UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI
ANANDA XAVIER OLIVEIRA
DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE UM SENSOR VOLTAMÉTRICO
PARA ANÁLISE SIMULTÂNEA DE DOPAMINA, ÁCIDO ASCÓRBICO E ÁCIDO
ÚRICO EMPREGANDO UM ELETRODO MODIFICADO COM NAFTOQUINONA
ADSORVIDA SOBRE NANOTUBOS DE CARBONO
Diamantina - MG
2012
ANANDA XAVIER OLIVEIRA
DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE UM SENSOR VOLTAMÉTRICO
PARA ANÁLISE SIMULTÂNEA DE DOPAMINA, ÁCIDO ASCÓRBICO E ÁCIDO
ÚRICO EMPREGANDO UM ELETRODO MODIFICADO COM NAFTOQUINONA
ADSORVIDA SOBRE NANOTUBOS DE CARBONO
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação Stricto Sensu da
Universidade Federal dos Vales do
Jequitinhonha e Mucuri – UFVJM, como
pré-requisito para obtenção do grau de
Mestre em Química.
Orientadora: Profa. Dra. Rita de
Cássia Silva Luz
Diamantina – MG
2012
Ficha Catalográfica - Serviço de Bibliotecas/UFVJM
Bibliotecária Nathália Machado Laponez Maia
CRB6-3002
O48d
Oliveira, Ananda Xavier.
Desenvolvimento e aplicação de um sensor voltamétrico para análise
simultânea de dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico empregando um
eletrodo modificado com naftoquinona adsorvida sobre nanotubos de carbono
/ Ananda Xavier Oliveira. – Diamantina: UFVJM, 2012.
83 p.
Orientadora: Profa. Dra. Rita de Cássia Silva Luz.
Dissertação (Mestrado - Programa de Pós-Graduação em Química) –
Faculdade de Ciências Exatas, Universidade Federal dos Vales do
Jequitinhonha e Mucuri, 2012.
1. Dopamina. 2. Ácido ascórbico. 3. Naftoquinona. 4. Nanotubos de carbono
de paredes múltiplas. 5. Eletrodo de grafite pirolítico de plano basal. I. Rita de
Cássia Silva Luz. II. Título.
CDD 572
Elaborada com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
ANANDA XAVIER OLIVEIRA
DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE UM SENSOR VOLTAMÉTRICO
PARA ANÁLISE SIMULTÂNEA DE DOPAMINA, ÁCIDO ASCÓRBICO E ÁCIDO
ÚRICO EMPREGANDO UM ELETRODO MODIFICADO COM NAFTOQUINONA
ADSORVIDA SOBRE NANOTUBOS DE CARBONO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade
Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri – UFVJM, como pré-requisito para obtenção do
grau de Mestre em Química.
COMISSÃO EXAMINADORA
_______________________________________________
Prof. Dr. Reinaldo Francisco Teófilo
Examinador
Universidade Federal de Viçosa
_______________________________________________
Profa. Dra. Andréa Renata Malagutti
Examinadora
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri
_______________________________________________
Prof. Dr. Flavio Santos Damos
Examinador
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri
_______________________________________________
Profa. Dra. Rita de Cássia Silva Luz
Orientadora/Presidente
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri
“Penso no que faço, com fé. Faço o que
devo fazer, com amor. Eu me esforço para ser
cada dia melhor, pois bondade também se
aprende. Mesmo quando tudo parece desabar,
cabe a mim decidir entre rir ou chorar, ir ou
ficar, desistir ou lutar; porque descobri, no
caminho incerto da vida, que o mais importante é
decidir.” (Cora Coralina)
AGRADECIMENTO(S)
Agradeço a Deus, pelo existir, pelas bênçãos e pelas enormes alegrias que me concede
a cada dia.
Aos meus pais, Ari e Alverina, por todas as oportunidades, apoio e amor.
Aos meus irmãos, Murilo e Marcelus, por estarem sempre por perto.
À minha família, pelas orações.
Ao Vinícius, pelo carinho, incentivo, paciência, compreensão e amor.
À minha anjinha e amiga Zabelê, pela presença, orações, conselhos, orientações e
incentivo durante toda a minha caminhada.
Aos amigos de Ouro Preto – Cíntia, Sabê, Palitin, Caio, Laurinha, Maíra e Kat – por
fazerem dos meus dias mais felizes! E a todos os amigos que sempre se fizeram presentes e
torcem pela minha felicidade e sucesso.
Aos professores Dra. Rita de Cássia Silva Luz e Dr. Flavio Santos Damos, pela
orientação, incentivo, oportunidade e conhecimento. Serei sempre grata, obrigada por tudo!
Aos amigos Saimon, Fernando e professor Dr. Wallans Torres Pio dos Santos, pelas
contribuições e conhecimentos compartilhados durante o decorrer deste trabalho.
A todos os amigos e colegas do Grupo de Interfaces e Desenvolvimento de Sensores
(GEIDS), em especial à Neuma, Ana e Dênio, pela companhia, cooperação, incentivo e
aprendizado.
À CAPES e FAPEMIG pela bolsa e auxílio concedidos.
RESUMO
O presente trabalho descreve o desenvolvimento de um sensor voltamétrico altamente seletivo
e sensível para dopamina (DA), ácido ascórbico (AA) e ácido úrico (AU) utilizando um
eletrodo de grafite pirolítico de plano basal modificado com 1,4-naftoquinona adsorvida sobre
nanotubos de carbono de paredes múltiplas (EGPPB/NTCPM/NQ). Imagens de Microscopia
Eletrônica de Varredura foram utilizadas para caracterizar os materiais. Os processos de
oxidação de DA, AA e AU foram investigados por Voltametria Cíclica (VC) e Voltametria de
Pulso Diferencial (VPD). O eletrodo modificado apresentou excelente atividade catalítica para
oxidação de DA, AA e AU, fornecendo três picos voltamétricos bem definidos em
aproximadamente – 0,050, 0,145 e 0,270 V vs. Ag/AgCl, respectivamente, por VPD. Após a
otimização dos parâmetros experimentais (solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato pH 7,5),
obteve-se as curvas analíticas para DA, AA e AU, cujas faixas de linearidade foram 10,0-70,0
nmol L-1, 40,0-280,0 µmol L-1 e 2,0-14,0 µmol L-1, respectivamente. Os limites de detecção e
sensibilidade foram, respectivamente, 0,126 nmol L-1 e 0,653 µA/ nmol L-1 para DA, 2,136
µmol L-1 e 0,076 µA/ µmol L-1 para AA e 0,018 µmol L-1 e 9,888 µA/ µmol L-1 para AU. O
sensor foi aplicado com sucesso em amostras de urina humana e os resultados mostraram que
o mesmo não sofre interferência da matriz biológica. Estudos de adição e recuperação dos
analitos foram realizados para avaliar a exatidão do método e obteve-se uma porcentagem de
recuperação entre 95,14% e 101,49% para DA, 96,10% e 103,47% para AA e 97,90% e
102,32% para AU.
Palavras-chave: Dopamina; ácido ascórbico; ácido úrico; 1,4-naftoquinona; nanotubos de
carbono de paredes múltiplas; eletrodo de grafite pirolítico de plano basal.
i
ABSTRACT
The present work describes the development of a highly selective and sensitive voltammetric
sensor for dopamine (DA), ascorbic acid (AA) and uric acid (AU) using a basal plane
pyrolytic graphite electrode modified with 1,4-naphthoquinone adsorbed on multi-walled
carbon nanotubes (EGPPB/NTCPM/NQ). Images of Scanning Electron Microscopy were
used to characterize the materials. Oxidation process of DA, AA and AU were investigated by
Cyclic Voltammetry (VC) and Differential Pulse Voltammetry (VPD). The modified
electrode showed an excellent catalytic activity towards the oxidations of DA, AA and AU,
providing three well-defined voltammetric peaks at – 0.050, 0.145 e 0.270 V vs. Ag/AgCl,
respectively, by VPD. After optimization of experimental parameters (0.1 mol L-1 phosphate
buffer solution pH 7.5), the calibration plots were obtained for DA, AA and AU, in the range
from 10.0 up to 70.0 nmol L-1, 40.0 up to 280.0 µmol L-1 and 2.0 up to 14.0 µmol L-1,
respectively. The detection limit and sensitivity were, respectively, 0.126 nmol L-1 and 0.653
µA/ nmol L-1 for DA, 2.136 µmol L-1 and 0.076 µA/ µmol L-1 for AA and 0.018 µmol L-1 and
9.888 µA/ µmol L-1 for AU. The sensor developed has been successfully applied in human
urine samples and the results showed that the matrix biological does not affect the response of
the sensor. Studies of addition and recovery for DA, AA and AU were carried out to evaluate
the error of the method and was verified a recovery percentage between 95.14% and 101.49%
for DA, 96.10% and 103.47% for AA and 97.90% and 102.32% for AU.
Key-words: Dopamine; ascorbic acid; uric acid; 1,4-naphthoquinone; multi-walled carbon
nanotubes; basal plane pyrolytic graphite electrode.
ii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 – Representação esquemática de (a) NTCPS e (b) NTCPM. Fonte: Ferreira;
Rangel, 2009. .............................................................................................................................. 4
FIGURA 2 – Diagrama da formação dos nanotubos de carbono a partir de uma folha de
grafite. Fonte: Herbst et al., 2004. ............................................................................................. 5
FIGURA 3 – Fórmula estrutural da dopamina. ........................................................................ 10
FIGURA 4 – Fórmula estrutural do ácido ascórbico. ............................................................... 11
FIGURA 5 – Fórmula estrutural do ácido úrico. ...................................................................... 12
FIGURA 6 – Potenciostato/galvanostato da Echo Chemie (Autolab® modelo PGSTAT 128
N) utilizado para as medidas eletroquímicas. ........................................................................... 25
FIGURA 7 – (a) Célula eletroquímica com entrada para três eletrodos utilizada nas medidas
eletroquímicas. (b) ER= eletrodo de referência; EA= eletrodo auxiliar; ET= eletrodo de
trabalho. .................................................................................................................................... 26
FIGURA 8 – Microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM-6510LV. Disponível em:
http://www.jeol.com. Acesso em 12 de maio de 2012. ............................................................ 27
FIGURA 9 – Imagens obtidas por MEV dos (a) NTCPM e do (b) compósito NTCPM/NQ. . 31
FIGURA 10 - Voltamogramas cíclicos referentes ao EGPPB/NTCPM/NQ em solução 0,1 mol
L-1 de tampão fosfato (pH 7,0) no intervalo de velocidade de varredura de (a) 0,01 a 0,1 V s -1
e (b) 0,2 a 1,0 V s-1; gráfico de Ip vs. v para o intervalo de velocidade de varredura de 0,01 a
0,1 V s-1 obtidos para o (c) primeiro e (d) segundo par redox; e gráfico de Ip vs. v1/2 para o
intervalo de velocidade de varredura de 0,2 a 1,0 V s-1 obtidos para o (e) primeiro e (f)
segundo par redox..................................................................................................................... 33
FIGURA 11 – Variação experimental do potencial de pico vs. o logaritmo da velocidade de
varredura para o intervalo de velocidade de varredura de 0,02 a 1 V s-1 obtidos para o (a)
primeiro e (b) segundo par redox do EGPPB/NTCPM/NQ em solução 0,1 mol L-1 de tampão
fosfato (pH 7,0). Inserções: ampliação do gráfico para elevadas velocidades (acima de 0,2 V
s-1). ............................................................................................................................................ 36
iii
FIGURA 12 – Relação entre o potencial médio e o pH da solução no intervalo de pH
compreendido entre 6,0 e 8,0 para o (a) primeiro e (b) segundo par redox do
EGPPB/NTCPM/NQ em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato. ........................................... 38
FIGURA 13 – Processo redox da naftoquinona em meio aquoso. ........................................... 39
FIGURA 14 – Voltamogramas cíclicos referentes ao EGPPB/NTCPM/NQ na ausência (1) e
presença de AA (2), DA (3) e AU (4). Os voltamogramas foram obtidos utilizando AA na
concentração de 1,0 mmol L-1, DA na concentração de 10,0 µmol L-1, AU na concentração de
10,0 µmol L-1 e solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0) como eletrólito. v = 0,03 V
s-1. ............................................................................................................................................. 41
FIGURA 15 – Relação entre a corrente de pico anódica versus a raiz quadrada da velocidade
de varredura para (a) 1,0 mmol L-1 de AA, no intervalo de velocidade de varredura de 0,005 a
0,055 V s-1; (b) 10,0 µmol L-1 de DA, no intervalo de velocidade de varredura de 0,01 a 0,1 V
s-1; e (c) 10,0 µmol L-1 de AU, no intervalo de velocidade de varredura de 0,01 a 0,07 V s-1,
em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0). ................................................................ 42
FIGURA 16 – Voltamogramas de pulso diferencial (a) do EGPPB não modificado na
ausência (curva 1) e presença (curva 2) de DA, AA e AU; (b) do EGPPB/NTCPM na ausência
(curva 1) e presença (curva 2) de DA, AA e AU e do EGPPB/NQ na ausência (curva 3) e
presença (curva 4) de DA, AA e AU; (c) do EGPPB/NTCPM/NQ na ausência (curva 1) e
presença (curva 2) de DA, AA e AU. Os voltamogramas foram obtidos utilizando as
concentrações de 10,0 nmol L-1 de DA, 1,0 mmol L-1 de AA e 10,0 µmol L-1 de AU em 0,1
mol L-1 de solução tampão fosfato (pH 7,0). v = 0,03 V s-1; Ap = 0,03 V. ............................... 45
FIGURA 17 – (a) Voltamogramas de pulso diferencial e (b) gráfico Ipa vs. [DA] para o sensor
proposto em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0) contendo 1,0 mmol L-1 AA, 10,0
µmol L-1 AU e diferentes concentrações de DA: 10,0, 20,0, 30,0, 40,0 e 50,0 nmol L-1. v =
0,03 V s-1; Ap = 0,03 V. ............................................................................................................ 47
FIGURA 18 – (a) Voltamogramas de pulso diferencial e (b) gráfico Ipa vs. [AA] para o sensor
proposto em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0) contendo 10,0 nmol L-1 DA e
10,0 µmol L-1 AU e diferentes concentrações de AA: 291,0, 385,0, 476,0 e 566,0 µmol L-1. v
= 0,03 V s-1; Ap = 0,03 V. ......................................................................................................... 49
iv
FIGURA 19 – (a) Voltamogramas de pulso diferencial e (b) gráfico Ipa vs. [AU] para o sensor
proposto em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0) contendo 1,0 mmol L-1 AA, 10,0
nmol L-1 DA e diferentes concentrações de AU: 10,0, 15,0, 20,0, 25,0 e 30,0 µmol L-1. v =
0,03 V s-1; Ap = 0,03 V. ............................................................................................................ 51
FIGURA 20 – Influência do pH sobre a resposta do sensor imerso em solução contendo 10,0
nmol L-1 de DA, 1,0 mmol L-1 de AA e 10,0 µmol L-1 de AU. Medidas conduzidas em
solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato. v = 0,03 V s-1; Ap = 0,03 V......................................... 53
FIGURA 21 – Influência da velocidade de varredura (v) sobre a resposta do sensor proposto
para a determinação simultânea de DA, AA e AU. Medidas conduzidas em solução 0,1 mol
L-1 de tampão fosfato (pH 7,5) contendo 10,0 nmol L-1 de DA, 1,0 mmol L-1 de AA e 10,0
µmol L-1 de AU. Ap = 0,025 V. ................................................................................................ 56
FIGURA 22 – Influência da amplitude de pulso (Ap) sobre a resposta do sensor proposto para
a determinação simultânea de DA, AA e AU. Medidas conduzidas em solução 0,1 mol L-1 de
tampão fosfato (pH 7,5) contendo 10,0 nmol L-1 de DA, 1,0 mmol L-1 de AA e 10,0 µmol L-1
de AU. v = 0,06 V s-1. ............................................................................................................... 57
FIGURA 23 – (a) Voltamogramas de pulso diferencial para a oxidação simultânea de AA, DA
e AU nas seguintes concentrações: AA: (1) 40,0, (2) 80,0, (3) 120,0, (4) 160,0, (5) 200,0, (6)
240,0 e (7) 280,0 µmol L-1; DA: (1) 10,0, (2) 20,0, (3) 30,0, (4) 40,0, (5) 50,0, (6) 60,0 e (7)
70,0 nmol L-1; AU: (1) 2,0, (2) 4,0, (3) 6,0, (4) 8,0, (5) 10,0, (6) 12,0 e (7) 14,0 µmol L-1.
