Acta Scientiae Veterinariae
ISSN: 1678-0345
[email protected]
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Brasil
Quintino Rodrigues, Giovanna; Bezerra Bruno, Jamily; Rocha Faustino, Luciana; Gomes da Silva,
Cleidson Manoel; de Figueiredo, José Ricardo
Suplementação proteica no meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais
Acta Scientiae Veterinariae, vol. 38, núm. 4, 2010, pp. 341-349
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, Brasil
Disponível em: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=289021903001
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Rodrigues G.Q., Bruno J.B., Faustino L.R., Silva C.M.G. & Figueiredo J.R. 2010. Suplementação proteica no meio de cultivo
in vitro de folículos pré-antrais.
Acta Scientiae Veterinariae. 38(4): 341-349.
Acta Scientiae Veterinariae. 38(4): 341-349, 2010.
REVIEW ARTICLE
Pub. 922
ISSN 1679-9216 (Online)
Suplementação proteica no meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais
Protein supplementation on In Vitro Preantral Follicle Medium Culture
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Gomes
Silva 1 & José Ricardo de Figueiredo2
ABSTRACT
Background: The in vitro culture of preantral follicles is an important tool to elucidate the mechanisms involved in controlling
early folliculogenesis as well as to improve reproductive efficiency by providing a large number of oocytes for in vitro
production of embryos. To this end, improvements in the performance of current culture systems are needed, including
changes in the composition of the medium. Supplementation of culture medium with proteins is a great strategy to improve
survival and in vitro development of preantral follicles. This review highlights the importance of in vitro culture of preantral
follicles with emphasis on the main protein sources used to supplement the culture media.
Review: Throughout the study were discussed issues related to the use of protein substances to culture medium of preantral
follicles, highlighting the fetal bovine serum, bovine serum albumin and follicular fluid, and demonstrating the importance of
each these substances to follicular development. The fetal bovine serum (FBS) is a protein supplement widely used in in vitro
culture of preantral follicles, composed of various substances, including proteins, carbohydrates, amino acids, growth factors
and hormones which maintain the viability and promote the growth of these follicles. Although several studies have found that
serum promotes beneficial effects such as maintaining the viability and promotion of follicular growth, other studies showed
that serum decreased membrane integrity, increased extrusion rates and induced luteolysis. These contradictory results show
that it is still difficult to determine which substances in the serum are necessary for development of follicles, oocytes or even
embryos. Moreover, it is noteworthy that the results repeatability when using the serum may vary. In semi-defined culture
media, bovine serum albumin (BSA) is a protein supplement used in replacing the serum, being a protein of high biological
value and their various properties. BSA may act as a surfactant, heavy metals chelator or also as a scavenger of reactive oxygen
species. These properties contribute to maintain follicles structure favoring their survival. Nevertheless, the role of albumin
during culture is not well understood, since the BSA is a highly variable substance. Another protein supplement widely used
is the follicular fluid (FF), whose composition has been studied recently in an attempt to increase knowledge about the
follicular development and atresia. Studies show that FF may acts in maintaining the follicular survival and growth similar to
serum. On the other hand, studies have shown an inhibitory effect of this substance on the follicles growth. Similar to SFB, the
beneficial effect of supplementation with FF is still not well understood because of the great variability of results, which occurs
due to the difference in the composition of the samples collected.
Conclusion: Although great progresses have been obtained in adapting the culture medium of preantral follicles in different
species, including domestic animals, the results are still unsatisfactory. Therefore, there is the necessity to optimize the existent
culture systems, which can be obtained with protein supplementation, the major component of in vitro culture of this follicular
category. However, further studies are still needed in order to provide more information about the mechanism of proteins action
on follicular cells.
Keywords: oocyte, bovine seric albumin, fetal calf serum, maturation, follicular culture in vitro.
Descritores: oócito, albumina sérica bovina, soro fetal bovino, maturação cultivo folicular in vitro.
