UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA E FISIOTERAPIA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ROSA ELAYNE MARQUES DE FREITAS
AVALIAÇÃO BIOLÓGICA E DE FATORES GÊNICOS MODULADOS
PELOS RETINOIDES NO CICLO CELULAR, PROLIFERAÇÃO,
DIFERENCIAÇÃO, APOPTOSE E NECROSE EM CÉLULAS DE
CRIPTA INTESTINAL DE RATO
FORTALEZA
2014
ROSA ELAYNE MARQUES DE FREITAS
AVALIAÇÃO BIOLÓGICA E DE FATORES GÊNICOS MODULADOS
PELOS RETINOIDES NO CICLO CELULAR, PROLIFERAÇÃO,
DIFERENCIAÇÃO, APOPTOSE E NECROSE EM CÉLULAS DE
CRIPTA INTESTINAL DE RATO
Dissertação apresentada à coordenação do
Curso de Pós-Graduação em Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará como requisito
parcial para a obtenção do grau de Mestre em
Farmacologia.
Área de Concentração: Farmacologia
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Havt Bindá
FORTALEZA
2014
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
F938e
Freitas, Rosa Elayne Marques de.
Avaliação biológica e de fatores gênicos modulados pelos retinoides no ciclo
celular, proliferação, diferenciação, apoptose e necrose em células de cripta intestinal
de rato. / Rosa Elayne Marques de Freitas. – 2014.
90 f.: il. color., enc.; 30 cm.
Dissertação (mestrado). – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia, Mestrado em Farmacologia, Fortaleza, 2014.
Área de Concentração: Farmacologia.
Orientação: Prof. Dr. Alexandre Havt Bindá.
1. Desnutrição. 2. Células Epiteliais. 3. Vitamina A. I. Título.
CDD 615.73
ROSA ELAYNE MARQUES DE FREITAS
AVALIAÇÃO BIOLÓGICA E DE FATORES GÊNICOS MODULADOS
PELOS RETINOIDES NO CICLO CELULAR, PROLIFERAÇÃO,
DIFERENCIAÇÃO, APOPTOSE E NECROSE EM CÉLULAS DE
CRIPTA INTESTINAL DE RATO
Defesa de Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia,
da
Universidade
Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do título de
Mestre em Farmacologia.
Aprovada em: ____ / _____ / _____.
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________
Prof. Dr. Alexandre Havt Bindá (Orientador)
___________________________________________
Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima
_______________________________________
Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
A Deus.
Aos meus amados pais.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço à Deus, pelo dom da vida, da inteligência e da
sabedoria tão necessários nesta caminhada e pela coragem de enfrentar todas as
dificuldades.
À
minha família pelo amor, compreensão e o apoio em todos os
momentos
À Universidade Federal do Ceará, e a todos os que fazem parte do
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.
Ao meu orientador, professor Dr. Alexandre Havt Bindá, pela
orientação, confiança e apoio durante todas as etapas do mestrado.
Ao professor Aldo Ângelo Moreira Lima, agradeço pela oportunidade
de trabalhar no seu grupo de pesquisa e realizar esse trabalho no Laboratório de
Doenças Infecciosas (LDI).
Aos queridos colegas Mara Prata, Vinícius Alves, Paloma Cavalcante
por todos os ensinamentos e boa vontade em ajudar. Sem vocês não seria
possível a realização desse trabalho.
Aos colegas de laboratório, Pedro Quintela e Marco Clementino, pela
grande ajuda e apoio. E todos os outros bolsistas do laboratório por toda
presteza e incentivo.
Ao professor Diego Wilke e as pesquisadora Josiane Quetz e Alba
Fabíola por toda assistência e pela contribuição com seus conhecimentos.
Meu imenso agradecimento a doutoranda em Farmacologia Camila
Fernandes, quem me ajudou, apoiou e incentivou nos momentos de maior
necessidade. Sua presença foi de grande importância para a realização deste
trabalho.
Meu grande agradecimento ao doutorando em Farmacologia, Adelvane
Rodrigues, pela participação na revisão da dissertação, pelas relevantes
contribuições, pelo incentivo e amizade.
Ao meu namorado, César Vieira, pela imensa paciência, apoio e
companheirismo.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) pela concessão da bolsa de pesquisa. E ao INCT-IBISAB pelo
financiamento da pesquisa.
RESUMO
A mortalidade infantil afeta milhões de crianças em todo mundo e a
desnutrição contribui com cerca de um terço dessa mortalidade. A vitamina A já é
utilizada no tratamento da desnutrição infantil. Contudo, poucos ou nenhum estudo
fora realizado, ao nível celular, para avaliar o impacto da suplementação com a
vitamina A em células epiteliais intestinais com desnutrição proteica in vitro. Desse
modo, objetivamos demonstrar os efeitos da desnutrição e do tratamento com
retinoides nos processos de proliferação, apoptose/necrose, ciclo celular e
diferenciação celular, assim como na ativação das vias de sinalização em células IEC6 de rato com desnutrição proteica. Demonstramos que a desnutrição diminuiu a
proliferação celular nos tempos de 6, 12, 24 e 48 horas. Em adição, nos tempos de 24
e 48 horas a suplementação com palmitato de retinol intensificou esta redução em
comparação ao grupo desnutrido. Contudo, a diminuição da proliferação não estava
relacionada à morte celular. Na verdade, o palmitato de retinol reduziu apoptose no
tempo de 48 horas após a indução de desnutrição. Adicionalmente, a desnutrição
estimulou a quiescência celular e a mesma foi intensificada pelo retinol identificada
pelo aumento do percentual de células na fase G0/G1 e diminuição dos percentuais de
células nas fases S e G2/M, principalmente nos tempos entre 24 e 48 horas. Para
verificar se a desnutrição, associada ou não à suplementação dos retinoides,
estimulava a diferenciação celular foi realizada a análise da transcrição gênica dos
marcadores específicos FABP e IAP no período de 42 horas. Os dois retinoides
testados aumentaram em aproximadamente cinco vezes a expressão dos mRNAs de
FABP e IAP. Visto que a diferenciação fora estimulada, foram verificadas quais as
vias de sinalização intracelular, acopladas à ativação da proteína G, estavam ativadas.
Os resultados deste trabalho demonstraram que a desnutrição proteica diminuiu a
transcrição gênica de c-Jun, STAT3, MEF2C, e ATF2, mas aumentou a expressão dos
mRNAs de GLI-3 e c-Fos em relação ao grupo nutrido. Entretanto, os retinoides
aumentaram a transcrição dos mRNAs de ELK-1, SRF, c-Jun, FOXO, STAT3, ATF2,
GLI-3 e NF-κB em relação com o grupo desnutrido. Deste modo, este trabalho
mostrou que a desnutrição interferiu na proliferação estimulando a quiescência
celular. Porém, o tratamento com os retinoides intensificou a quiescência diminuindo
a apoptose com estimulação da diferenciação celular associado com a ativação das
vias moleculares do ATF2, MAPK/ERK/JNK, IL-6, Hedgehog, PI3K/AKT e NF-κB.
Palavras-chave: Desnutrição, Células epiteliais intestinais, e Vitamina A,
ABSTRACT
Infant mortality affects millions of children around the world and malnutrition
contributes about one third of this mortality. Vitamin A is already used in the
treatment of childhood malnutrition. However, few or no study has been done, carried
out at the cellular level, to assess the impact of vitamin A supplementation in
intestinal epithelial cells under in vitro protein malnutrition. Thus, we aimed to
demonstrate the effects of malnutrition and treatment with retinoids in the processes
of proliferation, apoptosis/necrosis, cell cycle and cell differentiation as well as
activation of signaling pathways in IEC-6 rat cells under protein malnutrition. We
demonstrated that malnutrition decreased cell proliferation in periods of 6, 12, 24 and
48 hours. In addition, retinyl palmitate treatment intensified the decrease of cell
proliferation when compared to the malnourished group in the periods of 24 and 48
hours after supplementation. However, the reduction in proliferation was not related
to cell death. Indeed, retinyl palmitate reduced apoptosis in the period of 48 hours
after induction of malnutrition. Additionally, malnutrition stimulated cell quiescence,
and the same was enhanced by retinol, which was identified by the increase in the
percentage of cells in G0/G1 phase and the reduction of the percentage of cells in S
phase and G2/M, especially in periods of 24 and 48 hours. To check if malnutrition,
with or without supplementation of retinoids, was stimulating cell differentiation, we
evaluated the gene transcription of the specific markers FABP and IAP within 42
hours. Both retinoids tested increased approximately 5-fold the expression of FABP
and IAP mRNAs. Knowing that differentiation had been stimulated, we decided to
check which intracellular signaling pathways, coupled to the activation of G proteins,
were activated. Our results demonstrated that protein malnutrition decreased gene
transcription of c-Jun, STAT3, MEF2C and ATF2, but increased the expression of the
GLI-3 and c-Fos mRNAs in relation to the nourish group. However, retinoids
increased the transcription of ELK-1, SRF, c-Jun, FOXO, STAT3, ATF2, GLI-3, NFkB in relation to the malnourished group. Thus, this study showed that cell
malnutrition interfered with cell proliferation stimulating cell quiescence. However,
retinoids treatment intensified cell quiescence, decreased IEC-6 apoptosis and
stimulated cell differentiation associated with the activation of the molecular
pathways of ATF2, MAPK/ERK/JNK, IL-6, Hedgehog, PI3K/AKT and NF-kB.
Key words: malnourish, intestine epithelial cells and Vitamin A.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 13 1.1 DESNUTRIÇÃO ...................................................................................................................................... 13 1.1.1 Epidemiologia ............................................................................................................................. 13 1.1.2 Classificação da desnutrição ................................................................................................ 14 1.1.3 Fatores que influenciam na desnutrição ......................................................................... 15 1.1.4 Consequências da desnutrição ............................................................................................. 16 1.2 ESTRUTURA INTESTINAL .................................................................................................................... 16 1.2.1 Intestino delgado: estrutura anatomofuncional e principias vias de sinalizações .................................................................................................................................................. 16 1.2.2 Consequências da desnutrição na função intestinal .................................................. 21 1.3 VITAMINA A .......................................................................................................................................... 22 1.3.1 Funções .......................................................................................................................................... 22 1.3.2 Suplementação com vitamina A .......................................................................................... 23 1.3.3 Aspectos farmacológicos do retinol ................................................................................... 24 1.3.4 Mecanismos de ativação celular pelos retinoides ....................................................... 26 1.4 VIAS DE SINALIZAÇÃO ......................................................................................................................... 27 1.4.1 Ativação de MAPK por proteínas G .................................................................................... 29 1.4.2 Envolvimento da MAPK no ciclo celular, proliferação e apoptose de células intestinais. .................................................................................................................................................... 30 2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA .......................................................................................... 33 3 OBJETIVOS ................................................................................................................................ 34 3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................................................. 34 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................................... 34 4 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................................... 35 4.1 LINHAGEM CELULAR ........................................................................................................................... 35 4.2 CULTIVO CELULAR E REAGENTES ..................................................................................................... 35 4.3 PLAQUEAMENTO CELULAR E TRATAMENTO COM VITAMINA A EM CÉLULAS DESNUTRIDAS . 36 4.4 ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR .............................................................................................. 37 4.5 ANÁLISE DE APOPTOSE E NECROSE POR CITÔMETRIA DE FLUXO ................................................ 38 4.6 ANALISE DO PERFIL DO CICLO CELULAR POR CITOMETRIA DE FLUXO ...................................... 40 4.7 ANÁLISE DA TRANSCRIÇÃO GÊNICA RELACIONADA AOS GENES MARCADORES DE DIFERENCIAÇÃO CELULAR E VIAS DE ATIVAÇÃO INTRACELULAR ............................................................ 42 4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................................................ 44 5 RESULTADOS ........................................................................................................................... 45 5.1 EFEITO DA DESNUTRIÇÃO E TRATAMENTO COM RETINOL E PALMITATO DE RETINOL NA PROLIFERAÇÃO CELULAR. .............................................................................................................................. 45 5.2 EFEITO DO TRATAMENTO COM RETINOL E PALMITATO DE RETINOL NA APOPTOSE E NECROSE EM CÉLULAS DESNUTRIDAS. .......................................................................................................................... 46 5.3 EFEITO DA DESNUTRIÇÃO E DO TRATAMENTO COM RETINOL E PALMITATO DE RETINOL NO CICLO CELULAR. ............................................................................................................................................... 48 5.4 ANÁLISE DA DIFERENCIAÇÃO CELULAR ESTIMULADA PELO TRATAMENTO COM RETINOL E PALMITATO DE RETINOL EM CÉLULAS DESNUTRIDAS. .............................................................................. 50 5.5 ANÁLISE DAS VIAS DE SINALIZAÇÃO DESENCADEADAS PELOS TRATAMENTOS COM RETINOL E PALMITATO DE RETINOL EM CÉLULAS DESNUTRIDAS. .............................................................................. 52 6 DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 55 7 CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 67 8 PERSPECTIVAS ........................................................................................................................ 68 9 BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................ 69 LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Anatomia do epitélio do intestino delgado e esquema da diferenciação
celular a partir das células indiferenciadas. ................................................................. 18 Figura 2 - Ilustração de algumas vias de sinalização envolvidas na modelagem do
epitélio intestinal. ......................................................................................................... 20 Figura 3 - Mecanismo de ação da via Hedgehog na estrutura intestinal...................... 21 Figura 4 - Principais formas de Vitamina A. ............................................................... 24 Figura 5 - Metabolismo intracelular do retinol e ação nuclear. ................................... 27 Figura 6 - As cascatas convencionais da MAPK e seus efeitos. ................................. 29 Figura 7 - Estrutura química das duas formas de Vitamina A utilizada nos
experimentos. ............................................................................................................... 36 Figura 8 - Esquema do tratamento das células IEC-6. ................................................. 37 Figura 9 – Figura representativa da análise da frequência de células em apoptose e
necrose. ........................................................................................................................ 40 Figura 10 – Figura ilustrativa do dot plot de exclusão das células agregadas. ............ 41 Figura 11 – Figura representativa da análise do ciclo celular no modelo de Watson. . 42 Figura 12 - Tempo-efeito do tratamento com retinol ou palmitato de retinol sobre a
proliferação celular em células desnutridas. ................................................................ 46 Figura 13 - Cinética da análise de apoptose e necrose dos grupos nutridos, desnutridos
e tratados com vitamina A. .......................................................................................... 47 Figura 14 - Cinética da distribuição nas fases do ciclo celular das células desnutridas e
tratadas com retinol e palmitato de retinol. .................................................................. 49 Figura 15 – Expressão dos principais genes relacionados com a diferenciação celular
nas células desnutridas tratadas com retinol e palmitato de retinol. ............................ 51 Figura 16 - Efeito do retinol e do palmitato de retinol sobre a transcrição genica de
mediadores das vias de sinalização celular em células IEC-6 desnutridas. ................. 53 Figura 17 - Efeito do retinol e do palmitato de retinol sobre a transcrição genica de
mediadores das vias de sinalização celular em células IEC-6 desnutridas. ................. 54 LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Distribuição em regiões da prevalência (%) da desnutrição no Brasil em
2013. ............................................................................................................................. 14 Tabela 2 – Funções de algumas vias de sinalização importantes para o trato
gastrointestinal. ............................................................................................................ 32 Tabela 3 - Sequência dos iniciadores utilizados. ......................................................... 44 Tabela 4
– Valores das médias ± E.P.M das análises da transcrição dos genes
relacionados à diferenciação em células desnutridas tratadas com retinol ou Palmitato
de retinol. ..................................................................................................................... 50 Tabela 5: Resumo dos resultados da transcrição gênica para as vias analisadas em
comparação ao grupo desnutrido. ................................................................................ 66 1
INTRODUÇÃO
1.1
1.1.1
Desnutrição
Epidemiologia
A mortalidade de crianças menores de cinco anos vem diminuindo no
mundo, passando de 12,6 milhões em 1990 para 6,6 milhões em 2012. Isto significou
uma redução de cerca de 17.000 mortes a cada dia. Desde 1990, a taxa global de
mortalidade diminuiu 47% até 2012. Todas as regiões, exceto a África Subsaariana e
a Oceania reduziram sua taxa de mortalidade infantil em 50% ou mais (UNICEF et
al., 2013).
