Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Ciências Médicas
Curso de Pós Graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental
Mestrado
DETECÇÃO E TIPAGEM DE PAPILOMAVIRUS
HUMANO EM GESTANTES SOROPOSITIVAS E
SORONEGATIVAS PARA HIV-1
Daniele Costa Abreu
Rio de Janeiro
2004
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Ciências Médicas
Curso de Pós Graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental
Mestrado
DETECÇÃO E TIPAGEM DE PAPILOMAVÍRUS
HUMANO EM GESTANTES SOROPOSITIVAS E
SORONEGATIVAS PARA HIV-1
Daniele Costa Abreu
Rio de Janeiro
2004
i
Ficha Catalográfica
Ficha Catalográfica
Nome: Abreu, Daniele Costa
Detecção e tipagem de papilimavírus humano em gestantes
soropositivas e soronegativas para hiv-1
xi 65p 19 ilustrações
Orientador: José Pascoal Simonetti
Co-Orientador: Dirce Bonfim de Lima
Dissertação (mestrado): UERJ, Centro Biomédico, Faculdade de
Ciências Médicas.
Palavras Chaves: 1- HPV, 2-gestante, 3- HIV, 4- PCR, 5Seqüenciamento. I- José Pascoal Simonetti, II- UERJ, III- Centro
Biomédico – Faculdade de Ciências Médicas
Estudo da detecção e tipagem de papilomavírus humano em gestantes
soropositivas e soronegativas para hiv-1
ii
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Ciências Médicas
Curso de Pós Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental
Mestrado
DETECÇÃO E TIPAGEM DE PAPILOMAVÍRUS
HUMANO EM GESTANTES SOROPOSITIVAS E
SORONEGATIVAS PARA HIV-1
Daniele Costa Abreu
Dissertação apresentada à Pós
Graduação em Fisiopatologia Clínica
e Experimental da Universidade do
Estado do Rio de Janeiro como parte
dos requisitos para obtenção do grau
de Mestre em Fisiopatologia Clínica e
Experimental.
Rio de Janeiro
2004
iii
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Ciências Médicas
Curso de Pós Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental
Mestrado
DETECÇÃO E TIPAGEM DE PAPILOMAVÍRUS
HUMANO EM GESTANTES SOROPOSITIVAS E
SORONEGATIVAS PARA HIV-1
Autor: Daniele Costa Abreu
Orientador: José Pascoal Simonetti
Co-Orientador: Dirce Bonfim de Lima
Banca Examinadora:
Profº Dr. Amadeu Ramos da Silva Filho - UERJ
Profº Dr. Mauro Velho - UERJ
Profª Drª Izabel C. P. P. Frugulhetti - UFF
iv
LISTA DE QUADROS, GRÁFICOS E TABELAS
DESCRIÇÃO
PÁGINA
Quadro 1 - Classificação dos Papilomavírus
04
Gráfico 1 – Relação das amostras soropositivas para HIV-1 e
36
soronegativas para HIV-1 e presença de DNA HPV
Gráfico 2 – Análise da infecção produtiva e infecção latente por
37
papilomavírus nas amostras reativas para DNA HPV
Gráfico 3 – Distribuição dos tipos detectados quanto ao risco
47
atribuído: baixo risco, alto risco e risco desconhecido
Tabela 1 – Resultado das análises referentes ao PCR DNA HPV,
40
seqüenciamento de DNA e indicação clínica das amostras procedentes
do IFF
Tabela 2 – Resultado das análises referentes ao PCR DNA HPV,
42
seqüenciamento de DNA e indicação clínica das amostras procedentes
do HUGG
Tabela 3 – Resultado das análises referentes ao PCR DNA HPV,
44
seqüenciamento de DNA e indicação clínica das amostras procedentes
do HUPE
Tabela 4 – Os diferentes tipos de HPV de alto risco detectados e as
45
respectivas amostras onde estes foram detectados
Tabela 5 - Os diferentes tipos de HPV de baixo risco detectados e as
46
respectivas amostras onde estes foram detectados
Tabela 6 - Os diferentes tipos de HPV de risco desconhecido
46
detectados e as respectivas amostras onde estes foram detectados
Tabela 7 – Tabela de contingência 2x2 representativa com os dados
48
obtidos e utilizados para análise por teste de associação Qui Quadrado
com correção de Yates
v
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
DESCRIÇÃO
Figura 1 – Microscopia eletrônica da partícula do Papilomavirus
PÁGINA
05
Humano
Figura 2 – Estrutura genômica do HPV
05
Figura 3 – Infecção e replicação do Papilomavírus Humano nas células
11
epiteliais cervicais
Figura 4 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para β-
29
globina
Figura 5 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
30
DNA HPV das amostras procedentes do HUPE: HUPE 01 a HUPE 07
Figura 6 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
30
DNA HPV das amostras procedentes do HUPE: HUPE 08 a HUPE 23
Figura 7 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
31
DNA HPV das amostras procedentes do HUPE: HUPE 24 a HUPE 37
Figura 8 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
31
DNA HPV das amostras procedentes do HUPE: HUPE 38 a HUPE 50
Figura 9 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
32
DNA HPV das amostras procedentes do HUPE: HUPE 31 a HUPE 74
Figura 10 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
32
DNA HPV das amostras procedentes do HUPE: HUPE 75 a HUPE 100
Figura 11 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
33
vi
DNA HPV das amostras procedentes do HUGG: HUGG 01 a HUGG 21
Figura 12 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
33
DNA HPV das amostras procedentes do HUGG: HUGG 22 a HUGG 33
Figura 13 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
34
DNA HPV das amostras procedentes do HUGG: HUGG 34 a HUGG 48
Figura 14 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
34
DNA HPV das amostras procedentes do HUGG: HUGG 49 a HUGG 51 e
IFF 31
Figura 15 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
35
DNA HPV das amostras procedentes do HUGG: HUGG 56 a HUGG 72
Figura 16 – Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para
35
DNA HPV das amostras procedentes do IFF: IFF 01 a IFF 18
Figura 17 – Gel de agarose 2% demosntrando o resultado de PCR para
36
DNA HPV das amostras procedentes do IFF: IFF 19 a IFF 30
Figura 18 – Exemplo do eletroferograma fornecido pelo seqüênciador
38
pós análise da amostra. Eletroferograma referente à amostra HUPE 85
Figura 19 – Representação da análise da seqüência obtida pelo
39
seqüenciador utilizando o GeneBank – BLAST. O resultado é referente
à análise da amostra HUPE
vii
SUMÁRIO
DESCRIÇÃO
PÁGINA
I- Introdução
01
I-1 Papilomavirus Humano (HPV)
01
I-1A Histórico
01
I-1B Transmissão
02
I-1C Variabilidade Genética e Tropismo Celular
03
I-1D Estrutura Viral
04
I-1E Replicação Viral
09
I-1F Infecção Latente e Infecção Produtiva
12
I-1G Diagnóstico por Biologia Molecular
13
I-1H Tratamento
15
I-1I Prevenção
17
I-2 HIV e HPV – Infecção mista
18
II- Objetivos
20
II-1 Objetivo Geral
20
II-2 Objetivos Específicos
20
III- Metodologia
21
III-1 Casuística
21
III-2 Papanicolau
21
III-3 Teste para HIV
22
III-4 Coleta de amostra
22
viii
III-5 Extração do DNA
23
III-6 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
23
III-6A PCR para o gene da β-globina humana
23
III-6B PCR para DNA HPV
24
III-7 Seqüenciamento de DNA
26
III-7A Seqüenciamento ciclíco
27
III-7B Purificação em coluna CentriSep
27
III-7C Análise dos resultados
27
IV- Resultados
IV-1 Análises estatísticas
28
47
V- Discussão
50
VI- Conclusão
58
VII- Referências Bibliográficas
60
ANEXOS
ix
Resumo
O Papilomavírus Humano (HPV) pertence à família Papovaviridae, subfamília
Papillomavirinae. É um vírus com 55nm de diâmetro, não envelopado, capsídeo
icosaédrico, possui genoma constituído de dupla fita de DNA circular com
aproximadamente 7.900 pares de nucleotídeos e se replica no núcleo da célula. Os
HPVs são espécie específicos e epiteliotrópicos, causam hiperproliferação localizada
manifestadas mais comumente como verrugas de pele ou como condiloma acuminado
em mucosa. Mais de 120 tipos diferentes têm sido identificados com base na
heterologia da seqüência de DNA. Aproximadamente 40 tipos infectam o trato genital
podendo ser dividos em tipos de alto risco, baixo risco e risco desconhecido. Neste
estudo foram analisadas 196 gestantes atendidas pelo serviço de Pré-Natal de três
hospitais públicos diferentes localizados na cidade do Rio de Janeiro, Brasil. Trinta e
oito amostras eram soropositivas para HIV-1 e 120 soronegativas para HIV-1. Uma
amostra de escovado cervical foi colhida de cada gestante durante o acompanhamento
pré-natal. O DNA HPV foi extraído e detectado por Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) usando um par de primers degenerados (MY11/09) que amplificam um
fragmento de 450 bp da região L1 do genoma viral. A identificação do tipo foi realizada
por seqüenciamento direto do DNA HPV em equipamento seqüenciador ABI Prism 310
Genetic Analyzer e 3.100 Avant Genetic Analyzer - Perkin Elmer CA. As seqüências
obtidas foram comparadas com outras seqüências disponíveis no GenBank utilizando
o servidor BLAST. Das 196 amostras analisadas, em 56 (28.6%) foi detectado o DNA
HPV por PCR, e dessas 56 amostras 18 eram soropositivas para HIV-1. Seis pacientes
apresentavam infecção clínica no momento da coleta do escovado cervical. O tipo de
HPV foi identificado em 38 (67.8%) das 56 amostras. Dezenove tipos diferentes de
HPV foram correlacionados com alto risco, 7 com baixo risco e 8 com risco
desconhecido.
x
Abstract
Human Papillomaviruses (HPV) belong to the Papovaviridae family, Papillomavirinae
subfamily, sharing properties that include no enveloped small size virions (55nm in
diameter), an icosahedral capsid, a double-stranded circular DNA genome (7.900
nucleotide pairs) and the nucleous as the replication site. The HPVs are strictly
species-specific and epitheliotropic. They cause localized hyper proliferations
manifested most commonly as skin warts or as mucosal condilomata. More than 120
types of HPV have been defined on the basis of DNA sequence heterology.
Approximately 40 types have been found in the genital tract. They can be stratified into
high, low or unknown risk types. In this study, 196 pregnant women, attended in the
Prenatal Care Service at three different general hospitals in Rio de Janeiro, Brasil were
analyzed. Thirty-eight were HIV-seropositive and 120 HIV-seronegative. Cervical
samples were obtained from each pregnant woman on her regular examination at the
service. The HPV DNA was extracted and was detected by Polymerase Chain Reaction
(PCR) using degenerate consensus primers MY11/09 which amplified a 450 bp
fragment from L1 genome region, followed by typing identification based on directed
sequencing (ABI Prism 310 Genetic Analyzer; 3.100 Avant Genetic Analyzer - Perkin
Elmer CA). Sequences obtained were compared to all of those available in the
GenBank using the BLAST server. Out of the 196 cervical samples, 56 (28.6%) had
HPV DNA detected by PCR and, from these, 18 were also HIV-seropositive. Only six
patients had clinical infection when they were recruited into this study. The type of HPV
was identified in 38 (67.8%) of the 56 samples. Nineteen different types were correlated
to the high risk type, seven were correlated to the low risk type and eight were
correlated to the unknown risk type.
xi
INTRODUÇÃO
I- Introdução
I-1 Papilomavirus Humano (HPV)
I-1A Histórico
A etiologia viral das verrugas de pele em humanos (papilomas) foi estabelecida
em 1907 através da transmissão direta das verrugas pela inoculação de um extrato
celular livre em tecido verrucoso. Baseado em suas características e aspectos
histológicos, as verrugas são distribuídas em humanos em vários sítios diferentes:
pele, trato genital, cavidade oral e trato respiratório. Também são encontradas em
diferentes espécies animais. Os Papilomavirus pertencem a família dos Papovaviridae,
subfamília Papilomavirinae, causam hiperproliferação celular localizada, e são
identificados como agente causador do condiloma acuminado, verrugas genitais e
também são associados a carcinomas invasores e benignos. O primeiro papilomavirus
foi descrito em 1930 quando Richard Shope identificou o vírus em cottontail rabbit e
denominou de Shope papilomavirus. O Shope papilomavirus de coelho foi um dos
primeiros exemplos de estudo experimental de um vírus que causa câncer em
mamíferos e de um vírus DNA oncogênico. Este vírus recuperado a partir da
ocorrência natural de papiloma cutâneo em cottantail rabbit, produziu papiloma em
coelhos domésticos com carcinoma progressivo na maioria dos casos. Em 1933 foi
denominado de Cottotail Rabbit Papilomavirus (CRPV) (Sheh VK, 1996)
No período de 1960, acreditava-se que apenas um tipo de Papilomavirus
Humano (HPV) era dominante e a natureza de infectar um epitélio específico como
sítio particular era provavelmente responsável pelas características morfológicas e
pelo comportamento das lesões verrucosas. No período de 1970, quando as técnicas
moleculares de clonagem de DNA viral foram disponibilizadas, o primeiro genoma de
papilomavirus foi clonado com sucesso em bactéria, a partir daí a extraordinária
diversidade dos papilomavirus humano e animal foi reconhecida. A análise de isolados
de DNA viral a partir de diferentes lesões individuais, levou a identificação de mais de
1
70 tipos diferentes de HPV e possibilitou a associação de lesões clínicas específicas
com diferentes tipos de HPV. Em geral os papilomavirus são específicos para
diferentes espécies não havendo exemplo de infecções cruzadas entre as mesmas.
