Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro
Escola Nacional de Botânica Tropical
Programa de Pós-Graduação em Botânica
Respostas fisiológicas e celulares de macroalgas e corais à
acidificação da água do mar
Vanessa Moura dos Reis
Orientador: Dr. Leonardo Tavares Salgado
Co-orientador: Dr. Gilberto Menezes Amado Filho
Nível: Doutorado
Rio de Janeiro, maio de 2012
1
SUMÁRIO
Página
Lista de ilustrações e tabelas ...................................................................................3
Resumo ...................................................................................................................4
1. Introdução ...........................................................................................................5
2. Hipóteses ........................................................................................................................................10
3. Objetivos .........................................................................................................................................11
4. Justificativa .....................................................................................................................................11
5. Material e Métodos ........................................................................................................................12
5.1. Área de estudo .....................................................................................................................12
5.2. Amostragens .......................................................................................................................13
5.3. Efeito in vitro do aumento [CO2] e da redução dos valores do pH ...............................13
5.4. Determinação das taxas de mineralização de CaCO3 .....................................................14
5.5. Avaliação das respostas fisiológicas .................................................................................15
5.6. Avaliação das respostas celulares .....................................................................................15
5.7. Determinação da taxa de sobrevivência/letalidade do coral e da alga calcária ...........16
5.8. Avaliação da capacidade reprodutiva e da taxa de sobrevivência de esporos de L.
abyssalis ......................................................................................................................................17
6. Cronograma de metas ....................................................................................................................17
7. Orçamento ......................................................................................................................................18
8. Referências bibliográficas .............................................................................................................18
2
Lista de ilustrações e tabelas
Figura 1: L. superpositum ................................................................................................................
9
Figura 2: M. braziliensis ............................................................................................
10
Figura 3: Indivíduo de L. abyssalis associado a rodolitos ...........................................
10
Tabela1: Concentrações de CO2 e valores de pH usados nos experimentos in vitro
(Cenário A1F1 do IPCC) ..........................................................................................
14
RESUMO
O termo “acidificação dos oceanos” diz respeito a mudanças na química do carbonato
nas águas oceânicas devido ao aumento da concentração atmosférica do CO2 e,
consequentemente, da sua absorção pela água do mar. Atualmente, várias pesquisas vêm
sendo desenvolvidas para avaliar a influência da acidificação dos oceanos em
organismos marinhos. No entanto, esses trabalhos estão voltados principalmente a
respostas fisiológicas, como crescimento tecidual, enquanto que respostas celulares não
têm sido frequentemente estudadas, principalmente em relação à calcificação. Dessa
forma, este trabalho terá como objetivo avaliar os efeitos da acidificação da água do mar
na biologia celular e fisiologia de macroalgas marinhas e corais escleractínios. Para isso,
foram escolhidos os organismos: Lithothamnion superpositum – alga calcária
incrustante mais importante em termos de abundância e distribuição no Banco do
Abrolhos, Mussismilia braziliensis – coral endêmico do Brasil e principal espécie de
coral em águas rasas do Banco dos Abrolhos e Laminaria abyssalis, alga endêmica do
Brasil, com elevada importância econômica e ecológica. Serão realizados experimentos
in vitro, com manipulações nas concentrações de CO2 e a partir disso, serão analisados
os seguintes parâmetros: taxas de mineralização de CaCO3, respostas fisiológicas e
celulares, taxa de sobrevivência/letalidade e capacidade reprodutiva e sobrevivência de
esporos de Laminaria abyssalis.
Palavras chave: acidificação, Lithothamnion superpositum, Abrolhos, Mussismilia
braziliensis, Laminaria abyssalis.
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1. Introdução
O termo “acidificação dos oceanos” diz respeito a mudanças na química do
carbonato nas águas oceânicas devido ao aumento da concentração atmosférica do CO2
e, consequentemente, da sua absorção pela água do mar. Essas mudanças se resumem ao
aumento nas concentrações de bicarbonato (HCO3-) e prótons H+ e ao decréscimo na
concentração de íons carbonato (CO32-) e no ponto de saturação do carbonato de cálcio
(CaCO3) (Gattuso et al. 1998; Caldeira & Wickett 2003, Orr et al. 2005). Quando
absorvido pelos oceanos, o CO2 reage com a água e produz ácido carbônico, que, por
sua vez, se dissocia para formar íons bicarbonato e prótons, que novamente reagem com
íons carbonato para produzir mais íons bicarbonatos, reduzindo a disponibilidade de
carbonatos nos sistemas biológicos (Hoegh-Guldberg et al. 2007).
