CRISTIANE PIMENTEL VICTÓRIO
Cultura de Tecidos e Metabólitos Especiais em
“Colônia” (Alpinia zerumbet Pers. Burtt et
Smith) e A. purpurata (Vieill) K. Schum e
Estudos Preliminares da Atividade Biológica
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO
DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Rio de Janeiro 2 0 0 8
II
Cristiane Pimentel Victório
Cultura de Tecidos e Metabólitos Especiais em “Colônia” (Alpinia
zerumbet Pers. Burtt et Smith) e A. purpurata (Vieill) K. Schum e Estudos
Preliminares de Atividade Biológica
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Ciências Biológicas (Biofísica), Universidade Federal do
Rio de Janeiro (UFRJ), como requisito parcial à obtenção do
título de Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica).
Orientador:
Dr. Celso Luiz Salgueiro Lage
Co-orientador:
Dr. Ricardo Machado Kuster
Colaboradores:
Dr. Roberto Soares de Moura
Dr. Carlos Alberto da Silva Riehl
Dra. Alice Sato
Rio de Janeiro, RJ, 2008
III
VICTÓRIO, Cristiane Pimentel.
Cultura de Tecidos e Metabólitos Especiais em “Colônia” (Alpinia zerumbet
Pers. Burtt et Smith) e A. purpurata (Vieill) K. Schum e Estudos
Preliminares de Atividade Biológica/ Cristiane Pimentel Victório; orientação
Celso Luiz Salgueiro Lage. Rio de Janeiro, 2008, XXVI, 188 f.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas (Biofísica) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Universidade Federal do Rio de Janeiro.
1. Colônia. 2. Planta medicinal. 3. Cultura de tecidos vegetais. 4.
Reguladores de crescimento vegetal. 5. Flavonóides. 6. Óleo essencial. 7.
Atividade vasodilatadora. 8. Zingiberaceae. I. Lage, Celso Luiz. II.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho, Programa de Pós-graduação em Ciência Biológicas (Biofísica). III.
Título.
IV
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Rio de Janeiro 2 0 0 8
Cristiane Pimentel Victório
Cultura de Tecidos e Metabólitos Especiais em
“Colônia” (Alpinia zerumbet Pers. Burtt et Smith) e A.
purpurata (Vieill) K. Schum e Estudos Preliminares de
Atividade Biológica.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pósgraduação
em Ciências Biológicas (Biofísica),
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), como
requisito parcial à obtenção do título de Doutor em
Ciências Biológicas (Biofísica)
Aprovada em:
___________________________________
Dr. Celso Luiz Salgueiro Lage (UFRJ)
__________________________________
Dra. Maria Auxiliadora Coelho Kaplan (UFRJ)
__________________________________
Dr. Alcino Palermo (Instituto Militar de Engenharia – IME)
__________________________________
Dra. Sandra Azevedo (UFRJ)
____________________________________
Dra. Marsen Garcia Pinto Coelho (UERJ)
V
Lista de Abreviaturas
ACh
-
Acetilcolina
MS
-
Sais de Murashige & Skoog (1962)
AIA
-
Ácido indolacético
BAP
-
6-benzilaminopurina
CIN
-
Cinetina
CCD (TLC)
-
Cromatografia em camada delgada
EDTA
ácido etilenodiamino tetracético
CG/DIC
Cromatografia a gás por detecção de ionização em chamas
CG/EM (GC/MS)
-
Cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas
CLAE (HPLC)
-
Cromatografia líquida de alta eficiência
EAG
-
Equivalentes em ácido gálico
EDS (SDE)
-
Extração por destilação simultânea
HD
LVM
Hidrodestilação
-
NG
Leito mesentérico
Nitroglicerina
NP:PEG
-
2-aminoetilfenilborato + polietilenoglicol
NOR
-
Noradrenalina
RMN (NMR)
-
Ressonância magnética nuclear
TDZ
-
Tidiazuron
UV
-
Ultravioleta
VI
Lista de Figuras
INTRODUÇÃO
Figura 1
-
Ilustração botânica da espécie Alpinia zerumbet (1-5). 1- planta em
4
floração, 2 – porção distal mostrando a inflorescência, 3 – flor, 4 –
labelo, 5 – estames e pistilo.
Figura 2
-
Fotos da espécie Alpinia purpurata.
Figura 3
-
Esquema simplificado da rota biossintética dos flavonóides.
13
Figura 4
-
Esquema simplificado da rota biossintética dos terpenóides.
15
6
Capitulo 1. Sistemas de cultura de tecidos para as espécies Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
1.1 Estabelecimento in vitro de culturas assépticas de plantas de Alpinia zerumbet
(Pers) Burtt et Smith
Figura 1
-
Protocolos de desinfestação dos explantes obtidos de A. zerumbet .
37
Figura 2
-
Plantas in vitro de Alpinia zerumbet com 2 meses. MS0 líquido
41
(A), AIA 2 (B). C. Plantas de A. zerumbet na sala de cultura sob
lâmpadas luz fluorescentes. D. Plantas aclimatizadas, após 2 anos.
E-F. Calogênese a partir do pseudocaule, em TDZ, após 2 meses
(F) e cultura de células em suspensão (E).
Figura 3
-
Respostas morfogênicas de Alpinia zerumbet com 3 meses in vitro,
44
sob ação de diferentes reguladores de crescimento vegetal.
Figura 4
-
Alongamento in vitro de brotos de Alpinia zerumbet após 3 meses,
sob ação de diferentes reguladores de crescimento vegetal.
45
VII
Figura 5
-
Diferenças (%) no desenvolvimento de Alpinia zerumbet, entre 1-2
45
meses e 2-3 meses.
1.2 Propagação in vitro de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum sob efeito de auxinas
e citocininas
Figura 1
-
Desenvolvimento in vitro de Alpinia purpurata em meio MS
51
liquido, com 2 meses (A). Seqüência do desenvolvimento (B): 1
mês (I), 2 meses (II) e 3 (III) meses.
Capítulo 2. Produção de metabólitos especiais em plantas de Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
2.1. Diferentes métodos de extração de flavonóides de folhas de Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith
Figura 1
-
Perfis cromatográficos (CLAE) do extrato aquoso (A) e
60
hidroalcoólico (B) de Alpinia zerumbet, pelo método de ultrassom
45 min. 1. Rutina (TR: 31.42 min) e 2. kaempferol-3-Oglicuronídeo (TR: 34.49 min), 360 nm.
Figura 2
-
Estrutura dos flavonóides glicosilados de Alpinia zerumbet. A.
61
rutina e B. kaempferol-3-O-glicuronídeo.
Figura 3
-
Conteúdo de flavonóides rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo no
extrato aquoso e hidroalcoólico de A. zerumbet obtido por CLAE e
determinado por uma curva de calibração dos padrões.
62
VIII
2.2. Detecção de flavonóides em folhas de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum. por
cromatografia líquida de alta eficiência.
Figura 1
-
Curvas analíticas para os padrões kaempferol-3-O-glicuronídeo e
71
rutina.
Figura 2
-
Espectros ultravioleta (CLAE) dos padrões (A) rutina e (B)
72
kaempferol-3-O-glicuronídeo, a 254 nm.
Figura 3
-
Comparação do conteúdo de fenóis totais de Alpinia zerumbet e
73
Alpinia purpurata coletadas em 2 diferentes períodos do ano.
Figura 4
-
Perfil cromatográfico do extrato bruto (A), extrato acetato de etila
75
(B) e butanólico (C) de Alpinia purpurata. (2) rutina e (4)
kaempferol-3-O-glicuronídeo, 254 nm.
2.3. Elucidação estrutural do flavonóide da espécie Alpinia purpurata (Vieill) K.
Schum utilizando técnicas de ressonância magnética nuclear
Figura 1
-
Esquema de fracionamento químico do extrato seco de Alpinia
80
purpurata
Figura 2
-
Estrutura química da rutina - AP29(4).
81
Capítulo 3 Produção de metabólitos especiais em culturas organogênicas de
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
3.1. Flavonóides produzidos por plantas in vitro de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et
Smith
Figura 1
-
A - Estágios de crescimento in vitro de Alpinia zerumbet em meio
90
IX
MS0. B - Plantas in vitro no tratamento acrescido de AIA 2 mg.l-1,
com 3 meses.
Figura 2
-
Perfis cromatográficos das plantas in vitro de Alpinia zerumbet. A.
94
MS0, B. AIA 2 + TDZ 2, C. TDZ 8, D. AIA 2. 1. Rutina, 2.
kaempferol-3-O-rutinosídeo e 3. kaempferol-3-O-glicuronídeo
Figura 3
-
Espectros de UV dos sinais 4, 5 e 6 e seus respectivos tempos de
95
retenção (TR) referidos no cromatograma (Figura 2), de plantas in
vitro de Alpinia zerumbet.
3.2 Produção de rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo em plantas in vitro de Alpinia
purpurata (Vieill) K. Schum
Figura 1
-
Desenvolvimento de Alpinia purpurata, com 3 meses de cultivo in
104
vitro.
Figura 2
-
Perfis cromatográficos dos extratos de folhas de plantas in vitro de
106
Alpinia purpurata, entre 3 a 4 meses. A. campo, B. MS (controle
2), C. TDZ 2, D. BAP 2 (360 nm), E. BAP 2 (254 nm, indicando o
TR 45.539), F. Plantas in vitro, após 3 meses em TDZ 2. 1. rutina,
2. kaempferol-3-O-glicuronídeo, 3. n.i. (1) – 254 nm, 4. n.i. (2) e
5. n.i. (3).
Figura 3
-
Concentração relativa (%) de rutina em relação às substâncias não
106
identificadas n.i.(1): TR 45.539 (254 nm); n.i.(2): TR 47.674;
n.i.(3): TR 50.982.
Figura 4
-
Concentração de flavonóides nas partes aéreas de plantas
cultivadas in vitro por 3-4 meses. Letras diferentes para cada
flavonóide em separado indicam diferenças estatísticas (p< 0,05).
107
X
Capítulo 4 Avaliação do óleo essencial e aroma de folhas de Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
4.1. Composição do óleo essencial de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum e Alpinia
zerumbet (Pers.) Burtt et Smith
Figura 1
-
Área relativa (%) obtida por CG/DIC dos principais componentes
119
do óleo essencial de Alpinia zerumbet. A. Abril 2005 e Novembro
2007. B. Novembro 2007 (HD e EDS).
4.2. Caracterização do aroma de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith: plantas de
campo e in vitro
Figura 1
-
Aspecto morfogênico das plantas de Alpinia zerumbet submetidas
126
às análises de “headspace”, com 4 meses de cultivo in vitro: A.
MS0 (controle), B. AIA, C. BAP, D. CIN, E. TDZ (2 mg.L-1).
Figura 2
-
Efeito dos reguladores de crescimento no desenvolvimento in vitro
126
de Alpinia zerumbet, com 4 meses. A. número de brotos (%), B.
número folhas (%), C. peso fresco das folhas (mg), D. peso seco
das folhas (mg).
Figura 3
-
Perfis cromatográficos do aroma de Alpinia zerumbet obtido por
131
CG/EM: (A) Plantas de campo. Plantas in vitro: (B) MS0, (C)
TDZ 2. (D) Fórmulas estruturais dos principais constituintes do
aroma das folhas.
Figura 4
-
Rota biossintética simplificada dos principais monoterpenos e
sesquiterpenos identificados em Alpinia zerumbet
132
XI
Capítulo 5 Estudos preliminares sobre a atividade vasodilatadora do extrato de
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
5.1. Atividade vasodilatadora do extrato de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e
A. purpurata (Vieill) K. Schum
Figura 1
-
Esquema do LVM perfundido com solução de Krebs (Adaptado de
141
Carvalho, 2002).
Figura 2
-
Perfis cromatográficos (CLAE) dos extratos hidroalcoólico de
143
Alpinia zerumbet (A) e Alpinia purpurata (B) de campo, 360 nm,
utilizados no teste de reatividade: (1) rutina e (2). kaempferol-3-Oglicuronídeo. Os números na figura correspondem aos mesmos da
Tabela 1.
Figura 3
-
Registro das alterações na pressão de perfusão no LVM de rato
145
induzida pelo KCl, ACh, NG e de extrato de Alpinia purpurata
obtidas durante o efeito pressor provocado pela NOR.
Figura 4
-
Relaxamento induzido pelo extrato de Alpinia purpurata e Alpinia
145
zerumbet procedentes do Rio de Janeiro no LVM isolado de rato,
contraído com norepinefrina (30 µM).
Figura 5
-
Relaxamento induzido pelo extrato de plantas in vitro de Alpinia
zerumbet tratadas com diferentes reguladores de crescimento
vegetal, no LVM isolado de rato contraído com norepinefrina (30
µM).
147
XII
Lista de Tabelas
INTRODUÇÃO
Tabela 1
-
Resumo das atividades biológicas de A. zerumbet e A. purpurata:
7
uso popular e comprovação científica.
Tabela 2
-
Principais relatos de variação dos constituintes do óleo essencial
24
produzido por diferentes espécies in vitro sob tratamentos ação de
diferentes reguladores de crescimento vegetal.
Tabela 3
-
Principais relatos da produção de flavonóides in vitro sob ação de
25
diferentes reguladores de crescimento vegetal.
Tabela 4
-
Plantas referidas como anti-hipertensivas pelo uso popular e
28
conhecimento científico.
Capitulo 1. Sistemas de cultura de tecidos para as espécies Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
1.1 Estabelecimento in vitro de culturas assépticas de plantas de Alpinia zerumbet
(Pers) Burtt et Smith
Tabela 1
-
Indução da calogênese em Alpinia zerumbet por 2,4D e CIN, em
46
meio MS.
1.2 Propagação in vitro de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum sob efeito de auxinas
e citocininas
Tabela 1
-
Respostas do desenvolvimento in vitro de Alpinia purpurata.
53
XIII
Capítulo 2. Produção de metabólitos especiais em plantas de Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
2.1. Diferentes métodos de extração de flavonóides de folhas de Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith
Tabela 1
- Especificações das metodologias de extração a partir de folhas
57
secas de Alpinia zerumbet.
Tabela 2
- Rendimento da extração a partir de folhas secas de Alpinia
60
zerumbet.
2.2. Detecção de flavonóides em folhas de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum. por
cromatografia líquida de alta eficiência.
Tabela 1
- Flavonóides relatados para o gênero Alpinia.
67
Tabela 2
- Comparação do conteúdo de fenóis totais de Alpinia zerumbet e
74
Alpinia purpurata coletadas em 2 diferentes períodos do ano.
2.3. Elucidação estrutural do flavonóide da espécie Alpinia purpurata (Vieill) K.
Schum utilizando técnicas de ressonância magnética nuclear
Tabela 1
- Comparação dos valores obtidos de RMN 1H e de 13C (400 e 100
MHz) obtidos para AP29(4) com os valores da literatura para
rutina (Markham, 1976).
82
XIV
Capítulo 3 Produção de metabólitos especiais em culturas organogênicas de
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
3.1. Flavonóides produzidos por plantas in vitro de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et
Smith
Tabela 1
- Efeito dos reguladores de crescimento no desenvolvimento in vitro
91
de Alpinia zerumbet, com 3 meses.
Tabela 2
- Conteúdo de flavonóides (mg.g
-1
folha seca) em extratos
93
hidroalcóolicos de Alpinia zerumbet de campo e obtidas in vitro
(cultivo por 3-4 meses).
Capítulo 4 Avaliação do óleo essencial e aroma de folhas de Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
4.1. Composição do óleo essencial de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum e Alpinia
zerumbet (Pers.) Burtt et Smith
Tabela 1
- Resultados referentes ao óleo essencial extraído da espécie A.
114
zerumbet e A. purpurata.
Tabela 2
- Composição do óleo essencial de Alpinia zerumbet e A. purpurata.
115
Tabela 3
Composição do óleo essencial de Alpinia zerumbet extraído por
118
EDS e HD, Novembro 2007.
XV
4.2. Caracterização do aroma de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith: plantas de
-
campo e in vitro
Tabela 1
- Caracterização do aroma de folhas de campo, e in vitro de Alpinia
127
zerumbet cultivada por 4 meses sob diferentes reguladores de
crescimento vegetal.
Capítulo 5 Estudos preliminares sobre a atividade vasodilatadora do extrato de
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
5.1. Atividade vasodilatadora do extrato de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e
A. purpurata (Vieill) K. Schum
Tabela 1
- Concentração de flavonóides nos extratos de Alpinia zerumbet e A.
purpurata, obtidas a partir das curvas analítica dos padrões.
143
XVI
RESUMO
Tese de Doutorado
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica)
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Cultura de Tecidos e Metabólitos Especiais em “Colônia” (Alpinia zerumbet Pers.
Burtt et Smith) e A. purpurata (Vieill) K. Schum e Estudos Preliminares de Atividade
Biológica.
Autoria: Cristiane Pimentel Victório
Orientador: Celso Luiz Salgueiro Lage
Co-orientador: Ricardo Machado Kuster
O uso de plantas medicinais é freqüente no do dia-a-dia do brasileiro. Estudos integrados de
técnicas biotecnológicas, fitoquímica e atividade biológica constituem uma abordagem
multidisciplinar que contribui para o conhecimento científico e uso seguro das plantas. A
espécie Alpinia zerumbet (colônia) é bastante utilizada nos tratamentos relacionados a
cardiopatias. Já a espécie Alpinia purpurata é comumente empregada com fins
ornamentais. Uma das propostas deste trabalho foi o estudo fitoquímico e biológico desta
espécie. Diversas técnicas envolvendo cultura de tecidos vegetais são utilizadas como
ferramenta, no intuito de se obter material vegetal homogêneo e de qualidade, e produzir
metabólitos secundários dentro de condições ambientais padronizadas e reprodutíveis. Os
flavonóides e terpenos estão entre os principais metabólitos relacionados ao uso terapêutico
das plantas medicinais. O potencial de produção destes metabólitos secundários foi
avaliado em plantas de campo, e plantas in vitro sob ação de diferentes reguladores de
crescimento vegetal. A rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo foram pela primeira vez
identificados para A. purpurata; a rutina foi isolada a partir da fração butanólica e
identificada por ressonância magnética nuclear. Os resultados para a organogênese direta in
vitro, em meio MS líquido, mostraram adequação quanto à produção monoclonal de plantas
livres de patógenos e com 100% de enraizamento. Poucas variações foram observadas entre
os tratamentos com citocininas e auxinas. As culturas in vitro após 3-4 meses foram
avaliadas quanto à produção de flavonóides. Em amostras de folhas in vitro de A. zerumbet
foram encontrados os flavonóides rutina, kaempferol-3-O-glicuronídeo e kaempferol-3-Orutinosídeo, com maiores concentrações de rutina sob o efeito de AIA + TDZ. Para a
espécie A. purpurata, o teor de kaempferol-3-O-glicuronídeo foi maior nos tratamentos
com BAP e AIA + TDZ. Os principais componentes do óleo de folhas de A. zerumbet
foram os monoterpenos terpinen-4-ol (29,4%), 1,8 cineol (23,1%) e γ–terpineno (16,1%).
Enquanto para a espécie A. purpurata, o β–pineno (34,7%) e α-pineno (11,8%) foram
predominantes. A caracterização da fração volátil de plantas de A. zerumbet foi avaliada
pela técnica de extração por “headspace” seguida pela análise por cromatografia a gás.
Como principais componentes, o aroma apresentou γ–terpineno, sabineno e terpinoleno.
Em todos os tratamentos in vitro, as plantas produziram sabineno, 1,8 cineol e cariofileno
como principais constituintes. A ação vasodilatadora mostrou igual potência em relação a
espécie A. zerumbet, na dose de 60 µg, mas a eficiência foi menor. As plantas in vitro de A.
zerumbet mostraram efeito vasodilatador reduzido, comparado as plantas de campo. As
estratégias biotecnológicas permitiram manipular e avaliar as respostas das espécies quanto
XVII
à produção de metabólitos secundários. Adicionalmente, os resultados forneceram
indicações para o efeito de reguladores de crescimento vegetal em rotas biossintéticas de
flavonóides e terpenos. Os estudos fitoquímicos da espécie A. purpurata são pioneiros e
fornecem indicações sobre substâncias bioativas que podem estar envolvidas no uso
medicinal da espécie. Os dados preliminares sobre atividade biológica de A. purpurata
sugerem efeito vasodilatador.
Palavras-chave: cromatografia líquida de alta eficiência, colônia, extração por destilação
simultânea, flavonóide, óleo essencial, planta medicinal, planta ornamental
XVIII
Tissue Culture and Secondary Metabolites in “Colônia” (Alpinia zerumbet Pers. Burtt
et Smith) and A. purpurata (Vieill) K. Schum and Preliminary Studies about Biological
Activity.
ABSTRACT
Medicinal plants are present in the daily life of Brazilian people. Integrated studies of
biotechnological techniques, phytochemistry and biological activity constitute a
multidisciplinary approach that contributes for the scientific knowledge and safe use of
plants. Alpinia zerumbet (“colônia”) is quite employed in cardiopathy related treatments.
Otherwise Alpinia purpurata is commonly used as ornamental purpose. One of the
proposals of this work was the phytochemical and biological study of this species. Several
techniques comprising plant tissue culture is utilized as tool, in order to get high-quality
and homogeneous plant material and secondary metabolites under standardized and
reproducible environment conditions. Flavonoids and terpenes are the main metabolites
related to therapeutical use of medicinal plant. The production potential of the above
secondary metabolite was evaluated in field plants and in vitro plants under different plant
growth regulator action. The rutin and kaempferol-3-O-glucuronide were for the first time
identified for A. purpurata; rutin was isolated from butanolic extract and identified by
nuclear magnetic resonance. In vitro direct organogenesis, in liquid MS medium, resulted
in adequate monoclonal production of pathogen-free plants, with 100% rooting. There were
little variations in treatments with cytokinins and auxins. After 3-4 months in vitro cultures
were evaluated as to flavonoids production. In vitro samples of leaves of A. zerumbet
presented the flavonoids rutin, kaempferol-3-O-glucuronide and kaempferol-3-Orutinoside, with higher concentration of rutin under IAA + TDZ effect. Kaempferol-3-Oglucuronide content for A. purpurata was higher in treatments with BAP and IAA + TDZ.
Essential oil was extracted by hydrodistillation and simultaneous-distillation extraction.
The main constituents of leaf oil of A. zerumbet was monoterpenes terpinen-4-ol (29.4%),
1,8 cineole (23.1%) and γ–terpinene (16.1%). While for A. purpurata, β–pinene (34.7%)
and α-pinene (11.8%) were the majority. Field plant aroma presented γ–terpinene, sabinene
and terpinolene as main constituents. For all in vitro treatments, plants produced sabinene,
1,8 cineole and caryophyllene as the main constituents. Vasodilation showed the same
potential in relation to A. zerumbet at 60 µg dose, but efficiency was lower. A. zerumbet in
vitro plants presented reduced vasodilation effect compared to field plants.
Biotechnological strategies permitted to manipulate and evaluate species responses as to
secondary metabolites production. Additionally, the results provided indications for the
effect of plant growth regulator in biosynthetic pathway of flavonoids and terpenes. A.
purpurata phytochemical studies are pioneer in indicating the presence of bioactive
molecules that can be responsible for the medicinal use of this specie. Preliminary data on
A. purpurata biological activity suggest vasodilation effect.
Keywords: “colônia”, essential oil, flavonoid, HPLC, SDE, TLC, medicinal plant
XIX
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO
1
1
Plantas medicinais: recursos naturais na medicina
1
2
Considerações a respeito do gênero Alpinia
1
2.1
Potencial químico e Uso popular de Alpinia zerumbet e A. purpurata
6
3
Considerações sobre o metabolismo secundário
10
3.1
Flavonóides: substâncias fenólicas com potencial terapêutico
11
3.2
Óleos essenciais e aroma
14
4
Cultura de tecidos vegetais
16
4.1
Reguladores de crescimento vegetal
18
4.2
Estratégias aplicadas ao cultivo in vitro para aumento da produção de
20
metabólitos especiais em plantas
5
Hipertensão e Alternativas Fitoterápicas
26
5.1
Endotélio e Fator de relaxamento derivado do endotélio (FRDE)
29
32
JUSTIFICATIVA
34
OBJETIVOS
Capitulo 1. Sistemas de cultura de tecidos para as espécies Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
1.1
Estabelecimento in vitro de culturas assépticas de plantas de Alpinia
35
zerumbet (Pers) Burtt et Smith
1.2
Propagação in vitro de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum sob efeito
de auxinas e citocininas
48
XX
Capítulo 2. Produção de metabólitos especiais em plantas de Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
2.1
Diferentes métodos de extração de flavonóides de folhas de Alpinia
54
zerumbet (Pers.) Burtt et Smith
2.2
Detecção de flavonóides em folhas de Alpinia purpurata (Vieill) K.
65
Schum. por cromatografia líquida de alta eficiência.
2.3
Elucidação estrutural do flavonóide da espécie Alpinia purpurata
76
(Vieill) K. Schum utilizando técnicas de ressonância magnética nuclear
Capítulo 3 Produção de metabólitos especiais em culturas organogênicas de
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
3.1
Flavonóides produzidos por plantas in vitro de Alpinia zerumbet (Pers.)
84
Burtt et Smith
3.2
Produção de rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo em plantas in vitro
98
de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum
Capítulo 4 Avaliação do óleo essencial e aroma de folhas de Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
4.1
Composição do óleo essencial de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum e
110
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith
4.2
Caracterização do aroma de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith:
plantas de campo e in vitro
121
XXI
Capítulo 5 Estudos preliminares sobre a atividade vasodilatadora do extrato
de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
5.1
Atividade vasodilatadora do extrato de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et
134
Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
CONSIDERAÇÕES FINAIS
149
REFERÊNCIAS
151
181
APÊNDICE A -Produção científica e artigos submetidos
184
ANEXO A - RMN 1H da fração Ap (29) 4 (400 MHz – Metanol OD)
ANEXO B - RMN 13C da fração Ap (29) 4 (100 MHz – Metanol OD)
185
ANEXO C - Coinjeção dos padrões de flavonóides (rutina, kaempferol-
186
3-O-glicuronídeo
e
kaempferol-3-O-rutinosídeo)
com
o
extrato
hidroalcoólico de folhas de Alpinia zerumbet in vitro.
ANEXO D - Coinjeção em CLAE e aplicação conjunta em CCD dos
padrões de flavonóides (rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo) com o
extrato hidroalcoólico de folhas de campo de Alpinia purpurata.
187
XXII
Dedico aos meus pais Terezinha e Emílio
pelo apoio, estímulo, sustento, paciência
e acima de tudo AMOR. Aos meus
irmãos Tiago e Regina.
XXIII
Agradeço a Deus que na concretização
de todas as coisas, se mostrou presente. Obrigada
pela oportunidade de realizar este trabalho,
pela ciência e pelo contato humano,
sempre muito enriquecedor.
XXIV
Agradecimentos
♣ Ao meu orientador Celso Lage, “Pai Celso”, que me orienta desde o Mestrado. As
famosas discussões sobre “tudo um pouco”. Está para nascer alguém que tenha tamanha
abrangência e diversidade intelectual. Momentos de muita aprendizagem.
♣ Ao meu co-orientador Ricardo Kuster, o famoso Richard, por todo carinho e atenção.
Por me dar um voto de confiança em meio a tantos solventes e reagentes. Por todas as
conversas, churrascos, risadas (...) por ter participado desta etapa de frutífero conhecimento
fitoquímico. Coletar frações da coluna de SEPHADEX sempre parecia muito fácil e rápido
ao lado do Ricardo.
♣ Quero deixar também registrado meu carinho e agradecimento a tão querida “Professora
Esquibel” (Maria Apparecida Esquibel) que mesmo de longe ainda nos fala de como ser um
bom e ético profissional.
♣ A professora Dra. Alice Sato do Dep. Botânica, UNIRIO. Na verdade não sei ao certo se
ela é UNIRIO ou UFRJ?! Sempre presente! Alice, valeu MUITO pelo estímulo, orientação
e preciosa ajuda (...) as palavras sempre são escassas neste momento.
♣ Ao professor Dr. Roberto Soares de Moura do Laboratório Dep. Farmacologia, IBRAG,
UERJ. Obrigada pela confiança, por me deixar a vontade no laboratório.
♣ Ao professor Dr. Carlos Alberto da Silva Riehl do Laboratório de Ensaios e
Metodologias Aplicadas do IQ/UFRJ pela disposição em participar da minha idéia, pela
forma descontraída ( ... ) a impressão que eu tenho é que trabalhava com ele há um bom
tempo.
♣ Agradeço ao professor Antônio Jorge do NPPN pelos auxílios com as análises no HPLC
e por resolver todos os “pepinos” que apareciam com o tão “temperamental” HPLC. No fim
tudo deu certo, como me disse a Crisinha e a Halliny. Neste momento também me lembro
dos seus alunos Osmã e Ricardo. Poxa, por pouco ia me esquecer, mas em tempo, agradeço
pelas ajudas com o HPLC, liofilizador e o espectrofotômetro.
♣ A Naomi que tanto me ajudou com as correções da Tese, muito obrigada.
♣ Agradeço a Suzana Leitão pelo auxílio logo no início deste trabalho quando eu queria
extrair o óleo essencial da colônia. Tão gentilmente abriu as portas do seu lab para que eu
pudesse fazer a hidrodestilação. Resultado o cheiro da colônia impregnou todo o lab.
Ainda, pela auxilio com a identificação dos terpenos. Aproveito, para também agradecer a
Aline Castellar, que gratuitamente me ajudou com a identificação dos espectros do CG/EM,
pela simplicidade do ato que foi fundamental para Tese.
♣ Quero também agradecer a Profa. Celuta e a Daniela Sales que permitiram a realização
dos ensaios microbiológicos com o óleo essencial da colônia, na Microbiologia, e ao Davi
(saxofonista microbiologista), hoje mestrando, mas que me ajudou em cada etapa dos
XXV
ensaios. Embora os resultados não tenham composto a Tese, foram enviados para
apresentação em congresso e uma submissão de artigo.
♣ À minha revisora oficial, Marsen Garcia, da UERJ, por toda atenção no momento da
correção, pela manhã inteira que se dispôs a me ajudar com a estatística. Sou muito grata.
Naquele dia fiquei muito feliz por finalizar a etapa estatística e a sopa de letrinhas.
♣ Minhas queridas estagiárias Iacinete (nome difícil no início) e Juliana. Por toda a vontade
de aprender e empenho de vocês que em contrapartida também me incentivaram. Agradeço
por toda ajuda que foi muito importante para conclusão de cada etapa desta Tese.
♣ A Gisele que tanto me auxiliou com as análises de HPLC, também por nossos papos
entre uma injeção e outra no HPLC, no NPPN. E a Cristina “Cris do Massas” por toda
paciência e compreensão. Cada ajuda com as análises no CG/MS, NPPN.
♣ Ao Sr. Valter, indispensável para o bom funcionamento do lab. de Fisiologia Vegetal.
Muito obrigada!!!!!!
♣ As meninas do lab da UERJ.... foi pouco tempo de convívio, mas o suficiente para
aprender muitas coisas. Quantas coisas pude fazer graças a ajuda de vocês. Obrigada pela
paciência e pela orientação quanto aos ensaios biológicos. À Lenize, Lúcia, Andréa, Cris,
Dayane, Paola, Taline...
♣ As meninas e ao Ivaldo do Richard`s Lab pela amizade, companheirismo nos tantos e
tantos “serões” (altas horas no trabalho no lab. aprendendo fitoquímica) que foram muito
divertidas. Bem, preciso mencioná-los para deixar registrado (....) minha xará menor
(Crisinha), valeu pelos altos papos, sobre tudo um pouco (...) podia indicar uma música
para fundo musical dos agradecimentos, talvez do Lenine...Letícia (Lelê), marcante foi
nossa ida ao Congresso de Botânica em Gramado, ali que descobri a Lelê depois de tanto
tempo (...) Hallinny, nome complicado, hein? Mas uma pessoa muito simples, acolhedora,
sempre disposta a ajudar e descomplicar as coisas, além de organizadora oficial de
seminários e eventos (....) Lívia (percussionista) - engraçadíssima, Kássia, sempre animada,
Dani, Ivana (a mamãe do ano), a novata Michelle, Ivaldo (o vendedor de perfume e
companheiro fiel dos serões). Cada um, uma história...E os casamentos, viagens nacionais e
internacionais ou congressos (risos)...o grande Celso (como um pai sempre tentando ajudar
e melhorar o ambiente para trabalharmos), o Joaquim (....) Pois é, a Ida Coralina, fizemos
um bom revezamento 2 x 2 no HLPC, não tinha mais pra ninguém. Também pelas ajudas
com os cálculos de concentração, os projetos incentivados para mais verbas.
♣ Á técnica Priscila Maia Pereira que realizou as análises de “headspace” no Laboratório
de Ensaios e Metodologias Aplicadas do Instituto de Química da UFRJ.
♣ Ao “meu” lab. (Fisiologia Vegetal, IBCCF). Simoneeeeee (vê se escuta aí de Manaus),
Vanessa, Cláudio, Vivi, Renata, Leandro entre os mais novos, Sandra e Ylan (a mais nova
cubana do lab.). Obrigada pela luta de vocês que tanto me estimulou, pelas conversas sobre
ciência ou não, pelos Congressos, viagens, passeios. Todas as trocas e doações, as vezes tão
medidas no meio da ciência, mas que entre nós foi sempre um prazer.
XXVI
♣ Van e Claude, os sobreviventes, vocês moram no meu coração de forma muito especial.
Obrigada, pela convivência alegre que se expandiu para além das paredes do laboratório,
através também de desabafos, partilha de vida, enfim, o lab. foi só um pretexto para nos
conhecermos. Van, a minha mais ilustre companheira de congressos, em 2º a Vivi.
♣ As amigas Josiane (Josi) e Márcia, Márcia e Josi. Valeu pelos incentivos, ensinamentos,
receitas homeopáticas, dicas, conversas....
♣ Aos agregados que só passam aqui para tomar café, brincadeirinha (....) Jana, Adonis,
Aline, Sharon, Calvin e tantos outros por todas as conversas nada a ver ou tudo a ver. Boas
gargalhadas (...) inimagináveis no meio científico (....) risos. Acho que os almoços são os
momentos mais divertidos de um dia de trabalho, pelo menos no lab. de Fisologia Vegetal.
♣ Obrigada Érika (Jardim Botânico) pela ajuda com a identificação das espécies do
presente estudo.
♣ Aos funcionários do IBCCF e NPPN.
♣ A FIOCRUZ pelas análises em RMN.
Esta Tese frutificou em meio a simbiose de áreas e laboratórios diferentes. Concordo com
quem disse, “A vida é a arte do encontro...”. Sinto me muitíssimo feliz por cada um de
vocês que encontrei e que citei aqui ou não por imperfeição da minha memória.
