EFEITO DA EXPOSIÇÃO CRÔNICA DE CROMO NA FISIOLOGIA
REPRODUTIVA E DESENVOLVIMENTO DE Tisbe biminiensis
(COPEPODA, HARPACTICOIDA)
Heitor Spinelli Montenegro – [email protected]
Universidade Federal Rural de Pernambuco
Rua Dom Manoel de Medeiros, S/N, Dois Irmãos
CEP: 52171-900 – Recife – Pernambuco
Francisco José Bezerra – [email protected]
Universidade Federal Rural de Pernambuco
Daniella Kelly de Melo – [email protected]
Universidade Federal Rural de Pernambuco
Cristiane Maria Varela de Araújo Castro – [email protected]
Universidade Federal Rural de Pernambuco
Resumo: Copépodos harpacticoides epibentônicos como os da espécie Tisbe biminiensis possuem
características importantes que os colocam como ideais para organismos-teste em bioensaios
ecotoxicológicos. O cromo é uma substância importante para o desenvolvimento dos organismos, mas
em grande quantidade podem causar danos diversos aos indivíduos e populações. O presente estudo
visa contribuir com dados sobre a sensibilidade de T. biminiensis expostos ao cromo em diferentes
estágios de vida. Dois bioensaios foram realizados, um com concentrações de 0,25, 0,50 1 e 2mg/L de
dicromato de potássio (K2Cr2O7) mais o grupo controle por um período de cinco dias, a fim de
observar efeitos na reprodução; e o outro com concentrações de 0,125, 0,25, 0,50 e 1 mg/L de
K2Cr2O7 mais o grupo controle durante 72h, para avaliar os efeitos no desenvolvimento, ambos com
fotoperíodo natural 12h claro/escuro e temperatura de 27 (±1) oC. Diferenças significativas foram
encontradas na fecundidade, sendo o grupo controle significativamente maior do que a concentração
de 1mg/L. Com relação ao número de sacos de ovos produzidos, há uma tendência de diminuição nas
concentrações 1 mg/L e 2 mg/L de K2Cr2O7. Não foram encontradas diferenças siginificativas com
relação ao número de náuplios. Porém existe uma diferença significativa no número de copepoditos,
onde há um aumento na concentração de 0,125mg/L em relação ao controle. Os resultados obtidos no
presente estudo demonstram que o cromo possui efeitos sobre a fisiologia do organismo-teste e
confirma o potencial que T. biminiensis possui para realização de avaliações ecotoxicológicas.
Palavras-chave: Tisbe bimininensis, Dicromato de potássio, Ciclo de vida, Reprodução,
Ecotoxicologia.
EFFECT OF CHRONIC EXPOSURE OF CHROME ON
REPRODUCTIVE PHYSIOLOGY AND DEVELOPMENT OF Tisbe
biminiensis ( COPEPODA , HARPACTICOIDA)
Pg
1
Abstract: Epibenthic harpacticoid copepods as of specie Tisbe biminiensis have important
characteristics that place them as ideal test organisms in ecotoxicological bioassays. Chrome is an
important substance for the development of organisms, but in large amounts can cause various
damages to individuals and populations. This study aims to contribute with data about the sensitivity
of T. biminiensis exposed to chrome at different stages of life. Two experiments were conducted , one
with concentrations of 0,25 , 0,50, 1, and 2mg/L of potassium dichromate K2Cr2O7 plus the control
group for a five day period, in order to observe the effects on reproduction; and the other with
concentrations of 0,125 , 0,25, 0,50 and 1 mg/L of potassium dichromate K2Cr2O7 plus the control
group for 72 h, to avaluate the effects on development, both with natural photoperiod 12 h light/dark
and temperature of 27 (±1) °C. Significant differences were found for fertility, being the control group
significantly higher than the concentration of 1mg/L. Regarding the number of egg sacs produced,
there is a trend of decreasing concentrations of 1 mg/L and 2 mg/L K2Cr2O7. Significatives
differences were not found on the number of nauplii. But there is a significant difference between the
number of copepodites, where there is an increased concentration of 0.125 mg / L compared to
control. The results of this study demonstrate that chrome has effects on the physiology of the test
organism and confirms the potential T. biminiensis has to perform ecotoxicological tests.