A alteração da química do carbonato oceânico vem ocorrendo desde a Revolução
Industrial (The Royal Society 2005, Doney et al. 2009), como reflexo do aumento do
CO2 atmosférico, que no período pré-industrial era de aproximadamente 280 ppm e,
atualmente, já está em torno de 380 ppm (Solomon et al. 2007). O cenário projetado
pelo Painel Intergovernamental de Mudanças Climáticas (IPCC) indica que o carbono
orgânico dissolvido nas águas superficiais dos oceanos possa aumentar cerca de 12% até
final do século XXI, quando as concentrações de CO2 atmosférico poderão chegar a
760 ppm. Como resultado, a concentração iônica dos carbonatos [CO32-] será reduzida
em até 60%.
De fato, a grande preocupação em relação à acidificação dos oceanos é em relação
à velocidade com que esse processo vem ocorrendo. Isso porque os níveis de CO2
atmosférico já estiveram elevados, assim como os atuais, mas em períodos glaciais e
inter-glaciais (Sanyal et al. 1995). No entanto, as maiores concentrações de CO2
inferidas de registros geológicos surgiram ao longo de muitos milhões de anos, através
de processos lentos, como tectonismo e evolução biológica (Caldeira & Wickett 2003).
Os oceanos têm capacidade de absorver grande parte do CO2 gerado por
atividades antropogênicas, porém, de maneira geral, a velocidade de degradação dos
sistemas naturais está sendo cada vez maior do que a capacidade de tamponação desses
sistemas. Nas últimas décadas, apenas a metade do CO2 emitido ficou retido na
atmosfera, da outra metade, 30 % foi absorvido pelos oceanos e 20% pela biosfera
terrestre (Feely et al. 2004).
Estudos de modelagem sugerem que, desde o início do período industrial houve
um declínio médio de 0,2 U no pH da água do mar, por causa do aumento da
5
concentração de CO2, resultado da queima de combustíveis fósseis (Caldeira & Wickett
2003) e, até o final do século XXI, esse declínio poderá chegar até 0,3–0,4 U (Haugan
& Drange 1996). Projeções de Orr et al. (2005) indicam ainda que a acidificação das
águas superficiais dos oceanos do hemisfério sul passará a um estado de não saturação
da aragonita (uma das formas cristalinas do CaCO3) no ano de 2050, tendo como
conseqüência a destruição de estruturas carbonáticas, como formações recifais, por
exemplo. É proposto ainda que as taxas de dissolução possam exceder as de
calcificação, em algas coralíneas, no final do século XXI, devido à acidificação dos
oceanos (Martin & Gattuso 2009).
O ponto de saturação do carbonato de cálcio é dado pelo produto da relação entre
as concentrações iônicas ([Ca2+] x [CO32-]) sobre o produto de solubilidade do mineral,
sendo que este último depende de determinadas condições, como alcalinidade,
salinidade e temperatura (Caldeira et al. 2004). Desta forma, a partir destes
conhecimentos básicos sobre a química da mineralização é que se fundamentam
diversas teorias e estudos a respeito dos danos causados pela acidificação da água do
mar aos organismos calcificadores.
As pesquisas atuais sobre o fenômeno da acidificação dos oceanos têm sido mais
direcionadas aos efeitos que podem causar aos organismos calcificadores (Hurd et al.
2009), comprometendo a capacidade destes manterem ou construírem estruturas
carbonáticas (Bijma et al. 1999, Riebesell et al. 2000, Orr et al. 2005, Shirayama &
Thornton 2005, De’ath et al. 2009).