(Sheh VK, 1996)
I-1B Transmissão
A infecção por papilomavirus é facilmente transmitida por fissuras microscópicas
no epitélio exatamente como ocorre durante o ato sexual, sendo esta a forma mais
evidente de transmissão. Pode ser transmitida de mulher para mulher, de homem para
homem e homem/mulher. A melhor alternativa para o estudo da infecção por HPV é a
nível molecular porque muitas infecções não são evidentes ao microscópio ou
apresentam aspectos clínicos visíveis. A faixa etária para a infecção cervical por HPV
é similar a outras infecções sexualmente transmissíveis, com um amplo espectro a
partir do inicio da atividade sexual. Como todos os tipos oncogênicos são transmitidos
por via sexual, é muito comum a ocorrência de infecções múltiplas. Cada tipo de HPV
é separado geneticamente e considerado idividualmente como infecção sexualmente
transmissível (IST) (Schiffman M et al. 2003).
Lesões orais por HPV não são comuns. Entretanto, a transmissão oral-genital
do HPV é sugerida devido a detecção do HPV 6, 11 e 16 em amostras da região oral.
Aproximadamente em 25% dos casos de cânceres oro-faríngeos o DNA HPV foi
detectado integrado no genoma da célula do hospedeiro. Transmissão não sexual do
HPV dos tipos 6 e 11 para conjuntiva e região nasal tem sido descrita. A transmissão
de tipos não genitais para área genital tem sido descrita através de outros fatores
como roupas de cama, de banho e vestimentas, da mesma forma de tipos genitais são
assim transmitidos (Clinical Proceedings 2001).
A respeito da transmissão vertical, muitos autores avaliam a presença de DNA
HPV nas gestantes e após o nascimento nas crianças levando também em
consideração o tipo de parto: normal ou cesariana. Elaine M. Smith e colaboradores
em 2004, realizaram um trabalho para avaliar a transmissão vertical e a concordância
2
dos tipos de HPV nas mães e nos recém natos. A pesquisa confirma a transmissão
vertical, mas observa não haver concordância entre os tipos encontrados nas mães e
os tipos encontrados nos recém natos. Wang Xiaoping e colaboradores em 1998
confirmaram a transmissão com taxa de 50% em casos onde foi realizado parto normal
e taxa de 33.3% em casos onde foi realizado parto cesariana. Chih-Jen Tseng e
colaboradores em 1998 também demonstraram uma taxa de 39.7% de transmissão
vertical do HPV-16 e HPV-18. No procedimento de parto normal a taxa de transmissão
foi de 51.4% e no procedimento de cesariana a taxa foi de 27.3%. Pode-se observar a
partir desses dados que o HPV pode ser transmitido por via vertical, não apenas por
via vaginal durante o parto mas também por via placentária durante o período
intrauterino.
I-1C Variabilidade Genética e Tropismo Celular
O motivo do tropismo específico do HPV é pouco conhecido, presume-se que
está ligado as diferenças genéticas secundárias dos diferentes tipos de HPV que
interagem com as proteínas codificas pelo hospedeiro em diferentes sítios. O número
de tipos de HPV descritos é de aproximadamente 120, sendo de 20-30% desses tipos
não classificados pois foram parcialmente seqüenciados. São numerados de acordo
com a ordem em que são descobertos. Um novo tipo de HPV é determinado quando
no mínimo 10% da seqüência dos genes E6, E7 e L1 diferem a partir de qualquer tipo
já conhecido e identificado. Subtipos e/ou variantes são assim determinados quando a
diferença do genoma é menor que 2,5 a 5,0% quando comparado com um tipo já
determinado. Já foram descritos, aproximadamente, 30 tipos diferentes de HPV que
infectam o trato anogenital de homens e mulheres resultando em doenças como
condilomas, verrugas planas, lesão papular, lesão subclínica e pré-câncer. Doenças
causadas pelos tipos de baixo risco se apresentam como condiloma papular e também
podem apresentar lesões planas identificadas ou não durante o exame clínico. Essas
verrugas se desenvolvem a partir de infecção epissomal (Clinical Proceedings, 2001;
Marques JA et al, 2000)
3
Os tipos de HPV genital são subdivididos atualmente em tipos de baixo risco,
encontrados principalmente nas verrugas genitais e tipos de alto risco que estão
associados freqüentemente ao câncer invasivo cervical. Este critério é baseado em
estudos moleculares epidemiológicos que analisam o risco estimado e a evidência do
potencial oncogênico de vários tipos de HPV. Entretanto, alguns tipos estão sendo
classificados como risco desconhecido ou indetrminado devido à baixa incidência na
população dificultando a análise epidemiológica e análise do potencial oncogênico. O
quadro 1 abaixo descreve a classificação dos tipos de HPV e o risco atribuído aos
mesmos (Munoz N, 2003).
Quadro 1.: Classificação dos papilomavírus
Tipos de HPV
Risco atribuído
16, 31, 33, 35, 52, 58 (grupo A9)
18, 39, 45, 59, 68, 70 (grupo A7)
26, 51, 82 (grupo A5)
ALTO RISCO
53, 56, 66 (grupoA6)
MM4
6, 11, 44 (grupo A10)
34, 73 (grupo A11)
40, 43 (grupo A8)
42 (grupo A1)
BAIXO RISCO
61, 72, 81, 83, 84, CP6108 (grupo A3)
57 (grupo A4)
86
87,54, 35H, LVX82, LVX160, Xc
RISCO DESCONHECIDO
I-1D Estrutura viral
Os papilomavirus possuem um capsídeo icosaédrico não envelopado, composto
de 72 capsômeros com aproximadamente 55nm de diâmetro (Figura 1) contendo o
genoma viral de DNA dupla fita de aproximadamente 8.000 pares de bases (bp). O
genoma pode ser encontrado integrado ao cromossoma da célula hospedeira e na
4
configuração epissomal (DNA viral está separado do DNA celular, se apresenta de
forma circular no interior da célula hospedeira e se auto replica). O DNA viral pode ser
dividido em 3 regiões: Regiões regulatórias (URR), regiões “Early” (E) e “Late” (L), que
são as regiões de leitura abertas (Open reading Frames - ORFs) (Figura 2). Todas
codificadas em apenas uma fita de DNA.
FIGURA 1- Microscopia eletrônica da partícula viral do Papilomavirus
Humano (www.ipog.com.br/imagens.htm)
FIGURA 2 - Estrutura genômica do HPV
Genoma do HPV-16
Proteínas não estruturais
Proteínas do vírion
5
Estudos recentes utilizando deleção ou mutagênese de sítios dirigidos têm
permitido o conhecimento das funções específicas das regiões ORFs do genoma viral.
A região “Late” codifica proteínas estruturais L1 e L2 responsáveis pela formação do
capsídeo viral sendo este composto 80% pela proteína L1 e o restante composto pela
proteína L2. Essas proteínas são codificas tardiamente no ciclo de replicação viral. A
região “Early” é expressa no início da infecção e é responsável pela manutenção de
um número elevado de DNA do HPV no hospedeiro. Essa região, nos tipos de alto
risco, também codifica proteínas importantes para a transformação da célula
hospedeira levando ao câncer. Sete diferentes áreas desta região são codificadas para
proteínas identificadas como E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7. A Proteína E1 especifica
duas outras proteínas necessárias para regulação da replicação do DNA epissomal,
age como uma helicase abrindo a fita dupla de DNA e promove a iniciação da
replicação do DNA viral; a E2 codifica duas proteínas que são reguladoras da
transcrição viral, com função auxiliar na replicação do vírus; a E3 ainda tem função
desconhecida, a E4 está envolvida na infectividade viral, é codificada tardiamente no
ciclo de replicação e atua no rompimento dos filamentos de citoqueratina (Howley PM,
1996; Stolen MH et al, 2003).
As proteínas E5, E6 e E7 tem papel importante no processo de oncogênese,
estão envolvidas na transformação celular (Howley PM, 1996; Stolen MH et al, 2003;
clinical proceedings,2001). A proteína E5 não possui atividade enzimática é provável
que sua função esteja ligada a alteração da atividade de proteínas da membrana
celular envolvidas na proliferação. É uma proteína transformadora de membrana que
interage com receptores do fator de crescimento. Os primeiros dados referentes a
possível função da E5 foram obtidos a partir de estudos do gene E5 codificado pelo
Papilomavirus Bovino tipo 1 (BPV-1). A proteína E5 do BPV-1 está localizada na
membrana plasmática e pode cooperar com o receptor do fator de crescimento de
epiderme (EGFR) e com o receptor de fator-1 estimulante de colônia. Esta interação
induz à transformação de células de linhagem NIH 3T3, possivelmente, aumentando a
sinalização mediada pelos receptores (Martin et al. 1989).
O receptor tipo β para fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR β) é
ativado em fibroblastos transformados pela proteína E5 do BPV-1.
Há uma curta
6
região de seqüência similar entre a proteína E5 e o fator de crescimento derivado de
plaquetas (PDGF), que permite a ligação desta proteína ao PDGFR β sugerindo a
ativação direta deste receptor pela E5. É observada uma preferência da proteína E5
pelo PDGFR β (Petti L et al, 1992 e 1994). Martin et al em 1989, demonstraram que a
proteína E5 pode estimular a atividade transformadora do EGFR humano em células
NIH 3T3 e afetar o metabolismo desse receptor nessa linhagem celular. O maior efeito
da expressão da E5 sob o receptor é de estabilizar a interação ligante-receptor. A E5 é
capaz de interagir com vários receptores de fator de crescimento. Em células de
linhagem COS, a E5 forma preferencialmente complexo com o PDGFR β e não com o
EGFR quando ambos estão co-expressos (Petti L et al, 1994).
O gene E6 de muitos tipos de HPV foi descrito in vitro como tendo atividade
transformadora em células de roedores e cooperando com o E7 para a imortalização
dos queratinócitos humanos. A oncoproteína E6 codificada pelos tipos de HPV de alto
risco como o 16 e o 18 degrada a p53, proteína produzida pelo gene supressor de
tumor p53, através da formação de um complexo com a ubiquitina ligase celular,
E6AP. A proteína E6 codificada por tipos de baixo risco apresenta uma redução na
habilidade de transformação das células e das funções bioquímicas da p53 devido à
ligação por baixa afinidade entre a E6 e a p53, consequentemente a E6 do HPV11
(baixo risco) demostra uma fraca elevação nas taxas de mutação quando expressas
em células de mamíferos. Além disso quando expressada em células diplóides
humanas, a proteína E6 do HPV-6 é incapaz de alterar o perfil do ciclo celular dessas
células. Embora estes dados sugerem que a habilidade da E6 de anular a função da
p53 no ciclo celular contribui para aumentar o potencial oncogênico observado nos
HPVs de alto risco, permanece determinado que a função da E6 dos vírus de alto risco
independente da p53, é conservada na E6 dos vírus de baixo risco (Zwerschke W et al.
2000, Oh ST et al. 2004). Em infecção por HPV-16, uma super expressão da proteína
E6 pode bloquear a apoptose induzida por E2 e E7. Durante a infecção os sinais próapoptose gerados por E2 e E7 são provavelmente contrabalanceados pela proteína
E6. Essa informação está de acordo com estudos que demonstram um aumento de
proliferação celular e diminuição de apoptose em epitélio cervical infectado por HPV
(Nair P et al. 1999, Webster K et al. 2001)
7
A proteína E7 é codificada por vários tipos de HPV, tem função como
oncoproteína, atua ligando à membrana proteínas supressoras de tumor como a
retinoblastoma (Rb), inibindo sua habilidade de modular a função do fator de
transcrição E2. Thomas et al em 1999, usando um sistema genético envolvendo a
transferência de genomas clonados de HPV para células de queratinócitos,
demonstrou que a expressão funcional das proteínas E6 e E7 dos tipos de HPV de alto
risco é necessária para a manutenção da replicação do genoma epissomal. Entretanto
quando as proteínas E6 e E7 são retiradas do genoma, o vírus não consegue se
manter por muito tempo em ensaios de replicação. Queratinócitos imortalizados
espontaneamente, contendo genoma do HPV-16 mutado na região E7 são incapazes
de amplificar o DNA viral durante a diferenciação celular, o que sugere o envolvimento
da proteína E7 em estágios tardios do ciclo de vida viral. O mecanismo pelo qual as
proteínas E6 e E7 contribuem para manter os epissomas no ciclo de vida do vírus não
é totalmente conhecido. Sabe-se que uma mutação na região E6 do genoma elimina a
habilidade da proteína E6 de inativar a ação da p53, perdendo a função de manter o
DNA epissomal o que sugere uma importância da p53 nessa ação. (Oh ST et al. 2004,
Zwerschke W et al. 2000).
Os genes supressores de tumor codificam proteínas que regulam o crescimento
celular e previnem eventos que iniciam a transformação malígna das células. O gene
supressor de tumor p53, também conhecido como “guardião do genoma”, está
localizado no braço curto do cromossoma 17. É o gene mais mutado em cânceres
humano. O gene p 53 tem esse nome por que codifica uma proteína de 53 Kilodaltons
(Kb) que é uma fosfoproteína nuclear que normalmente está presente em baixas
quantidades e tem uma meia vida muito curta nas células normais. Quando o DNA é
defeituoso, o gene p53 é ativado e a proteína p53 interage com outras proteínas. Essa
ação coordenada consiste em conter o ciclo celular na fase G1 para permitir o reparo
do DNA. Se o DNA for reparado, o ciclo celular continua normalmente. No caso do
reparo não ser realizado, a p53 sinaliza para outras proteínas resultando na indução
da apoptose. A p53 é considerada um fator de controle “checkpoint” (Juan LJ et al.
2000). No caso de mutação da p53 esta pode perder suas funções. A detecção da
8
proteína p53 tem sido usada em imunohistoquímica como fator prognóstico de
carcinoma invasivo cervical de células escamosas (Brenna S M et al. 2002).
Polimorfismos do gene p53 é visto como sendo comum e tem sido descrito em
pacientes com câncer cervical. O indivíduo pode carregar duas variações do gene p53;
p53 arg ou p53 pro. Tem sido sugerido que a oncoproteína E6 do HPV inativa mais
facilmente o gene p53 arg do que o pro, levando a uma associação com o resultado da
infecção por HPV. Na verdade tem sido proposto, não com uma concordância
unânime, que indivíduos que são homozigotos para p53 arg podem ser menos
protegidos contra os efeitos dos tipos oncogênicos de HPV (Brenna SM, et al 2003).