Received: June 2010
www.ufrgs.br/actavet
Accepted: August 2010
Doutorando, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará (UECE). 2Docente, Curso de Medicina
Veterinária e do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da UECE, Campus do Itaperi, CEP 60740-000 Fortaleza, CE, Brasil.
CORRESPONDÊNCIA: G.Q. Rodrigues [[email protected] - FAX: +(55) 85 3101-9840].
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in vitro de folículos pré-antrais.
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I. INTRODUÇÃO
II. CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS
III. IMPORTÂNCIA DA COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTIVO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS
IV. SORO
V. ALBUMINA SÉRICA BOVINA
VI. FLUIDO FOLICULAR
VII. CONSIDERAÇÕES FINAIS
VIII. REFERÊNCIAS
I. INTRODUÇÃO
Os mecanismos envolvidos no início do desenvolvimento folicular ainda são pouco elucidados,
principalmente no que se refere às espécies domésticas, as quais necessitam de vários meses para que os
folículos primordiais cheguem ao estádio antral. Nesse sentido, estudos têm se voltado para o entendimento dos fatores que controlam a foliculogênese
inicial com auxílio de protocolos de cultivo in vitro
folículos pré-antrais de diferentes espécies (suínos:
[56]; bovinos: [49]; humanos: [52]; caprinos: [50]).
Neste contexto, o desenvolvimento de um sistema
eficiente de cultivo é um ponto crucial para uma
melhor compreensão dos diversos fatores implicados na foliculogênese e no processo de atresia, além
de aumentar o potencial reprodutivo de fêmeas [13].
Até o momento, os melhores resultados após
cultivo in vitro de folículos pré-antrais foram obtidos
em camundongas, única espécie na qual foi relatada
a obtenção de crias saudáveis após maturação dos
oócitos inclusos nestes folículos [42], refletindo a
necessidade de melhorias nos sistemas de cultivo
existentes. Para isso, é de fundamental importância a
otimização de vários fatores, tais como a duração do
cultivo, volume e troca de meio, atmosfera gasosa e
suplementação do meio.
Dentre esses fatores, a suplementação do
meio de cultivo tem sido bastante estudada, visto que
é considerada essencial para a manutenção da viabilidade e crescimento celular [44]. Especificamente,
no cultivo in vitro de folículos pré-antrais, a adição
de suplementos proteicos tem sido utilizada rotineiramente por ser indispensável para o desenvolvimento folicular [1, 3].
Para esclarecer melhor a importância dos suplementos proteicos utilizados no meio de base, a
presente revisão destaca a importância do cultivo in
vitro folículos pré-antrais, composição do meio, dando enfoque às diferentes fontes proteicas, tais como
a albumina sérica bovina (BSA), os diferentes tipos
de soro e o fluido folicular (FF).
CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS
O cultivo in vitrode folículos pré-antraistem
como objetivo principal o completo desenvolvimento dessa categoria folicular, bem como assegurar o
crescimento e a maturação de seus oócitos, até que
estejam aptos a produção de embriões [13].
Nesses sistemas de cultivo in vitro, os folículos
ovarianos podem ser cultivados inclusos no próprio
tecido ovariano (in situ) ou na forma isolada. O cultivo in situ é considerado um modelo prático uma vez
que a manipulação é rápida e nesse cultivo a interação
entre os folículos e as células do estroma ovariano é
mantida. Já o cultivo de folículos isolados permite
uma melhor perfusão dos nutrientes e o acompanhamento individual dos folículos.
Grandes progressos já têm sido observados
no cultivo in vitro de folículos pré-antrais em diferentes espécies animais. Nas espécies ovina [2],
caprina [30], suína [56] e bubalina [17], embriões
foram produzidos após cultivo in vitro de grandes
folículos secundários. Entretanto, conforme dito anteriormente, os melhores resultados foram observados por O’Brien et al. [42] que obtiveram o nascimento de camundongos a partir de folículos primordiais desenvolvidos, maturados e fecundados in vitro.