Estudos sugerem que os efeitos do fenômeno da acidificação ocorrerão primeiro
em altas latitudes - devido ao aumento da solubilidade do CO2 em temperaturas frias onde é predito que o estado de não saturação da aragonita ocorrerá entre 2030 e 2038
(McNeil & Matear 2008), enquanto em mares do hemisfério Sul, ocorrerá no ano de
2050 (Orr et al. 2005).
Experimentos para simular os efeitos biológicos do aumento de CO2 nos
organismos marinhos não são simples, porque quando o pH da água é alterado, a
especiação do carbono também é modificada, o que pode gerar fortes implicações em
processos como fotossíntese, respiração e calcificação (Hurd et al. 2009). Além disso,
os próprios processos metabólicos dos organismos também modificam o pH; a
fotossíntese aumenta o pH, enquanto que a calcificação e a respiração reduzem o
mesmo (Hurd et al. 2009).
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Duas técnicas têm sido mais utilizadas para simular as condições de acidificação
da água do mar na maioria dos experimentos de perturbação biológica: a injeção de CO2
e adições de HCl⁄ NaOH. Cada método produz um alvo específico de especiação do
CO2, mas eles os atingem de maneiras diferentes (Langdon 2003). A diluição do CO2
gasoso com a água do mar estabiliza o equilíbrio pCO2, sem que ocorra mudança na
alcalinidade total (AT). Como resultado, o carbono total (CT) aumenta a partir de um
valor inicial. Em contraste, a adição de HCl envolve um decréscimo na AT, mas não
muda o CT. Até o momento, a técnica de borbulhamento de CO2 vem sendo considerada
a mais próxima da realidade atual da acidificação dos oceanos (Hurd et al. 2009).
Os estudos das respostas de macroalgas à acidificação são recentes, tendo se
iniciado os estudos de ecologia e fisiologia na década de 1990 (Gao et al. 1991, 1993).
Sabe-se que algumas macroalgas são capazes de responder a mudanças tanto na
concentração de CO2 quanto nos valores do pH na água do mar (Hurd et al. 2009). O
crescimento de Porphyra yezoensis, por exemplo, aumenta significativamente com o
enriquecimento de CO2 a 1000 ppm (Gao et al. 1991). Por outro lado, um decréscimo
nas taxas de crescimento causado por elevados níveis de CO2 ocorre em algumas algas
vermelhas (Israel et al. 1999). Além disso, um recente estudo mostra que as taxas de
crescimento de 13 espécies (Chlorophyta, Rhodophyta e Ochrophyta) cultivadas em
condições atuais são comparáveis ao crescimento daquelas cultivadas em água
enriquecida com CO2, e isso é atribuído à ocorrência de mecanismos de concentração de
carbono (CCMs) (Israel & Hophy 2002).
Além
da
fotossíntese,
o
CO2
influencia
no
processo
de
calcificação/biomineralização. Esse processo corresponde à formação biogênica de
carbonato de cálcio (Borowitzka 1987), pelo qual são produzidas estruturas diversas,
como carapaças de invertebrados marinhos, esqueletos dos vertebrados, conchas dos
moluscos, dentes e otólitos. As formas mais comuns de carbonato de cálcio (CaCO3)
são aragonita, calcita e calcita com alto teor de magnésio (Adey 1998). Dentre essas três
formas, a calcita com alto teor de magnésio é a forma mais instável (Chave et al. 1962).
Como a calcita com alto teor de magnésio é mineralizada pelas algas calcárias
(Borowitzka 1987), esses organismos podem ser os primeiros a sofrerem mais
drasticamente os efeitos da acidificação da água do mar.
As algas podem apresentar diferentes mecanismos de calcificação. Os
cocolitoforídeos, por exemplo, produzem calcita nas regiões intracelulares e essa é
extruída para as superfícies das células, enquanto que a alga verde Halimeda mineraliza
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aragonita no espaço intercelular e por fim, as algas vermelhas coralíneas depositam a
calcita com alto teor de magnésio no interior das paredes celulares (Borowitzka 1987).
