ANEXOS
ANEXO A
1. Curvas de calibração usadas para o estudo da capacidade antioxidativa:
Curva de calibração do Ácido Ascórbico
Abs
0,8
0,7
y = -0,0054x + 0,7049
0,6
R² = 0,9991
0,5
0,4
Figura A - Curva de calibração do Ácido Ascórbico utilizada na determinação da
0,3
capacidade
0,2 antioxidante pela captação do radical livre ABTS.
0,1
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Concentração de Ácido Ascórbico (µg/ml)
Figura A - Curva de calibração do Ácido Ascórbico utilizada na determinação da
capacidade antioxidante pela captação do radical livre ABTS.
Curva de calibração do Trolox
Abs
1,000
Figura B - Curva de calibração do Trolox utilizada na determinação da capacidade
y = -0,0037x + 0,9271
0,800
antioxidante pelo método de DPPH.
R² = 0,9934
0,600
0,400
0,200
0,000
0
50
100
150
200
250
300
Concentração de Trolox (µg/ ml)
Figura B - Curva de calibração do Trolox utilizada na determinação da capacidade
antioxidante pelo método de DPPH.
85
Curva de calibração do Ácido Gálico
1,0
Abs
0,8
y = 0,0028x - 0,03
R² = 0,9971
0,6
0,4
0,2
0,0
0
50
100
150
200
250
300
Concentração de Ácido Gálico (µg / ml)
Figura C - Curva de calibração do Ácido Gálico utilizada na determinação dos compostos
fenólicos pelo método de Folin-Ciocalteu.
2. Curvas de calibração usadas para o estudo das actividades enzimáticas:
Abs
Curva de calibração do p-Nitrofenol
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
y = 2,7395x - 0,0531
R² = 0,9992
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
Concentração de p-Nitrofenol (mM)
Figura D – Curva de calibração do p-Nitrofenol, utilizada para quantificação da actividade
enzimática da β-Galactosidase e α-L-Arabinofuranosidase.
86
Curva de calibração do Ácido
Galacturónico
0,5
Abs
0,4
0,3
0,2
y = 0,0087x + 0,0065
R² = 0,994
0,1
0
0
10
20
30
40
50
60
Concentração do Ácido Galacturonico (mM)
Figura E – Curva de calibração do Ácido Galacturónico, utilizada na determinação da
actividade enzimática da Exo-poligalacturonase.
87
ANEXO B
1. Protocolo usado na extracção do RNA, seguindo o Mini Kit RNasey Plant (Qiagen) (o
sublinhado indica alterações feitas ao protocolo) :
 Juntou-se a amostra (500 mg) a 450 µl RLT / β-ME;
 Vortexiou-se e colocou-se no gelo durante +/- 1 min;
 Colocou-se em seguida tudo na coluna lilas;
 Centrifugou-se a vmax, 2 min
 Retirou-se o sobrenadante para o tubo colector;
 Adicionou-se 50& do vol. total de EDTH;
 Transferiu-se para a coluna rosa;
 Centrifugou-se 15 s, 10,000 rpm;
 Adicionou-se 350 µl RW1;
 Centrifugou-se 15 s, 10.000 rpm;
 Adicionou-se 10 µl de DNAse com 70 µl RDD;
 Incubou-se a 37ºC, 45 min;
 Adicionou-se 350 µl RW1;
 Centrifugou-se 15 s, 10.000 rpm;
 Adicionou-se 500 µl RPE;
 Centrifugou-se a 15 s, 10.000 rpm;
 Adicionou-se 500 µl RPE;
 Centrifugou-se 2 min, 10.000 rpm;
 Centrifugou-se 1 min, vmax;
 Adicionou-se 30 µl H2O, centrifugou-se1 min, 10.000 rpm (1º eluição);
 Adicionou-se 30 µl H2O, centrifugou-se 1 min, 10.000 rpm (2º eluição);
88
ANEXO C
1. Comparação de valores de actividades enzimáticas quantificadas após 2 tempos de
reacção. A existência de diferenças estatísticas entre tempos confirma que no 1º tempo
investigado, as reacções ainda se encontravam na fase exponencial:
p-Nitrofenol µmol .min-1.µg-1
β - Galactosidase
6
*
5
4
3
2
1
H2O
Pe
Ap
ApPe
H2O
Pe
Ap
ApPe
0
15
30
Tempo de actividade
Figura F – Resultados da actividade da β-Galactosidase em pêras Rocha, 15 e 30 minutos após o início da reacção. H2O:
pêras em condições controlo; Pe, pêras inoculadas com P. expansum; Ap, pêras inoculadas com A. pullulans; e ApPe,
pêras inoculadas com os dois fungos, A. pullulans e P. expansum. O * indica diferenças estatísticas entre tempos P< 0,05.
Os valores representam a média ± erro padrão. O tracejado e a linha é referente às amostras obtidas 12 e 24 horas após a
inoculação, respectivamente.
Alfa-L-Arabinofuranosidase
*
p-Nitrofenol µmol.min-1.µg-1
2
1,5
1
0,5
H2O
Pe
Ap
ApPe
H2O
Pe
Ap
ApPe
0
30
60
Tempo de actividade
Figura G – Resultados da actividade da Alfa-L-Arabinofuranosidase em pêras Rocha, 30 e 60 minutos após o início da
reacção. H2O: pêras em condições controlo; Pe, pêras inoculadas com P. expansum; Ap, pêras inoculadas com A.
