ESTUDO DA HIDRÓLISE DO ÁCIDO CLAVULÂNICO NA PRESENÇA DO
POLIETILENO GLICOL
M. C. A. D. Barros1, C. S. da Silva2, M. B. Pasotto3
1
Bolsista de iniciação Científica IC/FAPESP/UFSCar, discente do curso de Engenharia Química
Bolsista de doutorado, discente do curso de Engenharia Química
3
Professor do Departamento de Engenharia Química da UFSCar/SP
2
1,2,3
Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de São Carlos – UFSCar, Via – Washington Luis,
Km 235, CEP: 13565-905 – São Carlos – SP, Brasil
e-mail: [email protected]
RESUMO - O sistema de duas fases aquosas composto por polietileno glicol e fosfato de
potássio tem sido estudado como alternativa para a purificação do antibiótico ácido clavulânico,
o qual é encontrado em culturas de Streptomyces clavuligerus e é potente inibidor de enzimas
beta-lactamase. Devido à necessidade de aperfeiçoamento do sistema de duas fases aquosas,
o presente trabalho mostra resultados de um estudo de degradação do ácido clavulânico na
presença do polietileno glicol 6000 e 400 e nas regiões de pH entre 5,4 e 8. Foi utilizado ácido
clavulânico proveniente do produto farmacêutico Clavulin®, e do caldo de fermentação prétratado por membrana de ultrafiltração de 3 kDa. Os resultados demonstraram que o ácido
clavulânico na presença do polietileno glicol apresenta uma maior estabilidade em pH 5,4. O
polietileno glicol 6000 apresentou uma menor velocidade de degradação do ácido clavulânico.
O ácido clavulânico distribuído na fase de fundo apresenta uma maior instabilidade em relação
ao ácido clavulânico presente na fase de topo.
Palavras-Chave: Ácido clavulânico; Degradação; Sistema de duas fases aquosas.
INTRODUÇÃO
O ácido clavulânico AC é um antibiótico βlactâmico, de ocorrência natural em cultura de
Streptomyces clavuligerus, e um potente inibidor
de enzimas β-lactamase. Tal substância não
apresenta alta atividade antimicrobiana, mas seu
uso associado a penicilinas dá-lhes proteção
contra tais enzimas (Santos et al., 2009). O ácido
clavulânico é produzido industrialmente em
cultura submersa e purificado através de uma
série de passos, dos quais os mais importantes
são a separação por extração líquido-líquido e a
adsorção por troca iônica.
Os processos convencionais de extração
líquido-líquido são realizados mediante a um
abaixamento de pH e utilizando-se a mistura de
solvente orgânico para promover a extração do
composto do meio fermentado. Esta técnica tem
dois inconvenientes, sendo que o primeiro está
relacionado ao aspecto ambiental, tendo em vista
a utilização de solventes orgânicos (Kilikian et al.,
2000), e segundo os estudos realizados por
Bersanetti et al. (2000) o AC é molécula
quimicamente instável e apresenta altas taxas de
degradação em regiões básicas, pH acima de 7,5,
e em regiões ácidas, pH abaixo de 4,5. Esta
instabilidade química acarreta baixos rendimentos
ao processo de purificação industrialmente.
Por isso, no caso da separação e
purificação de AC, novos tipos de extração
líquido-líquido vêm sendo estudados. Devido à
facilidade e confiabilidade no aumento de escala,
a rápida transferência de massa, a possibilidade
de se conduzir a extração em temperatura
ambiente e o fato do baixo custo de seus
componentes, atoxidade, o sistema de duas fases
aquosas (SDFA) tem sido alvo de estudo como
alternativa de separação do ácido clavulânico.
(Videira e Aires-Barros, 1994; Hirata, 2002; Brites,
2005. Silva et al., 2008).
Para maioria dos SDFA constituídos por
Polietileno glicol (PEG)/sal o produto é
comumente separado na fase superior rica em
PEG, enquanto que, os subprodutos são
dispensados na fase inferior rica em sal. O ácido
clavulânico possui uma alta afinidade pela fase
rica em PEG, apresentando altos valores de
recuperação (90-99%). Os valores obtidos para o
coeficiente de partição, que analisa a distribuição
da molécula de interesse entre a fase de topo e
fundo do SDFA, estão entre 1,5 a 114, para o AC
(Videira e Aires-Barros, 1994; Hirata, 2002).
Embora, o SDFA seja ambiente favorável à
extração de antibióticos beta-lactâmicos, sua
composição é constituída de 90% de água (Bora
et al. 2005). Nenhum trabalho aborda a taxa de
degradação AC no SDFA, sendo assim, estudos
da degradação do AC são considerados de
VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica
27 a 30 de julho de 2009
Uberlândia, Minas Gerais, Brasil
fundamental importância para que, ao apontar as
faixas de pH e de massa molecular de PEG que
apresentam menor taxa de degradação do AC, e
o uso do SDFA possa ser aplicado na indústria
farmacêutica. Neste intuito, este trabalho teve
objetivo de estudar a taxa de degradação do
ácido clavulânico em ambas as fases do SDFA.