As algas calcárias são a principal fonte marinha de carbonatos e sedimentos nas zonas
costeiras (Gattuso et al. 1998, Feely et al. 2004, Balch et al. 2007, Farina & AmadoFilho 2009). Nesse contexto, as macroalgas coralíneas são componentes importantes nas
comunidades bentônicas (Littler 1972, Adey 1975, Foster 1975, Johansen 1981, Paine
1984, Steneck 1986). Elas são os primeiros organismos colonizadores de espaços nus
(Matsuda 1989, Kendrick 1991) além de competidores dominantes por espaço (Quinn
1982, Paine 1984, Steneck 1986), construtores de recifes (Adey 1998, Chisholm 2003) e
de estruturas carbonáticas (nódulos calcários de vida livre, formados for algas nãogeniculadas) denominadas rodolitos (Foster 2001, Amado-Filho et al. 2007).
Os corais escleractínios - denominados anteriormente como hermatípicos mineralizam o carbonato de cálcio na forma de aragonita, sendo assim, esses
organismos também podem sofrer com os efeitos da alteração do pH na água do mar.
Os corais segregam CaCO3 pela epiderme de sua base, formando um esqueleto rígido
calcificado (Goreau et al. 1979). Os recifes coralíneos estão entre os ecossistemas mais
ricos e produtivos, provendo serviços ecológicos e subsistência para cerca de 500
milhões de pessoas (Wilkinson 2004). Metade dos recifes do mundo desapareceu nas
últimas cinco décadas e 70% do restante está criticamente degradado (Pandolfi et al.
2003, Wilkinson 2004). Estudos indicam que as taxas de calcificação de corais
construtores de recifes de regiões tropicais serão reduzidas entre 20-60% quando as
concentrações de CO2 atingirem o dobro das concentrações pré-industriais (cerca de 560
ppm) (Gattuso et al. 1998, Langdon 2003, The Royal Society 2005).
As formações coralíneas e bancos de rodolitos (formados por algas calcárias) são
reconhecidos como os mais importantes bioconstrutores de carbonato de cálcio e
contribuem significativamente no ciclo do CaCO3 nos ecossistemas costeiros tropicais.
Neste sentido, é fundamental avaliar os efeitos que a acidificação dos oceanos pode
trazer a esses ecossistemas.
Entre as algas calcárias e não-calcárias testadas até o presente, pode-se dizer que
não há um padrão em relação às respostas quanto à produção primária, crescimento ou
calcificação frente à acidificação (Hurd et al. 2009). O que é observado é que o espectro
de respostas pode ser devido a diferenças inerentes a fisiologia das algas, ao ambiente
onde a alga cresceu antes do experimento, à escala de tempo das respostas fisiológicas
medidas (ex. estimativas de fotossíntese vs. crescimento), duração do experimento ou
8
época do ano (Tortell et al. 2008). Outro fator que influencia é a escolha do método de
manipulação do pH, pois ele pode afetar de maneira diferente a química do carbonato
(Iglesias-Rodriguez et al. 2008, Riebesell et al. 2008).
Assim, não há ainda modelos disponíveis que permitam prever o impacto, em
diversos organismos e ecossistemas marinhos, do aumento da concentração atmosférico
do CO2 e, consequentemente, do grau de acidificação dos oceanos. Neste contexto, é
preocupante como estas mudanças globais poderão afetar, inclusive, os organismos que
formam os ambientes recifais brasileiros mais extensos, ricos e com elevada taxa de
endemismo, como o Banco dos Abrolhos, onde ocorrem extensas formações coralíneas
(recifes e banco de rodolitos).
Nesse sentido procuramos, nesse projeto, comparar o efeito da acidificação em
organismos construtores e não construtores importantes no contexto da biodiversidade
tropical brasileira. Foram escolhidos para esse estudo uma alga calcária incrustante
(Lithothamnion superpositum) e um coral (Mussismillia braziliensis), organismos
construtures, e a macroalga endêmica Laminaria abyssalis.
Figura 1: L. superpositum (Fonte: Bahia
2010).
9
Figura 2: M. braziliensis (Fonte: Francini-Filho 2005)
Figura 3: Indivíduo de L. abyssalis associado a
rodolitos (Fonte: Marins 2009)
2.