Outro gene supressor de tumor foi nomeado como gene Rb
por ter sido
identificado a primeira vez no retinoblastoma. É localizado no cromossoma 13 e
codifica uma proteína nuclear que regula a expressão dos genes. A perda da função
da proteína Rb dá início a perda do controle natural inibitório da progressão do ciclo
celular (Kastan M B; et al 1997).
A região URR é responsável pela regulação da replicação viral e controle da
transcrição de algumas regiões “Early” no ciclo de replicação viral. O ciclo de
replicação do HPV é ligado à diferenciação do tecido epitelial. A infecção ocorre nas
células da camada basal do epitélio estratificado onde o genoma é estabilizado como
epissoma e replicado sincronizadamente com DNA cromossômico (Oh ST et al. 2004).
I-1E Replicação Viral
Magnus Evander et al, em 1997 e Chun-Sik Yoon em 2001, sugeriram que a
subunidade α6 da integrina como o possível receptor para o Papilomavirus nas células
basais epiteliais. A integrina é um receptor de membrana para matriz extracelular, com
destribuição limitada no tecido epitelial, endotelial e nas células neurais.
O ciclo de replicação do HPV está ligado diretamente com as camadas
diferenciadas do tecido epitelial. A infecção ocorre nas células da camada basal ou do
epitélio estratificado onde o genoma viral se estabiliza como epissoma e é replicado
9
sincronizadamente com o DNA cromossomial. Seguindo a divisão celular, uma célula
filha infectada migra a partir da camada basal e começa a se diferenciar resultando na
ativação da expressão dos genes “Late”, amplificação do genoma viral e liberação da
partícula infectante.(Oh ST et al. 2004). A infecção do vírus ocorre nos queratinócitos
basais, a transcrição inicial do genoma viral é regulada através da proteína E2. A
proliferação e desordem celular da diferenciação dos queratinócitos é induzida pelas
proteínas E6 e E7 e a estimulação das células que estão na fase S do ciclo celular
induzem as enzimas do hospedeiro a sintetizarem DNA viral. A replicação do DNA viral
é inicializada e a dupla fita de DNA é estabilizada e mantida na forma epissomal. As
proteínas do capsídeo, L1 e L2, e a proteína associada à fase "Late", E4, são
sintetizadas e a partícula viral é organizada durante os estágios terminais da
diferenciação dos queratinócitos. A progênie viral é liberada e os queratinócitos mortos
são descartados a partir da superfície do epitélio (Phelps WCP et. al. 1995).
A cérvice normal tem uma zona de transformação estreita onde existe uma
transição abrupta a partir do epitélio colunar (às vezes via epitélio metaplásico) para
epitélio escamoso. O HPV mais infeccioso provavelmente é o encontrado nas células
que estão próximas a essa junção. O vírus HPV obtém acesso as células basais do
epitélio da cérvice via vagina, por exemplo, durante o ato sexual, onde irão se replicar
fora do cromossomo do hospedeiro, dentro do núcleo como epissoma e expressam os
genes virais "Early". As células basais infectadas que mostram sinais de transtorno
celular como resultado da infecção viral, mantém sua diferenciação e migração para a
superfície do epitélio, onde nesse momento as células escamosas iniciam a expressão
dos genes "Late" do HPV: L1 e L2. Partículas virais infecciosas são formadas e
lançadas no lúmem da vagina. A infecção por HPV, particularmente os de alto risco,
pode progredir de displasia leve induzida por HPV, para estágio final de neoplasia
cervical intraepitelial (NIC III) e, eventualmente, para câncer invasivo cervical quando a
base da membrana é rompida pelas células transformadas permitindo a difusão local e
distante dessas células produzindo metástase. Em células epiteliais transformadas o
genoma do HPV é integrado no cromossomo do hospedeiro com expressão dos
oncogenes, especificamente das proteínas E6 e E7, que vão se ligar aos genes
supressores de tumor p53 e Rb (Figura 3).
10
Figura 3 - Infecção e replicação do Papilomavirus Humano nas células epiteliais
cervicais
Cérvice normal
Lançamento de particulas
virais
Infecção por HPV
Formação de vírus infeccioso
Células epiteiais escamosas
Diferenciação e
movimento celular
Base da
membrana
Expressão de L1
e L2
Células basais epiteiais
Replicação do
epissoma
expressão de
E1, E2, E4-7
Zona de transformação da cérvice
Epitélio Colunar
Epitélio escamoso
Transformação malígna das células
Integração do HPV no
cromossoma do hospedeiro
Arquitetura de desordem celular
Células epiteliais transformadas
por HPV
Células em diferenciação
celular
Invasão
NIC III
Expressão de E6 e E7 Ligação com p53 e Rb
Câncer cervical invasivo
Modificado de Expert Reviews in molecular medicine
(www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/ smc/images/fig001smc.htm - Expert Reviews in Molecular Medicine © Cambridge
University Press ISSN 1462-3994)
11
I-1F Infecção latente e infecção produtiva
O termo latência tem sido aplicado para designar a detecção do HPV em pacientes
que não possuem evidência da doença nos exames citológicos, colposcópico e
morfológico. O vírus é detectado apenas por testes moleculares, onde o DNA viral é
pesquisado através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Captura
Híbrida. O período de latência é extremamente variável mas é estimado que o vírus
permaneça dessa forma num intervalo de um a oito meses. Não é elucidado se a
liberação do estado de latência pode ocorrer a partir da identificação do vírus pelo
sistema imunológico, ou se é necessário um grande número de cópias virais para que
haja identificação pelo sistema imune. O que estimularia a produção da infecção.
Nesse caso a maioria dos indivíduos apresentam lesões transitórias semelhantes que
não são detectadas. (Clinical proceedings, 2001; Middleton K et al, 2003).
Durante o período de latência o HPV, mantém-se com baixo número cópias
como epissoma nas células da camada basal e parabasal do epitélio. Ocorre a
replicação do epissoma somente quando há divisão celular do hospedeiro. A infecção
viral começa quando o HPV se replica independente da divisão celular do hospedeiro.
Resultando em um crescimento das lesões assim como na indução da proliferação
celular do hospedeiro pelo vírus. Essas lesões induzidas pelo HPV promovem um
aumento do número de moléculas de DNA viral nas camadas superficiais e
intermediárias do epitélio. Sendo a maioria das infecções por HPV associadas a lesões
transitórias, não é claro em que proporção o indivíduo infectado desenvolve a
expressão de lesão produtiva por HPV. O fator exato que determina a transição de
infecção latente para produção de infecção viral é desconhecido, mas a complexa
interação entre hospedeiro, vírus e fatores ambientais é muito importante (Middleton K
et al, 2003). Baseado em evidências de um período de estudo epidemiológico, Xavier
Castellsagué em 2002 demonstrou que o uso de contraceptivos orais (CO) por longos
períodos, o fumo, a co-infecção com outros agentes sexualmente transmissíveis e o
número de gravidezes são identificados como os co-fatores ambientais de maior
ligação na progressão da infecção por HPV para lesões intraepiteliais de alto risco e
câncer invasivo cervical. Segundo o amplo estudo da Agência Internacional de
Pesquisa em Câncer (IARC), mulheres com sete ou mais gravidezes termo,
12
apresentavam quatro vezes mais risco de desenvolver câncer cervical de células
escamosas quando comparadas com mulheres que nunca estiveram grávidas. O uso
de contraceptivos orais (CO) tem sido associado com o câncer cervical em muitos,
mas não em todos os estudos epidemiológicos. Alguns achados epidemiológicos
sugerem que o uso de CO por 5 anos ou mais é um co-fator que pode aumentar para
quatro vezes o risco de câncer cervical em mulheres que possuem DNA HPV. Não há
muitos dados disponíveis a respeito do mecanismo pelo qual as influências hormonais
podem modular o risco da progressão para uma doença cervical avançada entre
mulheres infectadas por HPV. Mecanismos hormonais relatados podem influenciar a
progressão de pré-malígna para lesão cervical malígna, promovendo a integração do
DNA HPV no genoma humano que resulta na ativação da expressão das proteínas E6
e E7. Estudos experimentais tem demonstrado que o estradiol pode estimular a
transcrição dos genes E6 e E7 do HPV16 em linhagens de células que contém HPV16
integrado. Sendo essas proteínas associadas com o potencial oncogênico do HPV, o
efeito do estrogênio na transcrição desses genes virais pode ser de relevância
biológica na transformação malígna de células infectadas por HPV 16 (IARC 1999;
Moreno V et al. 2002).
O HPV encontra-se presente em baixo número de cópias na camada de células
basais. Uma vez desenvolvida a lesão produtiva, a replicação viral produz inúmeras
cópias de genoma viral nas células mais próximas a superfície do epitélio. As células
superficiais do epitélio são as que contém maior número de cópias virais. A infecção
produtiva pode permanecer durante 3 -6 meses antes da manifestação da resposta
imune se iniciar. O sucesso desta resposta imunológica será determinante para a
persistência ou regressão da doença, a extensão e severidade das lesões e o sucesso
da terapia de tratamento.
I- 1G Diagnóstico por Biologia Molecular
Além dos testes citopatológicos como a citologia, a histologia e a
imunohistoquímica a biologia molecular têm sido de suma importância para o
diagnóstico e orientação de conduta a ser tomada em paciente com infecção genital
13
por papilomavirus humano. O diagnóstico molecular pesquisa a presença do DNA do
HPV no trato genital permitindo: a detecção do vírus em lesões precursoras e
avançadas; lesões colposcópicas não características; citologia sugestiva de alterações
morfológicas; lesões de baixo grau no colo, vagina e vulva; discordância citohistopatológica e controle da infecção e tratamento. A biologia molecular pode ser
aplicada em secreção cervicovaginal, raspado uretral, de glande e prepúcio, lesões
cutâneo mucosas, biópsias ou peças cirúrgicas, material emblocado em parafina,
raspado de lesões em meio de transporte conservante (Lancellotti CLP et al. 2000)
As principais técnicas de biologia molecular utilizadas para detecção do DNA do
HPV são a Hibridização in situ, a Captura Híbrida e a Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR).
A Hibridização in situ consiste na detecção de seqüências específicas de DNA
ou RNA em cortes de tecido ou preparados citológicos, utilizando-se uma seq6uência
complementar de ácidos nucléicos (sondas ou “probes”) marcada. Sob condições
apropriadas ocorre a hibridização da sonda com a seqüência alvo do DNA viral. A
hibridização in situ permite fazer a correlação com os aspectos morfológicos/
histológicos das lesões permitindo a análise de biópsias ou peças cirúrgicas. Esta
técnica também permite a detecção de tipos de baixo risco e alto risco utilizando um
“pool” de sondas específicas para determinados tipos (Cooper K 1996)
O sistema de captura do híbrido utiliza em uma solução hibridizadora,
anticorpos
na
captura
com
amplificação
de
sinal,
sendo
detectado
pela
quimioluminescência. Espécimes contendo DNA do HPV hibridizam-se com o coquetel
de sondas específico RNA-HPV. O resultado dos híbridos é capturado sobre a
superfície da microplaca recoberto com anticorpos específicos para os híbridos
RNA/DNA. A seguir, faz-se a reação destes híbridos imobilizados com conjugado de
anticorpos específicos para híbridos de RNA/DNA e fosfatase alcalina, que são
detectados por um substrato quimioluminescente. A Captura Híbrida é capaz de
detectar 18 tipos de HPV que mais comumente infectam o trato genital (Castle PE et
al. 2002, Clavel C et al. 1998)
14
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é utilizada para detecção de DNA do
HPV livre e integrado no genoma da célula hospedeira. É uma técnica de grande
sensibilidade, pois amplifica um segmento específico de DNA do agente investigado. É
uma amplificação enzimática que permite detectar números baixos de cópias de DNA
do HPV em períodos diferentes da infecção. Através de repetidos ciclos de
desnaturação do DNA por calor, pareamento dos primers específicos e atividade de
polimerização da enzima DNA polimerase termorresistente, geram-se milhões de
fragmentos idênticos de DNA que podem ser visualizados por luz ultravioleta (UV),
permitindo o diagnóstico (Lörincz AT et al. 2003). A tipagem do HPV pode ser
realizada a partir da digestão do amplificado com enzimas de restrição, fornecendo um
padrão tipo-específico; por hibridização com sondas específicas para cada tipo ou por
seqüenciamento do DNA (Johnson T et al. 2003)
I- 1H Tratamento
O objetivo do tratamento é reduzir, remover ou destruir lesões clínicas ou
subclínicas, além de prevenir a transmissão do HPV. Na maioria dos casos o
tratamento pode induzir a períodos de ausência de lesão, mas lesões recidivas da
infecção do HPV podem ocorrer devido principalmente a latência do vírus, aderência
ao tratamento, falha do método terapêutico, nova contaminação, auto contaminação.
Determinar o tempo de tratamento e reduzir a transmissão das verrugas genitais é
difícil pois é necessário determinar o tempo de persistência e a infectividade do HPV.
O tempo de tratamento é baseado em estudos que avaliam a persistência do HPV
após a terapia (Sarian LO et al. 2004).
Embora nenhum tratamento para verrugas genitais tenha seu sucesso garantido
em 100%, o uso de uma associação de modalidades de tratamento atualmente
disponíveis resultará no desaparecimento da lesão ou em remissão de longo prazo na
maior parte dos pacientes. Para pacientes que não têm respondido a terapias
cirúrgicas ou tópicas, que têm apresentado múltiplas recorrências ou têm tido lesões
muito grandes, o interferon constitui uma terapia eficaz. A administração da droga
resulta na erradicação das verrugas, na maioria dos pacientes, e numa baixa taxa de
15
recorrência. A terapia cirúrgica é uma opção de tratamento que tem como vantagem
na maioria dos casos a eliminação das verrugas em uma única vez (Workowski KA et
al 2002).
A escolha do tratamento depende de diversos fatores já que nenhum deles é
considerado ideal (Neves-Jorge et al. 2000):
¾ do número, tamanho e localização das lesões
¾ da aceitação pelo paciente do método proposto
¾ do estado imunológico do paciente
¾ da disponibilidade de recursos
¾ da eficácia e efeitos adversos
Existem várias formas de tratar as lesões causadas pelo HPV. Os métodos
disponíveis incluem: químicos, cirúrgicos e estimuladores da imunidade (Follen M et al.