Medidas conduzidas em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,5); Curva analítica
obtida a partir dos voltamogramas de pulso diferencial (FIGURA 23 (a)) para (b) AA, (c) DA
e (d) AU. v = 0,60 V s-1; Ap = 0,50 V. ...................................................................................... 59
FIGURA 24 – Tempo de vida útil do EGPPB/NTCPM/NQ. Respostas analíticas obtidas em
solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,5) contendo 50 nmol L-1 de DA, 100 µmol L-1 de
AA e 20 µmol L-1 de AU. v = 0,60 V s-1; Ap = 0,50 V. ............................................................ 63
v
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Influência de diferentes soluções tampão de concentração 0,1 mol L-1 (pH 7,5)
sobre as correntes de pico anódicas (Ipa) referentes à oxidação de DA, AA e AU obtidas em
concentrações de 10,0 nmol L-1, 1,0 mmol L-1 e 10,0 µmol L-1, respectivamente. v = 0,03 V
s-1; Ap = 0,03 V. ........................................................................................................................ 54
TABELA 2 – Influência da concentração da solução tampão fosfato (pH 7,5) sobre as
correntes de pico anódicas (Ipa) referentes à oxidação de DA, AA e AU obtidas em
concentrações de 10,0 nmol L-1, 1,0 mmol L-1 e 10,0 µmol L-1, respectivamente. v = 0,03 V
s-1; Ap = 0,03 V. ........................................................................................................................ 54
TABELA 3 – Parâmetros eletroanalíticos obtidos para a determinação simultânea de DA, AA
e AU utilizando diferentes eletrodos. ....................................................................................... 60
TABELA 4 – Avaliação da repetibilidade de medidas obtidas com o EGPPB/NTCPM/NQ
imerso em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,5) contendo 50,0 µmol L-1 de DA,
100,0 µmol L-1 de AA e 20,0 µmol L-1 de AU. v = 0,60 V s-1; Ap = 0,50 V. ........................... 61
TABELA 5 – Avaliação da reprodutibilidade do preparo do EGPPB/NTCPM/NQ. Medidas
obtidas em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,5) contendo 50,0 nmol L-1 de DA,
100,0 µmol L-1 de AA e 20,0 µmol L-1 de AU. v = 0,60 V s-1; Ap = 0,50 V. ........................... 62
TABELA 6 – Avaliação da seletividade do sensor proposto em relação a possíveis
interferentes encontrados na matriz de urina humana. ............................................................. 64
TABELA 7 – Resultados dos testes de adição e recuperação utilizando o método proposto
para três amostras contendo DA, AA e AU (n = 3).................................................................. 65
TABELA 8 – Figuras de mérito determinadas na validação do sensor proposto. ................... 66
vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
α
Coeficiente de transferência eletrônica
αa
Coeficiente de transferência eletrônica anódico
αc
Coeficiente de transferência eletrônica catódico
αm
Coeficiente de transferência eletrônica médio
A
Área do eletrodo
Ap
Amplitude de pulso
a
Coeficiente de regressão linear da curva analítica
AA
Ácido ascórbico
Ag
Prata
AgCl
Cloreto de prata
AIDS
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AU
Ácido Úrico
b
Coeficiente de regressão angular da curva analítica
C0
Concentração do analito
CV
Coeficiente de Variação
D0
Coeficiente de difusão do analito na solução
DA
Dopamina
Dopac
Ácido 3,4-dihidróxifenilacético
DPR
Desvio(s) Padrão Relativo(s)
EA
Eletrodo Auxiliar
ECV
Eletrodo de Carbono Vítreo
EGPPB
Eletrodo de Grafite Pirolítico de Plano Basal
EQM
Eletrodo(s) Quimicamente Modificado(s)
Em
Potencial médio
Epa
Potencial de pico anódico
Epc
Potencial de pico catódico
ER
Eletrodo de Referência
ET
Eletrodo de Trabalho
F
Constante de Faraday
HCl
Ácido clorídrico
vii
HEPES
[4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido]
INMETRO
Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
Ip
Corrente(s) de pico
Ipa
Corrente(s) de pico anódica(s)
Ipc
Corrente(s) de pico catódica(s)
IUPAC
International Union of Pure and Applied Chemistry
KCl
Cloreto de Potássio
ks
Constante de velocidade de transferência de carga
LGC
Laboratory of the Government Chemist
LOD
Limite de Detecção
LOQ
Limite de Quantificação
µ
Média verdadeira (média da população)
MEV
Microscopia Eletrônica de Varredura
MRC
Materiais de Referências Certificados
n
Número de medições
n
Número total de elétrons envolvidos na reação
ne
Número de elétrons
np
Número de prótons
NaOH
Hidróxido de sódio
Na2HPO4
Fosfato de sódio bibásico anidro
NADH
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NF
National Formulary
NIST
National Institute of Standards and Technology
NO
Óxido nítrico
NQ
1,4-naftoquinona
NTC
Nanotubos de Carbono
NTCPM
Nanotubos de Carbono de Paredes Múltiplas
NTCPS
Nanotubos de Carbono de Paredes Simples
R
Constante dos gases reais
r
Coeficiente de correlação linear
s
Estimativa do desvio padrão absoluto
s
Estimativa do desvio padrão das respostas do branco
sat.
Saturado
viii
σ
Desvio padrão absoluto
SCE
Eletrodo de Calomelano Saturado
SNC
Sistema Nervoso Central
Γ
Cobertura superficial
T
Temperatura
TRIS
Tris(hidroximetil)aminometano
USP
The United States Pharmacopeia
VC
Voltametria cíclica
VPD
Voltametria de pulso diferencial
v
Velocidade de varredura
vs.
Versus
xi
Valor individual de uma medição
̅
Média aritmética de um pequeno número de medições
ix
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................................... i
ABSTRACT ............................................................................................................................... ii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES .....................................................................................................iii
LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ........................................................................vii
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS ............................................................................................................................ 3
3 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................... 4
3.1 Nanotubos de carbono ........................................................................................... 4
3.2 Dopamina ............................................................................................................ 10
3.3 Ácido Ascórbico ................................................................................................. 10
3.3 Ácido Úrico ......................................................................................................... 11
3.5 Análise simultânea de dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico ........................ 12
3.6 Validação de métodos analíticos ......................................................................... 17
3.6.1 Seletividade .................................................................................................. 18
3.6.2. Linearidade .................................................................................................. 18
3.6.3 Precisão ........................................................................................................ 19
3.6.4 Exatidão ........................................................................................................ 20
3.6.5 Limite de detecção........................................................................................ 22
3.6.6 Limite de quantificação ................................................................................ 22
3.6.7 Sensibilidade ................................................................................................ 22
3.6.8 Robustez ....................................................................................................... 23
4 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................. 24
4.1 Reagente utilizados e soluções ............................................................................ 24
4.2 Instrumentação .................................................................................................... 24
4.3 Preparo do eletrodo modificado .......................................................................... 26
4.4 Caracterização dos NTCPM e do compósito NTCPM/NQ ................................ 26
x
4.4.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) .............................................. 27
4.5 Estudo voltamétrico do processo de oxidação individual da dopamina, ácido
ascórbico e ácido úrico sobre o EGPPB/NTCPM/NQ.......................................................... 27
4.6 Estudo do comportamento eletroquímico do EGPPB modificado com o
compósito NTCPM/NQ, com NTCPM, com NQ e não modificado na presença e na
ausência de mistura ternária (dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico) .............................. 28
4.7 Otimização dos parâmetros experimentais e operacionais do sistema
eletroquímico para a determinação simultânea de dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico
empregando o EGPPB/NTCPM/NQ .................................................................................... 28
4.7.1 Parâmetros experimentais............................................................................. 28
4.7.2 Parâmetros operacionais ............................................................................... 28
4.8 Caracterização analítica do sensor para a determinação simultânea de dopamina,
ácido ascórbico e ácido úrico ................................................................................................ 29
4.9 Avaliação da repetibilidade de medidas e da reprodutibilidade do preparo do
sensor .................................................................................................................................... 29
4.10 Avaliação do tempo de vida útil do sensor ....................................................... 29
4.11 Determinação simultânea de dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico em
amostras de urina humana empregando o EGPPB/NTCPM/NQ.......................................... 30
4.12 Testes de adição e recuperação ......................................................................... 30
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 31
5.1 Caracterização dos NTCPM e do compósito NTCPM/NQ ................................ 31
5.2 Estudo do comportamento eletroquímico do EGPPB/NTCPM/NQ ................... 31
5.3 Estudo voltamétrico do processo de oxidação individual da dopamina, ácido
ascórbico e ácido úrico sobre o EGPPB/NTCPM/NQ.......................................................... 39
5.4 Estudo do comportamento eletroquímico do EGPPB modificado com o
compósito NTCPM/NQ, com NQ, com NTCPM e não modificado na presença e na
ausência da mistura ternária (dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico) .............................. 43
5.5 Estudo da interferência de um analito sobre o outro empregando o
EGPPB/NTCPM/NQ ............................................................................................................ 46
xi
5.6 Otimização dos parâmetros experimentais e operacionais do sistema
eletroquímico ........................................................................................................................ 52
5.6.1 Parâmetros experimentais............................................................................. 52
5.6.2 Parâmetros operacionais ............................................................................... 54
5.7 Caracterização analítica do sensor para a determinação simultânea de dopamina,
ácido ascórbico e ácido úrico ................................................................................................ 57
5.8 Avaliação da repetibilidade de medidas e da reprodutibilidade do preparo do
sensor .................................................................................................................................... 61
5.9 Avaliação do tempo de vida útil do sensor ......................................................... 62
5.10 Determinação simultânea de dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico em
amostras de urina humana empregando o EGPPB/NTCPM/NQ.......................................... 63
5.11 Testes de adição e recuperação ......................................................................... 64
5.12
Validação
do
sensor
proposto
e
considerações
finais
sobre
o
EGPPB/NTCPM/NQ ............................................................................................................ 65
6 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 67
PERSPECTIVAS FUTURAS .................................................................................................. 69
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 70
ANEXO A ................................................................................................................................ 83
xii
1
1 INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de novos métodos analíticos é uma das áreas de maior e mais
rápido crescimento dentro da química analítica, o que se deve, principalmente, aos novos
desafios impostos para se desenvolver dispositivos que apresentem elevada sensibilidade,
seletividade e estabilidade quando aplicados para a detecção e quantificação de importantes
moléculas, como por exemplo, as de interesse biológico.
Dopamina (DA), ácido ascórbico (AA) e ácido úrico (AU) desempenham papéis
cruciais no metabolismo humano. Estas substâncias coexistem nos fluidos biológicos (como
sangue e urina) e seus níveis estão diretamente associados a uma diversidade de patologias.
Assim, a determinação individual ou simultânea destas moléculas é uma questão importante
não só no campo da química biomédica, mas também nas pesquisas patológicas e de
diagnósticos.
Neste sentido, a necessidade do desenvolvimento de novos dispositivos para detecção
dessas e outras moléculas de grande interesse tem levado a uma crescente busca por novos
métodos com o objetivo de substituir ou melhorar os já existentes.
Para tanto, diversas técnicas têm sido utilizadas para a detecção de DA, AA e AU, tais
como fluorimetria (WANG et al., 2003), quimiluminescência (HU et al., 2005), cromatografia
de troca iônica (DAI et al., 2007), cromatografia líquida de alta eficiência (LIU et al., 1996),
espectroscopia no ultravioleta-visível (FRAISSE et al., 2002) e eletroforese capilar (CAUSSE
et al., 2007). Estas técnicas podem apresentar algumas desvantagens ou inconvenientes, pois
são frequentemente complicadas e, muitas vezes, necessitam de pré-tratamento da amostra,
longo tempo de análise ou requerer grande quantidade de solventes orgânicos, o que além de
dispendioso leva à geração de quantidade elevada de resíduos tóxicos.
Neste sentido, os métodos eletroquímicos têm recebido grande atenção devido às
diversas vantagens que apresentam, tais como baixo custo, elevada sensibilidade e
seletividade, rapidez de análise e facilidade de operação. Além disso, estes métodos podem
ser miniaturizados e automatizados, possibilitando a construção de dispositivos portáteis que
permitem a análise rápida e eficiente de substâncias in situ.
Por outro lado, a utilidade de um eletrodo pode ser limitada em decorrência de alguns
fatores, como, por exemplo, da passivação gradual da superfície do eletrodo, proveniente da
adsorção de produtos ou subprodutos da própria reação de oxidação ou redução utilizada na
detecção (ROSATTO et al., 2001); da cinética de transferência eletrônica, a qual pode ser
excessivamente lenta e não favorecer a transferência de elétrons entre os compostos e os
2
materiais dos eletrodos (ROSATTO et al., 2001); do elevado potencial de oxidação ou
redução do analito; bem como da dificuldade em discriminar compostos alvos que possuam
características redox similares (WANG, 1991).
Para contornar esses problemas e conferir ao sistema características importantes, tais
como sensibilidade, seletividade e robustez, o uso de eletrodos quimicamente modificados
(EQM) tem sido bastante empregado. Neste contexto, além da escolha do transdutor, que é de
suma importância, pois deve possuir, principalmente, condutividade elétrica adequada e servir
de suporte para possíveis modificações ou imobilizações de substâncias, o uso de
modificadores pode propiciar um significativo aumento na sensibilidade e na seletividade do
sensor e, muitas vezes, pode promover um efeito sinérgico aumentando ainda mais a
sensibilidade do sistema. Dessa maneira, o objetivo da modificação superficial de eletrodos
consiste em pré-estabelecer e controlar a natureza físico-química da interface eletrodosolução, alterando a reatividade e a seletividade do sensor base (FREIRE et al., 2003).
Um grande problema encontrado na detecção eletroquímica direta e simultânea de DA,
AA e AU, está no fato deles apresentarem potenciais similares de oxidação sob a maioria dos
materiais eletródicos comuns, o que leva a uma sobreposição da resposta voltamétrica
(O’NEIL, 1994). Sendo assim, o emprego de EQM apresenta-se como uma excelente
alternativa para a detecção simultânea destes compostos.
Dentre
os
materiais
mais
estudados
e
empregados
na
construção
de
sensores/biossensores, encontram-se os filmes e compósitos à base de nanotubos de carbono
(NTC), os quais têm atraído considerável atenção e são de grande interesse devido às suas
excelentes propriedades, tais como seu tamanho nanométrico, sua eficiente acumulação de
moléculas, suas ótimas propriedades eletrocatalíticas, elevada condutividade elétrica e alta
resistência mecânica (LUZ et al., 2008; AGÜÍ et al., 2008; WANG et al., 2003). Além disso,
os NTC podem ser funcionalizados com compostos orgânicos de forma que suas propriedades
eletrônicas e químicas sejam preservadas (SAMILI; POURBEYRAM, 2003).
Sendo assim, o presente trabalho descreve o desenvolvimento e a aplicação de um
sensor eletroquímico eficiente, sensível, seletivo e estável para a determinação simultânea de
dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico em fluidos biológicos. O sensor foi construído
através da modificação de um eletrodo de grafite pirolítico de plano basal (EGPPB) com um
nanocompósito formado pela adsorção de 1,4-naftoquinona (NQ) sob os nanotubos de
carbono de paredes múltiplas (NTCPM), o qual foi denominado EGPPB/NTCPM/NQ. O
método desenvolvido foi então validado a fim de demonstrar que o mesmo é adequado ao uso
pretendido.
3
2 OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho consiste no desenvolvimento, validação e aplicação de
um sensor eletroquímico com alta sensibilidade, seletividade e estabilidade para a
determinação simultânea de DA, AA e AU empregando o EGPPB/NTCPM/NQ.
Para atingir o objetivo proposto, os seguintes objetivos específicos foram
estabelecidos:
a) Caracterizar os NTCPM e o compósito NTCPM/NQ empregando a Microscopia
Eletrônica de Varredura (MEV);
b) Estudar o comportamento eletroquímico do EGPPB/NTCPM/NQ e determinar
seus parâmetros cinéticos;
c) Estudar o comportamento do eletrodo modificado com o compósito NTCPM/NQ,
do eletrodo modificado apenas com NQ, do eletrodo modificado apenas com
NTCPM e do eletrodo não modificado na presença e na ausência de dopamina,
ácido ascórbico e ácido úrico;
d) Estudar a interferência de um analito sobre o outro;
e) Otimizar os parâmetros experimentais para determinação simultânea de dopamina,
ácido ascórbico e ácido úrico, tais como, pH, tipo de solução tampão e
concentração da solução tampão sobre o sinal analítico do sensor;
f) Otimizar os parâmetros operacionais da voltametria de pulso diferencial (VPD) e
construir curvas analíticas para a determinação simultânea de dopamina, ácido
ascórbico e ácido úrico utilizando a técnica otimizada;
g) Realizar a caracterização analítica do sensor desenvolvido;
h) Avaliar a repetibilidade das medidas, a reprodutibilidade do preparo do sensor e o
tempo de vida útil do eletrodo modificado;
i) Realizar estudos de adição e recuperação dos analitos para avaliar a exatidão do
método desenvolvido;
j) Aplicar o sensor em amostras de urina humana.
4
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Nanotubos de carbono
Os nanomateriais têm recebido grande atenção nos últimos anos devido ao grande
potencial que apresentam para aplicação em campos diversificados como a química,
bioquímica, eletrônica, mecânica e óptica. Um importante grupo dentro destes materiais em
nanoescala consiste nos nanotubos de carbono (NTC), descobertos em 1991 por Iijima. Desde
a sua descoberta, os NTC têm sido objeto de numerosas investigações, o que se deve às suas
propriedades estruturais, mecânicas e eletrônicas, que fazem destes materiais nanoestruturas
muito atraentes para uma vasta gama de aplicações (IIJIMA, 2001; AJAYAN, 1999).
Os NTC são formados por arranjos hexagonais de carbono dispostos em folhas de
grafeno, as quais são enroladas em formato cilíndrico e apresentam diâmetro na ordem de
nanômetros e comprimento que pode variar de nanômetros a vários micrômetros (HARRIS,
1999; DRESSELHAUS et al., 2001).
Do ponto de vista estrutural, existem dois tipos de NTC (DRESSELHAUS et al.,
1996): os nanotubos de carbono de parede simples (NTCPS, do inglês single-walled carbon
nanotube) e os nanotubos de carbono de paredes múltiplas (NTCPM, do inglês multi-walled
carbon nanotubes). Os NTCPS são constituídos por uma única folha de grafeno cujo diâmetro
interno varia entre 0,2 e 2,0 nm (FIGURA 1 (a)), já os NTCPM são constituídos por múltiplas
folhas de grafeno concêntricas cujo diâmetro interno varia entre 2,0 e 100,0 nm, com uma
distância entre camadas que pode variar entre 0,34 e 0,36 nm (FIGURA 1 (b)) (HARRIS,
1999; BRITTO et al., 1996).
FIGURA 1 – Representação esquemática de (a) NTCPS e (b) NTCPM. Fonte: Ferreira; Rangel, 2009.
5
As propriedades eletrônicas excepcionais dos NTCPS são decorrentes do mecanismo
de transporte de elétrons que apresentam e que pode variar desde o tipo semicondutor até o
tipo metálico, dependendo do seu diâmetro e ângulo chiral, Φ (também chamado ângulo de
helicidade). Estes dois parâmetros resultam do chamado índice de Hamada (n,m) (HAMADA
et al., 1992).
Um NTCPS pode ser construído a partir de uma folha de grafite enrolada de tal forma
que coincidam dois sítios cristalograficamente equivalentes de sua rede hexagonal. O vetor C,
chamado chiral, que define a posição relativa dos dois sítios, é definido mediante dois
números inteiros, n e m, e pelos vetores unitários da rede hexagonal, a1 e a2, sendo C = na1 +
ma2, assim como mostrado na FIGURA 2 (HERBST et al., 2004).
FIGURA 2 – Diagrama da formação dos nanotubos de carbono a partir de uma folha de grafite. Fonte: Herbst et
al., 2004.
Dependendo dos valores relativos do par (n, m), os NTC podem ser do tipo armchair
(n = m), zig-zag (n, m = 0) ou chiral (n ≠ m ≠ 0), e estão definidos pelo ângulo de helicidade
(Φ). Em função dos índices de Hamada (n,m), um nanotubo apresenta características de um
material metálico quando n – m é múltiplo de 3 e, em caso contrário, é semicondutor. Todos
os tipos armchair são metálicos, enquanto que os zig-zag e chiral podem ser metálicos ou
semicondutores.
As propriedades eletrônicas dos NTCPM assemelham-se às propriedades dos NTCPS
devido ao fraco acoplamento entre os cilindros de carbono concêntricos (HERBST, 2004).
Alguns estudos relataram o funcionamento do transporte eletrônico nos NTC. Em
2002, Baughman e colaboradores demonstraram que, por se tratarem de estruturas quasiunidirecionais, o transporte eletrônico nos NTC metálicos (tanto NTCPS como NTCPM)
6
ocorre de forma balística, isto é, sem espalhamento ao longo do tubo, o que possibilita a
condução de correntes através de grandes extensões do nanotubo sem que haja aquecimento.
Em 2007, Masheter e colaboradores além de confirmarem as observações de
Baughman e colaboradores, também concluíram que o aumento da velocidade no transporte
eletrônico é devido à presença de grupos funcionais dispostos nos NTC localizados
principalmente nos planos de borda. Estes planos de borda encontram-se, em sua maioria, em
defeitos presentes no corpo do tubo além das extremidades.