Hipóteses
 A acidificação da água do mar altera o padrão de calcificação dos organismos
bioconstrutores, reduzindo a calcificação num primeiro momento e causando a
descalcificação, em condições extremas de acidificação.
10
 A acidificação da água do mar altera as respostas fisiológicas e celulares dos
corais e das algas.
 O grau de interação entre as colônias do coral e as zooxantelas diminui com a
acidificação da água do mar.
 O aumento da concentração de CO2 e a redução dos valores do pH causa danos
aos tecidos dos organismos bioconstrutores.
 A taxa de sobrevivência de esporos de L. abyssalis é menor em virtude da
acidificação da água do mar, devido as alterações quimiosmóticas induzidas pela
queda do pH.
3. Objetivos
 Objetivo geral: Testar os efeitos da acidificação da água do mar, causado pelo
aumento das concentrações de CO2 atmosférico, na biologia celular e fisiologia
de macroalgas marinhas e corais escleractínios.
 Objetivos específicos:
- Verificar se a acidificação da água do mar interfere nas taxas de mineralização
de CaCO3 no coral e na alga calcária.
- Avaliar as respostas fisiológicas e celulares no coral, na alga calcária e em L.
abyssalis, em diferentes condições de acidificação da água do mar.
- Determinar se a acidificação da água do mar altera as taxas de
sobrevivência/letalidade do coral e da alga calcária.
- Verificar se a capacidade reprodutiva de L. abyssalis é prejudicada pela
acidificação da água do mar.
4. Justificativa
Atualmente, várias pesquisas vêm sendo desenvolvidas para avaliar a influência
das mudanças climáticas, mais especificamente, da acidificação dos oceanos, em
11
organismos marinhos. No entanto, esses trabalhos estão voltados principalmente a
respostas fisiológicas, como crescimento, enquanto que respostas celulares não têm sido
frequentemente estudadas, principalmente em relação à calcificação.
Já se considera que o processo de biomineralização em organismos marinhos
está sendo drasticamente afetado pelo aumento das concentrações de CO2 nos oceanos.
Ao mesmo tempo, tem sido cada vez maior a demanda por informações científicas no
intuito de determinar a capacidade de resistência e resiliência destes organismos e das
comunidades marinhas associadas. Sem dúvida, apenas com informações deste tipo será
possível elaborar e executar estratégias de conservação e manejo e fomentar novas
ações que visem à diminuição das emissões atmosféricas de CO2.
A escolha dos modelos desse estudo foi baseada nos seguintes critérios: L.
superpositum – alga calcária incrustante mais importante em termos de abundância e
distribuição no Banco do Abrolhos, maior recife coralíneo do Atlântico Sul (AmadoFilho et al. 2012); M. braziliensis – coral endêmico do Brasil e principal espécie de
coral em águas rasas do Banco dos Abrolhos (Leão & Kikuchi 2001); L. abyssalis, alga
do tipo “kelp” endêmica do Brasil, com elevada importância econômica e ecológica
(Marins et al. 2012) e que ocorre do sul do Banco dos Abrolhos até o norte do Estado do
Rio de Janeiro.
5. Material e Métodos
5.1. Área de estudo
O complexo recifal de Abrolhos ou Banco dos Abrolhos (16°50’ - 19°45’ S)
localiza-se entre o sul da Bahia e o norte do Espírito Santo. Corresponde a uma área de
~46,000 km2, e é considerada a mais extensa área recifal do Brasil e do Atlântico Sul
(Leão & Ginsburg 1997, Leão 2002), tendo como principal componente biológico as
algas calcárias coralíneas (Kempf 1970, Mello et al. 1975, Leão & Ginsburg 1997,
Leão 1996). Apesar da importância, a área do Parque Nacional Marinho dos Abrolhos
representa apenas ¼ da área recifal de Abrolhos.
A forma de crescimento dos recifes é bem característica, a partir de uma
estrutura em forma de cogumelo, denominada “chapeirão” (Leão 2002).
O clima é tropical e úmido, com precipitação pluvial média de 17,5 cm ao ano
(Nimer 1989). A temperatura da água do mar varia entre 23ºC (inverno) e 27ºC (verão)
(Muehe 1988).