As principais causas de mortalidade entre as crianças menores de cinco
anos incluem: pneumonia (17%), complicações de parto prematuro (15%), as
complicações durante o parto (10%), diarreia (9%) e malária (7%). Globalmente, mais
de 40% das mortes de crianças menores de cinco anos são atribuídas à desnutrição
(UNICEF et al., 2013).
Os três principais tipos de desnutrição são classificados a partir de dados
antropométricos: baixo peso para idade (P/I - “underweight” ou desnutrição ponderal
- o indicador de desnutrição mais utilizado no brasil), baixa estatura para idade (E/I “stunting” ou desnutrição crônica) ou baixo peso para estatura (P/E - “wasting” ou
desnutrição aguda) (COUTINHO; GENTIL; TORAL, 2008; GOULART, 1997;
UNICEF_BRASIL, 2006).
De acordo com estimativas das Nações Unidas, em 2011, cerca de 100
milhões (16%) de crianças menores de 5 anos em todo mundo, apresentavam
desnutrição ponderal, outras 160 milhões (26%) apresentavam desnutrição crônica e,
em menor grau a desnutrição aguda, afetando aproximadamente 51 milhões de
crianças (8%) (UNICEF; WHO; WORLD BANK, 2012; UNICEF; WHO, 2013). Em
2010, a Organização Mundial de Saúde atribuiu mais de um terço de todas as mortes
infantis em todo o mundo à desnutrição, principalmente ao déficit ponderal. Apesar
das prevalências de desnutrição infantil ponderal e crônica estarem diminuindo ao
longo dos anos, o progresso geral é insuficiente e milhões de crianças ainda
continuam em risco (WHO et al., 2010).
13
No Brasil, a análise no Sistema de Vigilância Alimentar e Nutricional do
Ministério da Saúde revela que, em 2013, a taxa de desnutrição ponderal, crônica e
aguda estavam estimadas em 4.28% 10.18% e 4.71%, respectivamente. No entanto, a
distribuição da desnutrição apresenta diferenças regionais, onde o Norte apresenta as
maiores prevalências (TABELA 1).
Tabela 1 – Distribuição em regiões da prevalência (%) da desnutrição no Brasil em 2013.
Fonte: SISVAN – Sistema de Vigilância Alimentar e Nutricional – Ministério da Saúde (BRASIL,
2014).
1.1.2
Classificação da desnutrição
A dieta necessária para um indivíduo se manter nutrido deve conter uma
quantidade adequada de energia (calorias), água, proteína, carboidrato, lipídios,
vitaminas e sais minerais de acordo com as necessidades de cada indivíduo. O estado
patológico da desnutrição ocorre quando órgãos e tecidos não se encontram em bom
funcionamento e saudáveis devido à carência de nutrientes em quantidade adequada
para o mantimento das suas funções vitais (WHO et al., 2010).
O desenvolvimento de um estado de desnutrição implica na sequência das
seguintes situações: ingestão insuficiente dos elementos dietéticos, redução nas
reservas corporais, deterioração de funções e lesões morfológicas (MOLINA;
PELISSARI; FEIRHMANN, 2009).
A falta de proteínas e/ou energia numa dieta ocasiona a Desnutrição
Proteico-Energética (DPE). Existem três doenças associadas a DPE, são elas o
marasmo, o kwashiokor e o kwashiorkor marasmático (MOLINA; PELISSARI;
FEIRHMANN, 2009).
O marasmo é a mais comum das síndromes e caracteriza-se clinicamente
14
pela depleção dos estoques de gordura subcutânea, perda de massa muscular e
ausência de edema. Provém de uma adaptação fisiológica do corpo em resposta à
privação severa de calorias e nutrientes. (GROVER; EE, 2009). O kwashiorkor é uma
síndrome de difícil identificação comparada ao marasmo, pois o indivíduo tem um
peso quase normal para a idade. Resulta de uma dieta que consiste de uma ingestão
calórica razoavelmente normal porém deficiente de proteína (SIDRANSKY, 1976). É
caracterizado pela presença de edema, abdômen distendido e hepatomegalia.
(AHMED; RAHMAN; CRAVIOTO, 2009; JAHOOR et al., 2008). Já o kwashiorkor
marásmico apresenta um quadro misto, com características de raquitismo e edema
(GROVER; EE, 2009).
1.1.3
Fatores que influenciam na desnutrição
De acordo com o manual de atendimento da criança com desnutrição
grave em hospitais públicos, a desnutrição apresenta-se como uma doença de natureza
sócio-político, ambiental, econômica e, sobretudo derivada da pobreza. A desnutrição
grave acomete todos os órgãos da criança, tornando-se crônica e levando a óbito caso
não seja tratada adequadamente (BRASIL, 2005).
Ressalta-se que o estado nutricional da mãe no momento da concepção e
durante a gravidez é outro fator importante para o crescimento e desenvolvimento
fetal. (BLACK et al., 2008). A falta de aleitamento materno até seis meses, introdução
tardia de alimentos complementares em quantidade e qualidade inadequadas, a
absorção prejudicada de nutrientes por infecções e parasitoses intestinais também são
tidos como agentes propiciadores da desnutrição (SAWAYA, 2006).
Repetidos episódios de doenças infecciosas graves na primeira infância,
tais como, diarreia, pneumonia e malária causam uma acentuada perda de peso,
levando então à desnutrição. A diarreia infecciosa, no entanto, revela-se como o mais
importante sintoma determinante da desnutrição a qual, por sua vez, aumenta a
incidência de duração de novas infecções intestinais, ocasionando um ciclo vicioso de
diarreia-desnutrição (CHECKLEY et al., 2008; FAGUNDES-NETO, 2013;
GUERRANT et al., 2008). Todas essas doenças, associadas com a desnutrição
aumentam o risco de mortalidade infantil (CAULFIELD et al., 2004; WHO et al.,
2010).
15
Ressalta-se que o ciclo vicioso da diarreia-desnutrição é caracterizado
pelo consumo inadequado de alimentos, aumento de doenças, perda de peso, baixa
imunidade, danos na mucosa gastrointestinal, perda de apetite, má absorção do
alimento e alterações importantes no metabolismo (SAWAYA, 2006).
1.1.4
Consequências da desnutrição
A nutrição adequada é essencial na infância para garantir o crescimento
saudável, a formação dos órgãos e realização das suas funções adequadas, um forte
sistema imunológico e o desenvolvimento neurológico e cognitivo (UNICEF; WHO;
WORLD BANK, 2012). A exposição à desnutrição durante períodos críticos do início
da vida pode ter consequências a longo prazo e danos irreversíveis para o
desenvolvimento futuro (HORTON, 2008).
A privação nutricional precoce está associada com o retardo no
crescimento, desenvolvimento físico e mental e baixo desempenho escolar. Estudos
feitos com animais também comprovam a deficiência cognitiva devido a uma
prolongada desnutrição proteico-energética (CHAUDHARY et al., 2013; RICHARD
et al., 2012; WHO et al., 2010)
O sistema imunológico também se apresenta comprometido em crianças
desnutridas, com atrofia dos órgãos linfoides (no timo em particular) e a capacidade
diminuída da proliferação dos linfócitos T (CALDER, 2013; PRENTICE, 1999).
Contraditoriamente, estudos recentes têm reportado que a obesidade e
algumas doenças crônicas, tais como diabetes e outras, se manifestam na vida adulta
estando associadas a uma prévia desnutrição infantil (BLACK et al., 2013; UAUY et
al., 2008) (SAWAYA, 2006).
1.2
1.2.1
Estrutura intestinal
Intestino delgado: estrutura anatomofuncional e principias vias de
sinalizações
O epitélio gastrointestinal forma uma barreira seletiva que separa os
eventos homeostáticos do interstício do lúmen intestinal. A membrana plasmática da
célula epitelial intestinal serve como uma barreira efetiva para a maior parte dos
16
solutos hidrofílicos. Esta barreira deve ser seletivamente permeável para permitir a
absorção de nutrientes, íons e líquidos através do epitélio intestinal ao mesmo tempo
que deve estar equipada com mecanismos de defesa contra ameaças ambientais locais
como, por exemplo, agentes patogênicos invasores (CLAYBURGH; SHEN;
TURNER, 2004; SCHENK; MUELLER, 2008). A barreira intestinal compreende
uma monocamada de células epiteliais que apresenta um número de adaptações
especializadas para a proteção, tais como a formação de junções celulares que vedam
os espaços paracelulares e revestem a superfície apical em conjunto com a secreção
de mucinas e agentes antimicrobianos, que impedem o acesso direto dos
microrganismos pela mucosa intestinal (CLAYBURGH; SHEN; TURNER, 2004;
SCHENK; MUELLER, 2008).
A arquitetura do intestino delgado é composta de vilosidades contíguas e
de criptas. As vilosidades, que se estendem para o lúmen intestinal, são revestidas por
uma única camada de epitélio colunar que contém células terminalmente
diferenciadas. As criptas são invaginações epiteliais na mucosa do intestino
responsáveis pelo potencial proliferativo deste tecido (SCOVILLE et al., 2008).
Nas criptas residem as células-tronco intestinais (CTI), que possuem duas
propriedades funcionais: a capacidade de perpetuar-se ao longo de um período
prolongado de tempo (auto-renovação) e dispor da capacidade de gerar todas as
células diferenciadas do tecido de origem (multipotência) (Figura 1). Ou seja, são
responsáveis por promover a constante renovação da população celular do epitélio
intestinal, além de não ascender em direção à luz intestinal (RICCI-VITIANI et al.,
2009).
Ademais, as CTIs se auto renovam ao longo da vida e produzem um tipo
especial de células denominadas como progenitoras ou transitórias, as quais
preenchem o restante das criptas. As células transitórias tem uma capacidade de autorenovação muito limitada, após três a quatro divisões celulares a sua prole
inevitavelmente se diferencia a uma das linhagens de células maduras (Figura 1)
(RADTKE; CLEVERS, 2005; SOUZA, 2003).
Conforme as células saem das criptas, movendo-se na direção apical, se
diferenciam em enterócitos absortivos ou qualquer um dos três tipos de células
17
secretórias: células caliciformes, células de paneth ou enteroendócrinas. Este processo
é acompanhado por uma redução do ritmo proliferativo e apoptose no ápice da
vilosidade (FIGURA 1) (JIANG; EDGAR, 2012; PINHO, 2009; UMAR, 2010).
Figura 1 - Anatomia do epitélio do intestino delgado e esquema da diferenciação celular a partir das
células indiferenciadas.
Fonte: Radtke e Clevers (2005).
Os enterócitos ou células absortivas, conhecidos ainda como células
colunares, são as mais abundantes entre os tipos celulares. Essas células apresentam
borda em escova, caracterizada por um densa matriz de vilosidades em sua superfície
apical (JIANG; EDGAR, 2012).
As células caliciformes assumem a morfologia permanente de um cálice,
pela contínua produção e acúmulo temporário de vesículas de secreção glicoproteica,
composta principalmente de mucina na região apical, e se localizam distribuídas entre
as células absortivas (enterócitos). Por produzirem grande quantidade de muco, têm
como função lubrificar e proteger o epitélio intestinal. As mucinas adicionam uma
barreira física ao epitélio intestinal, ajudando a conter bactérias comensais no lúmen
do intestino e impedindo a sua adesão nas células epiteliais (RICCI-VITIANI et al.,
2009; SCHENK; MUELLER, 2008).
18
As células de Paneth diferem dos outros tipos de células diferenciadas
uma vez que se encontram dispersas na parte inferior da cripta e não seguem o
percurso migratório ascendente. Elas são responsáveis por secretar proteínas
antibacterianas (lisozima e criptidinas ou defensinas) que impedem ainda mais o
acesso direto dos microrganismos à mucosa intestinal, agindo assim como reguladores
da densidade microbiana e protetores de células-tronco próximas (RICCI-VITIANI et
al., 2009; SCHENK; MUELLER, 2008).
Por último, encontra-se ainda as células enteroendócrinas (dos quais
existem muitos subtipos), menos abundantes, menores e que secretam vários
hormônios intestinais como gastrina, motilina, grelina e peptídeo intestinal vasoativo
(PIV), além de catecolaminas (PINHO, 2009).
Sabe-se que a modelagem do epitélio intestinal depende da interação entre
epitélio e mesênquima, que é controlada por várias vias de sinalização intracelular,
tais como a via de sinalização Hedgehog (Hh), da proteína morfogenética óssea
(BMP), das vias, WNT e Notch, e ainda do fator de crescimento derivado das
plaquetas (PDGF), que são responsáveis por esta comunicação (FIGURA 2). A via
PDGF ajuda a controlar o comportamento do mesênquima e a forma da vilosidade,
porém não influencia na proliferação e diferenciação do epitélio (CROSNIER;
STAMATAKI; LEWIS, 2006).
A via WNT controla o sistema das CTIs, mantendo-as em um estado
contínuo de proliferação. Quando essa via está bloqueada as criptas tendem a
desaparecer. Porém, quando está ativada elas proliferam. A via BMP, por sua vez, é
expressa no mesênquima e é o principal fator que medeia a ação da via Hh, ao
bloquear a formação de criptas ectópicas, a via WNT e a proliferação celular na
junção cripta/vilo. Desta forma, permite que haja a diferenciação celular (FIGURA
3a). A via Notch parece ter uma dupla função. Age juntamente com a via WNT para
manter a taxa proliferativa além de agir nas células progenitoras determinando a
decisão da linhagem de células diferenciadas entre enterócitos ou células secretórias
(MEDEMA; VERMEULEN, 2011).