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II. IMPORTÂNCIA DA COMPOSIÇÃO DO MEIO DE
CULTIVO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS
Dentre os meios de cultivo utilizados para
promover o desenvolvimento folicular in vitro em
diferentes espécies, podemos destacaro Meio Essencial Mínimo - MEM (caprinos: [49]), Waymouth
(murinos: [11]; ovinos: [38]), TCM 199 (ovinos: [2]),
Leibovitz (murinos: [37]) e McCoy’s (humanos:
[51]), cuja formulação original varia de acordo com
a presença de diferentes tampões (bicarbonato,
fosfato, HEPES) e substratos nutritivos
(monossacarídeos, lipídeos, proteínas, aminoácidos,
ácidos nucléicos, vitaminas etc).
Além dos suplementos já contidos na formulação original dos meios de base, outras substâncias
são adicionadas ao meio de cultivo de folículos préantrais. Dentre essas substâncias destacam-se o
hormônio folículo-estimulante (FSH), hormônio
luteinizante (LH), estradiol e progesterona. Tais
hormônios são utilizados no sentido de aumentar a
eficiência do meio visando promover a viabilidade e
o crescimento desses folículos [26,29,47].
Além de hormônios, diversos fatores de crescimento também são adicionados ao meio de cultivo
de folículos pré-antrais. Dentre esses fatores podemos citar o fator de o fator de crescimento e diferenciação - 9 (GDF-9) e o fator de crescimento epidermal
(EGF), os quais foram capazes de manter a viabilidade e promover o crescimento de folículos pré-antrais
caprinos [9,32].
Além das substâncias citadas, suplementos
protéicos também são adicionados ao meio, com o
objetivo de melhorar a eficiência do cultivo in vitro
de ículos pré-antrais, embora variações destas fontes
protéicas produzam efeitos adversos [46]. as fontes
protéicas utilizadas no cultivo in vitrode folículos préantrais, podemos citar diferentes fontes de soro, a
albumina sérica bovina (BSA) e o fluido folicular (FF).
III. SORO
Diversos trabalhos têm sugerido a adição de
soro, como fonte de nutrientes, hormônios e fatores
de crescimento ao meio de cultivo de folículos préantrais. Dentre eles, podemos citar o soro fetal bovino (SFB), soro de cabra em estro (SCE), soro de ovelha em estro (SOE), soro de porca pré-púbere (SPP).
O SFB é um suplemento proteico amplamente utilizado no cultivo in vitro de folículos pré-antrais,
o qual é composto por diversas substâncias, como
proteínas, carboidratos, aminoácidos, fatores de crescimento e hormônios [44], que permitem manter a
viabilidade e promover o crescimento de folículos
pré-antrais [1], além de ser uma fonte de precursores
para a síntese de esteróides, como o estradiol e a
progesterona, responsáveis pela promoção do crescimento folicular in vitro [20]. Murdoch [36] demonstrou que o estradiol pode inibir a apoptose de células
foliculares e luteais em suínos. Em associação ao FSH,
esse esteróide manteve a viabilidade folicular em
caprinos após 7 dias de cultivo in vitro [26].