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5.2. Amostragens
As coletas das algas calcárias e das colônias do coral serão realizadas na porção
central do Banco dos Abrolhos (17º32’23’’S, 38º12’91’’W). Amostragens destrutivas,
com auxílio de martelo e ponteira, serão realizadas através de mergulho autônomo e
livre em profundidades de 25 m. Os indivíduos de L. abyssalis (17 esporófitos férteis)
foram coletados no sul do Banco dos Abrolhos, em agosto de 2010.
O material coletado será trazido ao laboratório para ser realizado o cultivo das
algas e dos corais. Todo material será acondicionado em caixas plásticas opacas, de
modo a proteger o material contra a luminosidade excessiva e preservar pelo maior
período de tempo possível sua coloração original.
5.3. Efeito in vitro do aumento da concentração de CO2 e da redução dos
valores de pH
Colônias de M. braziliensis e indivíduos de L. superpositum serão transportados
para o Laboratório de Algas (IPJBRJ). As amostras serão mantidas para aclimatação por
15 dias em tanques aerados. Os indivíduos de L. abyssalis, coletados no sul do Banco
dos Abrolhos, já se encontram em cultivo em câmaras de germinação, em placas de
vidro com água do mar, enriquecida com meio Provasoli 25% e dióxido de germânio
0,1 mg/L, temperatura de 16°C, fluxo luminoso alternado claro: escuro (16h:8h) e
intensidade luminosa constante (5 µE.m‾2.s‾1).
Para avaliar a influência da concentração de CO2 e do pH nas taxas de
mineralização e em outros processos celulares e fisiológicos dos organismos estudados,
serão utilizados o método de injeção de CO2 atmosférico e adição de HCl/NaOH, em
sistemas diferentes. Serão realizados experimentos no período de incubação de 15 e 30
dias. Para ambos os métodos, os indivíduos de L. superpositum e as colônias de M.
braziliensis serão cultivados em tempos diferentes. A massa média inicial dos indivíduos
cultivados será determinada (em média será utilizada 5 g por indivíduo).
Para o método de injeção de CO2, espécimes de dimensões semelhantes serão
mantidos em 2 aquários de 10 L, sendo 5 porções de indivíduos em cada aquário. Os
aquários serão abastecidos com do mar água filtrada proveniente de uma caixa acrílica
(40 L), na qual haverá manipulação das concentrações de CO2 atmosférico. Esse sistema
será fechado e haverá circulação da água entre a caixa acrílica e os aquários. Haverá
injeções de CO2 na atmosfera das caixas acrílicas (uma caixa para cada concentração de
13
CO2) a fim de atingir as concentrações correspondentes ao cenário A1F1 do IPCC
(Intergovernmental Panel on Climate Change), representados na tabela a seguir. O
experimento “controle” corresponderá ao tratamento cuja concentração de CO2
representa os níveis atuais. A concentração de CO2 será ajustada utilizando um
controlador com sensor de CO2 Fuzzy Logic acoplado a um regulador e um cilindro de
CO2.
Período
Concentração de CO2 (ppm)
Valores de pH
Pré-industrial
300
~ 8.2
Presente (“Controle”)
400
~8
Ano 2050
560
~ 7.8
Final do século
1140
~ 7.6
Tabela 1: Concentrações de CO2 e valores de pH usados nos experimentos in vitro
(Cenário A1F1 do IPCC).
Adicionalmente, em outros tanques, haverá adições de HCl/NaOH, para manipular
o pH da água do mar, a fim de atingir os valores correspondentes aos das concentrações
de CO2 citadas anteriormente. Serão cultivados, separadamente, indivíduos da alga
calcária e do coral em dois aquários (n=5) para cada tipo de organismo, com 5 L cada.
Para cada valor de pH haverá 2 aquários para cada organismo.
Os indivíduos de L. abyssalis serão cultivados em placas de Petri (fundas) nas
quais será manipulado o pH somente pela adição de HCl/NaOH.
Os parâmetros físico-químicos (pH, salinidade, temperatura, concentração de
carbonatos, alcalinidade total) da água do mar serão medidos semanalmente.