Dessa forma, tanto a condução balística quanto a presença de planos de borda
fornecem aos NTC a capacidade de mediar transferência de elétrons em reações com espécies
em solução (HIURA et al., 2005), sendo assim muito atrativos no campo de Eletrodos
Quimicamente Modificados (EQM).
O termo EQM foi introduzido por Murray e colaboradores (1975) para designar
eletrodos com espécies quimicamente ativas convenientemente imobilizadas sobre suas
superfícies. O principal objetivo desta modificação é pré-estabelecer e controlar a natureza
físico-química da interface eletrodo-solução como uma forma de alterar a reatividade e a
seletividade do sensor base, favorecendo, assim, o desenvolvimento de eletrodos para
diversos fins e aplicações (DURST et al., 1997; KUTNER et al., 1998).
Para a preparação de um EQM, é preciso levar em consideração o eletrodo base, o
modificador químico e a(s) espécie(s) que se pretende determinar. O material do eletrodo
(suporte) deve apresentar características eletroquímicas apropriadas e deve, também, ser
adequado para o método de imobilização pretendido. Entre os materiais mais utilizados
encontram-se o grafite, o carbono vítreo, o ouro, a platina, as fibras e as pastas de carbono.
Os compostos modificadores são selecionados de acordo com o analito que se deseja
determinar, bloqueando o acesso direto e/ou inibindo processos do eletrodo, e promovendo
outros, permitindo deste modo uma maior seletividade nas análises (BRETT; OLIVEIRABRETT, 1993).
A modificação da superfície do eletrodo pode ser efetuada através de diferentes
técnicas, sendo elas: adsorção direta do modificador, ligação covalente a sítios específicos do
eletrodo, recobrimento da superfície do eletrodo com filmes poliméricos e modificação com
materiais compósitos.
A técnica de adsorção consiste na dissolução do agente modificador em um solvente
apropriado seguida da incorporação simples e rápida do composto no eletrodo suporte.
Na modificação do eletrodo por ligação covalente, o modificador é fixado
covalentemente à superfície do eletrodo, de forma estável, através da manipulação da
7
reatividade dos grupos funcionais existentes tanto na superfície do eletrodo como no
modificador.
A modificação com filmes poliméricos consiste no recobrimento da superfície do
eletrodo com filmes poliméricos condutores ou permeáveis ao eletrolólito de suporte e ao
analito de interesse. A modificação com membranas poliméricas permite a imobilização de
várias monocamadas da espécie ativa na superfície modificada, ampliando consideravelmente
a resposta eletroquímica (PEREIRA et al., 2002).
Por outro lado, materiais compósitos representam uma classe de materiais onde duas
ou mais substâncias combinadas passam a exibir propriedades únicas, que não são possíveis
de serem obtidas a partir de seus componentes individuais. Desta forma, compósitos podem
ser formados através da combinação de diferentes materiais, podendo ser do tipo inorgânicoinorgânico, orgânico-orgânico ou orgânico-inorgânico (CHUJO, 1996). Esta técnica é
bastante empregada para modificar eletrodos à base de carbono em pó como grafite, negro de
fumo e nanotubos de carbono.
A crescente aplicação dos NTC na área da química eletroanalítica, mais precisamente
no desenvolvimento de sensores eletroquímicos, tem sido impulsionada em virtude das
diversas vantagens práticas que eles apresentam, as quais podem ser descritas como: grande
área superficial, elevada velocidade na transferência de elétrons, elevada resistência mecânica,
capacidade anti-incrustante da superfície do eletrodo após modificação com NTC e a presença
de grupos funcionais que fazem com que os sensores baseados em NTC sejam atrativos para
serem modificados com diversos tipos de espécies (MERKOÇI et al., 2005; WANG, 2005;
WILDGOOSE, 2006).
A literatura apresenta uma diversidade de sensores desenvolvidos a partir da
modificação da superfície de um eletrodo com NTC, bem como com materiais compósitos à
base de NTC. Um dos primeiros sensores desenvolvidos utilizando os NTC foi feito por
Britto e colaboradores (1996) para demonstrar o comportamento de oxidação da dopamina.
Foi produzida uma pasta através da mistura dos NTC com bromofórmio a qual foi introduzida
em um tubo de vidro contendo um fio de platina. A oxidação via dois elétrons de dopamina
para dopaminoquinona mostraram reversibilidade ideal em voltametria cíclica e foi
significativamente superior à observada com outros eletrodos de carbono (dados da
comparação não apresentados pelos autores). Os autores atribuíram o melhor desempenho
deste sensor às dimensões nanoméricas, à estrutura eletrônica e aos defeitos topológicos
presentes na superfície dos NTC.
8
Em 2002, Wu e colaboradores modificaram um eletrodo de carbono vítreo (ECV) com
NTCPM para oxidação eletrocatalítica de óxido nítrico (NO). O preparo do sensor foi feito
através da dispersão dos NTCPM em acetona, adicionados posteriormente sobre a superfície
do ECV. Em seguida, a superfície do eletrodo foi coberta com uma membrana de Nafion para
eliminar possíveis interferentes. Os resultados obtidos mostraram uma elevada estabilidade e
um forte efeito catalítico do sensor proposto em relação à oxidação do NO, resultados estes
que também foram atribuídos às propriedades dos NTC.
Rubianes e Rivas (2003) prepararam um eletrodo de pasta de nanotubos de carbono
através da dispersão de NTCPM em óleo mineral para a oxidação de diferentes biomoléculas,
como ácido ascórbico, ácido úrico, dopamina, ácido 3,4-dihidróxifenilacético (dopac) e
peróxido de hidrogênio. O sensor proposto apresentou excelente atividade eletrocatalítica para
estas substâncias, sendo observada uma significativa redução do sobrepotencial para oxidação
de ácido ascórbico (redução de 0,230 V vs. Ag/AgCl, pH 7,4), ácido úrico (redução de 0,160
V vs. Ag/AgCl, pH 7,4) e peróxido de hidrogênio (redução de 0,300 V vs. Ag/AgCl, pH 7,4),
bem como um significativo aumento na reversibilidade do comportamento redox da dopamina
e dopac, quando comparados com o clássico eletrodo de pasta de carbono (grafite em pó).
Baseado na diminuição substancial do sobrepotencial de redução do peróxido de hidrogênio
(redução de 0,400 V vs. Ag/AgCl, pH 7,4), o sensor também foi utilizado para a preparação
de um biossensor para detecção de glicose através da incorporação de glucose oxidase dentro
do material compósito, a qual catalisa a oxidação da glicose para gluconolactona enquanto o
oxigênio, seu mediador natural, é convertido em peróxido de hidrogênio. Em comparação
com o eletrodo de pasta de carbono modificado com o catalisador, o sensor proposto
apresentou uma resposta mais rápida e 43 vezes mais sensível, sem sofrer qualquer
interferência mesmo na presença de excesso de ácido ascórbico, ácido úrico e acetaminofeno.
Os autores relataram que o novo material combina as vantagens de materiais compósitos com
as propriedades eletroquímicas dos nanotubos de carbono, o que oferece uma significativa
melhora no comportamento eletroquímico das moléculas estudadas.
Outro exemplo de EQM foi proposto por Wang e colaboradores (2006). Eles preparam
um sensor através da incorporação de β-ciclodextrinas em NTC, os quais foram adicionados
sobre a superfície de um eletrodo de grafite pirolítico para determinação de guanina e adenina.
Para avaliar e comparar as respostas obtidas com o sensor proposto, um sensor modificado
apenas com NTC também foi preparado e testado. Este sensor apresentou uma melhora tanto
na corrente de pico quanto na forma do pico de oxidação dos analitos quando comparado com
as respostas obtidas com o eletrodo não modificado. Os autores atribuíram estes resultados às
9
propriedades eletrônicas e à estrutura tubular unidimensional dos NTC, que têm a habilidade
de promover reações de transferência eletrônica e melhorar a eficiência da ação redox, bem
como aos agregados de NTC no eletrodo modificado, os quais possuem uma estrutura
interfacial que apresenta forte habilidade de acumulação de biomoléculas, resultando em um
melhor sinal analítico. Por fim, ao avaliar a resposta do sensor proposto, um aumento ainda
maior nas correntes de oxidação da guanina e da adenina foi observado, mostrando que o
novo eletrodo traz novos recursos para dispositivos eletroquímicos através da combinação das
vantagens dos NTC e das ciclodextrinas.
Com a finalidade de determinar Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NADH),
Huang e colaboradores (2007) prepararam um filme compósito formado por NTC/Nafion e o
mediador redox tionina adsorvido, sobre um ECV. Os autores observaram uma resposta para
oxidação do NADH em – 0,03 V vs. Ag/AgCl e a compararam com as respostas obtidas com
o eletrodo modificado com NTC/Nafion, modificado com Nafion/tionina e modificado apenas
com Nafion. O eletrodo modificado apenas com Nafion não foi capaz de responder ao NADH
na faixa de potencial investigada (– 0,6 a 0,8 vs. Ag/AgCl) e, na presença de tionina
(Nafion/tionina), apresentou uma pico de oxidação no potencial de 0,190 V vs. Ag/AgCl,
indicando que a tionina é responsável pela oxidação do mesmo porém, em potencial
significativamente maior que o obtido com o sensor proposto. Para o eletrodo modificado
com NTC/Nafion, um pequeno pico de oxidação em 0,130 V vs. Ag/AgCl foi observado, o
que se deve à presença dos NTC. A partir destas respostas, os autores atribuíram o resultado
apresentado pelo sensor proposto não apenas às propriedades dos NTC, mas sim à sinergia
positiva do filme integrado de tionina e NTC/Nafion, que facilitou a cinética de transferência
eletrônica. Além disso, também foi observado que as propriedades integradas da modificação
proposta evitaram o processo de dopagem do eletrodo, que geralmente é observado durante a
oxidação de NADH devido à sua própria adsorção e a de seus produtos de oxidação na
superfície do eletrodo limpo.
Em todos os casos apresentados anteriormente fica evidente a eficiência que os
sensores eletroquímicos à base de NTC apresentam, uma vez que podem ser confeccionados
através de diferentes técnicas, tais como a modificação com pasta, filme, camadas auto
organizadas (SAM) e camada sobre camada (layer-by-layer), possibilitam a imobilização de
variados tipos de modificadores e exibem propriedades eletrocatalíticas que não são tão
evidentes com o uso de outros materiais comuns, o que confere ao sistema desenvolvido uma
elevada sensibilidade e seletividade, principalmente.
10
Os analitos estudados no presente trabalho foram a dopamina, o ácido ascórbico e o
ácido úrico. Os mesmo serão descritos a seguir.
3.2 Dopamina
A dopamina (DA) (FIGURA 3) é um neurotransmissor endógeno, pertencente à
família das catecolaminas, que desempenha importante papel no sistema nervoso central
(SNC) e possui propriedades regulatórias das funções hormonais, renais e cardiovasculares
(WIGHTMAN et al., 1988). Na síntese das catecolaminas, a partir do aminoácido tirosina, a
dopamina é o precursor metabólico da noradrenalina e da adrenalina, as quais atuam em
receptores específicos no SNC, nos vasos mesentéricos, renais e nas coronárias.
HO
HO
NH2
pKa = 8,93
FIGURA 3 – Fórmula estrutural da dopamina.
O nível normal de DA no sangue situa-se na faixa de 0,1 a 1,0 µmol L-1 (Da SILVA et
al., 2008). Quantidades anormais desta substância no organismo humano estão diretamente
relacionadas com diversos distúrbios do funcionamento do cérebro, tais como déficit de
atenção, hiperatividade, transtornos do humor e má formação da memória, bem como com
doenças neurodegenerativas, como o mal de Parkinson e a esquizofrenia (BOULLIN et al.,
1976; SPOOREN et al., 2010).
Observa-se, portanto, que a DA possui uma grande aplicabilidade na área médica,
sendo, também, amplamente empregada em unidades de emergência hospitalar para o
tratamento do choque (cardiogênico, hemorrágico e séptico) e da hipotensão grave, pois atua
aumentando a pressão arterial e o fluxo sanguíneo bombeado pelo coração (OAK et al.,
2000).
3.3 Ácido Ascórbico
11
O ácido ascórbico (AA) (FIGURA 4), comumente conhecido como vitamina C, é um
componente vital na dieta humana e está presente tanto no reino animal quanto vegetal
(MARTIN et al., 1983). No plasma, seu nível normal encontra-se na faixa de 120,0 a 450,0
µmol L-1 e na urina em torno de 2,0 mmol L-1 (JACOBS et al., 1996; DILIBERTO et al.,
1991).
HO
O
HO
HO
O
OH
pKa1 = 4,17, pKa2 = 11,60
FIGURA 4 – Fórmula estrutural do ácido ascórbico.
O AA atua como cofator em diversas reações de hidroxilação e amidação através da
transferência de elétrons para enzimas que fornecem equivalentes redutores em muitas
reações biológicas. Outra função importante desta substância está relacionada à síntese de
colágenos, proteoglicanos e outros constituintes orgânicos da matriz intercelular em diversos
tecidos, tais como os dentes, ossos e endotélio capilar. Por isso, a deficiência de AA pode
estar relacionada com sintomas de algumas doenças, tal como a síndrome do escorbuto que,
se não tratada, pode ser fatal (STEVEN; LEVINE, 1998).
O uso de AA para prevenção e tratamento de diversas doenças é bastante comum,
como no caso de resfriados, doenças mentais, câncer, infertilidade e algumas manifestações
clínicas de infecção pelo vírus da AIDS. Também é bastante empregado em alimentos e
bebidas, atuando como um importante antioxidante (ARRIGONI; TULLIO, 2002).
3.3 Ácido Úrico
O ácido úrico (AU) (FIGURA 5) é o principal produto final do metabolismo das
purinas (guanina e adenina) no corpo humano. No indivíduo saudável, o nível normal de AU
na urina situa-se na faixa de 570,0 a 3400,0 µmol L-1, enquanto que no sangue encontra-se
entre 34,0 e 85,0 µmol L-1 (ADAMS, 1976; HARPER, 1977).
12
O
H
N
NH
O
N
H
N
H
O
pKa = 3,89
FIGURA 5 – Fórmula estrutural do ácido úrico.
Variações nos níveis de AU no organismo estão associadas com alterações no
metabolismo das purinas, que por sua vez estão relacionadas com inúmeras doenças e
distúrbios fisiológicos. Por isso, a quantificação de AU no sangue e na urina é de grande valor
para o diagnóstico e tratamento de doenças como hiperuricemia, leucemia, pneumonia,
doença de gota e síndrome de Lesch-Nyhan (DUTT; MOTTOLA, 1974).
3.5 Análise simultânea de dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico
Devido às diversas doenças associadas às variações nos níveis de dopamina, de ácido
ascórbico e de ácido úrico no organismo humano, bem como ao fato destas substâncias
coexistirem nos fluidos biológicos, a determinação simultânea destas moléculas desperta um
grande interesse tanto na área da química biomédica quanto nas pesquisas patológicas e de
diagnósticos.
Neste sentido, dentre as várias técnicas empregadas para a análise simultânea de DA,
AA e AU, os métodos eletroquímicos têm recebido grande destaque devido às vantagens que
apresentam, tais como o baixo custo, alta sensibilidade e seletividade, rapidez de análise e
facilidade de operação. No entanto, um grande problema associado à detecção eletroquímica
simultânea destas espécies consiste na interferência que uma substância promove na outra,
uma vez que elas apresentam potenciais de oxidação muito próximos, impossibilitando,
assim, uma detecção seletiva (FALAT; CHENG, 1982; ERNST; KNOLL, 2001).
Métodos eletroanalíticos utilizando eletrodos quimicamente modificados (EQM) têm
possibilitado a realização de análises com maior seletividade e sensibilidade, o que possibilita
sua aplicação para determinar simultaneamente DA, AA e AU.
Neste contexto, serão
descritos, a seguir, alguns trabalhos presentes na literatura envolvendo o emprego de EQM
para determinação simultânea destas substâncias.
13
Zare e colaboradores (2006) modificaram um eletrodo de carbono vítreo com um filme
de azul de oracet (um indicador de titulação) para determinar DA, AA e AU em solução 0,1
mol L-1 de tampão fosfato (pH 8,0). O sensor foi capaz de promover a oxidação
eletrocatalítica simultânea destes analitos, bem como resolver as respostas voltamétricas em
três picos bem definidos nos potenciais de – 0,035, 0,130 e 0,225 V vs. SCE, para o AA, DA e
AU, respectivamente. As curvas analíticas não foram obtidos em uma mistura ternária, mas
sim para cada analito separadamente. Assim, obteve-se uma faixa linear de resposta entre 40,0
e 800,0 µmol L-1 (r = 0,999), com sensibilidade de 0,0022 µA µmol-1 L e limite de detecção
(LOD) de 1,3 µmol L-1 para o AA. Para a DA, a faixa linear foi obtida no intervalo de 0,06 a
0,08 µmol L-1 (r = 0,999), com sensibilidade de 0,147 µA µmol-1 L e LOD de 0,02 µmol L-1.
E, para o AU, a faixa de resposta linear variou entre 20,0 e 600,0 µmol L-1 (r = 0,998), com
sensibilidade de 0,0071 µA µmol-1 L e LOD de 0,4 µmol L-1. Os autores deste trabalho,
entretanto, não aplicaram o sensor desenvolvido em amostras biológicas, bem como não
avaliaram a exatidão, precisão e seletividade da metodologia proposta. O tempo de vida útil
do sensor também não foi avaliado.
Argüello e colaboradores (2008) desenvolveram um sensor à base de azul de metileno
adsorvido sobre um compósito fosforilado zircônia-sílica, preparado por um processo sol-gel,
para a determinação simultânea de DA, AA e AU. O sensor foi aplicado em solução 0,35 mol
L-1 de tampão Tris-HCl (pH 7,4) contendo AA, DA e AU, sendo obtidos três picos de
oxidação bem definidos em – 0,074, 0,094 e 0,181 V vs. SCE, respectivamente, através da
voltamteria de pulso diferencial (VPD). As curvas analíticas foram obtidas a partir de uma
solução contendo uma mistura ternária dos analitos em que se observou uma faixa linear de
trabalho para o AA entre 100,0 e 1600,0 µmol L-1 (r = 0,998), com sensibilidade de 21,19 µA
mmol-1 L e LOD de 8,3 ± 0,1 µmol L-1. A faixa linear de trabalho para DA foi obtida no
intervalo de 6,0 a 100,0 µmol L-1 (r = 0,994), com sensibilidade de 482,80 (± 29,14) µA
mmol-1 L e LOD de 1,7 ± 0,1 µmol L-1. Para o AU, a faixa linear de trabalho variou de 22,0 a
350,0 µmol L-1 (r = 0,996), com sensibilidade de 120,15 (± 2,11) µA mmol-1 L e LOD de 3,7
± 0,2 µmol L-1. Os autores consideraram o sensor proposto estável e reutilizável, porém os
dados não foram apresentados. O eletrodo proposto não foi aplicado em amostras reais, assim
como não foram avaliadas a exatidão, precisão, seletividade e o tempo de vida útil do método
desenvolvido.