A via Hh é importante na regulação do desenvolvimento e homeostase do
intestino, participando da formação das vilosidades, garantindo a altura e localização
adequada do vilo e regulando a migração celular (TANG et al., 2006a; ZACHARIAS
et al., 2011).
19
Figura 2 - Ilustração de algumas vias de sinalização envolvidas na modelagem do
epitélio intestinal.
Fonte: Medema e Vermeulen (2011).
A sinalização Hh, que tem atividade tanto autócrina quanto parácrina,
depende da interação entre as proteínas PTCH (Patched) e SMO (Smoothened). A
ativação desta via, no intestino, ocorre através de 2 proteínas homólogas: Sonic
Hedgehog (SHH) ou Indian Hedgehog (IHH). Na ausência de um sinal de SHH ou
IHH, PTCH mantém SMO inativa. Porém, quando se liga a SHH ou IHH essa
inibição é removida. A SMO liberada ativa os fatores de transcrição GLI (1, 2 e 3), os
quais migram diretamente para o núcleo para realizar a transcrição de genes alvo da
via Hh (FIGURA 3b) (HUANG et al., 2013; KATOH; KATOH, 2006). Os fatores de
transcrição GLI podem ativar diversos genes (CyclinD1, N-Myc, Bcl2, Bmi1 e Snail)
envolvidos na regulação do ciclo celular, proliferação, sobrevivência, auto-renovação
e interação mesênquima-epitélio (RUIZ I ALTABA; MAS; STECCA, 2007).
A inibição da via Hh tem efeitos no desenvolvimento intestinal, levando a
uma ausência completa das vilosidades, a persistência de um epitélio bastante
20
proliferativo, com ativação aumentada da via WNT, e deficiência de células
propriamente diferenciadas, indicando assim seu envolvimento da formação das
vilosidades intestinais (CROSNIER; STAMATAKI; LEWIS, 2006; KOSINSKI et al.,
2010; MADISON et al., 2005).
Figura 3 - Mecanismo de ação da via Hedgehog na estrutura intestinal
Fonte: Medema e Vermeulen (2011).
1.2.2
Consequências da desnutrição na função intestinal
A desnutrição desencadeia ao nível intestinal uma diminuição da
maturação dos enterócitos, além de ocasionar um retardo no crescimento e redução da
proliferação celular (GEYRA et al., 2002).
Estudos relatam que a privação de nucleotídeos dietéticos leva a uma
diminuição no conteúdo de enzimas marcadoras da maturação intestinal (fosfatase
alcalina, a leucina-aminopeptidase, maltase, sucrase e lactase). Esses efeitos
aumentam progressivamente no sentido do ápice da vilosidade enquanto há pouco
efeito sobre a zona da cripta. Com base nisto, apoia-se a ideia de que nucleotídeos
dietéticos afetam o estado de maturação do epitélio do intestino delgado (ORTEGA,
M. A., GIL, A., SÁNCHEZ-POZO, 1995).
Estudos in vivo e in vitro reportam que a desnutrição também afeta a
morfologia intestinal, diminuindo a quantidade e altura das vilosidades, a
21
profundidade das criptas, a resistência transmucosa e a proliferação celular, além de
aumentar a apoptose epitelial (UENO et al., 2011). Além disso, também leva a uma
atrofia do intestino delgado e diminui a atividade das enzimas lactase e
aminopeptidase A (LYKKE et al., 2013).
Sobretudo, sabe-se que as alterações intestinais da desnutrição não são
irreversíveis, pois uma única célula de cripta é suficiente para possibilitar a
regeneração da cripta e consequentemente da vilosidade. Desta forma, se ocorrer
alguma lesão que afete algumas criptas/vilos, as células sobreviventes podem
regenerar um número suficiente de criptas, a fim de manter a homeostase epitelial
(UMAR, 2010).
1.3
1.3.1
Vitamina A
Funções
A vitamina A (VA) foi descoberta por volta de 1906, sendo utilizada pela
primeira vez em 1947. A vitamina A é uma vitamina solúvel em lipídios que é
necessária para o bom funcionamento de um conjunto diversificado de atividades
metabólicas e fisiológicas: visão, hematopoiese, desenvolvimento embrionário,
diferenciação celular epitelial e função do sistema imune.
O seguimento estrutural em comum dos retinoides são o anel de
cicloexenil (anel β-ionona) e a cadeia lateral isoprenoide. Todas as atividades da VA
estão ligadas a essas duas características estruturais (CHAPMAN, 2012).
Dentre suas principais funções, a VA modula a visão noturna por meio da
conversão do retinol à 11-cis-retinal na retina e, combinado à proteína opsina forma
as rodopsinas, que são o pigmento visual dos bastonetes que, por sua vez, são os
principais elementos para a visão em baixa luminosidade (LINTIG, 2012). Dados
clínicos demonstram que VA também está envolvida na proliferação e diferenciação
celular, agindo tanto topicamente quanto sistemicamente, além de normalizar o
epitélio hiperproliferativo (CHELI et al., 2003; LAMPEN et al., 2000; ORFANOS et
al., 1997).
Ao nível celular não há um consenso sobre o efeito da VA na produção de
espécies reativas de oxigênio (EROS). Assim, sua ação parece depender do tipo
celular e da dose. Portanto, a VA tem sido descrita tanto como anti- ou pró-oxidante.
Embora a ação oxidante causada pelas EROS esteja relacionada à doenças, a ativação
22
dessa via ocasionada pela VA também foi relacionada com a sobrevivência e
proliferação celular (LINTIG, 2012; ZANOTTO-FILHO; SCHRÖDER; MOREIRA,
2008). Outros estudos ainda apontam para a participação da VA tanto na resposta
imune, com a produção de citocinas específicas e combate à infecções (BERNARD et
al., 2002), quanto na melhoria da absorção de ferro (CITELLI et al., 2012).
1.3.2
Suplementação com vitamina A
A Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda que seja dada uma
dose elevada de vitamina A (50 000 a 200 000 UI , conforme a idade) para todas as
crianças com desnutrição aguda grave no momento da admissão hospitalar, mesmo
que elas não tenham sinais de deficiência de vitamina A. As crianças com sinais
oculares de deficiência de vitamina A ou sarampo recebem até 3 doses altas em 2
semanas (WHO, 2013a). A Organização Mundial da Saúde, através do Grupo
Consultivo Internacional da vitamina A (IVACG), define altas doses de vitamina A
como uma dose igual ou maior do que 25 000 UI (WHO, 2013b).
Alguns estudos comprovam que a suplementação da vitamina A gera
impacto na redução da mortalidade infantil de diversas causas, incluindo sarampo,
diarreia e problemas na visão, como cegueira e xeroftalmia (BATES, 1995). A
mortalidade infantil causada especificamente por diarreia, em crianças entre 6-59
meses foi reduzida em 30% quando suplementadas com vitamina A (IMDAD et al.,
2011). A suplementação de vitamina A também mostrou efeitos benéficos no
tratamento de infecções do trato respiratório. No tratamento do sarampo já se tornou
prática padrão usá-la em doses altas como adjuvante no tratamento, pois diminui
significativamente a morbidade e mortalidade associada à doença (BENOIST et al.,
2000). Entretanto, também foi reportado um aumento do risco de vômitos nas
primeiras 48h da suplementação como efeito adverso (MAYO-WILSON et al., 2011).
Estudos de análise de eficácia da suplementação de vitamina A
verificaram que crianças com desnutrição severa conseguiram um aumento de peso
após a suplementação e que o melhor tratamento se dava com baixas doses de VA,
visto que os resultados de melhora são similares aos de alta dose, porém sem os
eventuais efeitos colaterais. No entanto, para casos de desnutrição juntamente com
sarampo, diarreia severa (Shigelosis) ou deficiência de vitamina A, o uso de uma alta
dose de VA seria mais eficaz (IANNOTTI; TREHAN; MANARY, 2013; MANARY;
IANNOTTI, 2012)
23
A fortificação suplementacaode produtos alimentícios, tais como óleo
vegetal e produtos à base de cereais com vitamina A também é reconhecidamente
uma estratégia viável para o aumento da ingestão de vitamina A. Além do que, não há
problemas de toxicidade devido ao alto consumo se os níveis de fortificação forem
seguidos. (AKHTAR et al., 2013; AMBRÓSIO; CAMPOS; FARO, 2006).
1.3.3
Aspectos farmacológicos do retinol
O termo vitamina A é utilizado para todos os retinoides que têm atividade
biológica do retinol. Assim, a molécula básica de vitamina A é o retinol e, a partir do
seu metabolismo são sintetizados os retinoides funcionais (FIGURA 4). O retinol está
presente em alimentos e tecidos, principalmente na forma de ésteres combinados com
ácidos graxos de cadeia longa. As principais fontes dietéticas de vitamina A são a próvitamina A (na forma de carotenoides obtidos de fontes vegetais) e a pré vitamina A
(retinol, retinal, ácido retinoico e ésteres de retinil) obtida de fontes animais. A
vitamina A pré-formada é a mais ativa em humanos, sendo normalmente utilizada em
suplementos, sob a forma de ésteres de retinil (BATES, 1995; BLOMHOFF, 1990;
MAYO-WILSON et al., 2011).
Figura 4 - Principais formas de Vitamina A.
Fonte: Modificado de Napoli (1999).
Essencialmente, a vitamina A, na forma de retinoides, é emulsificada com
sais biliares, hidrolisada por várias enzimas pancreáticas e hidrolases antes da sua
absorção pelas células intestinais (enterócitos). Os ésteres de retinil são
24
enzimaticamente convertidos à retinol ainda no lúmen intestinal, antes da absorção. A
absorção do retinol é um processo mediado por carreadores. Acredita-se que pelo
menos 2 proteínas estejam envolvidas, a proteína de membrana estimulada por ácido
retinoico 6 (STRA6) e o receptor da proteína de ligação ao retinol 2 (RBPR2)
(ALAPATT et al., 2013; BATES, 1995; REBOUL, 2013).
Após a absorção, e ainda no enterócito, o retinol é complexado à proteína
celular de ligação ao retinol do tipo 2 (CRBP2). Esse complexo serve como substrato
para a reesterificação do retinol pela enzima lecitina:retinol aciltransferase (LRAT).
O retinol que não se liga a LRAT é esterificado pela acyl CoA:retinol aciltransferase
(ARAT). Os ésteres de retinil formados são, então, incorporados e transportados
através de quilomicrons (QM – lipoproteínas intestinais transportadores de lipídios),
que são secretados no sistema linfático (HARRISON; HUSSAIN, 2002; QUICK;
ONG, 1990; ZHONG et al., 2012).
Uma vez no sistema linfático, os ésteres de retinil nos quilomícrons
tornam-se biodisponíveis à todos os tecidos. No fígado, os hepatócitos são os
responsáveis pela captação de aproximadamente 66-75% dos retinides esterificados
contidos nos quilomícrons. Nos hepatócitos, são hidrolisados, transferidos para o
retículo endoplasmático, ligados com a proteína ligante de retinoides (RBP) para,
então, serem transferidos para as células estreladas. Cerca de 50-80% da VA total do
corpo é armazenada nas células hepáticas estreladas. Há também uma captação extra
hepática dos QM remanescentes. Ocorrem principalmente na medula óssea, baço e em
menor quantidade nos tecidos adiposos, musculo esquelético, testículo, pulmão e rins.
Desse modo, esses QM remanescentes podem ser importantes para a distribuição dos
ésteres de retinil para tecidos de intensa proliferação e diferenciação celular, como é o
caso do baço e medula óssea (BLOMHOFF, 1990; LINTIG, 2012).
Quando necessário, o retinol é mobilizado das reservas das células
estreladas para a corrente sanguínea na sua forma alcoólica não esterificada em
combinação com a proteína RBP, a partir da qual é fornecido aos tecidos (KANAI;
RAZ; GOODMAN, 1968; SMITH; GOODMAN, 1976; WHO, 1995). No plasma, o
complexo RBP-retinol se combina com a transtirretina (ttr) (uma proteína plasmática
que evita a filtração glomerular do retinol e a sua subsequente eliminação na urina)
para formar o holo-RBP (FREY et al., 2009). A captação do retinol pelos tecidos
específicos é mediada pela STRA6. A transferência do retinol do RBP para o citosol
através de STRA6 é bidirecional (LINTIG, 2012; RASK; PETERSON, 1976).
25
1.3.4
Mecanismos de ativação celular pelos retinoides
Intracelularmente, os retinoides interagem com proteínas citosólicas e
receptores nucleares. Assim, eles induzem a expressão de genes específicos que
reconhecem o complexo retinoide/receptor. São conhecidas duas classes de receptores
nucleares que medeiam a atividade dos retinoides: o receptor de ácido retinoico
(RAR) e o receptor retinoide X (RXR), ambos membros da superfamília dos
hormônios esteroides/tireoideos/vitamina D. Os receptores RAR e RXR possuem 3
isoformas, alfa, beta e gama, sendo codificadas por diferentes genes, e podendo
interagir na forma de homo e heterodímeros (KHILLAN, 2014).
Entre os metabólitos do retinol, o ácido retinoico (RA) é o que detém a
maior importância biológica, sendo conhecido como a “forma ativa da vitamina A”. O
retinol e o retinal possuem baixa ligação aos receptores RAR e RXR, sendo assim
funcionais como precursores para o ácido retinoico (FIGURA 5) (LAMPEN et al.,
2000; WANG, 2005).
Os receptores retinoides regulam a transcrição de genes ligando-se a
regiões do DNA responsivas ao ácido retinoico denominadas RARE (retinoic acid
response element) (BENOIST et al., 2000), modulando a expressão gênica. Muitos
genes humanos são conhecidos por conter a região RARE (FIGURA 5), e essa
regulação da expressão gênica pode explicar os efeitos da vitamina A na imunidade e
outras funções biológicas. Esses efeitos dos retinoides mediados pelos receptores é
conhecido como via “clássica” ou “genômica” (LAMPEN et al., 2000; ORFANOS et
al., 1997). Alguns estudos evidenciam a importância dessa via na proliferação celular,
como Grenier (2007), que verificou diminuição da proliferação com aumento da
diferenciação celular através da ativação da p38 MAPK induzidos por ácido retinoico
e mediado por RAR (GRENIER et al., 2007). De modo semelhante, Goodman (2012)
verificou o envolvimento dos retinoides na proliferação celular do giro denteado do
hipocampo através da ativação de RARbeta e RARgamma (GOODMAN et al., 2012).