A partir desse experimento, serão avaliados diversos parâmetros relacionados à
biologia celular dos organismos, que serão explicitados a partir do sub-item seguinte.
5.4. Determinação das taxas de mineralização de CaCO3 nos organismos
calcificadores
A taxa de mineralização será avaliada para verificar se haverá diferenças induzidas
pelas diferentes concentrações de CO2 e valores de pH, no coral e na alga calcária. A
taxa de mineralização será obtida pelo cálculo do volume deslocado pelos indivíduos no
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tempo inicial e após o experimento de incubação. Basicamente, determina-se o volume
deslocado de água após a imersão da amostra em um becker graduado. O método do
volume deslocado para estimativa da massa seca de CaCO3 é validado posteriormente
relacionando o volume final versus a massa seca determinada após secagem do material
a 500°C.
5.5. Avaliação das respostas fisiológicas
Serão avaliadas as taxas de fotossíntese e quantificação de pigmentos em
organismos calcificadores e em L.abyssalis.
A taxa de fotossíntese será medida in vitro, com a utilização de um fluorímetro
("Diving-PAM") para medição da fotossíntese por fluorescência da clorofila. Para a
quantificação de pigmentos fotossintetizantes será feita a extração, purificação e
quantificação dos pigmentos utilizado um cromatógrafo líquido de alta performance
Shimadzu Prominence acoplado a detectores de absorção UV-Visível-Infravermelho e de
emissão de fluorescência 400-750 nm.
5.6. Avaliação das respostas celulares
Serão avaliados os seguintes parâmetros: volume celular e espessura da parede
celular, quantificação de substâncias de reserva, interações simbióticas entre corais e
zooxantelas e síntese de matriz extracelular.
Serão avaliados, antes e após os experimentos, o volume celular e a espessura da
parede celular. Para a análise do volume celular, será utilizado o marcador fluorescente
Fm4-64 (para marcação do folheto externo da bicamada plasmática) e para a análise da
espessura da parede celular, será utilizado o marcador fluorescente Calcofluor White
(para marcação da celulose nas paredes celulares). Em seguida, serão obtidas imagens de
células superficiais fixadas e desmineralizadas de corais e algas calcárias e de L.
abyssalis por microscopia confocal de varredura a laser (LSM – sigla do termo em inglês
Laser Scanning Microscopy). A partir das imagens obtidas será realizada a reconstrução
tridimensional das células e o cálculo do volume intracelular, comparando células de
mesmos indivíduos antes e depois do experimento de cultivo em diferentes
concentrações de CO2 e valores de pH. Por fim, as taxas relativas de crescimento ou
redução do volume celular serão comparadas entre os diferentes tratamentos.
Para a quantificação das substâncias de reserva nas algas e nos corais,
especificamente para grãos de amido das florídeas, será utilizada a microscopia
15
eletrônica de transmissão convencional (MET), para a contagem e medida dos grãos de
amido comparando os diferentes indivíduos de tratamentos e tempos (zero e final). As
amostras para MET serão fixadas (GA 2,5%, PA 4% em CACO 0,1 M), lavadas,
desmineralizadas em EDTA 10%, lavadas, pós-fixadas (OsO4), desidratadas, incluídas
em resina SPURR, cortadas em ultramicrótomo e observadas ao microscópio eletrônico.
Para a quantificação de lipídeos, será utilizado o marcador fluorescente de lipídeos
neutros Nile Red. As amostras serão fixadas (formaldeído 4%), desmineralizadas em
EDTA 10%, incubadas com Nile Red a 10ug/mL por 30 min., lavadas em PBS (pH 6,5),
montadas em lâminas com n-propilgalacto diluído em glicerol:PBS (9:1) 0,2 M e, em
seguida, observadas por LSM (emissão 535 nm), para análise de número e tamanho de
gotículas lipídicas.
