UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
DIAGNÓSTICO GENÉTICO E MOLECULAR
EFEITOS IN VITRO DOS PRINCIPAIS METABÓLITOS
ACUMULADOS NA ACIDEMIA ISOVALÉRICA SOBRE
VÁRIOS PARÂMETROS DO METABOLISMO
ENERGÉTICO EM CÉREBRO DE RATOS JOVENS
Dissertação para obtenção do Título de
Mestre em Diagnóstico Genético e
Molecular
FABRÍCIO BALESTRO
ORIENTADOR: Prof. Dr. MOACIR WAJNER
CANOAS
2006
Dedico este trabalho a minha mãe Ana,
que sempre me apoiou em minhas decisões
e foi a principal idealizadora de minhas conquistas.
2
AGRADECIMENTOS
A todos os colegas do Diagnóstico Genético pela excelente convivência.
Às minhas colegas e amigas do laboratório 38: Carol, Anelise, Anna, Paula
e Bianca pelo companheirismo e cooperação.
Aos colegas e amigos Alexandre, Josué e Alexandre Solano pelo clima
alegre que sempre proporcionaram.
Às super Pati e Lali pelas dicas, instruções e alegria de ajudar e conviver.
Aos meus “brothers azuis” Guilhian, Gus e Rafa pela amizade verdadeira,
respeito, companheirismo e vibração tanto nos momentos de trabalho como
naqueles de folga.
Às amigas Karina Dalcin e Karina Scussiato, sempre presentes, e também
a Carolzinha pela amizade e o ótimo convívio desenvolvido.
À amiga e colega Vanessa, fundamental, pela competência e o empenho
com que desempenhou todo o trabalho ao nosso lado durante estes dois anos.
Ao meu grande amigo e parceiro César, “o pai do ano”, que foi
indispensável para a realização deste trabalho, pela paciência,
tranqüilidade,
sabedoria e acima de tudo, extrema competência em tudo o que faz.
Ao Professor, Orientador, amigo Moacir Wajner pelo carinho e dedicação
demonstrados desde o primeiro momento, pelo entusiasmo manifestado a cada
dia e pela infinita capacidade de concretizar sonhos.
A todos os demais colegas do Departamento de Bioquímica, principalmente
do laboratório de Erros Inatos do Metabolismo pela ajuda e amizade.
3
À minha família Ana, Alberto, Vinícius e Franciele, onde tudo começou,
pelo carinho, amor, dedicação e apoio demonstrados sempre, principalmente em
momentos difíceis.
À vó Maria por tudo o que realizou por mim durante todos esses anos e
principalmente agora.
À Caro pela paciência, compreensão e ajuda durante toda esta jornada.
A Deus.
4
Índice
Lista de Abreviaturas............................................................................................ 09
Lista de Figuras.................................................................................................... 11
RESUMO................................................................................................................ 16
ABSTRACT............................................................................................................. 18
1.INTRODUÇÃO..................................................................................................... 20
1.1 Erros inatos do metabolismo........................................................................ 20
1.1.1 Acidemias Orgânicas.................................................................................. 22
1.1.1.1 Acidemia Isovalérica................................................................................ 24
1.1.1.1.1 Aspectos clínicos..................................................................................... 26
1.1.1.1.2 Metabólitos anormais............................................................................... 27
1.1.1.1.3 Deficiência da enzima e genética............................................................ 28
1.1.1.1.4 Diagnóstico.............................................................................................. 29
1.1.1.1.5 Tratamento............................................................................................... 31
1.2 Metabolismo energético cerebral................................................................. 32
1.2.1 Fosforilação oxidativa................................................................................. 34
1.2.1.1 NADH desidrogenase (Complexo I)............................................................ 36
1.2.1.2 Coenzima Q (Ubiquinona).......................................................................... 37
1.2.1.3 Complexo II e Succinato desidrogenase.................................................... 37
1.2.1.4 Complexo III: Complexo b-c1 e Citocromo c.............................................. 38
1.2.1.5 Complexo IV: Citocromo oxidase............................................................... 38
1.2.2 Bombeamento de prótons.......................................................................... 39
1.2.2.1 Transferência seqüencial de elétrons......................................................... 39
1.2.3 Creatina quinase ......................................................................................... 40
1.2.4 Na+,K+ATPase............................................................................................... 43
2.OBJETIVOS........................................................................................................ 47
2.1 Gerais............................................................................................................... 47
2.2Específicos........................................................................................................ 47
3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 48
3.1 Reagentes........................................................................................................ 48
3.1.1 Reagentes utilizados...................................................................................
48
5
3.1.2 Equipamentos..............................................................................................
50
3.2 Caracterização da amostra.............................................................................. 51
3.3 Produção de CO2 por homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens..
...............................................................................................................................
52
3.3.1 Preparação do tecido ................................................................................... 53
3.3.2 Captação de CO2 ......................................................................................... 53
3.4 Determinação das atividades dos complexos da cadeia respiratória em
homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens....................................... 54
3.4.1 Soluções........................................................................................................ 54
3.4.1.1 Soluções para preparação da amostra....................................................... 54
3.4.1.2 Soluções para a determinação da atividade do complexo I....................... 55
3.4.1.3 Soluções para a determinação da atividade do complexo II e SDH ......... 55
3.4.1.4 Soluções para a determinação da atividade do complexo II+CoQ+III....... 56
3.4.1.5 Soluções para a determinação da atividade do complexo IV ................... 57
3.4.2 Preparação dos tecidos para a medida das atividades dos complexos da
cadeia respiratória.................................................................................................. 57
3.4.3 Determinação da quantidade de proteína..................................................... 58
3.4.4 Medida das atividades dos complexos da cadeia respiratória...................... 58
3.4.4.1 Determinação da atividade do complexo I (NADH desidrogenase)........... 58
3.4.4.2 Determinação da atividade do complexo II (succinato DCIP oxiredutase). 59
3.4.4.3 Determinação da atividade da SDH (succinato: fenazina oxirredutase).... 59
3.4.4.4 Determinação da atividade do complexo II+CoQ+III (succinato: citocromo c
oxiredutase)...........................................................................................................
60
3.4.4.5 Determinação da atividade do complexo IV (citocromo c oxidase)...........
60
3.5 Determinação da atividade da creatina quinase.......................................... 61
3.5.1 Soluções........................................................................................................ 61
3.5.2 Preparação de tecidos para a medida da atividade da creatina quinase...... 62
3.5.3 Determinação da quantidade de proteína..................................................... 63
3.5.4 Determinação da atividade enzimática da creatina quinase......................... 63
3.6 Determinação da atividade da Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas
sinápticas isoladas de córtex cerebral de ratos jovens................................... 64
3.6.1 Preparação de membranas plasmáticas sinápticas...................................... 65
3.6.2 Preparação de membranas plasmáticas sinápticas com pré-incubação de 1
6
hora a 37°C............................................................................................................. 66
3.6.3 Determinação da quantidade de proteína..................................................... 66
3.6.4 Determinação da atividade enzimática.......................................................... 67
3.7 Análise estatística............................................................................................. 67
4. RESULTADOS................................................................................................... 69
4.1 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico (3OHIVA) e da isovalerilglicina (IVG) sobre a produção de CO2 a partir de acetato
em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens................................. 69
4.2 Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre a atividade dos complexos enzimáticos da cadeia
respiratória em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens............ 73
4.2.1 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico (3OHIVA) e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do complexo I da cadeia
respiratória
em
homogeneizados
de
córtex
cerebral
de
ratos
jovens....................................................................................................................
73
4.2.2 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do complexo II da cadeia respiratória
em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens.......................................
77
4.2.3 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da enzima succinato desidrogenase
(SDH) em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens...........................
81
4.2.4 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do complexo II-III da cadeia respiratória
em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens....................................... 85
4.2.5 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do complexo IV da cadeia respiratória
em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens....................................... 89
4.3 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da enzima creatina quinase (CK
total) em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens....................... 93
4.4 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membranas
plasmáticas
sinápticas
isoladas
de
córtex
cerebral
de
ratos
7
jovens.................................................................................................................... 97
4.5 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em membranas
plasmáticas sinápticas de homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens
quando pré-incubados durante 1 hora a 37°C................................................... 101
4.6 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) na presença de glutationa reduzida
(GSH), do inibidor da óxido nítrico sintase N -nitro-L-argininametiléster (LNAME), da vitamina E (VIT E) ou da creatina (Cr) sobre a atividade da Na+,K+ATPase em membranas plasmáticas sinápticas de homogeneizados de córtex
cerebral
de
ratos
jovens
quando
co-incubados
durante
1
hora
a
37°C...................................................................................................................... 105
5. DISCUSSÃO..................................................................................................... 108
6. CONCLUSÕES................................................................................................. 113
7. BIBLIOGRAFIA................................................................................................ 115
8
Lista de Abreviaturas
•
3-OHIVA – ácido 3-hidroxiisovalérico
•
ADP – adenosina difosfato
•
ANOVA – análise de variância de uma via
•
ATP – adenosina trifosfato
•
CG – cromatografia gasosa
•
CK – creatina quinase
•
CoA – coenzima A
•
CoQ – coenzima Q
•
COX – citocromo c oxidase
•
Cr – creatina
•
Cys – cisteína
•
DCIP – dicloroindofenol
•
EDTA – ácido etileno-diamino-tetra-acético
•
EIM – erros inatos do metabolismo
•
FAD – flavina adenina dinucleotídeo (forma oxidada)
•
FADH2 – flavina adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
•
GSH – glutationa reduzida
•
HEPES – ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-etano sulfônico
•
IVA – ácido isovalérico
•
IVG – isovalerilglicina
•
L-NAME – N -nitro-L-argininametiléster
•
MS/MS – espectrometria de massa em tandem
9
•
NAD+ - nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada)
•
NADH – nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
•
PCr – fosfocreatina
•
pHMB – ácido p-hidroximercuribenzóico
•
Pi – fosfato inorgânico
•
POP - 2-difenil-oxazol
•
POPOP - 1,4-bis[2-(5-feniloxazolil)benzeno]
•
PMS – matassulfato de fenazina
•
SDH – succinato desidrogenase
•
SNC - sistema nervoso central
•
SPSS - pacote estatístico para ciências sociais
•
TCA – ácido tricloroacético
10
Lista de Figuras
•
Figura 1.1 Catabolismo da leucina..............................................................25
•
Figura 1.2 Fluxo de elétrons pela cadeia respiratória.................................36
•
Figura 1.3 Reação catalisada pela creatina quinase..................................40
•
Figura 1.4 Função do sistema Cr/CK/PCr...................................................42
•
Figura 1.5 Estrutura da Na+,K-ATPase.......................................................44
•
Figura 4.1 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a produção de
CO2 a partir de acetato em homogeneizados de córtex cerebral de ratos
jovens..........................................................................................................70
•
Figura 4.2 Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
produção de CO2 a partir de acetato em homogeneizados de córtex
cerebral de ratos jovens..............................................................................71
•
Figura 4.3 Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a produção de CO2
a partir de acetato em homogeneizados de córtex cerebral de ratos
jovens..........................................................................................................72
•
Figura 4.4 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade do
complexo I da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens............................................................................................74
•
Figura 4.5 Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade do complexo I da cadeia respiratória em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens...................................................................75
•
Figura 4.6 Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do
complexo I da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens............................................................................................76
11
•
Figura 4.7 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade do
complexo II da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens............................................................................................78
•
Figura 4.8 Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade do complexo II da cadeia respiratória em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens...................................................................79
•
Figura 4.9 Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do
complexo II da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens............................................................................................80
•
Figura 4.10 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade da
enzima succinato desidrogenase (SDH) em homogeneizados de córtex
cerebral de ratos jovens..............................................................................82
•
Figura 4.11 Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade da enzima succinato desidrogenase (SDH) em homogeneizados
de córtex cerebral de ratos jovens..............................................................83
•
Figura 4.12 Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da
enzima succinato desidrogenase (SDH) em homogeneizados de córtex
cerebral de ratos jovens..............................................................................84
•
Figura 4.13 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade do
complexo II-III da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex
cerebral de ratos jovens..............................................................................86
•
Figura 4.14 Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade do complexo II-III da cadeia respiratória em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens...................................................................87
12
•
Figura 4.15 Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do
complexo II-III da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex
cerebral de ratos jovens..............................................................................88
•
Figura 4.16 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade do
complexo IV da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens............................................................................................90
•
Figura 4.17 Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade do complexo IV da cadeia respiratória em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens...................................................................91
•
Figura 4.18 Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do
complexo IV da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens............................................................................................92
•
Figura 4.19 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade da
enzima creatina quinase (CK total) em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens............................................................................................94
•
Figura 4.20 Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade da enzima creatina quinase (CK total) em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens...................................................................95
•
Figura 4.21 Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da
enzima creatina quinase (CK total) em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens............................................................................................96
•
Figura 4.22 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade da
Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas isoladas de córtex
cerebral de ratos jovens..............................................................................98
13
•
Figura 4.23 Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade da Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas
isoladas de córtex cerebral de ratos jovens................................................99
•
Figura 4.24 Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da
Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas isoladas de córtex
cerebral de ratos jovens............................................................................100
•
Figura 4.25 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade da
Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas de córtex cerebral
de ratos jovens quando pré-incubado durante 1 hora a 37°C..................102
•
Figura 4.26 Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade da Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas de
córtex cerebral de ratos jovens quando pré-incubado durante 1 hora a
37°C..........................................................................................................103
•
Figura 4.27 Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da
Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas de córtex cerebral
de ratos jovens quando pré-incubada durante 1 hora a 37°C.................104
•
Figura 4.28 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) na presença do
antioxidante glutationa reduzida (GSH, 1 mM) e do inibidor da óxido nítrico
sintase N -nitro-L-argininametiléster (L-NAME, 1 mM) sobre a atividade da
Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas de córtex cerebral
de
ratos
jovens
quando
co-incubados
durante
1
hora
a
37°C..........................................................................................................106
•
Figura 4.29 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) na presença do
antioxidante vitamina E (VIT E, 1 mM) e creatina (Cr, 1 mM) sobre a
atividade da Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas de
14
córtex cerebral de ratos jovens quando co-incubados durante 1 hora a
37°C..........................................................................................................107
15
RESUMO
A acidemia isovalérica é uma doença hereditária neurometabólica causada
pela deficiência da isovaleril-CoA desidrogenase da rota de degradação da
leucina, caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo principalmente dos ácidos
isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA), bem como da isovalerilglicina
(IVG) nos tecidos e fluidos biológicos dos pacientes. Os pacientes apresentam
também acidose metabólica, acidúria lática, cetonúrica, e hiperamonemia
moderadas. Clinicamente caracteriza-se por sintomas neurológicos severos, tais
como convulsões, coma e letargia.
Tendo em vista que os mecanismos envolvidos no dano cerebral dessa
doença até o momento são pouco conhecidos e que o aumento de ácido lático
indica disfunção mitocondrial, o presente trabalho teve por objetivo investigar os
efeitos in vitro do IVA, 3-OHIVA e da IVG sobre vários parâmetros do
metabolismo energético em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida.
Nossos resultados demonstraram que o IVA, nas concentrações de
0,01 a 5 mM e o 3-OHIVA e a IVG, nas concentrações de 0,01 a 1 mM, não
inibiram a produção de CO2 por homogeneizados de córtex cerebral de ratos
jovens a partir de acetato, indicando que os principais metabólitos acumulados na
acidemia isovalérica não comprometem a atividade do ciclo do ácido cítrico.
Similarmente, estes metabólitos, nas mesmas concentrações, não alteraram as
atividades dos complexos I, II, II-III, e IV da cadeia respiratória, bem como da
enzima sucinato desidrogenase em homogeneizados de córtex cerebral. Além
disso, a creatina quinase, uma enzima crucial envolvida na transferência
16
intracelular de ATP, não foi modificada pela presença das doses máximas
utilizadas dessas substâncias.
Por outro lado, a atividade da Na+,K+-ATPase de membranas plasmáticas
sinápticas foi significativamente inibida quando os homogeneizados de córtex
cerebral foram pré-incubados por uma hora com 5 mM de IVA e as membranas
sinápticas preparadas a seguir. No entanto, a exposição direta de membranas
sinápticas purificadas de córtex cerebral ao IVA não provocou qualquer inibição
da atividade da Na+,K+-ATPase, indicando que esse ácido provavelmente está
agindo via um mecanismo indireto que provoca a inibição dessa atividade
enzimática. Por outro lado, o 3-OHIVA e IVG não foram capazes de inibir essa
enzima quando expostos aos homogeneizados ou diretamente às membranas
sinápticas purificadas, indicando uma ação específica do IVA.
Quando o IVA foi testado na presença dos antioxidantes vitamina E ou
creatina, estes foram capazes de impedir a redução da atividade da enzima pela
ação do IVA, sugerindo que a enzima teve a sua atividade diminuída via radicais
livres, causando lipoperoxidação da membrana plasmática onde a enzima está
inserida, assim afetando-a indiretamente.
Concluindo, o presente trabalho demonstrou que o IVA, o metabólito que mais
se acumula na acidemia isovalérica, inibe uma enzima crucial envolvida na
manutenção
do
potencial
de
membrana
basal
necessária
para
uma
neurotransmissão normal. É possível que a inibição dessa enzima possa
contribuir, ao menos em parte para a encefalopatia encontrada na acidemia
isovalérica, especialmente durante as crises de descompensação metabólica em
que os metabólitos tóxicos acumulados aumentam dramaticamente suas
concentrações teciduais.
17
ABSTRACT
Isovaleric acidemia is an inherited neurometabolic disorder of the
catabolism of leucine caused by deficiency of isovaleryl-CoA dehydrogenase,
biochemically characterized by accumulation of isovaleric acid (IVA), 3hydroxyisovaleric acid (3-OHIVA), as well as isovalerylglycine (IVG) in tissues and
biological fluids. Affected patients also present metabolic acidosis, lactic aciduria,
ketonuria and moderate hiperammonemia. Clinically, it is characterized by severe
neurological symptoms, such as convulsions, coma and lethargy.
