COMBINING TARGET-DRUGS AND CHEMOTHERAPY TO
INDUCE BREAST CANCER CELL LINES RESPONSES
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Viviane Alves Monteiro , Carlos Gil Ferreira , Cinthya Sternberg
1
Laboratório de Pesquisa Translacional, Coordenação de Pesquisa, Instituto Nacional do Câncer, RJ – Brasil
INTRODUCTION: Breast cancer represents one third of all cancer in
women. Chemotherapy is the therapy of choice in most of the cases and
many times the combination treatments are adopted to maximize
benefits of neoadjuvance or adjuvance. Breast cancer can be classified
into several categories regarding molecular diagnosis, and described
according to the expression of molecules such as hormonal receptors
and HER2 receptors. More than that, several signaling pathways are
disrupted and/or deregulated in these tumors, and because such
aberrant signaling might distinguishes malignant cells from normal,
they represent possible strategic targets for the development of new
therapeutic regimens. One such potential target is HER2, which is
overexpressed in 20% to 30% of the human metastatic breast cancer
cases. Tykerb (Lapatinib) and Herceptin (Trastuzumab) are drugs
already in use in the clinic that inhibit HER2, impairing the autophosphorylation of the receptor and blocking its signaling. Herceptin
use had a positive impact in patients with HER2+ advanced breast
cancer, however, some patients developed acquired or intrinsic
resistance, which can be associated to PI3K-Akt-mTOR activation.
Therefore, a better understanding of effects of HER2 inhibitors and its
combination therapies might help to design novel therapeutic
schedules based on molecular profiling of patients.
RESULTS:
A
MDA 231
MCF-7
B
( -) control
EGFR
HER -2
HSC -70
HSC -70
MDA231
(+) control
MCF-7
Figure 5: Basal expression of EGFR and HER-2 breast tumour lines. Western blotting showing
the endogenous expression of EGFR (A) and HER-2 (B) in the breast tumour lines MCF-7 and MDAMB-231, and negative control for EGFR (C33-A cells). SRBK3 cell line commercial lysate was included
as positive control for HER2 expression.
A
0,4
0,8
1,6
B
3,2
EGFR
0,4
0,8
1,6
PM
C
3,2
0,8
1,6
3,2
EGFR
EGFR
HSC -70
HSC -70
0,4
HSC -70
HER -2
0,4
PM
0,8
1,6
0,4
3,2
PM
0,8
1,6
3,2
HER -2
HER -2
HSC -70
HSC -70
HSC -70
Figure 6: MCF-10A, MCF-7 and MDA-MB-231 basal expression depends on the culture cell
density. Western blotting showing the EGFR and HER-2 endogenous expression of MCF-10A (A),
MCF-7 (B) and MDA-MB-231 (C) cell lines seeded in several cell densities (0,4; 0,8; 1,6 and 3,2x105
cells/mL).
A
Lapatinib MCF-7
C
Lapatinib MDA 231
140
100
100
80
80
100
80
60
40
% viabilidade
% viabilidade
% viabilidade
120
60
40
0
0
100
200
300
400
500
600
0
300
700
60
40
20
20
20
Lapatinib MCF-10A
0
400
500
Lapatinib (uM)
600
700
800
0
900 1000
10
20
30
40
50
60
Lapatinib (uM)
Lapatinib (uM)
Figure 7: Tykerb sensitivity of tumour and normal breast cell lines. Metabolic activity of MCF-7
(A), MDA-MB-231 (B) and MCF-10A (C) cell lines treated with Tykerb.
B
Herceptin MCF-7
100
100
120
80
100
% viabilidade
Figure 1: Mechanism of action of Tykerb and Herceptin (Ami Citri et. al, 2006).
% viabilidade
120
80
60
C
Herceptin MDA 231
% viabilidade
A
60
40
20
40
0
20
40
60
80
100
80
60
40
20
0
50
120
Herceptin MCF-10A
100
Herceptin (ug)
150
200
0
80
250
120
160
200
240
280
320
Herceptin (ug)
Herceptin (ug)
Figure 8: Herceptin sensitivity of tumour and normal breast cell lines. Metabolic activity of
MCF-7 (A), MDA-MB-231 (B) and MCF-10A (C) cell lines treated with Herceptin.
B
Metformina MCF-7
C
Metformina MDA 231
100
100
80
80
80
60
40
% viabilidade
100
% viabilidade
% viabilidade
A
60
40
60
40
20
20
20
0
0
0
0
30
60
90
Metformina (mM)
120
0
20
40
60
80
100
Metformina (mM)
120
140
Metformina MCF-10A
0
5
10
15
20
25
30
Metformina (mM)
Figure 2: Mechanism of action of Metformin (Data sheet Cell Signaling).
OBJECTIVE: To study the effects of Metformin (AMPK direct-inhibitor
and mTOR indirect inhibitor) combined with Herceptin (anti-HER2
antibody) or Tykerb (EGFR and HER-2 inhibitor) in the MCF-7 and MDAMB-231 cancer cell lines and the non-tumoral cell line MCF-10A, which
harbor different expression profiles regarding the HER protein family
members.