Keywords: Tisbe bimininensis, Potassium dichromate, Life cycle, Reproduction, Ecotoxicology.
1. INTRODUÇÃO
A ecotoxicologia é uma ciência multidisciplinar que contempla a química, a toxicologia e
a ecologia. A junção destas três áreas permite uma análise mais completa dos efeitos que substâncias
nocivas podem causar sobre aspectos fisiológicos de organismos expostos e seu sistema ecológico
(MARCHINI, 2005). A adição de elementos tóxicos em ambientes aquáticos produz respostas
complexas nos organismos e estas precisam ser avaliadas, e o uso de bioensaios pode trazer respostas
relevantes sobre os efeitos crônicos ou agudos de determinada substância (SILVA et al, 2007).
No Brasil um grande número de ensaios toxicológicos com animais marinhos está sendo
realizado, tanto para o monitoramento ambiental quanto para estudos metodológicos (RESGALA &
LAITANO, 2002). Infelizmente testes ecotoxicológicos ainda não são muito utilizados na Região
Nordeste (SOUZA-SANTOS & ARAÚJO, 2013).
Metais pesados são encontrados naturalmente no meio ambiente e alguns deles possuem
importância fisiológica para os organismos. Ações antrópicas podem elevar o nível desses metais
tornando-os tóxicos. O cromo existe em várias formas, porém as mais comuns são as trivalentes e
hexavalentes. A forma hexavalente é reconhecidamente tóxica. A disponibilidade do cromo depende
do pH, outros minerais e alguns poluentes orgânicos (MUNIZ & OLIVEIRA-FILHO, 2006; SIMÕES,
2011).
O cromo é encontrado naturalmente em rochas, organismos vivos, solo e névoas
vulcânicas e sua concentração varia de 2 a 3400 ppm dependendo da tipo de rocha. No ar atmosférico
a concentração do cromo é menor que 0,1 µg/m3, em água não contaminada esse valor é de
aproximadamente 1µg/L e na água do mar está em uma faixa entre 1 e 10µg/kg (SILVA &
PEDROZO, 2001).
A maior parte do cromo encontrado em ambientes aquáticos encontra-se em águas
superficiais, na forma de material particulado ou depositada no sedimento. Na água do mar o cromo
hexavalente é o mais estável, podendo ser reduzido a cromo trivalente por matérias orgânicas e ser
depositado nos sedimentos (SILVA & PEDROZO, 2001).
Por possuir um potencial tóxico uma legislação federal controla o número máximo
permitido de cromo na água. Os fatores influenciadores da disponibilidade do cromo fazem com que
existam concentrações aceitáveis distintas para água doce, salobra e salgada. A resolução nº 357 do
Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA), de 2005, dentre outras disposições classifica as
águas salinas em três classes a partir do seu uso e define a quantidade de cromo por litro máximo para
cada classe. A classificação das águas salinas é:
Pg
2
I - classe especial: águas destinadas:
a) à preservação dos ambientes aquáticos em unidades
de conservação de proteção integral; e
b) à preservação do equilíbrio natural das comunidades
aquáticas.
II - classe 1: águas que podem ser destinadas:
a) à recreação de contato primário, conforme Resolução
CONAMA nº 274, de 2000;
b) à proteção das comunidades aquáticas; e
c) à aquicultura e à atividade de pesca.
III - classe 2: águas que podem ser destinadas:
a) à pesca amadora; e
b) à recreação de contato secundário.
IV - classe 3: águas que podem ser destinadas:
a) à navegação; e
b) à harmonia paisagística (CONAMA, 2005).