Since the mechanisms inolved in the cerebral damage in this disorder are
still poorly known and the increase of lactic acid indicates mitochondrial
dysfunction, the present work aimed to investigate the in vitro effects of IVA, 3OHIVA and IVG on various parameters of energy metabolism in cerebral cortex of
30-day-old rats.
Our results showed that IVA, at concentrations varying from 0.01 to 5 mM,
and 3-OHIVA and IVG, at concentrations varying from 0.01 to 1 mM, did not inhibit
CO2 production from acetate by cerebral cortex homogenates from young rats,
indicating that the principal metabolites accumulated in isovaleric acidemia do not
compromise ctric acid cycle activity. Similarly, these metabolites, at the same
concentrations, did not alter the activities of complexes I, II, II-III and IV of the
respiratory chain and succinate dehydrogenase activity in cerebral cortex
homogenates.
In addition, creatine kinase, a crucial enzyme involved in
intracellular ATP transfer, was not affected by the presence of maximal doses of
these substances.
18
Conversely, the activity of Na+,K+-ATPase from synaptic plasma membranes was
significantly inhibited when cortical homogenates were pre-incubated for one hour
with 5 mM IVA and the synaptic membranes prepared afterwards. However, direct
exposition of purified synaptic membranes from cerebral cortex to IVA did not
provoke any inhibition of Na+,K+-ATPase activity, indicating that this acid probably
acted through an indirect mechanism that cause inhibition of this enzyme activity.
In contrast, 3-OHIVA and IVG were not able to inhibit this activity, when exposed
to homogenates or directly to purified synaptic membranes, suggesting a selective
effect of IVA.
When IVA was tested in the presence of the antioxidants vitamin E or
creatine, these compounds prevented the reduction of this enzyme activity caused
by IVA, suggesting that the enzyme had its activity reduced via free radicals,
probably causing lipid peroxidation of the plasma membrane where the enzyme is
embebbed, thus causing an indirect action on the enzyme.
In conclusion, the present work demonstrated that IVA, the metabolite that
most accumulates in isovaleric acidemia, inhibits a crucial enzyme involved in the
maintenance of the membrane potential necessary to a normal neurotransmission.
It is possible that inhibition of this enzyme may contribute, at least in part, to the
encephalopathy found in isovaleric acidemia, especially during crises of
decompensation, in which the toxic metabolites dramatically increase their tissue
concentrations.
19
1. INTRODUÇÃO
1.1 Erros inatos do metabolismo
O termo erros inatos do metabolismo (EIM) foi utilizado pela primeira vez
por Archibald Garrod em 1908, durante estudos realizados com pacientes com
alcaptonúria, doença em que os pacientes afetados excretam grandes
quantidades de ácido homogentísico na urina. O pesquisador observou que,
freqüentemente, um ou mais indivíduos da mesma família demonstravam ser
afetados sem que seus pais ou demais parentes apresentassem a doença.
Baseado também na observação da maior incidência de consangüinidade entre
os pais dos pacientes e nas leis de Mendel, Garrod propôs um modelo de
herança autossômica recessiva para este distúrbio. Através da determinação do
ácido homogentísico na urina de pacientes com alcaptonúria e da observação de
que esta substância era um metabólito normal da degradação da tirosina, ele
relacionou este acúmulo a um bloqueio na conversão do ácido homogentísico até
fumarato e acetoacetato. Verificou-se mais tarde que tais alterações resultavam
da síntese qualitativa ou quantitativamente anormal de uma proteína, enzimática
ou não (Scriver et al., 2001).
Atualmente, mais de 450 erros inatos do metabolismo foram descritos, a
maioria deles envolvendo processos de síntese, degradação, transporte e
armazenamento de moléculas no organismo (Scriver et al., 2001).
Os pacientes portadores de algum tipo de EIM apresentam sintomatologia
muito variada e inespecífica, mesmo entre aqueles que possuem o mesmo
distúrbio. Essa variação fenotípica deve-se a diferentes graus de deficiência
20
enzimática, áreas do metabolismo envolvidas e tecidos afetados, podendo os
episódios variar de vômitos e diarréia, até acometimento do SNC, com retardo
neuropsicomotor e neurodegeneração progressiva (Burton, 1987).
Os EIM foram classificados por Sinclair (1982), em quatro grupos,
dependendo da função exercida pela enzima deficiente e do tecido envolvido,
bem como dos aspectos clínicos, bioquímicos, patológicos e terapêuticos:
1) Desordens de transporte: afetam basicamente o transporte renal e/ou
intestinal de moléculas orgânicas ou inorgânicas. Exemplos: deficiências de
dissacaridases, defeito no transporte de magnésio e Doença de Hartnup.
2) Desordens de armazenamento, degradação e secreção: envolvem
proteínas de organelas celulares como o aparelho de Golgi ou os lisossomas.
Ocorre o acúmulo de macromoléculas em tecidos específicos. Exemplos:
doenças lisossômicas de depósito, glicogenoses e cistinose.
3) Desordens de síntese: deficiência na síntese de proteínas ou outras
substâncias com funções importantes tais como hormônios, proteínas plasmáticas
e de defesa imunológica. Exemplos: hiperplasia adrenal congênita por deficiência
da enzima 21-hidroxilase da rota da síntese do cortisol.
4)
Desordens
do
metabolismo
intermediário:
caracterizam-se
por
deficiências enzimáticas das rotas do metabolismo intermediário de moléculas
pequenas, comprometendo importantes rotas, como o ciclo do ácido tricarboxílico,
o ciclo da uréia, ou outras rotas. Assim, o substrato da enzima deficiente se
21
acumula e, a menos que haja uma rota alternativa para metabolizá-lo, o produto
final da reação não será formado. Os mecanismos de dano tecidual podem
ocorrer pela ação do substrato acumulado que pode ser tóxico, levando a
alterações bioquímicas e danos em determinados tecidos por ser liberado na
circulação e transportado para todo o organismo, por seus metabólitos ou pela
falta de substâncias essenciais ao desenvolvimento do organismo, causada pelo
bloqueio metabólico. Considerados os mais freqüentes EIM, essas desordens têm
como exemplo as acidúrias orgânicas, as aminoacidopatias, as desordens do
metabolismo das purinas e pentoses, e outros.
1.1.1 Acidemias Orgânicas
As acidemias ou acidúrias orgânicas são erros inatos do metabolismo nos
quais um ou mais ácidos orgânicos acumulam-se nos tecidos dos pacientes
afetados devido à deficiência da atividade de uma enzima do metabolismo de
aminoácidos, lipídeos ou carboidratos (Chalmers & Lawson, 1982). Vários ácidos
orgânicos estão presentes no sangue e na urina de indivíduos normais, porém em
concentrações reduzidas. Nos pacientes com estes distúrbios, estes ácidos
encontram-se em altas concentrações no sangue e, principalmente, na urina.
Devido ao desconhecimento da classe médica, pela falta de laboratórios
especializados e pela dificuldade de diagnóstico, a freqüência destas doenças na
população em geral é pouco conhecida. Na Holanda, país considerado referência
para o diagnóstico de erros inatos do metabolismo, a incidência destas doenças é
estimada em 1: 2.200 habitantes, enquanto que na Alemanha, Israel e Inglaterra
é de aproximadamente 1:6.000 – 1:9.000 recém-nascidos (Hoffmann et al., 2004).
22
Na Arábia Saudita, onde a taxa de consangüidade é elevada, a freqüência é de 1:
740 nascidos vivos (Rashed et al., 1994).
No início da década de 80, foi demonstrado que estes distúrbios eram os
erros inatos do metabolismo mais freqüentes em crianças severamente enfermas
(Chalmers et al., 1980), o que motivou maiores estudos clínico-laboratoriais e
epidemiológicos nos anos que se seguiram.
Clinicamente os pacientes afetados apresentam, como sintomatologia mais
comum, disfunção neurológica em suas diversas formas de expressão: regressão
neurológica, convulsões, coma, ataxia, hipotonia, hipertonia, irritabilidade,
tremores,
movimentos
coreatetóticos,
tetraparesia
espástica,
atraso
no
desenvolvimento psicomotor e outros. As mais freqüentes manifestações
laboratoriais são cetose, cetonúria, neutropenia, trombocitopenia, acidose
metabólica, baixos níveis de bicarbonato, hiperglicinemia, hiperglicinúria,
hiperamonemia, hipo/hiperglicemia, acidemia lática, aumento dos níveis séricos
de ácidos graxos livres, bem como cheiro peculiar na urina e/ou suor e outros
(Scriver et al., 2001). Com a utilização da tomografia computadorizada e
ressonância magnética nuclear, foram verificadas freqüentemente alterações de
substância
branca
(hipomielização
e/ou
desmielização),
atrofia
cerebral
generalizada ou de gânglios da base (necrose ou calcificação), megaencefalia,
atrofia frontotemporal e atrofia cerebelar em pacientes afetados por estas
doenças (Mayatepek et al., 1996).
23
1.1.1.1
Acidemia Isovalérica
A acidemia isovalérica é uma acidemia orgânica causada pela deficiência
da atividade da enzima Isovaleril-CoA Desidrogenase (Tanaka et al., 1966). Esta
enzima é uma das presentes na rota catabólica da leucina (figura 1.1) e está
localizada na mitocôndria (Scriver et al., 2001). Foi o primeiro distúrbio do
metabolismo de ácidos orgânicos diagnosticado por cromatografia gasosa (GC),
sendo esta técnica até o momento o melhor método analítico para ácidos
orgânicos.
Mais de 70 casos de acidemia isovalérica já foram relatados. A
metodologia da espectrometria de massas em tandem (MS/MS ou Tandem MS)
também tem se tornado útil para o diagnóstico da acidemia isovalérica pela
detecção da elevação da isovalerilcarnitina (Millington et al., 1990).
24
Enzima
Metabólitos
L-Leucina
Transaminase
Ácido 2-Oxo-Isocapróico
Ácido 2-Oxo Desidrogenase
Isovaleril-CoA
Isovaleril-CoA Desidrogenase
3-Metilcrotonil-CoA
3-Metilcrotonil-CoA Carboxilase
3-Metilglutaconil-CoA
3-Metilglutaconil-CoA Hidratase
3-Hidroxi-3-Metilglutaril-CoA
3-Hidroxi-3-Metilglutaril-CoA
Liase*
Redutase
*
Ácido Isovalérico
Isovalerilglicina
Ácido 3-OH-Isovalérico
Ácido 4-OH-isovalérico
Ácido Mesacônico
Ácido Metilsuccinico
Isovalerilglucoronídeo
Ácido Isovalerilglutâmico
Isovalerilalanina
Isovalerilsarcosina
Ácido3-OH-Isoheptanóico
Isovalerilcarnitina
Ácido 3-Metilcrotônico
3-Metilcrotonilglicina
Ácido 3-OH-Isovalérico
3-OH-Isovalerilcarnitina
Ácido3-Metilglutacônico
Ácido 3-Metilglutárico
3-Metilglutarilcarnitina
Ácido 3-OH-3-Metil
glutárico
*
Ácido Acetoacético Acetil-CoA Ácido Mevalônico
Mevalono
Lactona
Colesterol
Figura 1.1 Catabolismo da Leucina (adaptado de Scriver et al., 2001).
25
1.1.1.1.1 Aspectos Clínicos
Duas formas clínicas diferentes da acidemia isovalérica têm sido relatadas,
com aproximadamente metade dos pacientes apresentando uma forma neonatal
severa e aguda e a outra metade dos pacientes a forma intermitente e crônica. As
duas formas são devidas ao mesmo defeito bioquímico, a deficiência da atividade
da desidrogenase da isovaleril-CoA (Scriver et al., 2001).
Na forma aguda, 3 a 6 dias após o nascimento, as crianças começam a
recusar o alimento, iniciam a vomitar, tornando-se desidratadas, desatentas e
letárgicas. Podem também se apresentar hipotérmicas, com tremores e
convulsões (Cohn et al., 1978). Um odor de pés suados devido à elevação da
concentração de ácido isovalérico é descrito. Também ocorre acidose metabólica
com
suave
a
moderada
cetonúria,
acidemia
lática,
hiperamonemia,
trombocitopenia, neutropenia ou pancitopenia e hipocalcemia (Fischer et al.,
1981). O progresso típico é que os pacientes tornem-se cianóticos e entrem em
coma seguido de morte. Mais da metade dos pacientes inicialmente relatados
com a forma aguda não sobreviveram, mas com o rápido diagnóstico e os
recentes melhoramentos na terapia, bem como com a administração de glicina e
carnitina, o resultado tem sido muito mais favorável nos últimos anos (Cohn et al.,
1978).
Na forma crônica, o quadro clínico é menos grave. O primeiro episódio da
doença geralmente ocorre durante o primeiro ano de vida. Os episódios
subseqüentes da doença freqüentemente ocorrem após infecções respiratórias
ou aumento da ingestão de alimentos ricos em proteínas. Eles tipicamente
envolvem vômitos, letargia progredindo para o coma, acidose com cetonúria e o
26
característico odor de pés suados (Shih et al., 1984). Nestas situações enfatize-se
a necessidade de restrição de proteínas e infusão de glicose. Achados adicionais
que podem ocorrer com os episódios incluem diarréia, trombocitopenia,
neutropenia, pancitopenia, e em alguns casos alopecia e hiperglicemia; o último
pode ser erroneamente confundido com cetoacidose diabética (Roe et al.,1984;
Williams et al., 1981). Hiperglicemia pode ocorrer em várias acidemias orgânicas,
incluindo a acidemia isovalérica.
Alguns pacientes com a forma crônica
intermitente da acidemia isovalérica tem desenvolvimento psicomotor normal,
mas alguns tem o desenvolvimento atrasado e lento ou mesmo retardo mental
severo (Budd et al., 1967; Shih et al., 1984). Muitos pacientes adquirem uma
aversão natural para alimentos ricos em proteínas (Gerdes et al., 1988).
1.1.1.1.2 Metabólitos Anormais
O nome acidemia isovalérica deriva de uma concentração elevada de ácido
isovalérico encontrada no sangue dos pacientes (Tanaka et al., 1966). A
concentração normal de ácido isovalérico no plasma é menor do que 10
M.
Durante a remissão da doença em tratamento os pacientes podem ter uma
concentração de ácido isovalérico normal ou até 10 vezes o normal (10 M), mas
durante episódios severos os níveis alcançam até 100 a 500 vezes os níveis
normais (600 a 5.000
M). A quantidade do ácido isovalérico na urina dos
pacientes afetados é na ordem de 8 a 300
mol/dia (normal menos que 2
mol/dia) (Scriver et al., 2001).
O metabólito da isovaleril-CoA que mais se acumula devido à deficiência da
atividade da isovaleril-CoA desidrogenase não é o seu produto da hidrólise, o
27
ácido isovalérico, mas a isovalerilglicina, um composto amídico produzido pela
conjugação com a glicina (Tanaka et al., 1967). Essa reação é catalizada pela
enzima mitocondrial glicina N-acilase, a qual também forma benzoilglicina (ácido
hipúrico) a partir de benzoil-CoA (Bartlett et al., 1974; Gregersen et al., 1986). A
excreção urinária de isovalerilglicina por pacientes com acidemia isovalérica varia
de 2.000 a 15.000
que 15
mol/dia, comparado com excreções normais de menos do
mol/dia. A excreção é maior durante episódios agudos, mas é ainda
muito alta durante a remissão. Durante episódios agudos, quando a quantidade
de isovaleril-CoA é muito aumentada, a capacidade da glicina N-acilase é
excedida, e o ácido isovalérico livre se torna elevado. Um segundo metabólito do
ácido isovalérico que foi identificado é o ácido 3-hidroxi-isovalérico (Tanaka et al.,
1968). Ele é excretado em quantidades anormais somente durante episódios
agudos, quando pode estar tão alto quanto 3.000 mol/dia. A isovaleril-CoA pode
formar também isovalerilcarnitina. No plasma ou em sangue em papel de filtro, a
isovalerilcarnitina elevada é importante para o diagnóstico da doença (Scriver et
al., 2001).
1.1.1.1.3 Deficiência da Enzima e Genética
A oxidação do ácido isovalérico para CO2 em leucócitos e a oxidação da
leucina para CO2 em fibroblastos é deficiente em pacientes com acidemia
isovalérica (Tanaka et al., 1966; Shih et al., 1973; Tanaka et al., 1976), o que
pode ser explicado pela deficiência da enzima isovaleril-CoA desidrogenase. Uma
técnica sensível para medir a atividade da isovaleril-CoA desidrogenase é
baseada na liberação de trítio da isovaleril-CoA (Rhead et al., 1981), mostrando
28
uma atividade da enzima em mitocôndrias isoladas de fibroblastos de pacientes
com acidemia isovalérica da ordem 0 a 3,5% do normal (Hyman & Tanaka.,
1986).
A acidemia isovalérica é uma doença autossômica recessiva. O gene da
isovaleril-CoA desidrogenase está localizado no cromossomo humano 15q14q15. A apresentação aguda neonatal e a forma intermitente crônica podem
ocorrer na mesma família, sugerindo que a heterogeneidade clínica é causada
por fatores não genéticos (Scriver et al., 2001).
Os estudos genéticos complementares indicam que os pacientes afetados
com a doença apresentam envolvimento de um único locus. Além disso, ocorre
heterogeneidade molecular da isovaleril-CoA desidrogenase que foi demonstrada
em fibroblastos de 15 pacientes com acidemia isovalérica, sendo oito mutações
diferentes encontradas (Dubiel et al., 1983).
