receberam o liofilizado das cascas de
jabuticaba (Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg.) na dieta, a redução na concentração sérica de
ácidos graxos, o aumento das defesas antioxidantes no plasma, a redução da peroxidação
lipídica no encéfalo, assim como a melhora na capacidade antioxidante renal (BATISTA et
al., 2013). A atividade antimicrobiana in vitro também foi observada para o extrato
hidroalcoólico das folhas de jabuticaba (Myrciaria cauliflora) em culturas bacterianas
formadoras do biofilme dental (MACEDO-COSTA et al., 2009).
Apesar das atividades biológicas já reveladas para as diferentes espécies de jabuticaba,
estudos avaliando a atividade antioxidante in vitro e in vivo de Plinia trunciflora ainda são
muito escassos. Apenas um estudo demonstrou atividade antibacteriana do óleo essencial
dessa planta contra bactérias gram-positivas (Streptococcus equi e Staphilococcus
epidermidis) e fungos patogênicos do gênero Candida e Criptococcus (LAGO et al., 2011).
Diante do exposto, faz-se necessário a realização de estudos preliminares focados na
avaliação da atividade antioxidante in vitro, bem como na avaliação toxicológica in vivo de
Plinia trunciflora. Esses estudos são fundamentais para predizer uma possível ação benéfica
da espécie vegetal em modelos in vivo, sem, no entanto, apresentar riscos toxicológicos a
esses animais, nem a humanos que poderiam futuramente se beneficiar dos possíveis efeitos
medicinais de Plinia trunciflora.
3.6 MERCÚRIO
3.6.1 Aspectos gerais: ocorrência, formas químicas e propriedades
O mercúrio é o único metal encontrado na forma líquida em condições de temperatura
e pressão normais, formando vapores incolores e inodoros. É representado pelo símbolo Hg e
pertence à família química dos metais do grupo IIB da tabela periódica (NASCIMENTO;
CHASIN, 2001). Possui o aspecto de líquido prateado, muito denso e seus pontos de fusão e
ebulição são -38,87ºC e 356,58ºC, respectivamente. A sua tensão superficial elevada permite
a formação de pequenas esferas perfeitas nas rochas e minerais onde é encontrado
(GUIMARÃES et al., 2000).
Apresenta-se na natureza sob diferentes formas, como Hg elementar ou Hg metálico
(Hg0), íon mercuroso (Hg2++) e íon mercúrico (Hg++). Pode também formar compostos
31
orgânicos, alguns dos quais de interesse industrial e agrícola (EPA, 2007). Os compostos
inorgânicos de Hg mais conhecidos são o cloreto de Hg (HgCl2), cloreto mercuroso (Hg2Cl2),
o qual ainda é eventualmente utilizado na medicina e o sulfeto de Hg (HgS), empregado na
produção de pigmentos para tintas (HSDB, 2000). Os compostos orgânicos são os mais
importantes do ponto de vista toxicológico, uma vez que foram detectados em peixes
(principalmente predadores) e outros animais marinhos que fazem parte da cadeia alimentar
humana (OGA, 2008).
3.6.2 Fontes de exposição e usos
Normalmente, o Hg está distribuído de maneira ampla, porém em pequenas
concentrações nos diferentes compartimentos da crosta terrestre (EPA, 2007), sendo raro
encontrá-lo como elemento livre na natureza (AZEVEDO, 2003). Suas fontes podem ser
classificadas como:
Naturais: representadas pelas emissões vulcânicas (que podem chegar a 6.000 ton/ano)
e gaseificação da crosta terrestre (SUNDERLAND; CHMURA, 2000). A evaporação natural
da crosta terrestre representa cerca de 25 mil a 125 mil toneladas/ano da emissão de Hg
(WHO, 1989).
Artificiais ou antrópicas: fazem parte a exploração mineral, extração e refino do ouro,
indústrias (papel, plástico, medicamentos, eletrônica), praguicidas agrícolas e insumos
hospitalares (FURST; RADDING, 1998). A emissão de Hg pela mineração responde por
cerca de 10 mil toneladas/ano. Aproximadamente 50% da emissão de Hg na atmosfera é
oriunda da indústria de equipamentos elétricos e tintas, queima de combustíveis fósseis, bem
como a extração e refino do ouro (WHO, 1991) e por conta dessa última atividade, a
Amazônia apresenta graves problemas de contaminação pelo metal que culminaram em
acúmulo de altos níveis no solo e rios. Em algumas regiões, os peixes contaminados
apresentam concentrações do metal acima do permitido por leis brasileiras (0,5mg/kg)
(BISINOTI; JARDIM, 2004). O Hg também é utilizado pelas indústrias de fabricação de
termômetros, barômetros, eletrodos, tintas, lâmpadas elétricas, explosivos, tratamento de
minérios, refino de metais, conservação de vacinas e para fabricação de amálgamas
odontológicas (CLARKSON, 1997; O´REILLY et al., 2010; AZEVEDO et al., 2012).
As principais formas de exposição humana abrangem a exposição ocupacional, que
inclui a inalação de vapores de Hg por trabalhadores de todas as atividades humanas onde
esse metal é utilizado, bem como a exposição através da ingestão de água e alimentos
32
marinhos contaminados. Essa última é uma consequência da contaminação ambiental por
Hg derivado das atividades agroindustriais, a qual é agravada pelo chamado ciclo do Hg no
ambiente, que consiste na biotransformação por bactérias do Hg inorgânico a metilmercúrio
(MeHg) que bioacumula e biomagnifica ao longo da cadeia alimentar, sendo os maiores
níveis atingidos em peixes predadores e consequentemente, pelo ser humano, por estar no
topo dessa cadeia (GUIMARÃES et al., 2000).
3.6.3 Toxicocinética e toxicodinâmica
A absorção do mercúrio metálico (Hg0) ocorre preferencialmente pela via pulmonar,
dada as suas características voláteis e lipossolúveis, enquanto que o HgCl2 e o Hg2Cl2 são
absorvidos principalmente por via gastrintestinal, embora essa absorção não seja extensiva
(apenas 7 a 15% do Hg++ é absorvido) (DART; SULLIVAN, 2004). As formas orgânicas
como o MeHg, por sua vez, são quase completamente absorvidas no trato gastrintestinal ou
pela via pulmonar (WHO, 1991).
A distribuição da forma iônica é realizada pelo plasma, enquanto que da forma
elementar (Hg0) e orgânica é realizada pelos eritrócitos (CORNELIS et al., 2005). Tanto o
Hg0 quanto as formas orgânicas podem ser biotransformadas à forma inorgânica Hg++. A
oxidação do Hg0  Hg++ é realizada pelo complexo catalase-peróxido de hidrogênio dos
tecidos em geral, enquanto que os compostos organomercuriais são quebrados na ligação
carbono-mercúrio, sendo os alquilmercuriais de cadeia curta (MeHg e etilmercúrio) mais
estáveis à essa quebra em relação aos de cadeia longa (EPA, 1997).
A acumulação do Hg no organismo é progressiva e irreversível e depende da sua
forma. O Hg inorgânico, que é menos lipossolúvel, tem sua acumulação principalmente em
tecidos renais e hepáticos (ZALUPS, 2000), enquanto que o Hg orgânico apresenta maior
afinidade pelos tecidos cerebrais, pois é mais lipossolúvel e tem a capacidade de atravessar a
barreira hematoencefálica (WHO, 1989). A eliminação de todas as formas do Hg ocorre pela
via urinária e fecal, porém glândulas sudoríparas e salivares, além da via hepática-biliar, pele
e leite também constam como via de excreção (SWIFT, 1997).
Todas as formas de Hg são tóxicas para o ser humano, e o grau de toxicidade varia de
acordo com a sua espécie química, a via de exposição, a concentração alcançada nos diversos
órgãos, bem como a vulnerabilidade individual (CORNELIS et al., 2005). De forma geral, a
inativação de enzimas e proteínas estruturais dependentes de grupos sulfidrílicos (-SH), bem
como a alteração na permeabilidade da membrana celular estão entre os prováveis
33
mecanismos da toxicidade do Hg em órgãos alvos, tais como o encéfalo, trato gastrintestinal,
fígado e rins (STOHS; BAGGHI, 1995; ZALUPS, 2000).