MATERIAIS E MÉTODOS
pseudo-primeira ordem. A degradação, por hidrólise, do AC ocorre conforme a equação:
k2
AC →
PD
(1)
em que PD é produto de degradação.
Considerando o excesso de água
comparado à quantidade de AC, a degradação do
mesmo segue a cinética de pseudo-primeira
ordem segundo a equação:
Materiais
Ácido clavulânico: O ácido clavulânico foi
obtido de duas fontes diferentes: solução 700mg/l
de clavulanato de potássio obtido através do
produto farmacêutico Clavulin® (um comprimido
contém 125mg de clavulanato de potássio e
500mg
de
amoxicilina),
importado
por
GlaxoSmithKline Brasil Ltda; e o caldo de
fermentação de ácido clavulânico foi obtido
através de cultivo de Streptomyces clavuligerus,
ATCC 27064, pré-tratado por membrana de
ultrafiltração de polisulfona de tamanho de poro
3kDa.
Polietileno glicol: Foram utilizados PEG de
massas moleculares 200, 300 e 600 (Fluka,
BioChemica), 400 (Synth ) e 4000 e 6000 (Merck).
Solução de fosfato: As soluções tampão de
fosfato foram feitas com KH2PO4 e K2HPO4, em
pHs 8, 7 e 5,4.
Método analítico
Determinação da concentração do AC: A
concentração do ácido clavulânico em solução
aquosa foi determinada em espectrofotômetro,
segundo o método proposto por Bird et al. (1982),
que se baseia na derivatização do ácido
clavulânico com uma solução de imidazol de
60g/L e leitura de absorbância em 312 nm.
Método experimental
Os sistemas de duas fases aquosas foram
formados a partir de soluções estoque de PEG e
fosfato de potássio com pH variando de 5,4 a 8, e
à temperatura controlada em 20ºC. Após a
separação das fases um volume da cada fase foi
recolhido em frasco Erlenmeyer de 250mL. Os
frascos foram mantidos à temperatura constante
em 20ºC, e para que a concentração de AC fosse
determinada foram retiradas, desses frascos,
alíquotas de 0,5mL periodicamente.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Cinética de degradação do AC
Segundo Bersanetti et al. (2000) a degradação do AC se ocorre como uma cinética de
− dC
= k 2C
dt
(2)
Em que k2 é a constante de velocidade de
segunda ordem e C é a concentração de AC. Assim, isolando as variáveis comuns e integrando,
obtém-se a relação linear entre a concentração de
AC e tempo:
− ln
C
= k 2t
C0
(3)
Degradação de AC presente em solução de
Clavulin
A estabilidade do AC em solução de
Clavulin para pHs entre 5,4 e 8 na fase de topo do
SDFA para os PEGs 6000 e 400, estão
representados na Figura 1 e 2, respectivamente.
Pode ser observado que a velocidade de
degradação do AC, k, aumenta com aumento do
pH, para ambos os PEGs. Este comportamento
pode ser observado para a degradação do AC na
fase de fundo do SDFA para os PEGs 6000 e 400
(Figura 3 e 4, respectivamente).
Normalmente após a formação das fases
do SDFA o pH da fase de fundo é muito
semelhante ao pH da fase de topo. O fato da
maior massa molecular de PEG apresentar uma
menor velocidade de degradação deve estar
relacionado ao fato de uma maior interação entre
AC e o PEG 6000, sendo esta proporcionando
uma maior estabilidade à molécula do AC.
As constantes de velocidade, k, estimadas
por regressão linear dos dados experimentais, a
partir do gráfico semi-logarítmico versus tempo,
são mostradas nas Tabelas 1 e 2 para fase de
topo e fase de fundo, respectivamente.
Comparando os valores das constantes de
velocidade, k, entre fase de topo (Tabela1) e
fundo (Tabela 2), nota-se que a velocidade de
degradação é superior à fase fundo. A
degradação do AC presente na fase de fundo
ocorre em sua totalidade dentro de 6h após a
separação das fases para o PEG 400 (Figura 4),
vale ressaltar que os coeficientes de partição do
AC para SDFA são altos entre 10 e 100 (Videira e
Aires-Barros, 1994), indicando que o AC se
distribui quase na sua totalidade na fase de topo
do SDFA. Esta alta velocidade de degradação
está relacionado à menor quantidade de PEG
presente na fase de fundo após a formação das
fases para ambos os PEgs.
3
-ln(C/C0)
pH 8
pH 7
pH 5,4
pH 8
pH 7
pH 5,4
3
2
-ln(C/C0)
1
2
0
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
3
4
5
6
7
8
100
Tempo (h)
Figura 1 – Hidrólise do AC na fase de topo do
SDFA-PEG 6000. Solução de Clavulin.