Huang e colaboradores (2008) desenvolveram um eletrodo de pasta de carbono
modificado com um nanocompósito formado por nanopartículas de paládio sobre carbono
grafite em pó para a determinação simultânea de DA, AA e AU. A seletividade do eletrodo
14
modificado foi estudada por VPD em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 4,5) e o
mesmo promoveu a resolução dos picos em três picos bem definidos, nos potenciais de 0,158,
0,402 e 0,550 V vs. Ag/AgCl, os quais se referem ao AA, DA e AU, respectivamente. As
curvas analíticas foram obtidas para cada analito individualmente, porém em uma mistura
contendo uma concentração fixa dos outros dois analitos. A corrente de pico anódica do AA
apresentou-se linear no intervalo de concentração de 0,05 a 4,0 mmol L-1 (r = 0,9988), com
LOD de 15,0 µmol L-1. Para a DA, a faixa de concentração foi linear no intervalo de 0,5 a
160,0 µmol L-1 (r = 0,9994), com LOD de 0,2 µmol L-1. E, para o AU, o intervalo de
concentração linear situou-se entre 2,0 e 200,0 µmol L-1 (r = 0,9998), com LOD de 0,7 µmol
L-1. As sensibilidades obtidas não foram apresentadas. Os autores avaliaram a repetibilidade
das medidas e a reprodutibilidade do sensor em uma mistura ternária dos analitos. Os DPR
obtidos para 20 medidas sucessivas foram 3,51%, 2,37% e 3,24%, para AA, DA e AU,
respectivamente, e, para 8 sensores preparados da mesma maneira e em dias diferentes, os
DPR foram de 4,05%, 3,94% e 3,78%. O eletrodo modificado se mostrou estável, seletivo e
reprodutível. A metodologia desenvolvida foi aplicada em amostras comerciais de dopamina
para injeção para a determinação de DA e, para a determinação de AU, a metodologia foi
aplicada em amostras de urina humana. Os resultados mostraram boa recuperação, bem como
a não interferência de possíveis substâncias provenientes da matriz da urina. Apesar dos
resultados obtidos, os autores não aplicaram o sensor desenvolvido para a determinação
simultânea dos analitos em algum tipo de amostra real, assim como não avaliaram o tempo de
vida útil do eletrodo modificado.
Ensafi e colaboradores (2009) modificaram um eletrodo de carbono vítreo com um
filme polimérico de CCDA (ácido poli-3-(5-cloro-2-hidroxfenilazo)-4,5-dihidroxinaftaleno2,7-disulfônico) para a determinação simultânea de DA, AA e AU em amostras reais. O
sensor proposto foi aplicado em solução 0,05 mol L-1 de tampão fosfato (pH 4,0) contendo
um mistura dos analitos e foram obtidos três picos de oxidação bem definidos em potenciais
de 0,280, 0,440 e 0,610 V vs. Ag/AgCl, para AA, DA e AU, respectivamente, através de
VPD. As curvas de calibração foram obtidas para os analitos individualmente mas na
presença de concentração fixa dos outros dois. A faixa linear de resposta para o AA foi obtida
entre 5,0 e 240,0 µmol L-1 (r = 0,996), com sensibilidade de 0,11 µA µmol-1 L e LOD de 1,43
µmol L-1. Para a DA, a faixa linear de resposta foi obtida no intervalo de 5,0 a 280,0 µmol L-1,
com sensibilidade de 0,054 µA µmol-1 L e LOD de 0,29 µmol L-1. O intervalo linear de
resposta para o AU foi entre 0,1 e 18,0 µmol L-1, com sensibilidade de 0,35 µA µmol-1 L e
LOD de 0,016 µmol L-1. Os autores avaliaram a seletividade do método, assim como
15
possíveis interferências de algumas substâncias. A metodologia foi aplicada em amostras
comerciais de vitamina C, em laranja e em limão – para determinação de AA; em amostras de
ampolas para injeção de dopamina – para determinação de DA; e em amostras de urina
humana enriquecidas com dopamina – para determinação de DA e AU. Entretanto, a
determinação simultânea de AA, DA e AU em amostras reais não foi avaliada, bem como o
tempo de vida útil do sensor desenvolvido.
Um método eletroquímico para a determinação simultânea de AA, DA e AU em
solução 0,05 mol L-1 de tampão fosfato (pH 4,5) utilizando um eletrodo de carbono cerâmico
modificado com NTCPM foi descrito por Habibi e Pournaghi-Azar (2010). Através da VPD,
o eletrodo modificado foi capaz de resolver os picos voltamétricos em três picos bem
definidos em potenciais de 0,092, 0,297 e 0,458 V vs. SCE, para AA, DA e AU,
respectivamente. A curva de calibração foi obtida para cada analito individualmente, porém
na presença dos demais analitos. A faixa de trabalho apresentou-se linear no intervalo de 15,0
a 800,0 µmol L-1 (r = 0,995) para o AA, com sensibilidade de 0,0413 µA µmol-1 L e LOD de
7,71 µmol L-1. Para a DA, a faixa de trabalho foi linear no intervalo de 0,5 a 100,0 µmol L-1 (r
= 0,998), com sensibilidade de 1,4917 µA µmol-1 L e LOD de 0,31 mol L-1. E, para o AU, a
faixa de trabalho apresentou-se linear no intervalo de 0,55 a 90,00 µmol L-1 (r = 0,998), com
sensibilidade de 0,42 µA µmol-1 L e LOD de 0,42 µmol L-1. A repetibilidade das medidas foi
avaliada e os DPR foram de 2,5%, 1,7% e 1,9% para AA, DA e AU, respectivamente. O
eletrodo modificado se mostrou seletivo e reprodutível. O método foi aplicado em amostras
comerciais de vitamina C – para determinação de AA; em amostras comerciais de solução de
dopamina para injeção – para determinação de DA; e em amostras de soro humano – para
determinação tanto de AU quanto de AA e DA, porém em diferentes experimentos. Apesar
destes resultados, os autores não aplicaram o sensor desenvolvido para a determinação
simultânea dos analitos em amostras reais, como também não avaliaram o tempo de vida útil
do mesmo.
Ensafi e colaboradores (2010) modificaram um eletrodo de carbono vítreo com um
filme polimérico de sulfonazo III para a determinação simultânea de DA, AA e AU em
amostras reais. Através da VPD, o sensor proposto foi aplicado em solução 0,05 mol L-1 de
tampão fosfato (pH 3,5) promovendo a oxidação eletrocatalítica de AA, DA e AU nos
potenciais de 0,170, 0,350 e 0,500 V vs. Ag/AgCl, respectivamente. As curvas de calibração
não foram obtidas simultaneamente, mas sim em experimentos separados para cada analito
nos quais se variou a concentração de um analito e se manteve constantes as concentrações
dos demais. A corrente de pico anódica do AA variou linearmente na faixa de concentração
16
de 5,0 a 1300,0 µmol L-1 (r = 0,997), com LOD de 0,17 µmol L-1. Para a DA, o intervalo de
resposta linear variou entre 0,2 a 470,3 µmol L-1 (r = 0,994), com LOD de 0,03 µmol L-1. E,
para o AU, a faixa de concentração foi linear no intervalo de 5,0 a 100,0 µmol L-1 (r =
0,9997), com LOD de 0,11 µmol L-1. Foram realizados estudo de possíveis interferentes e
estudos de adição e recuperação em amostras preparadas no laboratório contendo uma mistura
ternária dos analitos. O sensor proposto apresentou boa seletividade e boa exatidão. Os
autores aplicaram a metodologia desenvolvida em amostras comerciais de vitamina C – para a
determinação de AA; em amostras comerciais de ampolas de injeção de dopamina – para a
determinação de DA; e em amostras de urina humana enriquecidas – para a determinação de
AU e DA. Apesar dos resultados terem mostrado uma boa recuperação, o sensor proposto não
foi aplicado em amostras reais para a determinação simultânea dos analitos em estudo. A
precisão do método e o tempo de vida útil do sensor também não foram avaliados.
Mais recentemente, Kamyabi e Shafiee (2012) prepararam um eletrodo de carbono
vítreo modificado com NTCPM e poli-(2,6-diaminopiridina) para a determinação simultânea
de DA, AA e AU. O eletrodo modificado apresentou atividade eletrocatalítica para a oxidação
de AA, DA e AU em potenciais de – 0,063, 0,121 e 0,258 V vs. Ag/AgCl, respectivamente,
em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 8,0), através de VPD. Os autores não deixam
claro se as curva de calibração foram obtidas em uma mistura ternária dos analitos ou de
forma individual, portanto não é possível confirmar a seletividade do método proposto. Para o
AA, a curva de calibração foi obtida dentro de um intervalo linear de 27,0 a 1830,0 µmol L-1
(r = 0,9941), com LOD de 5,0 µmol L-1. Para a DA, o intervalo linear foi entre 0,83 e 10,00
µmol L-1, com LOD de 41,60 nmol L-1. Para o AU, a faixa linear de resposta foi entre 4,16 e
225,00 µmol L-1, com LOD de 0,70 µmol L-1. Os autores avaliaram o DPR para 10 medidas
sucessivas com o sensor proposto, sendo obtidos os desvios de 1,20%, 1,40% e 1,30%, para
AA, DA e AU, respectivamente. A reprodutibilidade para 5 eletrodos diferentes também foi
avaliada, apresentando um DPR de 3,40%, 3,90% e 4,50%, respectivamente. A metodologia
proposta foi aplicada em diferentes amostras, sendo o AA determinado em amostras
comerciais de vitamina C para injeção, a DA determinada em soluções comerciais para
injeção de DA, e o AU determinado em águas de poço enriquecidas com AU. Os valores de
recuperação obtidos estão dentro dos limites aceitáveis, porém, o sensor proposto não foi
aplicado em amostras biológicas, bem como não foi aplicado para determinação simultânea
dos analitos em nenhum tipo de amostra. Também, não foi apresentada nenhuma medida para
avaliar o tempo de vida útil do sensor.
17
Pelo exposto, observa-se que muitos dos sistemas desenvolvidos não permitem a
detecção simultânea de DA, AA e AU com alta sensibilidade, estabilidade e baixos limites de
detecção, sendo este último muito importante para a determinação de substâncias em baixas
concentrações, como, por exemplo, a DA, a qual está presente em níveis muito baixos nos
fluidos biológicos.
É importante ressaltar que apenas alguns dos trabalhos descritos anteriormente
aplicaram a metodologia desenvolvida em amostras biológicas para a detecção simultânea dos
três analitos. Este tipo de avaliação é de extrema importância, uma vez que é imprescindível
se verificar possíveis alterações nos sinais dos analitos provocadas por espécies provenientes
da matriz biológica, bem como verificar a influência que um analito exerce frente ao outro.
Sendo assim, com o objetivo de garantir características essenciais, tais como elevada
sensibilidade, seletividade, estabilidade e baixos limites de detecção, se faz necessário o uso
de novos modificadores que apresentem propriedades físico-químicas favoráveis para que
possam ser aplicados na área de desenvolvimento de sensores eletroquímicos.
3.6 Validação de métodos analíticos
Para garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis e
interpretáveis sobre a amostra, ele deve sofrer uma avaliação denominada validação. A
validação de métodos analíticos é, então, essencial para definir se o método desenvolvido está
completamente adequado aos objetivos a que se destina, a fim de se obter resultados
confiáveis que possam ser satisfatoriamente interpretados.
No Brasil, há duas agências credenciadoras para verificar a competência de
laboratórios de ensaios, a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e o
INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial). Estes
órgãos disponibilizam guias para o procedimento de validação de métodos analíticos – a
Resolução ANVISA no 899, de 29 de maio de 2003 e o documento INMETRO DOQCGCRE-008, de maço de 2007, respectivamente. Os guias são documentos que sugerem uma
linha a ser seguida, sendo intencionalmente vagos para deixar aos analistas a flexibilidade de
adaptá-los de acordo com o método a ser usado (KRULL; SWARTZ, 1998).
Segundo o INMETRO (2007), a validação é a comprovação, através de fornecimento
de evidência objetiva, de que os requisitos para uma aplicação ou uso específicos pretendidos
foram atendidos. A Resolução no 899 da ANVISA (2003) define a validação da seguinte
maneira: a validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda
18
às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados; e que
para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade,
limite de quantificação e exatidão adequados à análise.
Desta forma, a validação possibilita o conhecimento das limitações e da confiabilidade
nas medidas realizadas nas análises.
Durante a validação de uma metodologia analítica, alguns parâmetros analíticos
devem ser determinados, como: exatidão, precisão, especificidade, limite de detecção (LOD),
limite de quantificação (LOQ), linearidade, sensibilidade e robustez. Os parâmetros analíticos
devem ser baseados na intenção do uso do método. Desta forma, os experimentos podem ser
limitados para o que realmente é necessário.
A seguir, uma breve definição dos parâmetros de validação avaliados durante o
processo de validação de uma nova metodologia analítica é realizada.
3.6.1 Seletividade
A seletividade de um método refere-se à sua capacidade em avaliar, de forma
inequívoca, as substâncias em análise em presença de componentes que podem interferir com
a sua determinação em uma amostra complexa. A seletividade avalia o grau de interferência
de tais como outro ingrediente ativo, excipientes, impurezas e produtos de degradação, além
de outros compostos de propriedades similares que possam estar presentes. Assim, a
seletividade garante que a resposta obtida seja exclusivamente do composto de interesse (USP
31, 2008; VESSMAN et al., 2001). Se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a
exatidão e a precisão estarão seriamente comprometidas.
3.6.2. Linearidade
A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados diretamente
proporcionais à concentração da substância em análise, dentro de uma determinada faixa de
aplicação (ICH, 1995; USP 31, 2008; SWARTZ; KRULL, 1998).
A correlação entre o sinal medido e a concentração da espécie de interesse deve ser
determinada empiricamente e essa relação matemática pode ser expressa como uma equação
de reta chamada de curva analítica (BARROS NETO et al., 2004).
Matematicamente, a estimativa dos coeficientes de uma curva analítica a partir de um
conjunto de medições experimentais pode ser efetuada usando o método matemático
19
conhecido como regressão linear (CUSTÓDIO et al., 1997). Além dos coeficientes de
regressão linear (a) e angular (b) de uma curva analítica, a partir dos pontos experimentais
também é possível calcular o coeficiente de correlação linear (r) (CHUI et al., 2001), o qual
permite estimar a qualidade da curva obtida uma vez que quanto mais próximo de 1,0, menor
é a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor é a incerteza dos coeficientes de
regressão estimados. A ANVISA (2003) recomenda um coeficiente de correlação mínimo
aceitável igual a 0,99, enquanto o INMETRO (2007) um valor acima de 0,90.
Em qualquer técnica instrumental, a relação linear simples, descrita pela equação Y =
b X + a, só é válida em um determinado intervalo de concentração da espécie medida. Este
intervalo de concentrações, no qual se pode construir uma curva analítica linear, é
denominado faixa linear de trabalho (ICH, 1995).
A quantificação do composto de interesse em validação pode ser obtida através dos
seguintes métodos: padronização externa, padronização interna, superposição da matriz e
adição padrão.
3.6.3 Precisão
A precisão é utilizada para avaliar a dispersão de resultados entre ensaios
independentes e repetidos de uma mesma amostra sob as condições definidas (ICH, 1995;
INMETRO, 2007). A precisão é avaliada pelo desvio padrão absoluto (σ) de um número
significativo de medidas. Na prática, em validação de métodos, o número de determinações é
geralmente pequeno e o que se calcula é a estimativa do desvio padrão absoluto (s).
s
∑ ( – ̅)
√
n
( )
onde ̅ é a média aritmética de um pequeno número de medições (média das determinações),
sendo uma estimativa de µ, a média verdadeira (média da população); xi é o valor individual
de uma medição e n é o número de medições.
A precisão também pode ser expressa através do intervalo de confiança da média, que
é uma faixa de valores no qual existe uma determinada probabilidade de se encontrar certo
valor de uma variável, calculada pela equação:
Intervalo de confiança da média
̅
tn
s
√n
( )
20
em que tn-1 corresponde ao valor crítico de Student com n-1 graus de liberdade. O valor de t é
tabelado e apresenta valores para diferentes níveis de confiança.
Outra expressão da precisão é através da estimativa do desvio padrão relativo (DPR),
também conhecido como coeficiente de variância (CV).
DPR ( ) ou CV ( )
s
̅
00
( )
A precisão em validação de métodos é considerada em três níveis diferentes:
repetitividade (repetibilidade), precisão intermediária e reprodutibilidade.
A repetitividade ou repetibilidade representa a concordância entre os resultados de
medições sucessivas de um mesmo mensurando, efetuadas sob as mesmas condições de
medição, chamadas de condições de repetitividade: mesmo procedimento de medição, mesmo
observador, mesmo instrumento usado sob mesmas condições, mesmo local e repetições em
curto espaço de tempo (INMETRO, 2007). A repetitividade envolve várias medições da
mesma amostra, em diferentes preparações, e pode ser expressa através da estimativa do DPR.
A precisão intermediária, também denominada de reprodutibilidade interna, refere-se à
precisão avaliada sobre a mesma amostra, amostras idênticas ou padrões, utilizando o mesmo
método, no mesmo laboratório, mas definindo exatamente quais as condições a variar (uma ou
mais), tais como: diferentes analistas, diferentes equipamentos e diferentes tempos. Esta
medida é conhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados em um
laboratório e, como tal, mais aconselhável de se usar. Para se avaliar a precisão intermediária
de um método, efetuam-se “n” medições em replicata, ou em ensaio único, sobre a amostra
nas condições pré-definidas (INMETRO, 2007).
A reprodutibilidade é o grau de concordância entre os resultados das medições de um
mesmo mensurando, efetuadas sob as condições variadas de medições (mudança de operador,
local, equipamentos, etc) (INMETRO, 2007). A reprodutibilidade refere-se aos resultados dos
estudos de colaboração entre laboratórios e deve ser considerada em situações como a
padronização de procedimentos analíticos a serem incluídos, por exemplo, em farmacopeias.
3.6.4 Exatidão
21
A exatidão representa o grau de concordância entre o resultado de um ensaio e o valor
de referência aceito convencionalmente como verdadeiro. Os procedimentos utilizados
normalmente para avaliar a exatidão de um método são: a comparação com materiais de
referência certificados (MRC), participação em comparações interlaboratoriais e realização de
ensaios de recuperação (INMETRO, 2007).
Os materiais de referência certificados (MRC) são materiais de referência
acompanhados de um certificado que possui o valor de concentração de uma dada substância,
ou outra grandeza, para cada parâmetro e uma incerteza associada. Os MRC são fornecidos
por organismos reconhecidos e confiáveis, como NIST (National Institute of Standards and
Technology – Estados Unidos), LGC (Laboratory of the Government Chemist – Reino
Unido), USP (United States Pharmacopeia – Estados Unidos), etc.