Diversos trabalhos têm utilizado o SFB como
fonte de proteína no meio de cultivo in vitrode
folículos pré-antrais verificando que este fator promove efeitos benéficos. Em murinos, a ausência de
soro no meio de cultivo folicular tem sido relacionada com a indução da apoptose e o comprometimento do desenvolvimento folicular [10]. Telfer et al. [51]
verificaram um aumento significativo na sobrevivência de folículos pré-antrais suínos após 20 dias de
cultivo na presença de 10% de SFB em relação àqueles cultivados sem soro. Cecconi et al. [8] obtiveram
um rápido crescimento e uma alta taxa de formação
de antro utilizando 10% de SFB durante o cultivo in
vitro de folículos pré-antrais de ovelhas, obtendo pela
primeira vez a formação de antro nesta espécie. soro
foi mais efetivo comparado a outras fontes de
macromoléculas na promoção do aumento do diâmetro durante o cultivo in vitro folículos pré-antrais
de fetos bovinos [3]. Mao et al.[31]observaram que
o SFB quando adicionado ao meio de cultivo de
folículos pré-antrais suínos, aumenta as taxas de recuperação de complexos cumulus-oócito (CCO)
intactos, além da taxa de formação de antro quando
comparado ao soro de porca pré-púbere. Eppig et
al.[12] compararam a eficácia de um meio
suplementado com SFB ou BSA, sobre o desenvolvimento in vitrode complexos cumulus-oócitos-células da granulosa (CCO-CG). Foi observado que
muitos oócitos cultivados na presença do soro
clivaram após fertilização e mostraram-se competentes
para se desenvolver até o estádio de blastocisto quando comparados àqueles cultivados apenas com BSA.
Por outro lado, alguns estudos observaram
que a utilização de 10% de SFB diminuiu a viabilidade folicular e a capacidade de desenvolvimento
oocitário [20] e promoveu uma perda significativa
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da integridade da membrana basal de folículos préantrais bovinos [53]. Além disso, outros estudos
mostraram que o SFB aumenta as taxas de extrusão
e a degeneração de folículos ovinos isolados [41].
Picton et al. [43] relataram que o SFB reduziu a produção de estradiol e progesterona em células da
granulosa suínas cultivadas in vitro.Em adição, na
ausência de SFB, Wandji et al. [54] demonstraram
pela primeira vez que folículos primordiais bovinos
inclusos em fragmentos do córtex ovariano de fetos
sobreviveram e iniciaram com altas taxas (94%) o
crescimento in vitro.
Além do SFB, outros tipos de soro também
são utilizados no cultivo celular. O soro de cabra em
estro (SCE) e o soro de ovelha em estro (SOE), por
exemplo, também podem ser utilizados como suplementos protéico no meio de cultivo in vitro de folículos
ovarianos pré-antrais. et al. [2] obtiveram oócitos
maduros oriundos de folículos pré-antraisovinos cultivados in vitro, utilizando 20% de SOE no meio de
maturação. Hulshof et al. [20] também observaram
aumento significativo do diâmetro de folículos préantraisbovinos cultivados na presença de 17βestradiol, substância presente em grandes quantidades no soro do animal em estro. Bruno et al. [6] compararam diferentes origens e concentrações de soro
no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos e
observaram que 20% de SCE promoveu a ativação e
o aumento do diâmetro folicular, embora a
morfologia folicular não tenha sido mantida. No entanto, apesar dos diversos estudos, ainda é difícil
determinar quais substâncias presentes no soro são
necessárias ao desenvolvimento folicular, oocitário
ou até mesmo embrionário.
Por se tratar de um produto biológico, a contaminação do meio de cultivo por agentes
microbianos deve ser sempre considerada [14], uma
vez que o soro pode agir como uma fonte de
patógenos como o vírus da diarréia viral bovina [5].
Para minimizar esse efeito, pode-se lançar mão da
inativação do soro através do calor. Além de reduzir
ou eliminar possíveis microorganismos presentes no
soro, tal processo também é utilizado para inativar as
proteínas do complemento, que, quando presentes
podem prejudicar a disponibilização de algumas substâncias presentes no meio de cultivo.
Vale ressaltar que a repetibilidade dos resultados, quando se utiliza o soro pode variar. et
al.[27]demonstraram que alterações na partida do
soro resultam em alta variabilidade no sistema de
cultivo in vitro, dificultando a repetição de resultados, provavelmente, por apresentar componentes
indefinidos tais como, ácidos graxos, fatores de crescimento, aminoácidos e vitaminas. A identificação
de diferentes fatores de crescimento e proteínas presentes no SFB e que são essenciais para o crescimento folicular ainda é um desafio para o cultivo celular.