5
pH 8
pH 7
pH 5,4
4
2
1
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Tempo (h)
Figura 2 – Hidrólise do AC na fase de topo do
SDFA-PEG 400. Solução de Clavulin.
6
pH 8
pH 7
pH 5,4
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
Tabela 1 – Constantes de velocidade, k, na
fase de topo do SDFA. Solução de Clavulin.
-1
PEG
pH
k(h )
6000
5,4
0,016
400
5,4
0,025
6000
7,0
0,029
400
7,0
0,041
6000
8,0
0,038
400
8,0
0,109
Tabela 2 – Constantes de velocidade, k, na
fase de Fundo do SDFA. Solução de Clavulin.
PEG
pH
k(h-1)
6000
5,4
0,067
400
5,4
0,130
6000
7,0
0,315
400
7,0
0,379
6000
8,0
0,269
400
8,0
0,747
3
-ln(C/C0)
2
Figura 4 – Hidrólise do AC na fase de fundo do
SDFA-PEG 400. Solução de Clavulin.
0
-ln(C/C0)
1
Tempo (h)
1
70
Tempo (h)
Figura 3 – Hidrólise do AC na fase de fundo do
SDFA-PEG 6000. Solução de Clavulin.
Degradação de AC presente em caldo de fermentação
As Figuras 5 e 6 mostram o resultados experimentais da degradação do AC presente em
caldo de fermentação para os PEGs 6000 e 400
nas fases de topo. Na Tabela 3 pode se observar
os valores obtidos para constantes de velocidades, k, estes foram próximos aos resultados obtidos para o AC proveniente da solução de Clavulin
(Tabela 3) para ambos PEGs. Resultado este
também observado para a fase de fundo do PEG
6000(Tabela 4). No entanto, a degradação total
do AC na fase de fundo do PEG 400 ocorreu em
um tempo inferior 1h, impossibilitando a determinação da velocidade de degradação. Este fato
pode ser explicado possivelmente pela presença
de alguns componentes no meio fermentativo,
como compostos de amônia, que aumenta a instabilidade do AC, e estes compostos podem ter a
sua maior distribuição na fase de fundo do PEG
400.
As Figura 6 a 7 pode-se observado que a
velocidade de degradação do AC, k, aumenta
com aumento do pH, para ambos os PEGs. Fato
este observado para ao AC proveniente do Clavulin (Figura 1 a 4).
5
pH 8
pH 7
pH 5,4
4
Tabela 4 – Constantes de velocidade, k, na
fase de fundo do SDFA.
PEG
pH
k(h-1)
6000
5,4
0,084
6000
7,0
0,364
6000
8,0
0,750
3
-ln(C/C0)
Tabela 3 – Constantes de velocidade, k, na
fase de topo do SDFA.
-1
PEG
pH
k(h )
6000
5,4
0,016
400
5,4
0,024
6000
7,0
0,021
400
7,0
0,021
6000
8,0
0,027
400
8,0
0,036
2
1
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
CONCLUSÕES
240
Tempo (h)
Figura 5 – Hidrólise do AC na fase de topo do
SDFA-PEG 6000. Caldo de fermentação.
5
pH 8
pH 7
pH 5,4
4
-ln(C/C0)
3
2
1
0
0
20
40
60
80
100 120 140 160 180 200 220 240 260
Tempo (h)
Figura 6 – Hidrólise do AC na fase de topo do
SDFA-PEG 400. Caldo de fermentação.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
4
pH 8
pH 7
pH 5,4
3
-ln(C/C0)
Apesar de que o SDFA ser um ambiente
favorável à extração de biomoléculas e tendo
vasta aplicação industrial da técnica para extração
do antibiótico beta-lactâmico ácido clavulânico, foi
estudado a sua degradação neste sistema, para
os PEGs 6000 e 400, em diferentes condições
pHs e origem do AC.
O PEG de maior peso molecular 6000
apresenta ambiente mais favorável à estabilidade
do AC em toda faixa de valores de pHs. O
antibiótico ácido clavulânico apresenta uma maior
estabilidade em pH 5,4 para os dois PEGs
apresentados independente da origem do acido
clavulânico.
O AC presente na fase de fundo apresenta
uma maior instabilidade em relação ao AC
presente na fase de topo.
Finalmente a cinética de degradação do AC
no SDFA segue uma cinética de pseudo-primeira
ordem como proposto inicialmente na realização
dos experimentos.
2
1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (h)
Figura 7 – Hidrólise do AC na fase de fundo do
SDFA-PEG 6000. Caldo de fermentação.
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AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem pelo financiamento
da FAPESP (05/55079-4) e pela bolsa de IC de
M.C.A.D.Barros (2009/50749-2) e à CNPq pela
bolsa de doutorado de C.S. da Silva.