O Hg possui afinidade elevada pelos grupos -SH de diferentes proteínas e enzimas,
entre elas, a δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D), envolvida na via de biossíntese do
heme, o grupo prostético da hemoglobina e dos citocromos em geral (EMANUELLI et al.,
1996). A depleção do tripeptídeo glutationa (GSH) em células renais está associada à geração
de processos peroxidativos, com aumento da produção de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS) e consequente modificação da permeabilidade celular (DART;
SULLIVAN, 2004). Além disso, a ligação do Hg com proteínas sulfidrílicas intracelulares
denominadas metalotioneínas, favorece o fluxo dos íons metálicos para o interior das células,
e por isso, ocorre a sua acumulação no interior de diferentes tecidos e órgãos (HARDMAN;
LIMBIRD; GILMAN, 2003). Em contrapartida, a ligação do Hg às metalotioneínas em
diversos tecidos, principalmente nos rins, parece ter um efeito protetor contra a toxicidade
desse metal, uma vez que reduz a sua biodisponibilidade para ligar a outros alvos biológicos
importantes (EPA, 1997; CALABUIG; GISBERT, 2001). Além desses, o Hg ainda pode
interagir com grupos selenoidrila (SeH), formando complexos com compostos que contenham
selenol, tais como as enzimas antioxidantes tiorredoxina redutase (TrxR) e glutationa
peroxidase (GPx), culminando na redução da capacidade antioxidante e aumento da geração
de EROs (KAUR et al., 2006; FARINA et al., 2011).
3.6.4 Nefrotoxicidade do Hg
Os rins estão entre os principais órgãos de acumulação das formas elementar e
inorgânicas do Hg. Além disso, essas formas têm potencial de causar nefrotoxicidade, sendo o
Hg inorgânico o principal causador desse efeito tóxico (CORNELIS et al., 2005). A
nefrotoxicidade é um efeito agudo da exposição ao Hg inorgânico e pode se manifestar em
menos de 24 horas após a exposição ao metal como falência renal (ZALUPS, 2000). A
falência renal está associada com a formação de glomerulonefrite, seguida por proteinúria,
oligúria e hematúria (PESCE et al., 1977). Também é possível observar necrose tubular e
degeneração glomerular (SMETANA et al., 1996; RUTOWSKI et al., 1998; ZALUPS et al.,
2000; YE et al.; 2009), quando o córtex renal e túbulos proximais são as principais regiões
renais afetadas pelo Hg inorgânico. Os danos provocados aos túbulos proximais resultam na
incapacidade de reabsorção de água e solutos (DANSCHER et al., 1990; CLARKSON, 1997).
34
Nesse contexto, o HgCl2 é um potente agente nefrotóxico e é geralmente utilizado para
a indução de dano renal em animais de experimentação (EWALD; CALABRESE, 2001;
DURANTE et al., 2010; BRANDÃO et al., 2011). Os mecanismos envolvidos nesse efeito
parecem abranger desde a complexação do Hg com a GSH e posterior acúmulo do seu
produto de degradação nas células epiteliais do túbulo proximal, até a geração de radicais
livres (RLs) e peróxido de hidrogênio com consequente peroxidação lipídica (ZALUPS et al.,
1993; GIRARDI; ELIAS, 1995; AUGUSTI et al., 2007;2008; BRANDÃO et al., 2011; LIU et
al., 2011). Além disso, esses efeitos podem aparecer associados à inibição ou redução dos
níveis de defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas (AUGUSTI et al., 2007;2008;
BRANDÃO et al., 2008).
Considerando o fato de que há envolvimento da geração de EROs e do estresse
oxidativo nos mecanismos de toxicidade do Hg, a nefrotoxicidade induzida pela exposição
aguda ao HgCl2 em ratos foi escolhida como modelo de investigação dos possíveis efeitos
protetores de Plinia trunciflora in vivo.
35
4 REFERÊNCIAS DA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
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46
5 MATERIAIS E MÉTODOS, RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os tópicos acima são descritos na íntegra, em dois manuscritos a serem submetidos às
revistas American Journal of Toxicology and Pharmacology e à Environmental Toxicology
and Farmacology.
47
5.1 MANUSCRITO 1
Manuscrito a ser submetido à revista American Journal of Toxicology and
Pharmacology.
48
5.1.1 Evaluation of in vitro antioxidant activity and acute oral toxicity of an ethanolic extract
of jabuticaba (Plinia trunciflora) in mice
EVALUATION OF IN VITRO ANTIOXIDANT ACTIVITY AND ACUTE ORAL TOXICITY OF AN
ETHANOLIC EXTRACT OF JABUTICABA (PLINIA TRUNCIFLORA) IN MICE
1
4
Fabrieli Tatiane Lusa; 1Fernanda Kuhn; 1Catia Capelleto; 2Andrigo Lorenzoni; 3Mayara Schäfer Copini;
Clodoaldo Antônio de Sá; 4Vanessa da Silva Corralo, 1,5Greicy Michelle Marafiga Conterato1,5, Jacir Dalmagro1
1
Programa de Pós Graduação em Ciências Ambientais, Universidade Comunitária da Região de Chapecó.
Avenida Senador Attílio Fontana, 591E, 89809-000, Chapecó, SC, Brazil.
2
Curso de Farmácia, Universidade Comunitária da Região de Chapecó. Avenida Senador Attílio Fontana, 591E,
89809-000, Chapecó, SC, Brazil.
3
Curso de Engenharia Química, Universidade Comunitária da Região de Chapecó. Avenida Senador Attílio
Fontana, 591E, 89809-000, Chapecó, SC, Brazil.
4
Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Comunitária da Região de Chapecó. Avenida
Senador Attílio Fontana, 591E, 89809-000, Chapecó, SC, Brazil.
5
Universidade Federal de Santa Catarina, Campus Curitibanos, Rodovia Ulysses Gaboardi – km3, CEP 89520000, Curitibanos, SC, Brazil.
Corresponding authors: Greicy Michelle Marafiga Conterato, Universidade Federal de Santa Catarina, Campus
Curitibanos, Curitibanos, Brazil. E-mail: greicymmc@ufsc.br
49
ABSTRACT
Plinia trunciflora (O. Berg) Kausel (PT), Myrtaceae, is a native tree from Brazil, where is known as
“jaboticaba”. Although many biological properties have been attributed to several members of this family,
mainly by their use in folk medicine, little is known about the beneficial effects of P. trunciflora. This study
aimed to evaluate the in vitro antioxidant activity of an ethanolic extract of P. trunciflora fruit peels (EEPT), as
well as its oral acute toxicity in mice. Our results showed that EEPT presented total phenolic compounds and
anthocyanin, which probably were involved in the antioxidant activity observed for this extract. The in vitro
antioxidant activity was verified by the ferric reducing antioxidant power (FRAP) and radical scavenging
capacity (DPPH, hydroxyl and superoxide radical anion), which occurred in almost all concentrations used in
these assays (5 – 80 µg/mL). Oral acute toxicity was assessed by evaluating the body and organ weights, as well
as alterations in behavioral and hematological parameters during seven or fifteen days to increasing doses of
EEPT (0 – 2000 mg/kg) by gavage. Oral administration until the highest dose of EEPT resulted in no mortality
or signs of toxicity in mice, suggesting that this extract does not produce toxic effects. Overall, the data indicate
that EEPT presents relevant antioxidant activity and may be considered safe to human consumption. Therefore,
EEPT might find potential application in pharmaceutical and food industries.
Keywords: Plinia trunciflora, Myrtaceae, antioxidant activity, toxicity assays.
1.
INTRODUCTION
Free radicals and reactive oxygen species (ROS) are commonly produced during physiological conditions,
such as the cellular metabolism, phagocytosis and cell grow regulation and signaling (Ferreira and Abreu, 2007;
Cavalcante and Bruin, 2009). However, when ROS production exceeds their removal by intracellular antioxidant
systems, a condition named oxidative stress is established in living cells (Atashak et al., 2014). It consists in an
imbalance between oxidants and antioxidants that disrupts the function of DNA, lipids and protein so that it can
end up in apoptosis (Barbosa et al., 2010). Accordingly, ROS have been involved in the genesis of
cardiovascular, neurodegenerative and neoplastic diseases, as well as in the early aging (Ferreira and Abreu,
2007; Minelli et al, 2009; Serra et al, 2009.).
A large number of studies have been carried out in attempt to find out antioxidant compounds with
potential application in human diseases (Lenquiste et al., 2012). In this context, vegetables arise as important
alternatives, since they contain a wide variety of bioactive compounds such as phenolic compounds, and among
these, anthocyanins (Sousa et al., 2007; Schreckinger et al., 2010). Many beneficial properties have been
attributed to these compounds, among them, antioxidant, anti-diabetic (Wu et al., 2012), antibacterial, antitumor,
antiviral as well as cytoprotective effect on the vascular system, liver and pancreas (Cazarolli et al., 2008).
Plinia trunciflora, (O. Berg) Kausel, a synonym of Myrciaria trunciflora Mart. (O. Berg) is popularly
known in Brazil as jaboticabeira. It belongs to the Myrtaceae family, and preferentially occurs at forests from
Brazil, Argentine and Paraguay. Its fruits typically measure 3-4 cm in diameter and are characterized as a thickskinned berry with purple-black color and smooth peel. The pulp is whitish translucent, mucilaginous and
contains 1-4 seeds (Reynertson et al., 2006; Lima et al , 2008). The popular use involves treatment of stomach
disorders, throat afflictions, diabetes, gout and hypertension (Reynertson et al., 2006; Dragano et al., 2013). The
bark of P. trunciflora is astringent and used in the treatment of diarrhea and skin irritations (Lorenzi, 2000).