METHODS:
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Figure 3: MTT assay. 1x10 MCF-7, MDA-MB-231 or MCF-10A cells were cultured in 96-well plates.
24 hours later, cells were treated with Tykerb, Herceptin or Metformina. MTT assay was performed
after 48 hours incubation.
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Figure 4: Proteins Extraction. 1,2x10 MCF-7, MDA-MB-231 or MCF-10A cells were cultured in
2
75cm culture bottles. 24 hours later, cells were treated with Tykerb, Herceptin or Metformin. 48
hours later, proteins were isolated and Western blotting was performed.
PERSPECTIVES: ·
- Evaluate the sensibility of MCF-7, MDA-MB-231 and MCF-10A cell lines
regarding treatment with clinically relevant therapies, such as Paclitaxel
and radiotherapy, and combined treatments with Tykerb, Metformin,
Paclitaxel, Herceptin and radiotherapy;
- Investigate signaling pathways involved in the response to treatments,
either in monotherapy or combination.
FINANCIAL SUPPORT: INCT- Câncer, FAPERJ e FAF-INCA.
Introdução: Embora um progresso significativo tenha sido alcançado no tratamento do câncer de mama com
quimioterapia, um grande número de limitações relacionadas a este tipo de tratamento ainda existem. Portanto,
a pesquisa atual tem incidido sobre a avaliação de vários alvos moleculares e terapia combinada, usando drogas
alvo e citotóxica, e tal estratégia foi adotada para maximizar os benefícios. A molécula HER-2 está superexpressa
em aproximadamente 25% - 30% dos casos de câncer de mama metastático humano, e freqüentemente
associado com a expressão de EGFR. Seu potencial como alvo para terapia do câncer foi validada em
experimentos iniciais, onde mostram que os anticorpos monoclonais dirigidos ao domínio extracelular do
receptor resultou em uma acentuada inibição do crescimento de células de câncer de mama que
superexpressam HER-2. Lapatinib e Herceptin (trastuzumab) são drogas alvos utilizadas na clínica, cujo alvo são a
molécula HER-2 impedindo a autofosforilação do receptor e impedindo a ligação do ligante ao receptor,
portanto, inibindo a sinalização que leva à sobrevivência e proliferação celular. Embora a terapia com
trastuzumab tenha melhorado significativamente o resultado para pacientes com câncer de mama HER+
avançado, uma fração destas pacientes apresenta resistência adquirida ou de novo. Um estudo mostrou que
mulheres diabéticas com câncer de mama em tratamento com metformina apresentavam melhor resposta ao
tratamento de câncer. A metformina é um hipoglicemiante oral que inibe indiretamente a formação do
complexo mTORC1 dito um dos principais efetores da via de sinalização de PI3K e está envolvido na resistência a
trastuzumab. Estudos recentes com essa droga sugerem que seu uso pode estar associado com redução da
incidência e melhor prognóstico em certos cânceres.
Objetivo: Pretendemos avaliar os efeitos da Metformina (inibidor direto da AMPK e indireto de mTOR) em
combinação com Herceptin (anticorpo anti-HER-2) ou Lapatinib (inibidor de EGFR e HER-2) em linhagens
tumorais (MCF-7 e MDA-MB-231) e não tumoral (MCF-10A) de mama com diferentes perfis de expressão de
membros da família ErbB.
Métodos e Resultados: Para verificar a expressão basal de EGFR e HER2, nas linhagens celulares MCF7, MDA e
MCF10, as mesmas foram cultivadas em diversas densidades (4x104 to 3,2x105 células/mL). Depois de 48 horas,
proteínas foram extraídas e um western blotting para EGFR e HER2 foi realizado. MCF7 demonstrou uma baixa
expressão de EGFR quando comparado com MDA e MCF10, independente da densidade inicial utilizada. Todavia,
MCF10 e MDA demonstraram uma expressão reduzida de EGFR quando utilizada a densidade mais alta em
comparação com as demais densidades iniciais. MCF7 demonstrou uma expressão aumentada de HER2 que
correlaciona positivamente com a densidade inicial da cultura. Entretanto, as linhagens MCF10 e MDA exibiram
uma expressão reduzida de HER2, que correlaciona negativamente com a densidade inicial da cultura. Para
avaliar a sensibilidade das linhagens celulares de câncer de mama à drogas-alvo, nós tratamos as linhagens
celulares MCF7, MDA e MCF10 com TYK, MET e HRC e a viabilidade metabólica da célula foi verificada por MTT.
Conclusões: Os resultados demonstram uma possível regulação da expressão de EGFR e HER2
linhagem-específica que depende da densidade inicial da cultura celular. As linhagens
celulares MCF7, MCF10 e MDA exibiram uma redução na atividade metabólica
quando tratados com Tykerb, Metformina ou Herceptin por 24 e
48 horas de cultura.
Projeto Gráfico: Serviço de Edição e Informação Técnico-Científica / CEDC / INCA
Figure 9: Metformin sensitivity of tumour and normal breast cell lines. Metabolic activity of
MCF-7 (A), MDA-MB-231 (B) and MCF-10A (C) cell lines treated with Metformin.