Na avaliação da exatidão utilizando um material de referência, os valores obtidos pelo
laboratório – média e o desvio padrão de uma série de ensaios em replicata – devem ser
comparados com os valores certificados do material de referência. Caso não se alcancem as
condições satisfatórias, deve ser efetuado um plano de ações corretivas para verificar as
causas e reavaliar o ensaio (INMETRO, 2007).
A avaliação da exatidão do método a partir da comparação de métodos consiste na
comparação entre resultados obtidos empregando-se o método em desenvolvimento e os
resultados conseguidos através de um método de referência, em que é avaliado o grau de
proximidade entre os resultados obtidos por ambos. Esta abordagem assume que a incerteza
do método de referência é conhecida (RIBANI et al., 2004).
Por fim, a recuperação é definida como a proporção da quantidade de substância de
interesse, presente ou adicionada na porção analítica do material teste, que é passível de ser
quantificada (THOMPSON et al., 1999). A recuperação do analito pode ser estimada pela
análise de amostras adicionadas com quantidades conhecidas do mesmo (spike) em pelo
menos três concentrações diferentes. A recuperação é calculada segundo (INMETRO, 2007):
Recuperaç o ( )
C C
(
)
C
00
( )
onde C1 corresponde à concentração determinada na amostra adicionada e C2 à concentração
determinada na amostra não adicionada.
22
3.6.5 Limite de detecção
O limite de detecção, LOD, corresponde à menor concentração da substância em
análise que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, através de um
determinado procedimento experimental (ICH, 1995; INMETRO, 2007).
Segunda a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) (CURRIE,
1995), o LOD pode ser calculado através dos parâmetros da curva analítica, e ser expresso
como:
LOD
,
( )
onde s é a estimativa do desvio padrão das respostas do branco e b é a inclinação (slope) ou
coeficiente de regressão angular da curva analítica.
3.6.6 Limite de quantificação
O limite de quantificação, LOQ, representa a menor concentração da substância em
análise que pode ser determinada com um nível aceitável de exatidão e precisão, utilizando
um determinado procedimento experimental (ICH, 1995; INMETRO, 2007).
Segunda a IUPAC (CURRIE, 1995), o LOQ pode ser calculado através dos
parâmetros da curva analítica, e ser expresso como:
LOQ
0
( )
onde s é a estimativa do desvio padrão das respostas do branco e b é a inclinação (slope) ou
coeficiente de regressão angular da curva analítica. Após ter sido determinado, o valor deve
ser testado para averiguar se a exatidão e a precisão conseguidas são satisfatórias.
3.6.7 Sensibilidade
A sensibilidade é a capacidade do método em distinguir, com determinado nível de
confiança, duas concentrações próximas (AMARANTE et al., 2001). Do ponto de vista
23
prático, a sensibilidade constitui o coeficiente angular do gráfico analítico (CAUSON, 1997;
CURRIE, 1995).
Em métodos sensíveis, uma pequena diferença na concentração do analito causa
grande variação no valor do sinal analítico medido. Este critério expressa a capacidade do
procedimento analítico gerar variação no valor da propriedade monitorada ou medida,
causada por pequeno incremento na concentração ou quantidade do analito.
3.6.8 Robustez
A robustez de um método de ensaio mede a sensibilidade que este apresenta face a
pequenas variações. Um método diz-se robusto se revelar praticamente insensível a pequenas
variações que possam ocorrer quando esse está sendo executado. Assim, quanto maior for a
robustez de um método, maior será a confiança na sua precisão (INMETRO, 2007).
Segundo a USP (2008), a definição de robustez é um pouco diferente, e que lembra
reprodutibilidade. Considera-se que a robustez de um método analítico é o nível de
reprodutibilidade dos resultados dos testes obtidos pelas análises de algumas amostras sob
uma variedade de condições normais de teste, tais como diferentes laboratórios, diferentes
analistas, diferentes instrumentos, diferentes lotes de reagentes, diferentes dias, etc.
24
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Reagente utilizados e soluções
Dopamina (C8H11NO2), ácido úrico (C5H4N4O3), nanotubos de carbono de paredes
múltiplas (pureza > 95%, 7-15 nm x 0,5-10 µm), 1,4-naftoquinona e HEPES [4-(2-hidroxietil)
piperazina-1-ácido etanosulfônico] foram adquiridos da Sigma-Aldrich®, St. Louis, EUA.
Ácido ascórbico (C6H8O6), TRIS-BASE [Tris(hidroximetil) aminometano] e hidróxido de
sódio foram adquiridos da Vetec Química Fina, Rio de Janeiro, Brasil. Ácido cítrico anidro
(C6H8O7) foi adquirido da Isofar Indústria e Comércio de Produtos Químicos Ltda, Rio de
Janeiro, Brasil. Fosfato de sódio bibásico anidro (Na2HPO4) foi adquirido da Dinâmica®
Reagentes Analíticos, São Paulo, Brasil. Acetonitrila e acetona foram adquiridos da
Proquimios Comércio e Indústria Ltda, Rio de Janeiro, Brasil.
Para ajuste do pH das soluções tampão, utilizou-se soluções NaOH 0,2 mol L-1 ou HCl
0,1 mol L-1.
Os reagentes utilizados nos experimentos foram de grau analítico e todas as soluções
foram preparadas utilizando-se água purificada pelo sistema Milli-Q da Millipore® com
resistividade maior ou igual a 8 MΩ cm-1.
As amostras de urina humana utilizadas para quantificação de dopamina, ácido
ascórbico e ácido úrico foram obtidas no momento de cada análise e utilizadas sem qualquer
tratamento.
4.2 Instrumentação
As medidas eletroquímicas foram realizadas com um potenciostato/ galvanostato
Autolab® modelo PGSTAT 128 N da Echo Chemie (Utrecht, The Netherlands) (FIGURA 6),
acoplado a um microcomputador com o software GPES 4.9 para controle de potencial,
aquisição e tratamento de dados.
As respostas eletroquímicas de potenciais e correntes de pico foram obtidas pelas
técnicas de voltametria cíclica (VC) e voltametria de pulso diferencial (VPD).
25
FIGURA 6 – Potenciostato/galvanostato da Echo Chemie (Autolab® modelo PGSTAT 128 N) utilizado para as
medidas eletroquímicas.
O sistema utilizado para obtenção dos dados foi constituído por uma célula
eletroquímica com capacidade para 10,0 mL. Os eletrodos foram inseridos na célula por
entradas em uma tampa de Teflon®. O eletrodo de trabalho utilizado foi um disco de grafite
pirolítico de plano basal montado em Teflon®, com uma área geométrica de 0,196 cm2. Os
eletrodos auxiliar e de referência foram constituídos, respectivamente, por um fio de platina e
por Ag/AgCl(sat.), contendo 3,0 mol L-1 de KCl (FIGURA 7).
26
FIGURA 7 – (a) Célula eletroquímica com entrada para três eletrodos utilizada nas medidas eletroquímicas. (b)
ER= eletrodo de referência; EA= eletrodo auxiliar; ET= eletrodo de trabalho.
4.3 Preparo do eletrodo modificado
Previamente à modificação, o EGPPB foi preparado através da renovação de sua
superfície com cello tape (fita adesiva de celulose) (SALIMI et al., 2004). Este procedimento
consiste em polir a superfície do eletrodo com lixa e, em seguida, pressionar a fita adesiva
sobre a superfície limpa diversas vezes para remoção de qualquer aderente. O eletrodo foi,
então, enxaguado com acetona para remoção de qualquer adesivo remanescente.
Após a limpeza do EGPPB, uma suspensão foi preparada através da mistura de 500,0
mg de NTCPM e 3,2 mg de 1,4-naftoquinona (NQ) em 20,0 mL de acetonitrila. Após 48
horas, a suspensão foi filtrada e lavada diversas vezes com acetonitrila e deixada para secar a
40oC por 2 horas. 3,0 mg do compósito formado foram adicionados em 1,0 mL de acetonitrila
e deixados no sonicador por 10 minutos. Em seguida, 20,0 µL desta suspensão foram
colocados diretamente sobre a superfície do EGPPB, o qual foi deixado para secar a
temperatura ambiente por 3 horas. O eletrodo modificado com o compósito NTCPM/NQ foi
enxaguado com água purificada, para remover as espécies fracamente adsorvidas, e levado
para a célula eletroquímica.
4.4 Caracterização dos NTCPM e do compósito NTCPM/NQ
27
4.4.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Com o objetivo de caracterizar os compostos, imagens de MEV a 20 kV dos NTCPM
e do compósito NTCPM/NQ foram obtidas utilizando um microscópio eletrônico de
varredura JEOL modelo JSM-6510LV (FIGURA 8).
FIGURA 8 – Microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM-6510LV. Disponível em: http://www.jeol.com.
Acesso em 12 de maio de 2012.
4.5 Estudo voltamétrico do processo de oxidação individual da dopamina, ácido
ascórbico e ácido úrico sobre o EGPPB/NTCPM/NQ
Os processos de oxidação da DA, AA e AU sobre o EGPPB/NTCPM/NQ foram
avaliados individualmente através da técnica de voltametria cíclica (VC). Informações
adicionais sobre estes processos foram adquiridas a partir dos voltamogramas obtidos para
cada analito em diferentes velocidades de varredura. O estudo foi conduzido utilizando-se
como eletrólito suporte 10,0 mL de solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,5), DA na
concentração de 10,0 µmol L-1, AA na concentração de 1,0 mmol L-1 e AU na concentração
de 10,0 µmol L-1.
28
4.6 Estudo do comportamento eletroquímico do EGPPB modificado com o compósito
NTCPM/NQ, com NTCPM, com NQ e não modificado na presença e na ausência de
mistura ternária (dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico)
A habilidade do EGPPB/NTCPM/NQ em promover a resolução voltamétrica dos
analitos (DA, AA e AU) em uma mistura ternária foi avaliada através da técnica de
voltametria de pulso diferencial (VPD) na ausência e na presença dos mesmos. Para fins de
comparação, voltamogramas do EGPPB não modificado, modificado apenas com NTCPM
(EGPPB/NTCPM) e modificado apenas com NQ (EGPPB/NQ), na presença e na ausência
dos analitos, também foram realizados. Todos os voltamogramas foram obtidos utilizando-se
soluções 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0), à velocidade de varredura (v) de 0,03 V s-1 e
amplitude de pulso (Ap) de 0,03 V.
4.7 Otimização dos parâmetros experimentais e operacionais do sistema eletroquímico
para a determinação simultânea de dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico
empregando o EGPPB/NTCPM/NQ
Para melhor desempenho do sensor, os parâmetros experimentais e operacionais do
sistema que influenciam a sensibilidade da técnica, a estabilidade e o perfil da resposta
analítica foram investigados.
4.7.1 Parâmetros experimentais
Inicialmente, variou-se o pH da solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato contendo uma
mistura ternária de DA, AA e AU, nos valores de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 e 8,5, em busca do
sistema que apresentasse o melhor perfil voltamétrico para os analitos.
Em seguida, estudou-se o comportamento desses analitos nos tampões fosfato, Tris e
Hepes, todos no mesmo valor otimizado de pH.
Por fim, a melhor solução tampão foi escolhida para se avaliar os sinais analíticos da
mesma em diferentes concentrações. As concentrações avaliadas foram de 0,025, 0,050,
0,100, 0,150, 0,200 e 0,250 mol L-1.
4.7.2 Parâmetros operacionais
29
Para a construção da curva analítica, os parâmetros operacionais da técnica de
voltametria de pulso diferencial – velocidade de varredura (v) e amplitude de pulso (Ap) –
foram otimizados.
Inicialmente foram avaliadas as velocidades de varredura de 0,03, 0,04, 0,05, 0,06,
0,07 e 0,08 V s-1 e, após determinar o valor ótimo de v, foram avaliadas as amplitudes de
pulso de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07 e 0,08 V.
4.8 Caracterização analítica do sensor para a determinação simultânea de dopamina,
ácido ascórbico e ácido úrico
A curva analítica final para a determinação simultânea de DA, AA e AU em solução
0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,5) foi construída empregando a técnica de voltametria de
pulso diferencial sob as condições operacionais otimizadas.
4.9 Avaliação da repetibilidade de medidas e da reprodutibilidade do preparo do sensor
A repetibilidade de medidas do sensor proposto foi avaliada por meio dos desvios
padrão relativos (DPR) entre as correntes de pico anódicas obtidas para dez medidas
voltamétricas sucessivas, para cada analito.
A reprodutibilidade para oito sensores preparados em dias diferentes também foi
avaliada através dos DPR obtidos para a intensidade das correntes anódicas.
Todas as medidas foram realizadas sob as condições experimentais otimizadas para o
EGPPB/NTCPM/NQ.
4.10 Avaliação do tempo de vida útil do sensor
Voltamogramas foram obtidos com um mesmo eletrodo modificado durante o período
de trinta dias. O valor da resposta analítica obtido inicialmente foi considerado como 100% e
os demais valores correspondentes aos dias subsequentes foram calculados como
porcentagem desse valor inicial.
Durante o período de avaliação do tempo de vida útil do sensor, o mesmo foi
armazenado a temperatura ambiente.
30
4.11 Determinação simultânea de dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico em amostras
de urina humana empregando o EGPPB/NTCPM/NQ
O sensor desenvolvido foi aplicado em amostras de urina humana para verificar o
efeito da matriz biológica sobre a resposta do mesmo sobre os analitos.
A concentração de DA, AA e AU nas amostras foram determinadas pelo método de
adição padrão utilizando-se 10,0 mL de soluções 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,5) para
diluir as amostras. O estudo foi realizado sob as condições experimentais e operacionais
otimizadas, sendo as medidas realizadas em triplicata para maior confiabilidade dos
resultados.
4.12 Testes de adição e recuperação
Os testes de adição e recuperação de DA, AA e AU foram realizados através da adição
de quantidades conhecidas dos mesmos em amostras sintéticas. A porcentagem de
recuperação foi dada pela razão entre a concentração de DA, AA e AU encontrada (mistura
ternária + padrões adicionados) e a concentração esperada multiplicando-se por 100. Os testes
de adição e recuperação foram realizados em triplicata para maior confiabilidade dos
resultados.
É importante ressaltar que todas as medidas eletroquímicas foram realizadas à
temperatura ambiente.
31
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Caracterização dos NTCPM e do compósito NTCPM/NQ
Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) foram obtidas com o
objetivo de caracterizar a morfologia dos NTCPM e do compósito NTCPM/NQ. A partir das
FIGURAS 9 (a) e 9 (b), as quais correspondem às imagens de MEV dos NTCPM antes e após
a modificação com NQ, respectivamente, é possível verificar que as moléculas de NQ estão
bem distribuídas sobre a superfície dos NTCPM e que não há formação de grandes agregados.
FIGURA 9 – Imagens obtidas por MEV dos (a) NTCPM e do (b) compósito NTCPM/NQ.
5.2 Estudo do comportamento eletroquímico do EGPPB/NTCPM/NQ
O comportamento eletroquímico do EGPPB/NTCPM/NQ foi avaliado por voltametria
cíclica na faixa de potencial entre – 0,2 e 0,3 V vs. Ag/AgCl em solução 0,1 mol L-1 de
tampão fosfato (pH 7,0) no intervalo de velocidade de varredura de 0,01 a 1,0 V s -1
(FIGURAS 10 (a) e 10 (b)). Observa-se, através dos voltamogramas cíclicos da FIGURA 10
(a), a presença de dois pares de picos redox nos potenciais médios [Em = (Epa + Epc)/ 2] de
aproximadamente – 0,05 V e 0,15 V, os quais, de acordo com a literatura, correspondem aos
processos de oxidação e redução das moléculas de NQ (MANISANKAR et al., 2004;
SLJUKIC et al., 2004; GUIN et al., 2011; KUMAR; SWETHA, 2011).
Durante consecutivas varreduras de potencial, a intensidade das correntes de pico
anódicas e catódicas permaneceram constantes, indicando que o compósito NTCPM/NQ está
32
fortemente aderido sobre a superfície do eletrodo e que as espécies redox não migram da
superfície para a solução durante as medidas eletroquímicas.
A estabilidade do sensor proposto também foi comprovada pela comparação entre os
voltamogramas cíclicos realizados antes e após o processo de lavagem do mesmo, nos quais
nenhuma diferença significativa foi observada.
No estudo da influência da velocidade de varredura sobre o EGPPB/NTCPM/NQ
(FIGURAS 10 (c) e 10 (d)), observa-se uma relação linear entre as correntes de pico anódicas
(Ipa) e catódicas (Ipc) e a velocidade de varredura tanto para o primeiro quanto para o segundo
par redox, para velocidades abaixo de 0,1 V s-1. Este comportamento sugere a existência de
um processo adsortivo ou um processo redox confinado na superfície do eletrodo, o que
evidencia a adsorção do compósito NTCPM/NQ sobre a superfície do mesmo.
Adicionalmente, observa-se que a razão Ipa/ Ipc é quase igual à unidade, bem como a diferença
entre os potenciais de pico anódicos (Epa) e catódicos (Epc) para ambos os pares redox é
mínima, o que caracteriza os processos observados como reversíveis. Verifica-se, ainda, que o
potencial de pico não sofre alteração com o aumento da velocidade de varredura, o que sugere
uma elevada cinética de transferência de carga (MANISANKAR et al., 2005). No entanto,
para velocidades de varredura acima de 0,2 V s-1 (FIGURA 10 (b)), os potenciais de pico
anódicos se deslocaram para valores mais positivos, enquanto que os potenciais de pico
catódicos se deslocaram para valores mais negativos, indicando que, para velocidades mais
altas, existe uma limitação proveniente da cinética de transferência de carga.
Nas FIGURAS 10 (e) e 10 (f), observa-se uma relação linear entre as correntes de pico
anódicas e catódicas e a raiz quadrada da velocidade de varredura para velocidades acima de
0,2 V s-1. Este comportamento indica a existência de um processo de transferência de massa, o
qual pode estar relacionado com a difusão dos contra íons dentro do compósito para manter a
eletroneutralidade do eletrodo.
33
150
(a)
(b)
10
100
5
50
0
I/  A
I/  A
0
-50
-5
-100
-10
-150
-15
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
-0,2
0,3
-0,1
0,0
6
0,1
0,2
0,3
E/ V vs. Ag/AgCl
E/ V vs. Ag/AgCl
6
(c)
r = 0,991
(d)
4
r = 0,998
4
2
Ip/ A
Ip/ A
2
0
-2
-2
-4
r = 0,990
-6
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,00
0,02
0,04
-1
0,06
v/ V s
60
(e)
r = 0,999
-4
v/ V s
24
r = 0,999
40
16
20
8
Ip/ A
Ip/ A
0
0
(f)
0,08
0,10
-1
r = 0,998
0
-8
-20
-16
-40
r = 0,993
r = 0,998
-24
-60
0,4
0,5
0,6
0,7
1/2
0,8
-1 1/2
v / (V s )
0,9
1,0
0,4
0,5
0,6
0,7
1/2
0,8
0,9
1,0
-1 1/2
v / (V s )
FIGURA 10 - Voltamogramas cíclicos referentes ao EGPPB/NTCPM/NQ em solução 0,1 mol L -1 de tampão
fosfato (pH 7,0) no intervalo de velocidade de varredura de (a) 0,01 a 0,1 V s-1 e (b) 0,2 a 1,0 V s-1; gráfico de Ip
vs. v para o intervalo de velocidade de varredura de 0,01 a 0,1 V s -1 obtidos para o (c) primeiro e (d) segundo par
redox; e gráfico de Ip vs. v1/2 para o intervalo de velocidade de varredura de 0,2 a 1,0 V s -1 obtidos para o (e)
primeiro e (f) segundo par redox.