♣ Agradeço as instituições UFRJ (IBCCF, NPPN, IQ, Microbiologia) e UERJ (IBRAG).
♣ À coordenação da Pós-graduação do IBCCF. A Sandrinha por toda ajuda burocrática que
torna possível a existência do curso de pós-graduação.
♣ Ao Programa de pós-graduação em Biotecnologia Vegetal com o qual mantive estreita
relação devido a grande parte de disciplinas ali cursadas. As pessoas nunca sabem ao certo
se estou ligada a Biofísica ou a Biotecnologia. No final, ambos os lados se somaram.
♣ À CAPES pela bolsa de estudos concedida durante a realização deste trabalho.
♣ A toda minha família, em especial a minha tia Jô que perdeu horas me ajudando com o
inglês dos artigos e resumos. Aos meus pais reforço aqui todo o meu agradecimento, por
agüentar toda a minha “bagunça” de livros, artigos, etc espalhados pela mesa. Quero
agradecer também ao Alexandre que a cada vez que perguntava sobre a finalização da Tese,
me empurrava mais um pouquinho em direção a ela.
Quando comecei achei que não ia conseguir terminar, agora, gostaria de me estender mais
um pouquinho nos detalhes do convívio. Mas vamos a Tese.
Ainda, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho, meu
sincero agradecimento.
1
INTRODUÇÃO
1. Plantas medicinais: recursos terapêuticos
Plantas que possuem substâncias bioativas, há tempos têm sido alvos de estudos e
pesquisas, indicando caminhos alternativos para tratamentos terapêuticos ou revelando
substâncias posteriormente exploradas e sintetizadas para produção de formulações
farmacêuticas, cosméticas e agroquímicas (Balandrin et al., 1985; Fabricant & Farnsworth,
2001). Trazer a tona conhecimentos etnofarmacológicos, seguido do estudo científico das plantas
medicinais, aumenta as perspectivas de tratamentos terapêuticos e elaboração de medicamentos
(Gurib-Fakim, 2006).
O estudo de plantas medicinais abrange um vasto campo de pesquisas desde a área de
conhecimento etnobotânico até a concretização dos testes biológicos em prol de alternativas
terapêuticas. Diante da diversidade da flora e da gama de metabólitos secundários, os estudos
multidisciplinares são cada vez mais uma necessidade que resumidamente se inicia com a
obtenção do extrato a partir do material vegetal, seguindo pelos estudos fitoquímicos e ensaios
biológicos. Estes estudos envolvem as áreas da botânica, fitoquímica e farmacologia (Maciel et
al., 2002).
Este trabalho propõe um enfoque multidisciplinar relacionado às espécies Alpinia
zerumbet (Pers.) Burtt & Smith e Alpinia purpurata (Vieill.) K. Schum, utilizadas popularmente
em localidades no Brasil, América do Sul e outras regiões dos trópicos (Lahlou et al., 2002;
Elzaawely et al., 2007a).
2. Considerações a respeito do gênero Alpinia
2
A família Zingiberaceae é constituída por 53 gêneros e mais de 1200 espécies nativas de
regiões tropicais, especialmente do sul e sudeste da Ásia (Kress et al., 2002 e 2005), que se
expandem pela África tropical até a América do Sul e Central (Tomlinson, 1969). O gênero
Alpinia contido nesta família é oriundo da Ásia Oriental (Dahlgren et al., 1985). Hoje em dia é
cultivada em várias partes do mundo devido à beleza de suas inflorescências e a suas
propriedades terapêuticas (Zoghbi et al, 1999; Leal-Cardoso et al., 2004). Ao todo, foram
registradas 250 espécies de Alpinia (Sirirugsa, 1999) até 1999, sendo este gênero o maior da
família (Cronquist, 1981). Supõe-se que os membros da família tenham chegado ao Brasil por
acidente, provavelmente, os seus rizomas vieram misturados com a areia que servia de lastro às
caravelas portuguesas que voltavam das Índias (Winters, 1995).
Muitas espécies da família são utilizadas para alimentação, perfumaria, na produção de
condimentos de propriedades aromáticas, corantes, fibras e papel (Tomlinson, 1969).
O gênero Alpinia é largamente utilizado como ornamental devido à beleza de suas
inflorescências. Além da beleza, este gênero tem extenso uso medicinal em várias regiões
tropicais e subtropicais, sendo bastante investigado cientificamente. Como exemplo, o extrato
bruto da espécie A. nigra causou paralisia, deformação e morte do platelminto trematódeo
Fasciolopsis buski (Roy & Tanon, 1999). O óleo essencial da espécie A. oxyphylla mostrou
propriedades anti-cancer (Lee et al., 1998; Lee & Houghton, 2005). Hahm et al. (2003)
estudaram a ação de substâncias extraídas da semente de A. katsumadai que foram citotóxicas
para linhagens celulares (A549) de câncer de pulmão humano e linhagens leucêmicas (K562).
Diferentes substâncias de espécies de Alpinia têm sido registradas por atuarem de forma benéfica
na prevenção e tratamento do câncer (Surh, 1999).
3
O extrato bruto da espécie A. nigra causou paralisia, deformação e morte do platelminto
Fasciolopsis buski (Roy & Tanon, 1999). Também foi verificada atividade larvicida do óleo em
Aedes aegypti (Cavalcanti et al., 2004). Morita (1992) relata a produção de inseticida natural a
partir dos óleos essenciais da flor de A. zerumbet.
Em estudos sobre a diversidade e uso de espécies da família Zingiberaceae na Tailândia,
Sirirugsa (1999), aponta a espécie A. conchigera no tratamento de bronquite, reumatismo e
artrites; e, A. galanga usada contra cólicas, disenteria e câncer de estômago. Em 2003, Hahm et
al. estudaram a ação de substâncias extraídas da semente de A. katsumadai que foram citotóxicas
para linhagens celulares (A549) de câncer de pulmão humano e linhagens leucêmicas (K562).
Em algumas tribos africanas, a espécie A. smithiae é utilizada tanto para o tratamento terapêutico
humano quanto de gados (Joseph et al., 2001).
O gênero Alpinia, pertencente a família Zingiberaceae, foi classificado primeiramente por
Plumier, mas tem este nome em homenagem ao professor italiano de botânica do século XVI,
Próspero Alpino (Grieve, 2001). Este gênero pertence à divisão Magnoliophyta (Angiosperma),
classe Liliopsida, subclasse Zingiberidae e ordem Zingiberales (Scitamineae) (Watson &
Dallwitz, 1992). O gênero é caracterizado morfologicamente pela presença de rizoma e folhas
simples de bainha larga protegidas por brácteas vistosas, inflorescência terminal; todas as partes
da planta são aromáticas (Sirirugsa, 1999; Grieve, 2001). A propagação vegetativa observada
neste gênero esta relacionada à presença de rizoma de onde emergem novos indivíduos
continuamente (Gernot, 2001).
A espécie A. zerumbet (Figura 1), por exemplo, é muito utilizada na ornamentação de
praças, canteiros, jardins residenciais e públicos. Em páginas eletrônicas, há várias empresas e
parques, principalmente em São Paulo, que comercializam suas mudas. Kuehny et al. (2002)
citaram o aumento na comercialização do rizoma desta espécie a partir de 1998. Na região da
4
Amazônia, em especial na cidade de Belém, vários são os produtos utilizados que contêm esta
espécie, tais como perfumes e saquinhos de cheiro artesanais que possuem ação desinfetante
natural em bens domésticos (Lobato et al., 1989). A. zerumbet é uma planta herbácea e perene
atingindo 2,5 m de altura, rizomatosa e aromática (Albuquerque, 1999).
5
2
3
1
4
Figura 1. Ilustração botânica da espécie Alpinia zerumbet (1-5). 1- planta em floração, 2 – porção
a
distal mostrando a inflorescência, 3 – flor, 4 – labelo, 5 – estames e pistilo. Fonte:
http://www.efloras.org.
5
Sinonímia botânica
•
Zerumbet speciosum J. C. Wendland (1798).
•
Costus zerumbet Persoon (1805);
•
Alpinia fluviatilis Hayata;
•
A. schumanniana Valeton;
•
A. speciosa (J. C. Wendland) K. Schumann (1893);
•
Languas schumanniana (Valeton) Sasaki;
•
L. speciosa (J. C. Wendland) Small;
•
A. zerumbet (Persoon) B. L. Burtt et R. M. Smith (1972)
Amplamente cultivada em várias regiões do Brasil, recebe vários nomes vulgares: colônia,
paco-seroca, cuité-açu, pacová (Almeida, 1993), gengibre-concha (Lorenzi & Souza, 1995),
cardamomo-do-mato,
cardamomo-falso,
cana-do-brejo,
cana-do-mato
e
paco-seroso
(Machado, 1996).
Sinonímia popular
•
Paco-seroca, cuité-açu, pacova, colônia, vindicá, bastão-do-imperador, flor-da-redenção,
helicondia, alpínia, falso-cardamomo, jardineira, gengibre-concha (Brasil).
•
Collar de novia (em espanhol);
•
Colônia (Cuba); Flor Del paraíso, paraíso, ilusion (Venezuela), Boca de dragon
(República Dominicana);
•
Shell ginger, shell flower, ginger lily, pink porcelain lily Philippine wax-plant (em países
de língua inglesa).
6
A espécie A. purpurata (Syn. Guillainia purpurata Vieill.) (Figura 2) é uma planta herbácea e
perene, rizomatosa e aromática. A principal diferença entre A. zerumbet e A. purpurata é a
formação e coloração da inflorescência (Kress et al., 2005).
Figura 2. Fotos da espécie Alpinia purpurata. Fonte: http://toptropicals.com.
2.1. Potencial químico e Uso popular de Alpinia zerumbet e A. purpurata
A Tabela 1 mostra um resumo das atividades terapêuticas das espécies A. zerumbet e A.
purpurata.
7
Tabela 1. Resumo das atividades biológicas de A. zerumbet e A. purpurata: uso popular e comprovação científica.
Espécie
Uso popular
Comprovação científica
Localidades
Referência
Alpinia zerumbet
Reumatismo
n.e.
Ribeirão Preto
Carlini, 1972
(lavradores)
Influenza
(SP, Brasil)
n.e.
Ilha da Martinica
Longuefosse & Nossin, 1996
(América Central)
Doenças caridovasculares
Doenças caridovasculares
Brasil
Lahlou et al., 2002
Hipertensão arterial
Hipertensão arterial
Brasil
Leal-Cardoso et al., 2004
Mendonça et al., 1991
Lesões gástricas
n.e.
Tropicais e Subtropicais
Diurética
Diurética
Tropicais e Subtropicais
Laranja et al., 1991
Antifúngica
Antifúngica
Tropicais e Subtropicais
Janssen & Scheffer, 1985
Antibacteriana
Antibacteriana
n.e.
Antioxidante
Lima et al., 1993
-
Elzaawely et al., 2007b
Liao et al., 2000
Alpinia purpurata
Antinociceptiva
Antinociceptiva
Tropicais e Subtropicais
Araújo Pinho et al., 2005
Antiinflamatória
n.e.
Tropicais e Subtropicais
Zohgbi et al., 1999
Tosse
n.e.
Trujillo
Bermudez & Velasquez, 2002
(Venezuela)
n.e. – não encontrado
8
De acordo com Almeida (1993) as propriedades medicinais do gênero estão relacionadas
às diferentes partes da planta: folhas, flores, rizoma e raízes. O rizoma é a parte mais utilizada da
planta, tanto na cultura alimentícia como na medicinal. Há maior informação sobre os
flavonóides e terpenóides, mas também já foram constatados diaril-heptanóides, quinóides e arilalcalóides. Os diaril-heptanóides estão presentes em várias espécies de Alpinia e estão
relacionados às atividades antiinflamatórias por interferirem na biossíntese de prostaglandinas e
leucotrienos e inibirem a produção de óxido nítrico em macrófagos (Kiuchi et al., 1992; Prasain
et al., 1997). Estudos desde 1973 têm se empenhado na identificação dos componentes do óleo
essencial das diferentes partes destas espécies, sendo verificado monoterpenos como terpineno,
limoneno, 1,8 cineol e sabineno (Zoghbi et al., 1999). Tomlinson (1956) cita que os taninos são
muito freqüentes em todas as espécies de Zingiberaceae, apresentando uma distribuição muito
variável e estão envolvidos com as funções de proteger a planta da desidratação, da putrefação e
de lesões causadas por animais (Fahn, 1985).
As folhas e raízes de A. zerumbet contêm kavaina e desidrokavaina. Estas kavalactonas
agem no sistema nervoso central e dão à planta as mesmas atividades farmacológicas da planta
conhecida popularmente como Kava Kava (Piper methysticum) (Kuster et al., 1999), ansiolítica e
sedativa, usadas na terapêutica para o tratamento da ansiedade e da depressão relacionada à
ansiedade e estresse (Cass, 2004).
Segundo Carlini (1972), A. zerumbet é utilizada por lavradores da região de Ribeirão
Preto (SP) no tratamento de reumatismo e doenças cardíacas. No Nordeste e Sudeste brasileiro, o
seu chá é freqüentemente usado como hipotensor e diurético (Matos, 1998 apud Mendonça et al.
1991; Medeiros et al., 2004). Na Ilha da Martinica (América Central), esta espécie é muito
utilizada na terapêutica da influenza (Longuefosse & Nossin, 1996). Esta espécie está entre as
9
mais citadas no uso medicinal em regiões do Brasil e é sugerida para uso através SUS (Sistema
Único de Saúde) (Bieski, 2005).
Estudos com extrato etanólico de raízes de A. zerumbet inibiram o crescimento de cepas
de Helicobacter pylori isoladas do estômago de pacientes do Hospital de Taiwan (Wang &
Huang, 2005). O óleo essencial de A. zerumbet possui atividade pronunciada contra bactérias
gram (+) e (-) e fungos (Lobato et al., 1989). A atividade antimicrobiana do óleo essencial das
flores de A. zerumbet também foi registrada em patente por Morita, 1992. Almeida (1993)
citando estudos realizados, em 1984, por Fonteles e Oliveira revelaram resultados significativos
quanto ao efeito diurético de A. zerumbet. A presença de flavonóides em extratos A. zerumbet
têm sido relacionada à atividade hipotensora da espécie (Da Costa et al., 1998). Outra substância
identificada em algumas espécies, como a A. zerumbet, foi o resveratrol considerado um dos
componentes da dieta alimentar da população de Okinawa (Japão) responsável pela longevidade
(Murakami et al., 2005).
No campo da Etnofarmacologia, a espécie A. zerumbet é muito estudada devido ao uso
freqüente em rituais afro-brasileiros (Camargo, 1998). Albuquerque & Chiappeta (1994 e 1996)
investigaram rituais realizados em terreiros de macumba e relatam o uso desta espécie pelos
filhos (as)-de-santo para banhos de lavagem e descarrego.
A. purpurata é conhecida internacionalmente no mercado de plantas ornamentais ou como
flor para corte (Morón, 1987; Loges et al., 2005; Sangwanangkul et al., 2008). Para fins
terapêuticos, é utilizada em menor proporção. Em estudos etnobotânicos desenvolvidos em uma
comunidade do estado de Trujillo, Venezuela, constatou-se o uso da decocção da inflorescência
de A. purpurata, via oral, para tosse (Bermúdez & Velásquez, 2002). São poucos os trabalhos
sobre esta espécie, entre eles existem três trabalhos com plantas in vitro (Morón, 1987; Fereol et
al., 1996; González & Mogollón, 2001), e um sobre o conteúdo do óleo essencial (Zoghbi et al.,
10
1999). Entre os componentes do óleo essencial desta espécie se destacam 1,8 cineol e o α-pineno
nas folhas e o ß pineno nas folhas e flores, segundo pesquisas de plantas coletadas no Pará
(Zoghbi et al., 1999). A maioria dos trabalhos científicos com esta espécie trata de abordagens
voltadas para melhorias na produção de plantas com fins ornamentais: inseticidas alternativos,
tolerância à fumigação, controle biológicos de pragas, estoque in vitro de brotos (Anderson &
Gardner, 1999; Chen & Paull, 1998; Hara et al., 1997; Dekkers et al., 1991).
A presença dos metabólitos secundários nas espécies vegetais direciona o uso popular e
caracteriza sua atividade terapêutica.
3. Considerações sobre o metabolismo secundário
Os metabólitos secundários ou especiais são produtos resultantes da adaptação das plantas
ao meio ambiente, conseqüentemente, estes são indispensáveis à sobrevivência vegetal e estão
relacionados à proteção da planta contra infecção por microorganismos, herbivoria e efeitos
físicos (radiação ultravioleta, temperatura, evaporação), por outro lado também contribuem para
reprodução vegetal por atrairem polinizadores. Os metabólitos secundários apresentam
diversidade química estrutural, alta variação intraespecífica e são produzidos em quantidade
restrita conforme as condições ambientais, nutricionais e físicas do habitat (Hartmann, 1996;
Bourgaud et al., 2001; Wahid et al., 2007; Hartmann, 2007). Os principais grupos de metabólitos
secundários são os terpenóides, flavonóides, taninos, alcalóides, cumarinas, esteróides, quinonas
(Hartmann, 1996).
Embora os metabólitos especiais sejam um recurso para sobrevivência vegetal, os povos
em diferentes épocas e lugares descobriram suas propriedades terapêuticas (Newman et al., 2000;
Phillipson, 2001). Muitas plantas produzem substâncias importantes, como resinas, óleos
11
essenciais, taninos, flavonóides, e outros bastante utilizados em indústrias farmacêuticas, têxtil,
alimentícias, cosméticas e agrícolas (Balandrin et al., 1985; Pletsch, 1998). Os metabólitos
secundários têm norteado muitos estudos farmacológicos e têm sido utilizados como modelo
químico para síntese de novos medicamentos.
Uma das principais vertentes do uso de metabólitos secundários, com alta concentração
de estudos científicos, é a investigação de substâncias biologicamente ativas com potencial para
uso terapêutico (Balandrin et al., 1985; Verpoorte et al., 1999; Sudha & Ravishankar, 2002).
Os metabólitos secundários são derivados de intermediários do metabolismo primário,
portanto estas rotas biossintéticas apresentam estreita ligação. As principais vias de produção dos
metabólitos secundários iniciam com o ácido acético, ácido chiquímico e ácido mevalônico que
produzem vários grupos de metabólitos secundários (Herrmann, 1995).
3.1. Flavonóides: substâncias fenólicas com potencial terapêutico
Os flavonóides pertencem a uma das classes de polifenóis amplamente distribuída no
reino vegetal e podem ser divididos em vários tipos: flavonol, flavonal, flavononas, flavonas,
antocianinas e isoflavonas (Iwashina, 2000; Wach et al., 2007; Ferrer et al., 2008). Até 2006, há
o registro de 9000 estruturas de flavonóides (Martens & Mithöfer, 2005). São sintetizados a partir
da via biossintética mista do ácido acético e ácido chiquímico, e possuem uma estrutura básica
constituída de 15 carbonos (C6-C3-C6) e dois anéis aromáticos (Herrmann, 1995; Iwashina, 2000;
Takahama & Oniki, 2000; Winkel-Shirley, 2002; Havsteen, 2002; Julsing et al., 2006). A enzima
fenilalanina amônia-liase é um precursor importante que direciona o fluxo do metabolismo
primário para a produção dos fenilpropanóides (Olsen et al., in press). Por estarem contidos no
12
grupo das substâncias fenólicas, os flavonóides possuem uma ou mais hidroxilas substituintes
ligadas a um anel aromático (Figura 3).
Os flavonóides são um dos principais componentes biologicamente ativos em plantas.
Apresentam alta atividade antioxidante que favorece a prevenção de várias doenças
cardiovasculares, degenerativas, mutagênicas (Havsteen, 2002; kerget et al., 2005; Julsing et al.,
2006); além de atuar em várias atividades farmacológicas (Rijke et al., 2006).
A ação antioxidante dos flavonóides está relacionada a atenuação de espécies reativas de
oxigênio: O2●-, oxigênico molecular singlet (1O2) e o radical hidroxila (OH●) e a inibição da
peroxidação lipídica (Tkahama & Oniki, 2000; Havsteen, 2002).
De várias maneiras os flavonóides interagem com os processos fisiológicos, bioquímicos
e ecológicos do vegetal (Martens & Mithöfer, 2005). Atuam no crescimento vegetal por inibir a
exocitose e transporte da auxina, inibem a transferência de energia durante a fotofosforilação,
participam da fixação do nitrogênio por indução da nodulação nas raízes de leguminosas
(Havsteen, 2002; Peer & Murphy, 2007). Há evidências de sua ação como regulador endógeno
das auxinas (Brown et al., 2001). Como pigmentos estão envolvidos na coloração das flores.
Também são produzidos como defesa vegetal por protegerem as plantas de vários estresses
bióticos e abióticos. Uma das principais formas de defesa está relacionada à proteção contra a
radiação ultravioleta, importante na ocupação dos vegetais no ambiente terrestre (Gottlieb, 1987;
Rijke et al., 2006; Ferrer et al., 2008).
13
Carboidrato
FOTOSSÍNTESE
GLICÓLISE
Ácido fosfoenolpirúvico
Ácido acético
Ácido chiquímico
Chalcona
Diidroflavonol
(Aromadendrina)
Flavonol
(Kaempferol)
Flavanona
UDP-glicose
UDP
Diidroflavonol
(Taxifolina)
UDP-glicose
UDP
Flavonol
(quercetina)
Isoquercitrina
UDP-ramnose
UDP
Kaempferol-3-O-β-D-glicosídeo
kaempferol glicosídeos
Rutina
Figura 3. Esquema simplificado da rota biossintética dos flavonóides.
14
A família Zingiberaceae é rica em flavonóides, com alta representatividade em várias
espécies (Iwashina, 2000). Inclusive os flavonóides são considerados para classificação
quimiossistemática (Williams & Harborne, 1977; Nakatani et al., 1991; Vankar et al., 2006;
Pugialli et al., 1993; Victório et al., 2007). Alguns flavonóides já foram identificados para a
espécie A. zerumbet, como a cardamomina e a alpinetina em rizomas e sementes (Krishna, 1973;
Itokawa, 1981); e a rutina, isoquercitrina, catequina, epicatequina, kaempferol-3-O-glicuronídeo
e kaempferol-3-O-rutinosídeo foram isolados por Mplantinos et al. (1998).
3.2. Óleos essenciais e aroma
Existem vários registros do uso de substâncias aromáticas em ritos religiosos, na medicina
tradicional e como odorantes. O conhecimento sobre os óleos essenciais de plantas data desde
alguns séculos antes da era cristã. As referências históricas de obtenção desses óleos estão
ligadas, originalmente, aos países orientais, destacando-se o Egito, Grécia e a Pérsia que
utilizavam vários bálsamos em cerimônias religiosas. Os egípcios utilizavam óleos essenciais na
alimentação, medicina, perfumaria e em rituais de embalsamento dos corpos. Posteriormente, as
civilizações judaicas e cristãs também se utilizavam destas preparações que são bastante
registradas nas Sagradas Escrituras. A China e a Índia possuem registros bem antigos sobre o uso
de plantas medicinais; até hoje mais de 200 espécies são utilizadas para obtenção de óleos
essenciais, tradição mantida desde do século VI a.C. (Kala et al., 2006; Thompson, 2003).
Os principais constituintes do óleo essencial são os mono (C10), sesqui (C15) e diterpenos
(C20). Estes terpenóides participam de uma grande variedade de substâncias cuja origem
biossintética deriva da combinação de 2 unidades isoprênicas que origina o difosfato de geranila
15
e difosfato de farnesila, pela via do ácido mevalônico, precursores imediatos dos
monoterpenóides e sesquiterpenóides. (Figura 4) (McGarvey & Croteau, 1995; Grayson, 2000).
FOTOSSÍNTESE
Carboidrato
GLICÓLISE
Ácido fosfoenol pirúvico
Ácido acético
Ácido mevalônico
unidades isoprênicas
Isopreno
Difosfato de isopentila
Difosfato de dimetilalila
MONOTERPENOS
PPO
Difosfato de geranila
SESQUITERPENOS
PPO
Difosfato de farnesila
Figura 4. Esquema simplificado da rota biossintética dos terpenóides.
16
Os terpenos influenciam as intereações planta-inseto. Além de proteger os tecidos vegetais
contra o excesso de calor nas regiões onde o clima é seco, reduzem a atividade de transpiração
ou, ainda, controlam a função osmótica por acelerar o movimento da água através da parede
celular e, por conseqüência, o transporte de enzimas e materiais solúveis (Wattiez & Sternon
1942; Albuquerque, 1999). Os terpenos são amplamente distribuídos no Reino Vegetal e também
em alguns fungos. A produção de óleo essencial está relacionada à defesa ou sinalização vegetal,
ou ainda como parte do metabolismo secundário. O aroma, além de atrair os polinizadores, é útil
para proteger a planta contra o ataque de herbívoros (Wattiez & Sternon 1942; Dudareva &
Pichersky, 2008).
O óleo essencial é um importante recurso renovável de produtos naturais
tais como
cosméticos, perfumes, anti-sépticos, solventes, polímeros, agroquímicos e medicamentos (Fahn,
1979; McGarvey & Croteau, 1995).
Espécies do gênero Alpinia são muito utilizadas por suas propriedades aromáticas que
estão relacionadas à composição do óleo essencial (Saiki et al., 1978; De Pooter, 1995; Zoghbi et
al., 1999; Joseph et al., 2001; Ali, et al. 2002; Mallavarapu et al., 2002; Fang et al., 2003;
Elzaawely et al., 2007a).
4. Cultura de tecidos vegetais
A produção de metabólitos secundários in natura apresenta ampla variação conforme as
condições ambientais. Através do emprego da técnica de cultura de tecidos vegetal é possível
obter plantas selecionadas, livres de patógenos e seus produtos químicos sob condições físicas
adequadas e padronizadas (Giacometti, 1990). Esta técnica é bastante utilizada no intuito de
manipular a produção de metabólitos secundários. A obtenção rápida de plantas in vitro em
17
relação ao desenvolvimento in natura é bastante significativo. No âmbito da preservação do meio
ambiente, os sistemas in vitro evitam a exploração indiscriminada e excessiva dos recursos
naturais (Petrovick et al., 1997; Calixto, 2000; Lima et al., 2001; Pletsch, 2002). Adicionalmente,
os sistemas in vitro têm sido utilizados para estudos básicos sobre fisiologia e fitoquímica;
avaliando todo o desenvolvimento vegetal, inclusive a produção de metabólitos especiais
(Verpoorte et al, 1999; Zhao et al., 2001). Através da propagação in vitro, também pode se obter
melhores variedades vegetais e se manipular geneticamente diferentes espécies, sendo de alta
relevância comercial (Zhang & Lemaux, 2004).
A cultura de tecidos vegetais possui diferentes abordagens: organogênese direta,
calogênese e cultura de células em suspensão. A regeneração de plantas por este sistema baseiase no fundamento da totipotência, proposta por Mathias Schleiden e Theodor Schwann em 1838.
A totipotência consiste no potencial que cada célula tem para originar uma planta completa. Mais
tarde, em 1902, o fisiólogo vegetal Haberlandt pela primeira vez manipulou um sistema de
cultura de plantas in vitro (Cid, 2001).
Em geral, o sistema de cultura in vitro é provido de baixa intensidade luminosa obtida por
iluminação artificial, ambiente asséptico, umidade elevada e suplementos orgânicos e inorgânicos
que participam do desenvolvimento vegetal e contribuem para um crescimento com
características heterotróficas (Hazarika, 2006). Os meios de cultura são constituídos de sais
minerais, vitaminas e carboidratos, entre eles, a sacarose é o mais utilizado como fonte de
carbono.
O desenvolvimento das culturas é influenciado pelo tipo de meio nutritivo e suplementos
a ele adicionados, condições físicas de cultivo, genótipo e condições fisiológicas dos explantes
(Khawar et al., 2004).
18
Com base em estudos fisiológicos e genéticos, o processo de organogênese in vitro é
divido em três fases distintas, com requerimento diferenciado de reguladores de crescimento
vegetal exógeno:
1º - Desdiferenciação do tecido vegetal e aquisição de competência organogênica para
proliferação e formação de raízes e parte aérea;
2º - As células desdiferenciadas, então, adquirem determinação para formar um órgão
vegetal específico;
3º - Diferenciação e morfogênese vegetal, que independe da adição de reguladores de
crescimento (Sugiyama, 1999).
O uso de reguladores de crescimento vegetal depende do tipo de cultura que se pretende
obter, e atua como fator que interfere tanto no desenvolvimento vegetal quanto na produção de
metabólitos secundários.
4.1. Reguladores de crescimento vegetal
As interações entre as diferentes classes de hormônios vegetais regulam o crescimento e
desenvolvimento, diferenciação e crescimento celular vegetal (Palme & Schell, 1993; Hobbie et
al., 1994; Sembdner et al., 1994; Larcher, 1995; Gaspar et al., 1996; Kyozuka, 2007).
A adição de reguladores de crescimento vegetal pode ser indispensável para o
estabelecimento das culturas de algumas espécies vegetais, ou requerido para o aprimoramento
do desenvolvimento vegetal in vitro quanto ao número de brotações, enraizamento e alongamento
das plantas (Gaspar et al., 1996). A introdução destes no meio de cultura é primordial para
aprimorar as culturas in vitro, aumentando a produção clonal e modificando a morfogênese,
diferenciação vegetal, bem como a variação de metabólitos químicos. Este conhecimento sobre a
19
fisiologia vegetal é utilizado na manipulação de concentrações e combinações hormonais
apropriadas para a obtenção de meios nutritivos, estabelecimento da cultura de tecidos e
produção in vitro de metabólitos secundários.
A ação dos reguladores do crescimento vegetal depende da sensibilidade da célula ao
hormônio e do número de receptores com afinidade para o hormônio (Barendse & Peeters, 1995).
Atualmente, a maioria dos receptores dos hormônios vegetais já foi identificada (McSteen &
Zhao, 2008). A percepção do hormônio ocorre a partir da interação com o receptor. Inclusive, há
indicações de que alguns hormônios reconhecem sítios na membrana plasmática de células
vegetais, desencadeando processos de transcrição genética (Sudha & Ravishankar, 2002;
McSteen & Zhao, 2008).
As auxinas e citocininas são os reguladores de crescimento vegetal mais utilizados em
sistema de cultivo in vitro. As auxinas estão envolvidas no alongamento celular, iniciação de
raízes e brotos, diferenciação dos tecidos vasculares e mecanismos como o fototropismo e
gravitropismo (Hobbie et al., 1994; Claussen et al., 1996; Kimura & Kagawa, 2006; Boutté et al.,
2007; Kelly & Riechers, 2007). As citocininas são essenciais na divisão celular vegetal, indução e
proliferação de brotações, e participam de vários processos como fotomorfogênese, fotossíntese,
formação e manutenção dos cloroplastos, floração e senescência (Hobbie et al., 1994; Kaminek et
al., 1997, Zahir et al., 2001; Howell et al., 2003; Carimi et al., 2004; Barciszewski et al., 2007;
Kyozuka, 2007).
A síntese das auxinas acontece por várias vias, a partir da conversão do aminoácido
aromático triptofano que é oriundo da via do ácido chiquímico (Bartel, 1997). Alguns herbicidas
sintéticos, em baixas concentrações, possuem ação hormonal similar as auxinas devido a
proximidade estrutural, sendo bastante utilizados por seus resultados positivos em culturas de
tecidos vegetais: 2,4D, dicamba e picloram (Kelly & Riechers, 2007). As principais auxinas de
20
ocorrência natural em plantas são o ácido indolacético (AIA), o ácido indolbutírico (AIB) e o
ácido abscísico (ABA). As auxinas AIA e AIB são as mais utilizadas em cultura de tecidos
(Ludwig-Muller, 2007).
As citocininas naturais derivam de unidades de isopreno, sintetizadas pela via do ácido
mevalônico ou são derivadas da adenina, como a zeatina (Zea), cinetina (CIN) e
benzilaminopurina (BAP) (Mok & Mok, 2001; Barciszewski et al., 2007). As citocininas
sintéticas são da classe das feniluréias, como o tidiazuron (TDZ), e são caracterizadas pela
elevada estabilidade que se traduz numa eficiente resposta em cultura de tecidos (Mok & Mok,
2001).
4.2. Estratégias aplicadas ao cultivo in vitro para aumento da produção de metabólitos
secundários em plantas
Os sistemas de cultivo in vitro são um recurso importante na produção de metabólitos
secundários. A produção de metabólitos in vitro apresenta como vantagens padronização das
condições físicas de cultivo (luz e temperatura) que permite uma independência dos fatores
ambientais; manipulação das culturas no intuito de otimizar a produção de metabólitos;
propagação de genótipos selecionados de forma homogênea e com maior qualidade e controle da
produção; suprimento de produtos secundários continuamente (Collin, 2001; Rao & Ravishankar,
2002; Luczkiewicz & Glód, 2003). A manutenção de condições padronizadas de cultivo elimina
vários fatores que contribuem para alteração na produção de metabólitos secundários:
sazonalidade, temperatura, disponibilidade hídrica, radiação solar, composição nutricional,
poluição atmosférica, etc. (Gobbo-Neto & Lopes, 2007). A produção destes metabólitos pode ser
conferida no processo de organogênese direta, cultura de raízes, calogênese e células em
21
suspensão (Sato, 2000; Bourgaud et al., 2001; Rao & Ravishankar, 2002; Tavares, 2003;
Victório, 2004).
Na produção de metabólitos in vitro, diferentes estratégias são utilizadas como o uso de
estimuladores que participam da via metabólica da substância de interesse, o uso de hormônios
vegetais e co-cultivo de diferentes espécies (Palazón et al., 1995; Pereira et al., 2000; Bais et al.,
2001; Zhao et al., 2001; Verpoorte & Memelink, 2002; Yang, 2003; Vasconsuelo & Boland,
2007; Krolicka et al., 2008). Assim como a produção dos metabólitos secundários varia conforme
as condições ambientais, através da manipulação in vitro, a produção de metabólitos pode ser
estimulada ou inibida com a alteração da composição do meio de cultura: nitrogênio, sais
minerais, fonte de carbono, reguladores de crescimento vegetal ou outros estimuladores. As
substâncias nitrogenadas e os carboidratos são essenciais na composição do meio de cultura, visto
que eles fornecem as substâncias fundamentais para as vias secundárias. Na condição in vitro a
fotossíntese é reduzida e a produção de metabólitos secundários é dependente das substâncias das
rotas primárias adicionadas ao meio (Rao & Ravishankar, 2002).