1.1.1.1.4 Diagnóstico
O diagnóstico da acidemia isovalérica requer análise de ácidos orgânicos,
visto que os aspectos clínicos são comuns para várias acidúrias orgânicas. Um
odor de pés suados durante os episódios agudos pode ser sugestivo de acidemia
isovalérica, mas deve ser distinguido de um odor similar que pode ocorrer na
aciduria glutárica tipo 2 devido a acumulação dos ácidos isobutírico, 2metilbutírico e isovalérico. A possibilidade da acidemia isovalérica deve ser
considerada em recém nascidos ou em crianças que ocorra uma combinação de
recusa
alimentar,
vômitos,
letargia,
coma,
acidose
metabólica,
cetose,
hiperamonemia, hipocalcemia, neutropenia, trombocitopenia, e pancitopenia. A
29
análise de ácidos orgânicos voláteis de cadeia curta no plasma mostra elevação
do ácido isovalérico sem elevação dos outros ácidos de cadeia curta, sugerindo o
diagnóstico de acidemia isovalérica. No entanto, análises acuradas dos ácidos
orgânicos de cadeia curta no plasma são difíceis e com freqüência não estão
disponíveis. Assim, prefere-se a análise de ácidos orgânicos em geral que
mostram elevações da isovalerilglicina e do ácido 3-hidroxiisovalérico (Tanaka et
al., 1980). Além disso, também se encontram grandes elevações não específicas
de lactato, bem como dos ácidos 3-hidroxibutírico e acetoacético. Durante a
remissão, o único metabólito observado comumente é a isovalerilglicina (1000 a
3000 mmol/mol de creatinina).
A análise dos ésteres de carnitina no sangue e urina é complementar à
análise de ácidos orgânicos para o diagnóstico da acidemia isovalérica. As acilCoAs estão em equilíbrio com as suas acilcarnitinas, sendo as últimas presentes
no plasma e prontamente excretadas na urina. A isovalerilcarnitina, portanto, em
pequenas concentrações (10 a 20 mmol/mol de creatinina) tem sido identificada
por tandem MS na urina de pacientes com acidemia isovalérica mesmo durante a
remissão. A administração oral 100mg/kg de L-carnitina aumenta a excreção de
isovalerilcarnitina até aproximadamente 3200 mmol/mol de creatinina, sugerindo
que a administração de carnitina aumentaria a confiabilidade do diagnóstico da
acidemia isovalérica por detecção de acilcarnitinas na urina.
O diagnóstico da acidemia isovalérica por detecção dos metabólitos
anormais pode ser confirmado pela deficiência severa da atividade da isovalerilCoA desidrogenase em fibroblastos pela liberação de trítio (Hyman & Tanaka,
1986).
30
O diagnóstico pré-natal da acidemia isovalérica pode ser feito pela
detecção da atividade da isovaleril-CoA desidrogenase em cultura de amniócitos
ou pela detecção de concentrações elevadas do ácido isovalérico e da
isovalerilglicina no líquido amniótico após aminiocentese (Hine et al., 1986). Por
exemplo, a isovalerilglicina é quase indetectável nos líquidos amnióticos normais,
já em mulheres que tiveram fetos afetados com acidemia isovalérica, este
composto aparece altamente elevado (3,50 a 6,02 µM). Portanto a quantificação
deste composto no líquido amniótico, providencia um rápido e preciso diagnóstico
de acidemia isovalérica.
1.1.1.1.5 Tratamento
O tratamento de pacientes afetados por acidemia isovalérica durante os
episódios agudos é praticamente o mesmo dos afetados por outras acidurias
orgânicas e consta fundamentalmente de hidratação, infusão de glicose para
prover calorias e reduzir o catabolismo proteico endógeno e infusão de
bicarbonato de sódio para controlar a acidose (Tanaka & Rosemberg, 1983;
Tanaka, 1986). O tratamento durante a recuperação e remissão geralmente
consiste na restrição dietética de uma dieta natural protéica (1,5 g/Kg de proteína
por dia), bem como de leucina que é precursora do ácido isovalérico. Este
tratamento tem sido efetivo na diminuição da freqüência dos episódios de
descompensação metabólica.
Por outro lado, a concentração de glicina no plasma de pacientes com
acidemia isovalérica tende a diminuir durante episódios agudos, sugerindo que
quantias
insuficientes de glicina estão disponíveis
para
a síntese
da
31
isovalerilglicina (Krieger & Tanaka, 1976). Assim, o aumento da concentração de
glicina plasmática através da ingestão de glicina (250 mg/Kg por dia de glicina
dividida em 3 doses) é aconselhável no tratamento desses pacientes a longo
prazo, o que provocaria um aumento da razão isovalerilglicina/ácido isovalérico
por aumento da concentração de isovalerilglicina. Quando a glicina foi
suplementada oralmente com um competidor da leucina para um paciente com
acidemia isovalérica o aumento do ácido isovalérico no plasma foi prevenido e a
excreção de isovalerilglicina dobrado (de Souza et al., 1986).
Além disso, vários pacientes com acidemia isovalérica apresentam uma
deficiência de carnitina total e uma grande percentagem de carnitina esterificada
no plasma e na urina (Mayatepek et al., 1991; Roe et al., 1984). Daí ser
aconselhável tratá-los rotineiramente com L-carnitina (100 mg/Kg por dia dividida
em duas doses) (Lee et al., 1998). Embora seja difícil determinar se a glicina ou a
carnitina é mais efetiva no tratamento prolongado da acidemia isovalérica, os dois
medicamentos provocaram uma redução nos líquidos biológicos do ácido
isovalérico e da isovalerilglicina.
1.2 Metabolismo Energético Cerebral
O cérebro possui uma intensa atividade metabólica, no entanto suas
reservas energéticas são extremamente pequenas em relação à sua demanda.
Assim, há a necessidade de substratos energéticos para o cérebro de mamíferos,
sendo a glicose o principal deles, onde, em contraste com outros tecidos, não
necessita de insulina para ser captada e oxidada (Dickinson, 1996). No entanto, o
padrão de utilização deste nutriente varia conforme a etapa de desenvolvimento
32
do sistema nervoso central (SNC), o estado nutricional do indivíduo e o destino de
sua cadeia de átomos de carbono (Marks et al., 1996). Por exemplo, o lactato é a
principal fonte de obtenção de energia cerebral após o nascimento (Vicario et al.,
1991). Quando inicia o período de amamentação, já começa uma utilização de
grandes quantidades de corpos cetônicos, que são formados a partir da oxidação
dos ácidos graxos contidos no leite materno, sendo uma importante fonte de
energia para o cérebro nas primeiras semanas de vida. Neste período, o consumo
de glicose pelo cérebro está reduzido, sendo aumentado em poucas semanas
durante o desenvolvimento, até por volta dos 18 dias de vida, quando a utilização
de glicose se torna preferencial em condições normais (Crone, 1965; Cremer et
al., 1976). Essa utilização também pode ser modulada por padrões nutricionais,
como, por exemplo, situações de jejum prolongado, onde o SNC utiliza corpos
cetônicos.
O ciclo do ácido cítrico é a via comum de oxidação dos glicídios,
aminoácidos e ácidos graxos (aproximadamente 95% do ATP sintetizado). O
metabolismo energético cerebral se mostra essencialmente aeróbico, sendo a
glicose o principal substrato utilizado (Clark et al., 1993), entrando no ciclo sob a
forma de acetil-CoA, que é então oxidada completamente a CO2. As reações
anapleróticas, que alimentam o ciclo fornecendo diretamente seus intermediários,
também fornecem substratos para as reações de oxidação no cérebro. Quando
não há hipóxia, a fosforilação oxidativa é dependente da concentração de ATP,
ADP e fosfato inorgânico (Pi) e da razão mitocondrial de NADH/NAD+, que é
determinada pela atividade da cadeia transportadora de elétrons e pela
transferência de elétrons provenientes de reações catalisadas por enzimas
mitocondriais. A cadeia transportadora de elétrons oxida o NADH e bombeia
33
prótons para o espaço intermembrana da mitocôndria formando assim um
gradiente de prótons que através da passagem pela ATP-sintase, produz ATP na
fosforilação oxidativa (Erecinska & Silver, 1994).
Outro importante sistema que auxilia a manutenção dos níveis cerebrais de
ATP é o da creatina quinase, que está presente tanto no citosol quanto ligada às
membranas mitocondriais e catalisa a transferência reversível de um grupamento
fosfato entre a fosfocreatina e o ATP. Esse sistema tem sido associado a algumas
funções particularmente importantes para o cérebro, como tamponamento
energético (através da regeneração do ATP e da manutenção de níveis baixos de
ADP) e transferência de ATP de sítios de produção para outros de consumo
(Erecinska & Silver, 1994).
1.2.1 Fosforilação Oxidativa
Fosforilação oxidativa é o processo mais importante do metabolismo de
produção energética em organismos aeróbicos. Todos os passos da degradação
de carboidratos, lipídeos e aminoácidos convergem para este estágio final da
respiração celular em que os elétrons provenientes do NADH e FADH2 dirigem a
síntese de ATP. Em eucariotos, a fosforilação oxidativa ocorre nas mitocôndrias e
envolve a redução do O2 a H2O com elétrons doados por NADH ou FADH2, que
fluem por vários pares redox (cadeia respiratória) ocorrendo concomitante
produção de ATP a partir de ADP + Pi. Nosso atual entendimento de síntese de
ATP está baseado na hipótese introduzida por Peter Mitchel em 1961 (teoria
quimiosmótica), que diz que diferenças transmembrana na concentração de
34
prótons são o reservatório da energia extraída de reações de oxidação biológica
(Nelson & Cox, 2004).
As mitocôndrias são corpúsculos envolvidos por uma membrana externa,
facilmente permeável a pequenas moléculas e íons, e por uma membrana interna,
impermeável à maioria das moléculas e íons, incluindo prótons H+ (Nelson & Cox,
2000). A membrana interna contém transportadores específicos para substâncias
como o piruvato, glicerolfosfato, malato, ácidos graxos e outras moléculas
essenciais às funções mitocondriais. O fluxo de elétrons do NADH e FADH2 até o
O2 se dá através de complexos enzimáticos ancorados na membrana mitocondrial
interna. Essa transferência de elétrons é impulsionada por um crescente potencial
redox entre NADH e FADH2, os complexos enzimáticos e O2, o aceptor final da
cadeia respiratória.
Como mostra a Figura 1.2, a cadeia respiratória possui vários complexos
protéicos:
NADH
desidrogenase
(complexo
I),
sucinato:
ubiquininona
oxirredutase (complexo II), complexo citocromo b-c1 (complexo III) e citocromo
oxidase (complexo IV), além de elementos móveis que se localizam entre os
complexos. São eles a coenzima Q (CoQ), um componente não protéico
lipossolúvel que carreia elétrons entre os complexos I e III, e o citocromo c, uma
pequena proteína localizada na face externa da membrana que transfere os
elétrons do complexo III para o complexo IV (Marks et al., 1996).
35
Figura 1.2 – Fluxo de elétrons através dos complexos da cadeia respiratória
(adaptado de Nelson; Cox, 2000).
1.2.1.1 NADH desidrogenase (Complexo I)
O complexo I contém flavina mononucleotídeo (FMN) e centros ferroenxofre (Fe-S). FMN recebe elétrons do NADH e é capaz de transferi-los aos
centros Fe-S. O NADH é reoxidado a NAD+ e retorna para o ciclo de Krebs ou
para outras rotas metabólicas para receber elétrons. Os centros Fe-S estão
envolvidos na transferência de elétrons para a CoQ (Marks et al., 1996).
36
1.2.1.2
Coenzima Q (Ubiquinona)
A CoQ, também chamada de ubiquinona, é o único componente da cadeia
respiratória que não é ligado a proteínas. A CoQ é capaz de difundir-se através
dos lipídios da membrana mitocondrial interna, devido ao alto grau hidrofóbico da
sua cadeia lateral. Este movimento transmembrana faz parte do mecanismo de
bombeamento de prótons da NADH desidrogenase e do complexo b-c1 (Marks et
al., 1996).
1.2.1.3
Complexo II e Succinato desidrogenase
O complexo II, também conhecido como sucinato: ubiquinona oxirredutase
(Abeles et al., 1992), é um tetrâmero composto por duas subunidades
polipeptídicas catalíticas que correspondem à sucinato desidrogenase solúvel
(SDH) ou sucinato: metassulfato de fenazina oxirredutase (Fischer et. al., 1985), e
duas subunidades polipeptídicas ancoradas na membrana mitocondrial interna. A
sucinato desidrogenase ocupa uma posição única como parte integrante do ciclo
do ácido cítrico e também da cadeia respiratória (Oyedotum & Lemire, 1999).
Ligado à SDH, o FAD recebe 2 elétrons e é reduzido a FAD(2H). Este transfere
seus elétrons para os centros Fe-S da enzima que então doa esses elétrons para
a CoQ, para que estes fluam pela cadeia respiratória. Esse complexo, diferente
dos outros (complexos I, III e IV), não funciona como bomba de prótons, não
gerando gradiente eletroquímico (Marks et al., 1996).
37
1.2.1.4
Complexo III: Complexo b-c1 e Citocromo c
Os citocromos são proteínas que contêm um grupamento heme (um átomo
de ferro ligado a um núcleo porfirina formado por 4 anéis pirrólicos). Os elétrons
fluem entre os citocromos no sentido do citocromo de menor potencial redox para
o de maior. Os átomos de ferro nos citocromos se encontram no estado Fe+3.
Quando este recebe um elétron é reduzido para Fe+2, e, ao passar este elétron
para o próximo componente da cadeia respiratória, é reoxidado a Fe+3.
Os citocromos b e c1, juntamente com outras proteínas, formam o
complexo de membrana b-c1. O citocromo c é uma pequena proteína localizada
na face externa da membrana mitocondrial interna, e, assim como a CoQ, é um
transportador móvel de elétrons que transfere os elétrons do complexo b-c1 para
a citocromo oxidase (Marks et al., 1996).
1.2.1.5
Complexo IV: Citocromo Oxidase
A citocromo oxidase (COX), último complexo da cadeia respiratória,
transfere elétrons do citocromo c para o O2. Este complexo contém os citocromos
a e a3 e um sítio de ligação ao O2. Cada molécula de O2 precisa receber 4
elétrons para ser reduzida a duas moléculas de H2O. Na COX, a presença de
íons Cu+2 facilita a redução do O2. Como o Km da COX para o O2 é muito menor
que o Km da mioglobina e da hemoglobina, o O2 dos eritrócitos é facilmente
transferido para seus sítios de redução (Marks et al., 1996).
38
1.2.2 Bombeamento de prótons
O bombeamento de prótons da matriz mitocondrial para o espaço entre as
membranas interna e externa (espaço intermembranas) da mitocôndria ocorre
simultaneamente com a transferência de elétrons do NADH para a CoQ
(catalisado pelo complexo I) e da CoQ para o citocromo c (catalisado pelo
complexo III). A cada ciclo, a CoQ recebe 2 prótons e 2 elétrons da matriz
mitocondrial. Ela transfere os 2 prótons para o espaço intermembranas e doa um
elétron de volta para outro componente do complexo III e o outro para o citocromo
c. O citocromo c transfere então este elétron para a COX (complexo IV) que
também bombeia prótons para fora da matriz, contribuindo para a formação do
gradiente de prótons. O complexo II não atua diretamente como bomba de
prótons e participa diretamente do ciclo de Krebs (Marks et al., 1996).
1.2.2.1 Transferência seqüencial de elétrons
O fluxo de elétrons na cadeia transportadora de elétrons deve ser seqüencial
a partir do NADH ou FADH2 até o O2 para que ocorra a geração de ATP. Na
cadeia respiratória, cada complexo que atua como bomba de prótons está
associado à formação de aproximadamente uma molécula de ATP. Portanto, o
bloqueio em qualquer ponto da cadeia transportadora de elétrons prejudica a
formação ATP, pois o bombeamento de prótons para o espaço intermembrana
está associado ao movimento dos elétrons de um carreador para o seguinte, e
impede a formação do potencial eletroquímico (Marks et al., 1996).
39
1.2.3 Creatina Quinase
Figura 1.3.
Foram identificadas cinco isoenzimas de CK (duas mitocondriais e três
citosólicas), cujas subunidades são produzidas por genes distintos com
expressão
tecido-específica.
As
isoenzimas
citosólicas
(Cy-CK)
existem
exclusivamente como moléculas diméricas, compostas por dois tipos de
subunidades (CK-B e CK-M), originando três diferentes isoformas: CK-MM
(predominante em músculo esquelético adulto), CK-BB (predominante em
cérebro) e CK-MB (predominante em músculo cardíaco) (Manos et al., 1991;
Molloy et al., 1992). As duas isoenzimas mitocondriais, Mi-CK ubíqua e Mi-CK
sarcomérica, são encontradas no espaço intermembranas, formando moléculas
homodiméricas ou homooctaméricas prontamente interconversíveis (Wyss &
Kaddurah-Daouk,
2000).
A
Mi-CK
octamérica
é
considerada
a
forma
predominante e ativa in vivo, sendo muito importante para a função da enzima
(Soboll et al., 1999).
A Mi-CK interage simultaneamente com as membranas mitocondriais
interna e externa, permanecendo acoplada à translocase de nucleotídeos de
adenina, canal transportador do ATP da matriz mitocondrial para o espaço
intermembranas. O grupamento -fosfato do ATP é transferido pela Mi-CK no
espaço intermembranas para a Cr, formando ADP e PCr. A PCr deixa a
mitocôndria e se difunde através do citoplasma até os sítios de consumo de
energia, onde, por ação das isoenzimas citosólicas (CK-MM, CK-MB ou CK-BB),
irá regenerar o ATP e formar novamente Cr. A Cr liberada pode retornar a
mitocôndria fechando o ciclo (Figura 1.4) (Wyss & Kaddurah-Daouk, 2000). Foi
também verificado que, em regiões cerebrais ricas em mitocôndrias, grandes
quantidades de Mi-CK foram encontradas juntamente com CK-BB, o que poderia
reforçar a hipótese desta associação (Kaldis et al., 1996).
41
Figura 1.4. Função do sistema Cr/CK/PCr na difusão dos grupamentos
fosfato e no tamponamento dos níveis de ATP junto aos sítios de consumo.