34
A concentração de espécies eletroativas na superfície do eletrodo pode ser estimada
através do método sugerido por Sharp e colaboradores (1979). De acordo com este método, a
corrente de pico (Ip) está relacionada com a concentração de espécies eletroativas na
superfície do eletrodo (Γ) segundo a equação que se segue (WANG, 1994):
F Γ
RT
( )
onde n representa o número de elétrons envolvidos na reação, A é a área superficial do
eletrodo (0,196 cm2), Γ é a concentração de espécies eletroativas (mol cm2) e os demais
símbolos têm suas medidas usuais. Assim, a partir do coeficiente angular do gráfico Ipa vs. v
para o primeiro e o segundo par redox (FIGURAS 10 (b) e 10 (c)), as quantidades do
compósito NTCPM/NQ na superfície do eletrodo são iguais a 3,74 x 10-10 e 2,59 x 10-10 mol
cm-2, respectivamente.
Adicionalmente, a cinética de transferência eletrônica para o EGPPB/NTCPM/NQ foi
avaliada de acordo com o método descrito por Laviron (1979). O coeficiente de transferência
eletrônica (α) e a constante de velocidade de transferência de carga (ks) para um eletrodo
modificado podem ser estimados através da relação entre a variação dos potenciais de pico
anódico e catódico (ΔE) e o logaritmo das velocidades de varredura (log v).
Segundo a Teoria de Laviron, os coeficientes angulares do segmento linear anódico e
catódico do gráfico ΔE vs. log v são dados segundo as seguintes equações:
, 0 RT
αa F
Coeficiente angular
Coeficiente angular
–
, 0 RT
αc F
(8)
( )
onde αa e αc correspondem aos coeficientes de transferência eletrônica anódico e catódico,
respectivamente, n equivale ao número de elétrons envolvidos no processo de oxi-redução da
NQ (n= 2) e os demais símbolos têm suas medidas usuais.
relaç o ΔE vs. log v para o EGPPB/NTCPM/NQ é apresentada nas FIGURAS 11 (a)
e 11 (b), para o primeiro e segundo par redox, respectivamente. Como pode ser observado,
existe uma relação linear entre estes parâmetros para velocidades de varredura mais elevadas
35
(acima de 0,2 V s-1), nas quais os coeficientes angulares anódico e catódico correspondem a
0,049 e – 0,049 para o primeiro par redox, e 0,067 e – 0,067 para o segundo par redox.
Assim, os valores encontrados para αa e αc, referentes ao primeiro par redox, foram
iguais a 0,60. Para o segundo par redox, os valores encontrados para αa e αc foram iguais a
0,44. Sendo os valores de αmédio obtidos, para ambos os pares redox, valores próximos a 0,5,
sugere-se que o processo da naftoquinona é totalmente reversível (BARD; FAUKNER, 1980).
Para a obtenção da constante de velocidade de transferência de carga (ks) o método
descrito por Laviron (1979) propõe o uso da seguinte equação:
log
s
α log ( – α)
( – α) log α – log (
FΔ
RT
) – α ( – α) (
)
F
, 0 RT
( 0)
onde α é o coeficiente médio de transferência de carga, v é a velocidade de varredura e os
demais símbolos têm suas medidas usuais. Assim, para o primeiro par redox, o valor
encontrado para ks foi igual a 9,67 s-1 e, para o segundo par redox, foi igual a 7,95 s-1,
indicando uma rápida transferência de elétrons entre a naftoquinona e a superfície do eletrodo.
Comparando estes valores com o único valor encontrado na literatura para um diferente
sensor que também objetiva a determinação simultânea de DA, AA e AU (LIU et al., 2011),
observou-se que os valores obtidos com o sensor proposto no presente trabalho foram
significativamente superiores.
36
0,3
(a)
Y = 0,051 + 0,049 X
r = 0,098
0,08
0,04
E/ V
0,2
0,00
E/ V
-0,04
0,1
Y = - 0,051 - 0,049 X
r = - 0,098
-0,08
-0,8
-0,6
-0,4
Ep,a
-0,2
0,0
-1
log (v/ V s )
0,0
Ep,c
-0,1
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-1
log (v/ V s )
0,3
(b)
0,08
Y = 0,069 + 0,067 X
r = 0,986
0,2
E/ V
0,04
0,00
E/ V
-0,04
0,1
-0,08
Ep,a
Y = - 0,069 - 0,067 X
r = - 0,0986
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
-1
log (v/ V s )
0,0
Ep,c
-0,1
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-1
log (v/ V s )
FIGURA 11 – Variação experimental do potencial de pico vs. o logaritmo da velocidade de varredura para o
intervalo de velocidade de varredura de 0,02 a 1 V s-1 obtidos para o (a) primeiro e (b) segundo par redox do
EGPPB/NTCPM/NQ em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0). Inserções: ampliação do gráfico para
elevadas velocidades (acima de 0,2 V s-1).
37
A dependência do potencial médio dos pares redox confinados na superfície do
EGPPB/NTCPM/NQ com o pH da solução também foi investigada e os resultados são
apresentados nas FIGURAS 12 (a) 12 (b), as quais se referem ao primeiro e segundo par
redox, respectivamente. Conforme pode ser observado, existe uma relação linear entre o Em e
o pH da solução para a faixa de pH compreendida entre 6,0 e 8,0. Os coeficientes angulares
destes gráficos foram iguais a 0,0502 e 0,0508 V/ pH, respectivamente, estando estes valores
próximos ao esperado para um sistema nernstiano (0,0592 V/ pH a 25oC), o que indica que o
número de prótons (np) envolvidos neste processo é igual ao número de elétrons (ne)
(PAPOUCHADO et al.,1975), assim como esperado para o processo redox da naftoquinona
(MANISANKAR et al., 2004; SLJUKIC et al., 2004; GUIN et al., 2011; KUMAR;
SWETHA, 2011).
38
-0,02
(a)
-0,04
Em/ V
-0,06
-0,08
-0,10
-0,12
Coef. angular = 0,0502 V/ pH
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
pH
0,20
(b)
0,18
Em/ V
0,16
0,14
0,12
0,10
Coef. angular = 0,0508 V/ pH
0,08
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
pH
FIGURA 12 – Relação entre o potencial médio e o pH da solução no intervalo de pH compreendido entre 6,0 e
8,0 para o (a) primeiro e (b) segundo par redox do EGPPB/NTCPM/NQ em solução 0,1 mol L-1 de tampão
fosfato.
39
5.3 Estudo voltamétrico do processo de oxidação individual da dopamina, ácido
ascórbico e ácido úrico sobre o EGPPB/NTCPM/NQ
Voltamogramas cíclicos foram obtidos para o EGPPB/NTCPM/NQ na ausência
(FIGURA 14, curva 1) e presença de 1,0 mmol L-1 de AA (FIGURA 14, curva 2), de 10,0
µmol L-1 de DA (FIGURA 14, curva 3) e de 10,0 µmol L-1 de AU (FIGURA 14, curva 4) com
a finalidade de se verificar o comportamento voltamétrico dos mesmos.
No voltamograma da FIGURA 14, curva 1, dois pares redox com potencial em
aproximadamente – 0,05 e 0,15 V vs. Ag/AgCl podem ser observados, os quais resultam do
processo de oxidação e redução do grupo quinona da naftoquinona, conforme reação sugerida
pela literatura (MANISANKAR et al., 2004; GUIN et al., 2011):
OH
O
+ 2e + 2H+
O
OH
FIGURA 13 – Processo redox da naftoquinona em meio aquoso.
De acordo com a FIGURA 14, curva 2, após a adição do AA, verifica-se uma
significativa redução do sobrepotencial de oxidação, de aproximadamente 0,250 V vs.
Ag/AgCl, quando comparado com o potencial obtido no EGPPB não modificado (ANEXO A
FIGURA 1 (a)), bem como um aumento da corrente anódica exatamente sobre o potencial do
primeiro par redox da NQ e diminuição da corrente de pico catódica. Entretanto, o aumento
na corrente de pico anódica referente à oxidação do AA sobre o EGPPB/NTCPM/NQ não foi
tão pronunciado quando comparado com o EGPPB não modificado. A redução significativa
no potencial de oxidação sugere que a oxidação do AA sobre o EGPPB/NTCPM/NQ ocorre
via eletrocatálise, ou seja, a NQ adsorvida sobre os NTCPM promove um aumento na
velocidade de transferência eletrônica entre o analito em solução e a superfície do eletrodo,
fazendo com que a oxidação do AA ocorra em aproximadamente – 0,05 V vs. Ag/AgCl. (É
importante ressaltar que a concentração de AA estudada foi de 1,0 mmol L-1 em ambos os
casos).
40
Na FIGURA 14, curva 3, após a adição de 10,0 µmol L-1 de DA, observa-se um
aumento da corrente de pico anódica coincidentemente sobre o potencial do segundo par
redox da NQ (próximo de 0,170 V vs. Ag/AgCl). O mesmo potencial foi observado para a
oxidação de 10,0 µmol L-1 de DA sobre o EGPPB não modificado (ANEXO A FIGURA 1
(b)), porém, quando as correntes anódicas são comparadas nos dois casos, verifica-se, sem
nenhuma dúvida, que a oxidação de DA sobre o EGPPB/NQ/NTCPM é cerca de 16 vezes
maior que a corrente obtida com o EGPPB não modificado. Este resultado sugere que o
sensor proposto também promove a eletrocatálise do analito em questão.
Por fim, na FIGURA 14, curva 4, observa-se, após a adição de 10,0 µmol L-1 de AU,
novamente, a obtenção de um significativo aumento da corrente de pico anódica cerca de 35
vezes maior quando comparada com a resposta de 10,0 µmol L-1 de AU sobre o EGPPB não
modificado (ANEXO A FIGURA 1 (c)), porém ambas as oxidações ocorrem, assim como
para a DA, em um mesmo potencial (cerca de 0,300 V vs. Ag/AgCl).
Com base nessas informações, verifica-se que o sensor proposto promove uma
considerável redução no potencial de oxidação do AA com pequeno aumento na sua corrente
anódica, bem como significativos aumentos nas correntes de pico anódicas da DA e AU, sem
alteração nos seus potenciais de oxidação, promovendo uma eficiente separação entre os
picos. Desta maneira, o sensor proposto pode ser empregado para detectar e quantificar,
simultaneamente, AA, DA e AU como alta sensibilidade e seletividade.
41
2
40
I/  A
30
4
AA
20
3
10
0
DA
AU
1
-10
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
E/ V vs. Ag/AgCl
FIGURA 14 – Voltamogramas cíclicos referentes ao EGPPB/NTCPM/NQ na ausência (1) e presença de AA
(2), DA (3) e AU (4). Os voltamogramas foram obtidos utilizando AA na concentração de 1,0 mmol L-1, DA na
concentração de 10,0 µmol L-1, AU na concentração de 10,0 µmol L-1 e solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato
(pH 7,0) como eletrólito. v = 0,03 V s-1.
Com o propósito de obter mais informações sobre a oxidação do AA, da DA e do AU
sobre o EGPPB/NTCPM/NQ, gráficos de corrente de pico anódica versus a raiz quadrada da
velocidade de varredura (FIGURAS 15 (a), 15 (b) e 15 (c), respectivamente) foram feitos,
sendo observada uma relação linear entre estes parâmetros, o que sugere que a oxidação dos
analitos estudados corresponde a sistemas totalmente irreversíveis e controlados por difusão,
ou seja, que o transporte de massa é o fator limitante destes processos.
42
1/2
(a)
40
Ipa = 8,88 + 111,74 v
r = 0,998
Ipa/ A
35
30
25
20
0,10
0,15
0,20
1/2
0,25
0,30
-1 1/2
v / (V s )
(b) I = -18,76 + 185,04 v1/2
pa
40
35
r = 0,999
Ipa/ A
30
25
20
15
10
5
0,12
0,16
0,20
0,24
1/2
0,28
0,32
-1 1/2
v / (V s )
240
(c)
Ipa/ A
200
1/2
Ipa = -71,58 + 926,43 v
r = 0,999
160
120
80
0,12
0,16
0,20
0,24
1/2
0,28
0,32
-1 1/2
v / (V s )
FIGURA 15 – Relação entre a corrente de pico anódica versus a raiz quadrada da velocidade de varredura para
(a) 1,0 mmol L-1 de AA, no intervalo de velocidade de varredura de 0,005 a 0,055 V s -1; (b) 10,0 µmol L-1 de
DA, no intervalo de velocidade de varredura de 0,01 a 0,1 V s-1; e (c) 10,0 µmol L-1 de AU, no intervalo de
velocidade de varredura de 0,01 a 0,07 V s-1, em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0).
43
5.4 Estudo do comportamento eletroquímico do EGPPB modificado com o compósito
NTCPM/NQ, com NQ, com NTCPM e não modificado na presença e na ausência da
mistura ternária (dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico)
Com o objetivo de avaliar a habilidade do sensor proposto em promover a resolução
voltamétrica dos analitos, voltamogramas de pulso diferencial foram obtidos na ausência e
presença de 10,0 nmol L-1 de DA, 1,0 mmol L-1 de AA e 10,0 µmol L-1 de AU para o EGPPB
não modificado, modificado apenas com NTCPM, modificado apenas com NQ e modificado
com o compósito NTCPM/NQ. Os voltamogramas foram obtidos no intervalo de potencial de
– 0,2 a 0,45 V vs. Ag/AgCl e em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0).
No voltamograma da FIGURA 16 (a), curva 1, o qual se refere ao EGPPB não
modificado na ausência dos analitos, nenhum processo faradaico é observado. Para este
mesmo eletrodo na presença de DA, AA e AU, o voltamograma (FIGURA 16 (a), curva 2)
apresenta um pequeno e único pico de oxidação em 0,455 V vs. Ag/AgCl, demonstrando que
o mesmo não é capaz de distinguir as respostas voltamétricas destes analitos.
A FIGURA 16 (b) apresenta os voltamogramas obtidos com o EGPPB modificado
apenas com NTCPM e modificado apenas com NQ. Como pode ser observado no
voltamograma da FIGURA 16 (b), curva 1, o EGPPB/NTCPM na ausência dos analitos não
apresenta nenhum processo redox e, quando na presença dos mesmos (FIGUAR 16 (b), curva
2), um pico anódico em 0,235 V vs. Ag/AgCl é observado, o qual foi reduzido em 0,220 V e
apresentou uma corrente de pico anódica maior quando comparado com o EGPPB não
modificado (FIGURA 16 (a), curva 2). Entretanto, o EGPPB modificado apenas com NTCPM
também não é capaz de separar as respostas voltamétricas da DA, AA e AU.
Para o EGPPB modificado apenas com NQ, o voltamograma na ausência dos analitos
(FIGURA 16 (b), curva 3) apresenta apenas o pico de oxidação referente ao processo da
mesma. Quando na presença dos analitos, observa-se um outro pico anódico em 0,375 V vs.
Ag/AgCl (FIGURA 16 (b), curva 4), o qual apresenta uma corrente maior em menor potencial
que a verificada com o EGPPB não modificado (FIGURA 16 (a), curva 2), porém, quando
comparada com o EGPPB/NTCPM (FIGURA 16 (b), curva 2), a corrente de pico obtida é
menor e situa-se em potencial mais elevado. Tem-se, portanto, que a modificação do EGPPB
apenas com NQ também não é capaz de separar as respostas voltamétricas dos analitos.
Quando o EGPPB é modificado com o compósito NTCPM/NQ, o voltamograma
obtido na ausência dos analitos (FIGURA 16 (c), curva 1) apresenta 2 picos de oxidação em
aproximadamente – 0,05 e 0,15 V vs. Ag/AgCl, correspondentes aos processos redox da NQ
44
que se encontra adsorvida sobre os NTCPM na superfície do eletrodo, tal como mencionado
anteriormente. Observa-se que para este mesmo eletrodo na presença dos analitos, o
voltamograma obtido (FIGURA 16 (c), curva 2) apresenta três picos voltamétricos bem
definidos em aproximadamente – 0,050, 0,145 e 0,270 V vs. Ag/AgCl, os quais correspondem
à oxidação do AA, da DA e do AU, respectivamente. Adicionalmente, verifica-se um grande
aumento das correntes de pico anódicas quando comparadas com as obtidas com o EGPPB
não modificado (FIGURA 16 (a), curva 2), com o EGPPB/NTCPM (FIGURA 16 (b), curva
2) e com o EGPPB/NQ (FIGURA 16 (b), curva 4).
Do exposto, fica evidente que o emprego de NQ adsorvida sobre NTCPM na
modificação do EGPPB possibilita a detecção simultânea de AA, DA e AU, observada tanto
por VC quanto por VPD com grande seletividade, bem como proporciona elevados valores de
correntes de pico anódicas. Tais resultados podem ser atribuídos à baixa resistência à
transferência de carga do compósito NTCPM/NQ como também à boa habilidade que os
NTCPM apresentam em dispersar e fixar moléculas na superfície de eletrodos.
45
(a)
2
1,6
I/  A
1,2
0,8
0,4
1
0,0
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
E/ V vs. Ag/AgCl
2
(b)
10
8
I/  A
6
4
4
2
1
3
0
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
E/ V vs. Ag/AgCl
50
DA
(c)
AU
40
AA
I/  A
30
20
2
10
1
0
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
E/ V vs. Ag/AgCl
FIGURA 16 – Voltamogramas de pulso diferencial (a) do EGPPB não modificado na ausência (curva 1) e
presença (curva 2) de DA, AA e AU; (b) do EGPPB/NTCPM na ausência (curva 1) e presença (curva 2) de DA,
AA e AU e do EGPPB/NQ na ausência (curva 3) e presença (curva 4) de DA, AA e AU; (c) do
EGPPB/NTCPM/NQ na ausência (curva 1) e presença (curva 2) de DA, AA e AU. Os voltamogramas foram
obtidos utilizando as concentrações de 10,0 nmol L-1 de DA, 1,0 mmol L-1 de AA e 10,0 µmol L-1 de AU em 0,1
mol L-1 de solução tampão fosfato (pH 7,0). v = 0,03 V s-1; Ap = 0,03 V.