2004, Workowski KA et al 2002).
¾ Químicos - Indicado para lesões clínicas ou subclínicas, vulvares e penianas
•
Ácido tricloroacético (TCA) ou ácido bicloracético (BCA) 80%-90% –
Aplicado diretamente na lesão.
•
5-Fluoracil (5 FU) – creme a 5%. Aplicado diretamente na lesão.
•
Podofilina – aplicado na pele vulvar ou peniana, contra-indicado na
gestação.
•
Isoprinosine – administrado via oral - importante para casos de recidiva.
•
Interferons – uso tópico, intralesional ou sistêmico. Contra indicado para
pacientes HIV soropositivas com CD4<200 células / mm³
¾ Estimuladores de imunidade
16
•
Imiquimod – age aumentando a resposta imunológica – creme 5% para
uso tópico. Sua segurança para uso durante a gravidez é desconhecida.
•
Retinóides – reduzem o tamanho da lesão para auxiliar em tratamentos
cirúrgicos – Solução a 0,025%, 0,05% e 0,1%
¾ Cirúrgico
•
Curetagem – indicado para lesões verruciformes
•
Excisão por bisturi – indicado para neoplasia intraepitelial da pele ou
mucosa
•
Conização por bisturi - indicado para neoplasia intraepitelial da pele ou
mucosa
•
Criocirurgia – aplicação de nitrogênio líquido para congelar e destruir o
tecido anormal
•
Laser de CO2 - indicado para todos os tipos de lesões clínicas de vulva,
vagina e colo uterino. Para lesões subclínicas de vulva: sintométicas ou
associadas à neoplasia intra-epitelial até o carcinoma in situ, doença de
Bowen.
I- 1I Prevenção
A prevenção da infecção por HPV pode também prevenir o câncer cervical, e
modelos experimentais em animais estão sendo utilizados para pesquisa de uma
vacina com uma partícula viral similar a partícula infectante (Virus Like Particle - VLP)
que representa uma proteína externa da estrutura do HPV sem um DNA infectivo.
Estudos recentes em humanos tem demonstrado que essa vacina administrada por via
intramuscular produz altos títulos de anticorpo tipo - específico com efeitos mínimos
para o homem. Existem alguns processos de vacinação em larga escala em
andamento e os resultados preliminares são promissores (Koutsk LA.et al, 2002). As
vacinas "Early" estão sendo desenvolvidas para o HPV-16 e para alguns outros tipos
17
importantes, mas uma estratégia de vacinação mais eficiente requer uma vacina
polivalente. O tipo de vacina VLP é puramente profilático, contendo apenas uma
estrutura VLP, visando e obtendo anticorpos neutralizantes. Outro tipo de vacina que
utiliza uma quimera, que também possui algumas proteínas "Early" em estado não
infectante, tem o objetivo de obter imunidade terapêutica mediada por células, para
elevar a eliminação viral e em conjunto produzir anticorpos neutralizantes para
profilaxia. O sucesso dessas vacinas "Early" levará a uma nova geração de testes,
assim como várias modificações serão necessárias ,antes que uma versão aplicável e
acessível esteja disponível para o uso em todo mundo (Schiffman M et al, 2003).
I-2 HIV e HPV – Infecção mista
O Vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) é o agente etiológico da
síndrome da imunodeficiência humana (SIDA ou AIDS). É um Retrovirus, da família
dos Lentivirus. O HIV é um vírus envelopado, possui duas moléculas de RNA
dispostas no interior do capsídeo, esse conjunto é envolto por uma camada protéica,
formando uma estrutura denominada core. Envolvendo o core, existe o envelope,
composto por uma camada dupla de fosfolipídios, na qual estão imersas várias
moléculas proteicas específicas desse vírus como a gp120 que promove a ligação com
o receptor CD4 e co-receptores (CXCR4 e CCR5) das células linfócito T CD4+. No
core viral estão as proteínas p24, p7/p9, duas cópias da molécula de RNA, e as
enzimas virais: protease, integrase e trasncriptase reversa (Immunology and
microbiology on line text book).
O provirus HIV-1 codifica três proteínas estruturais: gag, pol e env. Codifica
também seis proteínas acessórias: tat, rev, vif, nef, vpr e vpu. As proteínas produzidas
pelo HIV tem importância particular em relação a sua atuação no processo de
carcinogênese cervical, principalmente tat e rev e possivelmente vpr. A proteína tat
aumenta a transcrição dos genes virais, enquanto o rev atua pós transcricionalmente
transferindo o RNAm viral do núcleo para o citoplasma. A proteína vpr assegura a
infecção em macrófagos, causa interrupção na fase G2 ; dessa forma aumenta a
18
produção viral (Clarke B et al. 2002). O gene tat do HIV-1 que codifica uma proteína
regulatória, tem sido associado como possível mecanismo para o aumento da
expressão do HPV em indivíduos soropositivos. O tat em combinação com a proteína
E2 do HPV 16, por exemplo, acentua a transativação da região URR do HPV,
aumentando a expressão dos genes do HPV (Wright TC Jr et al, 1996).
A infecção por HIV produz também um enfraquecimento progressivo do sistema
imunológico local mediado por células e um acentuado declínio no número de células
CD4 na pele. Sendo a resposta imune local mediada por células de grande importância
para o controle da infecção por HPV, a diminuição na eficiência dessa resposta pode
ser responsável pelo aumento da suscetibilidade e da severidade em uma infecção
mista de HIV e HPV. As células de Langehans (produzidas na medula) tem um papel
essencial na resposta imune em regiões de mucosa e epitélio escamoso. Em
indivíduos normais com infecção por HPV, a diminuição dessas células está
relacionada com a severidade da infecção por HPV. Em indivíduos portadores de HIV,
sem infecção mista por HPV, a diminuição das células de Langehans está relacionada
com o estágio da infecção por HIV. Portanto, o HIV e o HPV afetam as células de
Langehans prejudicando a habilidade do organismo de responder contra a infecção por
HPV, permitindo assim um aumento na prevalência e severidade da doença quando
associada ao HIV (Bell MC et al, 2000; Tay SK et al, 1987; Caorsi I et al, 1986)
A incidência das infecções por HPV em indivíduos imunodeficientes tem
aumentado. Pacientes submetidos a transplante e indivíduos com depleção do sistema
imunológico por quimioterapia e radioterapia, tem demonstrado um aumento no risco
de desenvolver infecções por HPV. Desde o reconhecimento do HIV em 1980, este
tem liderado a causa de imunodeficiência em todo mundo. Os efeitos citopáticos
causados pelo HIV nas células t-helper (CD4+) prejudicam a habilidade humana em
processar uma resposta celular contra microorganismos. Esse fato permite um
aumento da suscetibilidade dos pacientes portadores do HIV ou com AIDS para o
desenvolvimento de infecções: bacterianas, fúngicas, virais e parasitológicas.
19
OBJETIVOS
II – Objetivos
II-1Objetivo Geral
- Avaliar, por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), a presença e tipagem de
DNA do HPV em amostras de escovado cervical de gestantes soropositivas e
soronegativas para HIV-1, atendidas em três hospitais da rede pública de saúde na
cidade do Rio de Janeiro.
II-2 Objetivos específicos
- Através da utilização da técnica de seqüenciamento de DNA, identificar o tipo
específico de HPV de cada amostra reativa na PCR.
- Avaliar a presença de DNA HPV na população analisada de gestantes
soropositivas para HIV-1.
- Avaliar a presença de HPV na população analisada de gestantes
soronegativas para HIV-1
- Avaliar a presença de tipos de alto risco, baixo risco e risco indeterminado na
população estudada.
20
METODOLOGIA
III – Metodologia
III-1 Casuística
A população de estudo foi compreendida de mulheres gestantes, convidadas a
participar deste estudo. As gestantes participantes foram atendidas no serviço de PréNatal de três diferentes instituições públicas de saúde na cidade do Rio de Janeiro –
Brasil: Hospital Universitário Pedro Ernesto – HUPE/UERJ, período de coleta de
09/2003 a 12/2003 ; Hospital Universitário Gaffrée e Guinle – HUGG/UNIRIO, período
de coleta de 12/2003 a 03/2004 e Instituto Fernandes Figueira – IFF/FIOCRUZ-RJ,
período de coleta de 12/2003 a 01/2004.
Após esclarecimento e concordância a partir de termo de consentimento, 100
gestantes do HUPE com idade de 15 a 44 anos (média de 27 anos), 31 gestantes do
IFF com idade de 16 a 39 anos (média de 28.8 anos) e 72 gestantes do HUGG com
idade de 19 a 40 anos (média de 27.9 anos) aceitaram participar da pesquisa durante
o período de coleta em cada unidade.
As gestantes foram escolhidas a revelia. Com ou sem história prévia de infecção
por HPV ou com infecção produtiva no momento da coleta, as gestantes soropositivas
para HIV atendidas nos serviços acima também foram incluídas neste estudo. Das 196
amostras colhidas, 38 são soropositivas para HIV.
III-2 Papanicolau
As amostras procedentes do Hospital Universitário Pedro Ernesto – UERJ foram
analisadas pelo serviço especializado da instituição por teste de papanicolau. As
demais amostras analisadas não foram submetidas a teste citológico, não possuem
resultado de Papanicolau.
21
III-3 Teste para HIV
As amostras soropositivas para HIV-1, foram diagnosticadas de acordo com a
rotina dos laboratórios de cada instituição onde foram colhidas as amostras. Foram
realizados testes sorológicos de triagem (ELISA) e confirmatrório (Western Blot ou
imunofluorescência). No Hospital Universitário Gaffrée e Guinle também foi realizado
teste rápido de algumas amostras. O teste para HIV-1 é realizado como exame de
rotina do Pré-Natal em todas as três instituições participantes deste estudo.
III-4 Coleta de amostra
Foi coletado escovado cervical utilizando o coletor médio universal (Universal
Collection Medium® -UCM- Digene – Brasil), composto de uma escova e 1 tubo
contendo líquido conversante, é utilizado para coleta e transporte de amostra para
utilização de técnicas moleculares.
A paciente após concordar em participar, era levada à mesa ginecológica para
coleta do escovado cervical. Foi observada a presença de muco espesso no canal
cervial das gestantes sendo necessária à limpeza do canal vaginal e colo antes de
introduzir a escova ginecológica. Primeiramente foi realizada a limpeza com gaze
estéril presa na pinça de Cherron e com movimentos leves, evitando sangramento, o
excesso de muco foi retirado. O segundo passo foi a coleta das células da cérvice de
acordo com as orientações apresentadas na ficha técnica do fabricante do UCM: 1) a
gestante deveria apresentar abstinência sexual de três dias; 2) Não efetuar exame
digital (toque); 3) Introduzir a escova no canal cervical , entre 1,0 a 1,5 cm, até que as
cerdas maiores toquem a região da ectocervical e roda-la em sentido horário cinco
vezes; 4) escovar a ectocérvice e/ou a endocérvice; 5) Imediatamente após a coleta
inserir a escova no tubo coletor; 6) Tampar e agitar o coletor por 30 segundos para
homogeneizar a amostra. É importante evitar amostras com excesso de sangue pois
este excesso prejudica a análise por biologia molecular.
22
III-5 Extração do DNA
Para a extração do DNA foi retirado o volume total da suspensão celular de
aproximadamente 1mL. Uma alíquota de 400 μL foi retirada e armazenada a –20ºC. O
DNA foi extraído a partir de 600 μL da suspensão celular completada com 400 μL de
tampão PBS 1X, utilizando-se o QIAamp DNA Midi Kit (QIAGEN), e Bloodclean DNA
Purification Kit (Biotools) seguindo as orientações contidas na ficha técnica do
fabricante.
III-6 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
III-6A PCR para o gene da β-globina humana
A PCR para o gene da β-globina humana (adaptado de Manos et al, 1989) foi
utilizada como controle de extração do DNA. Após a extração do DNA a amostra foi
submetida a PCR para β-globina para confirmação da extração. Foi utilizado um par de
primers, PC04 e gH20, que amplificam um fragmento de 268 pares de bases (bp). A
reação foi otimizada com 5μL de DNA adicionados em 45μL de uma mistura de reação
contendo em cada μL: 10mM de Tris HCl (pH 8.3), 50mM de KCl; 2,5mM de MgCl2 ;
50μM de cada dNTP; 0,6 pmol de cada primer e 0,025 U de Taq DNA Polimerase. O
material foi amplificado em termociclador (GeneAmp PCR System 2400 – Applied
Biosystems; PTC 100 Programable Thermal Controller – MJR MJ Research, INC)
utilizando-se a seguinte ciclagem: 95ºC – 1 min, 55ºC – 1min, 72ºC – 2 min; repetidos
35 vezes seguido de uma extensão de 72ºC por 5 minutos.
O material amplificado foi submetido a uma corrida eletroforética em gel de
agarose 2%, corado com brometo de etídio e visualizado em transiluminador através
da incidência da luz Ultra Violeta (UV).
23
III-6B PCR para DNA HPV
Após a confirmação da extração do DNA pela PCR para β-globina a amostra foi
submetida a PCR para detecção de DNA HPV. Foi utilizado um par de primers, MY11
e MY09 (Manos et al, 1989; Bauer et al, 1992; Chi-Keong Ong et al, 1994; Wheeler et
al,1997) que amplificam um fragmento de 450 bp da região L1 do genoma viral. A
reação foi otimizada com 12μL de DNA adicionados em 38μL de uma mistura de
reação contendo em cada μL: 10mM de Tris HCl (pH 8.3), 50mM de KCl; 2,5mM de
MgCl2 ; 400μM de cada dNTP; 0,5 pmol de cada primer e 0,05 U de Taq DNA
Polimerase. O material foi amplificado em termociclador (GeneAmp PCR System 2400
– Applied Biosystems; PTC 100 Programable Thermal Controller – MJR MJ Research,
INC) utilizando o ciclo: 95ºC – 3 min; 40 ciclos de 95ºC – 1 min, 55ºC – 1min, 72ºC
– 1 min; seguido de uma extensão de 72ºC por 3 minutos.
O material amplificado foi submetido a uma corrida eletroforética em gel de
agarose 2%, corado com brometo de etídio e visualizado em transiluminador através
da incidência da luz Ultra Violeta (UV).