Tem sido demonstrada também uma relação da CK com ATPases
celulares específicas, como as bombas responsáveis por manter gradientes
iônicos transmembranas (Molloy et al., 1992; Kaldis et al., 1996).
São relatadas, basicamente, duas funções para o sistema Cr/CK/PCr: a
função de tamponamento energético e a função de transporte de grupamentos
fosfato. Enquanto para o tamponamento energético uma alta atividade da Mi-CK
não seria requerida, para a função de transporte sua atividade pode ser
essencial, principalmente quando a difusão de nucleotídeos de adenina através
da membrana mitocondrial externa for limitada. De acordo com esta idéia, a
atividade da Mi-CK está relacionada à capacidade oxidativa da musculatura
42
estriada, sendo muito maior no tecido cardíaco (cerca de 35% da atividade total
da CK) que em músculo esquelético (0,5 - 2% da ativdade da CK total) (Wyss &
Kaddurah-Daouk, 2000).
Recentemente, foi demonstrado que a Mi-CK é susceptível à inativação por
peroxinitrito, produto que se acumula em diversas doenças neurodegenerativas.
Esta inibição está relacionada à alteração de seus grupos tióis mediante a ação
de agentes oxidantes (Stachowiak et al., 1998). Além disso, a diminuição de
atividade da CK-BB tem sido encontrada em pacientes com doenças como a
doença de Alzheimer, em que o dano oxidativo parece estar relacionado à
neurodegeneração (Aksenov et al., 2000).
Inibição in vitro da atividade total da CK, bem como de suas isoenzimas
citosólica e mitocondrial causada por ácidos orgânicos acumulados em algumas
acidemias orgânicas, clinicamente caracterizadas por severa encefalopatia, têm
causado um prejuízo na produção ou no consumo de energia, podendo estar
relacionado com a fisiopatogenia destas doenças (da Silva et al., 2004).
1.2.4 Na+,K+-ATPase
A Na+,K+-ATPase é uma proteína transmembrana constituída por dois tipos
de subunidades, a subunidade α, de 110 kD e não-glicosilada que contém os
sítios de atividade catalítica da enzima e de ligação de íons, e a subunidade β,
que é uma glicoproteína de 55 kD de função desconhecida, formando uma
estrutura dimérica (αβ)2 (Figura 1.5).
43
Figura 1.5: Estrutura da Na+,K-ATPase (Fonte: Voet &Voet, 1995).
A função desta enzima é translocar Na+ (muito mais concentrado fora do que
dentro da célula) e K+ (muito mais concentrado dentro do que fora da célula),
através da membrana plasmática, contra seus gradientes de concentração
utilizando energia (ATP). A enzima transporta simultaneamente 3 Na+ para fora e
2 K+ para dentro da célula. A saída de Na+ capacita as células animais a controlar
osmoticamente seu conteúdo de água. Como três cargas positivas são
transportadas para o meio extracelular e apenas duas para o meio intracelular, o
fluxo de íons Na+ e K+ produz um gradiente eletroquímico através da membrana
celular (Lingrel & Kuntzweiler, 1994), que é usado como fonte de energia para a
despolarização e repolarização do potencial de membrana, manutenção e
regulação do volume celular, transporte ativo, transporte dependente de Na+, de
glicose, de aminoácidos e de neurotransmissores e cotransporte/antiporte de
outros íons (Geering, 1990). Enfatiza-se que todas as células eucarióticas
superiores consomem grandes quantidades do ATP por elas produzido para a
manutenção das concentrações citosólicas de Na+ e K+, sendo que o consumo
chega a ser de 40 a 60% nas células neuronais (Whittan, 1962).
A reação catalisada pela Na+,K+-ATPase é a seguinte:
44
→
3Na + (intracelular ) + 2K + ( extracelular ) + ATP ← 3Na + (extracelular ) + 2K + (int racelular ) + ADP + Pi
Alterações nos mecanismos que mantêm o equilíbrio entre a taxa de sódio
e potássio intra e extraneuronal podem ter conseqüências graves para as células
do SNC (Erecinska & Silver, 1994) tendo sido associadas com despolarização
excessiva, instabilidade da membrana e descargas paroxísticas (Donaldson et al.,
1977).
O efeito de radicais livres sobre a Na+, K+-ATPase tem sido enfatizado
como a principal fonte de dano celular na reperfusão seguida de isquemia do
miocárdio. Estudos têm demonstrado uma inibição in vitro da enzima quando
exposta a radicais hidroxila (Hitschke et al., 1994) e também quando exposta a
sistemas artificiais produtores de radicais livres em homogenizado de cérebro de
ratos (Tsakiris et al., 2000).
Por outro lado, a inibição da atividade da enzima tem sido associada a
diversas patologias neurológicas (Renkavec et al., 1992; Grisar, 1984; Bem-Ari,
1985; Lees & Leong, 1995)
Além disso, Hanglund e colaboradores (1985) demonstraram que uma
menor atividade da enzima Na+, K+-ATPase em algumas regiões cerebrais parece
estar relacionada a episódios convulsivos, talvez refletindo uma menor atividade
na regulação do potássio extracelular. Rapport e colaboradores (1975)
encontraram uma diminuição de 60% na atividade da Na+,K+-ATPase em córtex
cerebral obtido de um paciente que apresentava convulsões generalizadas
intratáveis. Além disso, a inibição da enzima está associada à liberação de
neurotransmissores em uma variedade de preparações neuronais (Jacobson et
al., 1986).
45
Através de estudos dos efeitos in vivo da administração de fenilalanina
sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de córtex cerebral de ratos, Wyse e
colaboradores (1995) demonstraram que na hiperfenilalaninemia experimental
produzida pela administração crônica de fenilalanina ocorre uma diminuição
significativa na atividade específica da Na+,K+-ATPase. Posteriormente, foi
demonstrado também que tanto a administração crônica de ácido propiônico
como a presença deste ácido no meio de incubação inibem a atividade da Na+,K+ATPase em córtex cerebral de ratos (Wyse et al., 1998). Silva e colaboradores
(1999) demonstraram ainda que o íon amônio, a citrulina, o ácido arginínico, a Nacetilarginina, a homoarginina e os três últimos metabólitos combinados
diminuem significativamente a atividade da Na+,K+-ATPase quando testados in
vitro. Tais resultados poderiam ser relevantes na explicação dos sintomas
neurológicos apresentados por pacientes com citrulinemia e argininemia.
46
2 OBJETIVOS
2.1 Gerais
O presente trabalho visa investigar o efeito in vitro dos principais
metabólitos acumulados na acidemia isovalérica sobre alguns parâmetros
importantes do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos, visando
contribuir para uma melhor compreensão da fisiopatogenia do dano neurológico
dessa doença.
2.2
Específicos
a) Determinar os efeitos in vitro dos ácidos isovalérico e 3-hidroxiisovalérico, bem
como da isovalerilglicina sobre a produção de CO2 a partir de acetato em
homogeneizado de córtex cerebral de ratos jovens;
b) Determinar os efeitos in vitro dos ácidos isovalérico e 3-hidroxiisovalérico, bem
como da isovalerilglicina sobre as atividades dos complexos da cadeia
respiratória em homogeneizado de córtex cerebral de ratos jovens;
c) Determinar os efeitos in vitro dos ácidos isovalérico e 3-hidroxiisovalérico, bem
como da isovalerilglicina sobre as atividades da creatina quinase em
homogeneizado de córtex cerebral de ratos jovens;
d) Determinar os efeitos in vitro dos ácidos isovalérico e 3-hidroxiisovalérico, bem
como da isovalerilglicina sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membranas
sinápticas isoladas de córtex cerebral de ratos jovens.
47
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Reagentes
Todos os reagentes utilizados no presente trabalho foram de grau de
pureza pró-análise (p.a.). Os ácidos isovalérico e 3-hidroxiisovalérico, bem como
a isovalerilglicina foram sempre dissolvidos e diluídos na solução tampão
específica para cada técnica no dia da realização dos ensaios.
3.1.1 Reagentes utilizados
•
α-Naftol – Sigma
•
Acetato de etila - Merck
•
[1-14C] ácido acético - Amersham
•
Ácido acético - Merck
•
Ácido clorídrico - Merck
•
Ácido etileno-diamino-tetra-acético (EDTA) sal dissódico – Sigma
•
Ácido isovalérico
•
Ácido 3-hidroxiisovalérico
•
Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-etano sulfônico (HEPES) – Sigma
•
Ácido orto-fosfórico - Merck
•
Ácido p-hidroximercuribenzóico (pHMB) – Sigma
•
Ácido sulfúrico - Merck
•
Ácido tricloroacético - Merck
•
Adenina-5’-difosfato (ADP) – Sigma
48
•
Adenosina-5’-trifosfato (ATP) - Sigma
•
Albumina bovina - Sigma
•
Azida sódica - Sigma
•
Bicarbonato de potássio - Reagen
•
Borohidrato de sódio – Sigma
•
Cianeto de potássio - Merck
•
Citocromo c – Sigma
•
Cloreto de magnésio hexahidratado - Sigma
•
Cloreto de potássio - Merck
•
Cloreto de sódio –Sigma
•
Coomasie Brilhante Blue G - Sigma
•
Creatina - Sigma
•
Diacetil - ICN
•
Dicloroindofenol (DCIP) – Sigma
•
Etanol absoluto - Merck
•
Fosfato de potássio dibásico - Reagen
•
Fosfato de potássio monobásico - Merck
•
Fosfocreatina - Sigma
•
Glicose – Sigma
•
Glutationa - Sigma
•
Heparina 5.000 U.I./mL – Cristália
•
Hiamina - Sigma
•
Hidróxido de sódio – Vetec
•
Isovalerilglicina
•
Lauril-maltosídeo – Sigma
49
•
Líquido de cintilação Opti Phase “hi-Safe” 3 - Wallac
•
Metassulfato de fenazina (PMS) – Sigma
•
Molibdato de amônio - Vetec
•
Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido ( -NADH) – Sigma
•
Ouabaína - Sigma
•
POP - Sigma
•
POPOP - Sigma
•
Rotenona - Sigma
•
Sacarose - Reagen
•
Succinato de sódio hexahidratado - Sigma
•
Sulfato de magnésio heptahidratado - Reagen
•
Tolueno - Merck
•
Trisma base – Sigma
•
Verde malaquita – Sigma
3.1.2 Equipamentos
-
Agitador de tubos modelo Maxi Mix Plus (Thermolyne).
-
Agitador magnético modelo 1005 (Fisaton).
-
Balança analítica digital (Sartorius Basic).
-
Balança digital modelo 430-21 (Kern).
-
Banho metabólico (Dubnoff).
-
Banho-maria modelo 1052 (Biomatic).
-
Centrífuga modelo 5403 (Eppendorf).
-
Contador de cintilação líquida modelo 1409 (Wallac).
50
-
Deionizador.
-
Destilador.
-
Espectrofotômetro de leitura cinética e com controlador de temperatura
modelo U-2001(Hitachi).
-
Espectrofotômetro modelo Spectronic Genesys 5 (Milton Roy).
-
Freezer -20° modelo H5 Electrolux (Prosdócimo).
-
Freezer -70°C (Scien Temp).
-
Geladeira (Brastemp).
-
Guilhotina.
-
Homogenizador elétrico modelo Potter S (B. Braun Biotech International).
-
Máquina de fazer gelo (Everest).
-
Material cirúrgico: tesouras, bisturis e espátulas.
-
Micropipetas de volume regulável (Gilson).
-
Microultracentrífuga modelo Himac CS 120 GX (Hitachi).
-
Potenciômetro modelo Tec-2 (Tecnal).
-
Tubos plásticos (Eppendorf).
-
Vidraria: provetas, pipetas graduadas, potter de vidro, balões volumétricos,
placas de Petry, pipetas Pasteur, tubos de ensaio, béqueres, funis, cubetas,
vials.
3.2 Caracterização da amostra
Para a determinação da produção de CO2 , das atividades enzimáticas dos
complexos da cadeia respiratória, da creatina quinase, e da atividade da enzima
Na+,K+-ATPase, foram utilizadas amostras de córtex cerebral de 140 ratos Wistar
51
de 30 dias de idade de ambos os sexos. Os animais, fornecidos pelo
Departamento de Bioquímica – ICBS – UFRGS, foram mantidos em temperatura
constante (20 ± 1 °C), em intervalos de 12 horas de ciclo claro/escuro,
alimentados com ração padrão (Supra ou Purina, São Leopoldo, RS) e livre
acesso à água. Este trabalho faz parte de um projeto maior intitulado “Estudo dos
mecanismos de neurotoxicidade de ácidos orgânicos” já aprovado pelo Comitê de
Ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (projeto e parecer 0351/2001). A
utilização dos animais seguiu um protocolo experimental aprovado pelo Comitê de
Ética acima mencionado e seguiu os Princípios de Cuidados de Animais de
Laboratório (Principles of Laboratory Animal Care, Instituto Nacional de Saúde
dos Estados Unidos da América, NIH, publicação número 85-23, revisada em
1985).
3.3 Produção de CO2 por homogeneizados de córtex cerebral de ratos
jovens
A produção de CO2 por homogeneizados de córtex cerebral foi determinada
a partir de [1-14C] ácido acético (0,055 Ci) na presença de 1 mM de ácido acético
não marcado no meio de incubação. Nestes experimentos os tubos testes
continham 0,01, 0,1, 1, e 5 mM de ácido isovalé.25172
o, 0,01,
0 Td
0,1(e)Tj
e 1 mM
6.25172
de ácido
0 Td3(r)Tj 3c
hidroxiisoval
52
3.3.1 Preparação do tecido
Os animais foram sacrificados por decapitação, sem anestesia. O cérebro
foi rapidamente removido e dissecado sobre uma placa de Petry em gelo para a
obtenção do córtex cerebral, de onde todo o sangue visível foi removido com o
auxílio de um papel filtro. O córtex cerebral foi isolado, pesado e homogeneizado
na proporção de 1:10 (p/v) em solução tampão contendo KHCO3 30 mM, KH2PO4
30 mM, NaCl 30 mM, MgCl2 3,5 mM, EDTA 0,2 mM e sacarose 24 mM, pH 7,4,
previamente aerada com mistura carbogênica durante 10 minutos.
3.3.2 Captação de CO2
Um volume de 450 L de homogeneizado, contendo aproximadamente 45
mg de cérebro médio, foi pré-incubado na presença de 1,4 mM de
laurilmaltosídeo por 20 minutos a 35°C em banho metabólico com agitação. Após,
foram acrescentados ao meio de incubação os substratos marcados e os ácidos a
serem testados (tubos testes). Os frascos foram fechados com tampas de
borracha contendo caçapas de vidro com papel filtro dobrado em forma de “W”,
vedados com parafilme e devolvidos ao banho. Transcorrida 1 hora de incubação
a reação foi interrompida pela adição de 200 L de TCA 50% ao homogeneizado
e foram adicionados então 100
L de hiamina dentro das caçapas. Os frascos
foram devolvidos ao banho por 30 minutos para que o CO2 pudesse ser
incorporado
ao
papel
filtro
impregnado
por
hiamina.
Terminado
este
procedimento, o papel filtro embebido em hiamina foi retirado com o auxílio de
uma pinça e de uma micropipeta sendo transferido para tubos de plástico. Em
53
cada tubo foi adicionado 3 mL de líquido de cintilação POP/POPOP/tolueno (4g/
50 mg/ tolueno q.s.p 1000 mL) quando da adição do papel filtro e da hiamina nos
tubos. Posteriormente, os tubos foram agitados e a radioatividade incorporada ao
CO2 foi determinada em contador de cintilação líquida. A produção de CO2 foi
expressa em percentagem do controle.
3.4 Determinação das atividades dos complexos da cadeia respiratória em
homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens
A atividade dos complexos II, SDH, II-III e IV da cadeia respiratória foi
determinada na presença de 0,01, 0,1, 1 e 5 mM do ácido isovalérico, ou na
presença de 0,01, 0,1 e 1 mM do ácido 3-hidroxiisovalérico ou da isovalerilglicina
(tubos testes). Os tubos controle não continham nenhum dos metabólitos
testados. Já a atividade do complexo I foi determinada na presença de 1 e 5 mM
do ácido isovalérico ou 1 mM do ácido 3-hidroxiisovalérico ou da isovalerilglicina
(tubos testes). Os tubos controle não continham nenhum dos metabólitos
estudados. Ambos os compostos foram sempre dissolvidos e diluídos na solução
tampão específica de cada técnica. Os experimentos foram realizados em
duplicata.
3.4.1 Soluções
3.4.1.1 Soluções para preparação da amostra
a. Tampão SETH
54
Solubilizar 4,28 g de sacarose, 0,0372 g de EDTA, 0,0605 g de
trisma-base e 0,5 mL de heparina 5000 U.I./mL em 40 mL de água MiliQ. Ajustar
o pH para 7,4 com HCl e completar o volume para 50 mL.
3.4.1.2 Soluções para a determinação da atividade do complexo I
a. Tampão fosfato 100 mM pH 7,4
Solubilizar 1,75 g de K2HPO4 em 100 mL de água MilliQ (solução A)
e 1,36 g de KH2PO4 em 100 mL de água MilliQ (solução B). Ajustar o pH da
solução A adicionando a solução B até atingir pH 7,4.
b. NADH 14 mM
Solubilizar 0,0497 g de NADH em 10,0 mL de água MilliQ.
c. Rotenona 2 mM
Solubilizar 0,00159 g de rotenona em 2 mL de etanol absoluto.
d. Ferricianato de potássio 10 mM
Solubilizar 0,01646 g de ferricianato de potássio em 5 mL de água
MilliQ.