O uso de hormônios vegetais como estimuladores na produção de metabólitos especiais
tem sido relatado em vários trabalhos (Palazón et al., 1995; Pereira et al., 2000; Bais et al., 2001;
Zhao et al., 2001; Affonso et al., 2007). Tanto fatores bióticos quanto abióticos podem agir como
estimuladores, que ao serem reconhecidos por receptores ativam as vias secundárias com
aumento ou diminuição da produção de metabólitos (Sudha & Ravishankar, 2002; Endt et al.,
2002). Os estimuladores são substâncias que induzem a síntese aumentada de fitoalexinas ou
outros metabólitos secundários em plantas (Bhagwath & Hjortsø, 2000). O processo de eliciação
depende de vários fatores como a concentração do estimulador, o estágio de crescimento da
cultura e o período de exposição da cultura ao estimulador. Um complexo de interações entre o
22
estimulador e a célula vegetal irá determinar a eficiência das respostas quanto a produção de
metabólitos secundários (Vasconsuelo & Boland, 2007).
A produção de metabólitos secundários, incluindo farmacêuticos e aditivos alimentares,
em sistemas de cultivo in vitro pode ser obtida por várias técnicas de cultura de tecidos
(Bourgaud et al., 2001; Rao & Ravishankar, 2002; Shohael et al., 2007). Alguns metabólitos de
alto valor e interesse medicinal têm sido produzidos através da cultura de tecidos vegetais, como:
vinblastina
(Catharanthus
roseus),
ácido
rosmarínico
(Salvia
officinalis),
chiconina
(Lithospermum erythorhizon) (Datta & Srivastava, 1997; Rao & Ravishankar, 2002; Karam,
2003).
A cultura de células é o meio mais empregado, e apresenta a vantagem de viabilizar a
produção em larga escala através de biorreatores, com menor acúmulo de pigmentos e lignina
(Balandrin et al., 1985; Cid, 1998). No entanto, vários trabalhos apontam os órgãos vegetais ou
planta inteira como produtores mais estáveis (Bourgaud et al., 2001; Rao & Ravishankar, 2002).
Muitas vezes, a produção de metabólitos especiais está restrita a determinadas fases do
desenvolvimento vegetal nas quais se presencia células diferenciadas; no entanto, alguns
trabalhos verificaram a produção de metabólitos em cultura de células que se encontram em
estágios mais organizados e diferenciados (Constabel et al., 1971; Ozeki & Komamine, 1981;
Datta & Srivastava, 1997).
Luczkiewicz & Glód (2003) conseguiram otimizar a produção de isoflavonas em culturas
de calos de Genista tinctoria (Fabaceae) sob ação de 2,4D e cinetina. Os resultados foram
promissores para produção em larga escala de isoflavonas, utilizando suspensão celular, e
também para o estudo das vias biossintéticas. Cultura de células de Hypericum perforatum
(Hypericaceae) em suspensão, tratadas com ácido jasmônico, aumentaram a produção de
hipericina (Walker et al., 2002). Experimentos com Morinda citrifolia (Rubiaceae) foram um dos
23
primeiros a relatar o uso de células não diferenciadas na produção de metabólitos especiais. Zhao
et al. (2001) verificaram que calos mais compactos sintetizavam mais alcalóides do que uma
suspensão celular, devido ao maior grau de diferenciação. Ainda, Zhao et al. (2001), em culturas
de calos de Catharanthus roseus (Apocynaceae) verificaram a produção de metabólitos especiais,
não obtidos em suspensão celular. Palazón et al. (1995) verificaram a influência da auxina na
produção de digitoxina em culturas de calos de Digitalis (Plantaginaceae).
A implementação de meios de cultura, uso de estimuladores, manipulação das condições
de cultivo in vitro e seleção de explantes têm sido investigados no intuito de se otimizar a
produção de vários metabólitos secundários em cultura de tecidos vegetais (Collin, 2001; Rao &
Ravishankar, 2002; Veerporte & Memelink, 2002). Componentes do óleo essencial de plantas de
Lavandula dentata (Lamiaceae), cultivadas in vitro, variaram conforme a concentração de
hormônios vegetais acrescida ao meio (Sudriá et al., 1999). Furuya et al., 1986, obtiveram
aumento na produção de saponinas em raízes in vitro de Panax ginseng por suplementação
exógena de giberelina.
A resposta das células ao cultivo in vitro permite selecionar linhagens mais produtivas
para o fim que se pretende alcançar. Vários estudos têm mostrado a variação dos componentes do
óleo essencial por estímulo de reguladores de crescimento vegetal (Tabela 2). Da mesma forma, a
produção de polifenóis in vitro tem sido relatado por vários estudos (Santos-Gomes et al., 2002).
Entre os polifenóis, a produção de flavonóides in vitro tem sido alvo de pesquisas que visam
aumentar a produção (Tabela 3) (Rao & Ravishankar, 2002).
24
Tabela 2. Principais referências quanto a variação dos constituintes do óleo essencial produzido por diferentes espécies in vitro sob
ação de diferentes reguladores de crescimento vegetal.
Regulador de
Substância do óleo essencial
Espécie
Sistema de cultivo in vitro
Referência
1,8 cineol, fenchol, borneol e
Lavandula dentata
planta
Sudriá et al., 1999
Lavandula dentata
planta
Sudriá et al., 1999
crescimento
BAP
cânfora
AIB
1,8 cineol, fenchol, borneol e
cânfora
BAP e 2,4D
1, 8 cineol e β-pineno
Eucalyptus camaldulensis
calos
Giamakis et al., 2001
-
sabineno, terpineol-4 e β-
Bupleurum fruticosum
plantas
Bertoli et al., 2004.
felandreno
TDZ
-
Salvia futiculosa
plantas
Arikat et al., 2004
AIA e BAP
neral e geraniol
Melissa officinallis
parte aérea
Silva et al., 2005
BAP, AIA e ANA
timol e cis-cariofileno
Coleus amboinicus
plantas e raízes in vitro
Roja et al., 2005
AIA
α-pineno e β-pineno
Lantana camara
plantas
Affonso et al., 2007
BAP
mirceno, α-felandreno,
Lantana camara
plantas
Affonso et al., 2007
Lantana camara
plantas
Affonso et al., 2007
α-pineno e β-pineno
TDZ
trans-cariofileno
25
Tabela 3. Principais referências quanto a produção de flavonóides in vitro sob ação de diferentes reguladores de crescimento vegetal.
Estimuladores
Flavonóides
Espécies
Sistemas de cultivo
Referências
in vitro
Regulador de crescimento
ANA
quercetina
Parthenocissus
planta
Bleichert & Ibrahim, 1974
ANA, AIA, 2,4D
flavonóides
Chrysosplenium
calos, folhas e raizes
Brisson et al., 1988
glicosídeos
americanum
BAP, Zea
antocianina
Oxalis linearis
calos
Collin, 2001
2,4D
quercetina
Vitis sp
células em suspensão
Kokubo et al., 2001
CIN, BAP
hesperetina,
Salvia officinalis
brotos
Santos-Gomes et al., 2002
isoflavonóides
Pueraria lobata
planta, raiz, calo
Thiem, 2003
L-fenilalanina,
quercetina,
Drosera capensis
planta
Krolicka et al., 2008
ácido jasmônico
mircetina
Passiflora quadrangularis
calos
Antognoni et al., 2007.
apigenina,
hispiduina,
cirsimartina,
genkwanina
GA3, BAP
Componentes da via
metabólica
Fatores físicos
Ultravioleta-B
orientina,
isovitexina,
isoorientina
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Trabalhos realizados com plantas cultivadas ex vitro, também mostram a influência dos
reguladores de crescimento vegetal na variação dos metabólitos especiais. A aplicação de
giberelina, utilizando aspersão, sobre a superfície foliar de Citrus paradisi (Rutaceae) em cultivo
no campo teve como resultado baixa produção de flavonóides (Berhow, 2000).
Estudos mais elaborados, relacionados à engenharia de metabólitos especiais, têm
utilizado a cultura de células e experimentado o uso de técnicas genéticas para modificar a
expressão de genes relacionados à produção destes metabólitos (Bourgaud et al., 2001; Verpoorte
& Memelink, 2002; Tanaka & Ohmiya, 2008).
Entre as vantagens da técnica de cultura de tecidos, há o aumento das perspectivas na
produção de metabólitos secundários que são inviáveis de serem produzidos em laboratório
devido ao alto custo dos solventes, a complexidade sintética e a longa duração da síntese (Collin,
2001). Também, métodos de cultivo in vitro favorecem o uso de estimuladores e podem trazer a
vantagem de produzir metabólitos em sistemas in vitro em vez de disponibilizar extensas
plantações.
5. Hipertensão e Alternativas Fitoterápicas
A principal indicação de uso da espécie A. zerumbet no Brasil é contra hipertensão
arterial. A hipertensão é caracterizada por uma alta na pressão arterial, ocasionada por fatores
relacionados à resistência vascular periférica e ao débito cardíaco. Todos os fatores que alteram
estas variáveis influenciam a P.A. (Lolio, 1990).
O Ministério da Saúde, em 2000, estimava que cerca de 43 milhões de adultos no Brasil
sofriam de pressão arterial alta (> 140 mmHg e/ou 95 mmHg) (Guimarães, 2002; Guimarães &
Ribas, 2006). Comum em todo o mundo, a hipertensão atinge diferentes faixas etárias e
27
independe do sexo, raça ou padrão social. A hipertensão arterial é o maior fator de risco para as
doenças cardiovasculares e a principal causa da queda da qualidade e expectativa de vida. Vale
ressaltar a ligação desta doença com outros problemas de saúde pública e também com a alta
incidência populacional de enfarte do miocárdio, derrame cerebral e insuficiência renal. Sendo as
doenças cardiovasculares a principal causa de mortalidade no Brasil, representando 65% do total
de mortes na faixa etária de 30 a 69 anos (Passos et al., 2006; Godoy et al., 2007).
No Brasil, são inúmeras as citações de plantas que tem ação anti-hipertensiva (Tabela 4),
entre elas, a espécie Alpinia zerumbet é bastante conhecida e utilizada popularmente. A atividade
hipotensora desta espécie é atribuída às substâncias presentes no extrato aquoso e hidroalcóolico
e no seu óleo essencial (Matos, 1994; Moura et al., 1998). Estudos utilizando o chá das folhas da
colônia, realizados por Laranja et al. (1992), confirmam o efeito hipotensor de A. zerumbet.
Mendonça et al. (1991) também observaram diminuição na pressão sanguínea de ratos e
cachorros dependendo da dose aplicada de extrato hidroalcóolico de A. speciosa. Mpalantinos et
al. (1998) sugerem que as substâncias promotoras desta ação terapêutica sejam os flavonóides e
as kava-lactonas obtidas a partir do extrato aquoso de A. zerumbet.
28
Tabela 4. Plantas referidas como anti-hipertensivas pelo uso popular e conhecimento científico.
Nome popular
Nome científico
Referências
açaí
Euterpe oleraceae
Rocha et al., 2007
alcachofra
Cynara scolymus
Oliveira & Araújo, 2007
alecrim
Rosmarinus officinalis
Tahraoui et al., 2007; Oliveira &
Araújo, 2007
alfavaca-cravo
Ocimum gradissimum
Oliveira & Araújo, 2007
alho
Allium sativum,
Chen et al., 2000; Tahraoui et al.,
Allium cepa
2007; Oliveira & Araújo, 2007
berinjela
Solanum melongena L
Oliveira & Araújo, 2007
capim-santo
Cymbopogon citratus
Gazola et al., 2004; Oliveira &
Araújo, 2007
chuchu
Sechium edule
Oliveira & Araújo, 2007
colônia
Alpinia zerumbet
Moura et al., 2005; Oliveira &
Araújo, 2007
erva-cidreira
Lippia alba
Gazola et al., 2004; Oliveira &
Melissa officinalis
Araújo, 2007
laranja
Citrus sinesis
limoeiro
Citrus limon
milho
Zea mays
pitanga
Stenocalyx pitanga
uva
Vitis vinifera
Soares de Moura et al., 2004.
-
Orthosiphon aristatus
Matsubara et al., 1999
-
Eugenia uniflora
Consolini et al., 1999
-
Cecropia glaziovii
Lima-Landman et al., 2007.
Oliveira & Araújo, 2007
A presença de alguns flavonóides é sugerida por atuar no sistema vascular por ação
antiarrítmica e vasodilatadora (Duarte et al., 1993; Almeida et al., 2002; Wang et al., 2004).
29
Alguns medicamentos comercializados que exercem ação sobre o sistema vascular contêm fração
de flavonóides purificadas, como exemplo, o Daflon 500 mg. Os flavonóides podem atuar como
vasodilatadores através de diferentes mecanismos. Podem inibir a atividade enzimática da ECA
(enzima conversora de angiotensina), através do sistema renina-angiotensina. A ECA ao
converter a angiotensina I em angiotensina II confere uma resposta constritora direta da
angiotensina II ou indireta por estímulo da aldosterona (Hansen et al., 1996). Outro mecanismo é
a diminuição do influxo de Ca++, por bloqueio dos canais de Ca++ que reduz a contratilidade da
musculatura lisa, a resistência vascular periférica e, por conseguinte a pressão arterial (Duarte et
al., 1993; Vuorela et al., 1997). A atuação dos flavonóides também pode ser observada através da
inibição da síntese de prostanóides vasoconstritores do endotélio vascular ou por aumento da
porcentagem de relaxamento mediada pela bradicinina (Formica & Regelson, 1995; Xu et al.,
2006).
Componentes do óleo essencial de A. zerumbet mostraram efeito hipotensor, em estudos feitos
com ratos, sendo atribuído ao terpinen-4-ol a ação hipotensora (Lahlou et al., 2003). Outros
estudos realizados pelo mesmo grupo (Lahlou et al., 2002) verificaram que a ação hipotensora do
óleo essencial ocorre independentemente da atuação do sistema nervoso simpático, sugerindo
uma ação relacionada diretamente ao relaxamento dos vasos sanguíneos.
5.1. Endotélio e Fator de relaxamento derivado do endotélio (FRDE)
Os experimentos de vasodilatação envolvendo a resposto do endotélio de ratos estão entre
os mais utilizados para sugerir uma atividade hipotensora de extratos vegetais.
30
Na década de 80, Furchgott & Zawadzki (1980) demonstraram que o revestimento
endotelial da parede vascular não se limitava a funcionar como uma barreira passiva entre o meio
circulante e os componentes da parede vascular, mas participava da regulação do tônus do
músculo liso vascular e ainda é sítio de atuação de vários fármacos que modulam a função
vascular. Utilizando aorta isolada de coelho, eles observaram que a acetilcolina promovia
relaxamento apenas em preparações nas quais se mantinha o endotélio íntegro. A retirada
mecânica do endotélio eliminava a resposta relaxante, revertendo-a em resposta constritora ainda
que com concentrações crescentes de acetilcolina. Estes resultados trouxeram novas perspectivas
para o estudo dos fatores liberados pelo endotélio envolvidos no controle da pressão sangüínea.
Em 1984, Furchgott demonstrou que o endotélio participava na resposta vasodilatadora induzida
pela acetilcolina em outros vasos de animais, inclusive do homem.
O entendimento de que o endotélio é uma estrutura ativa que participa da modulação das
atividades do músculo liso, incitou a investigação dos componentes derivados do endotélio.
Dentre as substâncias vasoativas liberadas pelo endotélio pode se citar os FRDE e os fatores
constritores derivados de endotélio (FCDE). Os FRDEs são responsáveis pela vasodilatação
induzida pela acetilcolina, que é acompanhada pelo aumento da guanosina monofosfato cíclica
(GMPc) no músculo liso vascular (Rapoport & Murad, 1983; Furchgott & Jothianandan, 1983), e
essa ação celular do FRDE é semelhante à do óxido nítrico (NO), mediador final da resposta
relaxante dos nitrocompostos (Palmer et al., 1988).
Palmer et al., 1988, demonstraram, utilizando cultura de células endoteliais sem Larginina, que após o experimento decrescia a liberação de FRDE induzido pela bradicinina, efeito
revertido pela presença de L-arginina. Nas células endoteliais, o NO é sintetizado a partir de
reações de óxido-redução. Em resposta ao aumento dos níveis de cálcio intracelular, o NO é
31
sintetizado a partir da L-arginina, sob ação de um grupo de enzimas NO sintases (NOS). Esta
2+
enzima é dependente de NADPH e Ca (Mulsh & Busse, 1991).
A liberação de NO é modulada por estímulos físicos e humorais. Entre os estímulos
físicos, o estresse mecânico exercido pelo sangue na parede arterial é um dos principais fatores
que regula a liberação local de NO. Vários mediadores neurohumorais provocam liberação de
NO através da ativação de receptores endoteliais específicos. O aumento no conteúdo de GMPc
no músculo liso vascular, induzido tanto pelo FRDE como pelos nitrovasodilatadores, medeia o
relaxamento por induzir uma desfosforilação dependente de GMPc da cadeia leve de miosina
+2
(Rapoport & Murad, 1983). A elevação de GMPc reduz o influxo de Ca para o sarcolema, reduz
+2
a liberação de Ca
de seus estoques e aumenta o seqüestro deste íon nos sítios de estoque
intracelulares.
A importância da integridade do endotélio na manutenção da função cardiovascular pode
ser avaliada com a utilização de substâncias análogas da L-arginina que por inibirem a atividade
da enzima NOS nas células endoteliais, reduzem a síntese e liberação de NO pelo endotélio, o
que produz provavelmente disfunção circulatória, que culmina com a elevação da pressão arterial
(Rees et al., 1989). O NO produzido pelas células endoteliais vasculares tem um papel central na
regulação da pressão arterial, relaxando a musculatura, com isso a pressão normal de um
indivíduo é mantida pela liberação de NO (Huang et al., 1999).
O efeito vasodilatador de extratos hidroalcóolicos da espécie A. zerumbet já foi estudado e
sua modulação decorre da ação de substâncias vasoativas liberadas pelas células endoteliais,
como bradicinina (B2) e NO-via GMPc (Moura et al., 1998; Emiliano, 2002; Moura et al., 2005).
32
JUSTIFICATIVA
Nos últimos anos surgiu um interesse pela investigação, produção e consumo de plantas
aromáticas e medicinais, abrindo um amplo e crescente campo de aplicação nas indústrias
farmacêuticas, alimentícias e de perfumaria-cosmética.
A cultura in vitro de tecidos vegetais é uma técnica básica na biotecnologia vegetal
permitindo desde a cultura de tecidos retirados de diferentes partes da planta para
desenvolvimento de plantas inteiras ou mesmo para produção de células diferenciadas em cultura,
considerando a rápida multiplicação do produto, devidamente padronizado e livre de patógenos
(Omokolo et al., 2003).
No gênero Alpinia as plantas se propagam de forma vegetativa, a partir do mesmo rizoma
de origem, apresentando pouquíssima variação genética o que inspirou experimentos realizados
por Fereol et al. (1996), nos quais, através de diferentes doses de radiação gama em culturas in
vitro de A. purpurata foi possível aumentar a variação genética da espécie. Mas a forma de
propagação deste gênero também ocasiona problemas de infestação por patógenos, tais como,
nematóides, bactérias, fungos e vírus, resultando em perda da quantidade e qualidade do material
vegetal e a contaminação de áreas de plantio. Desta forma, a cultura de tecidos permite o uso de
técnicas para se obter diferentes clones para posterior inserção no ambiente e a obtenção de
plantas livres de patógenos.
De forma a viabilizar, em bases científicas, a prática da medicina alternativa se requer
garantias de melhor e constante produtividade dos princípios ativos, e isto pode ser feito pela
cultura de tecidos vegetais, sob condições controladas (Verpoorte et al., 1999; Grzelak &
Janiszowska, 2002). Ainda, a padronização dos fatores ambientais no cultivo em uma sala de
cultura, garante constância na obtenção dos metabólitos a cada subcultivo que diferentemente do
33
meio ambiente, sofre inúmeras modificações conforme as características do solo, temperatura,
clima e estação do ano. Além disso, o uso de estimuladores, como os hormônios vegetais, na
cultura in vitro têm-se mostrado um recurso promissor no aumento de alguns metabólitos
especiais (Palazón et al., 1995; Eilert et al., 1995).
A espécie A. zerumbet possui alto potencial químico com aplicação fitoterápica e foi
estudada no Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais – NPPN (Mpalantinos, 2001), sendo
identificados alguns metabólitos secundários com provável atividade hipotensora. Já a espécie A.
purpurata é utilizada mais com finalidades ornamentais, mas também possui características
medicinais. Bermúdez & Velázquez (2002) observaram 4 citações para o uso das flores de A.
purpurata, preparadas por decocção, para tosse. Em vista disto, este trabalho visa a avaliação de
metabólitos secundários em plantas de A. purpurata e sua produção em plantas in vitro de A.
zerumbet e A. purpurata. Os flavonóides interagem de várias maneiras com os processos
fisiológicos da planta. Uma das hipóteses deste trabalho é a avaliação da produção de flavonóides
sob a influência de reguladores de crescimento vegetal. Tanto os flavonóides quanto o óleo
essencial são metabólitos secundários importantes na fitoquímica de espécies do gênero Alpinia e
por isso foram selecionados neste estudo.
Os ensaios biológicos para verificar a ação vasodilatadora de A. zerumbet já foram
realizados por Emiliano, 2002. Este estudo teve o intuito de verificar o efeito de extratos de A.
purpurata e plantas in vitro de A. zerumbet tratadas com reguladores de crescimento vegetal, no
leito vascular mesentérico de rato.
34
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Avaliar a produção de metabólitos especiais em plantas de campo em cultura in vitro de tecidos
de Alpinia zerumbet e Alpinia purpurata.
Objetivos Específicos
- Estabelecer as culturas in vitro de A. zerumbet e A. purpurata;
- Interferir, utilizando reguladores de crescimento vegetal, na produção de metabólitos especiais
em plantas in vitro.
- Avaliar a quantidade e qualidade de flavonóides produzidos nas plantas in vitro oriundas dos
diferentes meios de cultura sob ação de reguladores de crescimento vegetal;
- Analisar a composição do óleo essencial de plantas in vitro e de campo;
- Verificar a atividade vasodilatadora do extrato bruto de A. purpurata e plantas in vitro de
Alpinia zerumbet tratadas com reguladores de crescimento vegetal.
35
Capítulo 1
Sistemas de cultura de tecidos para as espécies Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e A.
purpurata (Vieill) K. Schum
1.1 Estabelecimento in vitro de culturas assépticas de plantas de Alpinia zerumbet (Pers)
Burtt et Smith
Resumo
A técnica de cultura de tecidos vegetais permite o estudo e obtenção de plantas sob
condições padronizadas. Brotos do rizoma de A. zerumbet foram desinfestados com solução de
água e detergente (15 min); álcool 70% (1 min); hipoclorito de sódio 30% (10 min) e
introduzidos em meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) líquido e sólido. Os reguladores de
crescimento vegetal utilizados foram AIA, TDZ e BAP para avaliar a organogênese direta. O
meio líquido foi o mais propício para as culturas por produzir respostas superiores em relação ao
MS sólido. A emissão de novos brotos é contínua, com diferentes estágios de desenvolvimento in
vitro ao longo de 3 meses. Os meios contendo TDZ reduziram o alongamento da lâmina foliar a
2,2 cm. A adição de 2 mg mL-1 de BAP diminuiu o número de brotos (2,7) em relação ao
controle (3,5). O protocolo desenvolvido foi eficiente para produção de plantas livres de
patógenos em período de 2 a 3 meses. O 2,4D induziu calos friáveis e compactos a partir do
pseudocaule, enquanto o uso de TDZ ou cinetina produziu só calo friável.
Palavras-chave: auxina, citocinina, micropropagação, planta medicinal, planta ornamental
36
Introdução
A espécie Alpinia zerumbet (Zingiberaceae) é conhecida pelos nomes vulgares de colônia,
pacová, gengibre-concha, cardomomo-falso, cana-do-brejo (Albuquerque & Neves, 2004). É
bastante apreciada como planta ornamental e apresenta várias propriedades medicinais:
antioxidante, hipotensora, antimicrobiana, antiinflamatória, diurética (Lobato et al, 1989; Laranja
et al., 1992; Moura et al., 2005). O uso medicinal desta espécie é amplo em várias regiões
tropicais, como no Brasil.
A produção de genótipos selecionados, em larga-escala, através da cultura de tecidos
vegetais é uma das principais características da técnica de propagação in vitro. Os sistemas de
cultivo in vitro também têm sido bastante empregados com o objetivo de se obter metabólitos
secundários com aplicação terapêutica, erradicar pragas e doenças das culturas, propagar plantas
com valor ornamental, conservar espécies ameaçadas e propagar espécies recalcitrantes (Pletsch,
2000; Canter et al., 2005; Rout et al., 2006). Diferentes protocolos já foram implementados para
espécies da família Zingiberaceae (Illg & Faria, 1995; Sharma & Singh, 1997; Borthakur et al.,
1999; Shirin et al., 2000; Miachir et al., 2004). Este trabalho é o primeiro estudo sobre cultura de
tecidos vegetais para a espécie A. zerumbet e teve como objetivo estabelecer um protocolo de
propagação in vitro, calogênese e cultura de células em suspensão de A. zerumbet.
Material e Métodos
Material Vegetal
O exemplar de Alpinia zerumbet foi obtido na área externa do NPPN – UFRJ, sendo
identificado no Herbário do Jardim Botânico (RB) do Rio de Janeiro, e depositado sob o número
RB 433485.
37
Desinfestação das gemas do rizoma de A. zerumbet
Os rizomas de A. zerumbet fonte dos explantes, depois de coletados, foram lavados em
água corrente, com detergente comercial neutro e o auxílio de uma escova de nylon para remoção
de partículas de solo. Depois, foi colocado em hipoclorito de sódio (água sanitária comercial) a
20% por 40 min. Os brotos do rizoma foram destacados com o auxílio de um canivete e as folhas
mais externas foram removidas. Foram utilizados 3 protocolos de desinfestação (Figura 1),
devido à dificuldade em eliminar os microorganismos endógenos, principalmente os fungos. O 2º
protocolo foi o utilizado nas desinfestações posteriores. Com o auxílio de pinça e bisturi, o ápice
foi isolado e inoculado em meio de cultura. O processo de desinfestação foi feito em fluxo
laminar.
Desinfestação
1º Protocolo: 1 h em banho-maria a 40ºC - solução de 2
mg/mL de azul de metileno; lavagem com água
destilada estéril, no fluxo laminar.
2º Protocolo: 15 min - água e detergente; 1min - álcool
70%; 10 min – hipoclorito de sódio 30%.
3º Protocolo: 15min – água, hipoclorito de sódio 30% e
detergente; 20 min – solução Benlate® 1 g/L; lavagem
com álcool 70% e água, no fluxo laminar.
Figura 1.1. Protocolos de desinfestação dos explantes obtidos de A. zerumbet .
Estabelecimento da cultura in vitro de A. zerumbet
Foi utilizado o meio líquido MS (Murashige & Skoog, 1962), acrescido de 30 g.L-1 de
sacarose, vitaminas (tiamina-HCl 1,3 µM, piridoxina 3 µM e ácido nicotínico 4,1 µM), mio-
38
inositol 0,6 mM, sendo o pH ajustado para 5,8. O meio MS sólido foi acrescido de 7,8 g.L-1 de
agar. Foram utilizados diferentes reguladores de crescimento vegetal isolados e em combinações
adicionados ao meio MS líquido: BAP (6-benzilaminopurina), TDZ (tidiazuron), AIA (ácido
indolacético). Os tratamentos foram: MS (controle); AIA 2 (2 mg.L-1); TDZ 2, TDZ 4 e TDZ 8
(2, 4 e 8 mg.L-1, respectivamente); BAP 2 (2 mg.L-1); AIA 2 + TDZ 2 (2 mg.L-1) e AIA 2 + BAP
2 (2 mg.L-1). Foram introduzidos por vidro (16 x 8 cm) 3 explantes, no mínimo 30 explantes por
tratamento. Os meios foram esterilizados, em autoclave a 120oC, 1 kgf.cm-2, durante 15 min.
Após introdução in vitro, as culturas ficaram por 3 semanas na condição de escuro para evitar a
fotoxidação. Depois foram mantidas em sala de crescimento a 25 ± 2ºC, sob intensidade luminosa
de 23 µmol.m-2.s-1, fornecidas por lâmpadas fluorescentes tubulares, subcategoria Duramax
Universal (General Electric®) (20 W T–12) e fotoperíodo de 16/8h (dia/noite). A distância entre
as prateleiras e as lâmpadas foram padronizadas em 30 cm (Figura 2C).
Avaliação das culturas in vitro
O desenvolvimento da planta in vitro foi avaliado mensalmente por 3 meses,
considerando: número e alongamento dos brotos, número de folhas por broto, comprimento da
lâmina foliar e presença ou ausência de raiz. Para alongamento do broto foi considerado o
pseudocaule até a maior extensão da lâmina foliar.
Calogênese e Cultura de células em suspensão
Segmentos da base da bainha foliar, cortes da lâmina foliar e de raízes de A. zerumbet
desenvolvidas in vitro foram introduzidos em vidros (72 x 59 mm) contendo meio MS acrescido
dos reguladores de crescimento vegetal cinetina (CIN) ou 2,4 diclorofenoxiacético (2,4D), nas
concentrações 1 mg.L-1 e 2 mg.L-1 respectivamente, e TDZ 8 mg.L-1 visando à determinação de
39
concentrações adequadas de reguladores de crescimento vegetal para produção de calos friáveis.
Os explantes foram mantidos na condição de escuro por 2 meses. A partir de calos friáveis foi
obtida a cultura de células em suspensão. O subcultivo dos calos foi feito através da divisão do
mesmo com o auxílio de um bisturi e transferido para novo meio de mesma combinação de
reguladores de crescimento vegetal. As culturas calogênicas foram observadas, com 30 dias,
quanto ao desenvolvimento do tipo de calo (friável ou compacto), organogênico ou não e
coloração.
Meios contendo 1,0 mg.L-1 de cinetina deram origem a calos friáveis que foram
transferidos para erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de meio líquido MS acrescido das
mesmas combinação de reguladores de crescimento vegetal que melhor induziram a calogênese.
As culturas foram mantidas em agitador orbital a 120 rpm, sob iluminação e temperatura já
descritas anteriormente. As suspensões foram renovadas, por filtração em peneiras de aço - malha
de 200 µM, esterilizadas e transferidas para novo meio de cultura.
Aclimatização
As plantas in vitro, após 3 meses in vitro foram aclimatizadas em jarros contendo terra
adubada e mantidos em ambiente arejado e sem incidência direta do sol. A rega foi feita a cada 2
dias.
Análises Estatísticas
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as comparações
estatísticas entre as médias foram feitas utilizando o teste de Dunnett, considerando todos os
valores de p< 0,05, no programa Graph Pad Instat®.
40
Resultados e Discussão
O cultivo em meio líquido foi crucial para o desenvolvimento da planta in vitro, com a
produção de novos brotos, em relação ao meio sólido (Figura 3C). O meio líquido propicia
melhor absorção dos nutrientes do meio pela planta e com isso contribuiu para o rápido início do
desenvolvimento in vitro. O meio sólido produziu respostas mais lentas em relação aos
parâmetros de desenvolvimento, podendo ser usado para manutenção das culturas por longo
período. O estabelecimento das culturas in vitro de A. zerumbet permitiu a implementação de
alternativas como o uso de radiação gama que contribuem para indução da variabilidade genética,
visto que tais plantas se propagam de forma vegetativa, produzindo outras de igual conteúdo
genético (Fereol et al., 1996). Esta característica reprodutiva é comum em espécies da família
Zingiberaceae, sendo encontrados diferentes trabalhos que utilizam a propagação in vitro para
inserir variabilidade genética (Fereol et al., 1996; Miachir et al., 2004). Além disso, estas plantas
por apresentarem rizoma são facilmente alvos de contaminação por microorganismos do solo,
representando uma ameaça às culturas comerciais. Em vista disso, através da propagação in vitro
se obtêm culturas livres de patógenos. As etapas de desinfestação e introdução no meio de cultura
foram executadas várias vezes, com diferentes protocolos de desinfestação, devido à alta
incidência de contaminação dos explantes por fungos. A dificuldade em estabelecer um protocolo
de desinfestação, para obter culturas assépticas foi também relatado para outras culturas de
Alpinia (Illg & Faria, 1995; Borthakur et al., 1999). As culturas apresentaram adaptação
satisfatória ao sistema in vitro, com alongamento dos brotos e rizogênese (Figura 2A-B)
41
C
1 cm
D
E
F
10 cm
1 cm
Figura 2. A-B. Plantas in vitro de Alpinia zerumbet com 2 meses. MS0 líquido (A), AIA2 (B). C.
Plantas de A. zerumbet na sala de cultura sob lâmpadas luz fluorescentes. D. Plantas
aclimatizadas, após 2 anos. E-F. Calogênese a partir do pseudocaule, em TDZ, após 2 meses (F)
e cultura de células em suspensão (E).
Para iniciar a cultura in vitro, além das contaminações, a baixa produção de novos brotos
conduziu os testes com diferentes concentrações de reguladores de crescimento vegetal no intuito
de aumentar o número de plantas obtidas a partir do cultivo in vitro. O crescimento das culturas
in vitro é contínuo, após um mês há brotos em vários estágios de desenvolvimento. Culturas
mantidas por 6 meses in vitro, sem renovação do meio de cultura, continuam a produzir novos
42
brotos. Estes resultados mostram uma característica comum a outras espécies de Alpinia quanto à
produção simultânea de novos brotos e raízes (Borthakur et al., 1999). Esta característica resulta
em diferenças, por vezes, discrepantes na altura dos brotos. Por isso a medida da altura dos brotos
foi feita em grupos de brotos maiores e menores que 5 cm.
As citocininas de modo geral estimulam a divisão celular, a formação de brotos
adventícios e quebram a dormência dos brotos laterais (Gaspar et al., 1996; Kamínek et al.,
1997). Após introdução dos explantes no meio, a cultura permaneceu por mais de 6 meses em
dormência até início do desenvolvimento de brotos e estabelecimento da cultura. Os rizomas de
Alpinia podem apresentar períodos de dormência (Burch et al., 1987; Kuehny et al., 2002).
Brotos do rizoma de espécies de Alpinia podem passar por períodos de dormência, o que retarda
o início das culturas. As citocininas podem ter participado da transição deste período de
dormência para desenvolvimento e proliferação.
O uso de concentrações crescentes de TDZ não resultou em aprimoramento dos
parâmetros avaliados (Figura 3). O TDZ é uma citocinina sintética que em baixas concentrações
age aumentando a proliferação de brotos, inibindo a formação de brotos e induz a calogênese
(Gaspar et al., 1996; Huang et al., 2001; Ledbetter & Preece, 2004). O efeito do TDZ em induzir
brotações têm sido relatado para várias espécies herbáceas e lenhosas (Malabadi et al., 2004).