São definidos apenas níveis máximos de cromo total para as classes 1 e 2. Para a classe 1
o valor máximo de Cr é de 0,005 mg/L e para a classe 2 o máximo aceitável é de 1,1 mg/L de Cromo
(CONAMA, 2005).
Os metais pesados podem ser bioacumulados e biomagnificados através da teia alimentar,
podendo chegar a organismos de topo de cadeia (FERREIRA et al, 2010). Estes podem estar presentes
na água intersticial, no material em suspensão, na água superficial e nos sedimentos. Organismos
planctônicos são importantes por ser a ligação entre os produtores primários e os consumidores de
topo de cadeia. Estes organismos podem ficar expostos ao contaminante presente nos quatro
compartimentos citados (GUSMÃO, 2004).
Segundo Souza et al. (2012) um importante passo para a ecotoxicologia marinha é a
descoberta de organismos apropriados e alguns copépodos bentônicos harpacticoides possuem várias
das características de um organismo-teste. Para Pane et al. (2008) os copépodos são mais sensíveis ou
possuem a mesma sensibilidade que outro crustáceos à poluição e possui características ideais para ser
utilizado como organismo teste, principalmente os harpacticoides. O copépodo da espécie Tisbe
biminiensi possui hábito epibentônico, tornando ele um bom organismo-teste para elementos presentes
na coluna de água e nos sedimentos. O seu pequeno tamanho, curto ciclo de vida e a sua alta taxa de
fecundidade também são fatores importantes para o uso dessa espécie em ensaios ecotoxicológicos
(ARAÚJO-CASTRO, 2008).
É comum a realização de ensaios ecotoxicológicos usando larvas de ouriços-do-mar e
bivalves. A CL50 com relação ao cromo para os larvas dos ouriços Arbacia lixula, Lytechinus
variegatus e para o bivalve Perna perna são respectivamente 4,15, 3,99 e 11,08 mg/L (RESGALA &
LAITANO, 2002). Copépodos do gênero Tisbe também estão entre os organismos-teste mais
utilizados e a espécie Tisbe biminiensis possui uma CL50 para K2Cr2O7 maior que as de outros
organismos como Tisbe longicornis e Tiburella viscana (ARAÚJO-CASTRO et al., 2009).
Desta forma, o objetivo deste trabalho é contribuir com dados sobre a sensibilidade do
copépodo Tisbe biminiensis ao cromo avaliando os efeitos deste contaminante sobre o
desenvolvimento e a reprodução e buscando descobrir qual parte do ciclo de vida do organismo-teste é
mais sensível ao cromo.
2. METODOLOGIA
2.1. Cultivo e manutenção de Tisbe biminiensis
O Cultivo de indivíduos da espécie Tisbe biminiensis é realizado desde maio de 2013 no
Laboratório de Ecofisiologia e Comportamento Ambiental (LECA), da Universidade Federal Rural de
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3
Pernambuco (UFRPE). O cultivo é mantido em recipientes plásticos com água do mar com salinidade
de 33. A troca da água é realizada uma vez por semana para manutenção de um ambiente ideal para o
desenvolvimento dos animais. Para a troca da água, todo o conteúdo dos recipientes de cultivo é
vertido por peneira de 63 µm de abertura de malha. Os animais retidos são transferidos para outro
recipiente, previamente limpo, com ajuda de pisceta contendo água do mar e o volume é completado
para 500 mL. O alimento oferecido para os animais consiste de ração básica para peixe alcon®
macerada, a qual é adicionada duas vezes por semana. Os cultivos são mantidos em temperatura de 27
± 1ºC e fotoperíodo natural de 12 h de claro e 12 h de escuro.