24
Fluxograma dos testes realizados para análise das amostras
Escovado Cervical
(UCM – Digene)
Estração do DNA
(BloodClean e QIAamp)
PCR - β globina
Não Reativo
Reativo
PCR – DNA HPV – Região L1
Não Reativo
Reativo
Seqüenciamento do DNA viral
25
III-7 Seqüenciamento de DNA
As amostras que apresentaram resultado reativo no PCR para DNA HPV foram
submetidas ao seqüenciamento de DNA para tipagem do vírus HPV específico de
cada uma das amostras reativas.
O material foi amplificado por PCR para DNA HPV com volume final de 100μL,
seguindo as mesmas concentrações e mesmo ciclo descritos no item anterior. Foram
utilizados 24μL de DNA extraído. Para aumentar a concentração do DNA nas amostras
que apresentaram um fragmento amplificado de baixa intensidade, o material foi
amplificado mais uma vez alterando a temperatura de anelamento para 42ºC ao invés
de 55ºC, o tempo de 1 minuto foi mantido. A presença do fragmento de 450bp foi
confirmada após corrida eletroforética em gel de agarose 2%, utilizando todo o volume
de DNA amplificado. O fragmento de 450bp foi recortado do gel de agarose e o
genoma amplificado foi extraído utilizando o ConcertTM Gel Extraction Systems (Life
Technologies – GIBCO/BRL) seguindo a orientação na ficha técnica do fabricante
(Esquema 1)
Esquema 1 - Excisão do fragmento amplificado do gel de agarose 2%
O fragmento é colocado em tubo
tipo ependorff. Seguir orientação
do fabricante para extração do
amplificado
Após esse procedimento o material foi quantificado a partir do uso do Low DNA
Mass (Invitrogen) de acordo com a comparação da intensidade do fragmento com a
escala do Low DNA Mass em gel de agarose 2%. Quando a quantificação do DNA foi
menor que 10ng/μL o material foi seco em centrífuga a vácuo e ressuspenso em 11μL
de tampão TE (Tris, EDTA) para concentrar o DNA antes de submetê-lo ao
seqüenciamento cíclico.
26
III-7A Seqüenciamento cíclico
O seqüenciamento cíclico foi realizado utilizando-se o material extraído do gel
com concentração de 75 ng a 160 ng de DNA viral amplificado. Para a reação foi
utilizado o ABI PRISM
®
Big Dye
®
Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing kit (Applied
Biosystems) de acordo com ficha técnica do fabricante e foram utilizados 7.0 pmol do
primer “reverse” MY09. O microtubo contendo os reagentes e o DNA amplificado foi
colocado no termociclador (GeneAmp PCR System 2400 – Applied Biosystems) e
submetido a 25 ciclos de: 96ºC por 10 seg, 50ºC por 15 Seg, 60ºC por 4 min. Durante
essa etapa ocorre a adição dos dideoxinucleotídeos (ddNTP) de terminação marcados
com fluorocromo.
III-7B Purificação em coluna CentriSep
O material foi purificado em coluna CentriSep (Applied Biosystems), uma coluna
contendo agarose, utilizada para reter fragmentos menores que 16 bp e ddNTP não
incorporados, seguindo ficha técnica do fabricante. O DNA marcado com ddNTP e
purificado é seco mais uma vez em centrífuga a vácuo, ressuspenso em Template
Suspenssion Reagent - TSR (Applied Biosystem) e aplicado no sequenciador (ABI
Prism 310 Genetic Analyser e 3.100 Genetic Analyser – Applied Biosystem).
III-7C Análise do resultado
A seqüência obtida pelo seqüenciador foi comparada com todas as seqüências
disponíveis
no
GeneBank
usando
o
servidor
BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), o tipo do HPV foi identificado com base em
homologia maior ou igual a 97%. Nos casos em que a homologia sugerida foi menor
que 97% o tipo de HPV é sugerido e não determinado.
27
Fluxograma da reação de seqüenciamento de DNA viral das amostras analisadas
PCR – DNA HPV – Vf = 100μL
Corrida eletroforética – agarose 2%
Excisão do fragmento amplificado do gel
Quantificação do DNA – Low DNA Mass
< que 75 ng de DNA
75 ng a 160 ng de DNA
Cycle Sequencing
Purificação em CentriSep
Aplicação no seqüenciador
Análise do resultado
GeneBank BLAST
28
RESULTADOS
IV- Resultados
Foram analisadas 196 amostras de escovado cervical: 72 amostras de
escovado cervical de gestantes atendidas no HUGG, 93 provenientes do HUPE e 31
amostras de gestantes atendidas no IFF. Das 196 amostras 38 eram soropositivas
para HIV-1 sendo 7 amostras do HUPE, 10 do IFF e 21 do HUGG. Todas as gestantes
provenientes do HUGG e do IFF foram analisadas clinicamente no momento da coleta
quanto à presença de condiloma acuminado, diagnóstico de NIC III e o histórico
passado de infecção por HPV também foi avaliado.
As amostras coletadas no Hospital Universitário Pedro Ernesto foram analisadas
pela instituição por exame citológico – Papanicolau – além dos exames clínicos e
histórico passado.
Após coleta e extração do DNA, o extraído foi submetido a PCR para o gene
humano da β-globina (Figura 4). Todas as amostras analisadas apresentaram
resultado reativo para PCR da β-globina.
Figura nº 4 - Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para β-globina (268bp). As
amostras reativas estão representadas em vermelho
01
02
03
04 05
06
07
08 09 10
11
12 13
14 15 16
17 18 19
20
268 bp
Descrição das cavidades
1- HUPE 44
2- HUPE 48
3- HUPE 49
4- HUPE 50
5- HUPE 51
6- HUPE 52
7- HUPE 75
8- HUPE 76
9- HUPE 77
10- HUPE 78
11- Ladder 50bp
12- HUPE 79
13- HUPE 80
14- HUPE 81
15- HUPE 82
16- HUPE 83
17- HUPE 84
18- HUPE 85
19- HUPE 86
20- HUPE 87
29
Após a confirmação da extração do DNA por PCR para β-globina todas as
amostras foram submetidas para análise da presença de DNA HPV utilizando a técnica
de PCR. A seqüência alvo é um fragmento de 450bp da região L1 do genoma do HPV.
Foi utilizado como controle positivo (CP) um plasmídeo que contém genoma do HPV,
além de um controle biológico. Das 196 amostras 56 apresentaram reatividade para
presença de DNA HPV sendo 27 amostras colhidas no HUPE (Figuras de 5 a 10), 22
amostras provenientes do HUGG (Figuras de 11 a 15) e 7 amostras colhidas no IFF
(Figuras de 16 a 17).
Figura nº 5 - Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do HUPE: HUPE 01 a 07. As amostras reativas estão representadas em
vermelho.
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
450 bp
Descrição das cavidades
1- HUPE 01
2- HUPE 02
3- HUPE 03
4- HUPE 04
5- HUPE 05
6- Ladder 50 bp
7- HUPE 06
8- HUPE 07
9- CP- Plasmídeo
10- CN água mQ
Figura nº 6 - Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do HUPE: Amostras HUPE 08 a HUPE 23 As amostras reativas estão
representadas em vermelho.
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17
450 bp
Descrição das cavidades
1- HUPE 08
2- HUPE 09
3- HUPE 10
4- HUPE 11
5- HUPE 12
6- HUPE 15
7- HUPE 16
8- Ladder 50bp
9- HUPE 17
10- HUPE 18
11- HUPE 20
12- HUPE 21
17- CN água mQ
13- HUPE 22
14- HUPE 23
15- CP Plasmídeo
16- CP Biológico
30
Figura nº 7 - Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do HUPE: Amostras HUPE 24 a HUPE 37. As amostras reativas estão
representadas em vermelho.
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17
450 bp
Descrição das cavidades
1- HUPE 24
2- HUPE 25
3- HUPE 26
4- HUPE 27
5- HUPE 28
6- HUPE 29
7- Ladder 50bp
8- HUPE 30
9- HUPE 31
10- HUPE 32
11- HUPE 34
12- HUPE 35
17- CN água mQ
13- HUPE 36
14- HUPE 37
15- CP Plasmídeo
16- CN Biológico
Figura nº 8 - Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do HUPE: Amostras HUPE 38 a HUPE 50. As amostras reativas estão
representadas em vermelho
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17
450 bp
Descrição das cavidades
1- HUPE 38
2- HUPE 39
3- HUPE 40
4- HUPE 41
5- HUPE 42
6- HUPE 43
7- HUPE 44
8- HUPE 45
9- Ladder 50bp
10- HUPE 46
11- HUPE 47
12- HUPE 48
13- HUPE 49
14- HUPE 50
15- CP Plasmídeo
16- CN Biológico
17- CN água mQ
31
Figura nº 9 -Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do HUPE: Amostras HUPE 51 a HUPE 74. As amostras reativas estão
representadas em vermelho
01
02 03 04 05 06
07 08 09 10
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
450 bp
450 bp
Descrição das cavidades
1- HUPE 51
2- HUPE 52
3- HUPE 53
4- HUPE 54
5- HUPE 55
6- Ladder 50bp
7- HUPE 56
8- HUPE 57
9- HUPE 58
10- HUPE 59
11- HUPE 60
12- HUPE 61
13- HUPE 62
14- HUPE 63
15- HUPE 64
16- HUPE 65
17- HUPE 66
18- Ladder 50bp
19- HUPE 67
20- HUPE 68
21- HUPE 69
22- HUPE 70
23- HUPE 72
24- HUPE 73
25- HUPE 74
26- CP Plasmídeo
27- CN Biológico
28- CN água mQ
Figura nº 10 - Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do HUPE: Amostras HUPE 75 a HUPE 100. As amostras reativas estão
representadas em vermelho
01
02 03 04 05 06
07 08 09 10
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
450 bp
450 bp
Descrição das cavidades
1- HUPE 75
2- HUPE 76
3- HUPE 77
4- HUPE 78
5- HUPE 79
6- Ladder 50bp
7- HUPE 80
8- HUPE 81
9- HUPE 82
10- HUPE 83
11- HUPE 84
12- HUPE 85
13- HUPE 86
14- HUPE 87
15- HUPE 88
16- HUPE 90
17- HUPE 92
18- Ladder 50bp
19- HUPE 93
20- HUPE 94
21- HUPE 95 26- HUPE 100
22- HUPE 96 27-CP Plasmídeo
23- HUPE 97 28- CN água mQ
24- HUPE 98
25- HUPE 99
32
Figura nº 11 - Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do HUGG: Amostras HUGG 01 a HUGG 21. As amostras reativas estão
representadas em vermelho.
16 17
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15
18
19
20 21
22
23 24 25
450 bp
Descrição das cavidades
1- HUGG 01
2- HUGG 02
3- HUGG 03
4- HUGG 04
5- HUGG 05
11- HUGG 10
12- HUGG 11
13- HUGG 12
14- CP Plasmídeo
15- CN água mQ
6- HUGG 06
7- HUGG 07
8- Ladder 50bp
9- HUGG 08
10- HUGG 09
16- HUGG 13
17- HUGG 14
18- HUGG 15
19- HUGG 16
20- HUGG 17
21- Ladder 50bp
22- HUGG 18
23- HUGG 19
24- HUGG 20
25- HUGG 21
Figura nº 12 -Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do HUGG: Amostras HUGG 22 a HUGG 33. As amostras reativas estão
representadas em vermelho
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
450 bp
Descrição das cavidades
1- HUGG 22
2- HUGG 23
3- HUGG 24
4- HUGG 25
5- HUGG 26
6- HUGG 27
7- HUGG 28
8- HUGG 29
9- Ladder 50bp
10- HUGG 30
11- HUGG 31
12- HUGG 32
13- HUGG 33
14- CP Plasmídeo
15- CN água mQ
33
Figura nº 13 - Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do HUGG: Amostras HUGG 34 a HUGG 48. As amostras reativas estão
representadas em vermelho.
01
02
03
04
05 06
07
08
11
09 10
12
13
14
15
16
17
18
19
450 bp
450 bp
Descrição das cavidades
1- HUGG 34
2- HUGG 35
3- HUGG 36
4- HUGG 37
5- HUGG 38
6- Ladder 50bp
7- HUGG 39
8- HUGG 40
9- HUGG 41
10- HUGG 42
11- HUGG 43
12- HUGG 44
13- HUGG 45
14- HUGG 46
15- Ladder 50bp
16- HUGG 47
17- HUGG 48
18- CP Plasmídeo
19- CN água mQ
Figura nº 14 - Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do HUGG: Amostras HUGG 49 a HUGG 55 e IFF 31. As amostras reativas estão
representadas em vermelho
01
02
03 04
05
06
07
08
09 10
450 bp
Descrição das cavidades
1- HUGG 49
2- HUGG 50
3- HUGG 51
4- HUGG 52
5- HUGG 53
6- Ladder 50bp
7- HUGG 54
8- HUGG 55
9- IFF 31
10- CP Plasmídeo
34
Figura nº 15 - Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do HUGG: Amostras HUGG 56 a HUGG 72. As amostras reativas estão
representadas em vermelho.
Repetição das amostras
HUGG 65 a HUGG 72
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
01 02 03 04 05 06 07 08 09
450 bp
450 bp
Descrição das cavidades
1- HUGG 56
2- HUGG 57
3- HUGG 58
4- HUGG 59
5- Ladder 50bp
6- HUGG 60
7- HUGG 61
8- HUGG 62
9- HUGG 63
10- HUGG 64
11- HUGG 65
12- HUGG 66
13- HUGG 67
14- HUGG 68
15- Ladder 50bp
16- HUGG 69
17- HUGG 70
18- HUGG 71
19- HUGG 72
20- CP Plasmídeo
Descrição das cavidades do gel de repetição das amostras HUGG 65 a HUGG 72
1- HUGG 65
2- HUGG 66
3- HUGG 67
4- HUGG 68
5- Ladder 50bp
6- HUGG 69
7- HUGG 70
8- HUGG 71
9- HUGG 72
Figura nº 16 - Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do IFF: Amostras IFF01 a IFF 18. As amostras reativas estão representadas em
vermelho.