Apenas um leve aumento no número de brotos, não significativo, foi verificado na concentração
de 8 mg.L-1 de TDZ em relação ao MS liquido (Figura 3).
Para o parâmetro número de brotos, as respostas obtidas para o tratamento com BAP
foram inferiores as do meio controle (MS líquido) (Figura 3). Em culturas in vitro de outras
espécies de Alpinia diferentes concentrações de BAP isolado ou em combinação com uma auxina
foi importante no aumento da produção de brotos (Morón, 1987; Illg & Faria, 1995).
43
O balanço entre citocininas e auxinas é muitas vezes utilizado para estabelecer protocolos
de cultivo in vitro, visto que os aspectos do crescimento, diferenciação e organogênese vegetal
são controlados pela interação entre estes hormônios (Gaspar et al., 1996). A combinação de AIA
e TDZ ou AIA e BAP não mostraram resultados diferentes estatisticamente dos obtidos para os
mesmos reguladores de crescimento isolados (Figura 3 e 4)
Foram verificadas diferenças no alongamento apenas entre os meios MS líquido e TDZ 2
para brotos menores que 5 cm (Figura 4A). A maior diferença no alongamento do broto foi
verificada entre 1 e 2 meses (Figura 5B) para todos os tratamentos. Da mesma forma para o
número de brotos, com exceção do meio AIA 2 + BAP 2 (Figura 5A); sendo este período crucial
para o desenvolvimento vegetal.
A adição de auxinas ao meio de cultura é muito comum para induzir e melhorar o
enraizamento in vitro (Lu, 2005; Ascough et al., 2007). O enraizamento in vitro de A. zerumbet
atingiu 100% para todos os meios testados, a auxina AIA foi dispensável.
44
comprimento lâmina foliar
4.5
4.0
*
3.5
3.0
*
#
*
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
número de folhas
4
*
3
#
2
1
0
4.5
número de brotos
4.0
3.5
3.0
2.5
*
2.0
1.5
#
1.0
0.5
AIA 2 + TDZ 2
AIA 2 + BAP 2
BAP 2
TDZ 8
TDZ 4
TDZ 2
AIA 2
MS0 líquido
MS0 sólido
0.0
Figura 3. Respostas morfogênicas de Alpinia zerumbet com 3 meses in vitro, sob ação de
diferentes reguladores de crescimento vegetal. Cada valor consiste na média ± EP. Diferenças
estatísticas (Dunnett, n ≥ 30): *p< 0,01 e #p< 0,05 em relação ao controle MS0 (líquido).
45
AIA 2 + BA 2
AIA 2 + TDZ 2
BA 2
TDZ 8
TDZ 4
TDZ 2
AIA 2
MS líquido
AIA 2 + BA 2
AIA 2 + TDZ 2
BA 2
TDZ 8
B
TDZ 4
70
60
50
40
30
20
10
0
TDZ 2
AIA 2 + BA 2
AIA 2 + TDZ 2
BA 2
TDZ 8
TDZ 4
TDZ 2
AIA 2
MS liquido
B
AIA 2
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
MS líquido
AIA 2 + BAP 2
AIA 2 + TDZ 2
BAP 2
TDZ 8
TDZ 4
TDZ 2
AIA 2
0
MS sólido
1
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
MS sólido
diferença número de brotos (%)
2
diferença alongamento (%)
*
3
> 0,5 cm
alongamento do broto (cm)
A
A
4
MS0 lquido
alongamento dos brotos (cm)
< 0,5 cm
Figura 4. Alongamento in vitro de brotos de Alpinia
Figura 5. Diferenças (%) no desenvolvimento in vitro de
zerumbet, com 3 meses, sob ação de diferentes reguladores
Alpinia zerumbet, entre 1-2 meses (■) e entre 2-3 meses
de crescimento vegetal. A. < 0,5 cm e B. > 0,5 cm. Cada
( ). A. número de brotos. B. alongamento dos brotos.
valor consiste na média ± EP. * Diferenças estatística, p<
Cada valor consiste na média, n≥ 30.
5%, n≥ 30, Tukey.
46
Não há citações de calogênese em plantas do gênero Alpinia. Todas as respostas de
calogênese foram obtidas a partir de explantes do pseudocaule. A condição de escuro foi
importante para se obter melhores resultados no processo de calogênese. Após 2 meses, os meios
contendo 1 mg.L-1 de CIN e 8 mg.L-1 de TDZ induziram a produção de calos friáveis que foram
utilizados para iniciar as culturas de células (Figura 2E). O TDZ têm sido bastante utilizado para
induzir calogênese (Heutteman & Preece, 1993). O 2,4D é o preferido e mais freqüentemente
utilizado na indução de calos (Nogueira et al., 2007). No entanto, em culturas de Curcuma
zedoaria (Zinbigeraceae) não foi observada calogênese utilizando 2,4D nas concentrações entre
1-20 mg.L-1 (Miachir et al., 2004). Neste estudo, os meios contendo 2,4D produziram, em
maioria, calos compactos e marrons que não são utilizados para iniciar a cultura de células em
suspensão (Tabela 1, Figura 2F). Os calos obtidos não aumentaram em massa por 6 meses. A
concentração e tipo de regulador de crescimento vegetal, bem como o tecido utilizado como
explante inicial são fundamentais na obtenção de diferentes tipos de calo.
Tabela 1. Indução da calogênese em Alpinia zerumbet por 2,4D e CIN, em meio MS.
Regulador de
Concentração
Explante
Período
pseudocaule
2 meses
Tipo de calo
-1
crescimento
mg.L
2,4 D
1e2
Compacto e
friável, marrom
lâmina foliar
s.r.
raízes
TDZ
8
pseudocaule
Compacto, branco
2 meses
lâmina foliar
Cinetina
s.r. – sem resposta.
1e2
pseudocaule
Friável, branco
s.r.
2 meses
Friável, branco
47
O sistema radicular bem desenvolvido in vitro possibilitou a eficiente aclimatização das
plantas de A. zerumbet (Figura 2D).
Conclusão
Este é o primeiro protocolo estabelecido para introdução e manutenção de culturas in vitro
de A. zerumbet por diferentes sistemas: organogênese direta, calogênese e cultura de células em
suspensão. O protocolo de desinfestação, utilizando detergente, álcool 70% e água sanitária 30%,
foi eficiente para iniciar os cultivos assépticos. A introdução in vitro de A. zerumbet permite o
estudo fitoquímico em sistemas padronizados de cultivo e viabiliza a propagação vegetativa de
plantas uniformes, livres de patógenos, de forma rápida. O meio MS líquido foi o mais propício à
propagação da espécie em relação ao meio sólido, considerando os parâmetros avaliados: número
e alongamento dos brotos, número e comprimento da lâmina foliar. A adição de auxina e/ou
citocinina ao meio MS líquido não resultou em respostas diferenciadas em relação ao controle;
apenas leve aumento no número de brotos foi obtido utilizando TDZ. Em vista disto, o meio MS
líquido é o mais indicado para produção de mudas de A. zerumbet, por produzir plantas com
características saudáveis quanto ao desenvolvimento e pronunciado processo de enraizamento. A
aclimatização foi eficiente graças ao sistema radicular desenvolvido in vitro. Este protocolo é
uma ferramenta que viabiliza a manipulação de várias alternativas para otimizar a produção de
metabólitos secundários, desde metodologias de elciação a engenharia genética.
48
1.2 Propagação in vitro de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum sob efeito de auxinas e
citocininas
Resumo
Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum é muito utilizada como ornamental e possui escassas
indicações de uso na medicina popular. Estudos utilizando técnicas de cultura de tecidos vegetais
permitem, a partir de condições padronizadas, avaliar as respostas fisiológicas e morfológicas dos
vegetais aos fitorreguladores exógenos. Este trabalho consistiu no estabelecimento de plantas de
A. purpurata in vitro utilizando auxinas (AIA) e citocininas (BAP e TDZ). Brotos oriundos da
inflorescência de A. purpurata foram desinfestados e introduzidos em meio MS (Murashige e
Skoog) para iniciar as culturas. O processo de organogênese direta foi rápido e satisfatório,
produzindo plantas alongadas e com sistema radicular desenvolvido. A porcentagem de
enraizamento atingiu 100% para todos os tratamentos ao final de 2 meses. As citocininas e auxina
foram importantes para incrementar o número de folhas (4,2 a 5,1) e alongamento dos brotos (4,0
cm) em comparação com o meio controle. O MS0 líquido apresentou as melhores características
para rápida propagação in vitro e maior produção de brotos, com suprimento de plantas aptas a
serem aclimatizadas.
Palavras-chave: cultura de tecidos vegetais, micropropagação, Zingiberaceae.
Introdução
O uso ornamental de Alpinia purpurata é extensivo a várias regiões tropicais e
subtropicais, com alta demanda no mercado internacional (Kress, 2002; Sangwanangkul et al.,
49
2008). A propagação vegetativa, através do rizoma, é a principal forma de produção de mudas
desta espécie. Segundo Morón, 1987, o período para obtenção de uma certa quantidade de mudas
em casa de vegetação é o dobro em relação aos sistemas de cultivo in vitro.
As técnicas de cultura de tecidos são empregadas no Brasil desde 1950 e as vantagens
obtidas incluem a produção contínua e rápida de plantas assépticas e genótipos selecionados. Está
técnica viabiliza a propagação em escala comercial e industrial de plantas (Santarém & Astarita,
1999; Rout et al., 2006). Logo, a produção in vitro de A. purpurata além de conferir uma
alternativa para produção da espécie, aumenta as possibilidades de estudá-la para fins medicinais.
A adição de auxinas e citocininas ao meio de cultura são muitas vezes fundamentais para
a regulação das respostas de crescimento e morfogênese (Sugiyama, 1999; Chitra & Padmaja,
2005; Kyozuka, 2007). Este estudo teve como objetivo estabelecer um protocolo de
organogênese direta e avaliar os efeitos das auxinas e citocininas durante a multiplicação de
brotos, alongamento, formação de folhas e enraizamento de A. purpurata.
Material e Métodos
Material vegetal
A planta matriz de Alpinia purpurata foi obtida no pátio do Instituto de Biofísica da
UFRJ, identificada e depositada no Herbário do Jardim Botânico (Rio de Janeiro) sob o número
RB 433484.
Desinfestação do material vegetal
Brotos da inflorescência de A. purpurata (Vieill) K. Schum, inflorescência vermelha,
foram coletados, lavados em água corrente e com detergente comercial com o auxílio de uma
escova de nylon para remoção de partículas de solo. Depois o material vegetal foi colocado em
50
água sanitária comercial a 20% por 40 min. Seguido do protocolo de desinfestação: 15 min - água
e detergente; 1 min - álcool 70%; 10 min - água sanitária 30%, em fluxo laminar.
Estabelecimento das culturas
Para início das culturas, explantes foram introduzidos em potes de vidro (16 x 8 cm)
contendo o meio sólido ou líquido MS (Murashige & Skoog, 1962). O meio foi acrescido de 30
g.L-1 de sacarose, vitaminas (tiamina-HCl 1,3 µM, piridoxina 3 µM e ácido nicotínico 4,1 µM),
mio-inositol 0,6 mM, sendo o pH ajustado para 5,8. A solidificação dos meios foi obtida pela
adição de 7,8 g de agar ao meio. Foram utilizados diferentes reguladores de crescimento vegetal
isolados e em combinações: BAP (6-benzilaminopurina), TDZ (tidiazuron), AIA (ácido
indolacético). Os tratamentos foram: MS sólido; MS líquido; AIA 2 (2 mg.L-1); TDZ 2 e TDZ 4
(2 e 4 mg.L-1, respectivamente); BAP 2 (2 mg.L-1); AIA 2 + TDZ 2 (2 mg.L-1) e AIA 2 + BAP 2
(2 mg.L-1). Todos os meios acrescidos de reguladores do crescimento vegetal são líquido. No
mínimo 30 explantes foram avaliados por tratamento. Os meios foram esterilizados, em autoclave
a 120oC, 1 kgf.cm-2, durante 15 min. As culturas foram mantidas em sala de crescimento a 25 ±
2ºC, sob intensidade luminosa de 23 µmol.m-2.s-1, fornecidas por lâmpadas fluorescentes,
subcategoria Duramax Universal (General Electric®, 20 W T–12) e fotoperíodo de 16 h.
Análises Estatísticas
Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as comparações
estatísticas entre as médias serão feitas utilizando o teste de Tukey, considerando p<0,05, no
programa Graph Pad Instat®. Para as diferenças entre as médias em porcentagem, será utilizado o
51
teste da diferença entre duas porcentagens (p1 e p2), 5%, de significância pelo teste t-Student para
amostras independentes no programa Statistic®.
Resultados e Discussão
As respostas do desenvolvimento in vitro de A. purpurata estão contidos na Tabela 1.
As espécies do gênero Alpinia possuem como vantagem o tipo de propagação vegetativa
que aumenta a capacidade de se propagar in vitro. O estabelecimento das culturas foi rápido e as
plantas apresentaram crescimento contínuo, ou seja, as brotações se perpetuaram até 5 a 6 meses
com aumento no número e tamanho de brotos. O uso de brotos da inflorescência para iniciar as
culturas é uma vantagem, já que brotos provindos do rizoma são mais difíceis de serem
desinfetados e podem apresentar dormência (Burch et al., 1987). Ao longo de 3 meses é possível
observar a formação de brotos em diferentes estágios de desenvolvimento (Figura 1B). No
entanto, com 2 meses já é possível iniciar novos subcultivos ou aclimatizar as plantas (Figura
1A). O meio líquido induziu 161% de novos brotos em relação ao MS sólido. Foram obtidos
cerca de 30 brotos por explante em MS (controle) por ano.
Figura 1. Desenvolvimento in vitro de Alpinia purpurata em meio MS liquido, com 2 meses (A).
Seqüência do desenvolvimento (B): 1 mês (I), 2 meses (II) e 3 (III) meses.
52
Entre os tratamentos com reguladores de crescimento vegetal, nenhuma vantagem foi
obtida em relação ao número de brotos. Em estudos realizados por Morón, 1987, o BAP foi
importante para aumentar a taxa proliferativa de brotos. Já Illg & Faria (1995) obtiveram
melhores respostas para número e brotos quando combinaram BAP com auxina. No presente
trabalho, as citocininas TDZ e BAP isoladas foram importantes para implementar o número de
folhas em relação ao controle. Pela primeira vez se avaliou o efeito de TDZ na indução de
brotações para o gênero Alpinia. A concentração de 2 mg.L-1 de TDZ foi suficiente para induzir
maior alongamento e produção de novas folhas em relação ao controle após 3 meses; a resposta
não foi crescente conforme o aumento da concentração de TDZ.
As auxinas estão relacionadas a iniciação do enraizamento (Wightman et al., 1980;
Normanly, 1997). Para a espécie A. purpurata, a adição de AIA não foi necessária para estimular
o enraizamento, visto que as plantas começaram a desenvolver novas raízes a partir do 1º mês
atingindo 100% de enraizamento em meio controle. No entanto, a auxina induziu aumento do
comprimento dos brotos e número de folhas em relação ao controle.
Outros protocolos para a espécie A. purpurata já foram elaborados, utilizando BAP e AIA
(Moron, 1987; Illg & Faria, 1995); no entanto, as diferenças observadas entre os resultados
indicam que a procedência e características do material vegetal: região de coleta, época de coleta,
idade da planta, é fundamental para o estabelecimento e desenvolvimento das culturas.
53
Tabela 1. Respostas do desenvolvimento in vitro de Alpinia purpurata.
Reguladores de
crescimento
número de brotos (%)
altura dos brotos (cm)
folhas/broto
3 meses
1 mês
2 meses
3 meses
1 mês
2 meses
3 meses
100a*
1,8±0,1a
2,9±0,1a
3,3±0,1a
2,3±0,3a
3,4±0,3a
3,4±0,1a
AIA 2
46b
2,3±0,1b
2,4±0,2b
3,6±0,3ab
2,3±0,1a
3,4±0,2a
4,1±0,2ac
TDZ 2
84b
2,1±0,1b
3,5±0,2a
3,5±0,1ab
2,2±0,1a
3,3±0,2a
5,1±0,1b
TDZ 4
82 b
2,3±0,1b
3,0±0,1a
3,2±0,1a
2,1±0,1a
3,3±0,2a
3,5±0,2a
BAP 2
74b
2,7±0,1b
3,5±0,2a
4,0±0,1b
2,8±0,1a
4,0±0,2a
4,2±0,2c
AIA 2 + TDZ 2
68b
2,8±0,1b
2,8±0,2a
3,1±0,1a
2,0±0,1a
4,2±0,2a
5,0±0,2b
AIA 2 + BAP 2
62b
2,6±0,1b
3,5±0,3a
3,7±0,2ab
2,5±0,1a
4,2±1.0a
5,1±0,2b
MS0 (controle)
Letras diferentes indicam diferenças estatísticas p< 0,05; Tukey, n ≥ 30.
*100% equivale a 30 brotos/explante, em 1 ano.
Conclusão
O protocolo de propagação in vitro de A. purpurata foi estabelecido utilizando meio MS
líquido e sólido. Como características, as plantas produziram folhas, raízes e novos brotos a partir
do 2º mês. Maior taxa multiplicativa foi obtida em meio MS líquido (30 brotos/ano), seguido do
meio contendo 2 mg.L-1 de TDZ. Os reguladores de crescimento vegetal induziram respostas
diferenciadas para os parâmetros altura do broto e número de folhas. O meio MS sem reguladores
de crescimento vegetal pode ser utilizado com o intuito de produzir maior número de brotos
enraizados.
O sistema de cultivo in vitro de A. purpurata, por produzir plantas assépticas e de forma
rápida, é uma ferramenta na obtenção em larga escala de mudas para uso ornamental e medicinal.
54
Capítulo 2
Produção de metabólitos especiais em plantas de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e
A. purpurata (Vieill) K. Schum
2.1. Avaliação de diferentes métodos de extração de flavonóides de folhas de Alpinia
zerumbet (Pers.) Burtt et Smith
Resumo
Alpinia zerumbet é uma planta medicinal que apresenta flavonóides importantes na ação
terapêutica. O objetivo foi verificar a metodologia de extração mais apropriada para rápida e
eficiente obtenção de flavonóides a partir de folhas secas de A. zerumbet. As folhas foram
coletadas e secas, por 3 dias, em estufa a 60ºC, depois moídas para preparação do extrato bruto.
Como solventes extratores foram utilizados água destilada e etanol 70%. Foram avaliadas 4
metodologias de extração: ultrassom, maceração sob agitação, microondas e agitador (50 a 60ºC).
Para separação e detecção dos flavonóides rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo foram utilizadas
CCD e CLAE. Os flavonóides foram confirmados através da comparação com os espectros e
tempos de retenção dos padrões. O solvente etanol 70% foi mais eficiente como extrator em
relação a água. Para as metodologias ultrassom, microondas e agitador, não houve variação
significativa para o rendimento utilizando etanol 70%. As metodologias de extração envolvendo
aquecimento aumentaram a eficiência dos solventes. A concentração relativa dos flavonóides foi
maior pelos métodos de extração ultrassom e microondas e utilizando o solvente etanol 70%.
Procedimentos rápidos e simplificados de extração otimizam o trabalho fitoquímico e a obtenção
de metabólitos secundários.
55
Palavras-chave: maceração, microondas, ultrassom, Zingiberaceae
Introdução
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith é uma planta medicinal amplamente distribuída
em regiões no Brasil. Esta espécie está entre as mais citadas no uso popular para fins
terapêuticos. É indicada no uso de doenças como a hipertensão arterial (Moura et al., 2005). Os
flavonóides desta espécie possuem relevante importância medicinal, e estão entre as principais
substâncias relacionadas à atividade da espécie (Da Costa et al., 1998; Mpalantinos et al., 1998;
Havsteen, 2002).
Parâmetros como tempo de extração, solvente, temperatura e método influenciam a
extração de metabólitos secundários. De tal forma que diferentes procedimentos de extração têm
sido utilizados para obtenção de substâncias biologicamente ativas de plantas.
A presença de flavonóides nas folhas de espécies da família Zingiberaceae é muito
representativa (Williams & Harborne, 1977). Os flavonóides rutina e kaempferol-3-Oglicuronídeo foram isolados de folhas de A. zerumbet (Mplantinos et al., 1998) e este estudo teve
o intuito de obter uma extração eficiente e rápida para flavonóides, visto que mais recentemente
há vários trabalhos mencionando as técnicas de ultrassom e microondas como eficientes na
extração de metabólitos especiais de plantas (Pan et al., 2000; Pan et al., 2003; Fulzele &
Satdive, 2005). O método de ultrassom já foi descrito por sua eficiência e diminuição do tempo
de extração de substâncias flavonoídicas (Yang & Zhang, 2008). A extração de polifenóis por
microondas foi eficiente para chá verde e outras metabólitos secundários (Pan et al., 2003). O uso
de microondas para extração de substâncias biologicamente ativas é recente, mostrando
resultados efetivos para óleo essencial, flavonóides, alcalóides, etc (Pan et al., 2003).
56
A escolha dos solventes e metodologias de extração são imprenscindíveis para otimizar a
obtenção de metabólitos secundários. Estes procedimentos propõem uma forma simplificada de
avaliar a presença de flavonóides nos extratos.
Material e Métodos
Material vegetal
O exemplar de Alpinia zerumbet foi obtido na área externa da Universidade Federal do
Rio de Janeiro (CCS - bloco H), identificado e depositado no Herbário do Jardim Botânico (RB)
do Rio de Janeiro, sob o número RB 433485.
Preparação dos extratos e metodologias de extração
Folhas de A. zerumbet foram coletadas pela manhã, e secas, por 3 dias, em estufa a 60ºC.
Após este procedimento, as folhas foram trituradas utilizando um liquidificador, para posterior
preparação do extrato. Foram feitos dois tipos de extrato: aquoso e hidroalcoolico (70% de
etanol), na proporção de 1 g de folha seca em 20 mL de solvente (10% p/v).
Foram avaliadas 4 metodologias de extração a partir das folhas de campo secas: banho de
ultrassom (40 kHz, Thornton Unique, modelo 1400 USC), maceração sob agitação (shaker) a 100
rpm; microondas (PANASONIC - Auto Sensor Diet, potência alta) e agitador (stirring) (Tabela
1).
57
Tabela 1. Especificações das metodologias de extração a partir de folhas secas de Alpinia
zerumbet.
Maceração
Solvente extrator
Temperaturaa
Tempo extração
a
Ultrassom
Microondas
Agitador
Água destilada e etOH 70%
25oC
40 e 60oC
60 e 70oC
50 a 60oC
1, 2 e 3 dias
15, 30 e 45 min
3x (3 seg)
60 min
Dados referentes a temperatura da água e do etanol 70%, respectivamente.
Os extratos foram filtrados a vácuo, utilizando papel de filtro Whattman® (110 mm ø,
qualidade 1). Posteriormente, os extratos aquosos foram congelados e liofilizados e os
hidroalcóolicos concentrados sob pressão reduzida em evaporador rotatório. O peso seco foi
aferido para verificação do rendimento da extração. O rendimento dos extratos foi calculado pela
expressão, em %: (massa do extrato seco/massa do material vegetal seca) x 100.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Para verificação dos flavonóides, uma alíquota dos extratos foi aplicada em cromatofolha
de CCD (sílica gel 60 F254 nm) e eluídas em concomitância com os padrões em diferentes sistemas
de solventes enumerados abaixo. O sistema de eluição 5 foi mais apropriado para a maioria das
amostras, com Rf = 0,37 (rutina) e Rf = 0,64 (kaempferol-3-O-glicuronídeo). A visualização dos
flavonóides foi feita, primeiramente, utilizando luz ultravioleta (λ 254 e 366 nm, Moldel UVGL58 Upland/EUA). A detecção foi obtida utilizando os reagentes 2-aminoetilfenilborato (1 mg.L-1
em etanol, Spectrum) e 5% polietilenoglicol-4000 (Fluka).
58
1
acetato de etila/etanol/ácido acético/água
(16:1,5:1,0:1,0, v/v/v/v)
2
acetato de etila/etanol/ácido acético/água
(7,5:2,0:0,5:0,5, v/v/v/v)
3
acetato de etila/etanol/ácido acético/água
(27:1,0:0,5:0,5, v/v/v/v)
4
acetato de etila/ácido acético/ácido fórmico/água
(100:11:11:27, v/v/v/v)
5
acetato de etila/ácido fórmico/água
(65:20:15, v/v/v)
6
clorofórmico/metanol
(70:30, v/v)
Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Os extratos aquosos e hidroalcoólicos (70% etanol) foram submetidos a análise por
CLAE. As amostras foram suspensas em 70% metanol a 10 mg/mL e os padrões a 1 mg/mL. A
análise em CLAE acoplada ao detector de feixes fotodiodos foi realizada utilizando aparelho
Shimadzu equipado com bomba LC-10AD e detector SPD-M10A. A separação foi feita na
coluna de fase reversa C18 (Lichrosorb-RP-18, S5-100-ODC, 25 cm x 4,6 nm), contendo sílica do
tipo octadecil silicato de 5 µm de 100Å como fase fixa, a temperatura ambiente. Os sinais foram
observados nos comprimentos de onda de 254 e 360 nm. A fase móvel foi água Milli-Q com
0,1% de ácido fosfórico 85% (v/v) (solvente A) e metanol (solvente B), fluxo de 1,0 mL/min. O
gradiente de eluição foi o seguinte: 1-10 min (30% B); 20 min (40% B); 60 min (100% B). Os
flavonóides foram detectados através dos seus tempos de retenção (TR), espectro ultravioleta em
comparação com os espectros dos padrões de flavonóides e pela co-injeção com amostras
autênticas. Para coinjeção, foi preparada uma mistura (1:1) do extrato a 10 mg.mL-1 e de cada
padrão, em separado, a 1 mg.mL-1.
Diferentes concentrações dos padrões foram injetadas para construção da curva analítica e
avaliação quantitativa. As injeções foram feitas em triplicatas. As curvas analíticas dos padrões
de rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo foram obtidas por CLAE, após cálculo de dispersão
59
dado pela curva y = ax - b, onde y representa a área do sinal e x a respectiva concentração em
mg.mL-1.
Solventes e Reagentes
Os solventes utilizados para CLAE possuíam grau técnico para CLAE, oriundos do grupo
Tedia. Outros solventes utilizados na extração do material tinham grau padrão analítico (P.A.). A
água utilizada para preparar os extratos foi destilada, e para as análises a água foi filtrada pelo
sistema Milli-Q (água desionizada). O kaempferol-3-O-glicuronídeo foi obtido por isolamento
(Mpalantinos, 2001) e a rutina comercialmente (Merck).
Resultados
A Tabela 2 mostra os rendimentos obtidos para cada metodologia de extração. O solvente
etanol 70% foi mais eficiente como extrator, sendo observada similaridade dos sinais de retenção
em relação à água (Figura 1). Quanto às metodologias extração, os rendimentos foram maiores
após extração com etanol 70% em relação à água. O menor rendimento foi obtido para o
procedimento de maceração (Tabela 2). Os métodos de extração envolvendo aquecimento
aumentaram a eficiência dos solventes.
A análise do extrato bruto hidroalcoólico de A. zerumbet pela CLAE utilizando coluna de
fase reversa revelou 6 substâncias principais, entre elas foi possível identificar os flavonóides
rutina (TR: 31.42 min) e kaempferol-3-O-glicuronídeo (TR: 34.49 min) (Figura 1 e 2). Tais
flavonóides também foram detectados por CCD.
A obtenção do perfil cromatográfico para cada metodologia e solvente utilizado é
importantíssima para verificar se há variações na composição qualitativa e quantitativa dos
60
metabólitos secundários. Estes dados vão refletir nos efeitos dos extratos em ensaios biológicos e
uso medicinal.
Tabela 2. Rendimento da extração a partir de folhas secas de Alpinia zerumbet.
Solventes
Rendimento (%)
extratores
Maceração
Ultrassom
Agitador
Microondas
(3 dias)
(45 min)
(60 min, 50oC)
3x (3 seg)
Aquoso
3,7
6,7
11
-
Hidroalcóolico
8,2
13
13,5
14
Valores obtidos a partir da média de 3 extrações.
100
mAbs
2
A
1
200
2
B
1
0
30
60 min
Tempo de retenção (min)
Figura 1. Perfis cromatográficos (CLAE) do extrato aquoso (A) e hidroalcóolico (B) de Alpinia
zerumbet obtido pelo método de ultrassom 45 min. Substâncias identificadas em comparação com
61
padrões e coinjeção. 1. rutina (TR: 31.42 min) e 2. kaempferol-3-O-glicuronídeo (TR: 34.49
min), 360 nm.
A
B
OH
OH
HO
HO
O
O
OH
OH
OH
OH
H2 OH
C
HO
O
O
O
O
O
OH
O
O
O
HO
OH
H3C
HO
OH
O
HO
OH
Figura 2. Estrutura dos flavonóides glicosilados de Alpinia zerumbet. A. rutina e B. kaempferol3-O-glicuronídeo.
O solvente etanol 70% foi mais eficiente na extração dos flavonóides rutina e kaempferol3-O-glicuronídeo (Figura 3) para todos os procedimentos de extração. O uso de ultrassom e
microondas foram mais adequados para extração dos flavonóides, seguidos do agitador (Figura
3).
62
7
6
a
a
***
***
b
**
5
b
#
4
#
3
#
agua
a
rutina
agitador
microondas
ultrassom
maceração
etanol
agitador
0
**
a
*
microondas
1
a
b
***
ultrassom
2
maceração
mg flavonóide/ g folha seca
8
kaempferol glicuronídeo
Figura 3. Conteúdo de flavonóides rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo no extrato aquoso e
hidroalcoólico de A. zerumbet obtido por CLAE e determinado por uma curva de calibração dos
padrões. Cada valor consiste da média ± DP. Letras iguais indicam que não há diferenças
estatísticas entre as metodologias de extração considerando o solvente etanol 70% (p< 0,05). *p<
0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001 indicam diferenças estatísticas comparando o extrato
hidroalcoólico com o aquoso para cada metodologia de extração, em separado; #p< 0,05
considerando o extrato aquoso, em relação ao método de maceração (Bonferroni, n= 3).
63
Discussão
Vários efeitos terapêuticos são relatados para espécie A. zerumbet, em parte eles estão
relacionados à presença de rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo que apresentam alto interesse
medicinal (Mpalantinos et al., 1998).
A mistura de água e etanol (70%) favoreceu a extração de flavonóides a partir de extratos
hidroalcoólicos. Extratos aquosos, alcoólicos e hidroalcóolicos são comumente utilizados em
pesquisas com extratos vegetais (Turkmen et al., 2006).
Em comparação com metodologias convencionais de extração, como o contato do
material vegetal com o solvente por longo tempo, as metodologias de ultrassom e microondas
permitiram a extração dos flavonóides de A. zerumbet em concentrações maiores, com a
vantagem de maior agilidade do procedimento. Estes métodos já foram relatados por garantir a
eficiência da extração de outros metabólitos secundários (Pan et al., 2001; Pan et al., 2003).
Maior temperatura, característica dos processos de microondas e ultrassom, parece ser
imprescindível para maior eficiência do processo de extração. Com isso, o tempo de extração foi
reduzido e o processo otimizado.
As técnicas cromatográficas como CCD e CLAE são bastante favoráveis as detecções de
flavonóides. Resultados positivos quanto a estas técnicas foram verificados para Alpinia
officinarum e outras espécies (Rijke et al., 2006; Tao et al., 2006).
Conclusão
O tipo de metodologia e solvente definiu a eficiência do processo de extração O etanol
70% mostrou a melhor resposta para extração de flavonóides a partir folhas secas de A. zerumbet,
para todos as metodologias utilizadas.
64
A proporção relativa de flavonóides foi menor para a técnica de maceração por 3 dias.,
enquanto as técnicas de microondas e ultrassom foram mais apropriadas em combinação com o
solvente etanol 70%.
O método ultrassom (45 min) e microondas são recomendados para a extração de
flavonóides de forma simplificadas, rápida e eficiente, considerando o rendimento e tempo de
extração.
65
2.2. Detecção de flavonóides em folhas de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum. por
cromatografia líquida de alta eficiência.
Resumo
A espécie Alpinia purpurata apresenta poucas citações referentes a etnofarmacologia e
fitoquímica. Este estudo propõe a análise de substâncias bioativas através da técnica de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O extrato bruto hidroalcóolico foi obtido a partir
de folhas secas de A. purpurata. A quantificação de fenóis totais foi realizada pelo método de
Folin-Ciocalteau, usando ácido gálico como padrão, sendo determinado no extrato bruto um teor
de 15,6 mg EAG g-1. O extrato bruto foi particionado com os solventes acetato de eltila e butanol
e depois analisado por cromatografia em camada delgada e CLAE. Nos extratos acetato de etila e
butanólico foram detectados os flavonóides kaempferol-3-O-glicuronídeo e rutina, em maior
concentração. O extrato butanólico contém a maior porcentagem de flavonóides (94,3%). Esta
espécie possui flavonóides importantes no uso terapêutico, já antes verificados para a espécie A.
zerumbet. Este é o primeiro trabalho que verifica a presença de flavonóides em extratos de A.
purpurata.i A espécie A. purpurata se mostrou um recurso natural na obtenção de moléculas
bioativas.
Palavras-chave: CCF, polifenóis, planta medicinal, rutina, Zingiberaceae
Introdução
O gênero Alpinia (Zingiberaceae) é nativo de regiões tropicais da Ásia Oriental (Kress et
al., 2002), atualmente é cultivado em várias partes do mundo devido à beleza de suas
inflorescências e pelo potencial terapêutico (Zoghbi et al, 1999; Leal-Cardoso et al., 2004). Além
66
disso, muitas espécies da família são utilizadas para alimentação, perfumaria, produção de
condimentos aromáticos, corantes, fibras e até papel (Tomlinson, 1969).
A. purpurata (Vieill) K. Schum (inflorescência vermelha) é conhecida internacionalmente
no mercado de plantas ornamentais ou como flor para corte (Morón, 1987). Em um estudo
etnobotânico desenvolvido em uma comunidade do estado de Trujillo, Venezuela, entre as
plantas utilizadas foi constatado o uso da decocção da inflorescência de A. purpurata, via oral,
para tosse (Bermudez & Veláquez, 2002). Zoghbi et al. (1999) analisaram a composição do óleo
essencial desta espécie que apresenta notável atividade antibacteriana, mas são escassos os
estudos para fins fitoterapêutico. A maioria dos trabalhos científicos relatados com esta espécie
trata de abordagens voltadas para melhorias na produção de plantas com fins ornamentais:
inseticidas alternativos, tolerância à fumigação, controle biológicos de pragas, estoque in vitro de
brotos, propagação in vitro (Morón, 1987; Anderson & Gardner, 1999; Chen & Paull, 1998; Hara
et al., 1997; Dekkers et al., 1991; Gonzalez & Mogollon, 2001; Sangwanangkul et al., 2008).