2.2. Determinação do número de saco de ovos e fecundidade de Tisbe biminiensis
Para avaliar o efeito do K2Cr2O7, foram preparadas quatro soluções com concentrações
diferentes, 0,25, 0,50, 1 e 2 mg/L. Para se chegar nestas concentrações foram colocados
respectivamente 0,125, 0,25, 0,50 e 1 mL de solução de K2Cr2O7 (1 mg/mL) em quatro balões
volumétricos diferentes com capacidade para 500 mL. Posteriormente, foi adicionado 1 mL de solução
de ração seguindo a seguinte proporção: 0,5 g de ração básica para peixe alcon® e 20 mL de água do
mar filtrada com salinidade 33. Após adição do alimento, foi adicionada água do mar filtrada, a
mesma salinidade, até completar 500 mL. O grupo controle consistiu de 1 mL da solução de ração
mais 499 mL de água do mar.
Cada grupo testado, inclusive controle, consistiu de quatro réplicas, contendo 50 mL da
solução teste mais 10 fêmeas ovígeras, cada, totalizando 200 fêmeas ovígeras do copépodo Tisbe
biminiensis em todo o experimento. Após 24h foram separadas 10 fêmeas de cada concentração e
foram acompanhadas individualmente por cinco dias. Durante o bioensaio sempre que a fêmea
desovava ela era transferida para outro recipiente com a mesma concentração e volume, e o conteúdo
do recipiente teste anterior era fixado com formol a 4% e corado com Rosa de Bengala para posterior
contagem e determinação do número de descendentes produzidos (fecundidade).
2.3. Efeito da exposição crônica na reprodução e no desenvolvimento de T. biminiensis
Para a realização do bioensaio foram utilizadas quatro concentrações de K2Cr2O7, 0,125,
0,250, 0,50 e 1 mg/L, mais o grupo controle. As soluções foram preparadas colocando
respectivamente 0,125, 0,25, 0,50 e 1 ml de solução K2Cr2O7 (1mg/mL) e água do mar filtrada até
completar 1L. Não foi adicionado nenhum tipo de alimentação nas soluções.
Todos os grupos testados foram compostos por cinco réplicas. Cada réplica continha 50
mL da solução e 10 fêmeas do copépodo Tisbe biminiensis. Após acompanhar os copépodos por 72h
todo o conteúdo dos recipientes foi fixado com formol a 4% e corados com Rosa de Bengala para
posterior contagem e observação dos efeitos na reprodução e desenvolvimento.
2.4 Análise estatística
Para análise dos dados obtidos foi utilizado o teste de Análise de Variância (ANOVA)
unifatorial. Antes da execução da ANOVA foram testadas normalidade dos dados, através do teste de
Kolmogorov-Smirnof, e homocedacidade das variâncias, como o teste de Bartlett. O teste de KruskalWallis foi utilizando quando os requisitos para a ANOVA não foram alcançados. O nível de
significância utilizado foi de 0,05. O teste de Dunnett foi utilizado para identificar diferenças
significativas entre as concentrações e o controle.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1 Determinação do número de desovas e de descendentes produzidos de Tisbe biminiensis
Pg
4
número de desovas/5 dias
No presente estudo foi possível observar que as fêmeas do grupo controle apresentaram,
em média, 1,8 (± 0,45) sacos de ovos durante o período de exposição, que consistiu de 5 dias. As
fêmeas expostas às concentrações de 0,250, 0,50, 1 e 2 mg de K 2Cr2O7/L apresentaram 1,75, 1,8, 1,2 e
1 saco de ovos, respectivamente. Não foram identificadas diferenças significativas (Kruskal-Wallis; H
= 6,749, p = 0,150), porém é possível observar uma tendência a diminuição no número de saco de
ovos produzidos nas fêmeas expostas as concentrações de 1 e 2 mg/L (Figura 1).
2,5
2
1,5
1
0,5
0
controle
0,25
0,5
1
2
concentrações de dicromato de potássio (mg/L)
Figura 1 – Número (média ± desvio padrão) de saco de ovos produzidos por Tisbe biminiensis
expostos a diferentes concentrações de K2Cr2O7 (0,25, 0,50, 1 e 2 mg/L) e controle (sem
contaminante) após um período de exposição de 5 dias.