3.4.1.3 Soluções para a determinação da atividade do complexo II e SDH
a. Succinato 250 mM
Solubilizar 0,3376 g de succinato de sódio hexahidratado em 4 mL
de água MilliQ, ajustar o pH para 7,4 com KOH. Completar o volume até 5 mL
com água MilliQ.
b. Tampão fosfato 62,5 mM pH 7,4
55
Solubilizar 2,23 g de K2HPO4 em 200 mL de água MilliQ (solução A)
e 1,275 g de KH2PO4 em 150 ml de água MilliQ (solução B). Adicionar a solução
B em 150 mL da solução A até o pH tornar-se 7,4.
c. Dicloroindofenol (DCIP) 0,5 mM
Solubilizar 0,00145 g de DCIP em 10 mL de água.
d. Azida sódica 100 mM
Solubilizar 0,013 g de azida sódica em 2 mL de água MilliQ.
e. Rotenona 2 mM
Solubilizar 0,00159 g de rotenona em 2 mL de etanol absoluto.
f. Metassulfato de fenazina (PMS) 24 mM
Solubilizar 0,00735 g de metassulfato de fenazina em 1 mL de água
MilliQ.
3.4.1.4 Soluções para a determinação da atividade do complexo II+CoQ+III
a. Tampão fosfato de potássio 62,5 mM pH 7,4
Solubilizar 2,23 g de K2HPO4 em 200 mL de água MilliQ (solução A)
e 1,275 g de KH2PO4 em 150 mL de água MilliQ (solução B). Adicionar a solução
B em 150 mL da solução A até o pH tornar-se 7,4.
b. Citocromo c 0,5%
Solubilizar 0,010 g de citocromo c em 2 mL de água MilliQ.
c. Azida sódica 100 mM
Solubilizar 0,013 g de azida sódica em 2 mL de água MilliQ.
d. Rotenona 2 mM
Solubilizar 0,00159 g de rotenona em 2 mL de etanol absoluto.
56
e. Sucinato 250 mM pH 7,4
Solubilizar 0,3376 g de succinato de sódio hexahidratado em 5 mL
de tampão fosfato de potássio 62,5 mM pH 7,4. Se necessário ajustar o pH com
KOH para 7,4.
3.4.1.5 Soluções para a determinação da atividade do complexo IV
a. Tampão fosfato 10 mM pH 7,0
Solubilizar 0,348 g de K2HPO4 em 200 mL de água MilliQ (solução
A) e 0,204 g de KH2PO4 em 150 mL de água MilliQ (solução B). Em 175 mL da
solução A acrescentar a solução B até o pH tornar-se igual a 7,0.
b. Lauril-maltosídio 125 mM
Solubilizar 0,319 g de lauril-maltósito em 5 mL de água MilliQ.
c. Citocromo c reduzido
Solubilizar em copo de béquer 0,025 g de citocromo c em 2,5 mL de
água MilliQ. Adicionar 0,004 g de borato de sódio (Sigma), misturando-o por 2
minutos e tampar o copo de béquer com Parafilm. Colocar a solução sobre o gelo
e esperar por 30 minutos para ajustar o pH até 7,0 com HCl 1 N.
3.4.2 Preparação dos tecidos para a medida das atividades dos complexos
da cadeia respiratória
Os animais foram sacrificados por decapitação sem anestesia, o cérebro
foi rapidamente removido, e o córtex cerebral rapidamente isolado e
homogeneizado 1:20 (p/v) em tampão SETH (sacarose 250 mM, EDTA 2 mM,
57
Trisma base 10 mM e heparina dissolvidos em água destilada e deionizada q.s.p
50 mL) pH 7,4. Os homogeneizados foram centrifugados a 800 x g por 10 minutos
e os sobrenadantes separados em alíquotas de 200 a 300 L e mantidos a -70°C
por um período máximo de um mês até o momento das determinações
enzimáticas.
No momento das determinações, as amostras foram congeladas e
descongeladas por duas vezes consecutivas para a determinação da atividade
dos complexos I, II e II-III.
3.4.3 Determinação da quantidade de proteína
O conteúdo protéico das amostras foi determinado pelo método de Lowry
et al. (1951) usando albumina bovina como padrão.
3.4.4 Medida das atividades dos complexos da cadeia respiratória
3.4.4.1
Determinação da atividade do Complexo I (NADH desidrogenase)
O meio de reação foi feito em tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 7,4,
contendo ferricianeto de potássio 0,5 mM, rotenona 5 µM e 0,1 mg/mL de
proteína (homogeneizado de córtex cerebral). A reação foi iniciada pela adição de
NADH a uma concentração final de 200 µM. A redução do ferricianeto a 420 nm e
37º C foi acompanhada na presença ou na ausência dos compostos a serem
testados durante 3 minutos. A atividade foi expressa em mmol de ferricianeto
reduzido/min/mg proteína (Cassina & Radi, 1996).
58
3.4.4.2
Determinação da atividade do Complexo II (succinato: DCIP
oxirredutase)
O meio de incubação era constituído de fosfato de potássio (40 mM pH
7,4), succinato de sódio (16 mM) e DCIP (8 µM). Inicialmente pré-incubava-se
com 40-80 µg de proteínas do homogeneizado a 30°C por 20 minutos os tubos
testes e controles. Depois, foram adicionados ao meio 4 mM de azida sódica e 7
µM de rotenona e a reação foi iniciada pela adição de 40 µM de DCIP. As
absorbâncias foram registradas por 5 minutos a 600nm. A atividade do complexo
II foi medida pela diminuição da absorbância causada pela redução do 2,6dicloroindofenol (DCIP) a 600 nm (Fischer et al., 1985).
3.4.4.3
Determinação
da
atividade
da
SDH
(sucinato:
fenazina
oxirredutase)
O meio de reação constituído de fosfato de potássio (40 mM, pH 7,4),
succinato de sódio (16 mM) e DCIP (8 µM) foi pré-incubado com 40-80 µg de
proteína do homogeneizado a 30°C por 20 minutos. Depois foram adicionados
4mM de azida sódica, 7 µM de rotenona e 40 µM de DCIP. A reação foi iniciada
pela adição de 1 mM de PMS. As absorbâncias foram registradas por 5 minutos a
600 nm. A atividade da enzima succinato: fenazina oxiredutase (succinato
desidrogenase solúvel - SDH) foi medida nas amostras de homogeneizado na
presença de metassulfato de fenazina (PMS) pela diminuição na absorbância
causada pela redução do 2,6-dicloroindofenol (DCIP) (Sorensen & Mehler, 1982).
59
3.4.4.4 Determinação da atividade do Complexo II+CoQ+III (succinato:
citocromo c oxirredutase)
Ao meio de reação constituído de tampão fosfato de potássio 40 mM pH 7,4
e sucinato de sódio 16 mM, foi adicionada amostra contendo 40 a 80 µg de
proteína. Tubos testes e controles foram pré-incubados por 30 minutos a 37°C e,
após, foram adicionados 4 mM de azida sódica e 7 µM de rotenona e a reação foi
iniciada pela adição de 0,6 µg/mL de citocromo c. A redução do citocromo c foi
registrada em 550 nm a 25°C durante 5 minutos (Fischer et al.,1985). A atividade
foi expressa em nmol de citocromo c reduzido / min / mg de proteína.
3.4.4.5
Determinação da atividade do Complexo IV (citocromo c oxidase)
O meio de incubação continha tampão fosfato de potássio (10 mM, pH 7,0),
lauril-maltosídio (0,6 mM) e 10-20 µg de proteína (homogenizado). A reação foi
iniciada com a adição de 0,7 µg de citocromo c. A atividade do complexo IV foi
medida a 25°C por 10 minutos na presença e na ausência dos ácidos bem como
da isovalerilglicina. A atividade da citocromo c oxidase (COX) foi medida pelo
decréscimo na absorbância devido à oxidação de citocromo c previamente
reduzido com borohidrato de sódio. As leituras serão feitas em 550 nm (Rustin et
al, 1994). A atividade foi expressa em nmol de citocromo c oxidado / min / mg de
proteína.
60
3.5 Determinação da atividade da creatina quinase
3.5.1 Soluções
a.Tampão Trisma-sulfato de magnésio pH 7,5 (trisma-base 100 mM e
MgSO4 15 mM).
Solubilizar 2,42 g de trisma-base e 0,740 g de sulfato de magnésio
heptahidratado (MgSO4) em 180 mL de água MilliQ, ajustar o pH até 7,4 com HCl
10 N e completar o volume até 200 mL com água MilliQ.
b. Fosfocreatina (11,8 mM)
Solubilizar 0,09 g de fosfocreatina em 30 mL do tampão trismasulfato de magnésio.
c. ADP-glutationa (ADP 16 mM e glutationa 4 mM)
Solubilizar 0,006146 g de glutationa em 5 mL de água MiliQ gelada
e em seguida dissolver nessa solução 0,0342 g de Adenina-5'
-difosfato (ADP). A
solução final é separada em alíquotas de 500 µL e congelada.
d. Hidróxido de sódio (NaOH) 10 N
Solubilizar 4 g de hidróxido de sódio em 10 mL de água MiliQ.
e. Ácido p-hidroximercuribenzóico (50 mM)
Solubilizar 0,18035 g de ácido p-hidroximercuribenzóico (pHMB) em
10 mL de água MilliQ e 2 gotas de NaOH 10 N.
f. Hidróxido de sódio (NaOH) 1,5 N
Solubilizar 30 g de NaOH em 500 mL de água MiliQ.
g. α- Naftol (20%)
61
Solubilizar 0,20 mg de α-naftol, no momento do uso, em 10 mL de
NaOH 1,5 N.
h. Solução de diacetil (20%)
Misturar 20 µL de diacetil em 100 mL de água MiliQ.
i. Solução de creatina-padrão (1 mM)
Solubilizar 0,00262 g de creatina em 1 mL de água MiliQ.
3.5.2 Preparação de tecidos para a medida da atividade da creatina quinase
Ratos Wistar de 30 dias de vida foram sacrificados por decapitação sem
anestesia, o cérebro foi removido sobre placa de Petry em gelo, e o córtex
cerebral foi rapidamente isolado. Posteriormente, o tecido foi homogeneizado na
proporção de 1:10 (p/v) em solução salina 0,85% tamponada, pH 7,5. A
homogeneização foi feita manualmente utilizando homogeneizador de vidro em
gelo. O homogeneizado foi armazenado em alíquotas de 10 µL a -70°C por, no
máximo uma semana, até o momento da medição da atividade total da enzima
creatina quinase (CK total).
A atividade total da enzima (CK total) foi determinada na presença de 0,01,
0,1, 1 e 5 mM do ácido isovalérico, e 0,01, 0,1 e 1 mM do ácido 3hidroxiisovalérico, bem como da isovalerilglicina (tubos testes) e também na
ausência destes (tubos controles). Os ácidos e a isovalerilglicina foram
dissolvidos e diluídos na solução tampão da técnica e os experimentos realizados
em triplicata.
62
3.5.3 Determinação da quantidade de proteína
O conteúdo protéico das amostras foi determinado pelo método de Lowry
et al., (1951) usando albumina bovina como padrão.
3.5.4 Determinação da atividade enzimática da creatina quinase
A atividade da CK (CK total) foi medida em homogeneizado de córtex
cerebral. A mistura reacional continha tampão Tris-HCl 60 mM, pH 7,5,
fosfocreatina
7
mM,
MgSO4
9
mM,
lauril-maltosídeo
0,625
aproximadamente 0,4-1,2 µg de proteína em um volume final de 100
mM
e
L. Os
sistemas (tubos testes e controles) foram pré-incubados por um período de 15
minutos a 37°C, sendo a reação iniciada com a adição de ADP e glutationa
reduzida a uma concentração final de 3,2 mM e 0,8 mM, respectivamente. A
reação foi interrompida após 10 minutos de incubação com a adição de 20 µL de
ácido p-hidroximercuribenzóico (pHMB) 50 mM. A creatina formada foi estimada
através de método colorimétrico, e a coloração foi obtida pela adição de 100 µL
de α-naftol 20%, 680 µL de água deionizada e 100 µL de diacetil 20%. A leitura
foi
feita
após
uma
segunda
incubação
de
20
minutos
a
37°C
por
espectrofotometria a 540 nm (Hughes, 1962). O resultado final foi expresso em
µmol de creatina formada / min / mg de proteína.
Para calcular a atividade da creatina quinase (CK) nas amostras, foi feita
uma curva de calibração com creatina nas concentrações de 4 nmol/mL (60 µL de
fosfocreatina, 10 µL de creatina-padrão e 10 µL de água MilliQ) e 8nmol/mL (60
63
µL de fosfocreatina e 20µL de creatina-padrão. Através deste obteve-se o fator de
calibração médio (FCM) necessário para os cálculos de atividade da CK.
3.6 Determinação
da
atividade
da
Na+,K+-ATPase
em
membranas
plasmáticas sinápticas isoladas de córtex cerebral de ratos jovens
A atividade da enzima Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas
sinápticas foi determinada na presença de 0,01, 0,1, 1,0 e 5,0 mM de ácido
isovalérico, ou na presença de 0,01, 0,1 e 1,0 mM do ácido 3-hidroxiisovalérico,
ou na presença de
isovalerilglicina nessas mesmas concentrações. Nestes
casos, os metabólitos foram expostos diretamente a membranas sinápticas
isoladas.
A atividade da Na+,K+-ATPase também foi determinada em membranas
plasmáticas sinápticas de córtex cerebral pré-incubadas durante 1 hora a 37°C na
presença de 1,0 e 5,0 mM de ácido isovalérico, ou na presença de 1,0 mM de 3hidroxiisovalérico ou isovalerilglicina.
Nestes casos, as membranas sinápticas
foram preparadas após esta pré-incubação.
Os experimentos com os antioxidantes (L-NAME, GSH, Vitamina E,
Creatina) foram realizados somente quando a determinação da atividade da
enzima Na+,K+-ATPase foi realizada em membranas de córtex cerebral préincubadas durante 1 hora a 37°C na presença de 5,0 mM de ácido isovalérico.
A realização dos experimentos foi condicionada a presença de tubos
controle que não continham nenhum dos ácidos testados, ou isovalerilglicina.
Todos os metabólitos testados foram dissolvidos na solução tampão específica da
técnica. Os ensaios foram realizados em duplicata.
64
3.6.1 Preparação de membranas plasmáticas sinápticas
As membranas foram preparadas de acordo com o método de Jones e
Matus (1974). O animal foi decapitado sem anestesia, o córtex cerebral foi isolado
e homogeneizado em 10 volumes de uma solução contendo 0,32 mM de
sacarose, 5,0 mM de HEPES e 0,1 mM de EDTA. O homogeneizado foi
centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos a 4°C. A solução sobrenadante foi
separada e novamente centrifugada a 14.000 rpm por 20 minutos a 4°C. O
sedimento resultante foi suspenso em uma solução hipotônica de Tris-HCl 5 mM
pH 8,1 sendo mantido em gelo durante 20 minutos, onde a cada 5 minutos era
agitado suavemente para que ocorresse a lise dos sinaptossomas e vesículas em
geral. Com estas amostras foi montado um gradiente descontínuo de sacarose
constituído de três camadas de diferentes concentrações (48, 28,5, e 10%). Este
gradiente, contendo a amostra misturada à fração mais densa de sacarose (48%),
foi centrifugado a 30.000 rpm por 1 hora e 50 minutos a 4°C. Conforme Jones e
Matus (1974), após esta centrifugação, a fração de menor concentração
(sacarose 10%) é composta basicamente por mielina; a fração intermediária é
constituída principalmente por membranas plasmáticas sinápticas (situadas na
interface das soluções 28,5 e 48%) e a última fração (sedimento) composta por
mitocôndrias. Com o auxílio de uma micropipeta de volume regulável, a fração
intermediária foi aspirada e suspensa em tampão Tris-HCl 5 mM pH 8,1, sendo
centrifugada a 14.000 rpm durante 20 minutos a 4°C , para a remoção da
sacarose residual. O sedimento, contendo as membranas plasmáticas sinápticas
purificadas, foi suspenso no tampão anteriormente citado de modo a obter-se
uma concentração final de proteínas entre 0,15 e 0,3 mg/ml. As amostras foram
65
então separadas em alíquotas e armazenadas a -70°C até o momento da
determinação enzimática.
3.6.2 Preparação de membranas plasmáticas sinápticas com pré-incubação
de 1 hora a 37°C
Quando as membranas preparadas para a medida da atividade Na+,K+ATPase necessitavam ser pré-incubadas durante 1 hora a 37°C, o animal era
decapitado sem anestesia, o córtex cerebral foi isolado e homogeneizado em 10
volumes de uma solução contendo 0,32 mM de sacarose, 5,0 mM de HEPES e
0,1 mM de EDTA. Neste momento o ácido isovalérico, ou o 3-hidroxiisovalérico ou
a isovalerilglicina era adicionado ao homogeneizado, bem como os antioxidantes
L-NAME 1mM ou GSH 1 mM ou Vitamina E 1 mM ou Creatina 1 mM, que foram
utilizados exclusivamente nos experimentos na presença de 5,0 mM de ácido
isovalérico e imediatamente incubados por 1 hora a 37°C juntamente com os
controles que não possuíam os metabólitos e antioxidantes. Em seguida as
membranas seguiam a preparação de acordo com o método de Jones e Matus
(1974).
3.6.3 Determinação da quantidade de proteína
A concentração de proteínas das amostras foi determinada pelo método de
Bradford (1976), utilizando-se albumina sérica bovina como padrão.
66
3.6.4 Determinação da atividade enzimática
A atividade da enzima Na+,K+-ATPase foi medida conforme o método de
Tsarkis e Deliconstantinus (1984). O meio de reação continha MgCl2 5 mM, NaCl
80 mM, KCl 20 mM, Tris-HCl 40 mM pH 7,4 em um volume final de 200 µl. A
atividade de outras ATPases foi medida na presença de ouabaína 1mM (inibidor
específico da Na+,K+-ATPase). A atividade da Na+,K+-ATPase foi então calculada
como sendo resultante da diferença da atividade obtida pelas ATPases no meio
sem ouabaína da atividade das ATPases do meio contendo ouabaína. As
amostras de membranas sináptica foram adicionadas ao meio em um volume de
10 µl (0,015 – 0,03 µg de proteína) e pré-incubadas na presença ou ausência dos
metabólitos testados a 37°C durante 10 minutos. A reação foi iniciada pela adição
de ATP 3 mM e o término, após 5 minutos de incubação a 37°C, ocorreu pela
adição de 200 µl de TCA 10%. O fosfato inorgânico (Pi) liberado durante a
incubação foi medido pelo método de Chan, Delfert e Junger (1986). A atividade
foi expressa em nmol de Pi liberado/min/mg de proteína.