Embora os efeitos de RA sejam mediados principalmente pela formação
dos heterodímeros RAR/RXR, o RXR também pode agir como homodímero ou
heterodímero com vários outros receptores nucleares, como é o caso do receptor do
hormônio da tireoide (TR), receptor ativado por proliferadores de peroxissoma
(PPAR) e receptor da vitamina D nos seus específicos elementos de resposta, afetando
assim diversas vias de sinalização (MARILL et al., 2003).
26
Figura 5 - Metabolismo intracelular do retinol e ação nuclear.
Fonte - McGrane (2007). RA – ácido retinoico; ROH – retinol na forma alcóolica; RE – éster de
retinol; RAR - receptor de ácido retinoico; RXR - receptor retinoide X, RARE - elemento de resposta
ao ácido retinoico (retinoic acid response elemento)
Além disso, os retinoides podem ainda produzir seus efeitos através da via
“não-clássica” ou não “genômica”, onde independem da ação de RAR e RXR. Foi
demonstrado que os retinoides ativam várias vias de sinalização, como por exemplo a
proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), fosfatadil inositol 3 quinase (PI3K),
proteína quinase dependente de AMP cíclico (PKA) e JAK/STAT mediante interação
com receptores acoplados à proteína G (MCGRANE, 2007; MCKENNA, 2012).
Outros trabalhos também apresentam a interação dos retinoides com produção de
espécies reativas de oxigênio (EROS) e consequente ativação das vias de sinalização
p38/MAPK, Akt, JNK e ERK1/2, independentes da ativação de RAR e RXR
(DALMOLIN et al., 2007; GELAIN et al., 2012).
1.4
Vias de sinalização
As MAPKs são uma família de proteínas quinases de serina/treonina que
estão envolvidos na modulação de vários processos celulares, como proliferação
celular, diferenciação, resposta ao estresse e apoptose (BALBI et al., 2009; YANG;
SHARROCKS; WHITMARSH, 2013).
A via de transdução das MAPKs é bastante conservada entre os membros
desta família. Essa via é composta de três quinases: uma MAP quinase quinase
quinase (MAPKKK), que fosforila e ativa uma MAP quinase quinase (MAPKK) que,
27
por sua vez ativa uma MAP quinase (MAPK). As ERKs (quinase regulada por sinal
extracelular), por exemplo, iniciam com a ativação de uma proteína Ras, que ativa a
Raf (MAPKKK), que ativa a MEK (MAPKK), e esta ativa a ERK (MAPK). Uma vez
ativada a MAPK migra do citosol para o núcleo, onde regula a atividade de vários
fatores de transcrição através de fosforilações (AVRUCH, 2007; MARSHALL, 1994;
NISHIDA; GOTOH, 1993). As principais vias da MAPKs incluem a ERK1/2
(também chamadas de p44/42), JNK (c-jun N-terminal kinase), as isoformas de p38
(p38a, β, γ e δ) e ERK5 (ENGLISH et al., 1999).
As MAPKs fosforilam e estimulam a atividade de vários fatores de
transcrição nuclear regulando, assim, a transcrição gênica (TURJANSKI; VAQUÉ;
GUTKIND, 2007). A figura 6 apresenta as principais cascatas da MAPK, os
principais fatores de transcrição ativados e os efeitos desencadeados na célula.
Adicionalmente, a via p38 também está associada à imunidade e às
respostas inflamatórias, regulando vários mediadores de inflamação, dentre os quais o
NF-kB (CARGNELLO; ROUX, 2011; HAYDEN; GHOSH, 2008).
28
Figura 6 - As cascatas convencionais da MAPK e seus efeitos.
Es:mulo&
MAPKs&Convencionais&
Substratos&
Efeitos&&
celulares&
MEF2A&&
MEF2C&&
c$Fos&
Fra$1&&
CREB&&
Ets$1&&
c$Myc&&
Sap$1a&&
ELK$1&&
SMAD$1&&
SMAD$2,&
SMAD4&&
MAF$A&&
p53&&
c$Myb&&
SP1&&
c$Myc&&
c$Fos&&
STAT$3&
Proliferação&
Sobrevivência&
Diferenciação&
&
ATF$2&&
c$Fos&&
p53&&
p73&&
MEF2&A&
MEF2&C&&
STAT$4&&
ELK$1&&
Sap$1a&&
CHOP&&
c$Jun&&
ATF$2&&
ELK$1&
JunD&&
ELK$3&&
p53&&
c$Myc&&
HSF$1&&
NFAT4&
FOS&&
&
Apoptose&
Proliferação&&
Diferenciação&
Produção&de&
citocinas&
Apoptose&
Fonte: Adaptado de Cargnello e Roux (2011); Turjanski, Vaqué e Gutkind (2007) e (Yang, Sharrocks e
Whitmarsh (2003).
1.4.1
Ativação de MAPK por proteínas G
As proteínas G são compostas por três unidades proteicas (α, β e γ) e são
as responsáveis por transmitir a informação dos receptores metabotrópicos para
29
diversos componentes de vias de sinalização. A ativação do receptor faz com que a
subunidade α da proteína G troque GDP por GTP, produzindo a dissociação de α,
ligada à GTP do receptor das subunidade βγ, para desencadear diversas cascatas de
sinalização. As subunidades α e βγ estimulam efetores distintos e regulam várias vias
de sinalização, incluindo a MAPK.
As proteínas G são classificadas de acordo com a estrutura e sequencia da
subunidade α, e suas três principais isoformas são a Gs, Gq e Gi. A proteína Gs
(estimulatória) ativa a adenilato ciclase (AC), que forma AMPc a partir do ATP
(trifosfato de adenosina). O aumento intracelular de AMPc ativa a PKA (proteína
quinase dependente de AMPc). PKA pode estimular ERK1/2 via Rap1–B-Raf quanto
pode inibir via C-Raf (ENGLISH et al., 1999). Pode também estimular p38MAPK via
Rap1 e inibir ERK5. A proteína Gq também pode regular MAPKs através da ativação
de PLCβ (fosfolipase C) que, uma vez ativada, hidrolisa PIP2 (fosfatidil inositol 4,5
bifosfato) para produzir IP3 (1,4,5 trifosfato de inositol) e DAG (1,2 diacilglicerol), o
que resulta na ativação da PKC (proteína quinase C) por via direta (PLC-DAG-PKC)
ou indireta através de liberação de Ca2+ intracelular (PLC-IP3-Ca2+-PKC). Assim, as
vias ERK, JNK, p38MAPK e ERK5 podem ser ativadas através de PLCβ-PKC,
ativado pela subunidade α ou por PLC e PI3K ativados pela subunidade βγ. A
proteína Gi (inibitória) exerce seus efeitos através da inibição de vias inibitórias por
meio da subunidade α. Esta bloqueia as vias PKA-C-Raf e Rap1-GAP-Rap, inibindo
seus efeitos inibitórios em ERK. A subunidade α também pode estimular a via JNK
através da ativação de Rho e CDC42. Já a subunidade βγ também tem efeitos
estimuladores da MAPK, ela ativa PLCβ e PI3K, que ativam Ras e,
consequentemente, ERK e JNK (COBB, 1999; GOLDSMITH; DHANASEKARAN,
2007; MOURA; VIDAL, 2011).
Desse modo, a proteína G pode regular diversos fatores de transcrição
como, AP-1, NF-kB, ATF, STAT3, ELK1, MEF2, através das vias ERK-, JNK-,
p38MAPKs ou ERK5 (GOLDSMITH; DHANASEKARAN, 2007).
1.4.2
Envolvimento da MAPK no ciclo celular, proliferação e apoptose de células
intestinais.
A proliferação, diferenciação e apoptose são eventos de fundamental
importância para o epitélio gastrointestinal, pois em condições normais, as células de
30
cripta intestinais proliferam e, posteriormente, se diferenciam à medida que migram
ao longo do vilos e substituem as células antigas que entram em apoptose e são
eliminados na extremidade da vilosidade em um processo que dura, no máximo, 5
dias. Todo esse processo é de extrema relevância na regulação do número ideal de
células no tecido (BHATTACHARYA et al., 2003; SHACKNEY; SHANKEY,
1999).
A proliferação celular resulta da progressão do ciclo celular, o qual é um
processo complexo que envolve várias proteínas reguladoras que direcionam a célula
através de uma sequencia específica de eventos que culmina na mitose e na produção
de células filhas. Numa população de células em proliferação pode ser reconhecido
quatro fases distintas: fase quiescente (G1), fase de síntese de DNA (S), duplicação do
DNA (G2) e a fase de mitose (M) (NUNEZ, 2001; SCHAFER, 1998).
A ativação das MAPKs é essencial para a regulação do ciclo celular. ERK
pode agir sinergicamente com JNK para ativar o complexo AP1. ERK ativa o fator de
transcrição Elk1 que, juntamente com fator de resposta ao soro (SRF), está envolvido
na expressão de c-Fos, a qual se associa com c-Jun (ativado por JNK) para formar o
complexo AP-1. A atividade desse complexo é necessária para a expressão da ciclina
D1, que está envolvida na progressão do ciclo celular, propiciando a transição G1/S.
(CARGNELLO; ROUX, 2011; KATZ; AMIT; YARDEN, 2007; MARAIS;
WYNNE; TREISMAN, 1993). Além disso, JNK também fosforila outras proteínas
AP1, incluindo JunB, JunD e ATF2. Os membros da família dos fatores de transcrição
Jun (c-Jun, JunB e JunD) formam homo- ou hererodímeros entre eles ou com os
membros da família Fos (c-Fos, FosB, Fra1 e Fra2), para formar os complexos
proteicos AP1 (TURJANSKI; VAQUÉ; GUTKIND, 2007).
A via p38 também tem participação na modulação do ciclo celular,
regulando negativamente, ou seja, atua na infraexpressão de algumas ciclinas,
impedindo as transições do ciclo em G1/S e G2/M (CARGNELLO; ROUX, 2011).
Com relação aos efeitos celulares desencadeados pelas MAPKs, eles
parecem estar envolvidos não apenas com os fatores de transcrição ativados, mas
também com o tempo de ativação da via. No caso de ERK e JNK, uma ativação
prolongada dessas vias pode levar à diferenciação celular, enquanto que uma ativação
transiente ocasionaria proliferação celular (DAVIS, 2000; MURPHY; BLENIS,
2006).
31
Além da participação da via JNK na regulação da proliferação e
diferenciação celular, também já foi descrito seu papel na apoptose, juntamente com
NF-κB. Alguns estudos sugerem que a via JNK desempenha um papel anti- ou próapoptótico dependendo do estímulo e da linhagem celular, em um processo
dependente da ativação de c-Jun ou de caspases (DUNN et al., 2002; IP; DAVIS,
1998; RIESGO-ESCOVAR, 1997). E que o NF-κB poderia inibir a apoptose causada
por JNK, contribuindo para o processo de sobrevivência celular (BHATTACHARYA
et al., 2003).
Desse modo podemos constatar que as MAPKs são potentes reguladores
das vias intracelulares que levam à proliferação, diferenciação e apoptose de células
epiteliais intestinais (ALIAGA et al., 1999) (TABELA 2).
Tabela 2 – Funções de algumas vias de sinalização importantes para o trato gastrointestinal.
Mecanismos envolvidos
Marcadores de Diferenciação Celular
ATF2
Gene
FUNÇÃO
FABP
DIFERENCIAÇÃO CELULAR
IAP
DIFERENCIAÇÃO CELULAR
ATF2
ELK1
MAPK/ERK
SRF
IL-6
STAT3
Hedgehog
GLI3
MEF2
MEF2C
PI3K/AKT
FOXO3-4
Vias de
sinalização
FOS
RESPOSTA AO ESTRESSE
DIFERENCIAÇÃO CELULAR
PROLIFERAÇÃO/DIFERENCIAÇÃO
ANTI-APOPTÓTICO
DESENVOLVIMENTO DO SNC
DIFERENCIAÇÃO
DIFERENCIAÇÃO E SOBREVIVÊNCIA
CELULAR
FORMAÇÃO EIXO CRIPTA-VILOS
MIGRAÇÃO/DIFERENCIAÇÃO
SOBREVIVÊNCIA CELULAR
ANTI-APOPTÓTICO
DIFERENCIAÇÃO CELULAR
PROTEÇÃO AO ESTRESSE
SOBREVIVÊNCIA E DIFERENCIAÇÃO
MAPK/JNK
CELULAR
JUN
1.4.2.1.1
NFk-B
NFk-B
ANTI-APOPTÓTICO
SOBREVIVÊNCIA CELULAR
ANTI-APOPTÓTICO
SNC- Sistema Nervoso Central
32
2
RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
A desnutrição afeta milhões de crianças em todo mundo e contribui
com cerca de um terço de todas as mortes infantis no mundo. Suas
consequências acometem todo o organismo, desde a estatura, desenvolvimento
cognitivo, imunidade e também a absorção intestinal de nutrientes. Devido a
alta prevalência da desnutrição no mundo todo, sua associação com várias
outras doenças infecciosas e suas consequências no organismo, principalmente
no trato gastrointestinal.
A vitamina A já é utilizada no tratamento da desnutrição infantil em
altas ou baixas doses, dependendo da gravidade e idade da criança.
Isoladamente,
apresenta
benefícios
na
visão,
sistema
imunológico,
hematopoiético e participa na proliferação e diferenciação das células epiteliais.
Entretanto poucos estudos a nível celular é realizado associando a vitamina A
com a desnutrição a nível intestinal. Portanto ainda não se sabe seus reais
efeitos e como ocorrem.
Nesse contexto, o presente trabalho originou-se na tentativa de
demonstrar os efeitos da vitamina A no epitélio intestinal em condições de
desnutrição proteica, avaliando seus possíveis benefícios na diferenciação
celular e manutenção da barreira intestinal prejudicada pela desnutrição em
células intestinais IEC-6.
33
3
3.1
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Investigar as consequências da desnutrição proteica na monocamada de
células intestinais, assim como os efeitos do tratamento com Vitamina A (retinol e
palmitato de retinol) em células de cripta intestinal desnutridas.
3.2
Objetivos específicos
Ø Investigar os efeitos da desnutrição de células intestinais na proliferação, ciclo
celular e apoptose.
Ø Avaliar os efeitos de diferentes concentrações do retinol e do palmitato de
retinol no tratamento da desnutrição, utilizando como parâmetros a
proliferação, ciclo celular e apoptose.
Ø Verificar os possíveis efeitos do retinol e do palmitato de retinol na
diferenciação celular.
Ø Avaliar os mecanismos de ação pelo qual o retinol e o palmitato de retinol
exercem seus efeitos no tratamento da desnutrição.
34
4
4.1
MATERIAIS E MÉTODOS
Linhagem celular
Para este estudo, foram utilizadas células derivadas de cripta intestinal de
rato (IEC-6) em passagens de 30 – 40, obtidas da Colecçç̧ão Americana de Cultura
(American Type Culture Collection-ATCC, Estados Unidos).