Studies have reported the presence of sesquiterpenes in the essential oils of P. trunciflora (Lago et al., 2011),
which probably is involved in its antimicrobial property. In addition, significant amount of phenolic compounds,
flavonoids, tannins and terpenoids were found in the leaf extract, which also showed antimicrobial and in vitro
antioxidant activity (Carvalho et al., 2009). However, there is no study regarding chemical composition and
biological activities of peel and fruit extracts of P. trunciflora.
Based on its popular use, this study was designated to evaluate the presence of bioactive compounds
and in vitro antioxidant activity of ethanolic extract of P. trunciflora peels (EEPT). To ensure the quality and
safety of a future application in foods and/or human health, we also evaluated the oral acute toxicity of this
extract in mice.
50
2.
MATERIALS AND METHODS
2.1 Plant Material
P. trunciflora was collected in Alpestre (RS, Brazil) (27 ° 10'56 .82 "S and 53 ° 7'19 .55" O) in the end
of September/2012, which was considered the time of fruiting. The botanical Marcos Eduardo Guerra Sobral
taxonomically identified this vegetal species.
2.2 Preparation of Extract
The preparation of EEPT was based on the methodology described by Veggi et al (2001) with
modifications. P. trunciflora peels (100 g) were previously dried at 40°C, transferred to a glass recipient and
mixtured with 200 mL of ethanol. The mixture was kept under the light for 72h. The solvent was evaporated and
the extract was lyophilized previous to perform the in vitro and in vivo assays. At the time of these experiments,
the lyophilized was dissolved in hydroalcoholic 70% solution for in vitro assays and in saline 0.9% for in vivo
toxicity tests.
2.3 Total Phenolic Compounds (TPC)
The total phenolic compounds (TPC) in the ethanolic extract were determined according to the Folin
Cicalteou method (Singlenton and Rossi, 1965). This method is based on the reduction of phosphor-wolframate
phosphomolybdate complex by phenolic compounds of the extract to a blue product in alkaline pH. The
absorbance was measured at 750 nm using a Scinco SUV- 2120 spectrophotometer. The results were expressed
as gallic acid equivalents (mg gallic acid equivalent/100g dried extract) and the values are presented as the
means of triplicate analysis.
2.4 Total Monomeric Anthocyanins (TMA)
The total monomeric anthocyanin (TMA) content was determined using the pH differential method (Giusti
and Wrolstad, 2001). Aliquots of extract diluted in ultrapure water (with absorbance in the range of 0.100 to
1.200 at 510 nm) were combined with potassium chloride and with sodium acetate buffers (pH 1.0 and 4.5,
respectively). After an equilibration period (15 min), the absorbance raw of each solution was measured at 510
and 700 nm. A corrected absorbance value was calculated as:
[(A510 - A700) pH 1.0 − (A510 - A700) pH 4.5]
The anthocyanin content was calculated using the molar absorptivity (ε) and molecular weights (MW) of
cyanidin 3-O-glucoside (ε = 26,900L/mol.cm; MW = 449.2g/mol). The results were expressed as mg of cyanidin
3-O-glucoside equivalents/100g dried extract.
2.5 Quantification of anthocyanin by HPLC-DAD
Reverse phase chromatographic analyses were carried out under gradient conditions using C18 column
(4.6 mm x 150 mm) packed with 5μm diameter particles; the mobile phase was water containing 1% formic acid
(A) and acetonitrile (B), and the composition gradient was: 13% of B until10 min and changed to obtain 20%,
30%, 50%, 60%, 70%, 20% and 10% B at 20, 30, 40, 50, 60, 70 and 80 min, respectively, following the method
described by Kamdem et al. (2013). P. trunciflora aqueous extract and mobile phase were filtered through 0.45
μm membrane filter (Millipore) and then degassed by ultrasonic bath prior to use, the aqueous extract was
analyzed at a concentration of 20 mg/mL. The flow rate was 0.5 mL/min, injection volume 20 μl and the
wavelength was 520 nm. Stock solutions of standards references were prepared in the HPLC mobile phase at a
concentration range of 0.030 - 0.250 mg/ml. Chromatography peaks were confirmed by comparing its retention
time with those of reference standards and by DAD spectra (300 to 700 nm). All chromatography operations
51
were carried out at ambient temperature and in triplicate. Calibration curve for cyanidin: Y = 13054x + 1245.8
(Rt = 0.9997); cyanidin 3-o-glucoside: Y = 12695x + 1184.3 (Rt = 0.9999); malvidin: Y = 12749x + 1267.9 (Rt
= 0.9996); malvidin 3-o-glucoside: Y = 13158x + 1305.2 (Rt = 0.9995) and delphinidin 3-o-glucoside: Y =
12539x + 1183.1 (Rt = 0.9997). The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were calculated
based on the standard deviation of the responses and the slope using three independent analytical curves. LOD
and LOQ were calculated as 3.3 and 10 σ/S, respectively, where σ is the standard deviation of the response and S
is the slope of the calibration curve (BOLIGON et al., 2013).
2.6 Antioxidant Activity in vitro
Determination of Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP). The FRAP assay was performed according to
the method published elsewhere (Benzie and Strain 1996). It is based on the reduction of Fe 3+ to Fe2+ by
antioxidant compounds of the extract. The absorbance of the complex formed between Fe2+ and 2,4,6-trypyridyls-triazine (TPTZ) was measured at 593 nm after incubation at 37°C for 15 min in the presence of EEPT (5-80
µg/mL). The results were expressed as the means of the absorbance of triplicate experiments (n=3).
1,1-Diphenyl-2-2picrylhydrazil Radical Scavenging Assay. The antiradical power of EEPT was determined
according to Brand-Williams et al. (1995) method. This method is based on the decreased of DPPH radical
absorbance after 24 h of incubation with different dilutions of EEPT (5-80 µg/mL) in methanol. A blank with
methanol was used. This analysis was performed in triplicate (n=3), and results were expressed as the means of
% inhibition of DPPH radical, which was calculated as follows: % inhibition = [(Abs control – Abs sample)/Abs
control] x 100. The concentration of EEPT that was able to scavenge 50% of DPPH radical (IC50) was
calculated through a non-linear regression analysis using GraphPad Prism Program version 6.0.
Hydroxyl Radical Scavenging Activity. The scavenging capacity towards the hydroxyl radical was measured by
using a deoxyribose method (Halliwell et al. 1987). This method is based on capacity of extract in scavenging
hydroxyl radical and then, protecting against deoxyribose oxidation induced by this radical, which is produced
through Fenton reaction. The protection provided by the extract was noticed by reduction of the pink color
produced by the reaction of malondialdehyde product with thiobarbituric acid, which absorbance was read at 532
nm in a spectrophotometer. The hydroxyl radical scavenging capacity was evaluated by calculating the inhibition
percentage of 2-deoxyribose oxidation by hydroxyl radicals. The scavenging percentage was calculated
according to the following formula:
Scavenging percentage (%) = [A0 – (A1 – A2)] × 100/A0
Where A0 is the absorbance of the positive control without a sample. A1 is the absorbance after adding the
sample and deoxyribose. A2 is the absorbance of the sample without deoxyribose.
Superoxide anion radical scavenging capacity. The ability of EEPT to inhibit the auto-oxidation of epinephrine
to adrenochrome, which is mediated by superoxide anions, was assessed at 480 nm. Reaction assay contained 50
mM glycine buffer, pH 10.2, 1 mM epinephrine at 30° C with or without EEPT (Misra and Fridovich, 1972).
The results were expressed as % epinephrine oxidation and the volume of EEPT necessary to inhibit 50% of
epinephrine oxidation (IC50) was calculated through a non-linear regression analysis using GraphPad Prism
Program version 6.0.
2.7 Acute Toxicity Study.
The acute oral toxicity study was performed according to the Organization for Economic Cooperation and
Development (OECD) test-420 with modifications (Ecobinochon, 1997).
2.7.1 Animals
Albino Swiss mice, male (33-48g) from the Bioterism Center of Unochapecó were housed individually
in metabolic cages under controlled environmental conditions (temperature 22°C±2°C, photoperiod of 12 h light
/dark, ventilation and humidity maintained by air conditioning, food and water ad libitum system). The
experimental procedure was carried out according to the institutional policies related to the handling of
experimental animals (approved by the Ethics Committee, process 008/2012).
52
2.7.2 Exposure and tissue collection
EEPT extract was dissolved in saline solution (0.9%) and adjusted to 1 ml/100g b.w. previous to its
administration in the animals (n=5). Increasing doses of EPPT extract (5, 50, 500 and 2000mg/kg) were
administered to mice in a single oral injection by gavage after an overnight fast. The animals were observed
daily for 7 or 15 days for signs of toxicity and mortality. During this period, information on body and organ
weight change, food and water consumption and excreta amount were collected. A control group followed the
experiment receiving saline (0.9%).