46
5.5 Estudo da interferência de um analito sobre o outro empregando o
EGPPB/NTCPM/NQ
A fim de se avaliar a interferência de um analito sobre o outro durante a utilização do
EGPPB/NTCPM/NQ para a quantificação simultânea de DA, AA e AU, três diferentes
experimentos foram realizados em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0). Em cada
experimento, variou-se a concentração de um dos três analitos enquanto que as dos demais
foram mantidas constantes.
A FIGURA 17 (a) apresenta os voltamogramas de pulso diferencial obtidos para a
variação da concentração de DA na faixa de 10,0 a 50,0 nmol L-1 na presença de 1,0 mmol L-1
de AA e 10,0 µmol L-1 de AU. A partir destes voltamogramas foi possível obter o gráfico que
relaciona a corrente de pico anódica com a concentração de DA (FIGURA 17 (b)), no qual se
verifica uma correlação linear entre estes parâmetros, com coeficiente de correlação (r) igual
a 0,999, o que demonstra que a presença de AA e de AU não afeta a resposta eletroquímica do
sensor proposto para a oxidação de DA. Além disso, verifica-se que nenhuma alteração
significativa ocorre nas correntes de pico anódicas do AA e do AU, mostrando que o aumento
da concentração de DA não interfere na resposta do sensor para estes analitos.
47
120
DA
(a)
100
I / A
80
60
40
AA
AU
20
0
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
E/V vs. Ag/AgCl
100
(b)
r = 0,999 (n = 5)
90
Ipa/ A
80
70
60
50
40
10
20
30
[DA]/ mol L
40
50
-1
FIGURA 17 – (a) Voltamogramas de pulso diferencial e (b) gráfico Ipa vs. [DA] para o sensor proposto em
solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0) contendo 1,0 mmol L-1 AA, 10,0 µmol L-1 AU e diferentes
concentrações de DA: 10,0, 20,0, 30,0, 40,0 e 50,0 nmol L-1. v = 0,03 V s-1; Ap = 0,03 V.
48
Os voltamogramas de pulso diferencial obtidos para a variação da concentração de AA
na faixa de 291,0 a 566,0 µmol L-1, na presença de 10,0 nmol L-1 de DA e 10,0 µmol L-1 de
AU, é apresentado na FIGURA 18 (a). As correntes de pico anódicas obtidas nestes
voltamogramas aumentam linearmente com o aumento da concentração de AA (FIGURA 18
(b)), com r = 0,999, o que demonstra que a presença de DA e de AU também não afeta a
resposta eletroquímica do sensor para a oxidação de AA, assim como foi verificado na análise
anterior. Observa-se, também, que não ocorre alteração significativa nas correntes de pico
anódicas da DA e do AU, ou seja, que o aumento da concentração de AA não interfere na
resposta do sensor para estes analitos.
49
50
(a)
DA
40
AU
30
I/ A
AA
20
10
0
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
E/ V vs. Ag/AgCl
16
(b) r = 0,999 (n= 4)
Ipa/ A
14
12
10
8
6
300
400
[AA]/ mol L
500
600
-1
FIGURA 18 – (a) Voltamogramas de pulso diferencial e (b) gráfico Ipa vs. [AA] para o sensor proposto em
solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0) contendo 10,0 nmol L-1 DA e 10,0 µmol L-1 AU e diferentes
concentrações de AA: 291,0, 385,0, 476,0 e 566,0 µmol L-1. v = 0,03 V s-1; Ap = 0,03 V.
50
Por fim, a FIGURA 19 (a) apresenta os voltamogramas de pulso diferencial obtidos
para a variação da concentração de AU na faixa de 10,0 a 30,0 µmol L-1, na presença de 1,0
mmol L-1 de AA e 10,0 nmol L-1 de DA. Na FIGURA 19 (b) é possível observar uma
correlação linear entre as correntes de pico anódicas e a concentração de AU, com r = 0,996,
o que também demonstra que a presença de AA e DA não afeta a resposta eletroquímica do
sensor para a oxidação de AU. Adicionalmente, verifica-se que nenhuma alteração
significativa ocorre nas correntes de pico anódica do AA e da DA, mostrando que o aumento
da concentração de AU não interfere na resposta do sensor para estes analitos.
51
120
AU
(a)
100
80
I/  A
DA
60
AA
40
20
0
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
E/ V vs. Ag/AgCl
120
(b) r = 0,996 (n= 5)
100
Ipa/ A
80
60
40
20
10
15
20
[AU]/ mol L
25
30
-1
FIGURA 19 – (a) Voltamogramas de pulso diferencial e (b) gráfico Ipa vs. [AU] para o sensor proposto em
solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,0) contendo 1,0 mmol L-1 AA, 10,0 nmol L-1 DA e diferentes
concentrações de AU: 10,0, 15,0, 20,0, 25,0 e 30,0 µmol L-1. v = 0,03 V s-1; Ap = 0,03 V.
52
5.6 Otimização dos parâmetros experimentais e operacionais do sistema eletroquímico
5.6.1 Parâmetros experimentais
5.6.1.1 Influência do pH, da solução tampão e da concentração da solução tampão sobre
a corrente de pico de oxidação da dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico empregando
a técnica de VPD
A influência do pH da solução na oxidação eletroquímica simultânea de DA, AA e AU
foi investigada por VPD utilizando-se soluções 0,1 mol L-1 de tampão fosfato contendo 10,0
nmol L-1 de DA, 1,0 mmol L-1 de AA e 10,0 µmol L-1 de AU no intervalo de pH entre 6,0 e
8,5 (FIGURA 20).
A partir dos resultados obtidos, observa-se que a corrente de pico anódica da oxidação
de DA não sofre grandes variações com o aumento do pH na faixa estudada, sendo a maior
corrente anódica obtida com o pH de 7,5. Por outro lado, para a oxidação do AA, verifica-se
que a corrente de pico anódica se mantem praticamente constante na faixa de pH entre 6,0 e
7,5, sendo que para valores maiores que estes a corrente decai. Quanto ao AU, observa-se que
o aumento do pH provoca uma diminuição da corrente de pico anódica.
Analisando os resultados simultaneamente e considerando que o presente trabalho tem
por objetivo a aplicação direta do sensor em amostras biológicas, as quais apresentam pH
próximo a 7,4 (VOLIANITIS et al., 2010), o pH igual a 7,5 foi então o escolhido para os
demais estudos.
Vale ressaltar que os desvios padrão relativos das medidas foram menores que 5%.
53
120
100
80
AU
Ipa/ A
60
40
20
DA
AA
0
-20
-40
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
pH
FIGURA 20 – Influência do pH sobre a resposta do sensor imerso em solução contendo 10,0 nmol L-1 de DA,
1,0 mmol L-1 de AA e 10,0 µmol L-1 de AU. Medidas conduzidas em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato. v =
0,03 V s-1; Ap = 0,03 V.
Para se avaliar qual solução tampão proporciona a melhor resposta do sensor para a
oxidação simultânea de DA, AA e AU, soluções tampão fosfato, Tris e Hepes foram estudas e
os resultados são mostrados na TABELA 1. Observa-se que as maiores correntes de pico
anódicas foram obtidas com o uso da solução tampão fosfato, sendo, portanto, a escolhida
para os experimentos subsequentes. Este resultado pode estar associado à maior mobilidade
iônica dos íons fosfato decorrente do pequeno tamanho que apresentam, o que possibilita uma
maior difusão do analito em solução e uma maior transferência de carga entre o eletrodo e a
solução, resultando, assim, em maiores valores de correntes de pico.
54
TABELA 1 – Influência de diferentes soluções tampão de concentração 0,1 mol L-1 (pH 7,5) sobre as correntes
de pico anódicas (Ipa) referentes à oxidação de DA, AA e AU obtidas em concentrações de 10,0 nmol L-1, 1,0
mmol L-1 e 10,0 µmol L-1, respectivamente. v = 0,03 V s-1; Ap = 0,03 V.
Solução tampão
Composição
Ipa (µA) DA
Ipa (µA) AA
Ipa (µA) AU
Fosfato
Na2HPO4
40,05 (± 1,05)
20,02 (± 0,19)
29,99 (± 0,80)
Tris
C4H11NO3
10,41 (± 1,39)
5,95 (± 0,34)
6,31 (± 0,73)
Hepes
C8H8N2O4S
22,79 (± 0,51)
6,67 (± 0,11)
4,68 (± 0,07)
A fim de se verificar qual concentração da solução tampão fosfato proporciona a
melhor resposta do sensor proposto, diferentes concentrações do mesmo foram estudadas: na
faixa de 0,025 e 0,150 mol L-1. Através dos resultados obtidos (TABELA 2), observa-se que a
concentração da solução tampão fosfato que forneceu as melhores correntes de pico,
simultaneamente, foi a de 0,1 mol L-1. Sendo assim, este valor foi o escolhido para os
experimentos subsequentes.
TABELA 2 – Influência da concentração da solução tampão fosfato (pH 7,5) sobre as correntes de pico anódicas
(Ipa) referentes à oxidação de DA, AA e AU obtidas em concentrações de 10,0 nmol L-1, 1,0 mmol L-1 e 10,0
µmol L-1, respectivamente. v = 0,03 V s-1; Ap = 0,03 V.
[Solução tampão] (mol L-1)
Ipa (µA) DA
Ipa (µA) AA
Ipa (µA) AU
0,025
43,55 (± 0,52)
7,53 (± 0,21)
19,32 (± 0,20)
0,050
43,91 (± 0,30)
13,70 (± 0,10)
18,95 (± 0,35)
0,100
39,98 (± 0,51)
19,95 (± 1,79)
30,01 (± 0,80)
0,150
21,06 (± 0,35)
14,48 (± 0,24)
14,71 (± 0,82)
5.6.2 Parâmetros operacionais
5.6.2.1 Voltametria de pulso diferencial
Na voltametria de pulso diferencial, pulsos de igual amplitude são aplicados sobre
uma rampa linear de potencial, sendo a corrente medida antes de o pulso ser aplicado e ao
final do mesmo. Estas correntes são então subtraídas, uma vez que a primeira apresenta a
contribuição da corrente capacitiva e a segunda que é, fundamentalmente, a contribuição da
corrente faradaica, e são plotadas contra o potencial da rampa linear gerando um
voltamograma de pulso diferencial que apresenta a forma de uma curva gaussiana (SOUZA et
al., 2003).
55
Nesta técnica, o efeito da velocidade de varredura (v) e da amplitude de pulso (Ap) são
parâmetros muito importantes uma vez que podem influenciar diretamente na sensibilidade e
na seletividade do sistema. Neste sentido, com o intuito de se determinar qual o valor de v
proporciona a melhor resposta do sistema para a detecção simultânea de DA, AA e AU, o
mesmo foi variado no intervalo de 0,03 a 0,08 V s-1 mantendo-se Ap constante e igual a 0,025
V. Os experimentos foram conduzidos empregando-se uma solução 0,1 mol L-1 de tampão
fosfato (pH 7,5) contendo 10,0 nmol L-1 de DA, 1,0 mmol L-1 de AA e 10,0 µmol L-1 de AU,
obtendo-se voltamogramas a partir dos quais construiu-se o gráfico que relaciona a razão
entre a corrente de pico anódica (Ipa) e a largura de pico a meia altura (w1/2) com a velocidade
de varredura (FIGURA 21).
É possível observar que, para a DA, não houve variações significativas na razão Ipa/
w1/2. Para o AU, observa-se que esta permanece praticamente constante nas velocidades entre
0,03 e 0,05 V s-1 e entre 0,07 a 0,08 V s-1, sendo a maior resposta obtida na velocidade de 0,06
V s-1. E, para o AA, a razão Ipa/ w1/2 permanece praticamente constante nas velocidades entre
0,03 e 0,07 V s-1. Neste sentido, considerando de forma simultânea os resultados, observa-se
que não houve variações significativas da resposta do sensor com o aumento da velocidade de
varredura para todos os analitos estudados. Sendo assim, a velocidade de 0,06 V s-1 foi
selecionada para os estudos subsequentes.
56
180
150
DA
Ipa/ w1/2
120
90
AU
60
AA
30
0
0,03
0,04
0,05
0,06
v/ V s
0,07
0,08
0,09
-1
FIGURA 21 – Influência da velocidade de varredura (v) sobre a resposta do sensor proposto para a
determinação simultânea de DA, AA e AU. Medidas conduzidas em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH
7,5) contendo 10,0 nmol L-1 de DA, 1,0 mmol L-1 de AA e 10,0 µmol L-1 de AU. Ap = 0,025 V.
Em seguida, para se determinar qual valor de amplitude de pulso é capaz de
proporcionar a melhor resposta para o sistema, a velocidade de varredura foi mantida em 0,06
V s-1 e a Ap foi variada no intervalo de 0,01 a 0,08 V. A partir dos voltamogramas obtidos,
construiu-se o gráfico da razão entre a corrente de pico anódica e a largura de pico a meia
altura versus a amplitude de pulso (FIGURA 22). Os resultados mostram que o valor de 0,05
V fornece o melhor valor da razão Ipa/ w1/2 para a DA e para o AU, porém, para o AA, os
maiores valores da razão Ipa/ w1/2. são observados entre 0,05 e 0,08 V. Sendo assim, o valor
escolhido para a análise simultânea dos três analitos foi de 0,05 V.
57
300
250
DA
Ipa/ w1/2
200
150
100
AA
AU
50
0
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
Ap/ V
FIGURA 22 – Influência da amplitude de pulso (Ap) sobre a resposta do sensor proposto para a determinação
simultânea de DA, AA e AU. Medidas conduzidas em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,5) contendo
10,0 nmol L-1 de DA, 1,0 mmol L-1 de AA e 10,0 µmol L-1 de AU. v = 0,06 V s-1.
5.7 Caracterização analítica do sensor para a determinação simultânea de dopamina,
ácido ascórbico e ácido úrico
Com o objetivo de se obter a curva analítica para a determinação simultânea de DA,
AA e AU sobre o EGPPB/NTCPM/NQ, voltamogramas de pulso diferencial foram obtidos
para diferentes concentrações de cada analito sob as condições experimentais e operacionais
otimizadas (FIGURA 23 (a)). As curvas analíticas obtidas a partir dos voltamogramas são
mostradas na FIGURA 23 (b). Observa-se que o EGPPB/NTCPM/NQ apresentou resposta
linear para a DA no intervalo de concentração de 10,0 a 70,0 nmol L-1, com coeficiente de
correlação (r) igual a 0,996 (n= 7). A expressão matemática que define esta curva pode ser
escrita como se segue:
Ipa (µA) = 0,818 (± 0,127) + 653,180 (± 27,447) [DA] (µmol L-1)
Segundo recomendações da IUPAC (CURRIE, 1995), os limites de detecção (LOD) e
de quantificação (LOQ) podem ser calculados através dos parâmetros da curva analítica, em
58
que LOD equivale a 3,3 s/b e LOQ a 10 s/b, onde s representa o desvio padrão para dez
voltamogramas do branco e b o coeficiente angular da curva analítica. Portanto, sendo s igual
a 24,937 nA, os valores de LOD e LOQ para a DA são 0,126 e 0,381 nmol L-1,
respectivamente.
A oxidação do AA sobre o EGPPB/NTCPM/NQ apresentou uma faixa linear de
resposta no intervalo de 40,0 a 280,0 µmol L-1, com r igual a 0,996 (n= 7). A curva analítica
para o AA pode ser expressa de acordo com a equação a seguir:
Ipa (µA) = – 2,437 (± 0,489) + 0,076 (± 0,003) [AA] (µmol L-1)
A partir de um desvio padrão de dez voltamogramas do branco (49,201 nA), os LOD e
LOQ são determinados e iguais a 2,136 e 6,475 µmol L-1, respectivamente.
Para o AU, o sensor apresentou uma faixa linear de resposta num intervalo de
concentração de 2,0 a 14,0 µmol L-1, com r igual a 0,991 (n= 7). A expressão matemática que
define a curva analítica é apresentada a seguir:
Ipa (µA) = 2,220 (± 1,930) + 9,888 (± 0,600) [AU] (µmol L-1)
Sendo o desvio padrão para dez voltamogramas do branco igual a 52,974 nA, obtémse um LOD e um LOQ para o AU iguais a 0,018 e 0,053 µmol L-1, respectivamente.
Contudo, verifica-se que o sensor proposto apresenta elevada sensibilidade e baixos
limites de detecção para DA, AA e AU quando comparado com outros trabalhos descritos na
literatura (TABELA 3). A alta sensibilidade apresentada pelo EGPPB/NTCPM/NQ pode ser
atribuída à eficiência de transferência eletrônica entre o compósito NTCPM/NQ e os analitos
bem como ao efeito catalítico promovido pelo compósito na superfície do eletrodo sobre a
resposta dos analitos.
59
140
(a)
AU
120
100
I/  A
80
DA
60
40
AA
20
0
-20
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
E/ V vs. Ag/AgCl
50
21
(c)
(b)
18
40
15
30
Ipa/ A
Ipa/ A
12
9
20
6
10
3
0
0
40
80
120
160
200
[AA] mol L
240
280
0
320
0
10
20
30
-1
40
50
[DA] nmol L
60
70
80
-1
140
(d)
120
100
Ipa/ A
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
[AU] mol L
10
12
14
16
-1
FIGURA 23 – (a) Voltamogramas de pulso diferencial para a oxidação simultânea de AA, DA e AU nas
seguintes concentrações: AA: (1) 40,0, (2) 80,0, (3) 120,0, (4) 160,0, (5) 200,0, (6) 240,0 e (7) 280,0 µmol L-1;
DA: (1) 10,0, (2) 20,0, (3) 30,0, (4) 40,0, (5) 50,0, (6) 60,0 e (7) 70,0 nmol L -1; AU: (1) 2,0, (2) 4,0, (3) 6,0, (4)
8,0, (5) 10,0, (6) 12,0 e (7) 14,0 µmol L-1. Medidas conduzidas em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH
7,5); Curva analítica obtida a partir dos voltamogramas de pulso diferencial (FIGURA 23 (a)) para (b) AA, (c)
DA e (d) AU. v = 0,60 V s-1; Ap = 0,50 V.
60
TABELA 3 – Parâmetros eletroanalíticos obtidos para a determinação simultânea de DA, AA e AU utilizando diferentes eletrodos.
LOD (µmol L-1)
Eoxi (V)
Faixa Linear (µmol L-1)
Sensibilidade (µA/ µmol L-1)
Referências
AA
DA
UA
AA
DA
UA
AA
DA
UA
AA
DA
UA
– 0,021
0,201
0,339
13,00
0,11
1,40
25,0 - 500,0
1,0 - 20,0
2,5 - 30,0
0,061
9,500
7,700
Da Silva et al., 2008.
0,017
0,350
0,500
0,17
0,03
0,11
0,5 - 1300,0
0,05 - 470
0,2 - 100,0
0,006
0,080
0,100
Ensafi et al., 2010.
0,158
0,402
0,550
15,00
0,20
0,70
50,0 - 4000,0
0,5 - 160,0
2,0 - 200,0
-
-
-
Huang et al., 2008.