A presença de altas concentrações de soro durante o
cultivo de ículos pré-antrais constitui uma condição
inadequada para estudos fisiológicos in vitro.De fato,
o soro contém numerosas proteínas conhecidas e
desconhecidas que podem interagir com outros componentes adicionados ao meio.
IV. ALBUMINA SÉRICA BOVINA (BSA)
A albumina sérica bovina (BSA) é a proteína
mais abundante no plasma sendo, portanto uma proteína de alto valor biológico. Essa proteína é produzida no fígado e sua concentração no plasma bovino
é de 35 a 50 mg/mL [48]. In vivo, possui como funções a manutenção da pressão osmótica; o transporte de hormônios tireoideanos e lipossolúveis, ácidos
graxos livres, bilirrubina não conjugada, fármacos e
drogas; além de controlar o pH. No entanto, sua propriedade mais interessante talvez seja a capacidade
de ligar-se reversivelmente a uma grande variedade
de substâncias, transportando-as para diversos órgãos
através do sistema circulatório [16].
No que se refere aos efeitos in vitro, estudos
têm apontado que além de atuar como um quelante
de metais pesados [33], a BSAprevine a aderência
das células às superfícies plásticas ou de vidro, devido a sua propriedade surfactante. Estudos têm demonstrado que a manutenção da estrutura dos
folículos durante o cultivo in vitro favorece a sobrevivência folicular [24]. Além disso, a BSA pode atuar como um sequestrador de espécies reativas de
oxigênio reduzindo os riscos de estresse oxidativo
[40].
Em meios de cultivo semi-definidos, a BSA
é um suplemento proteico utilizado em substituição
ao SFB. Gutierrez et al. [18] obtiveram pela primeira
vez a formação de antro em folículos pré-antrais bovinos cultivados por 28 dias na presença de 1% de
BSA. Nesse sistema de cultivo, os folículos mantiveram sua organização celular e foram responsivos aos
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efeitos estimulatórios do hormônio folículo estimulante (FSH), fator de crescimento epidermal (EGF) e
fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF1). McCaferry et al. [28] obtiveram resultados semelhantes após cultivo de 6 dias de folículos pré-antrais
bovinos em meio contendo 3,0 mg/mL de BSA. Itoh
et al. [21] cultivaram folículos pré-antrais bovinos
na presença de 1 mg/mL de BSA e observaram que a
estrutura tri-dimensional normal dos folículos foi
mantida, com formação de antro após 13 dias de
cultivo. Em caprinos e ovinos, embriões foram obtidos após maturação e fertilização de oócitos oriundos de folículos pré-antrais cultivados na presença
de 3 mg/mL e 0,5% de BSA, respectivamente [2,30].
Além disso, foi observado que a substituição do SFB
pela BSA aumentou em até 30% o percentual de
folículos pré-antrais felinos intactos cultivados in vitro
[23].
Apesar dos estudos citados, o papel da
albumina durante o cultivo ainda não está bem esclarecido, uma vez que a BSA é uma substância bastante variável [4], tendo em vista que a composição
depende da presença de moléculas pequenas que
permaneçem ligadas à sua estrutura durante sua preparação. Alguns componentes como ácidos graxos,
fatores do crescimento, aminoácidos e vitaminas presentes na BSA podem ter suas quantidades reduzidas durante o processo para extração, purificação e
liofilização da albumina para formar o produto, o que
poderia provocar as diferenças observadas nos diversos estudos [7].