As células IEC-6 são provenientes da cripta do jejuno de rato e constituem
uma linhagem celular de cariótipo diploide e de crescimento normal in vitro. É
caracterizada por serem células indiferenciadas, aderentes, com características
epitelioides e formadoras de monocamada (QUARONI et al., 1979a). São
amplamente utilizadas em modelos de recuperação intestinal (BAVARIA et al., 2014;
BRAGA-NETO et al., 2008, 2012; GAO et al., 2013; MACIEL et al., 2007).
4.2
Cultivo celular e reagentes
As células foram mantidas em cultivo em meio DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle Medium – Gibco, Estados Unidos) acrescido de 5% de soro fetal
bovino inativado (GIBCO, Estados Unidos), 10 mg de insulina bovina pancreática
(Sigma Aldrich, Estados Unidos), 50U/mL de penicilina (GIBCO, Estados Unidos) 50
µg/mL de estreptomicina (GIBCO, Estados Unidos) e 1mM/mL de piruvato de sódio
(Ginbco, Estados Unidos) e incubadas a 37°C em estufa com 5% de CO2 e 95% de
umidade.
Como substancias testes foram utilizados duas formas de Vitamina A
(FIGURA 7): o Retinol All Trans (Sigma Aldrich, Estados Unidos) e Palmitato de
retinol, utilizado comercialmente, entre outras funções, para tratamento de distúrbios
da má absorção intestinal, sob nome comercial de AROVIT (BAYER). Uma vez que
o Palmitato de Retinol têm peso molecular maior que o Retinol foi utilizado o
equivalente de retinol (ER) para cada dose. Dado que ambas as formas de Vitamina A
são lipossolúveis e fotossensíveis, o DMSO (0,5%) foi utilizado para a diluição e os
experimentos foram conduzidos em ambiente com baixa luminosidade. 35
Figura 7 - Estrutura química das duas formas de Vitamina A utilizada nos experimentos.
Fonte: Product Information Sheet - Sigma-Aldrich (2014)
4.3
Plaqueamento celular e tratamento com vitamina A em células desnutridas
Para determinar o número de células e sua viabilidade para posterior
plaqueamento e tratamento celular foi utilizado o método de exclusão por Azul de
tripan, um composto azólico que penetra nas células inviáveis e se localiza nos
núcleos, os quais se apresentam corados de azul. Para isso, foi retirado todo o meio
das células confluentes em cultura nos fracos de 25 ou 75 cm2 e adicionada tripsinaEDTA (Sigma Aldrich, Estados Unidos) a fim de desagregar as células dos frascos e
entre si. Posteriormente, foram resuspendidas em DMEM com 5% de SFB para a
inativação da tripsina e misturado com azul de tripan 0,4%. Imediatamente após
foram conduzidas para a contagem em câmara de Neubauer sob um microscópio
óptico. As células viáveis foram contadas e as inviáveis foram distinguidas por
apresentarem os núcleos corados de azul.
Para as metodologias seguintes, 2,5 x105células/mL foram plaqueadas em
placas de 96 ou 24 poços e incubadas por 24 horas a fim de propiciar a aderência à
placa e atingir cerca de 80% de confluência. Após esse período, foram lavadas duas
vezes com tampão fosfato salino (PBS - Gibco, Estados Unidos). O grupo nutrido foi
tratado com Glutamina (Glu-), Soro Fetal Bovino 5%. O modelo de desnutrição
celular foi realizado com Glutamina (Glu-), Soro Fetal Bovino 0% de acordo com o
modelo de desnutrição descrito por UENO et al., (2011) e adicionado ou não
concomitantemente das substancias testes – retinol ou palmitato de retinol - nas
concentrações de 2, 3.55, 6.3, 11.25 ou 20 µM (para simplificar, no decorrer do texto
essas doses são descritas apenas por 2, 3, 6, 11 e 20 uM) por 6, 12, 24 e 48h horas
como exemplificado na Figura 8.
36
Essas doses foram idealizadas utilizando como base as doses fisiológicas
de retinol (2uM) e concentrações consideradas tóxicas (20 uM) para certos tipos celulares (ZANOTTO-­‐FILHO, 2009) e feita uma curva logarítmica para delinear as concentrações intermediárias. Figura 8 - Esquema do tratamento das células IEC-6.
•  Ensaio de Proliferação
(6h 12h 24h 48h)
•  Ensaio de Apoptose/Necrose
•  Ciclo Celular
(6h 12h 24h 48h)
•  Análise de Diferenciação Celular
•  Vias de Sinalização
(42h)
4.4
Desnutrição + Tratamento
Palmitato de Retinol
ou Retinol
Concentração: 2µM 3,55µM
6,3µM 11,25µM 20µM
Controle Nutrido
Glu- SFB 5%
Controle Desnutrido
Glu- SFB 0%
Desnutrição + Tratamento
Palmitato de Retinol
ou Retinol
Concentração: 3,55µM 6,3µM
11,25µM
Controle Nutrido
Glu- SFB 5%
Controle Desnutrido
Glu- SFB 0%
Desnutrição + Tratamento
Palmitato de Retinol
ou Retinol
Concentração: 11,25µM
Controle Nutrido
Glu- SFB 5%
Controle Desnutrido
Glu- SFB 0%
Ensaio de Proliferação Celular
A determinação da proliferação e a viabilidade celular foi realizada
seguindo o protocolo modificado descrito por Brito et al. (2005). Além disso, este
método foi utilizado como critério de escolha das melhores doses para as
metodologias seguintes.
Para avaliar a viabilidade e evolução da proliferação, foi utilizado o Kit de
proliferação celular WST-1 (Roche, Alemanha) de acordo com as instruções do
fabricante. Trata-se de um teste colorimétrico de medida indireta que utiliza o
reagente
WST-1
(2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio),
um
sal
de
tetrazólio que uma vez reduzido à formazan torna-se alaranjado. Essa coloração surge
em células metabolicamente ativas através da ação das desidrogenases mitocondriais.
O aumento do número de células viáveis resulta em aumento da quantidade do
37
corante de formazan, o qual é detectável pelo leitor de placas (BERRIDGE et al.,
1996).
A cultura e tratamento das células pelas substâncias testes foi realizada em
placas de 96 poços, nos tempos de 6h, 12h, 24h e 48h e nas concentrações de 2µM
3,55µM 6,3µM 11,25µM 20µM. Após o tempo determinado foi adicionado 10µl do
reagente WST-1 em cada poço, homogeneizado por 1 minuto e incubado a 37ºC por
2h e 30m. Os resultados foram obtidos a partir de um n=12. A leitura da absorbância
pra quantificação das amostras foi realizada no leitor de ELISA em comprimento de
onda de 450nm com referencia em 620nm.
Os experimentos de proliferação celular foram seguidos da análise da
frequência da apoptose celular, com o intuito de verificar se a desnutrição ou o
tratamento com os retinóides testados causavam alguma lesão celular e consequente
apoptose.
4.5
Análise de apoptose e necrose por citômetria de fluxo
Para o ensaio, 2,5 x 105 células/mL foram semeadas em placas de 24
poços e tratadas por 6, 12, 24 e 48h horas, com as substâncias testes, nas
concentrações intermediárias de 3,55µM 6,3µM 11,25µM, uma vez que não foi
possível estabelecer uma única dose a partir da EC50 no experimento de proliferação.
Para a análise em citometria de fluxo foi utilizado o kit Annexin V-FITC Apoptosis
Detection Kit I (BD Bioscience, San Diego, CA, Estados Unidos) e o experimento
realizado de acordo com o protocolo do fabricante. A utilização da Anexina V
conjugada possibilita a marcação de células apoptóticas uma vez que se liga ao
fosfolipídio fosfatadilserina, externalizado da membrana da célula durante o processo
de apoptose. Conjuntamente com o Iodeto de Propídio (PI), permite verificar a
presença de células que perderam a integridade da membrana. Esta marcação dupla
permite a identificação de células que se encontram em uma etapa inicial ou tardia da
morte celular (NETO, 2000).
O sobrenadante de cada grupo (n=3) foi reservado e as células
tripsinizadas (50 µL de tripsina-EDTA e 100 µL de PBS) foram incubadas por 5
minutos a 37ºC. Em seguida foram ressuspendidas no sobrenadante reservado
adicionado de meio DMEM com SFB 5% para neutralizar a ação da tripsina. Após a
38
centrifugação da suspensão celular (3000 rpm; 5min) seguiram-se três lavagens com
tampão de ligação.
Posteriormente foi adicionado 200 µL de tampão de ligação juntamente
com 5 µL de anexina V conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e 5 µL de
PI (iodeto de propídio) e incubados por 15 minutos em ambiente protegido de luz. Por
fim, a suspensão celular foi centrifugada, o sobrenadante removido para retirar o
excesso de anexina e PI e as células ressuspendidas em 300 µL de tampão de ligação.
As amostras foram imediatamente encaminhadas para análise no citômetro de fluxo
FACS Calibur (Becton Dickison, Estados Unidos). Em cada ensaio foram adquiridos
10.000 eventos utilizando o software CellQuest®. Para a posterior análise da
frequência de células em apoptose ou necrose foi utilizado o software FlowJo
(FIGURA 9). Os valores foram apresentados em percentagem de células apoptóticas
e/ou necróticas.
39
Figura 9 – Figura representativa da análise da frequência de células em apoptose e necrose.
4.6
Analise do perfil do Ciclo Celular por Citometria de Fluxo
A análise do ciclo celular foi realizada de acordo com o protocolo
modificado e descrito por Ray et al., (1999).
O método avalia, por citometria de fluxo, a quantidade e integridade do
DNA nas fases do ciclo celular pelo teor e quantidade de Iodeto de Propídeo (PI)
incorporado ao DNA da célula. Desse modo, permite revelar a percentagem de células
em cada uma das 3 fases G1(2n), S (entre 2n e 4n) e G2/M (4n), assim como o
percentural de DNA fragmentado (POZAROWSKI; DARZYNKIEWICZ, 2004).
Células IEC-6 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração
de 105células/mL, foram desnutridas ou não e incubadas com as substâncias testes,
nas concentrações de 3,55µM 6,3µM 11,25µM, por 6, 12 , 24 e 48h. Posteriormente
as células foram tripsinizadas, lavadas com PBS gelado 4ºC, centrifugadas a 3000rpm
40
por 5 minutos, fixadas em etanol 80% gelado -20ºC e mantidas à 4ºC por no mínimo
30 min para a permeabilização celular. Posteriormente foram lavadas novamente com
PBS gelado para remover o etanol, centrifugadas e coradas com 500µL da solução de
PBS contendo de iodeto de propídeo (5µg/ml) e (RNAse 100 µg/ml). Após um
período de 1h de incubação em temperatura ambiente e protegido de luz, a
distribuição das fases do ciclo celular foi determinada através de citometria de fluxo
quantitativa, utilizando o Citômetro de Fluxo FACS Callibur (Becton Dickison,
Estados Unidos).
Em cada ensaio foram contados 10.000 eventos; doublets e células
agregadas foram excluídas de acordo com o protocolo descrito por Wesrto et al.,
(2001) (FIGURA 10). Os histogramas obtidos pelo programa de aquisição Cell-Quest
no citometro foram submetidos a avaliação quanto as fases do ciclo celular utilizando
o programa FlowJo 10_V (2011) e a análise do ciclo celular no modelo de Watson
(FIGURA 11).
Figura 10 – Figura ilustrativa do dot plot de exclusão das células agregadas.
41
Figura 11 – Figura representativa da análise do ciclo celular no modelo de Watson.
4.7
Análise da transcrição gênica relacionada aos genes marcadores de
diferenciação celular e vias de ativação intracelular
Células intestinais IEC-6 foram cultivadas em placas de 24 poços em
condições de nutrição ou desnutrição e na presença das substancias testes na
concentração de 11µM (a de melhor resultados nos experimentos de ciclo celular) por
um período de incubação de 42h. Este tempo foi escolhido visto que o tempo de 48h
foi o tempo onde foi encontrado os melhores resultados nos experimentos de
apoptose/necrose e ciclo celular. Em adição, o período de 42h seria um tempo anterior
à expressão proteica. As células foram encaminhadas para o isolamento de RNA pelo
kit RNeasy mini Kit (Qiagen). A quantidade e qualidade do RNA isolado foram
analisadas espectrofotometricamente através de leituras da absobância em 260 nm e
da razão das absorbâncias de 260/280nm, respectivamente, com o auxilio do
Nanodrop® (Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos).
Cerca de 1 ug de RNA total seguiu para a síntese de cDNA, utilizando o
kit iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). O cDNA sintetizado foi armazenado em
freezer -20°C até a amplificação do mesmo pela Reação de Polimerase em Cadeia em
42
Tempo Real (qPCR). Utilizando o equipamento CFX96 touch
TM
(Bio-Rad), avaliou-
se as expressões dos genes considerados marcadores de diferenciação de células de
vilos - Proteína de ligação de ácidos graxos (FABP) e a Fosfatase alcalina intestinal
(IAP) – e genes relacionados às vias de sinalização dependentes da ativação ou
inibição dos receptores acoplados a proteína-G. (TABELA 3). Como gene de
referência foi utilizado o YWHAZ – polipeptídeo zeta da proteína ativadora de
tirozina 3-monooxigenase/triptofano 5-monooxigenase. Os iniciadores de DNA
(primers) utilizados foram desenhados com base nas sequências de RNA mensageiro
dos genes investigados, obtidas no sítio eletrônico do National Center for
Biotechnology Information (NCBI).
Para a qPCR foi utilizado 10µL da SYBR® Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems, Estados Unidos), 2 µL de cada iniciador (0,2 uM), 1 µL de
cDNA das amostras e o volume completado para 20 µL com água MiliQ estéril. Ao
final da reação foi analisada a curva de dissociação para verificar a especificidade dos
iniciadores. Para tanto, os produtos foram submetidos ao aumento da temperatura a
partir da temperatura de anelamento até que fosse alcançada a temperatura de
desnaturação com acréscimos de 0,5 graus Celsius e permanência de 15 s.
Com os valores de CT (Cycle threshold, ciclo limiar) determinados pela reação de
qPCR, a análise da transcrição gênica relativa foi calculada utilizando o método do 2ΔΔCT
descrito por Livak e Schmittgen (2001). O ΔΔCT foi calculado de acordo com a
seguinte fórmula: ΔCT amostra (CT do gene alvo – CT do gene de referência) - ΔCT amostra
normalizadora
(Média do ΔCT do grupo controle). Uma vez determinado o ΔΔCT , aplicou-
se a fórmula 2-ΔΔCT , que resultou no valor da transcrição gênica relativa. O resultado
final revela quantas vezes o gene de interesse está alterado nas amostras em relação ao
grupo
controle,
tendo
como
padrão
o
gene
de
referência
YWHAZ.
43
Tabela 3 - Sequência dos iniciadores utilizados.