– 0,074
0,094
0,181
8,30
1,70
3,70
100,0 - 1600,0
6,0 - 100,0
22,0 - 350,0
0,021
0,4828
0,120
Arguello et al., 2008.
0,095
0,288
0,454
10,00
0,50
0,50
50,0 - 1000,0
1,0 - 200,0
1,0 - 120,0
0,0137
0,1234
0,131
Zhang et al., 2009.
0,064
0,227
0,354
-
-
-
197,0 - 988,0
1,97 - 9,88
19,7 - 98,8
0,00008
3,1575
0,008
Thiagarajan et al., 2009.
0,060
0,270
0,410
-
-
-
30,0 - 240,0
5,0 - 40,0
10,0 - 80,0
-
-
-
Kalimuthu e John, 2009.
0,092
0,297
0,458
7,71
0,31
0,42
15,0 - 800,0
0,5 - 100,0
0,55 - 90,00
0,041
1,492
0,340
Habibi et al., 2010.
0,130
0,224
0,376
5,00
0,06
0,02
30,0 - 400,0
0,2 - 3,8
0,06 - 10,00
0,020
3,490
5,950
Zhu et al., 2009.
– 0,035
0,130
0,225
1,30
0,02
0,40
65,0 - 2000,0
0,22 - 7,00
12,5 - 400,0
0,002
0,147
0,007
Zare et al., 2007.
-
-
-
10,00
0,02
1,00
150,0 - 1000,0
0,1 - 200,0
1,0 - 130,0
0,017
1,073
0,091
Yao et al., 2007.
0,200
0,350
0,540
103,00
24,00
21,00
103,0 - 165,0
24,0 - 384,0
21,0 - 336,0
0,008
0,050
0,015
Thiagarajan; Chen, 2007.
– 0,050
0,145
0,270
2,136
0,00013
0,018
40,0 - 280,0
0,01 - 0,07
2,0 - 14,0
0,076
653,180
9,888
Este trabalho.
61
5.8 Avaliação da repetibilidade de medidas e da reprodutibilidade do preparo do sensor
Para se avaliar a precisão do método proposto, sete medidas sucessivas do
EGPPB/NTCPM/NQ foram realizadas por VPD em solução 0,1 mol L-1 de tampão fosfato
(pH 7,5) contendo 50,0 nmol L-1 de DA, 100,0 µmol L-1 de AA e 20,0 µmol L-1 de AU. A
TABELA 4 apresenta os desvios padrão relativos (DPR) referentes às correntes de pico
anódicas obtidas em cada medida para cada analito.
TABELA 4 – Avaliação da repetibilidade de medidas obtidas com o EGPPB/NTCPM/NQ imerso em solução
0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,5) contendo 50,0 µmol L-1 de DA, 100,0 µmol L-1 de AA e 20,0 µmol L-1 de
AU. v = 0,60 V s-1; Ap = 0,50 V.
Medida
Ipa (µA)
DA
1
2
3
4
5
6
7
33,49
33,48
33,61
33,56
33,68
33,81
33,79
Média das Medidas
33,62
Ipa (µA)
AA
3,83
3,85
3,86
DPR
0,13%
3,86
3,86
Média das Medidas
3,85
Ipa (µA)
AU
138,43
136,23
135,62
Média das Medidas
133,90
3,85
3,85
DPR
0,01%
133,42
132,08
131,44
130,09
DPR
2,97%
Adicionalmente, oito sensores foram preparados da mesma maneira e em dias
diferentes para se avaliar a reprodutibilidade do preparo dos mesmos. Voltamogramas de
pulso diferencial foram então obtidos para cada sensor em solução 0,1 mol L-1 de tampão
fosfato (pH 7,5) contendo 50,0 µmol L-1 de DA, 100,0 µmol L-1 de AA e 20,0 µmol L-1 de
AU. Os DPR para as intensidades das correntes de pico anódicas são apresentados na
TABELA 5 e também foram utilizados como parâmetro para avaliar a precisão do método
analítico desenvolvido.
62
TABELA 5 – Avaliação da reprodutibilidade do preparo do EGPPB/NTCPM/NQ. Medidas obtidas em solução
0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,5) contendo 50,0 nmol L-1 de DA, 100,0 µmol L-1 de AA e 20,0 µmol L-1 de
AU. v = 0,60 V s-1; Ap = 0,50 V.
Sensor
Ipa (µA)
DA
Ipa (µA)
AA
Ipa (µA)
AU
1
2
3
4
5
6
7
8
Média
DPR
34,76
33,70
32,28
33,76
32,80
35,58
31,84
29,52
32,66
4,83%
4,27
4,20
4,50
4,60
4,46
4,26
4,04
4,39
4,34
4,18%
142,74
141,84
140,36
141,44
140,31
141,98
142,16
148,63
142,43
1,86%
A partir dos experimentos realizados e dos pequenos valores de DPR encontrados,
verifica-se que os eletrodos modificados com o compósito NTCPM/NQ apresentaram boa
repetibilidade de medidas e boa reprodutibilidade do preparo do sensor. Tais resultados
podem estar relacionados à habilidade que os NTCPM apresentam em fixar moléculas de NQ
sobre a superfície do eletrodo, indicando, portanto, que o método proposto apresenta elevada
precisão.
5.9 Avaliação do tempo de vida útil do sensor
O tempo de vida útil do sensor foi avaliado por um período de trinta dias a partir de
medidas da intensidade das correntes de pico anódicas dos voltamogramas de pulso
diferencial obtidos em soluções 0,1 mol L-1 de tampão fosfato (pH 7,5) contendo 50,0 nmol L1
de DA, 100,0 µmol L-1 de AA e 20,0 µmol L-1 de AU.
O valor da resposta analítica encontrado inicialmente para cada analito foi considerado
como 100,00% e os demais valores, correspondentes aos dias subsequentes, foram calculados
como porcentagem deste valor inicial (FIGURA 24). Verifica-se, através dos resultados, que
as porcentagens de resposta obtida com o sensor proposto permaneceram entre 95,00 e
103,00%, 98,00 e 102,00% e 99,00 e 101,00% para AA, DA e AU, respectivamente, o que
caracteriza o sensor desenvolvido como estável durante o período avaliado.
O sensor permaneceu armazenado à temperatura ambiente durante o período de
avaliação.
63
Resposta Analítica / %
110
AA
DA
100
AU
90
80
0
7 dias
15 dias
30 dias
FIGURA 24 – Tempo de vida útil do EGPPB/NTCPM/NQ. Respostas analíticas obtidas em solução 0,1 mol L-1
de tampão fosfato (pH 7,5) contendo 50 nmol L-1 de DA, 100 µmol L-1 de AA e 20 µmol L-1 de AU. v = 0,60 V
s-1; Ap = 0,50 V.
5.10 Determinação simultânea de dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico em amostras
de urina humana empregando o EGPPB/NTCPM/NQ
Com a finalidade de se verificar o efeito da matriz biológica sobre a resposta do sensor
desenvolvido, três amostras de urina humana foram analisadas (em triplicata) para determinar
simultaneamente DA, AA e AU. Para tanto, verificou-se que mesmo utilizando-se 100,0 µL
de amostra para 10,0 mL de eletrólito, obteve-se uma intensa corrente de oxidação para o AU,
dificultando a análise simultânea dos três analitos. Com isso, novas soluções foram
preparadas a partir da adição de 10,0 µL da amostra para 10,0 mL de eletrólito. Entretanto, a
nova diluição resultou em um pequeno sinal analítico para DA e AA, o que também dificultou
a análise simultânea dos mesmos. Por isso, determinou-se, inicialmente, apenas a
concentração de AU presente nas amostras e, em seguida, as mesmas foram enriquecidas com
10,0 µmol L-1 de DA e 160,0 µmol L-1 de AA, o que tornou possível a análise simultânea dos
mesmos através do método de adição padrão. Os resultados obtidos são apresentados na
TABELA 6.
64
TABELA 6 – Avaliação da seletividade do sensor proposto em relação a possíveis interferentes encontrados na
matriz de urina humana.
Amostras
AU*
AU
AU**
DPR entre a quantidade
quantificado
fortificado
encontrado
de AU quantificada e
na amostra
na amostra
(µmol L-1)
encontrada (%)
(µmol L-1)
(µmol L-1)
1
6,84
7,43 (± 0,23)
5,84
2
13,79
14,53 (± 0,32)
3,69
3
7,93
8,68(± 0,21)
6,38
Amostras
DA
DA
DA
DPR entre a quantidade
quantificada
fortificada
encontrada
de DA adicionada e
na amostra
na amostra
(nmol L-1)
encontrada (%)
(nmol L-1)
(nmol L-1)
1
10,00
10,23 (± 0,21)
1,61
2
10,00
10,64 (± 0,23)
4,38
3
10,00
10,62 (± 0,19)
4,25
Amostras
AA
AA
AA
DPR entre a quantidade
quantificado
fortificado
encontrado
de AA adicionada e
na amostra
na amostra
(µmol L-1)
encontrada (%)
(µmol L-1)
(µmol L-1)
1
160,00
155,95 (± 0,25)
1,81
2
160,00
162,69 (± 0,18)
1,18
3
160,00
158,33 (± 0,14)
0,74
*Determinados na ausência de DA e de AA; **Determinados na mistura ternária.
Conforme os resultados observados na TABELA 6, verifica-se que os desvios padrão
relativos entre a concentração do AU encontrado nas amostras na ausência de DA e AA e a
concentração de AU encontrada na presença dos mesmos (adicionados às amostras) foram
inferiores a 6,40%, sugerindo que a matriz biológica não apresenta efeito significativo na
resposta do sensor. O mesmo foi verificado para a DA e o AA, nos quais os desvios padrão
relativos entre a quantidade do analito adicionada e a quantidade do analito encontradas foram
inferiores a 4,40% e 1,90%, respectivamente, sugerindo, também, um mínimo efeito da matriz
sobre a resposta do sensor.
5.11 Testes de adição e recuperação
Para checar a exatidão da metodologia desenvolvida, experimentos de adição e
recuperação foram realizados através da adição de três quantidades conhecidas dos analitos às
amostras (TABELA 7). A porcentagem de recuperação foi dada pela razão entre a
concentração de DA, AA e AU encontrada (mistura ternária + padrões adicionados) e a
concentração esperada multiplicando-se por 100. Os testes de adição e recuperação foram
realizados em triplicata para maior confiabilidade dos resultados.
65
Observa-se, através dos resultados apresentados na TABELA 7, que o sensor permitiu
uma boa recuperação tanto para DA, AA e AU, com valores de recuperação compreendidos
entre 95,14% e 101,49% para DA, 96,10% e 103,47% para AA e 97,90% e 102,32% para AU,
atestando, portanto, a exatidão do método proposto.
Adicionalmente, observa-se que todas as amostras analisadas apresentaram baixos
desvios padrão para as medidas, mostrando, assim, uma boa repetibilidade do sensor para as
replicatas.
TABELA 7 – Resultados dos testes de adição e recuperação utilizando o método proposto para três amostras
contendo DA, AA e AU (n = 3).
Amostras
[DA]
adicionada
Recup.
[AA]
(%)
adicionada
-1
A
15,00
30,00
B
30,00
45,00
C
45,00
[AU]
(%)
adicionada
-1
(nmol L )
15,00
Recup.
(± 3,74)
97,63
(± 1,80)
98,54
(± 0,48)
96,03
(± 0,65)
95,14
(± 0,57)
97,27
(± 1,34)
60,00
60,00
100,00
100,00
160,00
160,00
(%)
-1
(µmol L )
101,49
Recup.
(µmol L )
100,63
(± 2,04)
97,47
(± 0,26)
97,09
(± 0,16)
96,10
(± 0,002)
101,26
(± 1,06)
103,47
(± 0,74)
4,00
4,00
7,00
7,00
10,00
10,00
100,62
(± 1,74)
101,39
(± 0,90)
100,83
(± 1,14)
100,09
(± 0,49)
102,32
(± 0,58)
97,90
(± 0,77)
5.12 Validação do sensor proposto e considerações finais sobre o EGPPB/NTCPM/NQ
Conforme recomendado pela USP 31/NF 26 (2008), a validação da metodologia
desenvolvida foi realizada baseada nas seguintes figuras de mérito: exatidão, precisão,
seletividade, limite de detecção, limite de quantificação e linearidade, conforme pode ser
observado na TABELA 8.
A exatidão do sensor proposto foi atestada pelos satisfatórios resultados dos estudos de
adição e recuperação dos analitos obtidos em todas as amostras analisadas. A precisão foi
considerada satisfatória após a verificação da repetibilidade de medidas e da reprodutibilidade
do preparo do sensor. Os desvios padrão relativos entre as correntes de pico encontrados em
66
ambos os testes foram inferiores a 5%, sendo este o valor máximo recomendado pela
Resolução no 899 da ANVISA (2003). A aplicação do sensor nas amostras biológicas
comprovou que as substâncias normalmente presentes em urina humana não interferem na
determinação de DA, AA e AU, bem como foi observado que o sensor proposto proporcionou
grande separação entre as respostas dos analitos, o que o caracteriza como altamente seletivo.
Os valores de LOD, LOQ, sensibilidade e linearidade encontrados para o sensor proposto
foram considerados satisfatórios para a determinação simultânea de DA, AA e AU.
Estes resultados comprovam que o sensor proposto foi validado e, portanto, é
adequado para a determinação simultânea seletiva e quantitativa de DA, AA e AU.
TABELA 8 – Figuras de mérito determinadas na validação do sensor proposto.
Figura de
mérito
Exatidão
Precisão
Seletividade
LOD
LOQ
Linearidade
Teste realizado
Adição e
recuperação
Repetibilidade
de medidas
Reprodutibilidade
do sensor
Estudo de
interferentes
-
DA
Resultados
AA
AU
Satisfatório
Satisfatório
Satisfatório
DPR = 0,13%
DPR = 0,01%
DPR = 2,97%
DPR = 4,83%
DPR = 4,18%
DPR = 1,86%
Satisfatório
Satisfatório
Satisfatório
-1
0,126 nmol L
0,381 nmol L-1
10,0 a 70,0 nmol L-1
-1
2,136 µmol L
6,475 µmol L-1
40,0 a 280,0 µmol L-1
0,018 µmol L-1
0,053 µmol L-1
2,0 a 14,0 µmol L-1
67
6 CONCLUSÕES
O presente trabalho demonstrou que o EGPPB/NTCPM/NQ é uma excelente
alternativa para a determinação simultânea de dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico em
amostras biológicas, tais como urina humana, através da técnica de voltametria de pulso
diferencial. A modificação da superfície do eletrodo efetuada no presente trabalho foi
realizada de forma simples e efetiva, proporcionando grande estabilidade ao sensor
desenvolvido.
O EGPPB/NTCPM/NQ foi capaz de separar as respostas voltamétricas dos analitos,
proporcionando uma considerável redução do sobrepotencial de oxidação do AA, bem como
significativos aumentos nas correntes de pico anódicas da DA e do AU. Estes resultados
podem ser atribuídos à baixa resistência à transferência de carga do compósito NTCPM/NQ,
bem como à boa habilidade que os NTCPM apresentam em dispersar e fixar moléculas, como
a NQ, na superfície de eletrodos. O emprego simultâneo dos NTCPM e da NQ é fundamental
para que a separação dos picos de oxidação dos analitos ocorra.
Imagens de MEV demonstraram que as moléculas de NQ estão bem distribuídas na
superfície dos NTCPM sem a formação de grandes agregados, confirmando o sucesso da
modificação destas nanoestruturas através de um processo físico de adsorção.
Estudos voltamétricos demostraram que o processo de oxidação da DA, AA e AU são
controlados por difusão, sendo o transporte de massa o fator limitante do processo.
A avaliação dos parâmetros analíticos do sensor desenvolvido mostrou que o mesmo
se apresenta como um ótimo dispositivo para a determinação simultânea de DA, AA e AU,
apresentando elevadas sensibilidades, baixos limites de detecção e de quantificação e grande
estabilidade. Os valores encontrados para cada um destes parâmetros foram melhores que os
encontrados em outros trabalhos descritos na literatura. A alta sensibilidade apresentada pelo
EGPPB/NTCPM/NQ pode ser atribuída à eficiência de transferência eletrônica entre o
compósito NTCPM/NQ e os analitos, bem como ao efeito catalítico promovido pelo mesmo
compósito para a oxidação de DA, AA e AU.
Os pequenos valores de desvio padrão relativo encontrados na avaliação da
repetibilidade de medidas e da reprodutibilidade do preparo do sensor podem estar
relacionados à habilidade dos NTCPM em fixar as moléculas de NQ e à simplicidade da
modificação do eletrodo, indicando, assim, que o método proposto apresenta elevada precisão.
O método desenvolvido foi considerado exato uma vez que apresentou ótimos
resultados nos estudos de adição e recuperação dos analitos nas amostras analisadas.
68
Os resultados do estudo da variação da concentração de um analito na presença dos
demais comprovaram que as respostas eletroquímicas dos mesmos não são afetadas quando
presentes em uma mistura ternária. Além disso, o estudo do efeito da matriz sobre a resposta
do EGPPB/NTCPM/NQ para a determinação simultânea dos analitos em amostras de urina
humana demonstrou que a matriz biológica não interfere na resposta do sensor. Sendo assim,
o método proposto foi caracterizado como seletivo, podendo, portanto, ser aplicado tanto para
a determinação simultânea quanto individual de DA, AA e AU.
Através da avaliação das figuras de mérito, a metodologia desenvolvida foi
classificada como validada e caracterizada como de baixo custo, fácil execução, rápida, exata,
precisa, sensível e linear para a determinação simultânea de dopamina, ácido ascórbico e
ácido úrico. Além disso, existe a grande possibilidade de miniaturização do sistema para a
aplicação em amostras reais.
69
PERSPECTIVAS FUTURAS
Como perspectiva futura, propõe-se a determinação de dopamina, ácido ascórbico e
ácido úrico em amostras de urina humana, coletadas nas mesmas condições, empregando o
método proposto e um método comparativo.
Propõem-se, também, o emprego do sensor desenvolvido para a determinação de DA,
AA e AU em amostras de sangue.
70
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADAMS, R. N. Probing brain chemistry with electroanalytical. Analytical Chemistry, vol.
48, p. 1126A-1138A, 1976.
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83
ANEXO A
35
(a)
30
25
Ipa/ A
20
15
10
5
0
-5
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,3
0,4
0,5
0,3
0,4
0,5
E/ V vs. Ag/AgCl
1,0
(b)
0,8
Ipa/ A
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
E/ V vs. Ag/AgCl
0,8
(c)
0,6
Ipa/ A
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
E/ V vs. Ag/AgCl
Figura 1 – Voltamogramas cíclicos referentes ao EGPPB não modificado em solução 0,1 mol L-1 de tampão
fosfato (pH 7,0) na presença de (a) 1,0 mmol L-1 de AA, (b) 10,0 µmol L-1 de DA e (c) 10,0 µmol L-1 de AU. V
= 0,03 v s-1.