89
pullulans; e ApPe, pêras inoculadas com os dois fungos, A. pullulans e P. expansum. O * indica diferenças estatísticas
entre tempos P< 0,05. Os valores representam a média ± erro padrão. O tracejado e a linha é referente às amostras obtidas
12 e 24 horas após a inoculação, respectivamente.
% de redução da viscosidase . h-1
Endo-Poligalacturonase
100
*
H2O
Pe
Ap
ApPe
H2O
Pe
Ap
ApPe
80
60
40
20
0
4
Tempo de actividade
7
Figura H – Resultados da actividade da Endo-Poligacturonase em pêras Rocha, 4 e 7 horas após o início da reacção. H2O:
pêras em condições controlo; Pe, pêras inoculadas com P. expansum; Ap, pêras inoculadas com A. pullulans; e ApPe,
pêras inoculadas com os dois fungos, A. pullulans e P. expansum. O * indica diferenças estatísticas entre tempos P< 0,05.
Os valores representam a média ± erro padrão. O tracejado e a linha é referente às amostras obtidas 12 e 24 horas após a
inoculação, respectivamente.
Exo-Poligalacturonase
70
*
Ac. Galacturonico
(µmol/min/µg)
60
50
40
30
20
10
H2O
Pe
Ap
ApPe
H2O
Pe
Ap
ApPe
0
15
Tempo de actividade
30
Figura I – Resultados da actividade da Exo-Poligacturonase em pêras Rocha, 15 e 30 minutos após o início da reacção.
H2O: pêras em condições controlo; Pe, pêras inoculadas com P. expansum; Ap, pêras inoculadas com A. pullulans; e
ApPe, pêras inoculadas com os dois fungos, A. pullulans e P. expansum. O * indica diferenças estatísticas entre tempos
P< 0,05. Os valores representam a média ± erro padrão. O tracejado e a linha é referente às amostras obtidas 12 e 24 horas
90
após a inoculação, respectivamente.
Pectina metilesterase
0,03
Δ616.min-1.µg-1
0,025
0,02
*
0,015
*
0,01
0,005
H2O
Pe
Ap
ApPe
H2O
Pe
Ap
ApPe
0
15
30
Tempo de actividade
Figura J – Resultados da actividade da Pectina metilesterase em pêras Rocha, 15 e 30 minutos após o início da reacção.
H2O: pêras em condições controlo; Pe, pêras inoculadas com P. expansum; Ap, pêras inoculadas com A. pullulans; e
ApPe, pêras inoculadas com os dois fungos, A. pullulans e P. expansum. O * indica diferenças estatísticas entre tempos
P< 0,05. Os valores representam a média ± erro padrão. O tracejado e a linha é referente às amostras obtidas 12 e 24 horas
após a inoculação, respectivamente.
% de redução da viscosidase . h-1
Endo-1,4-β-glucanase
100
*
80
60
40
20
H2O
Pe
Ap
ApPe
H2O
Pe
Ap
ApPe
0
3
Tempo de actividade
6
Figura K – Resultados da actividade da Endo-1,4-β-glucanase em pêras Rocha, 3 e 6 horas após o início da reacção. H2O:
pêras em condições controlo; Pe, pêras inoculadas com P. expansum; Ap, pêras inoculadas com A. pullulans; e ApPe,
pêras inoculadas com os dois fungos, A. pullulans e P. expansum. O * indica diferenças estatísticas entre tempos P< 0,05.
Os valores representam a média ± erro padrão. O tracejado e a linha é referente às amostras obtidas 12 e 24 horas após a
inoculação, respectivamente.
91
ANEXO D
Tabela 3 - Resumo dos resultados obtidos nas diferentes abordagens realizadas.
Horas após inoculação
Tratamento
Capacidade Antioxidativa
Actividade Enzimática
Expressão génica
ABTS
DPPH
FOLIN
β-Gal
AFase
Exo-PG
Endo-PG
PME
EGase
β-Gal
PG1
PG2
PME1
XTH1
XTH2
EGase 2
EXP1
EXP2
12
24
H2O
Pe
Ap
ApPe
a
a
a
a
a
b↓
b↑
a
b↓
b↓
b↑
ab ↑
ab ↓
b↓
b↑
b↑
a
a
a
b↑
a
a
a
a
a
b↑
↓
↑
a
c↓
c↑
b↓
c↓
b↓
c↓
b↑
b↓
a
48
H2O
a
a
a
a
Pe
b↓
b↓
b↓
a
Ap
a
b↓
b↓
ab ↑
ApPe
a
b↓
b↓
b↑
a
a
b↑
b↑
a
b↓
c↓
b↓
a
a
b↓
b↓
b↓
b↓
b↓
b↓
a
a
a
a
c↓
b↓
bc ↓
c↓
b↓
b↓
b↓
b↓
b↓
b↓
c↓
b↓
72
H2O
a
Pe
c↓
Ap
b↓
ApPe
b↓
a
b↓
b↓
b↓
a
a
a
b↓
b↓
b↓
b↓
c↓
c↓
a
a
a
a
a
b↓
b↓
bc ↓
c↓
b↑
b↓
c↓
c↓
b↓
c↑
H2O
a
Pe
b↓
Ap
a
ApPe
b↓
b↓
d↓
c↓
a
b↓
b↓
b↓
a
b↓
c↓
c↓
b↓
b↓
b↓
b↓
c↑
a
b↓
c↓
c↓
a
a
b↓
a
c↓
b↓
c↓
b↓
Não foi testado
Sem diferenças entre tratamentos
Diminuição da actividade ou expressão
Aumento da actividade ou expressão
Sem significado biológico
92