3.7 Análise estatística
Utilizou-se análise de variância de uma via (ANOVA) para comparação de
três ou mais , médias, seguida do teste de múltipla amplitude de Duncan, quando
o valor de F foi significativo. Também se utilizou o teste t de Student para
amostras pareadas para comparação de duas médias. O limite para significância
foi de p<0,05. Os resultados foram analisados usando o programa SPSS
67
(Statistical Package for the Social Sciences) versão 11.0 em um computador PC
compatível.
68
4
RESULTADOS
4.1 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico (3OHIVA) e da isovalerilglicina (IVG) sobre a produção de CO2 a partir de
acetato em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens
A figura 4.1 mostra que o IVA, nas concentrações de 0,01, 0,1, 1 e 5 mM,
não inibe significativamente a produção de CO2 a partir de acetato [F(4,14)=
0,088; p>0,05]. Por outro lado, o 3-OHIVA (figura 4.2) [F(3,15)= 1,123; p>0,05] e a
IVG (figura 4.3) [F(3,16)= 0,688; p>0,05], nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1,0
mM,
também não inibem significativamente a produção de CO2 a partir de
acetato.
69
Produção de 14CO2
(percentual do controle)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Controle
0,01
0,1
1
5
Concentração de IVA (mM)
Figura 4.1. Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a produção de
CO2 a partir de acetato em homogeneizados de córtex cerebral de ratos
jovens. Os valores representam médias ± erro padrão (n=5) e foram expressos
como percentagem do controle (2,20 ± 0,5 µmol de acetato convertido a CO2 / mg
de proteína / hora de incubação). A diferença entre as médias foi calculada por
análise de variância (ANOVA) de uma via. Não houve diferença significativa entre
os grupos.
70
Produção de 14CO 2
(percentual do controle)
140
120
100
80
60
40
20
0
Controle
0,01
0,1
1
Concetração de 3-OHIVA (mM)
Figura 4.2. Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
produção de CO2 a partir de acetato em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens. Os valores representam médias ± erro padrão (n=5) e foram
expressos como percentagem do controle (2,20 ± 0,5 µmol de acetato convertido
a CO2 / mg de proteína / hora de incubação). A diferença entre as médias foi
calculada por análise de variância (ANOVA) de uma via. Não houve diferença
significativa entre os grupos.
71
Produção de 14CO2
(percentual do controle)
120
100
80
60
40
20
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de IVG (mM)
Figura 4.3. Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a produção de CO2
a partir de acetato em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens.
Os valores representam médias ± erro padrão (n=5) e foram expressos como
percentagem do controle (4,50 ± 0,8 µmol de acetato convertido a CO2 / mg de
proteína / hora de incubação). A diferença entre as médias foi calculada por
análise de variância (ANOVA) de uma via. Não houve diferença significativa entre
os grupos.
72
4.2 Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre a atividade dos complexos enzimáticos da cadeia
respiratória em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens
4.2.1 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico
(3-OHIVA) e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do complexo I da
cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens
A figura 4.4 mostra que o IVA nas concentrações de 1 e 5 mM não teve
efeito sobre a atividade do complexo I [F(2,12)= 1,602; p>0,05]. As figuras 4.5 e
4.6, respectivamente, mostram que o 3-OHIVA [t(8)= -2,523; p>0,05] e a IVG
[t(8)= -1,863; p>0,05], na concentração de 1 mM, também não reduziram a
atividade do complexo I.
73
Atividade do Complexo I
(mmol de ferricianeto reduzido / min /
mg proteína)
750
600
450
300
150
0
Controle
1
5
Concentração de IVA (mM)
Figura 4.4. Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade do
complexo I da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral de
ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5). A diferença
entre as médias foi calculada por análise de variância (ANOVA) de uma via. Não
houve diferença significativa entre os grupos.
74
Atividade do Complexo I
(mmol de ferricianeto reduzido / min / mg
proteína)
600
500
400
300
200
100
0
Controle
3-OHIVA (1 mM)
Figura 4.5. Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade do complexo I da cadeia respiratória em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão
(n=5). Os resultados foram analisados com teste t de Student para amostras nãopareadas. Não houve diferença significativa entre os grupos.
75
Atividade do Complexo I
(mmol de ferricianeto reduzido / min / mg
proteína)
600
500
400
300
200
100
0
Controle
IVG (1 mM)
Figura 4.6. Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do
complexo I da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral de
ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5). Os resultados
foram analisados com teste t de Student para amostras não-pareadas. Não houve
diferença significativa entre os grupos.
76
4.2.2 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico
(3-OHIVA) e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do complexo II da
cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens
A figura 4.7 mostra que o IVA nas concentrações de 0,01, 0,1, 1 e 5 mM
não teve efeito significativo sobre a atividade do complexo II [F(4,20)= 1,080;
p>0,05]. Por outro lado, as figuras 4.8 e 4.9 mostram, respectivamente, que o 3OHIVA [F(3,16)= 0,581; p>0,05] e a IVG [F(3,16)= 2,230; p>0,05] nas
concentrações de 0,01, 0,1, e 1 mM não reduziram a atividade do complexo II.
77
Atividade do Complexo II
(nmol de DCIP reduzido/min/mg de
proteína)
7
6
5
4
3
2
1
0
Controle
0,01
0,1
1
5
Concentração de IVA (mM)
Figura 4.7 Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade do
complexo II da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5). Os
resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via. Não
houve diferença significativa entre os grupos.
78
Atividade do ComplexoII (nmol de
DCIP reduzido/min/mg de proteína)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de 3-OHIVA (mM)
Figura 4.8. Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade do complexo II da cadeia respiratória em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão
(n=5). Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma
via. Não houve diferença significativa entre os grupos.
79
Atividade do Complexo II (nmol de
DCIP reduzido/min/mg de proteína)
5
4
3
2
1
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de IVG (mM)
Figura 4.9. Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do
complexo II da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5). Os
resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via. Não
houve diferença significativa entre os grupos.
80
4.2.3 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico
(3-OHIVA) e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da enzima succinato
desidrogenase (SDH) em homogeneizados de córtex cerebral de ratos
jovens
A figura 4.10 mostra que o IVA nas concentrações de 0,01, 0,1, 1 e 5 mM
não teve efeito significativo sobre a atividade da enzima SDH [F(4,20)= 0,411;
p>0,05]. Além disso, as figuras 4.11 e 4.12 mostram, respectivamente, que o 3OHIVA [F(3,8)= 1,166; p>0,05] e a IVG [F(3,16)= 3,178; p>0,05] nas
concentrações de 0,01, 0,1 e 1 mM também não tiveram efeito significativo sobre
a atividade da enzima SDH.
81
Atividade da succinato
desidrogenase (nmol de DCIP
reduzido/min/mg de proteína)
25
20
15
10
5
0
Controle
0,01
0,1
1
5
Concentração de IVA (mM)
Figura 4.10. Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade da
enzima succinato desidrogenase (SDH) em homogeneizados de córtex
cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5).
Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via.
Não houve diferença significativa entre os grupos.
82
Atividade da succinato
desidrogenase (nmol de DCIP
reduzido/min/mg de proteína)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de 3-OHIVA (mM)
Figura 4.11. Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade da enzima succinato desidrogenase (SDH) em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão
(n=3). Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma
via. Não houve diferença significativa entre os grupos.
83
Atividade da succinato
desidrogenase(nmol de DCIP
reduzido/min/mg de proteína)
12
10
8
6
4
2
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de IVG (mM)
Figura 4.12. Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da
enzima succinato desidrogenase (SDH) em homogeneizados de córtex
cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5).
Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via.
Não houve diferença significativa entre os grupos.
84
4.2.4 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico
(3-OHIVA) e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do complexo II-III da
cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens
A figura 4.13 mostra que o IVA nas concentrações de 0,01, 0,1, 1 e 5 mM
não teve efeito significativo sobre a atividade do complexo II-III [F(4,23)= 0,492;
p>0,05]. Por outro lado, as figuras 4.14 e 4.15, respectivamente, mostram que o
3-OHIVA [F(3,16)= 0,289; p>0,05] e a IVG [F(3,16)= 0,140; p>0,05] nas
concentrações de 0,01, 0,1, e 1 mM não reduziram a atividade do complexo II-III.
85
Atividade do Complexo II-III (nmol
de citocromo c reduzido/min/mg de
proteína)
25
20
15
10
5
0
Controle
0,01
0,1
1
5
Concentração de IVA (mM)
Figura 4.13. Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade do
complexo II-III da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5). Os
resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via. Não
houve diferença significativa entre os grupos.
86
Atividade do Complexo II-III (nmol
de citocromo c reduzido/min/mg de
proteína)
25
20
15
10
5
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de 3-OHIVA (mM)
Figura4.14. Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade do complexo II-III da cadeia respiratória em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão
(n=5). Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma
via. Não houve diferença significativa entre os grupos.
87
Atividade do Complexo II-III(nmol de
citocromo c reduzido/min/mg de
proteína)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de IVG (mM)
Figura 4.15. Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do
complexo II-III da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5). Os
resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via. Não
houve diferença significativa entre os grupos.
88
4.2.5 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA), ácido 3-hidroxiisovalérico
(3-OHIVA) e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do complexo IV da
cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens
A figura 4.16 mostra que o IVA nas concentrações de 0,01, 0,1, 1 e 5 mM
não teve efeito significativo sobre a atividade do complexo IV [F(4,15)= 0,703;
p>0,05]. Além disso, as figuras 4.17 e 4.18 mostram, respectivamente, que o 3OHIVA [F(3,12)= 0,311; p>0,05] e a IVG [F(3,12)= 0,700; p>0,05] nas
concentrações de 0,01, 0,1, e 1 mM também não tiveram efeito significativo sobre
a atividade do complexo IV.
89
Atividade do Complexo IV (nmol de
citocromo c oxidado/min/mg de
proteína)
300
250
200
150
100
50
0
Controle
0,01
0,1
1
5
Concentração de IVA (mM)
Figura 4.16. Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade do
complexo IV da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5). Os
resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via. Não
houve diferença significativa entre os grupos.
90
Atividade do Complexo IV (nmol de
citocromo c oxidado/min/mg de
proteína)
300
250
200
150
100
50
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de 3-OHIVA (mM)
Figura 4.17. Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade do complexo IV da cadeia respiratória em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão
(n=5). Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma
via. Não houve diferença significativa entre os grupos.
91
Atividade do Complexo IV (nmol de
citocromo c oxidado/min/mg de
proteína)
350
300
250
200
150
100
50
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de IVG (mM)
Figura 4.18. Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade do
complexo IV da cadeia respiratória em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5). Os
resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via. Não
houve diferença significativa entre os grupos.
92
4.3 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3OHIVA) e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da enzima creatina
quinase (CK total) em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens
A figura 4.19 mostra que o IVA nas concentrações de 0,01, 0,1, 1 e 5 mM
não exerceu nenhum efeito significativo sobre a atividade da enzima creatina
quinase (CK) [F(4,27)= 0,176; p>0,05]. Por outro lado, as figuras 4.20 e 4.21,
respectivamente, mostram que o 3-OHIVA [F(3,16)= 0,695; p>0,05] e a IVG
[F(3,16)= 0,270; p>0,05] nas concentrações de 0,01, 0,1, e 1 mM não provocaram
nenhum efeito significativo sobre a atividade da enzima CK.
93
Atividade da creatina quinase ( µ mol
de creatina/min/mg de proteína)
5
4
3
2
1
0
Controle
0,01
0,1
1
5
Concentração de IVA (mM)
Figura 4.19. Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade total
da enzima creatina quinase (CK total) em homogeneizados de córtex
cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5).
Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via.
Não houve diferença significativa entre os grupos.
94
Atividade da creatina quinase ( µ mol
de creatina/min/mg de proteína)
4
3
2
1
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de 3-OHIVA (mM)
Figura 4.20. Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade total da enzima creatina quinase (CK total) em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão
(n=5). Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma
via. Não houve diferença significativa entre os grupos.
95
Atividade da creatina quinase ( µ mol
de creatina/min/mg de proteína)
6
5
4
3
2
1
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de IVG (mM)
Figura 4.21. Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade total da
enzima creatina quinase (CK total) em homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=5). Os
resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via. Não
houve diferença significativa entre os grupos.
96
4.4 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3OHIVA) e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de
membranas plasmáticas sinápticas isoladas de córtex cerebral de ratos
jovens
A figura 4.22 mostra que o IVA nas concentrações de 0,01, 0,1, 1 e 5 mM
não exerceu nenhum efeito sobre a atividade da enzima Na+,K+-ATPase em
membranas plasmáticas sinápticas isoladas de córtex cerebral de ratos jovens
[F(4,15)= 1,050; p>0,05]. Além disso, as figuras 4.23 e 4.24, respectivamente,
mostram que o 3-OHIVA [F(3,16)= 0,191; p>0,05] e a IVG [F(3,20)= 1,59; p>0,05]
nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1 mM não reduziram a atividade da enzima
Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas isoladas de córtex
cerebral de ratos jovens.
97
Atividade da enzima Na +, K+ ATPase
(percentual do controle)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Controle
0,01
0,1
1
5
Concentração de IVA (mM)
Figura 4.22. Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade da
Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas isoladas de córtex
cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=4) e
foram expressos em percentagem do controle (801,3 ± 42,2 µmol Pi / min / mg de
proteínas). Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de
uma via. Não houve diferença significativa entre os grupos.
98
Atividade da enzima Na +, K+ ATPase
(Percentual do Controle)
140
120
100
80
60
40
20
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de 3-OHIVA (mM)
Figura 4.23. Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade da Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas isoladas
de córtex cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro
padrão (n=5) e foram expressos em percentagem do controle (1288,0 ± 186,6
µmol Pi / min / mg de proteínas). Os resultados foram analisados por análise de
variância (ANOVA) de uma via. Não houve diferença significativa entre os grupos.
99
Atividade da enzima Na +, K+ ATPase
(percentual do controle)
140
120
100
80
60
40
20
0
Controle
0,01
0,1
1
Concentração de IVG (mM)
Figura 4.24. Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da
Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas isoladas de córtex
cerebral de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=6) e
foram expressos em percentagem do controle (1340,2 ± 208,8 µmol Pi / min / mg
de proteínas). Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA)
de uma via. Não houve diferença significativa entre os grupos.
100
4.5 Efeito in vitro dos ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3OHIVA) e da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em
membranas plasmáticas sinápticas de homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens quando pré-incubados durante 1 hora a 37°C
A figura 4.25 mostra que o IVA, na concentração de 5 mM, quando préincubado com homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens durante 1 hora
a 37°C, inibiu significativamente a atividade da enzima Na+,K+-ATPase em
membranas plasmáticas sinápticas [F(2,12)= 5,439; p<0,05]. No entanto, as
figuras 4.26 e 4.27, respectivamente, mostram que o 3-OHIVA [t(6)= -0,453;
p>0,05] e a IVG [t(4)= -1,449, p>0,05] quando pré-incubados durante 1 hora a
37°C na concentração de 1 mM não exerceram nenhum efeito sobre a atividade
da
enzima
Na+,K+-ATPase
em
membranas
plasmáticas
sinápticas
de
homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens.
101
Atividade da enzima Na +, K+ ATPase
(percentual do controle)
120
100
*
80
60
40
20
0
Controle
1
5
Concentração de IVA (mM)
Figura 4.25. Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade da
Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas de homogeneizados
de córtex cerebral de ratos jovens quando pré-incubados durante 1 hora a
37°C. Os valores representam média ± erro padrão (n=4), expressos em
percentagem do controle (899,1 ± 68,9 µmol Pi / min / mg de proteínas). Os
resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via
seguida do teste de múltipla amplitude de Duncan. * P < 0.05, diferente dos
controles.
102
(percentual do controle)
Atividade da enzima Na +, K+ ATPase
140
120
100
80
60
40
20
0
Controle
3-OHIVA (1 mM)
Figura 4.26. Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a
atividade da Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas de
homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens quando pré-incubados
durante 1 hora a 37°C. Os valores representam média ± erro padrão (n=4),
expressos em percentagem do controle (1002,5 ± 174,9 µmol Pi / min / mg de
proteínas). Os resultados foram analisados pelo teste t de Student para amostras
dependentes. Não houve diferença significativa entre os grupos.
103
(percentual do controle)
Atividade da enzima Na +, K+ ATPase
140
120
100
80
60
40
20
0
Controle
IVG (1 mM)
Figura 4.27. Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da
Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas de homogeneizados
de córtex cerebral de ratos jovens quando pré-incubados durante 1 hora a
37°C. Os valores representam média ± erro padrão (n=3), expressos em
percentagem do controle (1171,4 ± 94,5 µmol Pi / min / mg de proteínas). Os
resultados foram analisados pelo teste t de Student para amostras dependentes.
Não houve diferença significativa entre os grupos.