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
450 bp
450 bp
Descrição das cavidades
1- IFF 01
2- IFF 02
3- IFF 03
4- IFF 04
5- Ladder 50bp
6- IFF 05
7- IFF 06
8- IFF 07
9- CP Plasmídeo
10- CN água mQ
11- IFF 08
12- IFF 09
13- IFF 10
14- IFF 11
15- IFF 12
16- IFF 13
17- Ladder 50bp
18- IFF 14
19- IFF 15
20- IFF 16
21- IFF 17
22- IFF 18
23- CP Plasmídeo
24- CN água mQ
35
Figura nº17 -Gel de agarose 2% demonstrando o resultado de PCR para DNA HPV (450bp) das
amostras procedentes do IFF: Amostras IFF 19 a IFF 30. As amostras reativas estão representadas
em vermelho.
01 02 03 04 05 06
07 08 09 10 11 12 13 14
15 16
450 bp
Descrição das cavidades
1- IFF 19
2- IFF 20
3- IFF 21
4- IFF 22
5- IFF 23
6- IFF 24
7- Ladder 50bp
8- IFF 25
9- IFF 26
10- IFF 27
16- CN água mQ
11- IFF 28
12- IFF 29
13- IFF 30
14- CP Plasmídeo
15- CN Biológico
Das 196 amostras analisadas, 38 eram soropositivas para HIV-1 e 158
soronegativas para HIV-1. Foram reativas para DNA HPV 56 amostras sendo 18
soropositivas para HIV-1 e 38 amostras soronegativas para HIV-1 (Gráfico 1)
Gráfico 1- Relação das amostras soropositivas para HIV-1 e soronegativas para HIV-1 e
presença de DNA HPV
160
24.1% (38)
140
Nº de amostras
analisadas
120
100
75.9% (120)
80
HPV +
HPV -
60
40
47,4% (18)
20
52,6% (20)
0
HIV -
HIV +
36
Das 56 amostras reativas para DNA HPV, 7 amostras (12.5%) apresentavam
lesão condilomatosa no colo ou vagina no momento da coleta, uma amostra
apresentava diagnóstico NICIII, e duas amostras apresentavam diagnóstico passado
de infecção por papilomavírus. A amostra HUGG 06 apresentava lesão condilomatosa
na vagina mas a análise por PCR para DNA HPV foi NÃO REATIVA. A partir dessas
informações é possível concluir que 10 amostras apresentaram infecção produtiva por
HPV e 46 amostras apresentaram infecção latente. Das 10 amostras com infecção
produtiva, 7 amostras eram soropositivas para HIV-1, e 3 amostras soronegativas para
HIV-1. As 46 amostras que apresentaram infecção latente, 11 eram soropositivas para
HIV-1 e 35 soronegativas para HIV-1 (Gráfico 2).
Gráfico 2 – Análise da infecção produtiva e infecção latente por papilomavírus nas
amostras reativas para DNA HPV
60
50
Nº de amostras 40
analisadas
92% (35)
30
HIV -
20
HIV+
30 % (3)
70 % (7)
10
18 % (11)
0
Infec
Latente
Infec
Produtiva
Todas as amostras reativas para DNA HPV foram submetidas à técnica de
seqüênciamento do DNA para tipagem do vírus HPV. O eletroferograma foi analisado,
o resultado do seqüênciamento submetido ao GeneBank – BLAST – que analisou a
homologia da seqüência requerida com as seqüências já descritas em seu banco de
dados (Figuras 18 e 19).
37
Figura 18 – Exemplo do eletroferograma fornecido pelo seqüênciador pós análise da
amostra. Eletroferograma referente à amostra HUPE 85.
A figura acima demonstra a análise do DNA através dos picos de sinal formado
pelas bases marcadas inseridas na seqüência alvo, e o tamanho do fragmento
amplificado. O pico de cor preto revela a base guanina (G), o de cor verde a base
adenina (A), o vermelho a base timina (T) e o azul a base citosina (C).
38
Figura 19 – Representação da análise da seqüência obtida pelo seqüenciador
utilizando o GeneBank – BLAST. O resultado é referente à análise da amostra HUPE
85.
Na figura acima pôde-se determinar que o tipo de DNA HPV dessa amostra é do
tipo 16 do leste asiático, onde AF 534061.1 é o número da seqüência que foi utilizada
para comparação com a amostra analisada pelo GeneBank. Além disso esse resultado
também fornece o valor de homologia entre as duas seqüências, que neste caso foi de
99%, com 405 bases analisadas aproximadamente.
39
De acordo com o resultado do seqüenciamento, das 56 amostras submetidas a
esse processo de análise do DNA, 8 amostras (HUGG 36, HUGG 50, HUGG 61,
HUPE 22, HUPE 63, HUPE 67, HUPE 70 e HUPE 88) não foram seqüenciadas devido
a concentração insuficiente de DNA HPV (< 75ng). Nove amostras foram tipadas como
DNA humano – Homo Sapiens BAC RP11-420A23. O tipo de DNA HPV foi
determinado quando a seqüência analisada apresentava homologia ≥ 97% com a
seqüência comparada pelo BLAST. Quando a homologia foi menor que 97% o tipo
detectado foi sugerido mas não determinado. Nove amostras sugerem infecção por
mais de um tipo de HPV, em 26 amostras o tipo de DNA HPV foi determinado e em
uma amostra (IFF 08) a seqüência analisada foi determinada como sendo gene maior
do capsídeo viral com 98% de homologia sendo que o tipo mais próximo encontrado
foi o isolado CY22-889 com 85% de homologia. O total de 48 amostras foram
analisadas. Na tabela 1 a seguir demonstra a reatividade para PCR HPV e os
diferentes tipos de DNA HPV, grau de homologia encontrado nas amostras analisadas
procedentes do IFF, soropositividade para HIV-1 e presença de lesão condilomatosa
durante a colheita de material.
Tabela 1 – Resultado das análises referentes ao PCR DNA HPV, seqüenciamento de
DNA e indicação clínica das amostras procedentes do IFF.
AMOSTRA
PCR DNA HPV
TIPAGEM POR SEQÜÊNCIAMENTO
450 bp
HPV 11 (100%)
IFF06
450 bp
IFF08
450 bp
HPV 53 (99%)
HPV gene maior do capsídeo (98%) ; HPV
isolado CY22-889 (85%)
450 bp
HPV 33, isolado IS549 (99%)
450 bp
450 bp
450 bp
HPV isolado Bsb-63 (99%); isolado Bsb-61
(99%); HPV 53 (98%)
HPV 11 (99%)
HPV isolado Bsb-61 (100%)
IFF02
IFF10
**
**
#
IFF20
#
IFF26
IFF28
**
INDICAÇÃO CLÍNICA
Multiplas lesões de
condiloma na vagina e
anus. HIV +
HIV+
HIV+
Condiloma acuminado.
HIV+
S/ clínica
S/ clínica
Condiloma acuminado
HIV+
** Infecção produtiva por HPV e infecção mista HIV/HPV

infecção latente e mista HIV/HPV
#
infecção latente por HPV
40
A tabela 2 demonstra os resultados referentes à análise das amostras
procedentes do Hospital Universitário Gaffrée e Guinle (HUGG). Estão relacionados
reatividade por PCR HPV e os diferentes tipos de DNA HPV, grau de homologia
encontrados nas amostras analisadas, soropositividade para HIV-1 e presença de
lesão condilomatosa durante a colheita de material. Seis amostras apresentaram
infecção latente e mista HIV/ HPV, em duas amostras foi observada infecção produtiva
e mista HIV e HPV (HUGG 02 e HUGG 51). O DNA HPV foi detectado em sete
amostras sendo que na amostra HUGG 53 não foi determinado o tipo, nas amostras
HUGG 35 e HUGG 44, HUGG 68 foi detectado DNA humano e o seqüenciamento não
foi possível nas amostras: HUGG36, HUGG 50, HUGG 61. A amostra HUGG 30 de
acordo com os exames laboratoriais apresenta infecção produtiva e mista sendo que
no seqüenciamento foi detectado DNA humano. Seis amostras foram detectadas com
presença de DNA HPV, e tipadas.
41
Tabela 2 – Resultado das análises de PCR, seqüenciamento de DNA e informação
clínica das amostras procedentes do HUGG.
AMOSTRA
HUGG 01 
**
HUGG 02
RESULTADO
DE PCR HPV
450 bp
450 bp
TIPAGEM POR SEQUENCIAMENTO
HPV 31 (98%)
HPV 6 (98%)
HUGG 05 
HUGG 10 
HUGG 25 
HUGG 26 
HUGG 27 
HUGG 30 Û
450 bp
450 bp
450 bp
450 bp
450 bp
450 bp
HUGG 35 Û
450 bp
HUGG 36 Û
#
HUGG 39
HUGG 44 Û
450 bp
450bp
450 bp
#
450 bp
HPV 31 (99%)
HPV 58 isolado IS068 (100%)
HPV 16 tipo do leste asiático (99%)
HPV 16 tipo do leste asiático (99%)
HPV isolado CY09-407 (97%)
Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23
(100%)
Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23
(99%)
Baixa concentração de DNA
HPV 53 (94%)
Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23
(99%)
HPV 39 Isolado IS065 (99%)
HUGG 46
HUGG 50 Û
**
HUGG 51
#
450 bp
450 bp
450 bp
HPV 59 (94%)
Baixa concentração de DNA
HPV 16 tipo do leste asiático (99%)
HUGG 53 Û
#
HUGG 56
#
HUGG 60
450 bp
450 bp
450 bp
HUGG 61 Û
#
HUGG 63
HUGG68 Û
450 bp
450 bp
450 bp
HPV L1 gene clone DL416 (99%)
HPV 16 tipo do leste asiático (99%)
HPV isolado IS887 (99%); isolado IS1019
(99%); isolado MM4 (99%);
Baixa concentração de DNA
HPV 86 (90%)
Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23
HUGG 45
INFORMAÇÃO CLÍNICA
HIV +
Condiloma no colo
HIV +
HIV +
HIV +
HIV +
HIV +
HIV +
Condiloma plano no colo
HIV +
S/ clínica
S/ clínica
S/ clínica
S/ clínica
Diagnóstico clínico passado
(12 de 2002)
S/ clínica
S/ clínica
NIC III
HIV+
S/ clínica
S/ clínica
S/ clínica
S/ clínica
S/ clínica
S/ clínica
** Infecção produtiva por HPV e infecção mista HIV/HPV

Infecção latente e mista HIV/HPV
#
Infecção latente por HPV
Û
Reativas para PCR HPV não tipadas por seqüenciamento
42
As amostras procedentes do HUPE foram analisadas também quanto à infecção
mista, infecção produtiva ou latente e tipo de HPV responsável pela infecção. Além
desses resultados, essas amostras possuem resultado de exame citológico
(papanicolau). De acordo com os resultados da análise por biologia molecular foi
observado reatividade em 27 (29%) amostras das 93 analisadas. A citologia não foi
sugestiva de Infecção por HPV em nenhuma amostra, inclusive nas amostras que
apresentavam lesões sugestivas de infecção por papilomavírus. Devido à baixa
concentração de DNA HPV o seqüenciamento não foi possível em 5 amostras (HUPE
22, HUPE63, HUPE 70 e HUPE 88). Em cinco amostras a análise por seqüenciamento
detectou DNA humano – Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23.
O tipo de
papilomavírus foi determinado em 17 amostras das 22 amostras seqüenciadas
procedentes do HUPE sendo que a amostra HUPE 81 foi sugerida uma infecção por
mais de um tipo de HPV, com 94% de homologia pela análise do BLAST. Em outras
seis amostras (HUPE 44, HUPE 49, HUPE 52, HUPE 53, HUPE 62 e HUPE 85) a
infecção por mais de um tipo de HPV é sugerida. Na amostra HUPE 47 foi detectada
infecção produtiva e mista HIV/ HPV. Em três amostras (HUPE 08, HUPE 52e HUPE
81) foi detectada infecção latente por HPV e infecção mista HIV/HPV. Em onze
amostras foi detectado infecção latente por HPV e em duas amostras infecção
produtiva por HPV (HUPE 45 e HUPE 49).
43
Tabela 3 – Resultado das análises por PCR, seqüenciamento e informações clínicas
(papanicolau, diagnóstico clínico e indicação clínica) das amostras procedentes do HUPE
AMOSTRAS
RESULTADO
DE PCR HPV
450 bp
TIPAGEM POR SEQÜENCIAMENTO
INFORMAÇÂO CLÍNICA
HPV 58 isolado IS068 (99%)
#
450 bp
HPV 58 isolado IS068 (99%)
HUPE 12
#
HUPE 17
HUPE 22 Û
#
HUPE 34
#
HUPE 44
#
450 bp
450 bp
450 bp
450 bp
450 bp
HUPE 45 ƒ
450 bp
HPV 35H (100%)
HPV 53 (99%)
Baixa concentração de DNA
HPV isolado LVX160 (97%)
HPV 54 (97% - 452 NT); HPV Xc (100% - 99
NT)
HPV 31 (99%)
HIV+
Colpite inespecífica
Candida sp e Tricomonas
vaginalis
Vaginose
Colpite bacteriana
vaginose
Colpite bacteriana
S/ coleta
HUPE 47 **
450 bp
HPV 6b (99%)
HUPE 49 ƒ
450 bp
HUPE 52 
450 bp
HPV 33 (99%), isolado IS549 (99%), isolado
IS267 (99%)
HPV 61 (98%); HPV A61 (98%)
#
450 bp
HUPE 62
HUPE 63 Û
#
HUPE 66
#
450 bp
450 bp
450 bp
HUPE 67 Û
#
HUPE 69
Û
HUPE 70
HUPE 72 Û
HUPE 74 Û
HUPE 75 Û
HUPE 81 
450 bp
450 bp
450 bp
450 bp
450 bp
450 bp
450 bp
HUPE 82 Û
#
HUPE 85
450 bp
450 bp
HUPE 88 Û
HUPE 92 Û
#
HUPE 98
450 bp
450 bp
450 bp
HUPE 08 
HUPE 09
HUPE 53
HPV isolado CY08-410 (98%); isolado LVX160
(98%); HPV AE1 (98%)
HPV 61 (98%); HPV A61 [L1AE4] (98%)
Baixa concentração de DNA
HPV L1 gene (100%); HPV 68 isolado IS362
(98%)
Baixa concentração de DNA
HPV 61 (98%)
Baixa concentração de DNA
Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23 (98%)
Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23 (99%)
Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23 (99%)
HPV isolado CY08-410 (94%); isolado LVX160
(94%); HPV AE1 (94%); isolado SDL105 (94%)
Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23 (98%)
HPV isolado CY07-118 (99%); HPV16 tipo do
leste asiático (99%)
Baixa concentração de DNA
Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23 (98%)
HPV 61 (98%)
HPV em tratamento colpite
bacteriana
HIV+
Condiloma na vagina e colo
Suspeita de infecção por HPV
Candida sp
HIV +
Colpite bacteriana
Gardnerella vaginalis
Colpite inespecífica
S/ resultado citológico
Tricomonas vaginalis
Colpite inespecífica
Colpite Inespecífica
Colpite inespecífica
Gardnella vaginalis
S/ resultado citológico
Colpite inespecífica
HIV+
Colpite bacteriana
Candida sp
Colpite inispecífica
S/ resultado citológico
Colpite bacteriana
Colpite bacteriana
** Infecção produtiva por HPV e infecção mista HIV/HPV
Û
Reativas para PCR HPV não tipadas por seqüenciamento

Infecção latente e mista HIV/HPV
#
Infecção latente por HPV
ƒ
Infecção produtiva por HPV
44
A partir de 56 amostras seqüenciadas em 38 (67,8%) amostras foram definidos
os tipos de HPV. Em 18 amostras a tipagem do DNA HPV não foi possível: oito
amostras apresentaram baixa concentração de DNA, em 9 amostras foram detectados
DNA humano e em uma amostra (HUGG 53) a seqüência do gene L1 foi detectada
mas não foi possível a tipagem específica nessa amostra.