At the end of 7th or 15th day, the animals were anesthetized (ketamine 100mg/kg + xylasine 10 mg/kg)
and the blood samples were collected by cardiac punction for hematological determinations. After blood
collection, mice were euthanized by decapitation and had the liver, spleen and kidneys removed, washed with
saline and weighed.
2.7.3 Statistical Analysis
Results are shown as mean ± S.E.M. (antioxidant analysis) or mean ± SD (quantification of bioactive
compounds and toxicity test). In vitro assay and acute oral toxicity results were analyzed by one way analysis of
variance (ANOVA) followed by Tukey`s test. Differences among concentrations (in vitro assays) or groups
(toxicity test) were considered significant when p <0.05.
3. RESULTS
3.1 Total phenolic compounds and anthocyanin and quantification of anthocyanin by HPLC-DAD
The results for TPC and anthocyanin content presented values of 2095.83 ± 18.09 mg gallic acid
equivalent/100g dried extract and 449.87 ± 12.75 cyanidin 3-O-glucoside equivalents/100g dried extract,
respectively. These results indicate that anthocyanin comprise a large proportion (21.46 %) of TPC in EEPT.
HPLC fingerprinting of EEPT revealed the presence of the cyanidin chloride (retention time - tR = 6.41
min), malvidin chloride (tR = 9.73 min), delphinidin 3-0-glucoside chloride (tR = 11.94 min), cyanidin 3-0glucoside chloride (tR = 15.08) and malvidin 3-0-glucoside chloride (tR = 20.57 min). These data are shown in
Table 1 and Figure 1.
Table 1 – Phenolics and flavonoids composition of EEPT
Compounds
Crude ethanol extract 99%
LOD
mg/g
g/mL
Cyanidin
17.49±0.03
0.015
Malvidin
6.84±0.01
0.028
Delphinidin-3-O-glucoside
2.11±0.02
0.009
Cyanidin-3-O-glucoside
15.93±0.02
0.021
Malvidin-3-O-glucoside
11.74±0.01
0.017
Results are expressed as mean ± standard deviations (SD) of three determinations. LOD: limit of
LOQ: limit of quantification.
LOQ
g/mL
0.049
0.093
0.031
0.069
0.058
detection and
53
Cyanidin chloride (Standard)
Malvidin chloride (Standard)
Delphinidin 3-0-glucoside chloride
(Standard)
Cyanidin 3-0-glucoside chloride
Malvidin 3-0-glucoside chloride
(Standard)
Crude ethanol extract 99%
(Standard)
Fig.1. Representative high performance liquid chromatography profile of standards and Plinia trunciflora
extract. Cyanidin chloride (peak 1), malvidin chloride (peak 2), delphinidin 3-0-glucoside chloride (peak 3),
cyanidin 3-0-glucoside chloride (peak 4) and malvidin 3-0-glucoside chloride (peak 5).
3.2 In vitro antioxidant activity
To verify if EEPT could present a possible antioxidant activity, the ferric reducing antioxidant power
(FRAP) along with its scavenging capacity of synthetic and/or physiological radicals were evaluated. As is
shown in Fig. 1, EEPT presented significant reducing power from 5 to 80 µg/mL and this effect followed a
concentration-dependent profile (Fig.1A). In agreement with these results, all concentrations of EEPT also
showed radical scavenging properties, since it was able to remove both DPPH (IC50 = 18.64, confidence interval
14.62 – 23.78 µg/mL) and hydroxil radicals (Fig. 1B and C). For the first radical, increasing concentration of
54
EEPT lead to an increase of effect potency, whereas for the latter, the effect remained similar for all
concentrations of the extract. In addition, the antiradical power was also verified for EEPT in the presence of
superoxide radical anion (O.-2), even though this effect have required higher concentrations of the extract than
that used in other in vitro assays (Fig. 1D). This assay is frequently used to evaluate the superoxide dismutase
(SOD) activity, which is the natural enzymatic defense against O 2.- radical in the organism. One unit (1U) of
SOD is recognized as the volume of sample (blood, tissue, plasma) necessary to inhibit 50% of epinephrine
oxidation. In our study, the volume of EEPT required to reach this effect was 97.71 µL, which corresponds to
2.44 mg.mL-1 (confidence interval: 1.23 – 4.82 mg.mL-1 ).
A
B
4.0
§
Absorbance
3.2
2.4
‡
1.6
†
*
0.8
% DPPH inhibition
150
120
‡
40
80
†
60
30
*
*
0
0.0
0
5
10
20
40
80
5
-1
10
20
Concentration ( g.mL-1)
Concentration (g.mL )
C
D
50
*
40
30
*
*
*
*
20
10
0
5
10
20
40
Concentration (g.mL-1)
80
% epinephrine oxidation
% of hydroxil scavenging
‡
90
150
100
*
*
50
*
*
†
0
0
1.25
2.00
3.75
5.00
7.50
Concentration (mg.mL-1)
Fig.2. In vitro antioxidant activity of EEPT. A, Ferric reducing antioxidant power (FRAP). B, DPPH scavenging
assay. C, Hydroxil scavenging assay. D, Superoxide scavenging assay measured by the epinephrine oxidation
method in alkaline pH. Results represent the mean (±S.E.M). n=3 in each assay for each concentration. *†‡§:
Symbols above the bars indicate statistical difference in comparison with the control (mixture assay without
extract). Bars with different symbols indicate results statistically different. ANOVA/Tukey (p<0.05).
3.4 Acute Oral Toxicity Study.
No behavioral changes (piloroerection, locomotion) or signs of toxicity such as body and organ weights,
organ body index (Table 2), food or water consumption and amount of excreta (data not shown) were observed
in the mice that received orally EEPT up to 2.000 mg/kg. Heartbeats, breathing movements and body
temperature were also evaluated but no change was observed in comparison to the control group. All three mice
of each group survived until the time of euthanasia, i.e. at 7 th or 15 th day. Therefore, the results regarding oral
acute toxicity suggest that EEPT was safe up to the dose levels of 2.000 mg/kg body weight.
55
Table 2: Data obtained for body weight, organ weight and organ to body weight index after oral daily
administration of EEPT (n = 5) during 7 or 15 days (mean ± SD).
Parameter
Treatment (mg)
Observation time
7 days
15 days
0
39.71 ± 2.56
39.01 ± 1.91
5
36.24 ± 3.16
37.37 ± 1.38
50
37.83 ± 3.22
36.51 ± 1.18
500
38.43 ± 0.82
39.35 ± 0.89
2000
35.34 ± 0.81
38.86 ± 1.18
0
140 ± 30
120 ± 0
5
120 ± 20
120 ± 30
50
120 ± 30
110 ± 10
500
110 ± 11
110 ± 0
2000
110 ± 0
140 ± 0
0
610 ± 20
590 ± 20
5
560 ± 40
620 ± 20
50
530 ± 80
600 ± 70
500
590 ± 50
630 ± 40
2000
560 ± 30
610 ± 30
0
1730 ± 90
1820 ± 140
5
1470 ± 90
1630 ± 200
50
1560 ± 370
1580 ± 190
500
1820 ± 70
1870 ± 120
2000
1590 ± 140
1740 ± 120
Organ body index (%)
0
0.34 ± 0.02
0.31 ± 0.03
spleen
5
0.36 ± 0.06
0.32 ± 0.02
50
0.31 ± 0.04
0.31 ± 0.03
500
0.30 ± 0.02
0.28 ± 0.01
2000
0.33 ± 0.01
0.36 ± 0.01
Body weight (g)
Spleen weight (mg)
Kidney weight (mg)
Liver (mg)
56
Organ body index (%)
0
1.54 ± 0.08
1.52 ± 0.04
kidneys
5
1.56 ± 0.08
1.67 ± 0.07
50
1.40 ± 0.08
1.64 ± 0.10
500
1.54 ± 0.06
1.61 ± 0.10
2000
1.59 ± 0.01
1.57 ± 0.07
Organ body index (%)
0
4.66 ± 0.58
4.43 ± 0.18
liver
5
4.59 ± 0.67
3.96 ± 0.33
50
4.32 ± 0.77
4.35 ± 1.18
500
4.86 ± 0.23
4.64 ± 0.28
2000
4.94 ± 0.41
4.10 ± 0.36
Similar to behavioral and toxicity data, there was no change in hematological parameters in the groups
treated with EEPT when compared to the respective control at the same period of treatment (7 or 15 days) (Table
3).
57
Table 3: Hematological parameters obtained from the whole blood of mice after daily administration EEPT (n =
5) during 7 or 15 days.