SEQUENCIA DO INICIADOR (5’ - 3’)
MECANISMOS ENVOLVIDOS
GENE
FABP
MARCADORES DE
DIFERENCIAÇÃO CELULAR
ATF2
IAP
ATF2
ELK1
MAPK/ERK
SRF
VIAS DE
SINALIZAÇÃO
IL-6
STAT3
HEDGEHOG
GLI3
MEF2
MEF2C
PI3K/AKT
FOXO3-4
FOS
MAPK/JNK
JUN
NFK-B
NFK-B
E FUNÇÕES DO GENE
TAMANHO
DO
PRODUTO
(PB)
S: GGAAGCTTGGAGCTCATGACA
116
A:GACGCCGAGTTCAAACACAAC
S: AACTACATCGCGCACGTCAT
98
A:GGGGTGGTTGGTCTGTTCTC
S: CTGTAATCACCCAGGCACCAT
199
A:GGGATTCCTGGAACACTAGGC
S: TCCCAGCCATCCTAACAGAGA
130
A:CCTAGCAGGCTTGGGCTAAGT
S: CTTCTCTCAGGCACCATCCAC
160
A:CCCAGCTTGCTGTCCTATCAC
S: AGTTCAAGCACCTGACCCTGA
180
A:TGTTGGAGATCACCACGACTG
S: CCACCCTCCTCATCTTTTTCC
194
A:CTGAAGCTGCAGTGGGGTTAC
S: AGGTCACAGCCCTGAGTCTGA
123
A:GGGATGGTAACTGGCATCTCA
S:TGGAAGAACTCCATCCGYCACA
92
A:ATGATCCACCAAGAGCTCTTGCC
S:GCCTTCACCCTGCCTCTTC
79
A:GCTCCATGTTGCTAATGTTCTTGA
S:GCTGAGTGTCTGTATGCTGGG
119
A:GGACTTGTGGGTTGCTGGG
S:ACGATCTGTTTCCCCTCATC
150
A:TGCTTCTCTCCCCAGGAATA
S– Iniciador senso; A-Iniciador anti-senso.
4.8
Análise Estatística
A análise estatística foi realizada no software GraphPad Prism. Com
exceção da metodologia de biologia molecular, a qual foi aplicado o teste T seguido
do pós-teste Mann-Whitney, para todas as variáveis foi aplicado o ANOVA na
comparação dos controles com os tratamentos, seguido do pós-teste Bonferroni. O
grau de significância utilizado foi de 95% (P<0,05).
44
5
5.1
RESULTADOS
Efeito da desnutrição e tratamento com retinol e palmitato de retinol na
proliferação celular.
A proliferação celular é identificada pelos níveis de absorbância do teste.
Conforme a figura 12, observa-se que a partir de 6h ocorreu uma diferença
significativa entre os valores apresentados para as células dos grupo desnutrido
quando comparado ao grupo nutrido. O grupo nutrido apresentou maior proliferação
que o desnutrido em todos os tempos. Isso demonstra que a desnutrição afetou a
proliferação celular.
No entanto, os grupos tratados tanto com retinol quanto com palmitato de
retinol, só apresentaram diferença em relação ao controle desnutrido a partir do
período de 24h (Figura 12), no qual os grupos tratados com as doses de palmitato de
retinol diminuíram a proliferação, enquanto o grupo tratado com retinol, na dose de
20µM, aumentou a proliferação. Entretanto, no período de 48h (Figura 12), todos as
doses de palmitato de retinol diminuíram a proliferação celular quando comparado ao
controle desnutrido.
45
Figura 12 - Tempo-efeito do tratamento com retinol ou palmitato de retinol sobre a proliferação celular
em células desnutridas.
Os valores da figura representam a média ± E.P.M da proliferação celular em células desnutridas
tratadas com retinol ou Palmitato de retinol. Grupos: Nut - controle nutrido (Glu+, SFB 5%), Des –
controle desnutrido (Glu-, SFB 0%), DMSO – controle DMSO (Glu-, SFB 0%, DMSO 0,5%), outros desnutrido + tratamento com retinol ou palmitato de retinol (doses: 2, 3.55, 6.3, 11.25 ou 20 µM). A
análise estatística foi feito por ANOVA seguida do teste Bonferroni. Os valores significativos:
*P<0,0001 vs Controle Desnutrido, ## p<0,05 vs Controle Nutrido, ### p<0,0001 vs Controle Nutrido.
5.2
Efeito do tratamento com retinol e palmitato de retinol na apoptose e
necrose em células desnutridas.
Foi realizado o ensaio de Apoptose/Necrose para verificar a relação entre a
diminuição da proliferação /viabilidade e sua provável via, além de sua cinética.
As principais diferenças na apoptose foram no tempo de 48h (Figura 13A).
Conforme os resultados obtidos, o grupo nutrido (26,09±3,9%) apresentou maior
percentagem de células apoptóticas comparado ao grupo desnutrido (18,5±3,3%). No
entanto, os grupos tratados com palmitato de retinol em todas as doses estudadas
apresentaram uma diminuição do percentual de células apoptóticas.
46
Os grupos tratados com retinol não apresentaram diferença com relação ao
grupo desnutrido. Não houve diferenças estatísticas entre os tratamentos e tempos
quando avaliada a cinética da Necrose (Figura 13B).
Figura 13 - Cinética da análise de apoptose e necrose dos grupos nutridos, desnutridos e tratados com
vitamina A.
Os valores da figura representam a média ± E.P.M da apoptose ou necrose em células desnutridas
tratadas com retinol ou palmitato de retinol. Grupos: Nutrido (Glu+, SFB 5%), Desnutrido (Glu-, SFB
0%). Tratamentos: desnutrido + tratamento com retinol (Des + Ret) ou palmitato de retinol (Des +
P.Ret) (doses: 3.55, 6.3 ou 11.25µM). A análise estatística foi feito por ANOVA seguida do teste
Bonferroni. Os valores significativos: *P<0,05 vs Controle Desnutrido, # p<0,05 vs Controle Nutrido.
47
5.3
Efeito da desnutrição e do tratamento com retinol e palmitato de retinol no
ciclo celular.
O ciclo celular pode ser dividido em 5 fases - G0, G1, S, G2, M -
entretanto com a utilização do método de análise do ciclo por Iodeto de Propídio,
pode-se definir apenas 3 fases: G0/G1 (quiescência ou síntese de proteínas – 2n), S
(fase de síntese de DNA), G2/M (pré-mitose ou mitose – 4n).
De acordo com a figura 14A, o grupo desnutrido apresentou um aumento
do percentual de células IEC-6 na fase G0/G1 em 12h quando comparado ao grupo
nutrido. Em 24 e 48h os níveis se equiparam ao do nutrido. O tratamento com retinol
promoveu aumento na quantidade de células na fase G0/G1 quando comparado ao
controle desnutrido, principalmente no tempo de 24h e 12h e 48h na dose de 11µM.
Na fase S, ocorre uma diminuição do percentual de células do grupo
desnutrido em 12h com relação ao controle nutrido (Figura 14B). Os grupos tratados
com retinol nas doses 3, 6 e 11 µM apresentam uma diminuição na quantidade de
células nesta mesma fase em 24h com relação ao controle desnutrido.
Adicionalmente, a dose de retinol 11µM também diferiu do controle desnutrido em
12h. Em 48h não se observa diferença entre os grupos.
Conforme mostrado da figura 14C, o grupo nutrido apresenta maior
percentual de células na fase G2/M nos tempos de 6h, 12h e 24h quando comparado
ao controle desnutrido. Entretanto, os grupos tratados com retinol e palmitato de
retinol só diferiram do controle desnutrido no tempo de 48h, quando o percentual de
células do controle desnutrido se equiparou ao do nutrido.
O tratamento das células desnutridas com retinol e palmitato de retinol
pareceu levar as células a um estado quiescente maior que a desnutrição por si só
quando analisados no tempo de 48h. Isso pode ser observado nos resultados de todas
as fases, onde verifica-se um aumento da frequência de células na fase G0/G1, e
diminuição dessa frequência na fase S e G2/M.
48
Figura 14 - Cinética da distribuição nas fases do ciclo celular das células desnutridas e tratadas com
retinol e palmitato de retinol.
Fonte: 1 Os valores da figura representam a média ± E.P.M de cada fase do ciclo celular de células
desnutridas tratadas com retinol ou palmitato de retinol. Grupos: Nutrido (Glu+, SFB 5%), Desnutrido
(Glu-, SFB 0%). Tratamentos: desnutrido + tratamento com retinol (Des + Ret) ou palmitato de retinol
(Des + P.Ret) (doses: 3.55, 6.3 ou 11.25µM). A análise estatística foi feito por ANOVA seguida do
teste Bonferroni. Os valores significativos: *P<0,05 vs Controle Desnutrido, # p<0,05 vs Controle
Nutrido.
49
5.4
Análise da diferenciação celular estimulada pelo tratamento com retinol e
palmitato de retinol em células desnutridas.
Mediante os dados anteriores e, visto que a diferenciação celular de cripta
a vilos afeta o ciclo celular e a proliferação, ao suspender a sua progressão, foi
avaliado a expressão dos principais mediadores relacionados à diferenciação celular.
A figura 15 permite verificar que os tratamentos com retinol e palmitato
de retinol aumentaram a transcrição de todos os genes avaliados quando comparados
ao controle desnutrido. Nos genes FABP e IAP os grupos tratados com retinol e
palmitato de retinol tiveram uma expressão significativamente maior que no grupo
desnutrido (TABELA 4).
Tabela 4 – Valores das médias ± E.P.M das análises da transcrição dos genes relacionados à
diferenciação em células desnutridas tratadas com retinol ou Palmitato de retinol.
PALMITATO
DESNUTRIDO
NUTRIDO
FABP
1,27±0,42
0,60 ±0,10
5,72±0,70 **
4,22±0,75 *
IAP
1,28±0,37
0,29±0,08
5,54±0,93 **
5,82±1,04 *
DE RETINOL
RETINOL
Legenda: FABP - Proteína De Ligação ao Ácido Graxo; IAP - Fosfatase Alcalina Intestinal. A análise estatística
foi feito por Teste T seguido do pós-teste Mann-Whitney. Os valores significativos: **P<0,01 vs
Controle Desnutrido, *P<0,05 vs Controle Desnutrido.
50
Figura 15 – Expressão dos principais genes relacionados com a diferenciação celular nas células
desnutridas
tratadas
com
retinol
e
palmitato
de
retinol.
Os valores da figura representam a média ± E.P.M da expressão de cada gene relacionado a
diferenciação celular em células desnutridas tratadas com retinol ou palmitato de retinol. Grupos: Nut Nutrido (Glu+, SFB 5%), Des - Desnutrido (Glu-, SFB 0%). Tratamentos: desnutrido + tratamento com
retinol (Ret) ou palmitato de retinol (P.Ret) na dose 11.25µM e no tempo de 48h. A análise estatística
foi feito por Teste T seguido do pós-teste Mann-Whitney. Os valores significativos: **P<0,01 vs
Controle Desnutrido, *P<0,05 vs Controle Desnutrido.
51
5.5
Análise das vias de sinalização desencadeadas pelos tratamentos com
retinol e palmitato de retinol em células desnutridas.
Para avaliar como e por quais vias o tratamento com o retinol e palmitato de
retinol exerceu efeito anti-apoptótico demostrado, repressor do ciclo celular na fase
G0/G1 e promotor de diferenciação celular foram analisados os principais genes de
cada via de sinalização ativadas por receptores acoplados à proteínas G.
Conforme apresentado na figura 16 e 17, a transcrição dos genes SRF, ELK-1,
c-JUN, FOXO, STAT3, ATF2, GLI3 e NF-kB se mostrou aumentada nos grupos
tratados com as substancias teste em relação ao controle desnutrido. O grupo nutrido
também desencadeou um aumento da transcrição dos genes c-JUN (Figura 16),
STAT3, MEF2 e ATF2 (Figura 17) em relação ao desnutrido. Entretanto, se mostrou
diminuído nos genes c-FOS e GLI3. O tratamento com retinol e palmitato de retinol
não diferiu em relação ao desnutrido nos genes MEF2c e c-FOS. Contudo, nesses 2
genes, o grupo nutrido se mostrou diminuído e elevado, respectivamente, comparado
ao controle desnutrido.
52
Figura 16 - Efeito do retinol e do palmitato de retinol sobre a transcrição genica de mediadores das vias
de sinalização celular em células IEC-6 desnutridas.
Os valores da figura representam a média ± E.P.M da expressão de cada gene relacionado a vias de
sinalização celular em células desnutridas tratadas com retinol ou palmitato de retinol. Grupos: Nut Nutrido (Glu+, SFB 5%), Des - Desnutrido (Glu-, SFB 0%). Tratamentos: desnutrido + tratamento com
retinol (Ret) ou palmitato de retinol (P.Ret) na dose 11.25µM e no tempo de 48h. A análise estatística
foi feito por teste T seguido do pós-teste Mann-Whitney. Os valores significativos: *P<0,05 vs
Controle Desnutrido.
53
Figura 17 - Efeito do retinol e do palmitato de retinol sobre a transcrição genica de mediadores das vias
de sinalização celular em células IEC-6 desnutridas.
Os valores da figura representam a média ± E.P.M da expressão de cada gene relacionado a vias de
sinalização celular em células desnutridas tratadas com retinol ou palmitato de retinol. Grupos: Nut Nutrido (Glu+, SFB 5%), Des - Desnutrido (Glu-, SFB 0%). Tratamentos: desnutrido + tratamento com
retinol (Ret) ou palmitato de retinol (P.Ret) na dose 11.25µM e no tempo de 48h. A análise estatística
foi feito por teste T seguido do pós-teste Mann-Whitney. Os valores significativos: *P<0,05 vs
Controle Desnutrido.
54
6
DISCUSSÃO
A digestão e absorção de nutriente são funções primordiais do trato
intestinal e, para exercer isto, a sua mucosa tem altas taxas de renovação celular
comparadas a outros tecidos. Sua integridade é dependente da homeostase das taxas
de proliferação, migração e apoptose (BHATTACHARYA; RAY; JOHNSON, 2005).
A capacidade proliferativa das criptas se deve à presença das células tronco
intestinais, responsáveis por essa renovação epitelial (VAN DER FLIER; CLEVERS,
2009). Sabe-se que durante a desnutrição a absorção intestinal encontra-se afetada
(LUNN, 2000), resultante de uma atrofia da mucosa gástrica e intestinal, diminuição
das criptas, vilosidades e microvilosidades intestinais (MOLINA; PELISSARI;
FEIRHMANN, 2009).