Vinte e seis tipos diferentes de HPV foram detectados e sete isolados
diferentes, sendo que em 9 amostras mais de um tipo foi detectado. No total de 33
diferentes tipos e isolados de HPV foram detectados. De acordo com os resultados
obtidos foi observada uma grande variabilidade de tipos diferentes na população de
gestantes analisada (Tabela 4, 5 e 6). Esses tipos também apresentam o risco
atribuído distintos sendo que foi observado um maior número de tipos e isolados (19)
de alto risco presente nessa população.
Tabela 4 – Os diferentes tipos de HPV de alto risco detectados e as respectivas
amostras onde estes foram detectados.
AMOSTRAS
Tipos de HPV
Risco Atribuído
HUGG 60
MM4
Alto risco
HUGG 60
Isolado IS1019
Alto risco
HUGG 60
Isolado IS887
Alto risco
IFF 20, IFF 28
Bsb 61
Alto risco
IFF 20
Bsb 63
Alto risco
HUGG 39, IFF 06,
53
Alto risco
HUGG 45
39 isolado IS065
Alto risco
HUGG 25, HUGG 26, HUGG 51,
16 leste asiático
Alto risco
31
Alto risco
IFF 10, HUPE 49
33 isolado IS549
Alto risco
HUPE 49
33 isolado IS267
Alto risco
HUPE 49
33
Alto risco
HUGG 10, HUPE 08,
58 isolado IS068
Alto risco
HUPE 53
L1 AE1
Alto risco
HUGG 46
59
Alto risco
HUPE 66
68 isolado IS362
Alto risco
HUPE 17, IFF 20
HUGG 56, HUPE 85
HUGG 01, HUGG 05,
HUPE 45
HUPE 09
45
Tabela 5 – Os diferentes tipos de HPV de baixo risco detectados e as
respectivas amostras onde estes foram detectados.
AMOSTRAS
Tipos de HPV
Risco Atribuído
HUGG 02
6
Baixo risco
HUPE 47
6b
Baixo risco
IFF 02, IFF 26
11
Baixo risco
HUPE 52, HUPE62
L1 AE4 (A61)
Baixo risco
HUPE 44
54
Baixo risco
HUPE 52, HUPE 62, HUPE 69,
61
Baixo risco
86
Baixo risco
HUPE 98
HUGG 63
Tabela 6 – Os diferentes tipos de HPV de risco desconhecido detectados e as
respectivas amostras onde estes foram detectados.
AMOSTRAS
Tipos de HPV
Risco Atribuído
HUPE 34, HUPE 53
LVX 160
Risco desconhecido
HUPE 44
Xc
Risco desconhecido
HUPE 12
35H
Risco desconhecido
HUPE 53, HUPE 81
CY 08410
Risco desconhecido
HUPE 85
CY 07118
Risco desconhecido
HUPE 81
SDL 105
Risco desconhecido
HUGG 27
CY 09407
Risco desconhecido
IFF 08
CY 22-889
Risco desconhecido
O gráfico 3 demonstra a distribuição do número absoluto de amostras
soropositivas para HIV-1 que apresentaram HPV de alto (10), baixo (5) e risco
desconhecido (3). As amostras soronegativas para HIV-1 apresentaram o seguinte
resultado: 10 amostras tipadas como alto risco, 5 amostras como baixo risco e 5
amostras como risco desconhecido.
46
Gráfico 3 – Distribuição dos tipos detectados quanto ao risco atribuído: baixo
risco, alto risco e risco desconhecido.
60
50
Nº de amostras
analisadas
40
HIV -
30
HIV+
20
10
10
10
0
ALTO
RISCO
5
5
BAIXO
RISCO
5
3
RISCO
DESCONHECIDO
VI –1 Análises Estatísticas
Foi realizado o teste de estimação da proporção populacional (P) (CallegariJaques SM, 2004) para observarmos se a porcentagem de amostras HPV reativas nas
amostras de gestantes soropositivas e soronegativas para HIV-1, representa uma
proporção verdadeira na população da cidade do Rio de Janeiro.
Foram utilizadas duas fórmulas diferentes. Para a população amostral de gestantes
soropositivas para HIV-1 foi utilizada a fórmula aplicada quando a proporção de
sucesso da amostra (p) for um valor entre 0,3 e 0,7. Neste caso, p =0,47. O resultado
desta análise conclui que os limites para o intervalo de 95% de confiança (IC
95%)
para
47
a porcentagem verdadeira de gestantes soropositivas para HIV , é 30% - 63%. A
porcentagem de 47.4% de DNA do HPV em gestantes soropositivas para HIV-1 estima
uma proporção verdadeira de DNA do HPV na população de gestantes soropositivas
para HIV-1 na cidade do Rio de Janeiro.
Para a população amostral de gestantes HIV-1 soronegativas foi utilizada a fórmula
aplicada quando a proporção de sucesso da amostra (p) for um valor menor que 0,3 e
maior que 0,7. Neste caso, p =0,24. O resultado desta análise conclui que os limites
para o intervalo de 95% de confiança (IC
95%)
para a porcentagem verdadeira de
gestantes soronegativas para HIV , é 18% - 31%. A porcentagem de 24.1% de DNA do
HPV em gestantes soronegativas para HIV-1 estima uma proporção verdadeira de
DNA do HPV na população de gestantes soronegativas para HIV-1na cidade do Rio de
Janeiro.
O teste do Qui Quadrado (X2) com correção de Yates (Callegari-Jaques SM,
2004) foi realizado a partir de grau de liberdade 1 e tabela de contingência 2x2 (Tabela
7).
Tabela 7 – Tabela de contingência 2x2 representativa com os dados obtidos e
utilizados para análise por teste de associação Qui Quadrado com correção de Yates
HIV
HPV
Total de amostra
R*
NR **
R*
38
18
56
NR **
120
20
140
158
38
196
Total de amostra (nº)
(nº)
R * - Reativo ; NR ** - Não Reativo
48
Os dados acima foram aplicados na fórmula alternativa para o cálculo do X2 em
tabelas 2x2 (Callegari-Jaques SM, 2004). O X2 calculado foi igual a 7,0586 que é
menor que o X2 crítico para α= 0,05 (5.024), a partir daí, rejeita-se a independência
entre presença de HIV e de HPV. Conclui-se, então que gestantes soropositivas para
HIV-1apresentam maior freqüência de DNA do HPV (18/38 ou 47.4%) dos que
gestantes soronegativas para HIV-1 (24,1%).
49
DISCUSSÃO
V- Discussão
Muitas técnicas usadas em biologia molecular têm sido desenvolvidas para a
detecção do DNA do HPV. Estas envolvem hibridização in situ, Southern blot, PCR e
Captura do Híbrido. A citologia morfológica e os critérios histológicos ainda são as
técnicas mais utilizadas para avaliar infecção por papilomavírus. O diagnóstico
citológico é orientado pela presença de coilócitos (célula alterada pela presença do
vírus). Com base em alguns estudos o reconhecimento da presença de coilócitos não
é um critério preciso de diagnóstico para infecção por HPV (Bongain, A. et al 1996). Na
tentativa de uma detecção precoce de infecção por este vírus, a PCR tem sido
aplicada para a detecção do DNA viral em amostras clínicas. Estão disponíveis
inúmeros ensaios de PCR com diferentes primers tipo específicos ou gerais que
abrangem um espectro maior de tipos a serem detectados. (Evander M., et al 1991;
Castle, P. E. et al 2002; Chan, P. K et al 2002).
O genoma do HPV consiste em sete regiões “Early” (E1-E7) e duas regiões
“Late” (L1 e L2). Além de regiões muito variáveis os HPVs também compartilham de
uma grande homologia em certas regiões do seu genoma. Regiões semelhantes entre
os diferentes tipos conhecidos são utilizadas para a construção dos primers consenso
ou universais que podem amplificar diferentes genótipos do HPV. Existem muitos
primers consenso desenhados para região L1 (Manos, M.M. et al 1989; Yoshikawa, H.
et al 1990) e para região E6/ E7 do genoma do HPV (Resnick, R.M. et al, 1990).
Durante a integração do genoma viral no DNA da célula hospedeira, principalmente em
estágio de neoplasia, partes da região L1 podem estar deletadas e, nesse caso, os
primers consenso podem não encontrar a região L1. Quando em comparação com
primer para região E6, L1-PCR apresenta um amplo espectro de detecção de DNA
HPV e é mais usado para detecção de DNA HPV (Evander, M. et al 1992; Husnjak, K.
et al 2000).
Snijders e colaboradores desenvolveram, em 1990, um protocolo para PCR
utilizando os primers GP5 e GP6 que amplificam na região L1, um fragmento interno,
permitindo amplificar apenas 11 tipos diferentes de HPV.
50
Husnjak e colaboradores no ano de
2000 compararam cinco protocolos
diferentes da metodologia de PCR para detecção de DNA HPV. Analisaram 164
amostras de raspados cervicais que apresentavam exame citológico anormal. Foram
usados três conjuntos de primers todos específicos para região L1: MY09/MY11,
L1C1/L1C2-1/L1C2-2 e pI-1/pI-2. Os conjuntos MY e LC foram os mais eficientes
detectando o DNA HPV em 62.2% das amostras.
Primers tipo específicos normalmente não amplificam a região L1. Para HPV-6 e
11 a região alvo é E6/E7 assim como para HPV-16 e HPV-18 (Soler C et al, 1991). O
primer tipo específico para HPV-33 foi desenhado para amplificar a região E1/E2 do
vírus (van den Brule AJC, et al 1989).
Nosso trabalho foi realizado utilizando-se protocolo de PCR para detecção de
DNA do HPV com primers MY11 e MY 09 (Manos, M.M. et al 1989) que localizam a
região L1 do genoma do HPV. São primers degenerados que possuem 24 pares de
bases e são capazes de identificar mais de 25 tipos diferentes de HPV genitais. O fato
de serem primers consenso degenerados está diretamente ligado ao amplo espectro
de tipos de DNA do HPV detectáveis (Husnjak, K. et al 2000).
A padronização da metodologia de PCR originou-se no protocolo de Manos e
colaboradores de 1989, Bernard H-U e colaboradores de 1994 e foi adaptada para as
condições de trabalho do nosso laboratório. A técnica de seqüenciamento de DNA foi
utilizada para especificar o tipo de papilomavírus encontrado em cada amostra
analisada. Foram possíveis 33 detecções entre os diferentes tipos, isolados e subtipos
de HPV na casuística estudada. Devido a esta variabilidade foi importante o
conhecimento do genótipo do HPV de cada amostra possivelmente infectada. O
seqüenciamento foi realizado a partir da amplificação do DNA, pela utilização do
primer reverso (MY09), tendo permitido a detecção do tipo de HPV em 67,8% das
amostras. Foram necessárias as analises do número de nucleotídeos pareados e a
porcentagem de concordância entre as seqüências obtidas com aquelas fornecidas
pelo Gene Bank. A concordância entre 98% e 100% determinava o tipo específico de
HPV. Para concordância menor do que 97% o tipo de HPV foi sugerido. Estas
51
amostras podem inferir a existência de um novo tipo ou isolado de papilomavírus de
acordo com os dados da literatura (Johnson T. et al, 2003; Muñoz N. et al, 2003).
Os tipos encontrados em maior número foram: HPV-53 de alto risco em 4
amostras, HPV-16 do leste asiático de alto risco em 5 amostras e o HPV-61 de baixo
risco também em 4 amostras.
A presença de DNA HPV (24.1%) encontrada nas amostras soronegativas para
HIV-1 foi menor que outras reportadas por outros autores em estudos realizados no
Brasil e maior que um estudo realizado em Hong Kong: 48% (Armbruster-Moraes E et
al, 2000), 76% (Rabelo-Santos SH et al, 2003), 62% (Câmara G. N. L. et al, 2003) e
10.4% (Chan PKS et al, 2002).
Armbruster-Moraes e colaboradores em 2000 analisaram 125 amostras de
células cervicovaginais de gestantes que apresentavam exame de papanicolau
alterado. Foi detectada a presença de DNA HPV por hibridização slot-blot em 48% das
amostras, e a tipagem realizada para detecção de tipos específicos, sendo encontrada
a freqüência de 22.4% de HPV-16, 17.6% de HPV-18, 4.0% de infecção mista HPV-16
e HPV-18 e 4.0% de HPV 33.