Parameter
Erythrocytes (mm3)
Hemoglobin (g.dL)
Hematocrit (%)
Platelets (mm3)
Treatment (mg)
Observation time
7 days
15 days
0
7.72 ± 0.16
7.72 ± 0.16
5
7.17 ± 0.40
8.57 ± 0.46
50
7.93 ± 0.57
7.85 ± 0.66
500
7.05 ± 0.19
8.05 ± 0.21
2000
7.66 ± 0.55
7.04 ± 0.43
0
12.36 ± 0.21
12.78 ± 0.15
5
11.30 ± 0.79
11.89 ± 0.81
50
12.56 ± 0.87
12.86 ± 0.93
500
11.26 ± 0.15
12.12 ± 0.17
2000
12.63 ± 1.01
13.54 ± 1.01
0
35.66 ± 0.89
34.11 ± 1.11
5
32.00 ± 0.26
33.00 ± 0.29
50
37.66 ± 1.35
35.66 ± 1.41
500
33.16 ± 1.49
32.16 ± 0.89
2000
37.40 ± 3.72
35.40 ± 1.89
0
841.33 ± 82.21
735.33 ± 272.71
5
645.00 ± 222.19
945.09 ± 232.19
50
735.33 ± 387.63
735.67 ± 287.63
500
871.00 ± 214.56
689.09 ± 235.56
2000
917.67 ± 168.83
722.89 ± 268.83
58
4.
DISCUSSION
In the present study, the antioxidant capacity and oral acute toxicity of P. trunciflora was evaluated. Plants
are sources rich in bioactive compounds with beneficial biological activities. Among these compounds, phenolic
compounds, which are mainly represented by flavonoids and anthocyanin have been implicated in such effects
(Lima et al., 2011; Wu et al., 2012; 2013). High amount of TPC and anthocyanin have been found in several
parts of different species of jaboticaba, such as seeds, peels and fruits (Reynertson et al., 2005; 2006; 2008;
Santos et al., 2010; Santos and Meireles, 2011; Abe, et al. 2012; Leite-Legatti et al., 2012). In fact, TPC and
anthocyanin quantified for P. trunciflora peels was found to be as high as or even higher than that found in peels
of other jaboticaba species (Kuskoski et al., 2006; Teixeira et al., 2008; Santos et al., 2010). Regarding
anthocyanins identified in EEPT, cyanidin, cyanidin 3-O-glucoside chloride and malvidin 3-O-glucoside
chloride comprises the majority among these phytochemicals which percentage values represent 32.32, 29.44
and 21.70%, respectively in relation to the total of identified anthocyanins. The five anthocyanins found in EEPT
were also identified in the aqueous extract of P. trunciflora fruits, which percentage values for cyanidin were
lower (18.35%) than that found for EEPT, but with similar values found for cyanidin 3-O-glucoside chloride and
malvidin 3-O-glucoside chloride, i.e., 31.20 and 19.30%, respectively (Sacchet et al., submitted).
Studies revealed that antioxidant activity of TPC and anthocyanins can be associated to their reducing
and/or free radicals scavenging capacity (Jurikova et al., 2012). In this sense, antioxidant activity of natural
compounds have been assessed by different in vitro methods (Collins, 2005). FRAP assay is useful to indicate
the presence of electron donor compounds and this property may be associated to its ability in removing free
radicals (Benzie and Strain, 1996). Accordingly, the concentration-dependent reducing power verified for EEPT
indicates the presence of substances able to donate electrons. These results combined with that observed in
DPPH assay corroborate the reducing power of the extract, since both methods evaluate the ability of the
compounds to donate one single electron. It should be mentioned that IC50 value (18.64 µg.mL-1) found for
EEPT in DPPH method was lower than IC50 calculated for the aqueous extract of P. trunciflora fruits (42.2
µg.mL-1) (unpublished data). This may be attributed to the higher concentration of TPC and total anthocyanins in
EEPT compared to the aqueous extract (731.60 ± 18.73 mg gallic acid equivalent/100 g dried extract and 175.33
± 11.80 mg cyanidin 3-O-glucoside equivalents/100 g dried extract, respectively). Therefore, EEPT seem to
exhibit higher antioxidant activity compared to the aqueous extract.
Very interestingly, the additional ability of EEPT in removing radicals produced in intracellular
environment, such as hydroxyl and superoxide anion may support its future usefulness in the prevention and/or
treatment of oxidative stress-related human diseases. Once more, the scavenging activity of EEPT seemed to be
more effective than that of aqueous extract, since the latter did not exhibited superoxide scavenging ability
(Sacchet et al., submitted). Hydroxyl radical is an initiator agent of the lipid peroxidation, which is implicated in
several pathologies, especially in neurodegenerative disturbances (Halliwell, 1992). Therefore, the hydroxyl
radical scavenging activity revealed by EEPT indicates its ability for preventing and/or interrupting the lipid
peroxidation chain.
Acute toxicity tests are useful to ensure the safety of bioactive compounds with pharmacological
potential use. They are currently assessed because medicinal plants contain xenobiotics and their
biotransformation products are described as potentially toxic (Lapa et al., 2000). In this study, we evaluated the
oral acute toxicity of EEPT. These tests are designated to attain an appropriate dose for long-term toxicity tests,
besides to observe the affected organs at the end of the exposure (Jothy et al., 2011).
The body weight alterations are useful as a sensitive indication of the general health status of animals
(El Hilaly et al., 2004). In addition, the loss weight could be related to the loss of appetite due to disorders in the
metabolism of protein, carbohydrates or fat (Ping et al., 2013). Moreover, plant extracts administered at high
doses may be biotransformed in toxic products, interfering in the gastric function and then, decreasing the
digestion efficiency (Chokishi, 2007). However, no alteration was observed in body weight or food and water
consumption in mice treated with EEPT.
Similarly, no significant change occurred in organ weight (spleen, kidney and liver), suggesting that
EEPT had no effect on the normal growth of mice. In fact, the organ weight has been appointed as an important
toxicity predictor, since it may indicate physiologic disturbances, acute injury and is frequently associated to the
target organ of the xenobiotic studied. Additionally, it correlates well with hystopatological alterations (Michael
et al., 2007). Considering that neither the body or organ weight alterations nor macroscopic signs of organ
toxicity (colour and texture) were observed at any dose evaluated, we can suggest that EEPT is nontoxic to the
spleen, kidney and liver and apparently does not interfere in the normal growth of mice.
Hematological examinations is of great utility in determining the toxic effects of xenobiotics on the
blood cells, besides have high predictive value for human toxicity when the data are transposed from animal
studies (Yakubu et al., 2007; Ping et al., 2013). In the present study, the lack of changes in the number of
erythrocytes, hemoglobin concentration, hematocrit and platelets may indicate that EEPT does not interfere in
59
the erythropoiesis and supports the absence of toxicity suggested by the other parameters evaluated. However, a
more detailed experiment to verify its toxicity in a long-term experiment is crucial for support the possible
therapeutic and pharmaceutical and nutritional use of EEPT in humans.
5.
CONCLUSION
Based on these results, the extract of P. trunciflora peels presents remarkable antioxidant activity as
verified by different in vitro methods. These properties may be related to the meaningful content of phenolic
compounds and anthocyanin found in this extract. Finally, our preliminary results regarding oral acute toxicity
suggest that EEPT might be a promising alternative for future pharmacological and dietary applications.
However, more studies should be performed to evaluate its chronic toxicity as well as its beneficial properties in
in vivo experimental models.
Aknowledgements
The autors are grateful CNPq and FAPE/UNOCHAPECÓ.
Conflict of interest
The authors have declared that there is no conflict of interest.
6.
1.
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62
5.2 MANUSCRITO 2
Manuscrito submetido à revista Environmental Toxicology and Pharmacology.
63
5.2.1 Protective effect of the aqueous extract of Plinia trunciflora (jaboticaba) fruits on the
nephrotoxicity and oxidative stress induced by mercury chloride in rats
Fabrieli Tatiane Lusaa,*, Rafael Chitolinab,*, Adrieli Sachettb, Cássia Saccheta, Fernanda
Bevilaquab, Ricieri Naue Mocelina, Fernanda Kuhna, Marta Giachinib, Mônica Zanattab,
Marthiellen Roosevelt de Lima Felixc, Alini Tereza Gulartec, Adriano Tony Ramosc, Walter
Antônio Roman Júniorb,d, Angelo Luis Piatoe, Jacir Dal Magroa, Greicy Michelle Marafiga
Conteratoa, c**
a
Programa de Pós Graduação em Ciências Ambientais, Universidade Comunitária da Região
de Chapecó, Chapecó, SC, Brasil.
b
Núcleo de Fitoterápicos, Área de Ciências da Saúde, Universidade Comunitária da Região
de Chapecó, Chapecó, SC, Brazil.
c
Universidade Federal de Santa Catarina, Campus Curitibanos, Curitibanos, SC, Brazil.
d
Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Comunitária da Região de
Chapecó, Chapecó, SC, Brazil.
e
Programa de Pós Graduação em Farmacologia e Terapêutica, ICBS, Universidade Federal do
Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil.