V. FLUIDO FOLICULAR
O fluido folicular (FF) origina-se principalmente do plasma periférico, por transudação através
da membrana basal folicular, e acumula-se na cavidade antral [19]. O FF é, em parte, exsudado do
plasma sanguíneo e também é parcialmente composto
de substâncias produzidas localmente, as quais estão
relacionados com a atividade metabólica das células
foliculares [15]. Como resultado, os componentes do
FF mudam durante o crescimento e a expansão dos
folículos [55]. A composição do fluido folicular tem
sido bastante estudada nos últimos tempos, numa
tentativa de aumentar o conhecimento sobre o desenvolvimento e atresia folicular e maturação oocitária
[35]. A atividade metabólica e as propriedades da
barreira sangue-folículo alteram durante a fase de bre
crescimento folicular, consequentemente, a composição bioquímica do FF difere de acordo com o tamanho dos folículos. À medida que as células da
granulosa crescem e o oócito matura, ocorrem mudanças no ambiente bioquímico, ou seja, modificações nas características dos metabólitos, íons e
enzimas presentes no FF. Tais mudanças estão fortemente correlacionadas com o desenvolvimento
folicular e oocitário [22].
Ainda com relação à sua composição, e m
grandes folículos antrais, o FF contém concentrações
marcadamente elevadas de 17β-estradiol na fase
folicular, e progesterona com a aproximação da ovulação. Esse fluido tem ação fundamental nos aspectos fisiológicos, bioquímicos e metabólicos da
maturação nuclear e citoplasmática do oócito. O FF
passa por mudanças marcantes durante o ciclo estral
e desempenha uma série de funções, incluindo a
regulação das funções das células da granulosa; iniciação do crescimento folicular e esteroidogênese;
maturação oocitária, ovulação e transporte do oócito
para o oviduto; preparação do folículo para a formação do corpo lúteo subseqüente [19].
O efeito benéfico da suplementação com FF,
assim como as diferentes fontes de soro, ainda não
está bem esclarecido devido à uma grande variabilidade de resultados, em virtude da diferença na composição das amostras coletadas. Kim et al. [25], obtiveram uma taxa de 15,2% de oócitos em metáfase
II após cultivo de folículos pré-antrais murinos na
presença de 5% de hFF, além disso esse tratamento
foi semelhante ao tratamento com 5% de SFB e 0,3%
de BSA sobre o crescimento e a sobrevivência
folicular. Em suínos, o FF na concentração de 5%
aumentou significativamente o diâmetro de folículos
pré-antrais em relação ao SFB nessa mesma concentração, além disso o FF oriundo de grandes folículos
antrais promoveu uma taxa de 86,7% de formação
de antro e 86,7% de sobrevivência oocitária após 14
dias de cultivo [34]. Nandi et al. [39] avaliou o efeito
de diferentes concentrações de peptídeo isolado de
FF ovino sobre o crescimento e a sobrevivência de
folículos pré-antrais bubalinos e observou que não
houve formação de antro após 15 dias de cultivo,
bem como não houve diferença entre as doses utilizadas com relação ao crescimento e à sobrevivência
folicular. Além disso, as doses mais altas do peptídeo
(0,5; 1,0 e 2,0 345µg) causaram um efeito inibitório
sobre o crescimento dos folículos.
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As diferenças entre os resultados obtidos nos
diferentes trabalhos podem ser devidas à origem do
FF. Alguns trabalhos sugerem que o FF oriundo de
grandes folículos antrais possui um efeito mais significativo em relação ao FF oriundo de pequenos
folículos no que diz respeito ao crescimento folicular
[33] e secreção de progesterona nas células da
granulosa [45].
VI. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O conhecimento da foliculogênese inicial in
vitro ainda constitui um verdadeiro desafio, com grandes possibilidades para futuras aplicações na prática
clínica. Desde a última década, grandes progressos
já foram alcançados na adaptação do meio de cultivo folicular em diferentes espécies. No entanto, em
animais domésticos, os resultados ainda são considerados insatisfatórios, refletindo na necessidade de
se otimizar os sistemas de cultivo existentes, visando
o completo desenvolvimento in vitro de folículos préantrais. Com essa finalidade, a suplementação
proteica constitui um dos principais componentes do
cultivo in vitro dessa categoria folicular. No entanto,
estudos complementares ainda são necessários no
sentido de fornecer maiores informações acerca do
mecanismo de ação das proteínas sobre as células
foliculares.
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