104
4.6. Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade da Na+,K+ATPase em membranas plasmáticas sinápticas de homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens quando co-incubado durante 1 hora a 37°C
na presença de glutationa reduzida (GSH), do inibidor da óxido nítrico
sintase N -nitro-L-argininametiléster (L-NAME), da vitamina E (VIT E) ou da
creatina (Cr)
A figura 4.28 mostra que a inibição provocada pelo IVA (na concentração
de 5 mM) sobre a atividade da enzima Na+,K+-ATPase em membranas
plasmáticas sinápticas de homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens
não foi alterada pela glutationa reduzida (GSH, 1 mM) ou pelo inibidor da enzima
óxido nítrico sintase N -nitro-L-argininametiléster (L-NAME, 1 mM) quando coincubados durante 1 hora a 37°C [F(3,19)= 5,533; p<0,05]. Por outro lado, a figura
4.29 mostra que a inibição provocada pelo IVA (na concentração de 5 mM) sobre
a atividade da enzima Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas
isoladas de homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens foi prevenida pela
vitamina E (Vit E, 1 mM) e pela creatina (Cr, 1 mM) quando co-incubados durante
1 hora a 37°C [F(3,16)= 3,696; p<0,05] .
105
incubada durante 1 hora (percentual do
controle)
Atividade da enzima Na +, K+ ATPase pré-
120
100
*
80
*
*
60
40
20
0
Controle
IVA 5 mM
IVA 5 mM
+GSH 1 mM
IVA 5 mM + LNAME 1 mM
Figura 4.28. Efeito in vitro dos antioxidantes glutationa reduzida (GSH, 1
mM) e do inibidor da óxido nítrico sintase N -nitro-L-argininametiléster (LNAME, 1 mM) sobre a inibição provocada pelo ácido isovalérico (IVA) sobre
a atividade da Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas de
córtex cerebral de ratos jovens quando co-incubados durante 1 hora a 37°C.
Os valores representam média ± erro padrão (n=5-6) e foram expressos como
percentagem do controle (798,4 ± 27,1 µmol Pi / min / mg de proteínas). Os
resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via
seguida pelo teste de múltipla amplitude de Duncan. * P < 0,05, diferente dos
controles.
106
#
120
+
+
Atividade da enzima Na , K ATPase
(percentual do controle)
140
#
100
*
80
60
40
20
0
Controle
IVA 5 mM
IVA 5 mM + VIT IVA 5 mM + Cr
E 1 mM
1 mM
Figura 4.29. Efeito in vitro do antioxidante vitamina E (VIT E, 1mM) e da
creatina (Cr, 1 mM) sobre a inibição provocada pelo ácido isovalérico (IVA)
sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em membranas plasmáticas sinápticas
de córtex cerebral de ratos jovens quando co-incubados durante 1 hora a
37°C. Os valores representam média ± desvio padrão (n=5) e foram expressos
como percentagem do controle (786,5 ± 96,4 µmol de Pi / min / mg de proteínas).
Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via
seguida pelo teste de múltipla amplitude de Duncan. * P < 0.05, diferente dos
controles, # P < 0,05, diferente de IVA.
107
5. DISCUSSÃO
A acidemia isovalérica é uma doença neurometabólica autossômica
recessiva do catabolismo do aminoácido leucina causada pela deficiência da
atividade da enzima isovaleril-CoA desidrogenase (Tanaka et al, 1966), levando
ao acúmulo preponderante dos ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3OHIVA), bem como de isovalerilglicina (IVG). O nome da doença deve-se ao
ácido isovalérico que apresenta concentração milimolar no sangue dos pacientes,
principalmente durante episódios agudos (Tanaka et al., 1966).
Existem dois fenótipos clínicos da acidemia isovalérica, ambos devidos ao
mesmo defeito bioquímico. São eles a forma neonatal, severa aguda e a forma
crônica, menos grave, com início de apresentação mais tardio (Scriver et al.,
2001). Em ambos os variantes, os sintomas neurológicos, como hipotonia,
letargia, coma e convulsões são predominantes. Os achados laboratoriais são de
acidose
metabólica,
moderada
cetonúria,
acidemia/acidúria
láctica
e
hiperamonemia (Fischer et al., 1981).
O acúmulo dos metabólitos ácidos nesta doença não explica os sintomas
clínicos neurológicos dos pacientes, indicando que se faz necessária uma
investigação do papel desses metabólitos sobre a função do sistema nervoso
central que posssam esclarecer ao menos em parte a fisiolopatologia do dano
cerebral nesta doença. Tendo em vista que o ácido lático também se acumula nos
pacientes afetados principalmente durante os episódios de crise, indicando uma
disfunção mitocondrial, o presente trabalho teve como objetivo investigar os
efeitos do IVA, 3-OHIVA, e da IVG sobre alguns parâmetros importantes do
metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens, tais como a produção
108
de
14
CO2
a partir de [1-14C] acetato, bem como sobre as atividades dos
complexos I-IV da cadeia respiratória, da creatina quinase e da Na+, K+-ATPase
em membranas sinápticas.
As doses do IVA utilizadas nos ensaios in vitro foram similares às
encontradas no sangue dos pacientes afetados por acidemia isovalérica que se
aproximam de 5 mM durante as crises. Já o 3-OHIVA e a IVG foram utilizadas na
dose máxima de 1 mM, visto que estas substâncias se acumulam em menores
concentrações.
Primeiramente
nossos
resultados
demonstraram
que
o
IVA,
nas
concentrações de 0,01 a 5 mM, e o 3-OHIVA e a IVG, nas concentrações de 0,01
a 1 mM, não inibiram a produção de CO2 por homogeneizados de córtex cerebral
de ratos jovens a partir de acetato, indicando que os principais metabólitos
acumulados na acidemia isovalérica não comprometem a atividade do ciclo do
ácido cítrico. Similarmente, estes metabólitos, nas mesmas concentrações, não
alteraram as atividades dos complexos I, II, II-III, e IV da cadeia respiratória, bem
como da enzima sucinato desidrogenase em homogeneizados de córtex cerebral.
Além disso, a creatina quinase, uma enzima crucial envolvida na
transferência intracelular de ATP, não foi modificada pela presença das doses
máximas utilizadas dessas substâncias. Portanto, podemos concluir que o IVA, 3OHIVA e IVG provavelmente não comprometem in vitro a produção e a
transferência de energia em cérebro de ratos.
Por outro lado, a atividade da Na+,K+-ATPase de membranas plasmáticas
sinápticas foi significativamente inibida por 5 mM de IVA quando os
homogeneizados de córtex cerebral foram pré-incubados por uma hora com o IVA
e as membranas sinápticas preparadas a seguir. No entanto, a exposição direta
109
de membranas sinápticas purificadas de córtex cerebral ao IVA não provocou
qualquer inibição da atividade da Na+,K+-ATPase, indicando que esse ácido
provavelmente estava agindo via um mecanismo indireto que provoca a inibição
dessa atividade enzimática. Por outro lado, o 3-OHIVA e IVG não foram capazes
de inibir essa enzima quando expostos aos homogeneizados ou diretamente às
membranas sinápticas purificadas, indicando uma ação seletiva do IVA.
Considerando-se que a enzima Na+, K+-ATPase é muito vulnerável a
ataque de radicais livres (Lees, 1993; Kurella et al., 1997; Yousef et al., 2002), os
próximos ensaios foram feitos para testar o efeito de vários antioxidantes sobre a
inibição provocada pelo IVA sobre a atividade da Na+,K+-ATPase. O prétratamento dos homogeneizados de córtex cerebral com trolox (vitamina E
solúvel) e creatina preveniram totalmente a inibição provocada pelo IVA sobre
esta enzima, indicando que radicais peróxidos ou outros radicais livres que agem
contra grupamentos críticos para a função da enzima estão envolvidos com a
ação inibitória do IVA. Por outro lado, o pré-tratamento dos homogeneizados
corticiais com L-NAME e GSH não alteraram o efeito inibitório do IVA, sugerindo
que o óxido nítrico ou modificações dos grupos sulfidrilas da enzima que são
protegidos por GSH não são responsáveis por esse efeito.
Relativamente aos mecanismos responsáveis pela ação inibitória do IVA sobre
a atividade da Na+, K+-ATPase, poder-se-ia supor que eles fossem devidos, ao
menos em parte, a peroxidação lipídica da membrana plasmática sináptica, onde
a enzima está ancorada, já que, como demonstrado no presente estudo, a
inibição provocada pelo IVA foi completamente prevenida por vitamina E que age
sabidamente prevenindo ou removendo a formação de peróxidos.
110
No que diz respeito as consequências advindas da inibição da atividade da
Na+, K+-ATPase pelo IVA ao metabolismo e à função das células neurais,
evidências tem sido demonstradas associando alterações na atividade da
Na+,K+-ATPase com neurotoxicidade (Swedner, 1979; Lees et al., 1990; Satoh &
Nakazato, 1992; Lees, 1993), bem como pode levar aos processos de apoptose e
necrose (Xiao et al., 2000; Wang et al., 2003). Além disso, uma redução da
atividade da Na+,K+-ATPase no córtex cerebral de um neonato foi considerada
estar diretamente envolvida com o estado epiléptico e com a leucoencefalopatia
(Renkawek et al., 1992). Inibição da Na+, K+-ATPase tem também sido associada
à excitotoxidade e epilepsia (Grisar, 1984; Ben-Ari, 1985; Choi & Rothman, 1990;
Cousin et al., 1995; Lees & Leong, 1995). Nossos resultados poderiam, portanto,
explicar as crises encefalopáticas que ocorrem nos pacientes afetados pela
acidemia
isovalérica
após
infecções
ou
outras
situações
de
estresse
caracterizadas por catabolismo em que os níveis plasmáticos do IVA durante
esses episódios agudos atingem 5 mM (Scriver et al., 2001), similar aos que
provocaram inibição significante da atividade da Na+, K+-ATPase.
Concluindo, o presente trabalho demonstrou pela primeira vez que o IVA, o
metabólito que mais se acumula na acidedmia isovalérica, inibe uma enzima
crucial envolvida na manutenção do potencial de membrana basal necessária
para uma neurotransmissão normal. Se nossos resultados in vitro de inibição da
Na+, K+-ATPase forem confirmados in vivo e na doença humana em amostras
postmortem de cérebro, é possível que a inibição dessa enzima possa contribuir,
ao menos em parte para a encefalopatia encontrada na acidemia isovalérica,
especialmente durante as crises de descompensação metabólica em que os
111
metabólitos tóxicos acumulados aumentam dramaticamente suas concentrações
teciduais.
112
6. CONCLUSÕES
•
O ácido isovalérico (IVA) nas concentrações de 0,01, 0,1, 1, e 5 mM, bem
como o ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) e a isovalerilglicina (IVG) nas
concentrações de 0,01, 0,1, e 1 mM, não inibiram significativamente a
produção de CO2 a partir de acetato por homogeneizados de córtex
cerebral de ratos jovens.
•
O IVA, na concentração de 1 e 5 mM, não inibiu a atividade do complexo I
da cadeia respiratória, bem como a atividade dos complexos II, II-III, IV e
da SDH nas concentrações de 0,01, 0,1, 1 e 5 mM em homogeneizados de
córtex cerebral de ratos jovens.
•
O 3-OHIVA e a IVG não inibiram a atividade do complexo I em
homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens na concentração de 1
mM, bem como também não reduziram a atividade dos complexos II, II-III,
IV e da SDH nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1 mM.
•
O IVA, nas concentrações de 0,01, 0,1, 1 e 5 mM, bem como o 3-OHIVA e
a IVG nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1 mM, não reduziram a atividade
da enzima creatina quinase em homogeneizados de córtex cerebral de
ratos jovens.
•
O IVA, nas concentrações de 0,01, 0,1, 1 e 5 mM, bem como o 3-OHIVA e
a IVG, nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1 mM, não alteraram a atividade
113
da enzima Na+,K+-ATPase em membranas sinápticas plasmáticas isoladas
de córtex cerebral de ratos jovens.
•
O IVA, na concentração de 5 mM, quando pré-incubado durante 1 hora a
37°C com homogeneizados de córtex cerebral, inibiu em cerca de 40% a
atividade
da
enzima
Na+,K+-ATPase
em
membranas
sinápticas
plasmáticas de córtex cerebral de ratos jovens.
•
O efeito inibitório do IVA, na concentração de 5 mM, sobre a atividade da
enzima Na+,K+-ATPase em membranas sinápticas plasmáticas de córtex
cerebral de ratos jovens foi totalmente prevenido pela co-incubação de
vitamina E (1 mM) ou creatina (1 mM) com os homogeneizados por 1 hora
a 37°C.
•
O efeito inibitório do IVA na concentração de 5 mM sobre a atividade da
enzima Na+,K+-ATPase em membranas sinápticas plasmáticas de córtex
cerebral de ratos jovens não foi prevenido quando co-incubado com
homogeneizados por 1 hora a 37°C e com os antioxidantes L-NAME (1
mM) ou GSH (1 mM).
•
O 3-OHIVA e a IVG, na concentração de 1 mM, quando pré-incubados
durante 1 hora a 37°C não alteraram a atividade da enzima Na+,K+-ATPase
em membranas sinápticas plasmáticas de córtex cerebral de ratos jovens.
114
7. BIBLIOGRAFIA
ABELES, R. H.; FREY, P. A.; JENCKS, W. P. Biochemistry. London: Jones and
Bartlett, p. 603-631, 1992.
AKSENOV, M.; AKSENOVA, M.; BUTTERFIELD, D. A.; et al. Oxidative
modification of creatine kinase BB in Alzheimer’s disease brain. J. Neurochem, v.
74, p. 2520-2527, 2000.
BARTLETT, K.; GOMPERTZ, D. The specificity of glicine-N-acylase and
acylglycine excretion in the organic acidaemias. Biochem. Med. v. 10, p. 15, 1974.
BEN-ARI, Y. Limbic seizure and brain damage produced by kainic acid:
mechanisms and relevance to human temporal lobe epilepsy. Neuroscience, v.14,
p. 375-403, 1985.
BIRCH-MACHIN, M. A.; BRIGGS, H. L.; SABORIDO, A. A.; BINDOFF, L. A.;
TURNBULL, D. M. An evaluation of the measurement of the activities of
complexes I-IV in the respiratory chain of human skeletal muscle mitocondria.
Biochem Med Metab Biol, v. 51, p. 35-42, 1994.
BOEHM, E. A.; RADDA, G. K.; TOMLIN, H.; CLARCK, J. F. The utilisation of
creatine and analogues by cytosolic and mitocondrial creatine kinase. Biochim
Biophys Acta, v. 1274, p. 119-128, 1996.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of
microgram quantaties of protein utilizing the principle of protein-die binding. Anal.
Biochem. v. 72, p. 248-254, 1976.
BUDD, M. A.; TANAKA, K.; HOLMES, L. B.; EFRON, M. L.; CRAWFORD, J. D.;
ISSELBACHER, K. J. Isovaleric acidemia – clinical features of a new genetic
defect of leucine metabolism. N. Engl. J. Med. v. 277, p. 321, 1967.
BURTON, B. K. Inborn Errors of Metabolism: The clinical diagnosis in early
infancy. Pediatrics. v. 79, p. 359, 1987.
BURTON, G. W.; WRONSKA, U.; STONE, L.; FOSTER, D. O.; INGOLD, K. U.
Biokinetics of dietary RRR-α-tocopherol in the male guinea-pig at three dietary
levels of vitamin C and two levels of vitamin E. Lipids, v. 25, p. 199-210, 1990.
CASSINA, A.; RADI, R. Differential inibitory action of nitric oxide and peroxynitrite
on mitochondrial electron transport. Arch. Biochem. Biophys., v. 328(2), p. 309316, 1996.
CHALMERS, R. A.; LAWSON, A. M. Organic acids in man. Analytical chemistry,
biochemistry and diagnosis of the organic acidurias. London: Chapman & Hall, p.
221-229, 1982.
115
CHALMERS, R. A.; PURKISS, P.; WATTS; et al. Screening for organic acidurias
and amino acidopathies in newborns and children. J. Inher. Metab. Dis., v. 3, p.
27-29, 1980.
CHAN, K.; DELFERT, D.; JUNGER, K. D. A direct colotimetric assay for Ca2+ stimulated ATPase activity. Anal. Biochem. v. 157, p. 375-380, 1986.
CHOI, D. W.; ROTHMAN, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxicischemic neuronal death. Ann. Rev. Neurosci. v. 13, p. 171-182, 1990.
CLARK, J. B.; BATES, T. E.; CULLINGFORD, T.; et al. Development of enzymes
of energy metabolism in the neonatal mammalian brain. Dev. Neurosci-Basel., v.
17, p. 174-180, 1993.
COHN, R. N.; YUDKOFF, M.; ROTHMAN, R.; SEGAL, S. Isovaleric acidemia: Use
of glycine therapy in neonates. N Engl J Med, v. 299, p. 996, 1978.
COUSIN, M. A.; NICHOLLS, D. G.; POCOCK, J. M. Modulation of ion gradients
and glutamate release in cultured cerebellar granule cells by ouabain. J.
Neurochem. v. 64, p. 2097-2104, 1995.
CREMER, J. E.; BRAUN, L. D.; OLDENDORF, W. H. Changes during
development in transport process of the blood-brain barrier. Biochim. Biophys.
Acta., v. 448, p. 633-637, 1976.
CRONE, C. Facilited transfer of glucose from blood into brain tissue. J. Physiol.
(Lond), v. 181, p. 103-106, 1965.
DA SILVA, C. G.; BUENO, A. R.; SCHUCK, P. F.; et al. Inhibition of creatine
kinase activity from rat cerebral cortex by D-2-hydroxyglutaric acid in vitro.
Neurochem. Int., v. 44, p. 45-52, 2004.
DE SOUZA, C.; CHALMERS, R. A.; STACEY, T. E.; TRACEY, B. M.; WEAVER,
C. M.; BRADLEY, D. The response to L-carnitine and glycine terapy in isovaleric
acidaemia. Eur J Pediatr, v. 144, p. 451, 1986.
DICKINSON, C. J. Cerebral oxidative metabolism in hypertension. Clinical
Science, v. 91, p. 539-550, 1996.
DONALDSON, J.; ST-PIERRE, J.; MINICH J.; BARBEAL, A. Seizures in rats
associated with divalent cation inhibition of Na+, K+-ATPase. Can. J. Biochem.
v.49, p.1217-1224, 1977.