*The authors equally contributed to the development of this work.
**Corresponding author: Tel.: +55 48 3721-6274
E-mail addresses: greicymmc@yahoo.com.br, greicymmc@ufsc.br
Abbreviations: δ-ALA-D, δ-aminolevulinate dehydratase; CAT, catalase; DTNB, 5,5`dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); GSH, glutathione; GST, glutathione S-transferase; GPx,
glutathione peroxidase; MDA, malondialdehyde; NADPH, nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate oxidase; NPSH, non-protein thiol groups; PT, Aqueous extract of Plinia
trunciflora; ROS, reactive oxygen species; SOD, superoxide dismutase; TBA, thiobarbituric
acid; TBARS, thiobarbituric reactive species.
64
Abstract. Oxidative stress is involved in the mercury (Hg) nephrotoxicity. Hence,
antioxidants could help in the prevention and/or treatment of Hg poisoning. Plinia trunciflora
(O. Berg) Kausel belongs to Myrtaceae family, which contains members with antimicrobial,
antioxidant and anti-inflammatory properties. However, its effects on the oxidative stress and
nephrotoxicity induced by Hg are still unknown. This study evaluated the protective effect of
aqueous extract of Plinia trunciflora (PT) fruits on the renal function and oxidative stress in
Wistar rats exposed to mercury chloride (HgCl2). Our results showed that the pre-treatment
with PT (800 mg/kg, v.o.) partially protected against the renal lipid peroxidation and the
decrease in the antioxidant enzyme activities. Interestingly, PT also mitigated the
histopathological alterations in rat kidneys exposed to HgCl2, even though it has not prevented
the renal function parameters alterations neither δ-aminolevulinate dehydratase (δ-ALA-D)
activity inhibition. Overall, PT may provide protection against nephrotoxicity induced by Hg.
Keywords: mercury toxicity; renal function; natural compounds; antioxidant activity
65
1. Introduction
Mercury (Hg) is a metal widely recognized as a hazardous pollutant. However, it is
still used in batteries, fluorescent light bulbs, as preservative in vaccines, dental amalgams
and chlorine production (Clarkson, 1997; Clarkson and Magos, 2006; WHO, 1989). General
population can be exposed to Hg through contaminated water and foods (Magos and
Clarkson, 2006), especially through fish, which accumulate significant amount of organic
forms of Hg (Hylander and Goodsite, 2006; WHO, 1989). Different forms of Hg show
different profiles of distribution in tissues and organs. In this context, kidneys are considered
the primary organs for inorganic forms of Hg accumulation (Emanuelli et al., 1996), besides
being important Hg toxicity targets (Zalups and Diamond, 1987).
Hg toxicity has been attributed to its ability in forming stable complexes with
sulfhydryl groups in cysteine residues, which composes the structure of many protein and
non-protein molecules (Ballatori, 2002; Carvalho et al., 2008; Carvalho et al., 2011). In fact,
Hg commonly binds to the reduced glutathione (GSH), homocysteine, albumin and
thioredoxin and inhibits the δ-aminolevulinate dehydratase (δ-ALA-D) enzyme (Augusti et
al., 2007; Augusti et al., 2008). The binding of Hg to sulfhydryl molecules may implicate in
depletion of GSH levels and enzymatic inhibition, leading to an overproduction of reactive
oxygen species (ROS), such as superoxide anion radical, hydrogen peroxide and hydroxyl
radical (Perottoni et al., 2004; Stohs and Bagchi, 1995). In turn, ROS induce lipid, protein and
DNA oxidation, which may result in cell damage (Nordberg and Arnér, 2001; Samipillai et
al., 2009).
Taking into consideration that ROS overproduction has been involved in many human
diseases, antioxidant compounds from plants have emerged as important alternatives for the
prevention and treatment of these disorders (Nabi et al., 2013; Roman Junior et al., 2013). In
this sense, antioxidants potentially could aid in the treatment and prevention of Hg toxicity in
exposed populations. In fact, extracts of different plants have shown protective effects against
neurotoxicity and acute renal failure caused by methyl mercury and mercury chloride (HgCl2),
respectively (Ahn et al., 2002; Farina et al., 2005; Linares et al., 2004).
Plinia trunciflora (O. Berg) Kausel, popularly known in Brazil as jaboticabeira, is a
plant species found in forests of South America, especially in Brazil, Argentine and Paraguay.
It belongs to Myrtaceae family, which encompasses a wide range of members rich in
flavonoids, a class of phenolic compounds mainly represented by the anthocyanin pigments
(Reynertson et al., 2005; Schreckinger et al., 2010). Many beneficial properties have been
66
attributed to these compounds, among them, antioxidant, anti-diabetic (Sun et al., 2012),
antibacterial, antitumor, antiviral as well as cytoprotective effect on the vascular system, liver
and pancreas (Cazarolli et al., 2008). In addition, P. trunciflora is specifically used in the folk
medicine for diarrhea and skin irritations, stomach disorders, diabetes and hypertension
(Reynertson et al., 2005; Dragano et al., 2013).
However, investigations regarding the effects of Plinia trunciflora on the oxidative
stress and renal function impairment induced by heavy metals are still unknown. Based on the
fact that ROS play a pivotal role in Hg toxicity, we proposed to evaluate the protective effect
of P. trunciflora on the oxidative stress and renal function impairment induced by HgCl2 in
rats.
2. Materials and Methods
2.1 Extract preparation
P. trunciflora was collected in Alpestre (Brazil, RS) (27 ° 10'56 .82 "S and 53 ° 7'19
.55" O) in the end of September/2012, which was considered the fruiting time. It was
taxonomically identified by Marcos Eduardo Guerra Sobral (the voucher n° MBM #3302 was
deposited at UNOCHAPECO herbarium). The aqueous extract of Plinia trunciflora (PT) was
obtained according to Kuskoski et al. (2005), where 100 grams of whole frozen fruit was
triturated with 200 ml of acidified aqueous solution (pH 1.5). The mixture remained
refrigerated at 4 ° C for 12 hours protected from light. The mixture was centrifuged and the
supernatant was subjected to lyophilization. Previously to administration of PT to the animals,
the dry extract obtained was dissolved in ultrapure water.
2.2 Animals
Experiments were performed with 12 week-old male Wistar rats from our breeding
facility (268.7 ± 24.5 g b.w., n=30). They were maintained in cages (4 animals/cage) with 12hour light/dark cycle (lights on at 8:00h and off at 20:00h), under controlled environmental
conditions (22  1 °C, with free access to water and food [Nuvilab CR1]) for at least two
weeks before experiments. All procedures were carried out in accordance with Guiding
Principles for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH publication #85.23, 1985) and
institutional policies on the handling of experimental animals (ethics committee approval #
003/2013).
67
2.3 Experimental Protocol
Animals were distributed in 6 to 8 in each group (8 animals for the control group and 6
animals for other groups), totaling 32 rats. They received vehicle (Milli-Q water) or PT (0,
200 or 800 mg/kg) by oral gavage (1 mL/kg body weight). After 6 h, animals were
subcutaneously exposed (1 mL/kg body weight) to vehicle (120 mM NaCl, 10 mM phosphate
buffer, pH 7.4) or HgCl2 (5 mg/kg). The Hg dose was based on the studies of Augusti et al.
(2007; 2008), which demonstrated that 5 mg/kg HgCl2 inhibited δ-ALA-D activity, and
caused alterations in the antioxidant enzyme activities and oxidative damage parameters (lipid
peroxidation and carbonyl protein levels) in rat kidneys. In addition, the dose of 5 mg/kg
triggers a mild or moderate oxidative stress in renal cells (Lund et al., 1993). PT doses used in
this study have previously been defined in our pilot studies with P. trunciflora (Sacchet et al.,
submitted). Twelve hours after HgCl2 exposure, rats were anaesthetized with an
intraperitoneal injection of xylazin 10 mg/kg plus ketamine 75 mg/kg. Blood samples were
collected by punction of inferior cava vein into tubes without anticoagulant and centrifuged at
3000 x g for 10 min to obtain the serum. Serum was immediately removed and stored at -20
ºC until determination of creatinine and urea levels. Animals were euthanatized by anesthetics
overdose and kidneys were removed. The left kidney was homogenized in 3 volumes of
buffered saline (120 mM NaCl, 30 mM potassium phosphate, pH 7.4). The homogenate was
centrifuged at 3000 x g at 4 ºC for 10 min to yield a low-speed supernatant that was used to
determine δ-ALA-D activity, thiobarbituric reactive species (TBARS), non-protein thiol
groups (NPSH), antioxidant enzyme activities such as superoxide dismutase (SOD), catalase
(CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione S-transferase (GST). The right kidney
was removed, cut and separated for the histopathological analysis.