Outro estudo realizado em mulheres grávidas por Chan e colaboradores em
2002 na cidade de Hong Kong, analisou 308 amostras cervicais. O DNA HPV foi
detectado em 10.1% das amostras utilizando PCR com primers MY09/MY11 sendo
que essas gestantes HPV reativas 90% apresentavam exame citológico normal. A
tipagem foi realizada por seqüenciamento de DNA e os tipos mais encontrados foram o
HPV-16 e o HPV-58.
Rabelo-Santos e colaboradores em 2003 estimaram a prevalência e a
distribuição dos tipos de HPV em 74 mulheres não grávidas com neoplasia cervical
intraepitelial grau III (NIC III) e câncer cervical invasivo na cidade de Goiânia. As
amostras analisadas foram tecidos parafinados, e o DNA HPV foi amplificado a partir
do PCR para Região L1 com os primers GP5+/GP6+ e o produto amplificado tipado
por hibridização dot blot usando probes específicos para os tipos de DNA HPV. A
52
prevalência do DNA HPV foi de 76% e o tipo mais encontrado foi o 16 e o 18 como
segundo mais prevalente.
Camara e colaboradores em 2003 estudaram no Distrito Federal 129 amostras
de raspado cervical de mulheres que apresentavam testes de Papanicolau anormais
mostrando leões pré-neoplásicas ou neoplásicas. O DNA HPV foi detectado por PCR
utilizando os primers MY09/MY11 e tipado pela técnica de polimorfismos de tamanhos
de fragmentos gerados por enzima de restrição (RFLP) e seqüenciamento de DNA. A
partir da detecção do DNA do HPV em 62% das amostras, o tipo 16 foi o mais
prevalente em 43.8% das amostras seguido pelo tipo 58 em 12.5%, o HPV-31 em 10%
e o HPV-53 em 6.3%.
De acordo com os nossos estudos, presença de DNA do HPV (47.4%) nas
amostras soropositivas para HIV-1 foi maior em relação às amostras soronegativas,
mas foi menor em relação aos dados existentes na literartura: 69% (Volkow P. et al,
2001), 64% (Spinillo A et al 2001), 98% (Levi JE et al, 2002), 64.5% (Levi JE et al,
2002).
Volkow em 2001 na cidade do México, analisou junto a colaboradores, 85
amostras de escovado cervical de mulheres não grávidas, soropositivas para HIV-1,
sem histórico de patologias ginecológicas conhecidas. O DNA HPV foi detectado por
PCR (MY09/MY11, GP5/GP6 e primers tipo específicos) em 69% das amostras. A
tipagem realizada por seqüenciamento nas amostras amplificadas para região L1,
apresentou 48% de tipos de alto risco e 14% de tipos de baixo risco, sendo o HPV-16
o mais freqüente, 69%.
Spinillo e colaboradores em 2001 na Itália estudaram secreções cervicovaginais
de 124 mulheres não grávidas soropositivas para HIV-1 e obteve por PCR, com
primers MY09/MY11, 64% de DNA HPV detectado. O material amplificado foi tipado
por RFLP para 8 tipos diferentes e foi encontrado em 8.9% das amostras o tipo 11 de
baixo risco seguido pelo 18 em 7.3% das amostras.
Em 2002 Levi e colaboradores realizaram um estudo com 208 mulheres
soropositivas para HIV-1 da cidade de São Paulo- Brasil, com objetivo de observar a
53
alta prevalência do HPV e a freqüência de múltiplos genótipos nessa população. O
DNA HPV foi detectado por SPF10 PCR primer set e tipado por HPV-LiPA que permite
a identificação de 25 genótipos diferentes. O DNA HPV foi detectado em 98% das
amostras e tendo sido observada alta prevalência de múltiplos genótipos (78,9% dos
casos). O HPV-6 foi o genótipo mais prevalente (39.2%) seguido pelo HPV-51 (31.9%),
HPV-11 (26%), HPV-18 (24%) e o HPV-16 (22.5%). Em outro estudo no mesmo ano,
Levi e colaboradores analisaram também na cidade de São Paulo 265 amostras de
escovado cervical de mulheres soropositivas para HIV-1. Foi realizado o teste de
Captura Híbrida para detecção do DNA HPV encontrado em 64.5% das amostras.
A importância da análise de DNA HPV em amostras soropositivas para HIV-1 e,
principalmente em gestantes soropositivas para HIV-1, está diretamente relacionada a
imunossupressão que o HIV causa. Ahdieh em 2001 analisou a prevalência e a
persistência do HPV em mulheres não grávidas soropositivas para HIV-1 e
soronegativas para HIV-1. Utilizando PCR com primers MY09/MY11 foi detectado o
DNA HPV nos primeiros seis meses de estudo com persistência de 67.7% nas
amostras soropositivas para HIV-1 e 47.4% de persistência nas amostras
soronegativas para HIV-1. Trinta e seis meses após a detecção inicial, ao serem
reanalisadas, as amostras soropositivas para HIV-1 apresentavam uma persistência
tipo específica de 45.2% de DNA e as HIV-1 soronegativas de apenas 14.8%. Dessa
forma os dados mostram que a persistência acumulativa do DNA HPV está claramente
associada tanto com a infecção por HIV como a imunossupressão que o HIV causa.
Em 2003 Cerqueira e colaboradores encontraram na região central do Brasil,
variantes dos tipos 53, 58 e 66. O importante achado desse estudo em relação aos
tipos de HPV que foram detectados em nossa análise é referente aos isolados Bsb-61
e Bsb-63. São isolados que apresentam 98% de similaridade com o HPV-53 e
aparentemente são específicos do Brasil.
Após a análise por seqüenciamento observamos infecção sugerindo múltiplos
genótipos do HPV em 6 amostras. A amostra IFF 20 apresentou o isolado Bsb 63,
isolado Bsb 61 e HPV-53 que como descrito anteriormente são isolados que
apresentam 98% de similaridade com o HPV-53. Na amostra HUGG 60, analisada em
54
nosso estudo, ocorreu o mesmo fato, o tipo MM4 foi detectado junto com um isolado
similar ao MM4 o IS887. Na amostra HUPE 52 foram detectados dois tipos diferentes o
HPV-61 e o HPVA61, sugerindo uma infecção múltipla e mista já que essa amostra é
soropositiva para HIV-1. A amostra HUPE 53 apresentou dois tipos, LVX160 e AE1 e
um isolado CY08410, também sugerindo infecção múltipla. A amostra HUPE 81
apresentou, além de dois tipos, o LVX160 e o AE1, dois isolados o CY08-410 e o SDL
105 o que sugere infecção múltipla e infecção mista por HIV-1. A amostra HUPE 85
apresentou 1 tipo, HPV-16 do leste Asiático e um isolado o CY07-118. A infecção
múltipla, citada anteriormente, foi sugerida uma vez que muitos desses isolados ainda
estão sendo estudados para avaliação e confirmação do tipo de origem ou a
possibilidade de serem considerados novos tipos.
Levi e colaboradores em 2004, estudaram a presença de múltiplos genótipos de
HPV em amostras cervicais de mulheres infectadas por HIV. O autor analisou 255
mulheres HIV soropositivas por Captura Híbrida para presença de DNA do HPV e,
para tipagem foi realizado seqüenciamento da região L1. O DNA do HPV foi detctado
em 87% das amostras. Sessenta pacientes estavam infectadas por apenas um tipo de
HPV, 47 por dois tipos, 41 por três tipos, 36 por quatro tipos e 39 amostras infectadas
por mais de quatro tipos.
Cuschieri e colaboradores em 2004, analisaram 3444 amostras de citologia
líquida de mulheres não grávidas por PCR com primers GP5+/GP6+. Vinte por cento
das amostras foram reativas para DNA HPV, sendo encontrado múltiplos genótipos em
43.3% das amostras reativas para HPV.
McLaughlin-Drubin e Meyers em 2004 realizaram testes in vitro para observar
se é possível a infecção por dois tipos de HPV numa mesma célula do hospedeiro.
Eles concluíram que tipos que se apresentam em posições próximas na classificação
filogenéticas não se desenvolvem bem em conjunto pois precisam dos mesmos
substratos produzidos pela célula e irão competir por eles, não permitindo uma
replicação viral persistente de um dos dois tipos. Segundo esse estudo a infecção
múltipla in vitro foi possível quando os dois tipos não eram próximos na classificação
55
filogenética, pois não havia competição pelos substratos celulares e os dois
mantinham um nível alto de replicação viral.
De acordo com esses dados, foi observada uma prevalência do tipo 16 nas
amostras analisadas, sendo importante ressaltar que muitos desses estudos foram
realizados em amostras que já apresentavam alterações citológicas severas
associadas ao câncer cervical.
Em nosso estudo analisamos amostras independente dos resultados citológicos.
observamos um número maior do HPV-16 em , entretanto, em proporções diferentes
dos dados da literatura. Também observamos um maior número do tipo 53. Foi
encontrada grande variabilidade de tipos e isolados dificultando a detecção de um
mesmo tipo em um número maior de amostras. A grande variabilidade de tipos
encontrados em nosso estudo, deveu-se ao uso da técnica de seqüenciamento da
região L1 utilizando os primers MY09 e MY11 que permitiram detectar mais de 25 tipos
diferentes de HPV genital. O seqüenciamento não restringiu a possibilidade da
detecção de novos tipos ou isoformas. Os trabalhos citados nesta discussão utilizaram
técnicas com sondas e enzimas de restrição que restringem a detecção de diferentes
tipos, isolados, por exemplo, não são detectados por essas técnicas. A metodologia
utilizando sondas e enzimas de restrição é pouco sensível para detecção de tipos
incomuns como o Xc, LVX160, 35H, AE1, A61 que foram detectados em nosso estudo.
Não foi encontrada na literatura informações que possam elucidar as nove
amostras seqüenciadas como Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23. Informações
pessoais não descartam a hipótese dessas amostras serem DNA HPV reativo, uma
vez que ao analisarmos a amostra HUPE 85 em um primeiro ensaio encontramos
resultado pelo seqüenciamento, de Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23. Em uma
segunda análise, a mesma amostra de DNA foi amplificada novamente e por
seqüenciamento foi detectado DNA HPV-16.
As amostras consideradas como infecção produtiva, apresentavam no
momento da coleta, lesões clínicas visíveis indicativas de infecção por HPV. As
amostras consideradas infecção latente por HPV não apresentavam, no momento da
coleta, lesões clínicas visíveis sugestivas de infecção por HPV.
56
Algumas amostras apresentaram grau de homologia, percentual de identificação
por seqüenciamento, abaixo do que se considera fidedigno. As análises sugeriram,
como perspectivas de estudo, avaliação das mesmas amostras por amplificação de
outra região do genoma viral para que sejam confirmados os resultados de detecção.
A tipagem pode ser confirmada por outras metodologias como RFLP, ou pelo
seqüenciamento de regiões complementares do genoma viral analisando-se
comparativamente todos os resultados e definindo se o grau de homologia entre
amostras IFF08 (85%), HUGG 39 (94%), HUGG46 (94%), HUGG 63 (90%), HUPE 81
(94%) está mantido. As análises devem ser realizadas com o objetivo de detectar as
possibilidades da existência de novos tipos ou isolados.
57
CONCLUSÃO
VI– Conclusão
¾ Das 196 amostras analisadas 56 (28.6%) foram reativas para DNA do HPV por
PCR.
-
Das 158 amostras soronegativas para HIV-1 analisadas, 38 (24.1%) foram
reativas para DNA do HPV por PCR.
-
Das 38 amostras soropositivas para HIV-1 analisadas, 18 (47.4%) foram
reativas para DNA do HPV por PCR.
¾ Em 10 amostras analisadas foi detectada infecção produtiva por HPV, sendo três
amostras soronegativas para HIV-1 e sete soropositivas para HIV-1.
¾ Em 46 amostras foi detectada infecção latente, sendo 11 (18%) amostras
soropositivas para HIV-1 e 35 (92%) amostras soronegativas para HIV-1.
¾ O seqüenciamento de DNA detectou e identificou o tipo específico de HPV em 38
(67,8%) amostras das 56 analisadas.
-
Dezesseis das 18 amostras soropositivas para HIV-1 o DNA do HPV foi tipado
por seqüenciamento. Nas duas restantes não foi possível a tipagem, sendo
detectado, em uma das amostras HPV gene maior do capsídeo com 98% de
homologia e na outra, DNA humano identificado como Homo Sapiens BAC
clone RP11-420A23.
-
Em duas amostras soropositivas para HIV-1 (HUPE 49 e HUPE 81) a infecção
por mais de um tipo de HPV foi sugerida.
-
Em 21 amostras de 38 soronegativas para HIV-1 o DNA do HPV foi tipado por
seqüenciamento de DNA.
-
No total de 17 amostras o seqüenciamento não determinou o tipo de DNA HPV,
sendo em oito amostras devido à baixa concentração de DNA HPV; em 8
amostras foi detectado DNA humano - Homo Sapiens BAC clone RP11-420A23
58
e a amostra HUGG 53 foi detectado HPV L1 gene sendo o tipo de HPV
indeterminado.
-
Em sete das 21 amostras soronegativas para HIV-1 o seqüenciamento do DNA
do HPV sugeriu a infecção por mais de um tipo de HPV.
¾ Foram detectados, por seqüenciamento de DNA 21 tipos diferentes, doze isolados
e um subtipo de HPV. Doze tipos e sete isolados de alto risco, seis tipos e um
subtipo de baixo risco e três tipos e cinco isolados de risco desconhecido.
-
Nas amostras soropositivas para HIV-1 foram encontrados tipos de HPV de alto
risco em 10 amostras, em cinco amostras tipos de baixo risco e em três
amostras tipos de risco desconhecido.
-
Nas amostras soronegativas para HIV-1, 10 amostras foram tipadas como alto
risco, cinco amostras como baixo risco e cinco amostras como risco
desconhecido.
-
Os tipos de alto risco mais presentes em nossa casuística foram: HPV 58
isolado IS068 em três amostras, HPV 53 em quatro amostras e HPV 16 do leste
asiático em cinco amostras.
-
O tipo de baixo risco mais freqüente em nossa casuística foi o HPV 61 em
quatro amostras.
59
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