Para a análise do efeito do aumento da concentração de CO2 e da redução dos
valores do pH nas interações simbióticas entre os corais e as zooxantelas será analisada a
taxa de fotossíntese, pela fluorescência dos pigmentos fotossintetizantes e a densidade e
integridade celular das zooxantelas. Será determinada a densidade de zooxantelas e de
cloroplastos, pela fluorescência dos pigmentos fotossintetizantes, em células fixadas e
desmineralizadas, operando o microscópio confocal (LSM) no modo de varredura
espectral (de 450 a 700 nm de emissão de fluorescência). Por MET (protocolo descrito
anteriormente), as células das zooxantelas serão analisadas quanto a sua integridade
estrutural.
Para a análise de atividades relacionadas à síntese de matriz extracelular em células
da alga calcária e do coral, será avaliada, por MET, a atividade do aparato de Golgi
(analisando número e tamanho de cisternas) e a densidade de vesículas exocitando
substâncias para as paredes celulares e ainda, as mudanças na composição da matriz
extracelular, por testes citoquímicos (segundo de Souza, 2007).
5.7. Determinação da taxa de sobrevivência/letalidade do coral e da alga
calcária
As taxas de sobrevivência/letalidade de colônias de M. braziliensis e indivíduos de
L. superpositum serão avaliadas pelo estado de vitalidade dos organismos, determinado
pela coloração (Pereira Filho et al. 2012). As imagens serão obtidas com o uso de um
estereomicroscópio e analisadas no programa de computação Coral Point Count with
excel extensions (CPCe) (Kohler & Gill 2006).
16
5.8. Avaliação da capacidade reprodutiva e da taxa de sobrevivência de esporos
de L. abyssalis
Será avaliada a capacidade reprodutiva de L. abyssalis, pela obtenção de
esporófitos a partir de gametófitos masculinos e femininos (já em cultivo) e será
analisada a taxa de sobrevivência destes esporófitos. Isso ocorrerá em meios de cultivo
com diferentes valores de pH.
6. Cronograma de metas
SEMESTRES
Metas
2012
2013
2014
2015
1
1
1
1
2
2
2
2
2016
1
Realização das disciplinas
Estágio em docência
Exame de qualificação
Amostragens
Efeito in vitro do aumento
atmosférico e da queda do pH
do
CO2
Determinação das taxas de mineralização de
CaCO3
Avaliação das respostas fisiológicas
Avaliação das respostas celulares
Determinação
da
taxa
de
sobrevivência/letalidade dos corais e das algas
calcárias
Avaliação da capacidade reprodutiva
sobrevivência de esporos de L. abyssalis
e
Tratamento e análise de dados
17
Produção de artigos científicos
Redação da tese
Defesa da tese
7. Orçamento
Descrição
Quant.
1. CUSTEIO
1.1.Material de consumo
Reagentes, vidraria, bombas, peças de
reposição para equipamentos, dentre outros.
1.2.Serviços de terceiros Pessoa Jurídica
Serviço de apoio náutico
Gases (CO2)
1.3.Diárias
1.4.Passagens aéreas (GIG/SSA)
Total
Preço
Preço
Unit. (R$) Total (R$)
Vários
n.d.
25.000,00
2
10
8
4
1.000,00
1.000,00
187,83
800,00
2.000,00
10.000,00
1.502,64
2.400,00
40.902,64
Este projeto está integrado a outros projetos através da complementariedade dos
resultados a serem obtidos.
A maior parte da infra-estrutura e de apoio técnico está assegurada pelo apoio
institucional através da disponibilização de equipamentos como, microscópios ópticos e
eletrônicos, laboratório de cultivo de algas, parte dos reagentes para preparação e
fixação de amostras, câmeras de vídeos, ROV, outros equipamentos fotográficos,
computadores, softwares específicos, além dos pesquisadores e professores envolvidos.
Além disso, também há a colaboração com instituições externas, como UFRJ (Labs.
Biomineralização,
Ultraestrutura
Celular
Hertha
Meyer,
Pinças
Ópticas
e
Microbiologia) e INMETRO (Lab. Biotecnologia), onde há disponibilidade de
utilização dos equipamentos, assim como de auxílio de técnicos.
8. Referências bibliográficas
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Rio de Janeiro, _______ de ________________ de 2012
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Vanessa Moura dos Reis
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Leonardo Tavares Salgado (orientador)
_____________________________________________
Gilberto Menezes Amado Filho (co-orientador)
25