No presente estudo foi demostrado que a desnutrição alterou a
proliferação e retardou o ciclo celular. A inserção do tratamento com o palmitato de
retinol modulou a taxa proliferativa, apoptose e o ciclo celular em células IEC-6
desnutridas. Além disso, o tratamento com retinol, também apresentou aspectos
moduladores sobre os parâmetros do ciclo celular e fatores de diferenciação nesta
linhagem de células. Tais efeitos parecem estar relacionados com a ativação gênica de
ATF2, ELK1, SRF, FOXO, c-Jun, STAT3, GLI3 e NF-κB.
De acordo com Ortiz e Betancourt (1984), os tecidos que normalmente
têm uma alta taxa de renovação celular tendem a apresentar uma diminuição da
proliferação celular quando submetidos à desnutrição. Os dados do presente trabalho
demonstram que a desnutrição prejudicou a proliferação celular de células de cripta
intestinal a partir do tempo de 6h, estendendo-se até o tempo de 48h. Este resultado
corroborou com outros estudos, onde foi verificado uma diminuição da proliferação
em células intestinais desnutridas (UENO et al., 2011). Além disto, estudos in vivo
também verificaram uma diminuição da taxa proliferativa das criptas durante a
desnutrição (CHAUDHARY et al., 2000; GOODLAD; WRIGHT, 1984; HOLT;
KOTLER, 1988).
A suplementação com retinoides é um fator que influencia na reprodução
celular, podendo ter um efeito pró- ou anti-proliferativo (ZANOTTO-FILHO;
SCHRÖDER; MOREIRA, 2008). Neste trabalho, a cinética do tratamento com
palmitato de retinol em todas as doses, mas não com retinol, mostrou uma diminuição
55
da proliferação celular a partir do tempo de 24h. Resultados semelhantes também
foram observados em células de epitélio mamário bovino na ausência de soro fetal
bovino (SFB), onde o tratamento com retinoides (retinol e ácido retinoico) inibiu
parcialmente a proliferação celular independente da dose de Vitamina A (CHELI et
al., 2003); e o ácido retinoico também agiu diminuindo a proliferação experimental no
hipocampo de animais (GOODMAN et al., 2012).
A apoptose (morte celular programada) é um evento de fundamental
importância para a regulação do número celular do organismo, com grande relevância
para a homeostase do epitélio gastrointestinal (BHATTACHARYA et al., 2003). Em
condições normais, a taxa de proliferação coincide com a taxa de apoptose, o que
mantém a integridade fisiológica do intestino. No entanto, a apoptose é também um
mecanismo de defesa, ativado sempre que ocorre uma invasão por agentes
patogênicos, ou ainda quando o DNA for lesado (ELMORE, 2007; GRIVICICH;
REGNER; ROCHA, 2007). Neste estudo, foi observado que no maior tempo de
analise, 48h, a percentagem de células apoptóticas no grupo desnutrido se encontrava
mais baixa que no grupo nutrido. Dentre os tratamentos utilizados com retinoides, o
tratamento com palmitato de retinol diminuiu o percentual de apoptose com relação à
desnutrição, enquanto que o tratamento com retinol não apresentou modificação
quando comparado ao controle desnutrido. Nos outros tempos, e na análise de necrose
celular não foi verificada diferença entre os grupos.
Os retinoides, são por vezes descritos como agentes pró-apoptóticos,
sendo inclusive testados para o tratamento do câncer (TYKWINSKA et al., 2013).
Entretanto, há relatos de seus efeitos anti-apoptóticos, tais os efeitos encontrados para
o ácido retinoico e o β-caroteno, que diminuíram a apoptose em células mesangiais
(KITAMURA et al., 2002; MORENO-MANZANO et al., 1999), em células de
cumulus (PU et al., 2014), em células hepáticas em estresse oxidativo causado pelo
excesso de etanol (PENG et al., 2013) e em células de hepatocarcinoma desprovidas
de SFB (WANG et al., 2013).
Quanto ao grupo nutrido, o percentual de apoptose se apresentou mais
elevado do que o grupo desnutrido no tempo de 48 h. Este fato pode ser talvez
explicado em virtude de uma maior confluência das células nos poços do grupo
nutrido, haja visto que as mesmas mantiveram proliferação não retardada pela
desnutrição.
56
Estudos sugerem que as células desnutridas geralmente tornam-se
quiescentes, ou seja, saem do ciclo celular e entram na fase G0 como uma forma de
prevenir alguma possível lesão ao DNA e, assim, se proteger contra a apoptose
(AGARWAL et al., 2006; SCHAFER, 1998). Sugerimos então que a diminuição da
proliferação e da apoptose estejam relacionadas com a fase do ciclo celular.
Sabe-se que a taxa proliferativa está diretamente relacionada à progressão
do ciclo celular. Desse modo, a diminuição da proliferação pela desnutrição é apoiada
pelo resultado do ciclo celular, onde as células desnutridas apresentaram um aumento
na percentagem da fase G0/G1, quando comparadas ao grupo controle nutrido. Além
disso, o aumento da fase mitótica (G2/M) ocorreu apenas no tempo de 48h, se
equiparando ao grupo nutrido. Isso revela um retardo no tempo de replicação das
células IEC-6, as quais em condições normais de nutrição ocorreu em menor tempo,
variando entre 19-22h (QUARONI et al., 1979). O resultado do presente estudo está
de acordo com os resultados encontrados por Borelli (2009), nos quais animais com
desnutrição proteica apresentaram maior percentagem de células (de medula óssea) na
fase G0/G1 e menor percentagem nas fases S/G2/M com relação ao controle nutrido.
Isso sugere que a desnutrição proteica diminui a capacidade proliferativa das células
(BORELLI et al., 2009) devido a dificuldade que as células desnutridas têm de
transpor a fase G1 em consequência da falta de nutrientes necessários para a
progressão do ciclo (GÓMEZ et al., 1996; ORTIZ; BETANCOURT, 1984).
Já foi descrito que a interrupção do ciclo na fase G0/G1 em células
desnutridas da medula óssea é mediada pelo aumento da expressão das proteínas
supressoras da progressão do ciclo celular (p21 e p27) e, redução da expressão de
proteínas que induzem o ciclo celular (ciclina D1) (NAKAJIMA et al., 2014). Essa
suspensão ou prolongamento do ciclo celular na fase G0/G1 ou S parece ser
necessário nos casos de desnutrição, uma vez que visa prevenir o dano ao DNA e
apoptose (AGARWAL et al., 2006).
As constatações experimentais do presente estudo indicam que o declínio
da taxa proliferativa de células IEC-6, quando desnutridas, podem ser causados pelo
prolongamento do ciclo celular. Isso demonstra que a nutrição é um fator importante,
que determina se a célula progride no ciclo e em qual taxa isto ocorre (SCHAFER,
1998).
Os retinoides parecem desempenhar um papel na interrupção do ciclo
celular mediante à diferenciação celular (MCKENNA, 2012). Resultados semelhantes
57
ao do presente estudo foram encontrados por Ribeiro (2013) em células de melanoma,
onde o ácido retinoico diminuiu a proliferação celular, porém não aumentou a
apoptose. Além disso, ocorreu um bloqueio da progressão do ciclo celular na fase G1,
ou seja, aumentou a percentagem de células na fase G1 e diminuiu na fase S e G2/M
(RIBEIRO et al., 2013). Outros resultados também descreveram a estagnação do ciclo
celular em G0/G1 mediante tratamento com ácido retinoico, ocorrido através do
aumento de p27 (um inibidor de quinase dependente de ciclina) e diminuição da
expressão de c-Myc e ciclina-E (envolvidos na proliferação e ciclo celular)
(DIMBERG, 2002), impedindo que a célula entrasse no ciclo e se proliferasse, à
medida que também mostrou ter efeito pro-diferenciativo (NICHOLLS et al., 2013).
Os retinoides são bem conhecidos como agentes propiciadores da
diferenciação celular (SHI et al., 2013; TRAVERS et al., 2013; YANG; SHINKAI,
2013). Embora a maioria dos estudos revelem uma completa diferenciação celular
induzida por ácido retinoico, o trabalho de Niu e colaboradores (2010) sugeriu que o
ácido retinoico sozinho não conseguiu levar as células tronco de tumor cerebral a uma
completa diferenciação, permanecendo apenas parcialmente diferenciadas.
Dentre os dos principais marcadores de diferenciação nas células
intestinais, estão a enzima IAP (“intestinal alkaline phosphatase” – fosfatase alcalina
intestinal) (BALTES; NAU; LAMPEN, 2004) e a proteína FABP (Fat acid binding
protein - Proteína de ligação de ácidos graxos) (ADRIAANSE et al., 2013; PELSERS
et al., 2003). As expressões de IAP, enzima presente na borda em escova, e de FABP,
proteína citosólica dos enterócitos, estão restritas às células diferenciadas no intestino
delgado e, desde então, são consideradas excelentes marcadores da diferenciação das
cripta/vilos (BRESSENOT et al., 2012; DUBÉ et al., 2001; GOLDBERG et al.,
2008).
Já foi relatado o aumento de IAP induzido por ácido retinoico em células
Caco-2, inclusive em cultura com privação de SFB, demonstrando assim a
diferenciação celular (BALTES; NAU; LAMPEN, 2004). Além disso, o receptor
retinoide RXR, juntamente como receptor do hormônio da tireoide, parecem
participar da ativação de IAP (MALO et al., 2004). Do mesmo modo, estudos ainda
descreveram a relação dos retinoides com o aumento dos níveis da transcrição de
FABP em diferentes tipos celulares, mostrando assim que os retinoides são capazes de
ativar FABP (LARSEN; VOORHEES; ASTRÖM, 1994; POIRIER et al., 1997).
58
Neste contexto, as células tratadas no presente estudo com retinol ou
palmitato de retinol apresentaram níveis elevados de IAP e FABP com relação aos
controles nutrido e desnutrido. Desta forma, sugere-se que o tratamento com retinol e
palmitato de retinol levam a uma diferenciação das células IEC-6. No entanto,
necessita-se investigar ainda quais são os mecanismos celulares pelos quais os
retinoides testados realizam estes efeitos.
Os dados deste trabalho demostram que a desnutrição alterou a transcrição
de c-Jun, c-Fos, STAT3, MEF2C, ATF2 E GLI3, enquanto o tratamento com os
retinoides induziu o aumento da transcrição gênica de ATF2, ELK1, SRF, FOXO, cJun, STAT3, GLI3 e NF-κB.
Já é conhecido por outros estudos que os retinoides atuam sobre a via das
MAPKs. A ação do ácido retinoico em células intestinais, tal como nas células caco-2,
tiveram efeito na diminuição da proliferação e aumento da diferenciação celular
através da ativação da p38 MAPK, provavelmente através do mecanismo mediado por
RAR (GRENIER et al., 2007).
O ácido retinoico foi descrito como inibidor da proliferação de
fibroblastos através de um mecanismo associado com a modulação de ERK1/2 e
ativação JNK (c-Jun), em um mecanismo dependente da estimulação de RAR (HUO
et al., 2013).
Estudos sugerem que a ativação transiente de ERK1/2 esteja envolvida na
proliferação celular, enquanto a ativação sustentada resulta na diferenciação dos
enterócitos, uma vez que ERK1/2 também está envolvida na regulação da expressão
de outro marcador de diferenciação de enterócitos, denominado SI (Sucraseisomaltase), em células Caco-2 (ALIAGA et al., 1999).
O aumento de SRF (fator de resposta ao soro) tem sido associado ao
desenvolvimento do sistema nervoso central (STRINGER et al., 2002) e na
diferenciação de células do musculo liso vascular, do trato gastrointestinal e
mesênquimal, relacionado a uma diminuição de ELK-1 que, por sua vez, está
envolvido na proliferação (ALTHOFF et al., 2012; BROWNING et al., 1998; PARK
et al., 2011). Entretanto, alguns outros estudos mostraram a participação de SRF
juntamente com ELK-1 na indução da diferenciação de células hematopoiéticas
(TOWNSEND et al., 1999) , estando de acordo com os achados do presente trabalho.
59
Além disso, estudos sugerem a participação de ELK-1 na diferenciação
neuronal, na regulação da dinâmica do citoesqueleto (LAVAUR et al., 2007;
SALINAS et al., 2004; VANHOUTTE et al., 2001) e no estímulo de efeitos
neuroprotetores (ANGLADA-HUGUET et al., 2012). A via ERK-ELK-1 também foi
referida com efeitos anti-apoptóticos (GONCHARENKO-KHAIDER et al., 2012),
sendo mediadora dos efeitos da SOD3 (enzima superóxido dismutase-3), juntamente
com a AKT, na sobrevivência celular e diminuição da apoptose em células induzidas
a um estresse oxidativo (LAATIKAINEN et al., 2011). Mostrando assim, a
participação desses fatores na diferenciação e sobrevivência celular.
Além disso, SRF e ELK-1 também estão envolvidos com a transcrição de
c-Fos (JANKNECHT et al., 1993), embora seja proposto que esta transcrição exija
uma interação com mais fatores além de SRF e ELK-1 (MARAIS; WYNNE;
TREISMAN, 1993). C-Fos age conjuntamente com c-Jun atuando como um dimero,
mas c-Jun pode, por si só, atuar na ativação de fos/jun. Este fato já foi relatado e
associado com a diferenciação de células precursoras mieloides normais. Porém,
apenas c-jun atuou em mieloblastos leucêmicos (LORD; ABDOLLAHI; HOFFMANLIEBERMANN, 1993). A ativação sustentada de c-Fos e c-Jun também foi descrita
na diferenciação de células de feocromocitoma (PC12) (ERIKSSON; TASKINEN;
LEPPÄ, 2007) e c-jun na diferenciação endodérmica (BJERSING; BRORSSON;
HEBY, 1997).
Embora c-Jun seja referido como indutor da apoptose em vários trabalhos
(BAVARIA et al., 2014; BHATTACHARYA et al., 2003; HAM et al., 2000), ele
também pode desempenhar um papel anti-apoptótico, auxiliando na sobrevivência
(LEUNG et al., 2008; MA et al., 2012) e na diferenciação celular (LUO et al., 2014).
Em concordância com o presente trabalho, na análise de células
desprovidas de nutrientes foi verificado uma diminuição da expressão de c-jun (LI et
al., 2013; YOGEV et al., 2010). Embora c-fos e c-jun atuem muitas vezes em
conjunto, outros estudos também mostram que células desnutridas aumentam a
expressão de c-fos, como uma forma de proteção ao estresse causado pela desnutrição
(GARRETT et al., 2014; HENSEN et al., 2013; LEE et al., 2012).
O c-Jun está envolvido na diferenciação de células F9, mas este processo
parece ser mediado pela ativação de ATF2, que é induzida pelo tratamento com ácido
retinoico, ou seja, o ácido retinoico induz diferenciação de células F9 através da
ativação de ATF2/c-jun (KAWASAKI et al., 1998). Na realidade, c-jun e ATF2 agem
60
conjuntamente formando heterodímeros. Esta ligação evita o egresso de ATF2 do
núcleo e deste modo permite que controlem a expressão de um conjunto de genes,
incluindo do próprio c-Jun e de genes envolvidos na resposta ao estresse (LIU et al.,
2006). Outro estudo também sugeriu que o ácido retinóico promove diferenciação de
granulócitos através da ativação de ATF2 (HONG et al., 2004).