2.4. δ-Aminolevulinate dehydratase activity
After addition of sample to the incubation medium, the reaction was carried out at 39
°C for 180 min. The formed final product was determined using Ehrlich’s reagent at 555 nm
with a molar absorption coefficient of 6.1 x 104 for the Ehrlich-porphobilinogen salt. Results
were expressed as nmol porphobilinogen/h/mg protein (Sassa et al. 1982).
2.5. Lipid peroxidation
Lipid peroxidation was assessed by method described by Ohkawa et al. (1979) after
previous addition of 7.2 mM butylated hydroxytoluene to supernatants to avoid further
oxidation. This method consists in measuring the colored compound produced after
68
incubation of samples with thiobarbituric acid (TBA) in acid medium (TCA 10%) during 1h
at 100 ºC. Following incubation period, samples were extracted with n-butanol and the
reaction product was determined at 535 nm using a standard curve of 1,1,3,3tetraethoxypropane (Ohkawa et al. 1979). Data were expressed as nmol MDA/min/mg
protein.
2.6. Non-protein thiol groups
One volume of the low-speed supernatant fraction was mixed with 1 volume of 10%
trichloroacetic acid, followed by centrifugation and neutralization of the supernatant (to pH
7.5) with 1 M Tris as described by Jacques-Silva et al. (2001). Non-protein thiol groups were
immediately determined as described by Ellman (1959) at 412 nm after reaction with 5,50dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB). A standard curve using cysteine was used to
calculate the content of non-protein thiol groups in tissue samples.
2.7 Antioxidant enzyme activities
Superoxide dismutase (SOD) activity was determined spectrophotometrically based on
its ability to inhibit the autooxidation of epinephrine to adrenochrome at alkaline pH,
according by Misra and Fridovich (1972). SOD activity was expressed as the amount of
enzyme that inhibits the oxidation of epinephrine by 50%, which is equal to 1 unit. Catalase
(CAT) activity was determined using hydrogen peroxide (H2O2) as substrate (Aebi, 1984).
The pseudo-first order reaction constant (k) of the decrease in H2O2 absorption at 25 ºC was
determined and specific activity was expressed as k/g protein. Glutathione peroxidase (GPx)
activity was determined using glutathione reductase and NADPH. The method is based on the
oxidation of NADPH at 25 ºC, which is indicated by the decrease in absorbance at 340 nm,
according to Paglia and Valentine (1967). GST activity was determined by measuring the
increase in absorbance at 340 nm using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene as the substrate,
according Habig and Jakoby (1981).
2.8 Biochemical assays
Serum creatinine and urea levels were determined using routine laboratory kits (Doles
reagents, Goiânia, GO, Brazil). Protein was measured according to Lowry et al. (1951) using
bovine serum albumin as the standard.
69
2.9 Histopathological analysis
Renal tissue was fixed in 10% formalin, dehydrated in an ascending graded series of
ethanol, cleared in xylene and embedded in paraffin. Sections of 5 μm were obtained with a
standard microtome and were mounted on glass slides. The sections were later stained with
haematoxylin and eosin for histological analyses. Slides were examined by observers blinded
to the treatment, following a predetermined scoring system (Rumbeiha et al., 2000), which
express the results as a tubular damage score. Hence, normal kidneys received a score of 0,
while kidneys with mild tubular necrosis received a score of +1 and those with severe
necrosis received a score of + 3.
2.11 Statistical analysis
Comparisons among groups were performed using one-way analysis of variance
(ANOVA) followed by Tukey’s post hoc test. Data that did not exhibit a normal distribution
were transformed (log transformation) before analyses in order to meet ANOVA assumptions.
Variables that did not show a normal distribution even after the transformation (NPSH,
TBARS, SOD, GPx e GST) were analyzed by nonparametric Kruskal-Wallis ANOVA
followed by a multiple comparison test when required. Results were expressed as the means ±
SEM. Differences were considered statistically significant when p < 0.05. All statistical tests
were performed using STATISTIC 6.0 program.
3. Results
3.1 Effect of PT on the δ-ALA-D activity and oxidative damage parameters in rat kidneys
exposed to mercury
PT pre-treatment did not prevent the δ-ALA-D activity inhibition or the NPSH levels
reduction in rat kidneys exposed to Hg (p > 0.05, Fig. 1A and B). On the other hand, the
highest dose of PT (800 mg/kg) attenuated the increase of renal TBARS levels induced by Hg
exposure (~34% of attenuation) compared to Hg exposed group (PT0), p < 0.05, Fig. 1C),
thereby indicating a protective effect on lipid peroxidation induced by the metal.
3.2 Effect of PT on the antioxidant enzyme activities in rat kidneys exposed to mercury
As shown in Fig. 2, PT pre-treatment generaltt exerted a partial protective effect on the
decrease of antioxidant enzyme activities observed in Hg exposed rats (Fig. 2). This
protection was verified for SOD and GST activity (~50% and ~160% of increase in
70
comparison to Hg exposed group, p < 0.05, Fig. 2 A and D, respectively) only at the highest
dose (800 mg/kg). In turn, this protection was observed for GPx at both PT doses (200 and
800 mg/kg), which ranged approximately 80 and 90% of increase, respectively, in comparison
to the Hg exposed group (p < 0.05, Fig. 2C). Different from these enzymes, neither Hg
exposure nor PT affected the CAT activity in rat kidneys (Fig. 2B).
3.3 Effect of PT on the renal function markers and histopathological analysis of rat kidneys
exposed to mercury
Alterations in serum markers of renal function and histopathological analysis indicate
that Hg exposure model used in this study effectively induced renal damage in Hg exposed
rats. In this regard, HgCl2 lead to an increase in serum urea levels (297% increase, p < 0.05,
Fig. 3A) and a decrease in serum creatinine levels (>50% decrease, p < 0.05, Fig. 3B). In turn,
PT was ineffective in preventing alterations in both renal function markers, but very
interestingly, both doses of PT attenuated the histopathological changes observed in the Hg
treated group without extract (PT0) (p < 0.05, Fig. 4A-E).
4. Discussion
Oxidative stress is involved in the mechanisms of nephrotoxicity induced by Hg
(Augusti et al., 2007; 2008; Perottoni et al., 2004; Stohs and Bagchi, 1995). In this sense,
inhibition or depletion of sulfhydryl-dependent molecules such as δ-ALA-D enzyme, GSH
tripeptide and thioredoxin protein, as well as selenoproteins have widely been implicated
among the main targets of Hg toxicity (Carvalho et al., 2008; Carvalho et al., 2011; Emanuelli
et al., 1996). Accordingly, sulfhydryl-dependent molecules depletion can lead to severe
oxidative damage and cell death (Nordberg and Arnér, 2001). Based on these findings, many
studies have investigated the usefulness of antioxidant compounds in the prevention or
treatment of experimental toxicity induced by Hg (Joshi et al., 2014; Yang et al., 2011).
Here we showed that PT was not able to protect against renal δ-ALA-D activity
inhibition or NPSH levels reduction induced by Hg. In contrast, the higher dose of PT (800
mg/kg) alleviated the increased in TBARS levels in rat kidneys exposed to Hg. In this regard,
lipid peroxidation has been attributed to the ROS overproduction triggered by inorganic Hg
exposure, which in turn, causes severe renal damage and a variety of toxic effects in other
organs and systems (Stohs and Bagchi, 1995; Zalups and Diamond, 1987). In fact, the
reduction of renal NPSH levels along with increased TBARS levels indicate that free radicals
71
production exceeded the antioxidant capacity of renal cells. Hence, the protective effect of PT
on renal TBARS levels might be attributed to the presence of compounds with antioxidant
properties in this extract.
Plant species from Myrtaceae family known as jaboticabeira present a wide range of
bioactive compounds. Among the phenolic compounds, the anthocyanins have been widely
characterized in these species (Reynertson et al., 2006; Wu et al., 2012). Many authors report
the cyanidin 3-O-glucoside as the major anthocyanin in different species of jaboticaba, but
delphinidin 3-O-glucoside and cyanidin 3-O-galactoside are also reported (Leite-Legatti et al.,
2012; Wu et al., 2012). Accordingly, PT extract presented cyanidin 3-O-glycoside,
delphinidin 3-O-glycoside, malvidin 3-O-glycoside and cyanidin as its major anthocyanins,
which composed 31, 27, 19 and 18% of total of indentified anthocyanins by HPLC-DAD
(Sacchet et al., submitted). Compounds with scavenger activity other than anthocyanin, such
as p-hydroxibenzoic acid, coumarins, ellagitannins, gallic acid, dapsides and a series of other
flavonoids compounds are also found in these plants in different studies (Aqil et al., 2012
Reynertson et al., 2006; Wu et al., 2012). However, studies focusing on the benefits and
biological compounds of P. trunciflora are still scarce. To date, this is the first study reporting
antioxidant activity and protective effect of P. trunciflora in an in vivo model of Hg exposure.