DUBIEL, B.; DABROWSKI, C.; WETTS, R.; TANAKA, K. Complematation studies
of isovaleric acidemia and glutaric aciduria type II used cultured skin fibroblasts. J
Clin Invest, v. 72, p. 1543, 1983.
ERECINSKA, M.; SILVER, I. A. Íons and energy in mammalian brain. Progress in
Neurobiology, v.43, p. 37-71, 1994.
116
FISCHER, A. Q.; CHALLA, V. R.; BURTON, B. K.; MCLEAN W. T. Cerebellar
hemorrhage complicating isovaleric acidemia: A case report. Neurology, v. 31, p.
746, 1981.
FISCHER, J. C.; RUITENBEREK, W.; BERDEN, J. A. et. al. Differential
investigation of the capacity of succinate oxidation in human skeletal muscle. Clin
Chem Acta, v. 153, p. 23-26, 1985.
GEERING, K. Subunit assembly and funtional maturation of Na+, K+-ATPase. J.
Membrane Biol. v.155, p.109-121, 1990.
GERDES, A. M.; GREGERSEN, N.; LUDVIGSSON, P.; GUTTLER, F. A
Scandinavian case of isovaleric acidemia. J. Inherit. Metab. Dis., v. 11, p. 218,
1988.
GREGERSEN, N.; KOLVRAA, S.; MORTENSEN, P. B. Acyl-CoA: glycine Nacyltransferase: in vitro studies on the glycine conjugation of straight- and
branched-chained acyl-CoA esters in human liver. Biochem. Med. Metab. Biol. v.
35, p. 210, 1986.
GRISAR, T. Glial and neuronal Na+-K+ pump in epilepsy. Ann. Neurol., v.16, p.
S128-S134, 1984.
HANGLUND, M. M.; STHAL, W. L.; KUNKEL, D. D.; SCHWARTZKROIN, P. A.
Developmental and regional differences in the localization of Na+, K+-ATPase
activity in the rabbit hippocampus. Brain Res. v. 343, p. 198-203, 1985.
HINE, D. G.; HACK, A. M.; GOODMAN, S. I.; TANAKA, K. Stable isotope dilution
analysis of isovalerylglycine in amniotic fluid and urine and its application for the
prenatal diagnosis of isovaleric acidemia. Pediatr Res, v. 20, p. 222, 1986.
HITSCHKE, K.; BÜHLER, R.; APELL, H. J.; STARK, G. Inactivation of the Na+, K+ATPase by radiation-induced free radical-chain mechanism. FEBS Lett. v. 353, p.
297-300, 1994.
HOFFMANN, G. F.; VON KRIES, R.; KLOSE, D.; et al. Frequencies of inherited
organic acidurias and disorders of mitochondrial fattyacid transport and oxidation
in Germany. Eur. J. Pediatr., v. 163, p. 76-80, 2004.
HUGHES, B. P. A method for estimation of serum creatine kinase and its use in
comparing creatine kinase and aldolase activity in normal and pathological sera.
Clin Chim Acta, v. 7, p. 597-604, 1962.
HYMAN, D. B.; TANAKA, K. Isovaleryl-CoA Dehydrogenase activity in isovaleric
acidemia fibroblasts using and improved tritium release assay. Pediatr. Res., v.20,
p. 59, 1986.
JACOBSON, I. R.; HAGBERG, H.; SANBERG, M.; et al. Ouabain-induced
changes in extracellular aspartate, glutamate and GABA levels in the rabbit
alfactory bulb in vivo. Neurosci. Lett., v. 64, p. 211-215, 1986.
117
JONES, D. H.; MATUS, A. I.; Isolation of synaptic plasma membrane from brain
by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim.
Biophys. Acta. v. 356, p. 276-287, 1974.
KALDIS, P.; STOLZ, M.; WYSS, M.; et al. Identification of two distinctly localized
mitochondrial creatine kinase isoenzymes in spermatozoa. J. Cell. Sci., v. 109, p.
2079-2088, 1996.
KONOREV, E. A.; HOGG, N. ;KALYANARAMAN, B. Rapid and irreversible
inhibition of creatine kinase by peroxiynitrite. FEBS Letters, v. 427(2), p. 171-174,
1998.
KRIEGER, I.; TANAKA, K. Therapeutic effects of glycine in isovaleric acidemia.
Pediatric. Res., v. 10, p. 25, 1976.
KUMAR, A. R.; KURUP, P. A. Inhibition of membrane Na+, K+-ATPase activity: a
common pathway in central nervous system disorders. J. Assoc Physicians India
v. 50, p. 400-6, 2002.
KURELLA, E.; KUKLEY, M.; TYULINA, O.; DOBROTA, D.; MATEJOVILOVA, M.;
MEZESOVA, V.; BOLDIREV, A. Kinetic parameters of Na+, K+-ATPase modified
by free radicals in vitro and in vivo. Ann. N. Y. Acad. Sci., v. 834, p. 661-665,
1997.
LEE, P. J.; HARRISON, E. L.; JONES, M. G.; CHALMERS, R. A.; LEONARD, J.
V.; WHIPP, B. J. Improvment in excercise tolerance in isovaleric acidemia with Lcarnitine therapy. J. Pediatr., v. 21, p. 136, 1998.
LEES, G. J. Contributory mechanisms in the causation of neurodegenerative
disorders. Neuroscience, v.,54, p.,287-322, 1993.
LEES, G. J. Inhibition of sodium-potassium-ATPase: a potentially ubiquitous
mechanism contributing to central nervous system neuropathology. Brain Res
Brain Res Rev, v.,16, p.,283-300, 1991.
LEES, G. J.; LEHMANN, A.; SANDBERG, M. et al. The neurotoxicy of ouabain, a
sodium-potassium ATPase inhibition, in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. v.
120, p. 159-162, 1990.
LEES, G. J.; LEONG, W. Brain lesions induced by specific and non-specific
inhibitors of sodium potassium ATPase. Neurosci. Lett., v. 188, p. 113-116, 1995.
LINGREL, J. B.; KUNTZWEILER, T. Na+, K+-ATPase. J. Biochem. Chem., v. 269,
n. 31, p. 196599-196662, 1994.
LOWRY, O. H.; ROSEBROUGH, N. J.; FARR, A. L.; RANDALL, R. J. Protein
mesurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem, v. 193, p. 265-75, 1951.
118
MANOS, P.; BRIAN, G. K.; EDMOND, J. Creatine kinase activity in postnatal rat
brain development and in cultured neurons, astrocytes and oligodendrocytes. J.
Neurochem., v. 56, p. 2101-2107, 1991.
MARKS, D. B.; MARKS, A. D.; SMITH, C. M. Basic Medical Biochemistry: a
clinical approach. 1996
MAYATEPEK, E.; HOFFMANN, G. F.; BAUMGARTNER, R.; et al. Atypical vitamin
B12-uresponsive methylmalonic aciduria in a sibship with severe progressive
encephalomyopathy: a new genetic disease? Eur. J. Pediatr., v. 155, p. 398-403,
1996.
MAYATEPEK, E.; KURCZYNSKI, T. W.; HOPPEL, C. L. Long-term L-carnitine
treatment in isovaleric acidemia. Pediatr Neurol., v. 7, p. 137, 1991.
MEISTER, A.; ANDERSON, M. E. Glutathione. Ann. Rev. Biochem., v. 52, p. 711760, 1983.
MILLINGTON, D. S.; kODO, N.; NORWOOD, D. L.; ROE, C. R. Tandem mass
spectometry: A new method for acylcarnitine profiling whith potential for neonatal
screening for inborn errors of metabolism. J. Inherit. Metab. Dis., v. 13, p. 321,
1990.
MOLLOY, G. R.; WILSON, C. D.; BENFIELD, P.; et al. Rat brain creatine kinase
messenger RNA levels are high in primary cultures of brain astrocytes and
oligodendrocytes and low in neurons. J. Neurochem., v. 59, p. 1932-1952, 1992.
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger, Principles of Biochemistry. 4a ed. New
York: Worth Publishers, 2004.
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger, Principles of Biochemistry. 3a ed. New
York: Worth Publishers, 2000.
O’GORMAN, E.; BEUTNER, G.; WALLIMANN, T.; BRDICZKA, D. Differential
effects of creatine depletion onthe regulation of enzyme activities and on creatinestimulated mitocondrial respiration in skeletal muscle, heart and brain. Biochim
Biophys Acta, v. 1276, p. 161-170, 1996.
OYEDOTUN, K. S.; LERNIRE, B. D. The Saccharomyces cerevisiae succinate
dehydrogenase anchor subunit, SDH4p: mutations at the C-terminal Lys-132
perturb the hydrofobic domain. Bioch. Bioph. Acta., v. 1411, p. 170-179, 1999.
RAPPORT, R. L.; HARRIS, A. B.; FRIEL, P. N.; OJEMANN, G. A. Human epileptic
brain. Na+, K+-ATPase activity and phanytoin concentration. Arch. Neurol., v. 33,
p. 549-554, 1975.
RASHED, M.; OZAND, P. T.; AQEEL, A.; et al. Experience of King Faisal
Specialist Hospital and Research Center with organic acid disorders. Brain.
Develop., v. 16, p. 1-6, 1994.
119
RENKAVEK, K.; RENIER, W. O.; DE PONT, J. J.; VOGELS, O. J.; GABREELS, F.
J. Neonatal status convulsivus , spongiform encephalopathy, and low activity of
(Na+/K+)-ATPase in the brain. Epilepsy, v. 33, p. 58-64, 1992.
RHEAD, W. J.; HALL, C. L.; TANAKA, K. Novel tritium release assays for
isovaleryl-CoA and butyryl-CoA desidrogenases. J. Biol. Chem., v. 256, p. 1616,
1981.
ROE, C. R.; MILLINGTON, D. S.; MALTBY, D. A.; KAHLER, S. G.; BOHAN, T. P.
L-carnitine Therapy in isovaleric acidemia. J Clin Invest, v. 74, p. 2290, 1984.
RUSTIN, P.; CHRETIEN, D.; BOURGERON T.; et al. Biochemical and molecular
investigations in respiratory chain deficiencies. Clin Chem Acta, v. 228, p. 35-51,
1994.
SATOH, E.; NAKASATO, Y. On the mechanism of ouabain-induced released of
acetylcholine from synaptosomes. J. Neurochem. v. 58, p. 1038-1044, 1992.
SCRIVER, C. R.; BEAUDET, A. L.; SLY, W. S.; VALLE, D. (Eds.). The metabolic
and molecular bases of inherited disease, 8th ed. New York: McGraw-Hill, Inc.;
2001.
SHAPIRA, A. H.; COOPER, J. M.; DEXTER, D.; et al. Mitocondrial complex I
deficiency in Parkinson'
s disease. J Neurochem, v. 54, p. 823-827, 1990.
SHIH, V. E.; AUBRY, R. H.; DEGRANDE, G.; GURSKY, S. F.; TANAKA, K.
Maternal isovaleric acidemia. J Pediatr, v. 105, p. 77, 1984.
SHIH, V. E.; MANDELL, R.; TANAKA, K. Diagnosis of isovaleric acidemia in
cultured fibroblasts. Clin Chim Acta, v. 113, p. 101, 1973.
SILVA, C.G. Efeito “In Vitro” de substâncias acumuladas na citrulinemia e na
argininemia sobre a atividade da Na+, K+-ATPase de membrana plasmática
sináptica de córtex cerebral de ratos. Porto Alegre, 1999. Dissertação (Mestrado
em Bioquímica) - Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul.
SINCLAIR, L. A. A new look at the inborn errors of metabolism. Ann. Clin.
Biochem. v. 19, p. 314-21, 1982.
SOBOLL, S.; BRDICZKA, D; JAHNKE, D. et. al. Octamer-dimer transitions of
mitocondrial creatine kinase in heart disease. J Moll Cell Cardiol, v. 31(4), p. 857866, 1999.
SOKOLOFF, L. Sites and mechanisms of function-related changes in energy
metabolism in the nervous system. Dev Neurosci, v.15, p. 194-206, 1993.
SORENSEN, R. G.; MEHLER, H. R. Localization of endogenous ATPases at
nerve terminal. J Bioenerg Biomembr, v. 14, p. 527-547, 1982.
120
STACHOWIAK, O.; DOLDER, M.; WALLIMANN, T.; RICHTER, C. Mitocondrial
creatine kinase is a prime target of peroxynitrite-induced modification and
inactivation. J Biol Chem, v. 273(27), p. 16694-16699, 1998.
SWEADNER, K. J. Two molecular forms of Na+ K+ -stimulated ATPase in brain.
Separation , and difference in affinity for strophanthidin. J. Biol. Chem., v. 254, p.
6060-6067, 1979.
TANAKA, K. Inborn errors of branched-chain amino acid metabolism, in Odessy,
R. (ed): Problems and Potential of Branched-Chain Amino Acids in Physiology and
Medicine. New York, Elsevier, p. 201, 1986.
TANAKA, K.; BUDD, M. A.; EFRON, M. L.; ISSELBACHER, K. J. Isovaleric
acidemia: A new genetic defect of leucine metabolism. Proc Natl Acad Sci USA, v.
56, p. 236, 1966.
TANAKA, K.; ISSELBACHER, K. J. The isolation and identification of Nisovalerilglicine from urine of patients whith isovaleric acidemia. J. Biol. Chem., v.
242, p. 2966, 1967.
TANAKA, K.; MANDELL, R.; SHIH, V. E. Metabolism of [1-14C] and [2-14C]
leucine in cultured skin fibroblasts from patients whith isovaleric acidemia. J. Clin.
Invest., v. 58, p. 164, 1976.
TANAKA, K.; NEST-DULL, A.; HINE, D. G.; LYNN, T. B. ,LONE, T.
Gaschromatographic method of analysis for urinary organic acids. II. Description
of the procedure, and its application to diagnosis of patients with organic
acidurias. Clin Chem, v. 26, p. 1847, 1980.
TANAKA, K.; ORR, J. C.; ISSELBACHER, K. J. Identification of beta
hidroxyisovaleric acid in the urine of a patient with isovaleric acidemia. Biochim.
Biophys. Acta. v. 152, p. 638, 1968.
TANAKA, K.; ROSENBERG, L. E. Disorders of Branched-Chain Amino Acid and
Organic Acid Metabolism, in Stanbury, J.B.; Wyngaarden, J.B.; Fredrickson, D.S.;
Goldstein, J.L.; Brown, M.S. (eds): The maetabolic basis of inheritd disease, 5th ed
New York, Mc-Graw-Hill, p.440, 1983.
TSAKIRIS, S.; ANGELOGIANINNI, P.; SCHULPIS, K.; BEHRAKIS, P. Protective
effect of L Cisteine and Gluthatione on Rat Brain Na+, K+-ATPase Inhibition
Induced by Free Radicals. Z. Naturforsch, v. 55, p. 271-277, 2000.
TSAKIRIS, S.; DELICONSTANTINUS, G. Influence of phosphatidylserine on
(NA+, K+) – stimulated ATPase and acethylcholinesterase activities of dog brain
synaptosomal plasma membrane. Biochem. J., v. 22, p. 301-307, 1984.
VICARIO, C.; ARIZMENDI, C.; MALLOCH, G. D. A. et al. Lactate utilization by
isolated cells from early neonatal rat brain. J. Neurochem., v. 57, p. 1700-1707,
1991.
121
VOET, D.; VOET, J. G. Biochemistry, 2nd Ed. New York: John Wiley & Sons, Inc,
1995.
VOET, D.; VOET, J. G. Biochemistry. New York: John Wiley & Sons, Inc, 1990.
WANG, X. O.; XIAO, A. Y.; YANG, A.; LAROSE, L.; WEI, L.; YU, S. P. Block of
Na+,K+-ATPase and induction of hybrid death by 4-aminopyridine in cultured
cortical neurons. J. Pharmacol. Ther., v. 305, n. 2, p. 502-506, 2003.
WHITTAN, R. The dependence of the respiration of brain cortex on active cation
transport. Biochem. J., v.82, p.205-212, 1962.
WILLIAMS, K. M.; PEDEN, V. H.; HILLMAN, R. E. Isovaleric acidemia appearing
as diabetic ketoacidosis. Am. J. Dis. Child., v. 135, p. 1068, 1981.
WYSE, A. T. S.; BOLOGNESI, G.; BRUSQUE, A. M.; DUTRA-FILHO, C. S.;
WANNMACHER, C. M. D.; WAJNER, M. Na+, K+-ATPase activity in the sinaptic
plasma membrane from the cerebral cortex of rats subjected to chemically
induced phenylketonuria. Med. Sci. Res., v. 23, p. 261-262, 1995.
WYSE, A. T. S.; BRUSQUE, A. M.; SILVA, C. G.; STRECK, E. L. WAJNER, M.;
WANNMACHER, C. M. D. Inhibition of Na+, K+-ATPase from brain cortex by
propionic acid. Neuroreport, v. 9, n. 8, p. 1719-1721, 1998.
WYSS, M.; KADDURAH-DAOUK, R. Creatine and Creatinine Metabolism. Physiol.
Rev., v. 80, p. 1107-1213, 2000.
WYSS, M.; SMEITINK, J; WEVERS, R. A.; WALLIMANN, T. Mitocondrial creatine
kinase: a key enzyme of aerobic energy metabolism. Biochim Biophys Acta, v.
1102, p. 119-166, 1992.
XIAO, A. Y.; WEI, L.; XIA, S.; ROTHMAN, S.; YU, S. P. Ionic mechanism of
ouabain-induced concurrent apoptosis and necrosis in individual cultured cortical
neurons. J. Neurosci. v.22, p.1350-1362, 2003.
YOUSEF, M. I.; EL-HENDY, H. A.; EL-DEMERDASH, F. M.; ELAGAMY, E. I.;
Dietary zinc deficiency induced-changes in the activity of enzymes and the levels
of free radicals, lipids and protein electrophoretic behaviour in growing rats.
Toxicology. v. 175, p. 223-234, 2002.
122