Presente em várias regiões do Brasil, A. purpurata é de fácil acesso à população, sendo
um recurso viável no tratamento terapêutico. Várias espécies da família Zingiberaceae
apresentam propriedades antioxidantes, principalmente devido à presença pronunciada de
flavonóides, sendo destacado no gênero Alpinia os flavonóides kaempferol e rutina (Tabela 1)
(Williams & Harborne, 1977; Nakatani et al., 1991; Vankar et al., 2006). Pugialli et al. (1993 e
1994), em estudos de quimiossistemática da família Zingiberaceae elegeu os flavonóides e sua
variedade estrutural como marcadores taxonômicos. Esta família está posicionada no maior nível
dentro da Superordem Zingiberiflorae devido ao uso de mecanismos de proteção dos grupos
hidroxilas dos fenóis através da glicolisação e metilação. As relações fitoquímicas são uma
ferramenta importante na classificação evolutiva das espécies vegetais (Kaplan & Gottlieb,
67
1982). Com este trabalho se propõe um enfoque novo sobre a espécie Alpinia purpurata visto que
a partir de estudos de quimiossistemática do gênero, esta espécie apresenta um potencial
terapêutico ainda pouco estudado. Para sustentar está hipótese, estudos fitoquímicos foram feitos
no intuito de detectar a presença de flavonóides referidos na literatura por terem ação terapêutica.
O presente trabalho teve como objetivo realizar uma avaliação fitoquímica do extrato
hidroalcóolico das folhas de A. purpurata para verificar a presença dos flavonóides: rutina,
kaempferol-3-O-rutinosídeo e kaempferol-3-O-glicuronídeo.
Tabela 1. Flavonóides relatados para o gênero Alpinia.
Flavonóides
Espécie
Referência
rutina
A. zerumbet (folhas)
Mpalantinos et al., 1998
quercetina-3-O-glicosídeo
A. zerumbet (folhas)
Mpalantinos et al., 2001
kaempferol
A. tonkinensis (rizoma)
Zhang et al., 2003
A. officinarum (rizoma)
Bleier & Chirikdjian, 1972
Kim et al., 2006
kaempferol-3-O-glicuronídeo
A. zerumbet (folhas)
kaempferol-3-O-rutinosideo
A. zerumbet (folhas)
catequina e epicatequina
A. zerumbet (folhas)
Mpalantinos et al., 1998
Mendonça et al., 1998;
Mpalantinos et al., 1998
alpinetina
galangina e 3-O-metil
A. zerumbet (folhas)
Mendonça et al., 1998
A. zerumbet (sementes)
Krishna & Chaganty, 1973
A. katsumadai (sementes)
Rao & Lin, 1998
A. henryi
Wang et al., 2001
A. officinarum (rizoma)
Tao et al., 2006
A. officinarum (raízes)
Tunmann & Tkotz, 1972
galangina
*
*Nâo foi citado no resumo.
68
Material e Métodos
Material vegetal
Amostra da planta matriz de Alpinia purpurata foi obtida no pátio do Instituto de
Biofísica (IBCCF), UFRJ, Município do Rio de Janeiro, identificada e uma excicata depositada
no Jardim Botânico do Rio de Janeiro sob o número RB 433484.
Preparação do extrato
As folhas foram retiradas de plantas de A. purpurata coletadas no período da manhã, no
pátio da UFRJ. Após a coleta, o material vegetal foi seco por 3 dias em estufa a 60ºC, moído e
submetidos à maceração com etanol 70% por uma semana, e depois da primeira extração, as
folhas foram mantidas em etanol puro para extração até a exaustão. O extrato foi filtrado e seco
em evaporador rotatório a 60º C e por liofilização. A partir de 1009 g de folhas secas foi obtido
112,5 g de extrato bruto seco. O rendimento dos extratos foi calculado pela expressão, em %:
(massa do extrato/massa do material vegetal) x 100.
Partição do extrato bruto
Uma alíquota de 59,4 g do extrato bruto seco foi submetida à partição utilizando-se os
solventes em ordem crescente de polaridade: hexano, diclorometano, acetato de etila e butanol. O
extrato seco foi suspenso em metanol/água (9:1) e submetido a partição líquido-líquido com
hexano. A fração hexânica foi separada e a fração restante foi evaporada, em evaporador
rotatório, até retirada do metanol; esta fração foi ressuspensa em água e submetida a partição
líquido-líquido com diclorometano, acetato de etila e butanol. A cada fracionamento, a fração
69
aquosa foi lavada por 5 vezes com 50 a 60 mL de cada solvente. Os solventes foram evaporados,
obtendo-se os extratos: hexânico (4,12 g), diclorometano (0,29 g), acetato de etila (0,31 g) e
butanólico (4,8 g).
Padrões de flavonóides
Os padrões kaempferol-3-O-glicuronídeo (82% pureza), kaempferol-3-O-rutinosídeo
(91% pureza) e rutina (98% pureza) foram utilizados para co-injeção. Os da classe do kaempferol
foram isolados da espécie Alpinia zerumbet e identificados por RMN (Mpalantinos et al., 1998;
Mpalantinos, 2001); a rutina foi obtida comercialmente da Merck.
Determinação de fenóis totais
A quantificação de fenólicos foi realizada pelo método de Folin-Ciocalteau. Os extratos
hidrooalcólicos foram dissolvidos a 70% de etanol na concentração de 1 mg.mL-1. Foi utilizada
uma alíquota de 0,5 mL da solução do extrato bruto, na qual foi adicionada 2 mL de solução
aquosa de Folin-Ciocalteau a 10% e, após 3 min, 2 mL de solução aquosa de carbonato de sódio a
7,5%. A mistura foi homogeneizada e incubada por 30min em banho-maria a 50ºC.
Posteriormente, a absorvância foi medida usando-se os controles: (1) Folin-Ciocalteau +
carbonato de sódio e (2) solução do extrato bruto. A leitura das absorvâncias foi feita no
espectrofotômetro a 740 nm. A quantificação foi feita por meio de uma curva analítica preparada
com ácido gálico: y = 0,0229x + 0,0968, R2 = 0,9993, onde y é a absorvância e x a concentração
em µg equivalentes de ácido gálico (EAG) por mg de extrato bruto. As análises foram feitas em
triplicata.
70
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Para verificação dos flavonóides, uma alíquota das partições foi aplicada em cromatofolha
de CCD (sílica gel 60 F254
nm)
e eluídas em acetato de etila, ácido fórmico e água (65/20/15,
v/v/v). A detecção foi feita utilizando 2-aminoetilfenilborato (1 mg.L-1 em etanol, Spectrum) e
5% polietilenoglicol-4000 (Fluka). A presença dos flavonóides rutina, kaempferol-3-Orutinosídeo e kaempferol-3-O-glicuronídeo foi verificada nos extratos bruto, acetato de etila e
butanólico, depois de corrida concomitante com os padrões (Anexo D, pág. 187 e Victório et al.,
2007).
Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
Amostras do extrato bruto hidroalcóolico, acetato de etila e butanólico foram suspensos
em 70% metanol a 20 mg.mL-1, filtrados a vácuo e analisadas por cromatografia líquida de alta
eficiência. A análise em CLAE acoplada ao detector de feixes fotodiodos foi realizada utilizando
aparelho Shimadzu SPD-M10A, equipado com bomba LC-10AD e detector CBM-10A. A
separação foi feita em coluna de fase reversa (Lichrosorb RP-18, 25 cm x 5 mm), temperatura
ambiente. O monitoramento foi feito a 254 e 360 nm. Os eluentes da fase móvel foram água
ultrapura (Milli-Q) com 0,1% de ácido fosfórico (v/v) (solvente A) e metanol (solvente B): 1-10
min (30% de B); 20 min (40% de B); 60 min (100% de B), leitura a 254 nm e 360 nm, fluxo 1
mL/min. Os solventes utilizados para as análises possuíam grau técnico para CLAE. Os padrões
foram diluídos a 70% de metanol na concentração de 1 mg.mL-1 e analisados no mesmo sistema
de eluição. Diferentes concentrações dos padrões foram injetadas para construção da curva
analítica e avaliação quantitativa. As injeções foram feitas em triplicatas. As curvas analíticas dos
padrões de rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo foram obtidas a partir da linearidade entre as
71
concentrações (0,0078 - 0,0625 mg.mL-1) e (0,01325 - 0,25 mg.mL-1), respectivamente. A
concentração destes flavonóides nas amostras foi obtida, após cálculo de dispersão dado pela
curva y = ax - b, onde y representa a área do sinal e x a respectiva concentração em mg.mL-1
(Figura 1).
Á rea
1500000
3000000
-7
y = 3.10 x - 31152
R2 = 0,9991
-7
y = 1.10 x - 14764
R2 = 0,9951
2500000
2000000
Área
2000000
1000000
1500000
1000000
500000
500000
0
0,00
0
0,02
0,04
0,06
0,08
concentração rutina (mg/mL)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
concentração kaempferol glicuronídeo (mg/mL)
Figura 1. Curvas analíticas dos padrões rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo obtidas por CLAE.
Detecção dos flavonóides
Os flavonóides foram detectados através dos seus tempos de retenção (TR), espectro
ultravioleta em comparação com os espectros dos padrões de flavonóides (Figura 2) e pela coinjeção com amostras autênticas. Para co-injeção, foi preparada uma mistura (1:1) do extrato a 20
mg.mL-1 e de cada padrão, em separado, a 1 mg.mL-1 .
72
Figura 2. Espectros ultravioletas (CLAE) dos padrões (A) rutina e (B) kaempferol-3-Oglicuronídeo.
Resultados e Discussão
As substâncias fenólicas estão envolvidas na atividade antioxidante e por isso apresentam
amplo interesse como agentes terapêuticos, visto que os antioxidantes são capazes de estabilizar
ou desativar os radicais livres envolvidos em vários processos de enfermidades. Através do
método Folin-Ciocalteau é possível quantificar a presença de flavonóides e outras substâncias
fenólicas presentes nas amostras (Souza et al., 2007). Entre as espécies A. purpurata e A.
zerumbet em dois meses de coleta foi verificada diferenças significativas no conteúdo de fenóis
totais (p< 0,03) (Figura 3). Esta espécie foi utilizada como referência para comparação, por ser
mais utilizada na medicina popular e apresentar comprovação terapêutica científica.
73
(mg EAG/g extrato seco)
Fenois totais
35
30
25
20
A. zerum bet
15
A. purpurata
10
5
0
junho
fevereiro
Figura 3. Comparação do conteúdo de fenóis totais de Alpinia zerumbet e Alpinia purpurata
coletadas em dois períodos do ano.
Os perfis cromatográficos apresentam semelhança ao obtido para A. zerumbet, mostrando
os sinais de rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo (Mpalantinos, 2001). Os extratos polares
acetato de etila e butanólico mostraram a presença tanto da rutina quanto do kaempferol-3-Oglicuronídeo entre 20 e 40 min (Figura 4 e Anexo D, pág. 187). O flavonóide glicosilado,
kaempferol-3-O-rutinosídeo, não foi detectada por CCD nem por CLAE. Os sinais 1 e 3 no
cromatograma (Figura 4), mostram semelhança com o espectro UV de flavonóide, mas para
devida identificação, faz-se necessário o isolamento em coluna de SEPHADEX dos flavonóides
das frações acetato e/ou butanólica e posterior elucidação estrutural pelas técnicas de
espectroscopia. Os flavonóides rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo foram isolados de A.
zerumbet e também foram detectados na espécie A. purpurata nas respectivas concentrações:
0,17 e 0,09 (acetato de eltila) e 3,5 e 0,86 (butanólica) (Tabela 2). A concentração de rutina foi
maior para os dois extratos analisados. A rutina está amplamente distribuída no reino vegetal e
apesar da característica hidrofílica de sua estrutura, apresenta várias aplicações terapêuticas
74
como: atividade antioxidante, redução dos riscos de asteroesclerose, anti-edema (Wojcicki, 1995;
Holasova et al., 2001, Kreft et al., 2006). Os flavonóides da classe dos kaempferol apresentam
várias aplicações terapêuticas; em artigo recente, foi relatado o uso desta classe no tratamento da
doença de Alzheimer (De Melo & Costa, 2005). Mpalantinos et al. (1998) sugerem que os
flavonóides, entre eles a rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo, estão relacionados ao efeito
hipotensor da espécie A. zerumbet. O extrato bruto apresenta ainda outras substâncias entre os
tempos de retenção 40 e 60 min, verificadas a 254 nm, que não foram identificadas (Figura 4). O
método utilizado para CLAE foi reprodutível.
Tabela 2. Análise quantitativa dos flavonóides rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo nos extratos
de folhas secas de Alpinia purpurata, valores obtidos por CLAE a 254 nm.
Flavonóides
Rutina
Extratos
Rendimento
TR
Área
kaempferol-3-O-glicuronídeo
Concentração
TR
Área
(mg .g-1 folha seca)
%
Concentração
(mg .g-1 folha seca)
Bruto
11,1
Acetato
0,06
31.35
1845848
17,8
34.70
278400
8,7
Butanólico
0,9
30.63
16414602
356
34.65
1895737
85,5
*Todos os valores foram obtidos após média das triplicatas.
75
200
A
(mAbs)
2
1
0
2000
60 min
2
B
Figura 4. Perfis cromatográficos
(CLAE) do extrato bruto (A), extrato
acetato de etila (B) e butanólico (C)
de Alpinia purpurata. Substâncias
3
1
4
identificadas em comparação com
0
200
padrões e coinjeção: (2) rutina e (4)
C
kaempferol-3-O-glicuronídeo,
2
254
nm.
3
1
4
0
20
40 min
Os resultados mostram a presença dos flavonóides rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo,
importantes como substâncias biologicamente ativas, sugerindo que a espécie A. purpurata
apresenta também um potencial medicinal.
76
2.3. Elucidação estrutural de flavonóide da espécie Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum
utilizando técnicas de ressonância magnética nuclear
Resumo
A investigação de flavonóides na espécie A. purpurata (Zingiberaceae) foi pela primeira
vez realizada a partir do extrato hidroalcóolico do qual foi isolado o flavonóide rutina, inédito
nesta espécie. Este flavonóide é bastante conhecido por suas propriedades farmacológicas, tais
como antioxidante, antiinflamatória e protetora gastrintestinal. A rutina foi identificada por RMN
1
13
H e RMN
C e determinada por co-injeção com o padrão de rutina em CCD e CLAE/UV. A
identificação deste flavonóide traz novas perspectivas de uso medicinal de A. purpurata e
contribui para explicação de seus efeitos fitoterapêuticos.
Palavras-chave: flavonóide, quercetina-3-O-β-rutinosídeo, Zingiberaceae.
Introdução
O
gênero
Alpinia
(superordem: Zingiberiflorae,
ordem:
Zingiberales,
família:
Zingiberaceae, subfamília: Alpinioideae, tribo: Alpinieae,) é o maior e mais amplo da família,
compreende cerca de 230 espécies presentes em várias regiões tropicais e subtropicais (Kress et
al., 2002; Kress et al., 2005). O principal uso da espécie Alpinia purpurata (Vieill.) K. Schum.
está relacionado ao seu potencial ornamental (Kress et al., 2005). Poucas são as referências de
uso medicinal da espécie A. purpurata (Bermudez & Veláquez, 2002). No entanto, foi verificada
por cromatografia líquida de alta eficiência a presença de flavonóides já relatados por serem
importantes indicadores de atividade terapêutica para problemas cardiovasculares (Victório et al.,
2007, Mpalantinos et al., 1998). Quimicamente, os flavonóides são considerados bons
77
marcadores taxonômicos da família Zingiberaceae e a análise de sua estrutura química e seus
mecanismos de metilação e glicolisação já foram utilizadas em estudos de quimiossistemática da
família. A partir destes estudos feitos por Pugialli et al., 1993, a família Zingiberaceae foi
posicionada em um nível mais elevado dentro da superordem Zingiberiflorae.
Além dos flavonóides o gênero Alpinia é também rico em terpenóides, kava-pironas,
alcalóides, quinóides, taninos (Itokawa et al., 1981; Pugialli et al., 1993; Xu et al, 1996;
Mpalantinos et al., 1998; Fang et al., 2003; Elzaawely et al., 2007).
Tendo em vista a importância farmacologia e química dos flavonóides, este trabalho teve
como objetivo verificar a presença de flavonóides em extratos hidrooalcóolicos de A. purpurata.
Material e Métodos
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A análise em CLAE foi realizada utilizando aparelho Shimadzu SPD-M10A, equipado
com bomba LC-10AD e detector CBM-10A. A separação foi feita em coluna de fase reversa
(Lichrosorb RP-18,25 cm x 5 mm), temperatura ambiente, com o seguinte sistema de eluição:
água ultrapura (Milli-Q) com 0,1% de ácido fosfórico (v/v) (solvente A) e metanol (solvente B):
1-10 min (30% de B); 20 min (40% de B); 60 min (100% de B), leitura a 254 nm e 360 nm, fluxo
1 mL/min.
Ressonância magnética nuclear (RMN)
Os espectros de RMN de hidrogênio (RMN 1H) e carbono (RMN 13C) foram registrados
em espectrômetros Bruker (400 MHz e 100 MHz, respectivamente), com os solventes deuterados,
utilizando-se o trimetilsilano (TMS) ou o próprio solvente como referência interna. Os
78
deslocamentos químicos (δ) foram expressos em unidades ppm e as constantes de acoplamento
(J) em Hertz (Hz).
Solventes e padrão
Os solventes utilizados para CLAE possuíam grau técnico para CLAE, oriundos do grupo
Tedia e água Milli-Q. O padrão de rutina foi obtido comercialmente da Merck.
Material Vegetal
O material vegetal estudado foi obtido no pátio do Instituto de Biofísica (IBCCF),
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. A identificação botânica da espécie foi
feita no Herbário do Jardim Botânico do Rio de Janeiro, onde um exemplar se encontra sob o
número RB 433484.
Obtenção do extrato e fracionamento
As folhas (1 kg) coletadas em janeiro de 2006 foram secas em estufa a 50oC por 3 dias.
As folhas secas foram trituradas e submetidas ao processo de extração por maceração em etanol a
70% durante 15 dias. Repetidas extrações foram feitas até a exaustão do material vegetal. O
extrato bruto foi levado à secura por evaporação do solvente em evaporador rotatório. O material
seco foi pesado e suspenso em metanol e água destilada (9:1) e submetido a partições líquidolíquido com polaridade crescente de solventes tal como hexano, diclorometano, acetato de etila e
n-butanol. A partição hexânica foi obtida e o resíduo aquoso que contém metanol foi evaporado,
em evaporador rotatório, para retirada do metanol; este resíduo foi suspenso em água e submetido
79
a partição líquido-líquido com diclorometano, acetato de etila e butanol. A cada partição com os
solventes, o resíduo aquoso foi particionado por 5 vezes com 50 a 60 mL do respectivo solvente.
Todas as frações foram analisadas através da CLAE.
A partição butanólica foi submetida a fracionamento em coluna de SEPHADEX LH-20
(Aldrich, 80 cm/3 cm) utilizando como fase móvel o sistema de solvente metanol e água destilada
(1:1), para separação dos flavonóides (Figura 1). Foram obtidas cerca de 50 frações e algumas
destas, por não estarem puras, foram novamente submetidas a fracionamento em coluna de
SEPHADEX (80 cm/2 cm) utilizando metanol como fase móvel, para melhor purificação dos
flavonóides observados por CCD em cada fração. Os flavonóides isolados foram visualizados em
cromatofolha (sílica gel 60 F254 nm), utilizando o sistema de eluente composto por acetato de etila,
ácido fórmico e água destilada (65/15/20, v/v/v) e reveladas borrifando-se a cromatofolha com o
reagente 2-aminoetilfenilborato (1 mg/mL em etanol, Spectrum®) e polietilenoglicol 4000 (5%
em etanol, Fluka®).
O flavonóide isolado foi identificado utilizando-se as técnicas de ressonância magnética
nuclear de hidrogênio e carbono treze e comparação com os dados da literatura.
80
Folhas secas
1009 g
70% etanol
Resíduo
Extrato bruto
112,5 g
59,4 g
9:1 (metanol:H2O)
Hexano
Resíduo hidro-alcoólico
Partição em
hexano
4,12 g
Dicloromentano
Resíduo aquoso
Partição em diclorometano
0,29 g
Acetato de etila
Partição em acetato de etila
0,31 g
Resíduo aquoso
Rutina
23 mg
Partição em butanol
4,79 g
Butanol
Resíduo aquoso
Figura 1. Esquema de fracionamento químico do extrato hidroalcoólico de Alpinia purpurata
Resultados e Discussão
A substância codificada como AP29(4) (Figura 2) apresenta um perfil de ultravioleta,
obtido por CLAE, característico de flavonóides (259 e 359 nm), sendo a banda I a 359 nm,
indicativa de um flavonol com a hidroxila na posição 3 substituída (Mabry et al. 1970). O
81
espectro de RMN 1H apresenta sinais de hidrogênios aromáticos, sendo um dubleto a 6,17 ppm
acoplando com outro dubleto a 6,35 ppm com uma constante de acoplamento de 1,84 Hz
característicos de hidrogênios do anel A de flavonóides. O sinal de hidrogênio aromático a 7,62
ppm, um duplo dubleto (J= 2 e 8,44 Hz), acoplando com o dubletos a 7,66 ppm (J= 1,96 Hz) e
6,86 ppm (J= 8,4 Hz) são característicos de hidrogênios do anel B de flavonóides. Além destes
sinais, o dubleto em 5,07 ppm (J= 7,6 Hz) evidencia a presença da glicose na estrutura, o singleto
a 4,5 ppm juntamente com o dubleto a 1,11ppm (J= 6,2 ppm) evidencia a presença da ramnose e
os multipletos na região de 3 a 4ppm representam os sinais dos demais hidrogênios de ambas as
hexoses. A comparação dos dados de RMN 1H e de
13
C com os da literatura comprovam que a
referida substância trata-se da rutina (Markham, 1976; Mpalantinos, 2001) (Tabela 1). A coinjeção da substância AP29(4) com o padrão de rutina em CLAE/UV e a aplicação conjunta em
CCD (Rf = 0,35) evidenciou tratarem-se da mesma substância, confirmando-se assim as
informações espectrométricas obtidas.
Figura 2. Estrutura química da rutina - AP29(4).
82
Tabela 1. Comparação dos valores obtidos de RMN 1H e de
13
C (400 e 100 MHz) obtidos para
AP29(4) com os valores da literatura para rutina (Markham, 1976).
Numeração
AP29(4) (MeOD)
1
H (ppm)
AP29(4) (MeOD)
13
C (ppm)
RUTINA (DMSO)
13
C (ppm)
2
158,6
156,4
3
135,6
133,6
4
179,2
177,4
5
159,2
156,6
100,5
98,8
167,6
164,0
95,2
93,6
9
162,9
161,2
10
105,2
105,2
1´
123,6
121,6
117,6
115,3
3´
145,9
144,6
4´
149,9
148,3
6
6,17 (d; J= 1,84 Hz)
7
8
2´
6,35 (d; J= 1,,88 Hz)
7,66 (d; J= 1,96 Hz)
5´
6,86 (d; J= 8,4 Hz)
116,1
116,5
6´
7,62 (dd; J= 2 e 8,44 Hz)
123,1
121,6
Glc1
5,07 (d; J= 7,6 Hz)
104,9
103,4
2
3,44 (m)
75,7
75,3
3
3,40 (m)
78,2
77,4
4
3,27 (m)
72,1
71,1
5
3,28 (m)
77,2
76,6
6
3,80 (d; J= 10,4 Hz)
68,6
68,7
Ram1
4,5 (s)
102,4
102,0
2
3,63(m)
71,4
71,5
3
3,54 (dd; J= 9,48 e 3,36 Hz)
72,2
71,7
4
3,27 (m)
73,9
73,2
5
3,40 (m)
69,7
69,7
6
1,11 (d; J= 6,2 ppm)
17,9
18,6
* Espectros pág. 184 e 185 (Anexo A e B).
83
A rutina, quercetina-3-O-β-rutinosídeo, já foi isolada na espécie A. zerumbet (Mpalantinos
2001), mas pela primeira vez está sendo verificada para espécie A. purpurata. Entre as
propriedades terapêuticas, a rutina possui ação antioxidante, antiinflamatória, mostrou ser
protetora gastrintestinal e atua contra a isquemia cerebral (Rodrigues et al., 2003; Selloum et al.,
2003; Pu et al., 2007). A presença de rutina na espécie A. purpurata contribui para o
conhecimento químico e uso medicinal desta planta.
84
Capítulo 3
Produção de metabólitos especiais em culturas organogênicas de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et
Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
3.1. Flavonóides produzidos por plantas in vitro de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith
Resumo
Plantas de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith foram cultivadas in vitro, sob ação de
reguladores de crescimento vegetal AIA, TDZ e BAP. A capacidade de produzir rutina,
kaempferol-3-O-glicuronídeo e kaempferol-3-O-rutinosídeo foi avaliada entre 3 a 4 meses de
cultivo in vitro. As plantas cultivadas em TDZ apresentaram raízes e brotos curtos. O
enraizamento foi de 100% para todos os tratamentos. Poucas foram as variações quanto a
morfogênese e desenvolvimento entre os reguladores usados. A concentração relativa de fenóis
foi maior para os extratos de plantas oriundas do meio controle (100%), em relação aos outros
tratamentos in vitro e as plantas de campo (80%). A produção de rutina foi mais pronunciada em
relação aos outros flavonóides, para todos os tratamentos in vitro. A combinação AIA + TDZ
induziu maior produção de rutina (0,072 mg.g
-1
folha seca) e kaempferol-3-O-glicuronídeo
(0,029 mg.g -1 folha seca). O aumento da concentração de fenóis totais não correspondeu a maior
concentração de flavonóides, indicando que outras substâncias fenólicas foram estimuladas em
culturas in vitro de A. zerumbet.
Palavras-chave: cultivo in vitro, Folin-Ciocalteau, rutina, substâncias fenólicas, kaempferol-3-Oglicuronídeo, Zingiberaceae
85
Introdução
Os metabólitos especiais são produtos resultantes da adaptação das plantas ao meio
ambiente, estão relacionados à proteção da planta contra infecção por microorganismos
patogênicos, pragas e radiação ultravioleta (Macías et al., 2007). A diversidade destes
metabólitos compõe uma gama de alternativas terapêuticas oferecida pelas plantas medicinais que
por séculos são utilizadas e investigadas (Gurib-Fakim, 2006). Várias substâncias derivadas de
plantas são atualmente utilizadas na produção de medicamentos, cosméticos e produtos agrícolas
(Bourgaud et al., 2001; Rao & Ravishankar, 2002).
Apesar dos avanços na área de síntese química, muitos substâncias são de difícil obtenção
o que torna a produção in vitro uma metodologia vantajosa, pois independe das condições
ambientais e pode dispor de matéria-prima vegetal continuamente (Rao & Ravishankar, 2002). O
estabelecimento de um sistema in vitro para as espécies medicinais possibilita a manipulação de
vários fatores físicos e químicos que podem influenciar na produção dos metabólitos secundários,
mantendo condições padronizadas de cultivo (Collin, 2001; Rao & Ravishankar, 2002; Canter et
al., 2005).
A espécie Alpinia zerumbet é tradicionalmente utilizada em várias regiões tropicais e
subtropicais por suas propriedades medicinais e aromáticas (Zoghbi et al., 1999; Kress et al.,
2002). Esta espécie dispõe de importantes metabólitos especiais: taninos, kavalactonas,
terpenóides e flavonóides, constituindo um potente recurso natural para uso terapêutico
(Mpalantinos et al., 1998; Kuster et al., 1999; Albuquerque & Neves, 2004; Yoda & Yamakawa,
2006).
Em vários estudos, as auxinas e citocininas influenciaram a produção de metabólitos
secundários em culturas de tecidos (Piñol et al, 1985; Palazón et al., 1995; Sudriá et al., 1999;
Affonso et al., 2007). Estas substâncias reguladoras do crescimento vegetal quando em contato
86
com receptores da célula desencadeiam as respostas de diferenciação e desenvolvimento vegetal,
com conseqüências nas vias do metabolismo secundário (McSteen & Zhao, 2008). Este trabalho
teve como objetivo avaliar a produção de flavonóides em plantas in vitro de A. zerumbet
cultivada sob diferentes reguladores de crescimento vegetal.
Material e Métodos
Material vegetal
O exemplar de Alpinia zerumbet foi obtido na área externa da Universidade Federal do
Rio de Janeiro (CCS - bloco H), identificado e depositado no Herbário do Jardim Botânico (RB)
do Rio de Janeiro, sob o número RB 433485.
Condições de cultivo in vitro
As culturas foram iniciadas a partir de brotos do rizoma. As plantas foram introduzidas
em vidros (16 x 8 cm) contendo meio líquido MS (Murashige & Skoog, 1962), acrescido de 30
g.L-1 de sacarose, vitaminas (tiamina-HCl 1,3 µM, piridoxina 3 µM e ácido nicotínico 4,1 µM),
mio-inositol 0,6 mM, sendo o pH ajustado para 5,8. Depois do estabelecimento das culturas, as
plantas foram subcultivadas em diferentes meios com reguladores de crescimento vegetal: MS0
(controle); AIA - ácido indolacético (2 mg.L-1); TDZ - tidiazuron (2, 4 e 8 mg.L-1,
respectivamente); BAP - 6-benzilaminopurina (2 mg.L-1); AIA 2 + TDZ 2 (2 mg.L-1 cada) e AIA
2 + BAP 2 (2 mg.L-1 cada). As culturas foram mantidas em sala de crescimento a 25 ± 2ºC, sob
intensidade luminosa de 23 µmol.m-2.s-1, fornecidas por lâmpadas fluorescentes tubulares (20 W
T–12, General Electric®), e fotoperíodo de 16 h. Com 3 meses, as plantas foram avaliadas quanto
ao número de brotos, altura dos brotos, número de folhas e enraizamento.
87
Extração por ultrassom
Folhas secas e trituradas (2 g) foram misturadas em etanol 70% e tratadas em banho de
ultrassom na freqüência ultra-sônica de 40 kHz, por 45 min (60oC), em cuba de ultrassom
(Thornton Unique, modelo 1400 USC, 120 W). Os experimentos foram realizados em triplicata.
A metodologia de extração utilizada nestes experimentos foi avaliada quanto a eficiência e
rapidez (ver Item 2.1).
Determinação de fenóis totais
A quantificação de fenólicos foi realizada pelo método de Folin-Ciocalteau. Os extratos
hidrooalcólicos das plantas de campo e in vitro foram dissolvidos a 70% de etanol na
concentração de 1 mg.mL-1. Foi utilizada uma alíquota de 0,5 mL da solução do extrato bruto, na
qual foi adicionada 2 mL de solução aquosa de Folin-Ciocalteau a 10% e, após 3 min, 2 mL de
solução aquosa de carbonato de sódio a 7,5%. A mistura foi homogeneizada e incubada por
30min em banho-maria a 50ºC. Posteriormente, a absorvância foi medida em espectrofotômetro
Shimadzu 1601, usando-se os controles: (1) Folin-Ciocalteau + carbonato de sódio e (2) solução
do extrato bruto. A leitura das absorvâncias foi feita no espectrofotômetro a 740 nm. A
quantificação foi feita por meio de uma curva analítica preparada com ácido gálico (Riedel-deHaen): y = 0,0229x + 0,0968, R2 = 0,9993, onde y é a absorvância e x a concentração em µg
equivalentes de ácido gálico (EAG) por mg de extrato bruto. Os valores foram expressos em %,
considerando o meio MS0 (controle) 100%. Todas as avaliações forma feitas em triplicatas.
Padrões de flavonóides
88
Os flavonóides foram verificados utilizando os seguintes padrões: kaempferol-3-Oglicuronídeo (82% pureza), kaempferol-3-O-rutinosídeo (91% pureza) e rutina (98% pureza). Os
flavonóides da classe do kaempferol foram isolados da espécie Alpinia zerumbet Roxb. e
identificados por RMN (Mpalantinos et al., 1998), a rutina foi obtida comercialmente da Merck.
Análise por cromatografia de Camada Delgada (CCD)
A CCD foi feita para verificação prévia da presença de flavonóides nos extratos. Uma
alíquota da fração foi aplicada em cromatofolha de alumínio (sílica gel 60/20x20 F254 nm Merck®)
e eluídas em acetato de etila, ácido fórmico e água (65/20/15, v/v/v). A verificação das bandas
indicativas da presença de flavonóides, na cromatofolha, foi observada sob luz UV 254 e 366 nm
(Upland/USA modelo UVGL-58, 115-60 Hz, 0,16 amps) e reveladas por NP (C14H16BNO -2aminoetilfenilborato, 1 mg/mL em etanol, Spectrum®) seguido de PEG (polietilenoglicol 4000,
5% em etanol, Fluka®). A presença dos flavonóides rutina, kaempferol-3-O-rutinosídeo e
kaempferol-3-O-glicuronídeo foi verificada nos extratos, através da corrida concomitante com os
padrões.
Solventes e Reagentes
Os solventes utilizados possuíam grau técnico para CLAE, Tedia. Outros solventes
utilizados na extração e suspensão do material tinham grau analítico (P.A.). A água utilizada foi
purificada pelo sistema Milli-Q.
Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
89
Os extratos hidroalcóolicos (70% etanol) obtidos a partir das folhas de A. zerumbet por
extração em ultrassom (45 min) foram filtrados a vácuo e suspensos em metanol e água
desionizada (70% metanol), na concentração de 50 mg.mL-1 para injeção em aparelho de CLAE.
A análise em CLAE acoplada ao detector de feixes fotodiodos foi realizada utilizando
aparelho Shimadzu equipado com bomba LC-10AD e detector SPD-M10A. A separação foi feita
em coluna de fase reversa C18 (Lichrosorb-RP-18, S5-100-ODC) (25 cm x 4,6 nm), contendo
sílica do tipo octadecil silicato de 5 µm de 100 Å como fase fixa, a temperatura ambiente. A fase
móvel foi água ultrapura (Milli-Q) com 0,1% de ácido fosfórico 85% (v/v) (solvente A) e
metanol (solvente B): 1-10 min (30%); 20 min (40%); 60 min (100%) de B, fluxo de 1.0 mL/min,
leitura a 254 nm e 360 nm. Os flavonóides foram detectados através dos seus tempos de retenção
(TR), espectro ultravioleta em comparação com os espectros dos padrões de flavonóides e pela
co-injeção com amostras autênticas (Anexo C, pág. 186). Para co-injeção, foi preparada uma
mistura (1:1, v/v) do extrato a 50 mg.mL-1 e de cada padrão, em separado, a 1 mg.mL-1.
Os padrões foram diluídos a 70% de metanol na concentração de 1 mg.mL-1 e analisados
no mesmo sistema de eluição para CLAE. Diferentes concentrações dos padrões foram injetadas
para construção da curva analítica e avaliação quantitativa dos flavonóides. As injeções foram
feitas em triplicatas. A concentração destes flavonóides nas amostras foi obtida, após cálculo de
dispersão dado pela curva y = ax - b, onde y representa a área do sinal e x a respectiva
concentração em mg.mL-1.
Análises Estatísticas
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as comparações
estatísticas entre as médias foram feitas utilizando o teste de Tukey, considerando p<0,05, no
programa Graph Pad Instat 3.0 para Windows®.
90
Resultados e Discussão
As vias do metabolismo secundário são integradas ao desenvolvimento vegetal
(Hartmann, 1996). A máxima produção de metabólitos secundários ocorre no estágio final do
crescimento vegetal, no qual o carboidrato e o nitrogênio são redirecionados para biossíntese dos
metabólitos secundários (Collin, 2001; Lisiewska et al., 2006). Em vista disto, plantas entre 3 e 4
meses de cultivo in vitro, estágio caracterizado por contínua produção e alongamento de brotos e
aumento no número de folhas e raízes (Figura 1, Tabela 1), foram utilizadas para os ensaios
fitoquímicos.
14
tam an h o b ro to (cm )
12
A
B
10
8
6
4
2
0
mês 1
mês 2
mês 3
mês 4
Figura 1. A - Estágios de crescimento in vitro de Alpinia zerumbet em meio MS0. B - Plantas in
vitro no tratamento acrescido de AIA 2 mg.L-1, com 3 meses. Barra = 1 cm.
As respostas morfogênicas das plantas de A. zerumbet são mostradas na Tabela 1.
Plantas oriundas do meio com 2 mg.mL-1 TDZ apresentaram raízes e brotos curtos,
características já mencionadas por Davies (1990) como resposta ao TDZ. A porcentagem de
enraizamento atingiu 100% para todos os tratamentos o que possibilita maior sucesso no processo
91
de aclimatação. A adição de citocininas ao meio não surtiu efeito na indução de novos brotos em
relação ao controle. Poucas foram as variações morfológicas in vitro, em relação as brotações,
folhas e raízes. Embora o TDZ e BAP mostrem efeitos significativos para o aumento de
brotações em várias culturas in vitro (Murthy et al., 1998; Singh et al., 2003; Peddaboina et al.,
2006).
Tabela 1. Efeito dos reguladores de crescimento no desenvolvimento in vitro de Alpinia
zerumbet, com 3 meses.
Reguladores
controle
Número brotos
2,8±0,2ab
ab
Altura brotos
(cm)
5,1±0,3 a
ac
Raiz (%)
2,2±0,1 b
100
ab
100
AIA 2
3,0±0,7
TDZ 2
3,0±0,4 ab
2,9±0,1 c
3,2±0,2 ab
100
TDZ 4
3,1±0,5
ab
ac
ab
100
TDZ 8
3,7±0,4 a
3,8±0,2 bc
3,4±0,1 ab
100
BAP 2
2,0±0,2
b
b
a
100
AIA 2 + TDZ 2
3,0±0,2 a
4,2±0,3 ac
3,3±0,1 ab
100
AIA 2 + BAP 2
ab
ac
ab
100
3,0±0,2
5,2±0,5
Número folhas
4,1±0,4
4,3±0,2
4,1±0,1
3,6±0,2
3,2±0,1
2,9±0,1
3,3±0,1
n ≥ 30. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas, p<0,05, Tukey.
A metodologia de CCD não foi favorável na detecção qualitativa do kaempferol-3-Oglicuronídeo e kaempferol-3-O-rutinosídeo em plantas in vitro, somente a rutina (Rf= 0,69) foi
observada por CCD.
Entre os fenóis totais apresentados na Tabela 2, parte se deve a presença dos flavonóides
rutina, kaempferol-3-O-glicuronídeo e kaempferol-3-O-rutinosídeo detectados por CLAE (Figura
2). Este é a primeira referência quanto à presença destes flavonóides em sistemas in vitro. Os
flavonóides representam o grupo com maior diversidade e distribuição entre as substâncias
fenólicas de ocorrência vegetal (Miliauskas et al., 2004). Estes flavonóides estão relacionados à
92
ação terapêutica da espécie contra doenças cardiovasculares (Mpalantinos et al., 1998; Stanely &
Karthick, 2007). A alta concentração de fenóis totais obtida para as plantas cultivadas em meio
MS0 está relacionada ao aumento de outras substâncias fenólicas, além dos flavonóides. Os
fenóis estão relacionados a várias atividades terapêuticas: antioxidante, antimutagênica,
antihipertensiva, anti-hemorrágica e antiviral (Takahama & Oniki, 2000; Konczak-Islam et al.,
2003).
Condições de estresse para a planta induzem respostas no aumento de metabólitos
secundários (Bourgaud et al., 2001). A produção de substâncias fenólicas foi maior na condição
in vitro, meio controle (MS0) (Tabela 2). O tratamento com AIA 2 mostrou 39,2% de fenóis
totais em relação ao controle (100%). Collin (2001) relata que algumas auxinas parecem agir
inibindo as vias de produção de metabólitos secundários. Não houve linearidade entre a produção
de fenóis totais e flavonóides para as plantas in vitro. A produção de flavonóides in vitro foi
reduzida em relação à planta de campo (Tabela 2), sugerindo que outras substâncias fenólicas
como os taninos e terpenos foram responsáveis pelo aumento dos fenóis totais em plantas in
vitro.
Vários fatores influenciam a produção de metabólitos secundários: origem geográfica,
condições climáticas, período do ano, etc. (Miliauskas et al., 2004). Para as plantas in vitro, a
origem e condição fisiológica do material vegetal introduzido in vitro é um dos principais fatores
que alteram as respostas das culturas, visto que as condições de cultivo são padronizadas e
passíveis de serem reproduzidas.
93
Tabela 2. Conteúdo de flavonóides obtido por CLAE em extratos hidroalcóolicos de folhas de Alpinia zerumbet cultivadas no campo e
in vitro (3-4 meses).
In vitro (µg.g -1 folha seca)
Campo
Substâncias
fenólicas
Rutina
(mg.g -1
MS0
folha seca)
(controle)
AIA 2
TDZ 2
TDZ 4
TDZ 8
BAP 2
AIA 2
AIA 2
TDZ 2
BAP 2
5,65*
6,6 ± 0,8*
16,5 ± 0,9*
8,2 ± 0,6*
5,6 ± 0,3*
4,4 ± 1,3*
10,9 ± 1,3*
83,2± 18*
6,6 ± 0,7*
2,57
11,2 ± 4,0
12,5 ± 0,7**
18,1 ± 0,5**▲
13,5 ± 1,8**
8,0± 0,6
17,1± 0,1**▲
29,0± 1,0 *
4,0 ± 0,8
1,74
22,0 ± 1,5
24,1 ± 0,7
23,1 ± 1,2
18,4 ± 1,0
14,3 ± 1,6■
25,2 ± 1,6
27,0± 5,1
17,4 ± 0,1■
87
100
39,2
49,1
51,6
50,9
52,2
65,4
n.d.
y = 3.10-7 x – 31152
Kaempferol glicuronídeo
y = 1.10-7 x – 51000
Kaempferol rutinosídeo
y = 2.10-7 x – 235371
Fenóis totais (%)
Valores representam a média ± DP, n= 3, Tukey: * p< 0,001, indica diferenças estatísticas em relação a AIA 2 + TDZ 2. ** p<0,05, indica
diferenças estatísticas em relação a AIA 2 + BAP 2. ▲ p < 0,05, indica diferenças estatísticas em relação a TDZ 8. ■ p< 0,05, indica diferenças
estatísticas em relação a AIA 2 + TDZ 2. Para a avaliação estatística foi considerado cada flavonóide em separado. n.d. – não determinado.
94
tempo de retenção (min)
Figura 2. Perfis cromatográficos (CLAE) das plantas in vitro de Alpinia zerumbet. A. MS0, B.
AIA 2 + TDZ 2, C. TDZ 8, D. AIA 2. 1. rutina, 2. kaempferol-3-O-rutinosídeo e 3. kaempferol-3O-glicuronídeo.
95
O perfil cromatográfico das plantas in vitro revelou a presença de 10 substâncias, sendo
os sinais 1, 2 e 3 referentes aos flavonóides rutina, kaempferol-3-O-glicuronídeo e kaempferol-3O-rutinosídeo (Figura 2). Os sinais que apresentaram maior variação conforme o tratamento com
reguladores de crescimento estão mostrados como 4, 5 e 6 (Figura 2 e 3) e não foram possíveis de
serem identificados. Por comparação do espectro UV existe uma indicação quanto ao sinal 4, que
poderia ser a substância 5,6-desidrokavaína, comprimento de onda a 214, 259 e 344 nm, uma
kavalactona já isolada e identificada em extratos de A. zerumbet por Mpalantinos (2001) (Figura
3). As kavalactonas são importantes na terapêutica por agirem no Sistema Nervoso Central,
atuando como sedativas, calmantes, analgésica, anticonvulsivante e antidepressivas (Whitton et
al., 2003; Cass, 2004; Bilia et al., 2004).
214 (nm)
TR
259
47.4
344
216 (nm)
285
346
TR
49.58
214 (nm)
346
TR
51.77
Figura 3. Espectros de UV (CLAE) dos sinais 4, 5 e 6 e seus respectivos tempos de retenção (TR)
referidos no cromatograma (Figura 2), de plantas in vitro de Alpinia zerumbet.
Os flavonóides agem como modulador endógeno das auxinas: podem inibir o transporte
polar das auxinas com conseqüente acúmulo destas em certas regiões da planta (Brown et al.,
2001). Em alguns casos, o acúmulo de auxina pode induzir a síntese de flavonóides (Peer &
96
Murphy, 2007). As auxinas, por outro lado, interferem no tipo de proteína produzida antes ou
logo no início do crescimento vegetal, alterando o padrão enzimático e consequentemente os
níveis de algumas substâncias em plantas (Silva et al., 2005). O aumento da concentração de
rutina nos tratamentos com AIA 2 e AIA 2 + TDZ 2 pode estar relacionado à interação entre os
flavonóides, auxinas e citocininas. A combinação da auxina AIA com a citocinina TDZ aumentou
em 342% a concentração de rutina em relação ao meio contendo a auxina AIA isolada. Estudos
mostram a ação de auxinas naturais e sintéticas no aumento de flavonóides, sugere-se que as
auxinas interagem com a enzima flavonóide 3-O-glicosiltransferase, integrante da via sintética
dos flavonóides que participa da etapa de glicolisação (Kokubo et al., 2001).
Baixa concentração de TDZ (2 mg.mL-1) induziu maior ou igual produção de flavonóides
em relação as concentrações 4 e 8 mg.mL-1. Não há citações sobre a influência de TDZ na
produção de metabólitos secundários, mas esta citocinina potencializa a morfogênese in vitro de
várias culturas com aumento considerável no número de brotos (Venkataiah et al., 2003;
Malabadi et al., 2004), já outras citocininas como zeatina e BAP induziram aumento de
antocianinas e são sugeridas por influenciarem etapas das vias secundárias (Collin, 2001).
A atuação de auxinas e citocininas na produção de metabólitos secundários está
relacionada a interação com enzimas da rota biossintética do metabolismo secundário, como a
fenilalanina amônialiase, geranil transferase e chalcona sintase (Yang, 2003). As repostas obtidas
pelo uso de estimuladores nas culturas também se devem a origem do material, as condições
físicas estabelecidas, concentração e tipo de estimulador (Sugiyama, 1999; Rao & Ravishankar,
2002).
97
Conclusão
Não foi verificada correlação entre produção de fenóis totais em A. zerumbet e aumento
no conteúdo de flavonóides, podendo indicar o aumento de outras substâncias fenólicas.
A produção de rutina foi significantemente influenciada pela combinação de AIA e TDZ.
Os reguladores de crescimento vegetal induziram respostas diferenciadas na produção de
flavonóides, no entanto a concentração relativa foi menor para todos os tratamentos in vitro em
relação aos extratos obtidos de plantas de campo.
Este trabalho contribui para a avaliação dos efeitos das citocininas da classe das
feniluréias como o TDZ no metabolismo secundário, ainda escassos.
98
3.2 Produção de rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo em plantas in vitro de Alpinia
purpurata (Vieill) K. Schum
Resumo
O acúmulo de rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo foi avaliada em culturas
organogênicas de Alpinia purpurata. Por 3 a 4 meses as plantas foram mantidas em meio MS
(Murashige & Skoog) suplementado com diferentes reguladores de crescimento vegetal: MS
(controle), TDZ (2 e 4 mg.L-1); BAP 2 (2 mg.L-1) e AIA 2 + TDZ 2 (2 mg.L-1 cada). O meio
líquido foi mais propício para multiplicação das culturas. O uso de TDZ (4 mg.L-1) e BAP (2
mg.L-1) produziu plantas com menor número de folhas e tamanho da lâmina foliar. A
concentração relativa de kaempferol-3-O-glicuronídeo foi maior que a de rutina para todos os
tratamentos in vitro, com exceção do meio controle no qual as plantas não produziram
kaempferol-3-O-glicuronídeo. Aumento significativo de kaempferol-3-O-glicuronídeo foi
verificado para os tratamentos BAP 2 (0,030 mg.100 mg-1 extrato seco) e AIA 2 + TDZ 2 (0,030
mg.100 mg-1 extrato seco). Com a adição de 2 mg.L-1 de BAP, a concentração de rutina também
aumentou na proporção de 1:4. Os resultados mostraram que a manipulação de sistema in vitro
com reguladores de crescimento vegetal interfere na produção de flavonóides em A. purpurata.
Estes dados trazem perspectivas para o estudo fisiológico e biotecnológico da produção de
metabólitos secundários.
Palavras-chave: cultura de tecidos, flavonoides, hormônio vegetal, Zingiberaceae.
99
Introdução
O sistema de organogênese direta in vitro permite a propagação de plantas selecionadas,
uniformes, de forma contínua, sendo uma fonte constante de biomassa (Rao & Ravishankar,
2002).
A produção de metabólitos secundários em sistemas de cultura de tecidos vegetais oferece
a vantagem da produção independente das condições ambientais e dos diferentes estágios de
desenvolvimento do vegetal, evitando também riscos futuros ao meio ambiente por conseqüência
do extrativismo (Collin, 2001; Canter et al., 2005).
A produção de metabólitos secundários varia conforme a composição do meio de cultura:
substâncias inorgânicas, carboidratos e reguladores de crescimento vegetal; e os estágios de
crescimento da cultura (Collin, 2001). O uso de reguladores de crescimento vegetal é muito
comum para se obter uma resposta adequada do desenvolvimento vegetal in vitro como maior
número de brotos, alongamento dos brotos e enraizamento (Gaspar et al., 1996; Sugiyama, 1999).
As interações hormonais regulam as respostas fisiológicas quanto ao desenvolvimento vegetal e
produção de metabólitos (Gaspar et al., 1996; Bais et al., 2001; Zhao et al., 2001). A habilidade
de manipular sistemas de cultivo in vitro pode ser de alto valor para produção de substâncias
biologicamente ativas (Pletsch, 1998; Konczak-Islam et al., 2003) e uma alternativa para
produção de metabólitos cuja síntese química é muito cara ou longa, tornando o processo inviável
(Collin, 2001).
A espécie A. purpurata possui poucas referências medicinais. É utilizada no tratamento
das vias respiratórias (Bermudez & Velazquez, 2001). Estudos fitoquímicos da espécie
evidenciaram a presença dos flavonóides rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo (Victório, 2007),
metabólitos importantes no uso terapêutico (Havsteen, 2002; Yang et al., 2008). Os flavonóides
estão presentes em várias espécies de Alpinia e apresentam potencial terapêutico no tratamento de
100
doenças cardiovasculares (Pugialli et al., 1993; Mpalantinos et al., 1998). A produção de
flavonóides in vitro já foi obtida em culturas de tecidos vegetais (Kokubo et al., 2001; Thiem,
2003), mas este é a primeira evidência dos flavonóides rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo.
Com este trabalho teve-se o intuito de avaliar a produção de flavonóides em culturas in vitro de
A. purpurata sob influência de citocininas e auxinas.
Material e Métodos
Material vegetal
Amostra da planta matriz de Alpinia purpurata foi obtida no pátio do Instituto de
Biofísica (IBCCF), UFRJ, Município do Rio de Janeiro, identificada e depositada no Herbário do
Jardim Botânico do Rio de Janeiro sob o número RB 433484.
Cultivo in vitro
Plantas introduzidas in vitro, a partir de brotos florais, foram subcultivadas em meio MS
(Murashige & Skoog, 1962) sólido ou líquido, acrescido de 30 g.L-1 de sacarose, vitaminas
(tiamina HCl 1,3 µM, piridoxina 3 µM e ácido nicotínico 4,1 µM), e mio-inositol 0,6 mM, sendo
o pH ajustado para 5,8. A solidificação dos meios foi obtida pela adição de 7,8 g de agar. Foram
utilizados os reguladores de crescimento vegetal BAP (6-benzilaminopurina), TDZ (tidiazuron) e
AIA (ácido indolacético), isolados e em combinações: MS sólido (controle 1); MS líquido
(controle 2); AIA 2 (2 mg.L-1); TDZ 2 e TDZ 4 (2 e 4 mg.L-1, respectivamente); BAP 2 (2 mg.L1
); AIA 2 + TDZ 2 (2 mg.L-1 cada) e AIA 2 + BAP 2 (2 mg.L-1 cada). Os meios foram
esterilizados, em autoclave a 120o C, 1 kgf.cm-2, durante 15 min. As culturas foram mantidas em
sala de crescimento a 25 ± 2ºC, sob intensidade luminosa de 23 µmol.m-2.s-1, fornecidas por
lâmpadas fluorescentes tubulares, subcategoria Duramax Universal (20 W T–12) (General
101
Electric®) e fotoperíodo de 16 h. As plantas foram avaliadas quanto ao número de brotos,
tamanho dos brotos, número de gemas e tamanho da lâmina foliar.
Extração por ultrassom
Folhas foram retiradas de plantas in vitro com 3 a 4 meses e liofilizadas. A suspensão de
20 g folha seca/ 40 mL de etanol 70% foi sonicada na frequência ultrasônica de 40 kHz, por 45
min, em cuba de ultrassom (Thornton Unique, modelo 1400 USC, 120W para obtenção do
extrato. Foram feitas triplicatas para cada tratamento in vitro. Para verificar a concentração de
flavonóides foram investigados os extratos de plantas oriundas dos meios MS líquido (controle
2), BAP 2 e AIA 2 + TDZ 2. A metodologia de extração utilizada nestes experimentos foi
avaliada quanto a eficiência e rapidez (ver Item 2.1).
Análise por Cromatografia de Camada Delgada (CCD)
A CCD foi feita para verificação prévia da presença de flavonóides nos extratos. Uma
alíquota da fração foi aplicada em cromatofolha de alumínio (sílica gel 60/20x20 F254 nm Merck®)
e eluídas em acetato de etila, ácido fórmico e água (65/20/15, v/v/v). A verificação das bandas
indicativas da presença de flavonóides foi observada sob luz UV 254 nm (Upland/USA modelo
UVGL-58, 115-60 Hz, 0,16 amps). Os flavonóides foram revelados por NP (C14H16BNO -2aminoetilfenilborato, 1 mg/mL em etanol, Spectrum®) seguido de PEG (polietilenoglicol 4000,
5% em etanol, Fluka®). A presença dos flavonóides foi verificada nos extratos brutos, depois de
corrida concomitante com os padrões (Victório et al., 2007).
Solventes e Reagentes
Os solventes utilizados para CLAE possuíam grau técnico para CLAE, oriundos do grupo
Tedia. Outros solventes utilizados na extração e ressuspensão do material tinham grau analítico
102
(P.A.). A água utilizada para preparar os extratos foi destilada, e para as análises a água foi
purificada pelo sistema Milli-Q. O padrão kaempferol-3-O-glicuronídeo (82% pureza) foi obtido
a partir de isolamento de extratos de A. zerumbet e identificados por RMN (Mpalantinos et al.,
1998). A rutina (98% pureza) foi adquirida comercialmente da Merck.
Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Os extratos hidroalcoólicos (70% etanol) obtidos por extração em ultrassom (45 min), a
partir das folhas de plantas in vitro de A. purpurata, foram suspensos em metanol e água Milli-Q
(70% metanol), na concentração de 50mg.mL-1 e analisados pela metodologia de CLAE.
A análise em CLAE acoplada ao detector de feixes fotodiodos foi realizada utilizando
aparelho Shimadzu equipado com bomba LC-10AD e detector SPD-M10A. A separação foi feita
na coluna de fase reversa C18 (Lichrosorb-RP-18, S5-100-ODC, 25 cm x 4,6 nm), a temperatura
ambiente. A fase móvel foi água Milli-Q com 0,1% de ácido fosfórico 85% (v/v) (solvente A) e
metanol (solvente B). O gradiente de eluição foi o seguinte: 1-10 min (30%); 20 min (40%); 60
min (100%) de B, fluxo de 1.0 mL/min, leitura a 254 nm e 360 nm. Os flavonóides foram
detectados através dos seus tempos de retenção (TR), espectro ultravioleta em comparação com
os espectros dos padrões de flavonóides e pela co-injeção com amostras autênticas. Para coinjeção, foi preparada uma mistura (1:1) do extrato a 50 mg.mL-1 e de cada padrão, em separado,
a 1 mg.mL-1 .
Os padrões foram diluídos a 70% de metanol na concentração de 1 mg.mL-1 e analisados
no mesmo sistema de eluição. Diferentes concentrações dos padrões foram injetadas para
construção da curva analítica e avaliação quantitativa. As injeções foram feitas em triplicatas. As
curvas analíticas dos padrões de rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo foram obtidas a partir da
103
linearidade entre as concentrações (0,0078 - 0,0625 mg.mL-1) e (0,01325 - 0,25 mg.mL-1),
respectivamente. A concentração destes flavonóides nas amostras foi obtida, após cálculo de
dispersão dado pela curva y = ax - b, onde y representa a área do sinal e x a respectiva
concentração em mg.mL-1.
Análises Estatísticas
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as comparações
estatísticas entre as médias foram feitas utilizando o teste de Dunnett, considerando todos os
valores de p<0,05, utilizando o programa Graph Pad Instat 3.0 para Windows®.
Resultados
Desenvolvimento das culturas in vitro
Os dados do desenvolvimento das culturas in vitro estão na Figura 1.
O meio líquido (controle 2) foi mais propício para multiplicação propagativa (Figura 1-I).
No entanto, maior alongamento dos brotos foi verificado no meio sólido (controle 1) (Figura 1II). A menor concentração de TDZ (2 mg.L-1) produziu o maior número de brotos em relação aos
outros tratamentos, no entanto não diferiu de forma significativa do controle 2.
Os meios contendo as citocininas TDZ (4 mg.L-1) e BAP (2 mg.L-1) produziram menor
quantidade de material vegetal, devido a redução no número de folhas e tamanho da lâmina foliar
(Figura 1-III e IV). As combinações de AIA com TDZ e BAP, em separado, favoreceram o
aumento no número de folhas (Figura 1-III).
104
5
**
** **
1 .0
**
0 .5
AIA 2+ BAP 2
AIA 2 + TDZ 2
BAP 2
TDZ 4
TDZ 2
AIA 2
MS0 líquido
0 .0
*
#
**
**
4
** ***
3
**
***
2
1
0
AIA 2+ BAP 2
**
**
altura dos brotos (cm)
2 .5
1 .5
*
1
0
##
***
2
0
2 .0
**
AIA2 + TDZ2
1
#
BAP 2
2
3
TDZ 4
3
4
TDZ 2
*
AIA 2
#
5
MS0 líquido
***
MS0 sólido
**
númerodebrotos
5
4
6
** **
MS0 sólido
tamanhoda lâmina foliar (cm)
númerode folhas
6
Figura 1. Desenvolvimento de Alpinia purpurata com 3 meses in vitro. Diferenças estatísticas (Dunnett, n ≥ 30): #p< 0,001, ##p< 0,05
em relação ao meio MS sólido, *p< 0,001, **p<0,01, ***p<0,05 em relação ao meio MS líquido (controle).
105
Análise dos flavonóides em plantas in vitro
O sinal 3 (TR 45.539), monitorado a 254 nm, não foi identificado (n.i.), mas tal substância
mostrou concentração relativa pronunciada e considerável aumento nos tratamentos BAP 2 e AIA
2 + TDZ 2 em relação aos outros tratamentos in vitro e as plantas de campo (Figura 2 A-D e
Figura 3). O meio TDZ 2 estimulou a produção de n.i. (2) e n.i. (3) (Figura 2 C e Figura 3). A
substância n.i. (3) também teve maiores concentrações em meio controle (Figura 2 B e Figura 3).
A presença de rutina foi verificada por CCD e concentrações variadas foram determinadas
por CLAE em todos os tratamentos in vitro (Figura 4), mostrando maior concentração relativa
para os tratamentos BAP 2 e AIA 2 + TDZ 2. O meio BAP 2 estimulou a produção de rutina em
relação ao controle (Figura 4). Os tratamentos BAP 2 e AIA 2 + TDZ 2 induziram maior
produção de kaempferol-3-O-glicuronídeo quando comparada a TDZ 2. As plantas cultivadas em
MS controle 2 não produziram kaempferol-3-O-glicuronídeo (Figura 4).
106
Figura 2. Perfis cromatográficos (CLAE) dos extratos de folhas de plantas in vitro de Alpinia
purpurata, após período de 3-4 meses. A. campo, B. MS (controle 2), C. TDZ 2, D. BAP 2 (254
nm, indicando o TR 45.539): 1. rutina, 2. kaempferol-3-O-glicuronídeo, 3. n.i. (1) – 254 nm, 4.
n.i. (2) e 5. n.i. (3). E. Plantas in vitro, com 3 meses em TDZ 2, mostrando a estrutura da rutina.
BAP 2
TDZ 2
AIA 2+TDZ 2
MS controle
0%
20%
40%
60%
80%
rutina
n.i.(1)
n.i. (2)
n.i.(3)
100%
Figura 3. Concentração relativa (%) de rutina em relação às substâncias não identificadas n.i.(1):
TR 45.539 (254 nm); n.i.(2): TR 47.674; n.i.(3): TR 50.982, determinada pela área relativa obtida
por CLAE, a partir de extratos hidroalcóolicos de folhas de plantas in vitro de Alpinia purpurata.
107
0,035
a
a
mg/100 mg de extrato seco
0,03
b
0,025
a
0,02
0,015
0,01
b
c
bc
0,005
0
MS controle
TDZ 2
rutina
BAP 2
AIA 2+ TDZ 2
kaempferol glicuronídeo
Figura 4. Concentração de flavonóides nas partes aéreas de plantas de Alpinia purpurata
cultivadas in vitro por 3-4 meses, obtida por CLAE e quantificada usando a curva analítica dos
padrões. Letras diferentes para cada flavonóide em separado indicam diferenças estatísticas (p<
0,05, Dunnett), n = 3.
Discussão
O TDZ é uma substância sintética com atividade citocinínica, que apresenta resultados
promissores quanto ao aumento na taxa multiplicativa em sistemas de culturas in vitro (He et al.,
2007). A introdução de BAP no meio de cultura também induz a formação de brotos, com
aumento da taxa multiplicativa em culturas in vitro de espécies de Alpinia (Illg & Faria, 1995,
Moron, 2005). Ambas citocininas são comumente utilizadas em cultura de tecidos vegetais. As
culturas de A. purpurata não foram responsivas a estes reguladores de crescimento, embora haja
descrições sobre o aumento do número de brotos em cultivos desta espécie utilizando BAP
(Morón, 2005).
Através da co-injeção e comparação dos espectros ultravioleta com amostras dos padrões
de flavonóides, utilizando a CLAE, foi verificado os flavonóides rutina (TR= 31.129 min) e
108
kaempferol-3-O-glicuronídeo (TR= 34.578 min). Esta técnica cromatográfica é a mais utilizada
para verificação de flavonóides (Rijke et al., 2006).
Os flavonóides são metabólitos secundários produzidos como parte da defesa vegetal,
principalmente contra a incidência da radiação ultravioleta. Em vista disso, estão em maior
concentrações nas folhas, por ser a parte da planta mais exposta a incidência solar (Havsteen,
2001; Ferrer et al., 2008). O extrato hidroalcoólico de folhas de campo de A. purpurata mostrou
perfil cromatográfico semelhante ao das plantas cultivadas in vitro (Figura 2). A presença de
flavonóides em cultura de tecidos já foi descrita em vários estudos com as famílias: Vitaceae,
Oxalidaceae, Lamiaceae, Droseraceae e outras (Kokubo et al., 2001; Collin, 2001; Santos-Gomes
et al., 2002; Krolicka et al., 2008); para a família Zingiberaceae constitui-se na primeira citação.
Os flavonóides obtidos a partir de espécies de Alpinia são referidos como promissores agentes
terapêuticos (Mpalantinos et al., 1998).
Embora as respostas quanto aos aspectos morfogênicos não tenham apresentado variações
significativas, os meios contendo BAP 2 e AIA 2 + TDZ 2 aumentaram a produção de
kaempferol-3-O-glicuronídeo e da substância n.i. (1). Os resultados para aumento das substâncias
n.i. (1) e (2) nas folhas de A. purpurata tiveram em comum a presença de TDZ e BAP no meio de
cultura em combinação ou isolado. Sugere-se que tanto a auxina quanto a citocininas TDZ e BAP
podem estimular etapas enzimáticas da via biossintética dos flavonóides glicosilados. Algumas
auxinas, já foram referidas por promoverem a ação da enzima glicosiltransferase que catalisa a
glicolisação dos flavonóides (Kokubo et al., 2001).
A produção de rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo nas plantas de campo foi maior do
que nas plantas in vitro. Baixas concentrações dos flavonóides produzidos nas culturas in vitro de
A. purpurata podem estar relacionadas à atividade reduzida do aparato fotossintético, devido à
baixa intensidade luminosa do sistema in vitro (Hazarika, 2006). Em estudos com plantas in vitro
109
de Nicotiana tabacum foi verificado baixa produção dos carotenóides anteraxantina (1,4%) e
zeaxantina (5,1%) sob intensidade luminosa de 60 µmol.m-2.s-2, contra 9,6% e 12%,
respectivamente, em relação a intensidade de 200 µmol.m-2.s-2 (Ticha et al., 1998). Outra
sugestão para baixa concentração de flavonóides em plantas in vitro, pode estar relacionada à
redução da lâmina foliar que limita a área de exposição à luz.
Conclusão
Os flavonóides rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo foram verificados por CLAE em
folhas de plantas in vitro de A. purpurata, com aumento pronunciado de kaempferol-3-Oglicuronídeo nos tratamentos utilizando BAP 2, AIA 2 + TDZ 2. Aumento significativo para
rutina foi verificado no meio contendo BAP 2.
110
Capítulo 4
Avaliação do óleo essencial e aroma de folhas de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e A.
purpurata (Vieill) K. Schum
4.1. Composição do óleo essencial de Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum e Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith
Resumo
Folhas frescas de Alpinia zerumbet e A. purpurata (Zingiberaceae) foram coletadas na
cidade do Rio de Janeiro e sujeitas a hidrodestilação para análise da composição química por
CG/EM. Os principais constituintes do óleo das folhas de A. zerumbet foram o terpinen-4-ol
(29,4%) e o 1,8 cineol (23,1%). O óleo de folhas de A. purpurata é rico em β-pineno (34,7%) e αpineno (11,8%). Folhas de A. zerumbet foram submetidas aos métodos de extração por destilação
simultânea (EDS) e hidrodestilação (HD) para comparação da quantidade relativa e qualidade do
óleo essencial entre os métodos. Cerca de 20 (EDS) e 15 (HD) componentes do óleo foram
verificados por estes métodos e, com predominância dos monoterpenos. Em ambas amostras, os
principais constituintes foram terpinen-4-ol, 1,8 cineol, sabineno e γ-terpineno, com diferenças
quantitativas entre os métodos. O método de HD resultou em quantidade menor de substâncias
em relação ao EDS. Os constituintes canfeno (0,3%), ρ-2-menta-4(8)-dieno (1.4%) and transhidrato de sabineno (1.0%) foram obtidos somente por EDS. Quantidade relativa de cariofileno e
óxido de cariofileno, 3,7% (HD) e 6,8% (EDS) respectivamente, foram verificados.
Palavras-chave: óleo essencial, sabineno e terpinen-4-ol.
111
Introdução
Várias plantas do gênero Alpinia (Zingiberaceae) são amplamente utilizadas como
medicinais e aromáticas em diferentes partes do mundo, devido a diversidade de substâncias com
ação terapêutica. No Brasil, Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e tradicionalmente indicada
no tratamento da pressão arterial, além de ser muito utilizada em ritos afro-brasileiros (Camargo,
1998; Lahlou et al., 2003; Moura et al., 2005). Várias empresas extraem óleos essenciais de
folhas de A. zerumbet, principalmente no Japão (Elzaawely et al., 2007).
Alpinia purpurata é comumente utilizada como ornamental, importante no comércio de
flores ornamentais, há poucas citações para sua atividade medicinal (Morón, 1987; Bermudez &
Velázquez, 2002) onde todas as partes da planta são utilizadas: folhas, flores e rizoma. Esta
espécie é também apreciada como condimento, na perfumaria e como desinfetante natural
(Lobato et al., 1989).
O sabor e a fragrância são determinados pela composição do óleo essencial, quesito
importante na identificação do condimento e qualidade do aroma. Para o uso terapêutico, avaliar
a qualidade e quantidade dos constituintes do óleo essencial é imprescindível para relacionar às
respostas terapêuticas. A composição do óleo essencial de A. zerumbet já foi descrita para
amostras oriundas de outras regiões do Brasil e do mundo (Jia et al., 1987; De Pooter, 1995;
Zoghbi et al., 1999; Ali, et al. 2002; Elzaawely et al., 2007).
As técnicas de hidrodestilação (HD) e extração por destilação simultânea (EDS.) são
comumente utilizadas na análise de substâncias voláteis. A técnica EDS foi introduzida por
Likens & Nickerson em 1964 e apresenta a vantagem de permitir a análise qualitativa do óleo
essencial usando pouca quantidade de material vegetal em curto tempo de extração (Nickerson &
112
Likens, 1966). A desvantagem da técnica de extração é a mistura do óleo com o solvente
(Teixeira et al., 2007).
O objetivo deste estudo foi caracterizar o óleo essencial de A. zerumbet e A. purpurata a
partir de folhas coletadas na cidade do Rio de Janeiro, e comparar as metodologias de extração:
hidrodestilação e extração simultânea por destilação para o óleo de folhas de A. zerumbet.
Material e Métodos
Material vegetal
Folhas de Alpinia zerumbet e A. purpurata foram coletadas na Universidade Federal do
Rio de Janeiro. Exsicatas foram identificadas no Herbário do Jardim Botânico (RB) do Rio de
Janeiro, e depositadas sob o número RB 433485 (A. zerumbet) e RB 433484 (A. purpurata).
Extração por hidrodestilação (HD)
Os óleos essenciais foram extraídos por HD e diluídos em clorofórmico para injeção no
CG/EM. Cerca de 300 g de folhas frescas de plantas maduras de A. zerumbet e A. purpurata
foram coletadas em Abril de 2005, fragmentadas e introduzidas em um balão de vidro (2 L de
capacidade), o volume foi completado com água destilada até cobrir as folhas. A extração dos
óleos essenciais foi realizada por hidrodestilação, por 3 h, utilizando equipamento tipo Clevenger.
Extração por destilação simultânea (EDS)
Para comparar as metodologias HD e EDS foram feitas coletas de folhas de plantas
maduras de A. zerumbet em Novembro de 2007. A extração por HD foi realizada de acordo com
o mesmo procedimento descrito no item acima. Cerca de 5 g de folhas frescas foi homogeneizada
com 80 mL de água destilada e submetida a extração em aparelho de EDS (Godefroot et al.,
113
1981) por 2 h, utilizando 2 mL de diclorometano. Para manter baixa a temperatura da água que
entra no aparelho, utilizou-se uma caixa de isopor contendo gelo e uma bomba de aquário para
promover a circulação da água.
Análise da composição do óleo essencial
As análises por cromatografia a gás (CG/DIC) foram efetuadas em aparelho Varian Star
3400 equipado com coluna DB-5/MS (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm). O hidrogênio foi utilizado
como gás de arraste, fluxo 1 mL.min-1. A temperatura do injetor foi 270oC, a programação da
temperatura da coluna - 60ºC a 290ºC, 3°C/min. Foi injetado 1 µL do oleo dissolvido em
clorofórmico ou diclorometano (EDS), sem divisão de fluxo.
As análises por cromatografia a gás acoplada a espectrofotômetro de massas (CG/EM)
foram realizadas em cromatógrafo Hewlett Packard HP5890 acoplado a um detector seletivo de
massas HP5972, operando no modo impacto de elétrons 70 eV, divisão de fluxo 1:40. Utilizou-se
uma coluna de sílica fundida HP5-MS (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm), hélio carreador a uma
velocidade de 36,8 cm/s, fluxo de 1,03 mL/min. As condições cromatográficas foram:
temperatura do injetor a 260°C e da interface a 200 °C. A programação de temperatura foi de 60
a 240ºC, 3°C/min).
Identificação dos componentes do óleo essencial
Os componentes químicos foram identificados por comparação dos espectros de massas
com a biblioteca NIST 98 (National Institute of Standards and Technology) e com os espectros
disponíveis na literatura especializada para coluna DB5 (Adams, 1989), similar a HP5. A
confirmação dos componentes químicos foi obtida após cálculo do índice de Kovats (IK),
114
utilizando uma série homóloga de hidrocarbonetos alifáticos saturados (C9 a C24) nas mesmas
condições especificadas para as cromatografias dos óleos essenciais.
Resultados e Discussão
As condições climáticas da cidade do Rio de Janeiro, em Abril de 2005 eram: temperatura
mínima 25ºC e máxima 35ºC, umidade relativa 85% e precipitação 140 mm (dados obtidos da
página eletrônica do Instituto Nacional de Meteorologia, Brasil). Tais características e outras
relacionadas ao tipo de solo, local de coleta, período do dia, estação do ano, fase do
desenvolvimento vegetal são fatores cruciais na composição e diversidade do óleo essencial
(Milauskas et al., 2004; Gobbo-Neto & Lopes, 2007).
O rendimento foi calculado em base fresca, sendo verificado maior rendimento para
espécie A. zerumbet (Tabela 1). Os componentes do óleo essencial de A. zerumbet e A. purpurata,
obtidos em Abril 2005, estão apresentados na Tabela 2.
Tabela 1. Resultados referentes ao óleo essencial extraído da espécie A. zerumbet e A. purpurata.
Espécie
Rendimento
Coloração
(%)
Coleta
Mês/Ano
Período do dia
A. zerumbet
0,44
incolor
Abril/2005
matutino
A. purpurata
0,032
amarela
Abril/2005
matutino
Os componentes principais do óleo essencial das folhas de campo de A. zerumbet foram
terpinen-4-ol (29,4%), 1,8 cineol (23,1%) e γ–terpineno (16,1%). Os monoterpenos foram a
classe predominante. O principal componente químico, terpinen-4-ol, tem ação anti-hipertensiva
e antimicrobiana (Lahlou et al., 2003). Este também foi verificado em maior concentração
115
relativa em outras amostras coletadas em diferentes regiões: Pará (22,7%) e Ilhas Fiji (40,9%)
(Zoghbi et al., 1999; Ali et al., 2002). O constituinte 1,8 cineol foi verificado como principal
componente no óleo de plantas das Ilhas Fiji (13,2%) e Okinawa (Japão) (18,8%) (Ali et al.,
2002; Elzaawely et al., 2007). O 1,8 cineol ou eucaliptol possui comprovada atividade
antimicrobiana (Janssen et al., 1985; Ünlü et al., 2002; Matasyoh et al., 2007) e no sistema
cardiovascular (Lahlou et al., 2002).
O óleo essencial de plantas coletadas no Rio Grande do Sul apresentaram β–pineno
(37,3%), 1,8 cineol (24,9%) e α–pineno (19,1%) (Brasil e Silva et al., 1977) Ao contrário, neste
estudo foi verificado baixas concentrações do β-pineno (3,8%) e α–pineno (1,7%).
Tabela 2. Composição do óleo essencial determinado por CG/EM e CG/DIC de Alpinia zerumbet
e A. purpurata coletadas em Abril de 2005, Rio de Janeiro.
No.
Componentes
IR cal.
Área relativa (%)
Alpinia zerumbet
Alpinia purpurata
1
α-tujeno
933
4,1
-
2
α –pineno
940
1,7
11,8
3
canfeno
950
-
1,5
4
sabineno
979
7,2
-
5
ß-pineno
979
3,8
34,7
6
α -terpineno
1023
3,3
-
7
limoneno
1026
-
1,7
8
ρ-cimeno
1032
4,6
-
9
limoneno
1036
1,8
-
10
1,8 cineol
1038
23,1
-
11
γ-terpineno
1068
16,1
-
12
linalol
1092
-
1,4
13
trans-pinocarveol
1129
-
1,2
14
pinocarvona
1155
-
0,9
116
continuação
15
borneol
1159
-
0,8
16
terpinen-4-ol
1184
29,4
0,6
17
α-terpineol
1186
-
1,1
18
mirtenal
1189
-
1,8
19
mirtenol
1191
-
1,0
20
acetato de bornila
1281
-
1,9
21
ρ-cimen-7-ol
1292
-
4,8
22
trans-sabinyl acetate
1294
-
1,1
23
trans-pinocarvyl acetate
1307
-
2,8
24
acetato de piperila
1320
-
0,5
25
ß-damascenona
1344
-
0,4
26
longifoleno
1408
-
0,8
27
β-cariofileno
1425
2,2
-
28
acetato de nerila
1451
-
3,3
29
ß-chamigreno
1474
-
1,5
30
γ-himachaleno
1476
-
2,3
31
γ-muuroleno
1481
-
0,5
32
germacreno D
1484
-
3,4
33
guaiol
1507
-
6,0
34
óxido de cariofileno
1590
1,4
-
35
3-tujopsanona
1647
-
0,9
36
α-eudesmol
1658
-
0,9
37
14-hidroxi-δ-cadineno
1785
-
2,6
38
3-α-hidroxi-manool
2343
-
3,2
Monoterpenos (%)
97,2
73,2
Sesquiterpenos (%)
1,4
21,8
O óleo essencial de folhas de A. purpurata foi caracterizado pela presença de 73,2% de
monoterpenos, entre eles, os principais foram o β–pineno (34,7%) e α-pineno (11,8%). Área
relativa similar de β–pineno (29,4%) foi verificado em folhas de plantas coletadas nas Ilhas Fiji
117
(Ali et al., 2002). Os pinenos estão relacionados à proteção contra convulsão tônica (Sayyah et
al., 2002), possuem atividade espasmogênica (Lis-Balchin et al., 1999). O α–pineno compõe um
medicamento utilizado para dissolver cálculos na vesícula biliar, doença colelitíase (GomesCarneiro et al., 2005).
A técnica de extração é essencial na determinação quantitativa e qualitativa do óleo
essencial (Mejdoub & Katsiotis, 1998; Sorensen & Katsiotis, 2000). Os componentes do óleo
essencial após HD e EDS estão listados na Tabela 3. Foram obtidas 20 substâncias por EDS e 15
por HD. Os constituintes foram agrupados em 4 classes principais: monoterpenos hidrocarbonos
e oxigenados e sequiterpenos: hidrocarbonos e oxigenados. O óleo essencial de A. zerumbet
coletado no Rio de Janeiro (RJ) é rico em monoterpenos oxigenados. Os principais constituintes
do óleo essencial foram o terpinen-4-ol, 1,8 cineol, sabineno e γ-terpineno, representando 61,7%
(EDS) e 62,6% (HD) do óleo total. Os sesquiterpenos foram verificados em baixas concentrações
tanto para a técnica HD (3,7%) quanto para EDS (6,8%). Foram poucas as diferenças obtidas
entre as técnicas. Pelo método EDS, foi verificado o dobro da porcentagem (27,7%) de sabineno.
Enquanto por HD os principais foram γ-terpineno e terpinen-4-ol. Os componentes adicionais
verificados pelo método EDS não resultam de artefatos térmicos porque já foram verificados em
óleos de outras amostras de A. zerumbet (Jia et al., 1987; Elzaawely et al., 2007).
118
Tabela 3. Composição do óleo essencial de Alpinia zerumbet extraído por EDS e HD, Novembro
2007, determinada por CG/EM e CG/DIC.
No.
Componentes
IR
Área relativa (%)
EDSa
HDa
1
tricicleno
927
2,4
3,5
2
α -pineno
936
2,0
2,0
3
canfeno
953
0,3
-
4
sabineno
974
27,7
14,2
5
ß-pineno
979
2,2
5,4
6
mirceno
988
1,1
1,2
7
α -terpineno
1017
2,5
3,8
8
ρ-cimeno
1026
2,0
3,4
9
limoneno
1030
1,8
1,04
10
1,8 cineol
1034
15,6
16,0
11
γ-terpineno
1059
7,4
13,1
12
cis-hidrato de sabineno
1072
1,3
1,8
13
ρ-2-menta-4(8)-dieno
1085
1,4
-
14
trans-hidrato de sabineno
1098
1,0
-
15
linalol
1100
1,9
1,4
16
n.i. b
1125
0,6
-
17
terpinen-4-ol
1181
11,0
19,3
18
α-terpineol
1194
1,3
2,6
1324
1,4
1,4
b
19
n.i.
20
β-cariofileno
1418
4,6
2,4
21
óxido de cariofileno
1581
2,2
1,3
Monoterpenos hidrocarbonos
50,4
47,6
Monoterpenos oxigenados
32,1
41,1
Sesquiterpenos hidrocarbonos
4,6
2,4
Sesquiterpenos oxigenados
2,2
1,3
Total identificado
88,7
87,3
a
Análises em duplicata. b não identificado.
119
A Figura 1A mostra os constituintes em maior concentração relativa obtidos para A.
zerumbet, por HD, comparando dois períodos de coleta: Abril e Novembro. A Figura 1B, mostra
a área relativa (%) dos componentes principais do óleo de folhas coletadas em Novembro 2007,
comparando as técnicas de extração HD e EDS.
30
A
30
25
20
Abril
15
Novembro
10
5
Á rea relativa (% )
Á rea relativa (% )
35
B
25
20
HD
15
EDS
10
5
0
0
sabineno
1,8 cineol
terpinene terpinen-4-ol
sabineno
1,8 cineol
terpinene terpinen-4-ol
Figura 1. Área relativa (%) obtida por CG/DIC dos principais componentes do óleo essencial de
Alpinia zerumbet. A. Abril 2005 e Novembro 2007. B. Novembro 2007 (HD e EDS).
Conclusão
Os principais componentes do óleo essencial de A. zerumbet pertencem à classe dos
monoterpenos. O óleo essencial de A. zerumbet coletada no Rio de Janeiro, apresenta os
componentes sabineno, 1,8 cineol, terpineno e terpinen-4-ol como seus principais componentes
nos dois períodos de coleta (Abril e Novembro). Conforme a variação sazonal, os resultados
obtidos indicam que é mais favorável o mês de Abril para coleta do material vegetal.
Para as diferentes metodologias de extração foram obtidos os mesmo constituintes
principais; sendo a técnica de EDS mais eficiente, por extrair 4 componentes a mais que a HD.
Através da metodologia de EDS maior concentração relativa do sabineno foi obtida, enquanto a
abundância de γ–terpineno e tepinen-4-ol foi maior pela metodologia de HD. O desenvolvimento
120
de uma metodolgia de extração para A. zerumbet por EDS viabiliza o uso de pequenas
quantidades de material vegetal para análise do óleo essencial.
O óleo de A. purpurata apresenta predominância dos pinenos, da classe dos
monoterpenos. Estes componentes estão em pequenas concentrações no óleo de A. zerumbet.
A caracterização do ambiente de coleta associada à composição do óleo é uma referência
fundamental quanto à atividade biológica da espécie, devido aos inúmeros fatores que induzem
variação no metabolismo vegetal. Além disso, a composição do óleo direciona o seu uso
comercial. A identificação dos componentes do óleo é importante para delinear estudos
relacionados a produção e estímulo de metabólitos secundários.
121
4.2. Caracterização do aroma de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith: plantas de campo
e in vitro
Resumo
Em regiões tropicais e subtropicais, a espécie Alpinia zerumbet (Zingiberaceae) é bastante
apreciada por suas características aromáticas. Neste trabalho, foi avaliada a composição do aroma
de folhas de campo e in vitro por “headspace” estático. As plantas in vitro foram tratadas com
diferentes reguladores de crescimento vegetal: AIA, TDZ, BAP e CIN. Os voláteis foram
extraídos por “headspace” estático (HS-E) e analisados por CG/EM. Folhas da planta matriz
mostraram como componentes principais: sabineno, γ-terpineno e 1,8 cineol. Amostras do óleo
essenciail de folhas de plantas cultivadas in vitro apresentaram em comum o monoterpeno
sabineno e os sesquiterpenos cariofileno e cariofileno óxido. Foi verificada a presença de 1,8
cineol apenas nos tratamentos controle, BAP e CIN. Muitos alcanos foram obtidos sob a
influência de citocininas.
Palavras-chave: CG, terpenos, reguladores de crescimento vegetal, substâncias voláteis
Introdução
O aroma consiste em um conjunto de substâncias voláteis que estimulam os nossos
sentidos. A constituição do aroma é um fator de alto impacto para várias industrias, tais como,
alimentícias, fitoterápicas e cosméticas. Além disso, o uso de substâncias aromáticas tem
crescente aplicação na aromoterapia (Broughan, 1999; Yoo, 2006).
A produção de voláteis em culturas de tecidos tem mostrado resultados positivos na
implementação de constituintes do aroma por uso de estimuladores como hormônios vegetais e
componentes da via metabólica dos terpenos, bem como a própria condição de estresse do
122
microambiente do sistema in vitro (Bertoli et al., 2004; Roja et al., 2005; Affonso et al., 2007). A
técnica de “headspace” tem sido extensivamente utilizada para investigar a composição das
substâncias voláteis (Rohloff, 2002). O conjunto de técnicas de “headspace” tem como ponto
comum a avaliação, por cromatografia a gás, do vapor emitido pelo material vegetal após seu
aquecimento (Tholl et al., 2006).
Todas as partes da planta Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith são aromáticas. Sendo
esta espécie muito utilizada por tais propriedades em condimentos, “saquinhos de cheiro” e
perfumes (Lobato et al., 1989). Em vista disso, este estudo teve o objetivo de avaliar a
composição do aroma de folhas de campo e in vitro, sob a influência de reguladores de
crescimento vegetal, de A. zerumbet.
Material e Métodos
Material vegetal
O exemplar de Alpinia zerumbet foi obtido no entorno da Universidade Federal do Rio de
Janeiro (Centro de Ciências da Saúde - bloco H) Cidade Universitária, sendo identificada e
depositada no Herbário do Jardim Botânico (RB) do Rio de Janeiro, sob o número RB 433485.
Culturas in vitro
As culturas foram iniciadas a partir de brotos do rizoma da planta matriz de A. zerumbet.
As plantas foram introduzidas em vidros (16 x 8 cm) contendo meio líquido MS (Murashige &
Skoog, 1962), acrescido de 30 g.L-1 de sacarose, vitaminas (tiamina-HCl 1,3 µM, piridoxina 3
µM e ácido nicotínico 4,1 µM), mio-inositol 0,6 mM, sendo o pH ajustado para 5,8 com solução
0,1 M de hidróxido de sódio. Após o estabelecimento das culturas, as plantas foram subcultivadas
123
em diferentes meios com reguladores de crescimento vegetal: MS0 (controle), ácido indolacético
(AIA), 6-benzilaminopurina (BAP), cinetina (CIN) e thidiazuron (TDZ). Todos os reguladores de
crescimento vegetal foram utilizados na mesma concentração de 2 mg.L-1 As culturas foram
mantidas em sala de crescimento a 25 ± 2ºC, sob intensidade luminosa de 23 µmol.m-2.s-1,
fornecidas por lâmpadas fluorescentes tubulares, subcategoria Duramax Universal (20 W T–12)
(General Electric®) e fotoperíodo de 16 h. Após 4 meses as plantas foram avaliadas quanto a
porcentagem de brotos/explante, porcentagem de folhas/broto, peso fresco e seco das folhas.
Folhas de plantas com 4 meses, retiradas de 2 vidros diferentes para o mesmo tratamento, foram
utilizadas nas análises de “headspace”.
Extração por hidrodestilação
O óleo essencial da folhas de A. zerumbet foi extraído por hidrodestilação (HD) em
aparelho tipo Clevenger, por 3h.
Análises por “headspace” estático
Para as análises por “headspace” estático (HS-E), 0,3 mL do óleo de folhas de campo
coletadas no Rio de Janeiro, no entorno da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Centro de
Ciências da Saúde - bloco H) e 160 mg de folhas de campo ou das plantas in vitro foram picadas
e colocadas individualmente em frascos de 20 mL. Cada frasco foi incubado em um agitador
orbital (300 rpm), por 15 min (tempo de equilíbrio) a 60oC. Um cromatógrafo a gás Varian CP
3800, conectado ao espectro de massas Varian 1200 L foi utilizado para as análises. A fração
volátil foi obtida aspirando-se 500 µL de ar da região superior do frasco, utilizando uma seringa
aquecida a 60oC e injetada diretamente no CG. A temperatura do injetor foi de 260°C. Foi
utilizada uma coluna modelo Zebron ZB-5HT (30 m x 0.25 mm, 0.10 µm) (Phenomenex,
124
Torrance, CA) com programação de temperatura de 30 – 210ºC, 3°C/min; 70 eV, divisor de fluxo
na proporção de 1:10. O hélio foi utilizado como gás carreador, com fluxo constante de 1
mL.min-1. Para as análises in vitro por HS-E foram utilizados 2 vidros de cultura por tratamento.
Todos os experimentos foram conduzidos em duplicata por vidro de cultura.
Análise do óleo essencial
As análises por cromatografia a gás (CG) foram efetuadas em aparelho Varian Star 3400
equipado com coluna DB-5/MS (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm). O hidrogênio foi utilizado como gás
de arraste, fluxo 1 mL.min-1. A temperatura do injetor foi 270oC, a programação de temperatura
da coluna foi 60ºC – 290ºC, 3°C/min. Uma amostra de 1 µL do oleo dissolvido em clorofórmico
foi injetada, sem divisor de fluxo.
As análises por cromatografia a gás acoplada a espectrofotômetro de massas (CG/EM)
foram realizadas em cromatógrafo Hewlett Packard HP5890 acoplado a um detector seletivo de
massas HP5972, operando no modo impacto de elétrons 70 eV, divisor de fluxo na proporção de
1:40. Utilizou-se uma coluna de sílica fundida HP5-MS (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm). O hélio foi
utilizado como gás carreador, com fluxo constante de 1,03 mL/min. As condições
cromatográficas foram: temperatura do injetor a 260°C e da interface a 200 °C. A programação
de temperatura foi de 60 – 240ºC, 3°C/min.
Identificação dos componentes do óleo essencial e aroma
Os componentes químicos foram identificados por comparação dos espectros de massas
com a biblioteca NIST 98 (National Institute of Standards and Technology) e com os espectros
disponíveis na literatura especializada (Adams, 1995). A confirmação dos componentes químicos
foi obtida após cálculo do índice de retenção (IR), utilizando uma série homóloga de
125
hidrocarbonetos alifáticos saturados (C10 a C20) nas mesmas condições das análises especificadas
para as cromatografias dos óleos essenciais.
Resultados e Discussão
Foi obtido um protocolo rápido de produção de plantas in vitro de A. zerumbet. A
freqüência regenerativa foi de 100% para todos os meios testados. O aspecto morfogênico das
culturas pode ser observado na Figura 1. No geral, as plantas apresentaram um desenvolvimento
satisfatório.
A citocinina TDZ foi o mais eficiente hormônio para produção de novos brotos e folhas,
mas as plantas apresentaram peso fresco e seco reduzido (Figura 2 A-D). O maior peso fresco e
seco foi obtido no meio controle (Figura 2 C-D). Além disso, os brotos e raízes apresentaram
alongamento reduzido sob o efeito do TDZ (Figura 1). O efeito inibitório do TDZ no
alongamento de brotos e raízes é bastante conhecid, como exemplo pode se citar os trabalhos de
Heutteman & Preece (1993) e Ledbetter & Preece (2004). O uso de CIN induziu leve aumento no
número de folhas. A introdução de citocininas no meio de cultura está relacionada a sua
propriedade de estimular a produção de brotos adventícios (Gaspar et al., 1996). A adição das
citocininas BAP e TDZ foram importantes para aumentar a porcentagem de brotos por explante
de A. zerumbet. Resultados positivos em relação ao uso destes reguladores de crescimento
vegetal também foram encontrados para as espécies A. galanga e A. purpurata (Illg & Faria,
1995; Borthakur et al., 1999).
O processo de enraizamento foi vigoroso nos meios: controle, AIA, BAP e CIN (Figura
1). A adição de auxinas não aprimorou qualquer parâmetro avaliado; diferente de outros estudos
de propagação in vitro de plantas do gênero Alpinia nos quais a auxina teve efeito positivo sobre
o enraizamento (Illg & Faria, 1995; Borthakur & Singh, 1999).
126
A
B
C
D
E
Figura 1. Aspecto morfogênico das plantas de Alpinia zerumbet submetidas às análises de HS-E,
com 4 meses de cultivo in vitro: A. MS0 (controle), B. AIA, C. BAP, D. CIN, E. TDZ (2 mg.L-1).
(Barra = 1 cm).
A
TDZ 2
CIN 2
CIN 2
BAP 2
BAP 2
AIA 2
AIA 2
controle
controle
0
100
200
0
número de folhas (%)
C
B
TDZ 2
TDZ 2
número de brotos (%)
BAP 2
a
CIN 2
KIN 2
a
BAP 2
a
AIA 2
a
controle
0
e
TDZ 2
b
25
50
peso seco (mg) *
50 100 150 200 250
D
d
c
AIA 2
b
a
controle
0
100 200 300 400 500 600
peso fresco (mg) *
Figura 2. Efeito dos reguladores de crescimento no desenvolvimento in vitro de Alpinia
zerumbet, com 4 meses. Cada valor representa a média ± EP. Letras diferentes indicam diferenças
estatísticas (p< 0,05, Tukey, n = 10). Os valores em porcentagem foram calculados considerando
o meio controle 100%. * Folhas.
127
Os resultados para caracterização do aroma são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Caracterização do aroma de folhas obtido por HS-E – CG/EM, a partir de plantas de
campo ou do cultivo in vitro de Alpinia zerumbet por 4 meses, sob ação de diferentes reguladores
de crescimento vegetal.
Plantas de campo
No.
IR
Voláteis
Plantas in vitro
óleo
folhas
MS0
AIA
BAP
CIN
TDZ
1
809
acetato de etila
-
X
X
X
X
X
X
2
860
hexenal
-
X
X
X
X
X
X
3
864
n.i.a
X
-
-
-
-
-
-
4
928
tricicleno
X
-
-
-
-
-
-
5
932
α-pineno
X
-
6
979
sabineno
X
X
X
X
X
X
X
7
993
mirceno
X
-
-
-
-
-
-
8
1015
α-terpineno
X
X
-
-
-
-
-
9
1023
ρ-cimeno
-
X
-
-
-
-
-
10
1026
D-limoneno
-
X
-
-
-
-
-
11
1034
1,8 cineol
X
X
X
-
X
X
-
12
1043
trans-β-ocimeno
-
X
-
-
-
-
-
13
1063
γ-terpineno
X
X
-
-
-
-
-
14
1068
trans-hidrato de sabineno
X
-
-
-
-
-
-
15
1085
terpinoleno
X
X
-
-
-
-
-
16
1095
linalol
X
X
-
-
-
-
-
128
continuação
17
1119
ρ-menta-1,3,8-trieno
X
-
-
-
-
-
-
18
1175
terpinene-4-ol
X
-
-
-
-
-
-
19
1188
α-terpineol
X
-
-
-
-
-
-
20
1399
cariofileno
X
X
X
X
X
X
X
21
1497
pentadecano
-
-
-
-
X
X
-
22
1505
α-bisaboleno
X
-
-
-
-
-
-
23
1562
óxido de cariofileno
X
X
X
X
X
X
X
24
1598
hexadecano
-
-
-
-
X
X
X
25
1697
heptadecano
-
-
-
-
X
X
-
26
1798
octadecano
-
-
-
-
X
X
-
27
1862
n.i.a
-
-
X
X
X
X
X
28
1977
n.i.a
X
-
-
-
-
-
X
29
1999
eicosano
-
-
-
-
-
X
-
30
2155
n.i.a
X
-
-
-
-
-
X
Monoterpenos (%)
81
69
29
20
18
16
11
Sesquiterpenos (%)
19
15
29
40
18
16
22
-
-
-
-
36
42
11
Alcanos (%)
a
não identificado.
As vantagens das técnicas de “headspace” se referem à análise de substâncias voláteis sem
a presença de solventes ou qualquer alteração no material vegetal como em outras técnicas de
extração. Neste estudo, foi utilizado o HS-E que se baseia no equilíbrio entre os voláteis e a
atmosfera em torno do frasco. Provavelmente, este método melhor representa a percepção do
129
aroma de plantas frescas (Stashenko et al., 2004); além de eliminar os passos de extração por
destilação e fracionamento da amostra (Huie, 2002).
O óleo essencial extraído de folhas de campo, por HD e analisado cromatograficamente
por HS-E revelou os componentes sabineno, γ-terpineno e linalol (monoterpenos) e cariofileno
(sesquiterpeno) como principais. O mesmo óleo após análise por injeção direta no CG/DIC e
CG/EM, evidenciou como principais constituintes γ-terpineno (13%), sabineno (14%), 1,8 cineol
(16%) e terpinen-4-ol (19%) (ver Item 4.1). Por HS-E, o óleo mostrou a presença de terpinoleno e
α–bisaboleno, não verificado pela injeção direta.
Nas folhas de A. zerumbet, o óleo essencial está contido em células oleíferas presentes no
mesofilo e na superfície abaxial das folhas (Albuquerque & Neves, 2004). A produção de
terpenóides em sistemas de cultivo in vitro está em sua maioria associada aos sistemas de
organogênese direta, no qual se obtém a planta inteira ou órgãos vegetais (Mulder-Krieger et al.,
1988; Collin, 2004).
O aroma das folhas de campo mostrou como principais constituintes o sabineno, γterpineno, 1,8-cineol e cariofileno (Figura 3 A e D), predominando os monoterpenos. Entre a
composição do aroma das folhas de campo e in vitro, as de campo produziram mais substâncias
voláteis (Figura 3). Os tratamentos com as citocininas BAP e CIN mostram a presença de vários
alcanos: 36 e 42% respectivamente. Resultados similares foram verificados em culturas in vitro
de Eucalyptus camaldulensis (Giamakis et al., 2001). Estes dados podem sugerir a ação destes
reguladores na biossíntese de hidrocarbonetos. O terpinen-4-ol, um dos principais componentes
do óleo essencial, não foi verificado no aroma das folhas de campo, nem in vitro. Além do
terpinen-4-ol, as folhas de campo não produziram os componentes α–pineno, mirceno, αterpineol e hidrato de sabineno. O aroma obtido para todos os tratamentos in vitro apresentou em
comum o sabineno, cariofileno e óxido de cariofileno entre os monos e sesquiterpenos (Figura 3
130
B e C). Os constituintes 27, 28 e 30 (Figura 3) não foram identificados, mas parecem ser
substâncias características da condição in vitro. O perfil dos voláteis varia conforme vários
fatores, entre eles, as condições dos sistemas in vitro como intensidade luminosa, umidade e
temperatura vão definir a composição aromática do material. Estas condições interferem
diretamente no metabolismo das substâncias voláteis por agir na fisiologia vegetal incluindo os
processos de fotossíntese e transpiração (Tholl et al., 2006).
A composição da fração volátil é resultado de um conjunto de fatores que atuam durante o
desenvolvimento vegetal, como genótipo, condições de cultivo e meios de cultura (Castro et al.,
2002). Embora o protocolo de produção de plantas in vitro tenha sido adequado para o
desenvolvimento das culturas, nenhum aumento foi verificado na produção dos voláteis
identificados em relação às plantas de campo. Também nenhuma variação foi verificada em
relação às analises obtidas de plantas cultivadas in vitro, oriundas de culturas diferentes, mas com
o mesmo tratamento.
A ação do TDZ nas culturas resultou em redução do alongamento dos brotos e menor
peso fresco e seco, no entanto alguns metabólitos não identificados foram mais expressivos neste
tratamento (Figura 3: 27, 28 e 30), o que sugere que o TDZ atua mais diretamente na rota
biossintética destes voláteis, independente da eficiência do crescimento e desenvolvimento.
A maioria das citações referentes à produção de óleo essencial in vitro é para espécies de
Dicotiledôneas, poucos sobre Monocotiledôneas (Mulder-Krieger et al., 1988). No entanto, várias
espécies da família Zingiberaceae apresentam relevante potencial econômico devido ao aroma.
Os aspectos atrativos da espécie A. zerumbet estão em grande parte associado ao aroma que como
foi visto nestes estudos consiste de uma combinação de “spicy-black pepper”, cânfora e
“cucumber” (Wise et al., 2002; Seo and Baek, 2005; Chyau et al., 2007).
131
O linalol, limoneno, γ–terpineno e terpinoleno foram os principais componentes
verificados no aroma de folhas de campo de A. zerumbet e não observado nas folhas de plantas in
vitro, sugerindo que a etapa de produção de limoneno (1) e a conversão deste em γ–terpineno (2)
e terpinoleno (3), podem ter sido inibidas sob condições in vitro (Figura 4). Phatak & Heble
(2002) sugerem a redução da atividade de enzimas da rota dos monoterpenos condicionados ao
estágio de diferenciação in vitro de Mentha arvensis.
13
600
A
D
O
6
11
15
20
22
23
0
sabineno
1,8 cineol
C
25
B
CH 2
27
6
20
γ-terpineno
23
11
HO
terpinen-4-ol
5
C
25
28
30
CH 2
27
CH 3
6
23
CH 2
20
cariofileno
5
0
60 min
Figura 3. Perfis cromatográficos (CG) do aroma de Alpinia zerumbet obtido por “headspace”: (A)
Plantas de campo. Plantas in vitro: (B) MS0, (C) TDZ 2. Os números dos sinais assinalados no
132
cromatograma correspondem aos mesmos na Tabela 1. (D) Fórmulas estruturais dos principais
constituintes do aroma das folhas.
2
1
3
Figura 4. Rota biossintética simplificada dos principais monoterpenos e sesquiterpenos
identificados em Alpinia zerumbet por CG/EM.
Conclusão
A técnica de HS-E acoplada a CG/EM possibilitou a análise das substâncias voláteis
emitidas por plantas de campo e in vitro. O aroma produzido por folhas de campo de A. zerumbet
é composto em maioria por γ–terpineno, sabineno e terpinoleno semelhante ao aroma do óleo
extraído por HD. Foi verificada uma redução qualitativa na produção de terpenos sob condições
in vitro. Os voláteis das plantas in vitro foram constituídos principalmente por sabineno, 1,8
cineol, cariofileno e óxido de cariofileno, com envidência de alta porcentagem de alcanos em
meios contendo citocininas.
133
A qualidade do aroma foi alterada como conseqüência da adição de reguladores de
crescimento vegetal, e as características obtidas devem ser avaliadas e, como perspectivas, podem
ser manipuladas para o fim o qual será utilizado.
134
Capítulo 5
Estudos preliminares sobre a atividade vasodilatadora do extrato de Alpinia zerumbet (Pers.)
Burtt et Smith e A. purpurata (Vieill) K. Schum
5.1. Atividade vasodilatadora do extrato de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith e A.
purpurata (Vieill) K. Schum
Resumo
Atualmente, a hipertensão arterial é uma das maiores causas de morte e problemas
cardiovasculares. O uso de vasodilatadores é um dos mecanismos de ação dos fármacos
prescritos atualmente. Extratos hidroalcóolicos de Alpinia purpurata e A. zerumbet cultivada in
vitro sob diferentes tratamentos com reguladores de crescimento vegetal foram testados no leito
mesentérico retirado de ratos Wistar. Os extratos de A. purpurata e A. zerumbet produziram
efeito vasodilatador com padrão de resposta dose-dependente de duração prolongada. A espécie
A. zerumbet é mais eficaz que a A. purpurata, mas na dose de 60 µg, ambas atingem igual
potência quanto ao relaxamento (95 e 87%, respectivamente). As plantas in vitro de A. zerumbet
foram cultivadas por 3 meses em meio MS (Murashige e Skoog) e tratadas com AIA e AIA +
TDZ. O extrato obtido de folhas oriundas das culturas mantidas em meio contendo AIA inibiu o
relaxamento (17,4%) na dose de 90 µg em relação ao controle (MS0) no qual foi verificado
melhor efeito vasodilatador (60%). Estes resultados estão de acordo com a concentração de
fenóis totais que é 50% menor para os extratos de plantas in vitro cultivadas em AIA. A espécie
A. purpurata foi pela primeira vez testada quanto à atividade vasodilatadora, os resultados
obtidos indicam a presença de fenóis correlacionada a ação terapêutica da planta.
135
Palavras-chave: cultura de tecidos vegetais, endotélio-dependente, planta medicinal, relaxamento
Introdução
As doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade no Brasil (Godoy et al.,
2007). A hipertensão é caracterizada por uma alta na pressão arterial, que relaciona o esforço do
coração em impulsionar o sangue e a resistência vascular (Lolio, 1990). Esta doença atinge
diferentes faixas etárias e sociais e várias são as tentativas para minimizar ou prevenir os casos de
hipertensão que na sua maioria, envolvem dietas adequadas, exercícios físicos e medicamentos
(Guimarães, 2002; Guimarães & Ribas, 2006).
A espécie Alpinia zerumbet, colônia, é bastante conhecida e utilizada em várias regiões do
Brasil na medicina popular por seus efeitos anti-hipertensivos (Matos, 1994; Moura et al., 1998;
Oliveira & Araújo, 2007). Em estudos fitoquímicos realizados com a espécie Alpinia purpurata
foi verificado similaridade na composição do óleo essencial e substâncias flavonoídicas que é
esperado por critérios qumiossistemáticos (Pugialli et al., 1993). Estes metabólitos secundários
são referidos na literatura por estarem envolvidos na atividade vasodilatadora e hipotensora da
espécie A. zerumbet (Da Costa et al., 1998; Mpalantinos et al., 1998; Huang et al., 1999; ZhengTao et al., 2001; Lahlou et al., 2002; Lahlou et al., 2003; Moura et al., 2005). Os flavonóides
capturam as espécies reativas de oxigênio, apresentando alta atividade antioxidante, e atuam em
vários mecanismos hipotensores: inibição da enzima conversora de angiotensina, bloqueio dos
canais de Ca++, inibição da síntese de prostanóides vasoconstritores e estímulo do relaxamento
mediado pela bradicinina (Duarte et al., 1993; Formica & Regelson, 1995; Hansen, 1996;
Pourcel et al., 2006; Havsteen, 2002; Xu et al., 2006). Sendo assim, a espécie A. purpurata
apresenta potencial fitoquímico para também agir de forma terapêutica em doenças
136
cardiovasculares por similaridade química com a espécie A. zerumbet em relação ao teor de
polifenóis totais, entre eles os flavonóides que possuem pronunciada atividade antioxidante
(Julsing et al., 2006; Victório et al., in press). Algumas respostas em sistemas de cultivo in vitro
de tecidos vegetais têm mostrado a otimização de metabólitos secundários. Em vista disso,
plantas de A. purpurata e plantas in vitro de A. zerumbet cultivadas sob condições de estresse
pela adição de reguladores de crescimento vegetal foram testadas para verificar a atividade
terapêutica.
O teste utilizando leito mesentérico de rato permite a avaliação vasodilatadora dos
extratos (McNeill & Jurgens, 2006), e dependendo dos resultados pode sugerir uma atividade
hipotensora. A hipertensão tem como principal conseqüência uma perfusão inadequada dos
tecidos que aumenta os riscos de acidentes vasculares cerebrais e coronariopatias (Kaiser, 2004).
O intuito deste trabalho foi avaliar a ação vasodilatadora de plantas de A. purpurata e A.
zerumbet in vitro.
Material e Métodos
Animais utilizados
Foram utilizados ratos Wistar machos, com idade de 2 meses e meio e peso entre 230 e
260 g, provenientes do biotério do Departamento de Farmacologia e Psicobiologia, do Instituto
de Biologia Roberto
idroalcó Gomes, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Os animais
foram mantidos em ciclo de sono-vigília de 12 h, com presença de luz à partir das 6 h da manhã,
sendo os experimentos realizados durante o dia. Os animais tiveram livre acesso à ração e água
antes do período experimental.
Material Vegetal e Preparação dos extratos
137
Exemplares de Alpinia zerumbet e Alpinia purpurata foram obtidos na Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro – RJ, sendo identificados no Herbário do Jardim
Botânico do Rio de Janeiro, e depositados sob o número RB 433485 e RB 433484,
respectivamente.
As plantas in vitro de A. zerumbet foram cultivadas sob condições assépticas em meio MS
(Murashige & Skoog, 1962), acrescido de 30 g.L-1 de sacarose, vitaminas e mio-inositol, pH
ajustado para 5,8. Foram avaliados 3 tratamentos: MS0 (controle), AIA 2 (ácido indolacético) 2
mg.L-1 e AIA 2 + TDZ 2 (tidiazuron) 2 mg.L-1. Os meios foram esterilizados, em autoclave a
120oC, 1 kgf.cm-2, durante 15 min. As culturas foram mantidas em sala de crescimento a 25 ±
2ºC, sob intensidade luminosa de 23 µmol.m-2.s-1, fornecidas por lâmpadas fluorescentes
tubulares (20 W T–12, General Electric®) e fotoperíodo de 16 h.
Folhas das plantas de A. zerumbet e A. purpurata, obtidas na cidade do Rio de Janeiro,
foram secas por 3 dias, em estufa a 60ºC. As folhas foram trituradas e extraídas em etanol 70%
utilizando ultrassom (40 kHz Thornton Unique, modelo 1400 USC, 120 W) por 45 min, em
triplicata. As folhas obtidas de A. zerumbet cultivada in vitro foram secas por liofilização e
extraídas com 70% de etanol seguindo o mesmo procedimento acima. As extrações foram feitas
em separado para cada tratamento com reguladores de crescimento vegetal. Os extratos foram
filtrados a vácuo, utilizando papel de filtro Whattman® (110 mm ø, qualidade 1). Os extratos
etanólicos foram concentrados sob pressão reduzida em evaporador rotatório. O peso seco foi
aferido para verificação do rendimento da extração.
Determinação de fenóis totais
138
A quantificação de fenólicos foi realizada pelo método de Folin-Ciocalteau. Os extratos
hidrooalcólicos das plantas de campo e in vitro foram dissolvidos a 70% de etanol na
concentração de 1 mg.mL-1. Foi utilizada uma alíquota de 0,5 mL da solução do extrato bruto, na
qual foi adicionada 2 mL de solução aquosa de Folin-Ciocalteau a 10% e, após 3 min, 2 mL de
solução aquosa de carbonato de sódio a 7,5%. A mistura foi homogeneizada e incubada por 30
min em banho-maria a 50ºC. Posteriormente, a absorvância foi medida usando-se os controles:
(1) Folin-Ciocalteau + carbonato de sódio e (2) solução do extrato bruto. A leitura das
absorvâncias foi feita no espectrofotômetro a 740 nm. A quantificação foi feita por meio de uma
curva analítica preparada com ácido gálico: y = 0,0229x + 0,0968, R2 = 0,9993, onde y é a
absorvância e x a concentração em µg equivalentes de ácido gálico (EAG) por mg de extrato
bruto (Figura 1). As análises foram feitas em triplicata.
Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Os extratos brutos foram filtrados a vácuo e suspensos em metanol:água deionizada (70%
metanol), na concentração de 10 mg/mL (campo) e 50 mg/mL (in vitro).
A análise em CLAE acoplada ao detector de feixes fotodiodos foi realizada utilizando
aparelho Shimadzu, equipado com bomba LC-10AD e detector SPD-M10A. A separação foi feita
na coluna de fase reversa C18 (Lichrosorb-RP-18, Rexchrom® S5-100-ODC) de 25 cm de
comprimento e 4,6 nm de diâmetro (25 cm x 4,6 nm), contendo sílica do tipo octadecil silicato de
5 µm de 100Å como fase fixa, temperatura ambiente. A fase móvel foi água Milli-Q com 0,1%
de ácido fosfórico 85% (v/v) (solvente A) e metanol (solvente B), fluxo de 1,0 mL/min. O
gradiente de eluição foi o seguinte: 1-10 min (30%); 20 min (40%); 60 min (100%) de B. As
leituras foram realizadas no λ=360 nm. Todos os solventes utilizados para suspender as amostras
139
ou no CLAE foram de qualidade própria para CLAE, Tedia. As injeções foram feitas em
triplicatas.
Os flavonóides foram detectados pela co-injeção com os padrões autênticos. As curvas
analíticas dos padrões de rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo foram obtidas a partir da
linearidade entre as concentrações (0,0078 – 0,0625 mg.mL-1) e (0,01325 – 0,25 mg.mL-1),
respectivamente. A concentração destes flavonóides nas amostras foi obtida, após cálculo de
dispersão dado pela curva y = ax – b, onde y representa a área do sinal e x a respectiva
concentração em mg.mL-1.
Efeito dos diferentes extratos vegetais no do leito vascular mesentérico (LVM) isolado de ratos
Este estudo avaliou os efeitos dos extratos de A. purpurata coletadas no pátio do Instituto
de Biofísica (UFRJ, Rio de Janeiro) e plantas in vitro de A. zerumbet em vasos contraídos com
norepinefrina (NOR). Os resultados apresentados para o extrato hidroalcoólico de A. zerumbet de
campo foram realizados em estudos feitos por Emiliano (2002). Os extratos vegetais secos foram
suspensos na proporção de 1:1 (etanol:água destilada), na concentração de 1 mg/mL. Após a
estabilização da preparação, o tônus do LVM foi elevado por meio de perfusão de solução de
Krebs contendo NOR (30 µM). Nesta concentração, a NOR induz uma elevação da pressão de
perfusão e a mantém constante em aproximadamente 80 a 100 mmHg. Após a estabilização do
aumento da pressão de perfusão, a integridade do endotélio e do músculo liso vascular foi testada
pela análise da resposta vasodilatadora induzida pelas injeções de 10 pmol de acetilcolina (Ach) e
10 nmol de nitroglicerina (NG). Uma vez confirmada a presença de endotélio e músculo liso
funcional, isto é, resposta vasodilatadora significativa induzida pela injeção de Ach e NG, foram
administradas doses crescentes (1, 3, 6, 10, 30 e 60 µg) in bolus dos diferentes extratos (n = 6).
140
Isolamento, perfusão e registro da pressão de perfusão do LVM
As preparações do LVM de rato foram isoladas conforme descrito por McGregor (1965).
Os ratos foram sacrificados em câmara de CO procedimento aprovado pelo Comitê de Ética
2,
animal desta instituição, e imediatamente seguida a laparotomia. O LVM foi estendido para o
exterior da cavidade abdominal e envolto em gaze umedecida com solução de Krebs (composição
em mM: NaCl 118,3; KCl 4,7; CaCl .2H O 2,5; MgSO .6H O 1,2; KH PO 1,2; NaHCO 25,0;
2
2
4
2
2
4
3
ácido etilenodiamino tetra-acético-EDTA 0,026 e glicose 11,1) para a devida visualização dos
vasos mesentéricos. A artéria mesentérica superior foi isolada na sua origem, à altura da aorta
abdominal, canulada com tubo de polietileno (PE 50, Clay Adams Brand CA – Becton
Dickinson), e esta cânula, de aproximadamente 4 cm de comprimento, foi preenchida com
solução de Krebs heparinizada (50 UI/mL). O ramo principal da artéria foi ligado, imediatamente
após as bifurcações para o mesentérico. O LVM foi separado do intestino cortando-se rente à
borda intestinal, imerso em uma cuba contendo 10 mL de Krebs e perfundido com solução de
Krebs (aquecida a 37º C e borbulhada com mistura carbogênica, O 95% e CO 5%). A perfusão
2
2
foi realizada por meio de uma bomba peristáltica (Life Care Pump, Model 4 – Abbot / Shaw)
com fluxo constante de 4 mL/min. A pressão de perfusão foi registrada por meio de um
transdutor de pressão posicionado entre a bomba peristáltica e o LVM. O transdutor foi
conectado a um polígrafo (Hewlett Packard -7754 A) para o registro contínuo das variações da
pressão de perfusão como demonstrado na Figura 1.
141
Figura 1. Esquema do LVM perfundido com solução de Krebs (Adaptado de Carvalho, 2002).
Uma vez instalada a perfusão do leito mesentérico, foi respeitado um período de no
mínimo 40 min para a devida adaptação do LVM às novas condições experimentais (período de
equilíbrio). Nestas condições experimentais a pressão de perfusão basal, ao final do período de
equilíbrio oscilava entre 20 e 40 mmHg. Após este período, testou-se a viabilidade dos vasos
mesentéricos por meio de injeção in bolus de 120 µmol de KCl diretamente no fluxo de Krebs.
Esta injeção, como as demais, foi feita imediatamente antes da cânula arterial. Os fármacos foram
injetados in bolus em volume sempre inferior a 110 µL. O efeito vasodilatador ou vasoconstritor
dos fármacos injetados durante a resposta pressora NOR foram quantificados em termos de
percentagem da resposta pressora da NOR. Além das injeções feitas in bolus, dos agentes
vasodilatadores dependentes de endotélio (ACh) e independente de endotélio (NG), também
foram injetados os diferentes extratos de A. zerumbet e A. purpurata, in bolus.
142
Análise Estatística.
Para os cálculos estatísticos foi utilizado o programa GraphPad InStat 3.0. O programa
SigmaPlot 5.0 foi utilizado na montagem dos gráficos. Para comparar as variações das pressões
de perfusão em grupo experimental diferente foi utilizado o teste Bonferroni não pareado, nível
de significância p<0,05.
Resultados e Discussão
O perfil cromatográfico das espécies A. zerumbet e A. purpurata (Figura 2) mostra a
presença de flavonóides já isolados e sugeridos por contribuírem com a atividade hipotensora da
espécie A. zerumbet (Mpalantinos et al., 1998). A concentração dos flavonóides rutina e
kaempferol-3-O-glicuronídeo nos extratos secos de folhas de A. zerumbet e A. purpurata está
contida na Tabela 1. A maior diferenças entre as espécies, para os flavonóides avaliados, se refere
a maior concentração de kaempferol-3-O-glicuronídeo nas folhas de A. zerumbet (5,9 mg.mg-1).
Entre as plantas in vitro de A. zerumbet o meio controle (MS0) mostrou maior número de fenóis
totais (66,8 µg EAG. mg-1), enquanto o tratamento com AIA 2 mostrou menos que 50% de fenóis
(26,2 µg EAG. mg-1) em relação ao controle (Tabela 1). Estes valores estão condizentes com o
maior ou menor efeito dos extratos de plantas in vitro no LVM. A produção de polifenóis em
sistemas de cultivo in vitro já foi verificada para várias espécies (Konczak-Islam et al., 2003). Os
polifenóis estão associados à redução dos riscos cardiovasculares (Khan & Mukhtar, 2007;
Maisuthisakul et al., 2008).
143
A
B
0
20
40
60
Tempo de Retenção (min)
Figura 2. Perfis cromatográficos (CLAE) dos extratos hidroalcoólico de Alpinia zerumbet (A) e
Alpinia purpurata (B) de campo, 360 nm, utilizados no teste de reatividade: (1) rutina e (2).
Kaempferol-3-O-glicuronídeo. Os números na figura correspondem aos mesmos da Tabela 1.
Tabela 1. Concentração de flavonóides nos extratos de Alpinia zerumbet e A. purpurata, obtidas a
partir das curvas analíticas dos padrões.
Espécie
Tratamento
Fenóis totais
No. a
TR
rutina
kaempferol-3-O-glicuronídeo
-1
(µg EAG. mg )
(mg.100 mg-1 de extrato seco)
A. zerumbet
campo
58,1
1
31.233
0,48
-
2
34.772
-
4,74
0,0003
0,024
0,134
0,58
-
0,028
0,018
0,032
0,20
in vitro
MS0
AIA2
AIA2 + TDZ2
A. purpurata
66,8
26,2
43,7
30,1
32.314
1
35.524
2
a
Números se referem aos sinais dos cromatogramas da Figura 1.
campo
144
Efeito vasodilatador da espécie Alpinia purpurata
O LVM isolado de ratos foi perfundido com solução de Krebs, a 4 mL/min, e apresentou
pressão de perfusão média basal em torno de 25 a 30 mmHg. A injeção in bolus de 120 µmol de
KCl aumentou a pressão de perfusão para 80 mmHg, demonstrando a viabilidade da preparação
de LVM (Figura 2). A adição de NOR (30 µM) na solução de perfusão induziu uma elevação da
pressão de perfusão e a manteve constante em 84 a 120 mmHg, o que possibilitou o estudo do
efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de A. purpurata. A administração in bolus de Ach
(10 pmol) e NG (10 nmol) reduziram a pressão de perfusão, demonstrando a integridade do
endotélio e do músculo liso vascular, respectivamente. A administração de doses crescentes do
extrato da A. purpurata (3, 6, 10, 30 e 60 µg) produziu efeito vasodilatador dose-dependente de
duração prolongada, similar ao padrão de resposta da espécie A. zerumbet (Moura et al., 2005)
(Figura 3). A resposta foi crescente à medida que se aumentou a dose, a partir de 6 µg. Para A.
zerumbet o efeito foi mais eficaz do que para o extrato de A. purpurata, a 6 µg o efeito constritor
da NOR foi mais que 50% revertido (Figura 4) (Emiliano, 2002; Moura et al., 2005). No entanto,
o extrato da espécie A. purpurata mostrou um relaxamento crescente e contínuo, com a mesma
potência na resposta ao final, na dose de 60 µg (Figura 4). As semelhanças quanto a resposta e
efeito vasodilatador das espécies podem estar relacionadas à presença de metabólitos secundários
comuns. A espécie A. purpurata é um recurso natural de flavonóides importantes, como a rutina,
derivado de quercetina, e kaempferol-3-O-glicuronídeo que podem ser explorados, isolados e
testado em frações mais puras. Ambas as classes de flavonóides são referidas por terem ação
vasodilatadora e anti-hipertensiva (Duarte et al., 1993; Formica & Regelson, 1995; PerezVizcaino et al., 2002; Xu et al., 2006). Recentemente, Ferreira et al. (2007) verificaram que a
rutina é um dos principais flavonóides de extratos etanólicos de Hancornia speciosa que
contribuem para atividade vasodilatadora endotélio-dependente na artéria mesentérica de ratos. A
145
ação vasodilatadora endotélio-independente também foi verificada em estudos com o flavonóide
quercetina (Perez-Vizcaino et al., 2002).
Figura 3. Registro das alterações na pressão de perfusão no LVM de rato induzida pelo KCl, Ach,
NG e do extrato de Alpinia purpurata de campo obtidas durante o efeito pressor provocado pela
NOR.
*
0
% Relaxamento
*
20
40
*
60
80
Alpinia purpurata
a
Alpinia zerumbet
100
1
10
100
Doses (µg)
Figura 4 – Relaxamento induzido pelo extrato de Alpinia purpurata e Alpinia zerumbet de campo
(Rio de Janeiro) no LVM isolado de rato, contraído com norepinefrina (30 µM). Os dados são
apresentados como média ± EP; n ≥ 6 para todos os grupos. * Indicam diferenças significativas
entre as espécies, p< 0,05, Bonferroni. aEmiliano, 2002.
146
Em estudos realizados por Emiliano (2002) sugere-se que o efeito vasodilatador do
extrato
idroalcóolico de A. zerumbet é endotélio-dependente e está relacionado à produção de
NO que é um agente vasodilatador que atua aumentando a atividade da guanilato ciclase solúvel,
que por sua vez induz a produção de GMPc (Nagao & Vanhoutte, 1991; Rapaporte & Murad,
1983). Conforme estes dados, o uso popular da A. zerumbet nos casos de hipertensão arterial
mostra respostas positivas devido a ação do extrato na diminuição da resistência periférica
(Emiliano, 2002). Tal sugestão pode ser avaliada para o extrato de A. purpurata, no entanto os
resultados obtidos são preliminares e seriam necessários outras coletas e ensaios biológicos para
sugerir o efeito vasodilatador da espécie. Mpalantinos (2001) obteve resultados diferenciados
quanto a atividade do extrato aquoso de A. zerumbet oriundo de diferentes regiões do Brasil.
Inclusive, para alguns destes extratos de A. zerumbet a atividade vasodilatadora foi inferior ao
obtido por A. purpurata no presente estudo (Figura 4). As condições ambientais influenciam na
produção de metabólitos secundários, que alteram as curvas dose-efeito.
Efeito vasodilatador das plantas in vitro de Alpinia zerumbet
Os extratos de A. zerumbet obtidos de plantas in vitro mostraram diferentes respostas, mas
sempre com padrão vasodilatador dose-dependente de duração prolongada (Figura 5). Os
tratamentos com reguladores de crescimento vegetal reduziram as respostas obtidas com exceção
do tratamento AIA 2 + TDZ 2 nas doses 30 e 60 µg. Estes resultados podem indicar o efeito
inibitório do AIA 2 em relação a produção dos metabólitos secundários, visto que a
administração isolada do AIA 2 resultou em maior inibição do que a combinação AIA 2 + TDZ
2. De modo geral, a planta em meio controle foi mais eficiente quanto a resposta vasodilatadora.
A máxima resposta obtida para os extratos de plantas in vitro de A. zerumbet foi de 60% de
relaxamento na dose de 90 µg, contra 95% das plantas de campo a 60 µg. Embora a condição in
147
vitro seja uma ferramenta importante na produção de material vegetal em larga escala, os
resultados para a produção de metabólitos secundários in vitro não foi propícia ainda que
utilizando reguladores de crescimento vegetal como eliciador. Mas resultados importantes podem
ser sugeridos, como a inibição de vias metabólicas secundárias pela auxina AIA (Collin, 2001),
em concordância com a diminuição de fenóis totais em extratos oriundos deste tratamento. Os
polifenóis são substâncias antioxidantes importantes no processo de estabilização e/ou
desativação dos radicais livres, características importantes no tratamento ou prevenção de
doenças cardiovasculares (Atoui et al., 2005).
70
Controle
AIA2
AIA2 + TDZ2
% Relaxamento
60
50
*+
+
40
#+
30
*
20
*
10
0
* +
10
*
30
60
90
Doses (µg)
* resposta menor em relação ao controle
# resposta maior em relação ao controle
+ resposta maior do tratamento AIA2 + TDZ2 em relação ao tratamento AIA2
Figura 5 – Relaxamento induzido pelo extrato de plantas in vitro de Alpinia zerumbet tratadas
com diferentes reguladores de crescimento vegetal, no LVM isolado de rato contraído com
norepinefrina (30 µM). Os dados são apresentados como média ± EP; n ≥ 6 para todos os grupos.
Diferenças significativas, p< 0,05, Bonferroni.
148
Conclusão
A presença de rutina no extrato de ambas espécies é um dos fatores que contribuem para a
atividade vasodilatadora, com base em literatura recente. Através deste estudo, a detecção de
kaempferol-3-O-glicuronídeo pode indicar outro flavonóide relacionado a este efeito terapêutico.
Pelos testes preliminares realizados, os extratos hidroalcóolicos da espécie A. purpurata,
embora tenha mostrado ação vasodilatadora com igual potência a espécie A. zerumbet, na dose de
60 µg, a combinação eficiência e potência requerida para implementação de um fármaco não foi
obtida. No entanto, a presença de substâncias biologicamente ativas foi detectada, o que não
exclui a espécie A. purpurata como um recurso natural no uso terapêutico e matéria-prima em
estudos fitoquímicos. Além disso, os estudos são preliminares e seria necessária a obtenção de
extratos de outras localidades para confirmar a resposta dose-efeito.
As plantas in vitro de A. zerumbet mostraram efeito vasodilatador reduzido em
comparação com o material vegetal oriundo do campo. Alta produção de polifenóis totais não foi
equivalente ao aumento no efeito vasodilatador. Assim sendo, nenhum dos tratamentos com
reguladores de crescimento vegetal otimizou a produção de metabólitos específicos que estariam
envolvidos com o efeito vasodilatador.
149
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os primeiros resultados obtidos no intuito de identificar uma metodologia e o solvente
mais apropriado para a extração de flavonóides de folhas secas de A. zerumbet otimizaram todo o
trabalho fitoquímico das espécies tanto coletadas no campo quanto provindas das culturas in
vitro.
A propagação in vitro estabelecida de A. zerumbet e A. purpurata foi adequada para
produção de mudas selecionadas com qualidade fitossanitárias, uniformidade, produção rápida e
adaptação após transferência para o solo. Tais requisitos são importantes para o investimento em
produções maiores de mudas, sem o impacto sobre as populações naturais e dispensando o uso de
largas áreas de cultivo. Além disso, estas culturas in vitro viabilizam e dinamizam a produção de
mudas de alta qualidade para fins ornamental e medicinal. Ambas espécies responderam melhor
ao meio líquido e apresentaram poucas variações quanto ao desenvolvimento, conforme os
reguladores de crescimento utilizado.
Os sistemas in vitro, como a cultura de calos e células em suspensão de A. zerumbet, é um
pontapé inicial para produção em biorreatores de metabólitos secundários e trazem como
perspectivas o estudo de etapas de rotas biossintéticas in vitro.
A investigação de flavonóides em folhas de A. purpurata é pioneira e mostra resultados
promissores quanto à presença de substâncias biologicamente ativas. Com este trabalho foi
isolada a rutina e detectado o flavonóide kaempferol glicuronídeo e outras substâncias não
identificadas.
A obtenção de flavonóides e substâncias aromáticas, sob condições in vitro, é uma
ferramenta importante na avaliação de fatores químicos, como os fitorreguladores, e físicos, na
modulação da produção de metabólitos secundários. Também possibilita a ampliação do uso de
150
estimuladores, contribuindo para o entendimento das rotas biossintéticas e a interação das
respostas morfológicas, fisiológicas e fitoquímicas do vegetal. Este estudo avaliou de forma
indireta as repostas das vias metabólicas do ácido chiquímico e mevalonato sob a interferência de
hormônios vegetais. Vale ressaltar o
idroal inédito da relação TDZ e produção de flavonóides
in vitro. A combinação AIA e TDZ produziu as melhores respostas para produção in vitro de
flavonóides, para ambas espécies, embora não tenha sido encontrada correlação com o
aprimoramento do desenvolvimento in vitro.
As técnicas hidrodestilação, extração por destilação simultânea e “headspace” utilizadas
para extração do óleo essencial permitiram a detecção dos principais monos e sesquiterpenos da
espécie A. zerumbet. No entanto, através da técnica de EDS mais substâncias voláteis foram
isoladas em relação aos outros métodos.
Os estudos in vitro relacionando produção de terpenos sob influência de reguladores de
crescimento vegetal também trazem novas perspectivas sobre o uso em plantas no campo, visto
que os sítios primários de síntese dos monoterpenos estão localizados nas folhas e a aspersão
seria uma metodologia facilmente empregada.
Semelhanças quanto à composição química entre A. zerumbet e A. purpurata direcionam e
ampliam os estudos fitoquímicos e farmacológicos da espécie A. purpurata. Adicionalmente, os
resultados preliminares da espécie A. purpurata, mostram igual padrão de resposta para atividade
vasodilatadora que merecem ser aprofundado quanto à eficácia.
Os ensaios farmacológicos com extratos de plantas in vitro de A. zerumbet, sugerem que
não só os flavonóides estão envolvidos na resposta vasodilatadora, mas também outros polifenóis
devido a maior concentração destes em extratos de plantas cultivadas em meio controle em
relação à de campo. A diminuição dos efeitos obtidos para os extratos oriundos de plantas
151
tratadas com auxina também sugere que a auxina AIA pode agir inibindo a rota biossintéticas das
substâncias fenólicas.
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flowers of Alpinia speciosa K. Schum. and A. purpurata (Viell.) Schum. Flavour and Fragrance.
Journal, 14: 411– 414, 1999.
181
Apêndice A
Produção científica: Resumos e Artigos submetidos
Lista de Resumos
VII Jornada Paulista de Plantas Medicinais, 2005
1. VICTÓRIO, C.P.; ESQUIBEL, M.A..; LAGE, C.L.S. Estabelecimento da Cultura In Vitro da
Colônia (Alpinia zerumbet Pers. Burtt et Smith)
XVI Congresso idro-Latino-Americano de Etnomedicina, 2007
2. VICTÓRIO, C.P.; KUSTER, R.M.; LAGE, C.L.S. Detecção de flavonóides em plantas in vitro
de Alpinia zerumbet por cromatografia em camada delgada
3. VICTÓRIO, C.P.; KUSTER, R.M.; LAGE, C.L.S. Metodologias de extração de flavonóides de
folhas de Alpinia zerumbet Pers. Burtt et Smith
VIII Jornada Paulista de Plantas Medicinais, 2007
4. VICTÓRIO, C.P.; KUSTER, R.M.; LAGE, C.L.S. Detecção de flavonóides de Alpinia
purpurata por CCD e CLAE
IV Simpósio Brasileiro de Óleos Essenciais, 2007
5. VICTÓRIO, C. P.; CASTELLAR, A.; LEITÃO, S. G., LAGE, C.L.S. Constituintes químicos
do óleo essencial de folhas de Alpinia purpurata coletada no rio de janeiro
6. VICTÓRIO, C. P.; LEITÃO, S. G., LAGE, C.L.S. Análise do óleo essencial de folhas de
Alpinia zerumbet coletada em diferentes períodos do ano no rio de janeiro
XXIX Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Artística e Cultural UFRJ, 2007
7. DA CRUZ, I. P.; VICTÓRIO, C. P. ; LAGE, C. L. S. . Micropropagação de Alpinia purpurata
a partir de Brotos Florais.
VIII Jornada de Biofísica, UFRJ, 2007
8. VICTÓRIO, C.P.; DA CRUZ, I.P., KUSTER, R.M.; LAGE, C.L.S. Perfil cromatográfico dos
extratos idroalcóolicos de plantas de Alpinia zerumbet Pers. Burtt et Smith cultivadas in vitro
sob ação de fitohormônios.
9. VICTÓRIO, C.P.; DA CRUZ, I.P., BELTRAMI, J.C., KUSTER, R.M.; LAGE, C.L.S
Produção de polifenóis em cultura de tecidos de Alpinia zerumbet Pers. Burtt et Smith
10. VICTÓRIO, C.P.; DA CRUZ, I.P., BELTRAMI, J.C., KUSTER, R.M.; LAGE, C.L.S
Variação sazonal de polifenóis de plantas de Alpinia zerumbet e Alpinia purpurata
XX Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil & X Congresso Internacional de
Etnofarmacologia, 2008
182
11. VICTÓRIO, C.P.; RIEHL, C.A.S.; LAGE, C.L.S. Headspace analysis of leaf aroma of
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith.
12. VICTÓRIO, C.P.; SILVA, D.O.; ALVIANO, D.S.; ALVIANO, C.S.; LAGE, C.L.S
Antimicrobial activity of leaf oil from Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith.
Resumos publicados em revistas científicas
VICTÓRIO, C.P.; KUSTER, R.M.; LAGE, C.L.S. Detecção de flavonóides de Alpinia
purpurata por CCD e CLAE. Jornal Brasileiro de Fitomedicina, 5(3): 177.
Artigos submetidos 2007-2008
1. VICTÓRIO, C. P.; LEITÃO, S. G., LAGE, C.L.S. Chemical composition of the leaf oils of
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith and A. purpurata (Vieill) K. Schum. from Rio de Janeiro,
Brazil.. Journal of Essential Oil Research (Aceito 08.08.2008) – Item 4.1
2. VICTÓRIO, C.P., ALVIANO, D.S., ALVIANO, C.S., LAGE, C.L.S. Chemical composition
of fractions of leaf oil of Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith. and antimicrobial activity.
Revista Brasileira de Farmacognosia.
3. VICTÓRIO, C.P.; DA CRUZ, I.P.; KUSTER, R.M.; LAGE, C.L.S. Detection of flavonoids in
Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum. Leaves by high-performance liquid chromatography.
Revista Brasileira de Plantas Medicinais (Aceito 24.05.2008, em fase de correção) - Item 2.2
4. VICTÓRIO, C.P.; RIEHL, C.A. da S.; LAGE, C.L.S. Simultaneous distillation-extraction,
hydrodistillation and headspace methods for the analysis of volatile secondary metabolites of
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith from Southeast Brazil. Journal of Essentail Oil Bearing
Plants (Aceito 21.08.2008, em fase de correção) – Item 4.1
5. VICTÓRIO, C.P.; KUSTER, R.M.; SOARES DE MOURA, R.; LAGE, C.L.S. Atividade
vasodilatadora do extrato de Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith in vitro e A. purpurata
(Vieill) K. Schum de campo. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas – Item 5.1.
6. VICTÓRIO, C.P.; DA CRUZ, I.P.; SATO, A.; KUSTER, R.M.; LAGE, C.L.S. Effects of
auxins and cytokinins on in vitro development of Alpinia purpurata (Vieill) K. Schum and
phenolic compounds production. Plant Cell Cuture & Micropropagation – Item 1.2.
7. VICTÓRIO, C.P.; DA CRUZ, I.P.; LAGE, C.L.S. In vitro establishment of Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith cultures. Revista Ciência Agronômica – Item 1.1
183
Artigos em fase de preparação
1. Aroma quality of field and in vitro Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith. by headspace. Item
4.2.
2. Leaf and root oil produced by in vitro Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith. under influence
of different plant growth regulators
3. Variations of flavonoids contents on in vitro plants of Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Smith.
cultured with growth regulators. Item 3.1
184
Anexo A
RMN 1H da fração Ap (29) 4 (400 MHz – Metanol OD)
185
Anexo B
RMN 13C da fração Ap (29) 4 (100 MHz – Metanol OD)
186
Anexo C
Coinjeção em CLAE dos padrões de flavonóides (rutina, kaempferol-3-O-glicuronídeo e
kaempferol-3-O-rutinosídeo) com o extrato hidroalcoólico de folhas de Alpinia zerumbet in vitro,
cultivadas em meio AIA 2 + TDZ 2.
mAbs
Tempo de renteção (min)
187
Anexo D
Coinjeção em CLAE e aplicação conjunta em CCD dos padrões de flavonóides (rutina e
kaempferol-3-O-glicuronídeo) com o extrato hidroalcoólico de folhas de campo de Alpinia
purpurata.
mAbs
CLAE
Tempo de renteção
188
CCD