Em discordância com os resultados deste estudo, outros trabalhos
observaram que a desnutrição proteica levou a um aumento da ativação de ATF2, que
por sua vez está envolvido com a transcrição de CHOP, gene cuja expressão está
associada com a supressão de aminoácidos (AVEROUS et al., 2004; BRUHAT et al.,
2000) e com a regulação do metabolismo energético (ROESLER, 2001).
Já é conhecido que a ativação da PI3/AKT, principal via de fosforilação
de FOXO (fator de transcrição da família Forkhead Box), promove a sobrevivência
em vários tipos celulares, incluindo células epiteliais intestinais (FINNBERG; ELDEIRY, 2004; TRAN et al., 2002). Já foi relatado que o aumento da ativação de
AKT em células intestinais, desprovidas de poliaminas, atua na ativação de NF-κB,
que está relacionado com um decréscimo da apoptose por meio de um mecanismo que
inibe a ativação da caspase-9 e caspase-3 (BHATTACHARYA; RAY; JOHNSON,
2005; ZHANG et al., 2004).
Ressalta-se que em resposta a baixos níveis de estresse oxidativo, c-Jun
pode fosforilar FoxO4 levando a uma relocalização das proteínas FoxO para o núcleo,
com a função de controlar o estresse oxidativo através da indução da transcrição de
enzimas antioxidantes, como SOD e catalase (ESSERS et al., 2004). A proteína
FoxO1 também está relacionada com o metabolismo do retinol nas células hepáticas,
desempenhando função importante durante a gliconeogênese hepática (SHIN et al.,
2012). Outros estudos também apontam FoxO1 e FoxO3 como fatores de
sobrevivência celular em células cardíacas, uma vez que podem diminuir o estresse
oxidativo e a morte celular (SENGUPTA et al., 2011). Além disso FOXO4,
juntamente com MEF2c também desempenham função no desenvolvimento
cardiovascular (CREEMERS et al., 2006) e na longevidade de células com restrições
dietéticas (GREER; BANKO; BRUNET, 2009; GREER; BRUNET, 2009). Os níveis
de transcrição dos FoxOs se associam também com a nutrição e tratamentos
hormonais, assim podem se encontrar elevados diante de uma dieta desprovida de
proteína e tratamento com glicocorticoide (IMAE et al., 2003).
61
O fator de transcrição FoxO também pode levar ao bloqueio no ciclo celular,
principalmente na fase G1/S devido a promoção dos inibidores de Cdk p27 e p21
(MEDEMA et al., 2000; SEOANE et al., 2004) e a repressão da expressão da ciclina
D1 e D2 (SCHMIDT et al., 2002). Embora as proteínas FoxO tenham sido bastante
associadas com a apoptose e bloqueio do ciclo celular, também já mostrou participar
da diferenciação de mioblastos primários (BOIS; GROSVELD, 2003). Todos esses
dados comprovam a ação das proteínas FoxO em diversas funções, por mais que
sejam diversificadas e complexas. No presente trabalho, foi demonstrado o aumento
da transcrição de Foxo3-4 que juntamente com os outros genes analisados em células
IEC-6 desnutridas e tratadas com retinol e ácido retinóico, foram os possíveis
responsáveis pelos resultados do tratamento destas substancias, tais a diminuição da
proliferação, a apoptose, bloqueio do ciclo celular na fase G1 e promoção da
diferenciação celular.
Outro estudo indicou que a localização nuclear de FoxO1a pode modular
a atividade de IL-6- agindo como um coativator de STAT3 (KORTYLEWSKI et al.,
2003). A ativação de STAT3 parece inibir a autofagia, processo de sobrevivência
celular desencadeado pela desnutrição (SHEN et al., 2012). Desse modo estes dados
corroboram com o resultado do presente trabalho, em que as células desnutridas
diminuíram a transcrição de STAT3.
Além disso, estudos demonstraram que a diferenciação de células
neuronais mediante tratamento com ácido retinoico levou a uma ativação de STAT3
mediante ativação de RAR (HERRERA; CHEN; SCHUBERT, 2010). O tratamento
com ácido retinoico também induziu o desenvolvimento de células dendríticas através
da ativação de STAT3 (FENG et al., 2010).
O fator de transcrição STAT3 tem sido reportado como detentor de função
na diferenciação de vários tipos celulares, tais como células dendríticas (PARK et al.,
2004), células de leucemia mieloide (MINAMI et al., 1996), na diferenciação de
gliomas, como uma forma de tratamento de supressão de tumor, através da ativação
da via IL-6/JAK2/STAT3, conhecida como via de sobrevivência (SHU et al., 2011) e
no bloqueio da proliferação e diferenciação de célula de carcinoma medular da
tireoide (PARK et al., 2005) e de células leucêmicas (NAKAJIMA et al., 1996).
Além disso, foram observados efeitos anti-apoptóticos, uma vez que a sua
inibição foi associada ao aumento da morte celular (SHIM et al., 2009) e uma
associação entre a sobrevivência de células desnutridas e a ativação de STAT3
62
induzida por tratamento com IL-22 (LIU et al., 2012). A sobrevivência celular
desencadeada por STAT3 parece estar relacionada com a inibição da abertura do poro
de transição de permeabilidade (PTP) da mitocôndria e consequente inibição da
apoptose (BOENGLER et al., 2010). No intestino, sua ativação também foi
relacionada com a sobrevivência celular (GRIVENNIKOV et al., 2009) e na proteção
contra infecção (GUO et al., 2014).
A transcrição de MEF2c neste trabalho se apresentou diminuída no grupo
desnutrido quando comparado ao nutrido. Do mesmo modo, a desnutrição de células
do músculo esquelético e a atrofia muscular também demonstrou uma supressão da
transcrição de MEF2c (SHUM et al., 2012; YOGEV et al., 2013).
Embora a expressão de MEF2c no intestino participe diretamente do
metabolismo na vitamina A, ela está principalmente relacionada com a promoção da
expressão da BCMO1 (enzima que cliva o β-caroteno a retinal) (GONG et al., 2006).
Assim, os retinoides testados no presente estudo não mostraram uma alteração
estatística da transcrição de MEF2c com relação ao controle desnutrido, em parte
também devido a alta variabilidade dos grupos, principalmente do retinol.
A ativação de MEF2c através de MAPk além de aumentar a transcrição de
c-Jun (expresso em células quiescentes em resposta a mitógenos) (KATO et al., 1997,
2000; MCKINSEY; ZHANG; OLSON, 2002) ainda parece desempenhar um papel
importante na sobrevivência de células endoteliais (OLSON, 2004), células
musculares (DEVAKANMALAI; ZUMRUT; OZBUDAK, 2013) e células neuronais
(AKHTAR et al., 2012). Também destaca-se que MEF2c é uma proteína reguladora
da transcrição do transportador de glicose (THAI et al., 1998). É possível que isto
explique o fato de apenas o grupo nutrido apresentar aumento significativo de
MEF2c.
Na maioria das células o NF-κB se encontra inativo no citosol, retido em
um estado latente através da interação com a proteína IκB, a qual existe em 3
isoformas (IκBα, IκBβe IκBε). Na presença de um sinal, essa interação é
desfeita e NF-κB pode migrar para o núcleo e se ligar à sequencias específicas do
DNA (sítios κB), onde pode promover inflamação, sobrevivência ou divisão celular
(GERONDAKIS et al., 2014; VAYSBERG et al., 2008).
A via de sinalização NF-kB desempenha um papel central na ativação de
respostas pro-inflamatórias mediante presença de agentes patogênicos. Como
63
exemplo temos o LPS (lipopolissacarídeo), presente na membrana de bactérias gramnegativas estimula significativamente NF-kB (WANG; GAO; HARDWIDGE, 2012).
Entretanto, outros estudos também observaram a participação do fator de transcrição
NF-kB na promoção da sobrevivência celular (CARGNELLO; ROUX, 2011),
diminuindo a apoptose, com o aumento da transcrição de proteínas anti-apoptóticas e
diminuição das pro-apoptóticas (HOMAIDAN; CHAKROUN; EL-SABBAN, 2003).
Estudos também demonstram a importância dessa via para a manutenção
da homeostase e integridade intestinal (PASPARAKIS, 2008, 2012). Experimentos
knockout, mostraram a relevância do NF-κB na proteção intestinal (CHEN et al.,
2003) e na regulação da transcrição de genes codificadores de peptídeos
antimicrobianos (NENCI et al., 2007), além da sobrevivência celular através da
inibição da apoptose nas células intestinais (BURDELYA et al., 2008). Desse modo, o
aumento da transcrição de NF-κB neste trabalho pode estar associado ao efeito dos
retinoides na diminuição da apoptose.
A via Hedgehog (Hh) é necessária para a formação adequada das
vilosidades, regulação da migração celular e para a contenção da proliferação das
regiões intervilos dentro do epitélio intestinal. O bloqueio da via Hedgehog leva a
uma completa ausência de vilosidades, a persistência de um epitélio altamente
proliferativo, um déficit de células devidamente diferenciadas (CROSNIER;
STAMATAKI; LEWIS, 2006) e conduz a um aumento da morte celular por apoptose
(TANG et al., 2006b).
Os fatores de transcrição Gli-Kruppel (GLI 1, 2 e 3) são os principais
mediadores da via de sinalização hedgehog/patched (RUPPERT et al., 1988; YANG
et al., 1997). Dos 3 tipos dos fatores de transcrição GLI, o GLI3 é o mais
abundantemente expresso tanto no íleo quanto no estômago (TANG, 2006) .
O tratamento de células com retinoides mostrou ter efeito na via Hh,
regulando os níveis de GLI2 e GLI3 (GOYETTE et al., 2000; MAYNARD et al.,
2013), entretanto essas funções ainda não foram vistas em células intestinais.
A transcrição de GLI3 desempenha funções no desenvolvimento
embrionário e sua alteração ou mutação pode levar a malformações do trato
gastrointestinal (KOLTERUD et al., 2009). A expressão de GLI3 parece estar
envolvido na diferenciação celular (YANG et al., 1997) e na formação do eixo criptavilos, através da transcrição dos genes Foxf1 e Foxl1 (MADISON et al., 2009). Os
64
efeitos de diferenciação celular não estão restritos ao intestino, mas também são
importantes na diferenciação dos condrócitos (PROBST; ZELLER; ZUNIGA, 2013) e
na diferenciação neuronal (MIYAHARA et al., 2014). Durante a diferenciação dos
mioblastos regula fatores pró-angiogênicos (RENAULT et al., 2013) e em células
endoteliais promove a migração celular (RENAULT et al., 2009).
Destaca-se, além do exposto, que estímulos estressantes, neste caso a
desnutrição, pode desencadear, dentre outros efeitos, a diferenciação celular, de uma
forma reversível (PROSKURYAKOV; KONOPLYANNIKOV; GABAI, 2003).
Assim, podemos sugerir que este fator, juntamente com a adição dos retinoides, pode
facilitar a diferenciação das células IEC-6.
Desse modo, a partir dos resultados mostrados neste trabalho, pode-se
propor que os genes ATF2, ELK1, SRF, FOXO, c-Jun, STAT3, GLI3 e NF-κB agem
em conjunto para a realização dos efeitos dos retinoides na apoptose, no ciclo celular
e na diferenciação em células IEC-6 desnutridas.
65
Tabela 5: Resumo dos resultados da transcrição gênica para as vias analisadas em comparação ao grupo
desnutrido.
Table 1
GENE
NUTRIDO
FABP
−
IAP
PALMITATO
DE RETINOL
RETINOL
FUNÇÃO
é
é
DIFERENCIAÇÃO CELULAR
−
é
é
DIFERENCIAÇÃO CELULAR
ELK1
−
é
é
SRF
−
é
é
FOS
ê
−
−
PROTEÇÃO AO ESTRESSE
JUN
é
é
é
DIFERENCIAÇÃO CELULAR
PROLIFERAÇÃO/DIFERENCIAÇÃO
ANTI-APOPTÓTICO
DESENVOLVIMENTO DO SNC
DIFERENCIAÇÃO CELULAR
SOBREVIVÊNCIA E
ANTI-APOPTÓTICO
FOXO3-4
−
é
é
ANTI-APOPTÓTICO
DIFERENCIAÇÃO CELULAR
DIFERENCIAÇÃO E
STAT3
é
é
é
SOBREVIVÊNCIA CELULAR
ANTI-APOPTÓTICO
MEF2C
é
−
−
ATF2
é
é
é
GLI3
ê
é
é
NFk-B
−
é
é
SOBREVIVÊNCIA CELULAR
RESPOSTA AO ESTRESSE
DIFERENCIAÇÃO CELULAR
FORMAÇÃO EIXO CRIPTA-VILOS
MIGRAÇÃO/DIFERENCIAÇÃO
SOBREVIVÊNCIA CELULAR
ANTI-APOPTÓTICO
Legenda: SNC – Sistema Nervoso Central. ( é ) aumento de transcrição; ( ê ) diminuição da
transcrição; ( - ) transcrição não alterada
66
7
CONCLUSÃO
Os resultados do presente trabalho nos permitem concluir que a
desnutrição afetou a proliferação celular, retardando o ciclo celular.
O tratamento com o palmitato de retinol, mas não o retinol, diminuiu a
taxa proliferativa e a apoptose. Ambos os tratamentos com os retinoides retardaram o
ciclo celular quando comparados ao controle desnutrido e estimularam a diferenciação
celular possivelmente por mecanismos associados com as vias moleculares do ATF2,
MAPK/ERK/JNK, IL-6, Hedgehog, PI3K/AKT e NF-κB.
67
8
PERSPECTIVAS
Embora muito já tenha sido investigado, ainda necessita-se de mais
estudos para melhor elucidação da hipótese proposta.
Assim, experimentos com métodos de supressão gênica e utilização de
bloqueios farmacológicos serão necessários a fim de investigar se os efeitos dos
retinoides nas vias propostas devem-se a ativação dos receptores acoplados à
proteínas G, ou dos receptores retinoides RAR/RXR.
Além disso, as vias também podem ser investigadas mais detalhadamente,
através de suas inibições, com o intuito de verificar o real efeito de cada via nas
células intestinais tratadas com retinoides.
Os experimentos de análise proteica dos genes analisados já foram
iniciados. Entretanto por motivos de problemas metodológicos esses experimentos
foram temporariamente adiados, sendo necessário sua retomada.
Contudo os dados apresentados no presente estudo direcionam e norteiam
as futuras pesquisas na identificação do mecanismo de ação modulatório dos
retinoides nas células intestinais.
68
9
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