O ciclo de vida do copépodo Tisbe biminiensis pode variar de acordo com sua
alimentação. O tempo total de vida médio é de aproximadamente 30 dias para fêmeas e 26 para
machos. Após atingir a maturidade as fêmeas de T. biminiensis produzem sacos de ovos a cada dois
dias após os náuplios terem eclodido. São produzidos mais de 40 ovos em cada ninhada e esse número
cai cada vez que ocorre a desova (PINTO et al.,2001). O número de sacos produzidos pelas fêmeas
durante os cinco dias de duração do bioensaio no grupo controle e nas duas primeiras concentrações,
0,25 e 0,5 mg/L de K2Cr2O7, está de acordo com o encontrado na literatura, já que o tempo médio
entre uma ninhada e outra é de dois dias e o tempo médio que a Fêmea permanece ovígera é de
aproximadamente dois dias também. As duas maiores concentrações, 1 e 2 mg/L, apresentaram um
número abaixo do esperado para o tempo que durou o bioensaio, uma média de 1,2 e 1 saco de ovos
respectivamente.
Com relação aos efeitos no número de descendentes produzidos, foi verificada diferença
significativa na fecundidade (ANOVA, F = 3,492; p = 0,009). Fêmeas expostas as maiores
concentrações (1 e 2 mg/L) de K 2Cr2O7 apresentaram uma diminuição na fecundidade, 9,43 (± 11,73)
e 30,25 (± 23,92) respectivamente, sendo o grupo exposto a 1 mg/L significativamente (Dunnett, p <
0,05) menor em relação ao controle (Figura 2). O grupo controle apresentou fecundidade total média
de 54 (± 23,02), enquanto que os grupos de fêmeas expostos as concentrações de 0,25 e 0,5 mg/L de
dicromato de potássio apresentaram uma média de 63,25 (± 31,12) e 48 (± 30,40), respectivamente.
Pg
5
100
fecundidade
80
60
40
20
0
controle
-20
0,25
0,5
1
2
Concentração de K2Cr2O7 em mg/L
Figura 2 - Fecundidade (média ± desvio padrão) do copépodo Tisbe biminiensis expostos a diferentes
concentrações de K2Cr2O7 (0,25, 0,50, 1 e 2 mg/L) e controle (sem contaminante) após um período de
exposição de 5 dias.
O número de náuplios produzidos após cada desova é geralmente maior que 39, podendo
passar dos 70 (PINTO et al., 2001). Esses números estão acima dos observados no presente estudo,
inclusive no grupo controle. Porém, há diferença significativa entre o grupo controle e a concentração
de 1 mg/L de K2Cr2O7 (Dunnett, p < 0,05), mostrando que o cromo teve influência na fecundidade
(Figura 3). Experimentos como o de Okumura (2011) e Pane et al. (2008) confirmam que o cromo
causa efeitos sobre a fisiologia de copépodos e outros organismos.
Figura 3 - Número (média ± desvio padrão) de náuplios de Tisbe biminiensis expostos a
diferentes concentrações de K2Cr2O7 (0,25, 0,50 1e 2 mg/L) e controle (sem contaminante).
Okumura (2011), ao estudar a sensibilidade de Argyrodiapyomus furcatus e
Notodiaptomus iheringi, observou uma redução no desenvolvimento náupliar com o aumento da
concentração de K2Cr2O7. Para A. furcatus houve diferença significativa na maior concentração
utilizada (1,5 mg/L) e para N. iheringi as diferenças significativas foram encontradas nas duas maiores
concentrações (2 e 2,5mg/L). Os estudos realizados por Pane et al (2008) com o Copepoda Tigripus
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6
fulvus apontam que o cromo não causa mudança no número de sacos de ovos produzidos pelas fêmeas
mas que o número de náuplios acaba sendo reduzido.