The decreased activity of antioxidant enzymes along with increased lipid peroxidation
and reduced NPSH levels in rat kidneys exposed to Hg support the imbalance in the oxidative
status, which ended up in renal tissue damage. The latter is supported by the alterations in the
renal function markers and histopathological analysis. SOD, GPx and GST inhibition by Hg
also was previously demonstrated by other authors (Bharathi and Jagadeesan, 2014; Gado and
Aldahmash, 2013; Joshi et al., 2014). Enzyme inhibition may be due to a covalent binding of
Hg ions to the reactive amino acid residues in their active site, mainly cysteine and
selenocysteine residues, the latter found in GPx (Carthy et al., 1979; Carvalho et al., 2008;
Carvalho et al., 2011; Shimojo et al., 2002). Moreover, the interaction between Hg and
essential minerals in terms of metabolism and uptake may also have contributed to this
inhibitory effect (Berlin, 1978; Brzóska et al., 2002; Default et al., 2009). Alternatively,
reactive species excessively generated by Hg exposure may have affected the enzyme
structures (Nordberg and Arnér, 2001; Salo et al., 1988). In turn, the effectiveness of PT in
attenuating the antioxidant enzyme inhibition suggest that a protective effect on these
antioxidant enzymes could be attained. In fact, anthocyanin and other flavonoid compounds
are biotransformed in metabolites with free radical scavenging activity (Fernandes et al.,
2013) and restore the decrease in antioxidant enzyme activities and GSH depletion caused by
72
a hepatotoxic agent (Choi et al., 2009). In addition, anthocyanin show chelating properties and
are able to recover the antioxidant enzyme activities by regulating their gene transcription
(Kim et al., 2014).
According to the proposal that the oxidative stress is involved in Hg toxicity, the
protection provided by PT against renal histopathological alterations might be linked to its
antioxidant effects observed in the present study. The mechanisms possibly involved in such
effects could include scavenging activity, ability in restoring the antioxidant enzyme activities
or even chelating properties of phenolic compounds, which might restrict Hg bioavailability
to bind to renal structures, and therefore alleviating the renal tissue damage caused by Hg.
This partial protection of renal tissue by PT was not accompanied, however, by the protection
on the renal function biomarkers (creatinine and urea) levels. These results may be attributed
to the fact that other mechanisms than oxidative stress would be involved in the causes of
nephrotoxicity induced by Hg. In fact, the affinity of Hg by sulfhydryl-dependent molecules
is also implicated in the inhibition of Na+-K+ATPase, (Ca+2-Mg+2)-ATPase and mitochondrial
ATPases enzymes. Consequently, solute and water reabsorption, transport of substrates for
energy metabolism and synthesis of biomolecules are impaired in kidney by Hg (Diamond
and Zalups, 1998). Moreover, the lack of protection of PT on the decrease of renal NPSH
levels may also be involved in the absence of a complete protection of this extract on the renal
damage.
In summary, our results suggest that P. trunciflora exhibits beneficial effects on
nephrotoxicity induced by Hg by attenuating the lipid peroxidation, restoring antioxidant
enzymes activity and protecting against renal tissue damage. Although these protective effects
have not been complete, these results reveal for the first time the antioxidant potential of P.
trunciflora in vivo and provide evidences that this plant species may be useful against Hg
nephrotoxicity. Further studies are necessary to elucidate the potential usefulness of P.
trunciflora in the therapy of mercury poisoning.
Acknowledgements
The authors are grateful to Research Support Fund of Unochapecó (Process number
212/VICE-EPE/2012/UNOCHAPECO).
73
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78
Figure legends
Figure 1. δ-Aminolevulinate dehydratase activity (δ-ALA-D; A), non-protein thiol groups
(SHNP; B) and thiobarbituric acid reactive substances levels (TBARS; C) in kidneys of rats
treated with PT (0, 200 and 800 mg/kg by gavage) followed by mercuric chloride (5 mg/kg,
subcutaneous. Data are expressed as means ± S.E.M. (n=6-8). Different letters on the bars
indicate statistically different results (p < 0.05, ANOVA/Tukey or Kruskal-Wallis ANOVA).
C: control group (without PT or HgCl2); PT0: HgCl2 group; PT200: PT (200 mg/kg) + HgCl2;
PT800: PT (800 mg/kg) + HgCl2.
79
Figure 2. Antioxidant enzyme activity in rat kidneys treated with PT (0, 200 and 800 mg/kg
by gavage) followed by mercuric chloride (5 mg/kg, subcutaneous). (A) Superoxide
dismutase (SOD), (B) catalase (CAT), (C) glutathione peroxidase (GPx) and (D) glutathione
s-transferase (GST). Data are expressed as means ± S.E.M. (n=6-8). Different letters on the
bars indicate statistically different results (p < 0.05), by Kruskal-Wallis ANOVA or
ANOVA/Tukey. C: control group (without PT or HgCl2); PT0: HgCl2 group; PT200: PT (200
mg/kg) + HgCl2; PT800: PT (800 mg/kg) + HgCl2.
80
B
350
2.0
a
Urea (mg/dL)
280
a
a
210
140
70
Creatinine (mg/dL)
A
1.5
1.0
a
a
a
0.5
0.0
0
C
PT0
PT200
HgCl2
PT800
C
PT0
PT200
PT800
HgCl2
Figure 3. Urea (A), creatinine (B) in rat kidneys treated with PT (0, 200 and 800 mg/kg by
gavage) followed by mercuric chloride (5 mg/kg, subcutaneous). Data are expressed as means
± S.E.M. (n = 6–8). *Different from the respective control group, i.e. without PT or HgCl2 (p
< 0.05, ANOVA/Tukey). C: control group (without PT or HgCl2); PT0: HgCl2 group; PT200:
PT (200 mg/kg) + HgCl2; PT800: PT (800 mg/kg) + HgCl2.
81
Figure 4. Representative histology (A-D) and tubular damage score of renal tissue of rats.
Magnification was 40 X. (A) C: control group, (B) PT0: Hg treated group, (C) PT200: PT
200 mg/kg + HgCl2 and (D) PT800: PT 800 mg/kg + HgCl2. In (E) n=8 for C group and n=6
for other groups. *Different letters on the bars represent results significantly different (p <
0.05, ANOVA/Tukey). In (A): Presence of preserved architecture and regular epithelial cells.
In (B), there is a large amount of degenerated tubules with lacy cytoplasm and some necrotic
tubules, with picnotic nucleus (dark and small) and eosinophilic cytoplasm. Presence of loose
cells into the tubules. In (C), we can see degenerated tubules presenting cells with lacy
appearance, some necrotic cells with picnotic nucleus and eosinophilic cytoplasm with loss of
tubular cells. In (D), there are still degenerated tubules with cells with lacy appearance, but
rare necrotic cells with picnotic nucleus and and eosinophilic cytoplasm, with loss of tubular
cells.
82
6 CONCLUSÕES
Baseado nos resultados obtidos, pode-se concluir que a P. trunciflora é uma espécie de
jabuticaba com alto teor de compostos fenólicos, entre os quais as antocianinas ocupam
elevada percentagem. Esses compostos bioativos podem estar envolvidos nos efeitos
antioxidantes observados principalmente in vitro. No entanto, a ausência de proteção contra o
dano oxidativo renal, somado à tendência da P. trunciflora em atenuar o dano tecidual pelo
mercúrio podem estar associados ao fato de que outros mecanismos além do estresse
oxidativo estejam envolvidos na nefrotoxicidade desse metal. Finalmente, a ausência de
toxicidade aguda de P. trunciflora, sugere que essa espécie vegetal tenha grande potencial em
futuras aplicações em indústrias farmacêuticas e/ou de alimentos. No entanto, estudos
posteriores são necessários para melhor elucidar a toxicidade, bem como a atividade
antioxidante de P. trunciflora e atividades biológicas relacionadas a essa atividade in vivo.
83
7 PERSPECTIVAS
No sentido de melhor caracterizar os efeitos promovidos pelos extratos etanólico e
aquoso de Plinia trunciflora, as perspectivas são:

Avaliar a histopatologia, bem como os marcadores de função hepática e renal em
estudo de toxicidade aguda do extrato etanólico de P. trunciflora.

Avaliar a toxicidade crônica dos extratos etanólico e aquoso de P. trunciflora.

Avaliar o potencial protetor do extrato aquoso de P. trunciflora contra a toxicidade
do Hg em estudos de exposição ao Hg utilizando o pós-tratamento com o extrato
aquoso de P. trunciflora;

Elucidar a atividade antioxidante in vivo dos extratos de P. trunciflora em outros
modelos de indução de dano oxidativo.
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UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE