FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
Programa de Pós-Graduação de Clínica e Reprodução Animal
VANESSA VISCARDI
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA
FOSFATASE ALCALINA (EC 3.1.3.1) NO
LAVADO TRAQUEAL DE EQUINOS DA
POLÍCIA MILITAR DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
NITERÓI
2012
1
VANESSA VISCARDI
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA (EC 3.1.3.1)
NO LAVADO TRAQUEAL DE EQUINOS DA
POLÍCIA MILITAR DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Clínica e Reprodução
Animal da Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial para a obtenção do
Grau de Mestre. Área de Concentração:
Clínica e Reprodução Veterinária
Orientador: Prof. Dr. DANIEL AUGUSTO BARROSO LESSA
Orientador: Profa. Dra. NADIA REGINA PEREIRA ALMOSNY
Coorientador: Prof. Dr. NAYRO XAVIER ALENCAR
Niterói
2012
2
V822
Viscardi, Vanessa
Determinação da atividade da fosfatase alcalina
(EC 3.1.3.1) no lavado traqueal de equinos da
Polícia Militar do estado do Rio de Janeiro/
Vanessa Viscardi; orientador Daniel Augusto Barroso
Lessa. — 2012.
50f.
Dissertação (Mestrado em Clínica e Reprodução
Animal) — Universidade Federal Fluminense, 2012.
Orientador: Daniel Augusto Barroso Lessa
1. Doença respiratória. 2. Doenças do cavalo. 3.
Fosfatase alcalina. 4. Traqueia. 5. Citologia.
I. Título.
CDD 636.08962
3
DEDICATÓRIA
À minha família, pela torcida, pela compreensão e pelo incentivo sempre presentes.
Em especial aos meus pais, Monica e Tadeu, por todo apoio, amor e dedicação que
me ofereceram desde o meu primeiro dia de vida até hoje; ao meu querido irmão
Filipe, que embora pequeno, já é um grande companheiro, inclusive de cavalgadas;
à minha avó Lygia, que onde estiver, tenho certeza que está acompanhando mais
esta vitória.
Aos meus queridos amigos de infância, adolescência, de faculdade, de residência,
da vida, pelos anos de amizade, por compreenderem as minhas ausências, pelos
momentos compartilhados, por permanecerem por perto e acreditarem em mim.
À minha égua Ventania, por me mostrar que o meu caminho era o da veterinária,
pelo exemplo de força e de luta. Aos rottweilers Juma e Bructus, pelo amor
incondicional, pela fidelidade e pelo companheirismo que nunca serão esquecidos.
Ao meu querido Mangalarga Paulista, Querubim, que desde 1997 me traz alegrias.
Aos animais, por sua sinceridade e pureza, por compreenderem muitas ações que
sequer o ser humano compreende e, principalmente, por tudo que são capazes de
nos ensinar.
4
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Daniel Lessa, meu orientador, por acreditar em mim, por me orientar e,
junto com o prof. Nayro Xavier, meu coorientador, por todas as dicas e pela
infraestrutura viabilizada que otimizaram meu experimento. Muito obrigada pela
paciência, incentivo e ensinamentos, desde a época da graduação.
A mestre e, agora, colega de trabalho, Maria Luisa, pela presença e ajuda
constantes em todas as fases do meu mestrado, inclusive na dissertação. Você é um
exemplo de pessoa e profissional a ser seguido! Às mestres Juliana e Kátia, pela
ajuda indispensável com as coletas, dosagens e dissertação. Meninas, muito
obrigada por tudo, principalmente por serem meu cérebro nos meus instantes de
débito ou crédito e por tornarem divertidos até os momentos mais estressantes.
Ao nosso grupo de pesquisa Hipiatras, que vem crescendo e se fortalecendo a cada
ano. Às mestrandas Gabi e Paula, pela ajuda com o certificado do comitê de ética e
abstract, e Julia Timponi pela ajuda nas coletas. Aos graduandos Carlos, Marina,
Nathália, Gisela e Thomaz pela presença nos longos dias de coletas na PMERJ. A
mestre e amiga Eliene Pina, pela ajuda na dissertação. Ao Rodolpho Oliva, pela
presença indispensável com o design.
À Polícia Militar do Estado do Rio de Janeiro, em especial à equipe da subseção de
veterinária, minha nova família! Aos PM Aux. Enf. André, Cardoso, (Carlos)
Azevedo, Duque, Edimilson, Fernando, Kassia, Jonas, Márcia Amorim, Matias, Mello
e Trindade; aos Ten PM Rego e Schrapett e aos civis Juninho e Maurício por toda
ajuda na seleção e manejo dos animais. Ao CB PM Hector pelo auxílio com a nova
ortografia. Ao Maj PM Vet Alexandre e ao grande amigo e Ten PM Vet (Roberto)
Gonçalves, por permitirem trocar os plantões necessários para concluir meu
experimento. Ao Cmt do RPMont/CECS, Cel Samaha, e ao chefe da Subseção de
Veterinária, Ten Cel Luciano, pela autorização para a execução deste trabalho.
A Coopers Brasil LTDA®, pela doação do Coopazine®, sedativo necessário para
contenção química de alguns cavalos, garantindo a segurança dos animais e dos
profissionais.
Aos amigos: os doutorandos Ananda e Pedro, a mestranda Renata Guedes e os Ten
Vet Lee e Cássia pela presença indispensável nas hemogasometrias. À profa. Nadia
Almosny, sem a qual eu não teria material para fazer os exames de
hemogasometria, além da ajuda essencial na interpretação dos resultados obtidos.
5
Aos professores da UFF Ana Beatriz Monteiro, pela estatística e Luciano, pela ajuda
com os exames parasitológicos. À técnica do laboratório de patologia clínica da UFF
Camila, pela ajuda com as bioquímicas e com as minhas amostras congeladas.
À veterinária do JCB Rosalie Kowal, por permitir que o uso do microscópio para
realizar as leituras de algumas lâminas. Aos meus colegas de trabalho do SIT pelos
diversos plantões trocados, especialmente às amigas Julia e Angelina, sem as quais
eu não conseguiria ter conciliado trabalho e mestrado.
Aos queridos amigos Bruno, doutorando na UFF, pelo apoio e ajuda nesses dois
anos e João Paulo, doutorando na Universidade de Michigan, pelos diversos artigos
adquiridos; Carol Costa e Rodrigo Almeida, pela presença na hora do meu
desespero estatístico.
Aos colegas de turma de mestrado, em especial Gabriel Bobany, Isabela, Livia, Luis
e Renata Guedes pela amizade, pelas risadas compartilhadas e por tornarem esta
etapa de nossas vidas mais alegre e divertida. Espero não perdermos o contato.
À minha mãe, por aturar meus momentos de mau humor, cansaço e ansiedade, pela
motivação sempre presente e por todo o tempo dispensado comigo e minha
dissertação. Ao meu pai, pelos conselhos, apoio e torcida; por realizar um dos meus
maiores sonhos e mantê-lo até hoje: o Querubim! À minha “roomie” Fernanda, pelo
lar compartilhado, por ser a irmã que nunca tive, pela paciência com a minha
pessoa, pelas diversas soluções básicas para problemas que eu considerava
complexos. Vou sentir saudades!!!
A todos os animais que cruzaram o meu caminho, seja em aula, seja na rua, seja no
trabalho ou nas férias... Em especial aos cavalos da PMERJ! Desculpem-me por
qualquer coisa, e muito obrigada pela existência de vocês!
A Deus e ao meu Anjo da Guarda, por cuidarem tão bem de mim.
A todos aqueles que de alguma maneira estiveram presentes na minha vida nesses
últimos dois anos e que, direta ou indiretamente, me ajudaram a completar mais esta
jornada, o meu MUITO OBRIGADA!
6
“Quanto mais as pessoas acreditam em uma coisa,
quanto mais se dedicam a ela,
mais podem influenciar no seu acontecimento”.
Dov Éden
7
RESUMO
Doenças respiratórias são a segunda principal causa de interrupção do treino de
cavalos atletas, sendo responsáveis por perdas econômicas consideráveis no setor
equestre mundial. A importância clínica das determinações das atividades
enzimáticas como ferramenta diagnóstica das enfermidades do trato respiratório
posterior já foi demonstrada em várias espécies, mas esses estudos ainda são
escassos na espécie equina. Por isso, o objetivo deste trabalho foi determinar a
atividade da Fosfatase Alcalina (FAL) no lavado traqueal (LT) de equinos
considerados sadios e equinos portadores de inflamação do trato respiratório
posterior, de acordo com o escore endoscópico e perfil citológico da traqueia. Para
tal, foram avaliados 36 cavalos machos, adultos, pertencentes à Polícia Militar do
Estado do Rio de Janeiro. Todos os animais apresentaram resultados do exame
físico, hemogasometria, hematócrito, leucograma, proteína total e fibrinogênio
plasmáticos dentro dos parâmetros fisiológicos. Os equinos selecionados foram
submetidos ao exame endoscópico para quantificação do muco traqueal e coleta do
lavado. O LT foi utilizado para citologia traqueal e dosagem da atividade da FAL,
realizada por espectrofotometria a partir de alíquotas do sobrenadante preservadas
em nitrogênio líquido. Esses 36 equinos foram classificados em três categorias
divididos em sadios e/ou com inflamação: categoria 1 - endoscopia (GE1 e GE2),
categoria 2 – citologia (GC1 e GC2) e categoria 3 – endoscopia + citologia (G1, G2,
G3 e G4). A atividade da FAL no LT dos cavalos com achados compatíveis com
inflamação do trato respiratório posterior (GE2, GC2, G4) foi maior que nos cavalos
considerados sadios (GE1, GC1 e G1, respectivamente), sendo esta diferença
estatisticamente significativa (P=0,021) entre os GC1 (10282,85 ± 5856,97) e GC2
(18865,05 ± 11233,40). A determinação da FAL no LT pode ser usada como
complementação do diagnóstico de enfermidades respiratórias, estando esta
elevada em equinos adultos, sem queixas clínicas, com perfil citológico traqueal
compatível com inflamação do trato respiratório posterior.
Palavras-chaves: equino, lavado traqueal, fosfatase alcalina, citologia traqueal,
escore endoscópico.
8
ABSTRACT
Respiratory diseases are the second main cause of lost training days and premature
retirement in performance horses and are responsible for considerable economic
losses in the equine industries worldwide. The clinical importance of enzymatic
activity determination as a diagnostic tool in lower respiratory tract (LRT) disorders
has been shown in many species, but there are still few studies in the equine
species. Therefore, the purpose of this study was to determine alkaline phosphatase
(AP) activity in tracheal wash (TW) of horses considered healthy and those with LRT
inflammation according to tracheal endoscopic score and cytological profile. Thirty six
male adult horses belonging to the Military Police of Rio de Janeiro State were
evaluated. All animals were normal at the physical exam and blood gas analysis; and
packed cell volume, white cell count, total protein and fibrinogen were within normal
limits. Endoscopic examination was done to quantify mucus accumulation and to
perform TW. TW cytology was evaluated and the AP activity of TW supernatant
aliquots preserved in liquid nitrogen was determined by spectrophotometry. The 36
horses were classified in three categories and divided into healthy and/or with
inflammation: category 1 – endoscopy (GE1, GE2), category 2 – cytology (GC1,
GC2) and category 3 – endoscopy + cytology (G1, G2, G3, G4). The AP activity of
TW in horses with LRT inflammation (GE2, GC2, G4) was higher than in healthy
horses (GE1, GC1 and G1, respectively). However, this difference was considered
statistically significant (P=0,021) only between GC1 (10282,85 ± 5856,97) and GC2
(18865,05 ± 11233,40). With the results of this study, it is possible to conclude that
determining AP activity in equine TW can be used as a complementary diagnosis of
respiratory diseases, since it is higher in adult horses with cytological profile of LRT
inflammation without clinical signs.
Key words: horses, tracheal wash, alkaline phosphatase, tracheal cytology,
endoscopic score.
9
SUMÁRIO
LISTA DE APÊNDICES
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
11
1. INTRODUÇÃO
12
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
15
3. MATERIAL E MÉTODO
20
3.1. Animais
20
3.2. Exames realizados
22
3.2.1. Exame Endoscópico
22
3.2.2. Exames Laboratoriais
23
3.3. Critérios para a formação dos grupos
27
3.3.1. Categoria 1 - Endoscopia
28
3.3.2. Categoria 2 - Citologia
29
3.3.3. Categoria 3 – Endoscopia + Citologia
29
3.4. Análise estatística
4. RESULTADOS
30
31
4.1. Atividade da FAL no LT dos animais na categoria 1 (GE1 e GE2)
31
4.2. Atividade da FAL no LT dos animais na categoria 2 (GC1 e GC2)
32
4.3. Atividade da FAL no LT dos animais na categoria 3 (G1,G2,G3,G4)
32
5. DISCUSSÃO
33
6. CONCLUSÃO
36
7. BIBLIOGRAFIA
37
APÊNDICES
43
10
LISTA DE APÊNDICES
APÊNDICE A – Dados de identificação dos 36 equinos pertencentes a PMERJ
utilizados neste estudo. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f. 43.
APÊNDICE B – Dados das funções vitais dos 36 equinos deste experimento. Rio de
Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.44.
APÊNDICE C – Resultados dos Hematócritos, Proteínas Plasmáticas Totais e
Fibrinogênios Plasmáticos dos 36 equinos deste experimento. Rio de Janeiro,
setembro-dezembro de 2010/2011, f.45.
APÊNDICE D – Resultados dos Leucogramas dos 36 equinos deste experimento.
Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.46.
APÊNDICE E – Resultados do pH, da PaO2 e da PaCO2 do sangue arterial dos 36
equinos. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.47.
APÊNDICE F – Resultados dos exames endoscópicos dos 36 equinos deste
experimento. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.48.
APÊNDICE G – Resultados em percentuais da contagem celular diferencial das
amostras de LT coradas pelo Giemsa dos 36 equinos deste experimento. Rio de
Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.49.
APÊNDICE H – Valores da atividade da FAL no FET dos 36 equinos deste
experimento. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.50.
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DIVA
Doença Inflamatória das Vias Aéreas
E
Escore endoscópico
FAL
Fosfatase Alcalina
FAN
Fosfatase Alcalina dos Neutrófilos
FD
Fator para correção da diluição
FET
Fluido epitelial traqueal
Fig.
Figura
GC
Grupo citologia
GE
Grupo endoscopia
LBA
Lavado broncoalveolar
LT
Lavado traqueal
PMERJ
Polícia Militar do Estado do Rio de Janeiro
RPMont/CECS
Regimento de Polícia Montada Coronel Enyr Cony dos Santos
12
1. INTRODUÇÃO
A história do homem e do cavalo é o relato de uma longa e bem sucedida
parceria, baseada em mútua confiança e em grande dose de compreensão. Desde
sua domesticação, há mais de dois mil anos, até o presente, o cavalo tem sido tanto
companheiro como servo fiel do homem. Poucos animais possuem um registro tão
antigo e completo, e o estudo de sua história é fascinante. Através dele, toma-se
conhecimento dos efeitos causados pela crescente mudança do meio ambiente na
batalha do animal pela sobrevivência e das adaptações que foram sendo
necessárias durante o processo de sua evolução (SAYER, 1977).
O Brasil possui a quarta maior tropa de equinos do mundo, com 5,8 milhões
de cabeças, sendo a maior concentração na região sudeste, com mais de 1.500.000
cavalos (IBGE, 2007). A importância social e econômica da equideocultura nacional
é traduzida por uma movimentação econômica da ordem de R$ 7,3 bilhões por ano
e a ocupação direta de mais de 640 mil pessoas, cifra que poderia atingir a casa de
3,2 milhões se fossem incluídos os empregos considerados indiretos. Considerando
apenas o segmento representado pelas federações hípicas, este mercado
movimenta R$ 57.600.000 anuais, empregando 2.000 pessoas. As escolas de
equitação movimentam R$ 78.000.000, gerando 9.000 empregos diretos, enquanto
que o segmento militar movimenta R$ 176.000.000 e gera 6.286 empregos diretos
(BARROS, 2006).
Se primeiramente o cavalo foi fonte de alimentação para o homem, logo
passou a ser meio de transporte urbano e rural, correio, máquina agrícola e até força
motriz, sendo um símbolo de poder em várias épocas históricas. Atualmente este
nobre animal ainda é usado como “carro” de carga e de passeio, além de ser um
elemento fundamental de desporto, lazer e para o policiamento montado.
13
Policiamento montado é a forma de policiamento que utiliza como meio de
locomoção o cavalo. Dentre as suas vantagens podemos citar: efeito psicológico da
presença do animal; atuação em terrenos inacessíveis a outras tropas; flexibilidade e
grande mobilidade (OLIVEIRA e ALVES, 2009).
O bom funcionamento do aparelho respiratório é fundamental para a saúde e
desempenho atlético. As enfermidades respiratórias acometem equinos de qualquer
idade e são a segunda principal causa de interrupção no treino de cavalos atletas
(RUSH e MAIR, 2004), sendo responsáveis por perdas econômicas consideráveis na
indústria equestre mundial (HODGSON e HODGSON, 2002).
A permanência dos equinos em grandes centros urbanos é um importante
fator de risco no desenvolvimento dessas enfermidades. Dentre elas, as não
infecciosas do trato respiratório posterior são particularmente importantes, sobretudo
na cidade do Rio de Janeiro, devido à sua prevalência (AMARAL et al., 1999;
LESSA et al., 2005; SAD, 2007; LESSA et al., 2008; JORGE, 2011; PEREIRA,
2011), e porque muitas vezes manifestam-se de forma discreta ou assintomática
(LESSA et al., 2008; LESSA et al., 2011), dificultando o diagnóstico e o tratamento
preciso.
Exame físico completo, histórico detalhado e técnicas diagnósticas adicionais
são importantes, especialmente para o diagnóstico das doenças respiratórias que
progridem de forma assintomática (VAN ERCK, 2009).
O estudo das secreções obtidas do trato respiratório já vem sendo realizado
no Brasil (MICHELOTTO JR, 1993; SANCHES, 1998; FERNANDES, 2001; LESSA,
2003; BIAVA, 2007; SAD, 2007; SANTOS et al., 2007; VIANA, 2008; SILVA, 2010;
VISCARDI et al., 2010; MICHELOTTO JR, 2010; JORGE, 2011) e tem sido
considerado de grande valia, já que representa um meio semiológico importante,
ajudando no diagnóstico (SANCHES, 1998; LESSA et al., 2011).
A citologia do lavado traqueal (LT) é considerada mais específica do que
somente o exame endoscópico. Apesar do lavado broncoalveolar (LBA) ser um
método bastante recomendado e utilizado para coleta de material para a avaliação
citológica do trato respiratório posterior (SCHUMACHER e MOLL, 2011), Hoffman
(2008) afirma que a realização deste procedimento, além de necessitar de sedação,
exige que o animal permaneça em repouso nas 24 a 48 horas posteriores. No caso
de animais atletas em atividade constante, esse repouso torna-se difícil de ser
14
executado. Nessas situações, o LT é apropriado, uma vez que não há necessidade
de repouso após a realização do procedimento, não interferindo no treinamento.
As técnicas diagnósticas rotineiramente
utilizadas podem apresentar
resultados falso-negativos, o que aumenta a necessidade de incorporação de novos
métodos que levem à melhoria da eficácia no diagnóstico e, por conseguinte, na
terapêutica. Portanto, é necessário estabelecer e implementar como rotina na clínica
médica de equinos a utilização de outros marcadores de processos inflamatórios
pulmonares como, por exemplo, a atividade das enzimas e, dentre elas, a fosfatase
alcalina (FAL). Tais marcadores podem, de forma segura, complementar as
informações obtidas pelas técnicas diagnósticas já consagradas.
O fluido epitelial contém elementos celulares e moleculares como, por
exemplo, enzimas e imunoglobulinas, que podem ser utilizados para a avaliação da
integridade do trato (SILVA et al., 2010). Pesquisadores já demonstraram a
importância clínica da utilização da determinação da atividade da FAL no trato
respiratório
posterior
como
ferramenta
diagnóstica
em
várias
espécies
(HENDERSON et al., 1995; CAPELLI et al., 1997; COBBEN et al., 1999a; COBBEN
et al., 1999b; MADEN et al., 2001). Na espécie equina, Jorge (2011) constatou
diminuição da atividade da FAL no LBA de equinos com citologia compatível com
Doença Inflamatória das Vias Aéreas (DIVA), não havendo informação sobre este
assunto, até o momento, para LT.
Em face do que foi previamente exposto, a determinação da atividade da FAL
no fluido epitelial traqueal (FET) de equinos é importante para o estabelecimento de
valores que futuramente possam ser utilizados na complementação do diagnóstico
de enfermidades pulmonares. Neste contexto, este estudo teve por objetivo
determinar a atividade da enzima FAL no FET de equinos adultos clinicamente
sadios, utilizados em policiamento montado no Estado do Rio de Janeiro, alocados
em três categorias de acordo com os escores endoscópicos e perfil citológico
traqueais.
15
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Enfermidades não infecciosas do trato respiratório posterior são comuns e
geralmente limitam o desempenho atlético do cavalo (RUSH e MAIR, 2004). As
doenças inflamatórias pulmonares possuem alta prevalência em equinos e podem
estar associadas tanto ao manejo ambiental quanto às condições de trabalho (VAN
ERCK, 2009).
As síndromes inflamatórias que afetam o trato respiratório posterior têm
recebido diversas nomenclaturas nos últimos anos, o que indica uma falta de
compreensão da fisiopatologia dessas síndromes e suas inter-relações. Nos
consensos internacionais de 20001 e de 20022 foram definidos três fenótipos
distintos para estas doenças das vias aéreas: Obstrução Recorrente das Vias
Aéreas (ORVA), DIVA de cavalos de corrida e DIVA de cavalos de lazer. Estas
definições mais precisas do fenótipo têm ajudado a esclarecer a patogênese das
doenças das vias aéreas (ROBINSON, 2008).
Lessa et al. (2008) caracterizaram clinicamente a DIVA nos cavalos da Polícia
Militar do Estado do Rio de Janeiro (PMERJ) como assintomática e justificaram o
fato devido ao trabalho de menor intensidade aeróbica realizado no policiamento
montado ou instruções de montaria.
O histórico detalhado do animal associado a um minucioso exame físico é
essencial para um diagnóstico preciso, mas algumas doenças respiratórias
progridem de forma assintomática e requerem técnicas adicionais de investigação
(VAN ERCK, 2009).
O exame endoscópico permite a visualização direta do trato respiratório
anterior, traqueia e entrada dos brônquios principais (RUSH e MAIR, 2004). Além de
1
2
International Workshop on Equine Chronic Airway Disease, Michigan StateUniversity, 16-18Jun2000
Inflammatory airway disease: defining the syndrome, Havemeyer Foundation, 30sep-3oct 2002.
16
possibilitar a avaliação da superfície da mucosa respiratória e da secreção traqueal,
a endoscopia também viabiliza a coleta guiada de secreções da traqueia e brônquios
para posterior avaliação citológica e bacteriológica (HODGSON e HODGSON,
2002).
Gerber et al. (2004a) demonstraram que a estratificação do acúmulo de muco
na traqueia baseada em uma avaliação endoscópica semiquantitativa (escore)
apresentou correlação significativa com o percentual de neutrófilos verificado à
citologia broncoalveolar, sendo considerada uma ferramenta clínica e de pesquisa
confiável para o diagnóstico de afecções inflamatórias do trato respiratório posterior
dos equinos. Porém, é subjetiva e sujeita a variações de resultados que dependem
do momento do exame (antes ou após exercício) e da interpretação de quem realiza
o exame, e por isso deve ser avaliado com cuidado.
A avaliação das secreções do trato respiratório posterior tem um papel vital
tanto para o manejo dos animais clinicamente doentes quanto para o progresso na
compreensão da fisiopatologia respiratória, especialmente com o desenvolvimento
de novas ferramentas de pesquisa (HEWSON e VIEL, 2002). As duas técnicas mais
importantes para avaliação das secreções do trato respiratório posterior são o LT e o
LBA (RUSH e MAIR, 2004).
Greet (1982) descreveu o método de coleta do LT em equinos via
endoscópio. Segundo Hodgson e Hodgson (2003) este método tem se tornado
popular, sendo considerado uma boa alternativa para coleta de material da traqueia.
Além de ser uma técnica não invasiva, ainda permite que o cateter seja guiado e
proporciona a inspeção do trato respiratório na hora da coleta de material,
possibilitando a avaliação da traqueia (grau de hiperemia) e conteúdo luminal
(quantidade e qualidade de secreção traqueal), dados que podem auxiliar na
interpretação dos resultados citológicos.
Apesar de o LT ser uma técnica simples, de baixo custo e segura para coleta
de componentes celulares e moleculares dos pulmões, a quantidade de fluido que
retorna é variável (PORTO et al., 2010). A instilação de solução isotônica para a
realização do LT resulta numa diluição significativa do FET (SILVA et al., 2010). Por
isso, para determinar a atividade enzimática no LT é preciso corrigir a diluição
causada pelo mesmo. A ureia é comumente utilizada como marcador endógeno de
diluição devido ao seu livre trânsito pelas membranas biológicas, estando em
equilíbrio no plasma e no FET (McGORUM et al., 1993).
17
Estudos avaliando enzimas celulares como marcadoras de afecções
pulmonares já foram realizados em ratos (HENDERSON et al., 1995), camundongos
(BEHNIA et al., 1996), caninos (MADEN et al., 2001), equinos (ART et al., 2006;
JORGE, 2011) e em seres humanos (COBBEN et al., 1999a; COBBEN et al., 1999b;
KUBOTA e HARUTA, 2006).
As fosfatases (EC 3.1.3.1) têm função hidrolítica, responsável pela remoção
do grupamento fosfato de vários tipos de moléculas (KANEKO, 1989). Elas são
classificadas em dois grupos: FAL e fosfatase ácida, de acordo com seu pH ótimo
em regiões com pH alcalino ou ácido, respectivamente. Nos mamíferos a FAL é
encontrada no fígado, intestino, placenta, rins (SEKIGUCHI et al., 2011) e ossos
(KANEKO, 1989). Sua atividade sérica vem sendo utilizada como indicador de lesão
hepática desde a década de 20 (KALINA et al., 1990).
A localização da enzima dentro da célula interfere na sua liberação para o
sangue. Enzimas de membrana como a FAL não são solúveis, estão firmemente
ligadas à membrana celular, e podem ser liberadas após um dano severo.
Entretanto, elas são detectadas no sangue usualmente após uma estimulação para
o aumento na produção (MEYER et al., 1995). Segundo Jain (1993), a FAL pode ser
encontrada em abundância nos neutrófilos maduros.
Em seres humanos adultos saudáveis, a maior parte da atividade da FAL
sanguínea é proveniente da FAL hepática e óssea e em diversos pacientes os
neutrófilos foram relacionados como fonte de aumento da atividade da FAL no soro
sanguíneo. A fosfatase alcalina dos neutrófilos (FAN) é detectada em neutrófilos e
monócitos diferenciados, e sua atividade in vitro aumenta com a exposição dos
neutrófilos ao fator estimulante de colônia de granulócitos (IZUMI et al., 2005).
Segundo Bednarska et al. (2006), a FAN localiza-se em vesículas secretoras e vai
para a membrana celular após a estimulação da célula.
Apesar do papel biológico da FAN permanecer incerto, ela é usada como
marcador para maturação granulocítica, e vem sendo útil no diagnóstico de algumas
doenças hematológicas. Acredita-se, ainda, que nas doenças bacterianas ocorra
aumento da atividade da FAN, enquanto que nas virais esta atividade diminua.
Entretanto, Kubota e Haruta (2006) observaram variação na atividade desta enzima
em diferentes tipos de infecções respiratórias virais em humanos, sendo inclusive,
elevada nos casos de adenovírus e do vírus sincicial.
18
Estudos indicam alta atividade da FAL nos pneumócitos do tipo II de seções
de tecido pulmonar, bem como em cultivos deste tipo celular. Esta atividade parece
estar relacionada com a síntese de compostos fosfolipídicos e proteicos da
substância surfactante pulmonar (KALINA et al., 1990).
As alterações encontradas na atividade da FAL no LBA durante a resposta
inflamatória pulmonar são difíceis de serem interpretadas devido às incertezas sobre
a sua origem e os mecanismos que envolvem sua liberação no fluido epitelial
pulmonar. Existem pelo menos três principais fontes potenciais de FAL no fluido
epitelial pulmonar: secreções das células tipo II, transudato das proteínas
sanguíneas e neutrófilos, sendo as duas últimas especialmente importantes no
pulmão inflamado, devido ao aumento da permeabilidade da barreira capilar alveolar
e influxo de neutrófilos (HENDERSON et al., 1995). Sanchez et al. (2000)
encontraram, ao realizar eletroforese das isoenzimas da FAL sérica de pacientes
com pneumopatias, uma banda isoenzimática única, correspondente à mesma
fração molecular no fluido do LBA.
Capelli et al. (1997) realizaram um estudo em 140 pacientes humanos para
avaliar a atividade da FAL no LBA como marcador de fibrose em enfermidades
pulmonares intersticiais crônicas e concluíram que o aumento da relação
FAL:albumina no LBA pode refletir a progressão de fibrose nesses pacientes.
Cobben et al. (1999a) constataram aumento das atividades da FAL e da
lactato desidrogenase no LBA de seres humanos com pneumonia ou fibrose
pulmonar que tinham predominância de polimorfonucleares no LBA. Esses autores
observaram que a atividade das enzimas obtidas por meio desse procedimento pode
ser útil como indicador de morte e lesão celular, sendo a atividade da FAL associada
à lesão ou ao estímulo de células do tipo II. Eles concluíram que não houve relação
entre a atividade da FAL e as células presentes no lavado, sugerindo que esta
enzima origina-se de células que não estão presentes no LBA.
Em outro estudo com pacientes humanos com doenças pulmonares com e
sem sinais de infecção pulmonar, Cobben et al. (1999b) perceberam que, apesar de
haver um aumento da atividade da FAL em todos os pacientes, não houve diferença
estatística entre os grupos, ao contrário da atividade da lactato desidrogenase, que
foi significativamente mais elevada no grupo de pacientes com infecção.
O aumento significativo da atividade da FAL no LBA de ratos com inflamação
pulmonar induzida por instilação intra-traqueal de endotoxinas parece estar
19
associado a uma lesão aguda e ao aumento da secreção de surfactante em
resposta à inativação do surfactante alveolar pela transudação de proteína sérica no
tecido pulmonar lesado. Esta informação, associada aos resultados de outros
estudos da FAL na região alveolar, indica que a maior fonte de aumento da atividade
da FAL no LBA está nos pneumócitos tipo II (HENDERSON et al., 1995).
Maden et al. (2001) observaram aumento significativo das atividades de
lactato desidrogenase e FAL no LBA de cães com broncopneumonia, mostrando a
relevância da atividade destas enzimas no LBA como indicadora de inflamação e/ou
lesão pulmonar. Estes autores observaram ainda aumento não significativo da
atividade destas enzimas no grupo de cães com traqueobronquite, e sugeriram que
o exame do LBA é útil no diagnóstico de enfermidades pulmonares.
Em um estudo com equinos da PMERJ, Jorge (2011) detectou redução da
atividade da FAL no fluido epitelial pulmonar dos animais do grupo com DIVA em
relação ao grupo sadio. A autora concluiu que a determinação da atividade desta
enzima no LBA pode ser usada como complementação no diagnóstico da DIVA em
equinos adultos, sem queixa clínica, com o mesmo perfil de trabalho e citologia
broncoalveolar compatível com essa enfermidade, sobretudo nos casos com escore
endoscópico de secreção traqueal intermediário (grau 2 e grau 3).
20
3. MATERIAL E MÉTODO
Este trabalho foi realizado de acordo com os Princípios Éticos na
Experimentação Animal. Obteve a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
Animal (CEPA/UFF), sob nº 00124/11 e autorização da Diretoria Geral de Saúde da
Polícia Militar do Estado do Rio de Janeiro (DGS – PMERJ), bem como do Comando
do Regimento de Polícia Montada Coronel Enyr Cony dos Santos (RPMont/CECS).
3.1. Animais
Foram utilizados 36 equinos adultos, do sexo masculino, sem raça definida,
com idade entre cinco e 14 anos, pesando em média 468 Kg. Esses animais
(apêndice A), pertencentes à PMERJ, eram usados em policiamento montado e
instrução de montaria. Foram mantidos semiestabulados diariamente em baias de
6m2, sem cama, das cinco às 15 horas (figura 1), e o restante do período soltos em
piquetes (figura 2), com água ad libitum. Eram alimentados com seis kg/animal de
ração comercial 12% de proteína bruta e 12 kg/animal de Capim-Angola (Brachiaria
mutica) cortado.
Todos os cavalos foram submetidos ao calendário profilático da Corporação:
vermifugação trimestral; vacinação semestral contra influenza, rinopneumonite,
encefalomielite equina leste e oeste, e anual contra tétano e raiva; e controle de
anemia infecciosa equina segundo as normas vigentes do Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA). Nos dois meses anteriores à realização do
experimento os animais não estiveram sob nenhum tipo de tratamento, nem foram
relatados sinais de doenças respiratórias.
21
Fig. 1 - Equinos da PMERJ alojados em Fig.2 - Equinos da PMERJ soltos em piquete.
baias durante o dia. RPMont/CECS, 2012.
Esquadrão Escola de Cavalaria, 2010.
Para a seleção dos cavalos foram realizados exames físicos (apêndice B),
com especial ênfase no exame do aparelho respiratório, sendo os achados para
percussão e auscultação pulmonares considerados normais baseando-se em
McGorum et al. (2002). Não foram observadas alterações no exame clínico
sugestivas de doença respiratória ou infecciosa e nem foram relatadas queixas de
queda de performance em nenhum dos animais selecionados,
No momento do experimento, todos os equinos estavam com valores de
hematócrito, proteína plasmática total, fibrinogênio plasmático (apêndice C) e
leucograma (apêndice D) dentro da normalidade segundo Jain (1993). Para
avaliação funcional pulmonar foram mensuradas as pressões parciais de oxigênio
(PaO2) e gás carbônico (PaCO2) (apêndice E), cujos valores podem ser observados
no apêndice E, sendo considerados como valores de referência de Van Erck et al.
(2005) e Doherty e Valverde (2006), respectivamente.
Os equinos foram então submetidos ao exame endoscópico do trato
respiratório para a quantificação da secreção traqueal e coleta do LT para realização
da citologia e dosagem da FAL. Com base nos resultados dos exames endoscópicos
e citológicos foram criadas três categorias: endoscopia, citologia e endoscopia +
citologia (vide seção 3.3.).
22
Baseando-se em Lessa et al. (2008) e Robinson (2008), os animais com perfil
compatível com inflamação aqui estudados poderiam se enquadrar na categoria de
DIVA de cavalos de lazer. Entretanto, como pelo escore endoscópico e pela
contagem diferencial da citologia traqueal não é possível diferenciar as síndromes
inflamatórias pulmonares, atribuiu-se o termo inflamação do trato respiratório
posterior, ao invés de DIVA.
3.2. Exames realizados
3.2.1. Exame Endoscópico
A avaliação endoscópica foi realizada sem exercício prévio dos animais,
utilizando-se fibroscópio de 13,3mm de diâmetro externo, 3,2mm de canal de
trabalho e 168cm de comprimento (colonofibroscópio Olympus ® modelo CF-10L,
Olympus Optical do Brasil, Ltda). O trato respiratório foi avaliado desde os meatos
nasais até a traqueia, sendo esta considerada normal quando estava com a mucosa
brilhante, íntegra e de coloração pálida e carina com aspecto afiado. Foi adotado o
escore endoscópico descrito por Gerber et al. (2004a) para a quantificação de
secreção observada na traqueia, conforme abaixo relacionado, assim como foi
assinalada a presença de qualquer sinal flogístico.
Escore 0 (E0) – Nenhuma secreção aparente;
Escore 1 (E1) – Pequenos e poucos pontos de secreção;
Escore 2 (E2) – Um número maior ou pontos maiores de secreção, podendo vir a
formar confluência;
Escore 3 (E3) – Presença de confluência de secreção na face ventral do lúmen
traqueal, podendo haver poças de secreção ao redor;
Escore 4 (E4) – Presença profusa de secreção traqueal ocupando 25% de toda
sua extensão e circunferência, e
Escore 5 (E5) - Presença profusa de secreção traqueal ocupando mais que 25%
de toda sua extensão.
23
3.2.2. Exames Laboratoriais
a) Amostras sanguíneas: as amostras de sangue venoso foram coletadas por
venopunção da jugular, utilizando-se tubos a vácuo (Vacutainer) e agulhas
hipodérmicas 0,80x25mm (21G). As amostras de sangue arterial foram obtidas
por punção da artéria facial transversa (figura 3) com agulha hipodérmica
0,55x20mm (24G) segundo a técnica descrita por Taylor (1981).
Fig. 3 – Coleta de sangue da artéria facial
transversa de um dos equinos do
experimento
para
realização
da
hemogasometria. Esquadrão Escola de
Cavalaria – Subseção de Veterinária, 2011.
 Hematócrito,
leucograma,
dosagem
de
proteína
e
fibrinogênio
plasmático: sangue coletado em tubos a vácuo com ácido etilenodiamino
tetra-acético (EDTA) a 10% na proporção de 0,1mL para cada 5mL de
sangue. Estes exames foram executados conforme as metodologias
descritas por Jain (1993).
 Ureia sérica: sangue coletado em tubos a vácuo sem anticoagulante no
momento da realização do LT e mantidos à temperatura ambiente até
coagular. Em seguida, os tubos foram centrifugados para separação do soro
sanguíneo, que foi estocado em micro tubos entre -14º e -18ºC. A
concentração da ureia foi determinada por meio de espectrofotometria
(Analisador bioquímico semiautomático Bioplus 2000 ®), utilizando-se kits
Ureia UV (Analisa®).
 Pressão parcial de Oxigênio (PaO2) e de Gás Carbônico (PaCO2): as
amostras de sangue arterial foram coletadas em seringas plásticas estéreis
de 3mL (BD Plastipak®), sem anticoagulante e processadas imediatamente
em analisador contínuo portátil i-STAT (Roche®) com a utilização do
cartucho i-STAT EG7+ (figura 4).
24
A
B
Fig. 4 – Realização do exame de hemogasometria. Preenchimento do cartucho EG7+ com o
sangue arterial coletado de um dos equinos do experimento (A). Resultado de um dos
exames processados no analisador contínuo portátil i-STAT (Roche®) (B). Esquadrão Escola
de Cavalaria – Subseção de Veterinária, 2011.
b) Lavado Traqueal (LT): os animais foram colocados em brete e contidos com
cachimbo e, quando necessário, sedados com cloridrato de Xilazina a 2%
(Coopazine®), na dosagem de 0,5-1,1mg/Kg, via endovenosa. O endoscópio,
com um cateter de polietileno no seu canal de trabalho, foi introduzido pelo
meato nasal ventral da narina em direção à traqueia (figura 5A). O cateter foi
posicionado na porção distal da traqueia, anterior à carina, de acordo com
técnica utilizada por Whitwell e Greet (1984). Foram instilados 20mL de solução
salina estéril (figura 5B) com uso de seringas plásticas estéreis de 20mL
(Injex®) e realizada imediata aspiração (figura 5C). As amostras foram
consideradas adequadas quando se observou presença de turvação, de
partículas suspensas e/ou de filamentos de muco (figura 5D). O lavado obtido
permaneceu refrigerado (4-8º C) em tubos cônicos de 50mL (figura 5E) até o
momento do processamento, que não ultrapassou quatro horas pós coleta.
25
B
A
C
D
E
Fig. 5 – Realização de exame endoscópico e coleta do LT: endoscópio, com um cateter de
polietileno no seu canal de trabalho, introduzido pelo meato nasal ventral da narina em
direção à traqueia (A). Instilação de solução salina estéril com uso de seringa plástica (B) e
imediata aspiração (C) e armazenamento em tubos cônicos de 50mL (D). Amostras
consideradas adequadas: presença de turvação, de partículas suspensas e/ou muco (E).
Esquadrão Escola de Cavalaria – Subseção de Veterinária, 2011.
 Citologia do LT: alíquotas de 200µL da suspensão celular do LT foram
submetidas à citocentrifugação a 110g por cinco minutos (centrífuga
Serocito® modelo 2400 FANEM®), de acordo com Hoffman (2008). As
lâminas confeccionadas foram fixadas com metanol e coradas com o corante
Giemsa. A leitura foi realizada em microscópio óptico com objetiva de
imersão de 100X, sendo analisados os tipos celulares com a contagem de
300 células nucleadas (figuras 6).
26
L
M
m
N
M
m
L
CE
CE
GC
A
B
Fig. 6 - Fotomicrografia digitalizada de citologia do LT de um equino sadio (A) e de um
equino com perfil citológico compatível com inflamação do trato respiratório posterior (B).
Presença de neutrófilos (N), células epiteliais (CE), célula epitelial caliciforme (GC), linfócitos
(L), macrófagos (M) e muco (m). Coloração de Giemsa. Microscopia ótica, aumento de 400x
(A)/1000x (B). Laboratório de Patologia Clínica/UFF, 2011.
 Atividade da FAL e concentração da ureia: foram realizadas em alíquotas
do sobrenadante do LT, centrifugadas a 800g por cinco minutos (centrífuga
FANEM® modelo 206R). Em seguida, as amostras foram acondicionadas em
criotubos e preservadas no nitrogênio líquido (-196°C) para posterior
determinação da atividade da FAL (JORGE, 2011). Para a dosagem da
concentração de ureia no LT, as amostras foram estocadas em micro tubos
entre -14 e -18°C. Todas as amostras foram analisadas dentro do período de
dois meses por espectrofotometria (analisador bioquímico semiautomático
Bioplus 2000®), utilizando-se kits Fosfatase Alcalina (Analisa®) e Ureia UV
(Analisa®), respectivamente.
As determinações da concentração da ureia no soro sanguíneo e no
sobrenadante do LT foram necessárias para corrigir a diluição causada pelo
LT e estimar a atividade da FAL no FET.
Para calcular a atividade da FAL no FET foi utilizada a seguinte fórmula
(PORTO et al., 2010):
FAL no FET = FAL dosada no LT x Fator para correção da diluição (FD),
onde:
FD =
Ureia no soro sanguíneo
Ureia no sobrenadante do LT
27
3.3. Critérios para a formação dos grupos
Os 36 equinos selecionados foram organizados em três categorias (figura 7) e
divididos em sadios e/ou com inflamação (tabela 1) de acordo com os resultados da
endoscopia (categoria 1), da citologia traqueal (categoria 2) e da combinação dos
resultados destes dois exames (categoria 3) conforme explicitado a seguir.
Fig. 7 – Esquema explicativo com a formação e divisão das três categorias nas
quais foram organizados e classificados os 36 equinos estudados neste
experimento. Rio de Janeiro, 2012.
28
Tabela 1 – Relação dos 36 equinos estudados com seus respectivos resultados de
escore endoscópico de muco traqueal e citologia do LT e sua classificação em cada
categoria. Rio de Janeiro/RJ, setembro-dezembro 2010/2011.
Animal
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
Escore
Endoscópico
Normal
Normal
Normal
Normal
Inflamado
Normal
Inflamado
Normal
Normal
Normal
Normal
Inflamado
Inflamado
Inflamado
Normal
Normal
Normal
Normal
Inflamado
Inflamado
Inflamado
Normal
Normal
Inflamado
Normal
Inflamado
Inflamado
Inflamado
Normal
Normal
Inflamado
Inflamado
Inflamado
Inflamado
Inflamado
Normal
Citologia
Traqueal
Inflamado
Normal
Normal
Inflamado
Normal
Inflamado
Inflamado
Normal
Normal
Normal
Inflamado
Normal
Inflamado
Inflamado
Inflamado
Normal
Inflamado
Inflamado
Normal
Inflamado
Inflamado
Normal
Inflamado
Inflamado
Normal
Normal
Normal
Inflamado
Inflamado
Normal
Normal
Normal
Normal
Inflamado
Inflamado
Normal
Categoria 1
Categoria 2
Categoria 3
GE1
GE1
GE1
GE1
GE2
GE1
GE2
GE1
GE1
GE1
GE1
GE2
GE2
GE2
GE1
GE1
GE1
GE1
GE2
GE2
GE2
GE1
GE1
GE2
GE1
GE2
GE2
GE2
GE1
GE1
GE2
GE2
GE2
GE2
GE2
GE1
GC2
GC1
GC1
GC2
GC1
GC2
GC2
GC1
GC1
GC1
GC2
GC1
GC2
GC2
GC2
GC1
GC2
GC2
GC1
GC2
GC2
GC1
GC2
GC2
GC1
GC1
GC1
GC2
GC2
GC1
GC1
GC1
GC1
GC2
GC2
GC1
G2
G1
G1
G2
G3
G2
G4
G1
G1
G1
G2
G3
G4
G4
G2
G1
G2
G2
G3
G4
G4
G1
G2
G4
G1
G3
G3
G4
G2
G1
G3
G3
G3
G4
G4
G1
3.3.1. Categoria 1 - Endoscopia
A avaliação semi-quantitativa do muco traqueal (escore) durante o exame
endoscópico variou de E0 a E3 nos 36 animais estudados (apêndice F). Baseandose na gradação estabelecida por Gerber et al. (2004a), nesta categoria foram criados
dois grupos:
29
a) Grupo endoscopia 1 (GE1) - cavalos considerados sadios (E0 ou E1):
dezenove (52,78%) dos 36 animais estudados tinham E0 ou E1 de secreção
traqueal
b) Grupo endoscopia 2 (GE2) - cavalos com escore compatível com
inflamação do trato respiratório posterior (E ≥ 2): dos 36 animais estudados,
17 (47,22%) tinham E2 ou E3 de secreção traqueal.
3.3.2. Categoria 2 - Citologia
Nesta categoria, os 36 animais estudados foram divididos de acordo com os
resultados da citologia traqueal (apêndice G), segundo o consenso de Havemeyer,
ratificado por Robinson (2003):
a) Grupo citologia 1 (GC1) - cavalos considerados sadios (eosinófilos < 1% e
neutrófilos < 20%): dezoito (50%) dos 36 animais estudados apresentaram
perfil citológico dentro dos valores de normalidade.
b) Grupo citologia 2 (GC2) - cavalos com perfil citológico compatível com
inflamação do trato respiratório posterior (eosinófilos ≥ 1% e/ou
neutrófilos ≥ 20%): dos 36 animais estudados, 18 (50%) tinham infiltrado
eosinofílico e/ou neutrofílico.
3.3.3. Categoria 3 – Endoscopia + citologia
Nesta categoria foram combinados os resultados de escore endoscópico (E) e
perfil citológico traqueal de cada animal (tabela 1), e os 36 equinos foram divididos
em quatro grupos:
a) Grupo 1 (G1) - equinos com escore endoscópico e perfil citológico
normais: dez equinos (27,78%) foram considerados sadios tanto pelo exame
endoscópico (E<2) quanto pelo citológico (eosinófilo<1% e neutrófilo <20%).
b) Grupo 2 (G2) - equinos com escore endoscópico normal e perfil
citológico compatível com inflamação do trato respiratório posterior: nove
equinos (25%) com E<2 de secreção traqueal estavam com infiltrado
eosinofílico e/ou neutrofílico na citologia traqueal.
30
c) Grupo 3 (G3) - equinos com escore endoscópico compatível com
inflamação do trato respiratório posterior e perfil citológico normal: oito
equinos (22,22%) com E≥2 de secreção traqueal foram considerados
citologicamente sadios (eosinófilo<1% e neutrófilo <20%).
d) Grupo 4 (G4) - equinos com escore endoscópico e perfil citológico
compatíveis com inflamação do trato respiratório posterior: nove equinos
(25%) tinham perfil compatível com inflamação do trato respiratório posterior
tanto no exame endoscópico (E≥2) quanto no citológico (eosinófilo ≥1% e/ou
neutrófilo ≥20%).
3.4. Análise Estatística
A análise estatística da atividade da FAL no LT foi realizada com o auxílio do
programa computacional SPSS versão 13, aplicando-se os testes não paramétricos
de Mann-Whitney para comparar os grupos da categoria 1 (GE1 e GE2) e da
categoria 2 (GC1 e GC2) independentemente e de Kruskal-Wallis para comparar os
quatro grupos (G1, G2, G3 e G4) da categoria 3, sendo considerado o nível de
significância de 5% para ambos os testes. Para comparar os grupos G1, G2, G3 e
G4 dois a dois foi utilizado o teste de Mann-Whitney, com o nível de significância de
1,25%.
31
4. RESULTADOS
Os valores da atividade da FAL no LT dos 36 equinos estudados podem ser
observados no apêndice H. Observou-se aumento na atividade da FAL no LT dos
cavalos com achados compatíveis com inflamação do trato respiratório posterior
(GE2, GC2, G4) em relação aos cavalos considerados sadios (GE1, GC1 e G1,
respectivamente), sendo esta diferença estatisticamente significativa (P=0,021) entre
os grupos de animais com perfil citológico compatível com inflamação (GC2) e grupo
citologicamente sadio (GC1).
4.1. Atividade da FAL no LT dos animais na categoria 1 (GE1 e GE2)
Ao comparar os valores da atividade da FAL entre os grupos da categoria 1
(tabela 2), foi observado um aumento desta atividade no grupo com escore
endoscópico compatível com inflamação do trato respiratório posterior (GE2) em
relação ao grupo com escore endoscópico normal (GE1), entretanto com os dados
obtidos não foi possível afirmar que exista uma diferença estatística (P=0,051).
Tabela 2 - Atividade da FAL em U/L no LT dos equinos na categoria 1 (GE1 e
GE2), descrita em média e desvio padrão. Rio de Janeiro/RJ, set-dez 2010/2011.
GE1 (n= 19)
GE2 (n = 17)
Média
Desvio Padrão
+
12511,44+
16879,11+
9958,71
9470,18
Existe uma tendência a apresentar diferença estatisticamente significativa (P=0,051).
32
4.2. Atividade da FAL no LT dos animais na categoria 2 (GC1 e GC2)
Dentro da categoria 2 (tabela 3), houve diferença estatística (P= 0,021) entre
os grupos com perfil citológico normal (GC1) e com perfil citológico compatível com
inflamação do trato respiratório posterior (GC2), sendo observado aumento da
atividade da FAL no GC2.
Tabela 3 - Atividade da FAL em U/L no LT dos equinos na categoria 2 (GC1 e
GC2), descrita em média e desvio padrão, Rio de Janeiro/RJ, set-dez 2010/2011.
GC1 (n= 18)
GC2 (n = 18)
Média
Desvio Padrão
10282,85*
18865,05*
5856,97
11233,40
* Existe diferença estatisticamente significativa (P<0,05).
4.3. Atividade da FAL dos animais na categoria 3 (G1, G2, G3 e G4)
Foi observada diferença significativa (P=0,034) na atividade da FAL (tabela 4)
entre os quatro grupos. Ao comparar os grupos dois a dois não é possível afirmar
que exista diferença estatística entre eles, embora haja uma tendência (P=0,022) ao
comparar a atividade desta enzima entre os G1 e G4.
Tabela 4 - Atividade da FAL em U/L no LT dos equinos na categoria 3 (G1, G2,
G3 e G4), descrita em média e desvio padrão, Rio de Janeiro/RJ, setembrodezembro 2010/2011.
G1 (n= 10)
G2 (n = 9)
G3 (n= 8)
G4 (n = 9)
Média+
Desvio Padrão
+
8465,38+*
17007,07+
12554,69+
20723,03+*
5922,46
11852,66
5253,13
10949,87
Existe diferença significativa entre os quatro grupos (P<0,05) pelo teste de Kruskal-Wallis.
* Existe uma tendência a apresentar diferença estatisticamente significativa (P=0,022) entre G1 e G4
pelo teste de Mann-Whitney, considerando P=0,0125 para comparar os grupos dois a dois.
33
5. DISCUSSÃO
Assim como observado por Capelli et al. (1997), Cobben et al. (1999a),
Cobben et al. (1999b) e Maden et al. (2001) em estudos com LBA, neste
experimento também foi observado aumento da atividade da FAL nos animais com
achados compatíveis com inflamação do trato respiratório posterior, embora a
dosagem tenha sido feita no LT.
O aumento da atividade da FAL no GE2 quando comparada ao GE1 não teve
diferença significativa. Mazan (2010) afirma que apesar da visualização endoscópica
de muco traqueal ser o método mais conveniente e rápido para estudos a campo,
este método é muito inespecífico sobre a natureza e a origem da inflamação. Além
disso, Gerber et al. (2004b) consideram quantidades intermediárias de muco (E2 e
E3) achados inespecíficos, pois foram observadas tanto em animais sadios quanto
nos doentes. Ratificando estas informações, salienta-se que todos os animais aqui
utilizados foram considerados sadios ao exame físico, e não foram encontrados
escores endoscópicos superiores ao E3.
É possível afirmar que há uma tendência à diferença estatística (P=0,051),
logo o aumento da atividade da FAL no GE2 é uma informação relevante, pois
relaciona a FAL elevada à inflamação do trato respiratório posterior. Neste estudo foi
escolhido utilizar como critério realizar o exame endoscópico sem exercitar os
animais previamente. Como o exercício aumenta a quantidade de neutrófilos e de
muco na traqueia (HODGSON, 2006; MALIKIDES et al., 2007), talvez se estes
animais tivessem sido exercitados anteriormente ao exame, a gradação do escore
endoscópico não seria a mesma e, consequentemente, o resultado da atividade da
FAL pudesse ter diferença significativa. Segundo Michelotto Jr (2008), as amostras
de LT devem ser coletadas entre 30 e 60 minutos após exercício para que tenham
maior valor diagnóstico.
34
O aumento significativo da atividade da FAL no GC2 em relação ao GC1
provavelmente está relacionado ao influxo neutrofílico e, consequentemente, à
atividade da FAN. Corroborando esta informação, Izumi et al. (2005) e Kubota e
Haruta (2006) relacionaram os neutrófilos como fonte de aumento da atividade desta
enzima no soro sanguíneo.
A morfologia celular no LT é menos preservada que no LBA (HODGSON,
2006), e muitas células encontram-se mais degeneradas, inclusive os neutrófilos.
Apesar de não haver estudos da atividade da FAN no LT, possivelmente estas
alterações morfológicas são importantes no aumento da atividade da FAL no FET,
uma vez que Izumi et al. (2005) afirmaram que na circulação sanguínea a FAN é
lançada por extravasamento, devido aos neutrófilos danificados ou mortos.
É importante lembrar, também, que a traqueia é uma via de eliminação
natural destas células, o que explica a qualidade morfológica e a quantidade dos
neutrófilos nesta região. Neste estágio, os neutrófilos rompem-se mais facilmente,
propiciando a liberação da FAL para a luz traqueal.
Jorge (2011), em um estudo com a mesma população deste experimento,
detectou, ao invés de um aumento, uma diminuição da atividade da FAL no LBA dos
equinos com DIVA assintomática. Esta diferença entre os resultados obtidos nestes
dois experimentos provavelmente se deve às diferentes origens da FAL em cada
lavado. Para Capelli et al. (1997), a atividade da FAL nos lavados pulmonares de
humanos é um marcador de lesão tecidual e de proliferação de pneumócitos tipo II,
sendo estas células a maior fonte de aumento da atividade da FAL no LBA de ratos
(HENDERSON et al., 1995).
Se, em equinos, a atividade da FAL no LBA está relacionada à função dos
pneumócitos tipo II, à semelhança do que ocorre em outras espécies, é de se
esperar realmente que a atividade da FAL se encontre baixa em animais com
quadros de DIVA crônica, pois as lesões teciduais da DIVA podem afetar o número,
bem como a função dos pneumócitos tipo II, com consequente redução na atividade
enzimática (JORGE, 2011).
Nos casos do LT, pode ser que parte da FAL seja proveniente da proliferação
de pneumócitos tipo II, entretanto a FAL elevada do FET parece estar mais
relacionada ao influxo de neutrófilos (HENDERSON et al., 1995; IZUMI et al., 2005;
Kubota e Haruta, 2006), já que esta população celular aumenta no grupo doente,
além de ser mais elevada no LT do que no LBA (MALIKIDES et al., 2003), o que
35
justifica o aumento da FAL observado nos animais com achados endoscópicos e
citológicos compatíveis com inflamação do trato respiratório posterior.
Comparando a atividade da FAL entre os grupos da categoria 3 (tabela 4),
pôde-se observar uma atividade mais elevada nos grupos dos animais com perfil
citológico compatível com inflamação (G2 e G4), e um desvio padrão menor nos
grupos dos animais com perfil citológico normal (G1 e G3). Isto pode ser explicado
devido ao fato do exame citológico ser mais sensível que o endoscópico como
critério de diagnóstico de processos inflamatórios do trato respiratório posterior.
Ao dividir os animais deste experimento em quatro grupos, o número de
animais em cada grupo ficou menor, fato este que pode ter sido responsável pela
ausência de diferença estatística entre os grupos quando comparados dois a dois.
Entretanto, houve uma tendência à diferença estatística (P=0,022) entre os G1 e G4,
corroborando a informação de que, ao utilizar conjuntamente os dois métodos de
exames na avaliação dos animais, aumenta-se a precisão do diagnóstico.
Provavelmente ao aumentar o número de animais em cada grupo, esta tendência à
diferença entre a atividade da FAL dos G1 e G4 se confirmaria estatisticamente.
36
6. CONCLUSÃO
A atividade da fosfatase alcalina no fluido epitelial traqueal aumenta em
equinos com achados traqueais compatíveis com inflamação do trato respiratório
posterior sem exercício prévio, sendo este aumento estatisticamente comprovado
nos animais com perfil citológico traqueal compatível com inflamação.
Para melhor relacionar a atividade da fosfatase alcalina com o escore
endoscópico, sugere-se novos estudos com os animais sendo exercitados antes do
exame endoscópico. Novos estudos também são necessários para marcar esta
enzima na traqueia e descobrir sua origem.
A determinação da atividade da fosfatase alcalina no lavado traqueal pode ser
usada como meio de complementação do diagnóstico de inflamação do trato
respiratório posterior em equinos adultos com o mesmo tipo de trabalho e sem
queixas clínicas, sendo de grande utilidade nos casos com o escore de muco
traqueal intermediário quando o exame da citologia traqueal não é acessível.
37
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43
APÊNDICE A – Dados de identificação dos 36 equinos pertencentes a PMERJ
utilizados neste estudo. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011.
Animal
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
Sexo
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
MC
Raça
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
SRD
Pelagem
Baia
Tordilha
Alazã
Tordilha
Castanha
Alazã
Rosilha
Castanha
Castanha
Castanha
Tordilha
Alazã
Alazã
Alazã
Castanha
Rosilha
Alazã
Alazã
Amarilha
Amarilha
Castanha
Alazã
Alazã
Tordilha
Castanha
Castanha
Alazã
Castanha
Alazã
Alazã
Alazã sobre baio
Castanha
Castanha
Alazã
Tordilha
Tordilha
MC: macho castrado; SRD: sem raça definida
Idade (anos)
9
8
8
13
8
7
12
11
5
10
8
7
5
11
8
9
10
13
7
9
9
12
12
11
14
12
7
8
8
14
8
12
11
8
14
12
Peso (Kg)
420
460
435
460
460
445
470
460
475
510
485
450
500
470
430
480
480
500
470
470
430
400
465
460
436
440
510
490
510
510
470
560
500
460
420
450
44
APÊNDICE B – Dados das funções vitais dos 36 equinos deste experimento. Rio de
Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011.
Animal
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
TR (°C)
37,3
37,1
37,2
37,3
36,9
37,1
36,9
37,6
37,2
37,5
37
37,4
36,9
37
37,8
37,6
37,8
37,2
37,5
37,6
37,5
37,3
37,8
37,4
37,5
37,5
37,2
37,9
37,1
36,4
37,2
36,8
37,6
37,2
37,9
FC (bpm)
45
32
42
28
34
24
36
36
30
40
36
36
30
32
38
48
32
36
36
34
34
34
36
38
30
28
30
34
36
36
34
42
36
32
56
32
FR (mpm)
8
12
24
16
24
18
15
30
20
16
14
15
16
10
20
40
24
24
32
28
42
12
28
14
28
40
10
16
16
18
12
14
13
32
14
14
TR: temperatura retal; FC: frequência cardíaca; bpm: batimentos por minuto;
FR: frequência respiratória; mpm: movimentos por minuto.
*Levando-se em consideração o estresse individual de cada animal e a temperatura
ambiental elevada no local onde foram realizadas as análises, foram considerados
normais alguns indivíduos que apresentaram apenas os valores de frequência
cardíaca e/ou respiratória um pouco acima da normalidade de referência.
45
APÊNDICE C – Resultados dos Hematócritos, Proteínas Plasmáticas Totais e
Fibrinogênios Plasmáticos dos 36 equinos deste experimento. Rio de Janeiro,
setembro-dezembro de 2010/2011.
Animal
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
Hematócrito
46%
36%
38%
31%
32%
36%
33%
34%
32%
37%
36%
42%
33%
30%
39%
33%
36%
32%
29%
40%
34%
32%
37%
33%
45%
33%
30%
35%
39%
33%
36%
37%
36%
34%
38%
32%
PPT: Proteína plasmática total
PPT (g/dL)
6,8
7,2
6,9
6,9
6,1
6,8
6,5
6,2
7
6,8
6,8
7,2
6,6
7,4
7,4
7,1
7
6,4
6,9
7,4
6,6
8
7
6,2
6,8
6,8
6,8
6,9
6,5
7,5
6,8
6,2
6,8
6,8
6,6
7,1
Fibrinogênio (mg/dL)
300
200
300
100
300
200
300
300
200
400
200
100
400
400
400
300
200
300
300
200
200
200
200
400
200
100
200
300
300
300
200
200
300
300
200
300
46
APÊNDICE D – Resultados dos Leucogramas dos 36 equinos deste experimento.
Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011.
Animal
LG
Neutrófilos
3
Total/mm
01
11900
02
10900
03
9800
04
9600
05
9000
06
7700
07
7900
08
8200
09
7800
10
8900
11
9700
12
11400
13
6000
14
8100
15
8700
16
9100
17
7700
18
8100
19
9400
20
11100
21
8700
22
8400
23
11300
24
7500
25
9000
26
6600
27
7800
28
8200
29
8700
30
9400
31
6100
32
6500
33
7600
34
6000
35
8500
36
7500
LG: leucometria global
3
Total/mm
5474
5232
5390
6048
4770
3157
3713
4674
3510
6408
4365
5016
3540
4779
4698
5096
3465
5184
5076
6216
4524
5628
5763
5325
5760
3960
4602
3936
4524
4888
2867
1950
4864
3480
4845
3975
Linfócitos
3
Total/mm
5355
5232
3528
2880
3330
3773
3239
2788
3432
2047
4365
4674
1740
2673
2610
3458
3003
2349
3384
3885
3654
2520
4520
1425
2700
1980
2730
3280
3219
3854
2318
3510
2432
1920
3060
2475
Monócitos
3
Total/mm
833
436
784
288
810
693
632
574
546
89
485
1140
300
243
870
91
693
405
564
777
348
252
791
600
360
594
390
492
696
376
671
845
228
480
510
675
Eosinófilos
3
Total/mm
238
0
98
384
90
385
316
164
312
356
485
570
240
324
435
455
539
162
376
222
174
0
113
150
180
66
78
492
261
188
122
195
76
120
85
375
Basófilos
3
Total/mm
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
180
81
87
0
0
0
0
0
0
0
113
0
0
0
0
0
0
94
122
0
0
0
0
0
47
APÊNDICE E – Resultados do pH, da PaO2 e da PaCO2 do sangue arterial dos 36
equinos deste experimento. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011.
Animal
pH
PaO2
PaCO2
01
7,41
101
40
02
7,39
89
48,7*
03
7,43
110*
36,7
04
7,42
103
40,4
05
7,40
103
37,4
06
7,37
109*
40
07
7,37
90
44,4
08
7,44
111*
38,3
09
7,43
96
38,7
10
7,48
105
39,6
11
7,36
101
46,4*
12
7,43
97
47,8*
13
7,41
99
41,8
14
7,45
91
44,7
15
7,40
87
48,3*
16
7,40
99
47,4*
17
7,32
105
38,4
18
7,39
100
41,2
19
7,37
103
40,2
20
7,39
103
43,7
21
7,41
104
44
22
7,44
113*
36,9
23
7,47
105
38,5
24
7,37
105
39,9
25
7,44
100
42,4
26
7,34
96
40,1
27
7,40
91
46,1*
28
7,44
101
41,1
29
7,42
92
46,2*
30
7,44
86
43,5
31
7,40
107*
40,5
32
7,46
89
44,3
33
7,40
88
45,5*
34
7,40
97
43,3
35
7,41
94
44,2
36
7,34
95
40
PaO2: pressão parcial de oxigênio; PaCO2: pressão parcial de gás carbônico
*Levando-se em consideração que os valores de referência adotados não são de
amostras processadas no analisador i-STAT (Roche®), o estresse individual de cada
animal e a temperatura ambiental elevada no local onde foram realizadas as
análises, foram considerados normais alguns indivíduos que apresentaram apenas
os valores de PaO2 e de PaCO2 um pouco acima da normalidade de referência.
48
APÊNDICE F – Resultados dos exames endoscópicos dos 36 equinos deste
experimento. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011.
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
Escore Endoscópico
E1
E0
E1
E1
E2
E1
E2
E0
E1
G1
E1
E3
E2
E3
E0
E1
E1
E1
E2
E3
E2
E1
E1
E2
E0
E3
E2
E3
E0
E1
E2
E2
E2
E3
E3
E1
Outras observações
Hiperemia de mucosa do TRA, HFL G1
HFL G2
HFL G1
Hiperemia de mucosa TRA e traqueia; HFL G1
carina edemaciada; HFL G2
HL G2
HFL G1; hiperemia de mucosa
hiperemia de mucosa e carina edemaciada
carina edemaciada
DDPMI
hiperemia de mucosa e carina edemaciada
E: escore de muco traqueal; TRA: trato respiratório anterior; HFL: hiperplasia folicular linfoide;
G: grau; HL: hemiplegia laringeana; DDPMI – deslocamento dorsal do palato mole intermitente
49
APÊNDICE G – Resultados em percentuais da contagem celular diferencial das
amostras de LT coradas pelo Giemsa dos 36 equinos deste experimento. Rio de
Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011.
Animal
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
Mastócitos Eosinófilos Neutrófilos
(%)
(%)
(%)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,33
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,33
0,00
0,00
0,33
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,33
0,00
0,00
0,00
0,00
0,33
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,67
0,00
1,00
0,00
0,67
0,33
0,33
0,67
1,67
3,33
1,00
0,00
6,33
7,67
0,00
0,67
6,67
0,67
2,33
4,67
0,33
0,33
0,00
4,33
3,00
0,00
0,00
0,33
0,33
0,33
0,00
0,67
46,33
15,33
13,00
18,00
19,00
24,33
33,33
11,00
4,67
10,00
54,00
2,33
51,67
44,67
16,00
4,33
26,33
12,67
15,67
23,33
11,00
9,33
12,33
15,00
6,00
6,33
16,00
33,00
17,67
5,33
10,67
12,67
11,33
48,67
35,33
14,33
Linfócitos
(%)
Macrófagos
(%)
8,67
12,67
14,00
33,33
20,67
21,33
15,33
11,33
7,67
11,00
21,00
12,33
11,00
17,67
11,00
14,67
15,67
15,33
19,00
34,67
20,33
12,00
11,33
21,00
15,00
28,33
10,67
9,33
6,33
14,67
16,85
18,00
15,33
16,67
13,67
11,67
35,67
39,67
13,67
36,00
20,00
9,00
22,33
26,33
25,67
33,67
18,67
38,00
18,33
26,67
27,00
35,67
42,33
34,33
52,00
38,00
39,00
31,33
41,00
29,67
20,00
41,67
31,67
29,67
49,00
30,67
32,02
33,33
40,00
29,00
49,33
39,00
Células
Epiteliais
(%)
8,33
32,33
59,33
11,67
39,67
45,33
28,00
51,33
61,33
44,67
6,00
46,67
17,33
7,67
45,00
45,33
9,33
30,00
13,33
3,33
22,67
46,67
33,00
29,33
58,67
23,33
41,67
23,67
24,00
49,00
40,45
35,67
33,00
5,33
1,33
34,33
50
APÊNDICE H – Valores da atividade da FAL no FET dos 36 equinos deste
experimento. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011.
FAL dosada Ureia Sérica
Ureia LT
no LT (U/L)
(mg/dL)
01
1082,00
33,03
0,917
02
194,50
38,07
0,917
03
240,00
43,12
0,917
04
551,00
31,65
2,752
05
564,00
39,45
1,376
06
526,00
35,32
1,376
07
489,00
39,45
0,917
08
136,50
36,70
0,917
09
93,98
38,07
0,459
10
86,50
44,49
1,376
11
1492,50
41,74
1,835
12
566,00
38,99
1,835
13
1534,00
39,45
2,294
14
1581,00
44,04
2,752
15
99,00
33,03
0,446
16
27,64
34,82
0,893
17
128,00
41,52
0,446
18
1367,50
39,91
2,752
19
378,00
39,91
0,917
20
2339,00
30,73
3,211
21
501,00
36,24
0,917
22
447,50
30,36
1,339
23
215,00
31,25
0,893
24
190,00
44,19
0,893
25
227,50
44,19
0,446
26
776,00
34,82
1,786
27
70,45
34,73
1,852
28
40,08
23,61
0,463
29
185,20
34,26
0,463
30
183,80
42,13
1,389
31
146,50
27,78
0,463
32
457,45
33,34
0,926
33
316,50
41,21
0,926
34
203,15
43,06
0,463
35
522,40
36,58
0,463
36
436,70
31,48
1,389
FD = Fator para correção da diluição causada pelo LT
Animal
FD
36,01527
41,51799
47,02072
11,50073
28,66860
25,66860
43,01854
40,01745
82,94553
32,33576
22,74768
21,24796
17,19616
16,00109
74,06726
38,99104
93,08296
14,50109
43,51908
9,57116
39,51690
22,66990
34,99216
49,48936
99,08969
19,49552
18,75000
51,00000
74,00000
30,33333
60,00000
36,00000
44,50000
93,00000
79,00000
22,66667
FAL no FET
(U/L)
38968,52
8075,25
11284,97
6336,90
16169,09
13501,69
21036,07
5462,38
7795,22
2797,04
33950,92
12026,34
26378,92
25297,72
7332,66
1077,71
11914,62
19830,24
16450,21
22386,95
19797,97
10144,78
7523,31
9402,98
22542,90
15128,52
1320,94
2044,08
13704,80
5575,27
8790,00
16468,20
14084,25
18892,95
41269,60
9898,25