3.2 Efeito da exposição crônica na reprodução e desenvolvimento de T. biminiensis
Com relação ao número de náuplios (ANOVA, F = 2,39; p = 0,097) não foram
encontradas diferenças significativas. O número médio de náuplios no grupo controle e nas
concentrações 0,125, 0,250, 0,500 e 1,000 mg/L de K2Cr2O7 foram respectivamente 95,5, 33,5, 88,
40,75 e 54,75 (Figura 4). Pode-se observar que o grupo controle apresentou o maior número de
náuplios e a concentração 0,125 mg/L o menor número. O baixo número de náuplios observados pode
ter sido em reflexo da ausencia de comida durate a realização do experimento, o que pode também ter
interferido no desenvolvimento destes para copepoditos. Segundo Pinto et al. (2001) a alimentação vai
interferir no número de náupios produzidos por fêmea. Dhal et al. ( 2008) e Araújo-Castro (2005)
também discutem a importância da alimentação para o desenvolvimento de diferentes espécies de
copépodos.
Figura 4 - Número (média ± desvio padrão) de náuplios de Tisbe biminiensis após 72h de exposição a
diferentes concentrações de K2Cr2O7 (0,125, 0,25, 0,50 e 1 mg/L) e controle (sem contaminante).
O número médio de copepoditos no final do bioensaio para o grupo controle, 0,125,
0,250, 0,500 e 1,000 mg/L de K 2Cr2O7 foi respectivamente 2, 11, 3, 6,25 e 1,25 (Figura 05). Assim, a
concentração de 0,125 mg/L apresentou o maior número médio de copepoditos e a concentração de 1
mg/L apresentou a menor média. A diferença significativa observada entre o grupo controle e a
concentração de 0,125 mg/L de K2Cr2O7 (Dunnett’s p. < 0,05) sugere que o cromo exerce nesta
concentração uma interferência positiva no desenvolvimento dos organismos.
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7
Figura 5 - Número (média ± desvio padrão) de copepoditos de Tisbe biminiensis após exposição de
72h a diferentes concentrações de K2Cr2O7 (0,125, 0,25, 0,50 e 1 mg/L) e controle (sem contaminante).
Segundo Araújo-Castro (2009), a espécie Tisbe biminiensis se demonstra mais resistentes
que outros organismos sistematicamente utilizados em ensaios ecotoxicológicos como Tiburonella
viscana e Tisbe longicornis. Okumura (2011), em um estudo sub-crônico encontrou uma inibição no
desenvolvimento do estágio de náuplio para o de copepodito de Argyrodiapyomus furcatus em
concentrações com de 1,5 mg/L de K2Cr2O7, concentração 0,5 mg/L maior que a necessária para
causar uma redução no número de náuplios e fecundidade em Tisbe biminiensis indicadas no presente
estudo.
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados do presente estudo demonstraram que o cromo interfere negativamente em
parâmetros fisiológicos de Tisbe biminiensis, tais como a fecundidade e número de saco de ovos
produzidos.
Foi possível observar uma tendência a uma diminuição na fecundidade nos grupos de
fêmeas expostas nas maiores concentrações testadas, sendo a concentração de 1 mg/L
significativamente menor do que o controle.
O número de saco de ovos produzidos por fêmeas de T. biminiensis ao final de 5 dias de
exposição tende a diminuir com a exposição ao cromo.
Esses efeitos na fecundidade e na produção de sacos de ovos podem contribuir para uma
diminuição na densidade populacional a médio e longo prazo podendo levar a uma morte ecológica e
consequências na teia alimentar a qual esta espécie participa.
Foi possível perceber um desenvolvimento mais acelerado de náulpios para copepoditos
na menor concentração testada (0,125mg/L de dicromato de potássio).
Agradecimentos
Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico Tecnológico (CNPq)
pela bolsa de iniciação científica que proporciona condições para que os trabalhos sejam realizados.
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5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Pg
9